ES2293894T3 - Inhibidores de la formacion celular de mononucleotido de niacinamida y su uso en la terapia del cancer. - Google Patents

Inhibidores de la formacion celular de mononucleotido de niacinamida y su uso en la terapia del cancer. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para seleccionar y detectar compuestos biológicamente activos que comprende: incubar células cultivadas seleccionadas entre células HepG2, células U - 87 MG, células MCF-7 M 1, células Caki-1, células HL-60, células PC3, células U-373 MG, células A549 y células KG-1 a en presencia de [ 14 C]-niacinamida y un compuesto a ensayar para determinar su actividad para inhibir la formación celular del mononucleótido de niacinamida; realizar el lisado de las células; aislar y separar los compuestos marcados con [ 14 C] y medir la cantidad de mononucleótido de niacinamida, NAD y NADP marcados formados.

Description

Inhibidores de la formación celular de mononucleótido de niacinamida y su uso en la terapia del cáncer.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevos compuestos biológicamente activos que inhiben la formación celular del mononucleótido de niacina, que es uno de los intermedios esenciales en la biosíntesis de NAD(P) en la célula. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen estos compuestos y a su uso, especialmente en el tratamiento de cánceres, leucemias o para la inmunosupresión. La invención también proporciona procedimientos de exploración como una herramienta para detectar los compuestos activos anteriores, y para examinar los tipos celulares con respecto a su ruta de síntesis de NAD(P).
Antecedentes técnicos de la invención
El NAD se sintetiza en las células de los mamíferos por tres rutas diferentes que parten del triptófano mediante el ácido quinolínico, de la niacina (también denominada ácido nicotínico) o de la niacinamida (también denominada nicotinamida), como se muestra en la Figura 1.
La adición de un resto de fosforribosilo da como resultado la formación de los mononucleótidos correspondientes, mononucleótido de niacina (dNAM) y mononucleótido de niacinamida (NAM). El ácido quinolínico se utiliza en una reacción con pirofosfato de fosforribosilo (PRPP) para formar mononucleótido de niacina (dNAM). La enzima que cataliza esta reacción, la ácido quinolínico fosforribosil transferasa (\ding{204}), se encuentra en el hígado, el riñón y el
cerebro.
La niacina reacciona con PRPP para formar el mononucleótido de niacina (dNAM). La enzima que cataliza esta reacción es la niacina fosforribosil transferasa (\ding{203}) y se distribuye ampliamente en diversos tejidos. Ambas rutas que parten del triptófano o de la niacina como precursores del NAD se unen en la etapa de formación del mononucleótido de niacina.
La niacinamida reacciona con PRPP para dar el mononucleótido de niacinamida (NAM). La enzima que cataliza esta reacción es la niacinamida fosforribosil transferasa (\ding{202}). Esta enzima es específica para niacinamida y es completamente distinta de la niacina fosforribosil transferasa (\ding{203}). También se distribuye extensamente en diversos
tejidos.
La adición posterior de adenosina monofosfato a los mononucleótidos da como resultado la formación de los dinucleótidos correspondientes: El mononucleótido de niacina y el mononucleótido de niacinamida reaccionan con ATP para producir dinucleótido de niacina adenina (dNAD) y dinucleótido de niacinamida adenina (NAD), respectivamente. Las dos reacciones, aunque se producen en dos rutas diferentes, se catalizan por la misma enzima, la NAD pirofosforilasa (\ding{205}).
Es necesaria una etapa de amidación adicional para convertir el dinucleótido de niacina adenina (dNAD) en el dinucleótido de niacinamida adenina (NAD). La enzima que cataliza esta reacción es la NAD sintetasa (\ding{206}). El NAD es el precursor inmediato del fosfato de dinucleótido de niacinamida adenina (NADP). La reacción se cataliza por la cinasa NAD (\ding{207}). Para más detalles, véase, por ejemplo, Cory, J. G. Purine and pirimidine nucleotide metabolism. En: Textbook of Biochemistry and Clinical Correlations, 3ª edición, ed. Devlin, T., Wiley Brisbane 1992, págs.
529-574.
Las células normales pueden utilizar típicamente tanto niacina como niacinamida como precursores para la síntesis de NAD(P), y en muchos casos además triptófano o sus metabolitos, habiéndose demostrado para diversos tejidos normales: Por consiguiente, las células gliales murinas (corteza e hipocampo = cerebro) usan: niacina, niacinamida y ácido quinolínico (Grant y col. (1998), J. Neurochem. 70: 1759-1763). Los linfocitos de seres humanos usan niacina y niacinamida (Carson y col. (1987), J. Immunol. 138: 1904-1907; Berger y col. (1982), Exp. Cell Res. 137: 79-88). Las células hepáticas de rata usan niacina, niacinamida y triptófano (Yamada y col. (1983), Internat. J. Vit. Nutr. Res. 53: 184-191; Shin y col. (1995), Internat. J. Vit. Nutr. Res. 65: 143-146; Dietrich (1971), Methods Enzymol. 18B: 144-149). Los eritrocitos de seres humanos usan niacina y niacinamida (Rocchigiani y col. (1991), Purine and pyrimidine metabolism in man VII, Parte B, ed. Harkness y col., Plenum Press, Nueva York, págs. 337-340). Los leucocitos de cobayas usan niacina (Flechner y col. (1970), Life Science. 9: 153-162).
El NAD(P) está implicado en una diversidad de reacciones bioquímicas que son vitales para la célula y que, por lo tanto, se han investigado minuciosamente. Esta función clave del NAD(P) también ha propiciado algunas investigaciones en el pasado sobre el papel de este compuesto para el desarrollo y crecimiento de tumores, y sobre cómo el metabolismo del NAD(P) puede utilizarse también para combatir tumores. De hecho, se ha descrito que los compuestos que se dirigen al tratamiento de enfermedades tumorales también implican -de forma concomitante con otros efectos- la disminución de los niveles de NAD(P) en la célula. Sin embargo, estos compuestos actúan principalmente iniciando la síntesis celular de derivados dinucleotídicos que se desvían estructuralmente del NAD natural. Las consecuencias bioquímicas de este procedimiento y los mecanismos putativos del daño celular resultante son, por lo tanto, múltiples, como se resume en la Tabla 1.
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3 
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Por lo tanto, es imposible hacer cualquier predicción a partir de estos datos sobre los efectos biológicos de una inhibición primaria y específica de la biosíntesis de NAD en diversos tipos celulares. En particular, continúa siendo totalmente una especulación que este mecanismo pueda ser ventajoso por encima de la utilización de los derivados de dinucleótidos anteriores con respecto a la selectividad tumoral del efecto que daña a la célula, la característica más importante de un fármaco potencial para terapia tumoral.
El documento JP-459555, publicado en 1970, describe la extracción de un constituyente estructural desconocido a partir de patatas, levadura de pastelería y sangre bovina, que inhibe la respiración en células tumorales y la síntesis de NAD por los eritrocitos. Los inventores proponen el uso de este constituyente en terapia tumoral. Sin embargo, los datos que se presentan en el documento JP-459555 están lejos de demostrar como claro o incluso como probable que la inhibición de la síntesis de NAD sea útil en la terapia del cáncer. En lugar de esto, los inventores llegan a la conclusión de que la actividad biológica del compuesto es multifacética y no se limita únicamente al fenómeno de la inhibición de la biosíntesis de NAD. En un estudio publicado posteriormente por el mismo grupo de investigación (A. Kizu: Kyoto Furitsu Ika Daigaku Zasshi 80, págs. 14-24, 1971), se demostró que los compuestos extraídos (derivados de glucosa) inhiben la respiración y la glucolisis en células tumorales ya en los primeros minutos, además de la inhibición de la síntesis de NAD. De hecho, las células tumorales tratadas con el extracto durante sólo 20 min sufrieron daños tan grandes que no crecieron en la cavidad abdominal de ratones, al contrario que las células de control no tratadas. En contraste con este descubrimiento, los presentes inventores han observado que los compuestos que inhiben rápidamente y selectivamente la síntesis de NAD en la célula ejercen un efecto perjudicial sobre células tumorales sólo después de una exposición durante 3-4 días, mientras que una exposición durante 20 min es completamente ineficaz independientemente de la concentración empleada. Por lo tanto, es muy improbable que sea la inhibición de la biosíntesis de NAD por la que el extracto descrito en el documento JP-459555 daña las células tumorales. Se asume más bien que son de manera primaria otros mecanismos los responsables de la muerte celular, mientras que la reducción de los niveles de NAD es un efecto secundario debido al daño general de la célula. El rápido efecto perjudicial sobre células tumorales, tal como lo produce este extracto, se debe, por lo tanto, obviamente a una inhibición de la respiración celular.
Además, la preferencia por los tumores del efecto de muerte celular del extracto, como se describe en el documento JP-459555, puede explicarse fácilmente por un rasgo característico del efecto inhibitorio de la respiración del extracto, ya que este efecto es marcado en células tumorales pero no se produce en células hepáticas. (Figura 2 en A. Kizu). Por lo tanto, el documento JP-459555 claramente no describía ningún medio de afectar a células tumorales mediante la inhibición de la síntesis de NAD.
También se sabía que los compuestos citotóxicos que dañan al ADN inician una disminución de la concentración celular de NAD. Algunos autores supusieron que disminuir los niveles de NAD celular, con una escasez de ATP como resultado en el interior de la célula, puede desempeñar un papel en el mecanismo de muerte celular producido por estos compuestos (Daniel S. Martin y Gary K. Schwartz, Oncology Research, Vol. 9, págs. 1-5, 1997). El efecto de estos compuestos sobre la concentración de NAD en el interior de la célula es, sin embargo, indirectamente el resultado de un consumo aumentado de NAD por las enzimas implicadas en la reparación del ADN (véase la Tabla 1).
El efecto primario de estos compuestos, concretamente el daño del ADN, tiene muchas consecuencias además de disminuir los niveles de NAD celular. Como se sabe, el ADN controla la síntesis de muchos constituyentes celulares, como proteínas y enzimas, que son de vital importancia para la célula. Por lo tanto, las consecuencias del daño del ADN son también múltiples, siendo la disminución de la concentración de NAD celular sólo una de ellas. El perfil de eficacia de una inhibición específica de la biosíntesis de NAD, por lo tanto, no puede deducirse de las observaciones realizadas con estos compuestos.
La misma escasa información sobre qué puede esperarse de una inhibición específica de la biosíntesis de NAD la proporciona la sintomatología de la deficiencia de niacinamida y de niacina. Estas vitaminas del grupo B son precursores de la biosíntesis de NAD como se ha indicado anteriormente. La deficiencia a largo plazo de estos precursores da como resultado una enfermedad denominada pelagra. Los síntomas principales son alteraciones de la piel y demencia. Este síndrome no muestra similitudes con la intoxicación crónica con cualquiera de los compuestos analizados anteriormente.
El documento WO 97/48695 describe nuevas aminas de ácidos de piridilalcanos, procedimientos para su producción, medicamentos que contienen estos compuestos, así como su uso, especialmente en el tratamiento de afecciones tumorales y/o como agentes citostáticos o como agentes inmunosupresores. El documento WO 97/48696 describe nuevas aminas de ácidos de piridilalquenos y de piridilalquinos, procedimientos para su producción, medicamentos que contienen estos compuestos, así como su uso, especialmente en el tratamiento de afecciones tumorales y/o como agentes citostáticos o como agentes inmunosupresores. En el documento WO 97/48397 se describe el uso de aminas de ácidos de piridilalcanos, piridilalquenos y/o piridilalquinos, especialmente en el tratamiento de afecciones tumorales y/o como agentes citostáticos o como agentes inmunosupresores, así como medicamentos con una cantidad de estos compuestos junto con otros agentes citostáticos o agentes inmunosupresores. El documento WO 99/31063, publicado el 24 de junio de 1999, describe nuevas carboxamidas de piridilalcanos, piridilalquenos y piridilalquinos sustituidas con piperazinilo, con un resto hidrocarburo saturado, una o varias veces insaturado en la porción del ácido carboxílico, procedimientos para la síntesis de estos compuestos, medicamentos que los contienen y su producción, así como su uso terapéutico, especialmente como agentes citostáticos y como agentes inmunosupresores, por ejemplo, en el tratamiento o la prevención de diversos tipos de tumores y en el control de reacciones inmunes, por ejemplo, de enfermedades autoinmunes. El documento WO 99/31060, publicado el 24 de junio de 1999, describe nuevas carboxamidas de piridilalcanos, piridilalquenos y piridilalquinos sustituidas con piperidinilo, con un resto hidrocarburo saturado, una o varias veces insaturado en la porción del ácido carboxílico, procedimientos para la síntesis de estos compuestos, medicamentos que los contienen y su producción, así como su uso terapéutico, especialmente como agentes citostáticos y como agentes inmunosupresores, por ejemplo, en el tratamiento o la prevención de diversos tipos de tumores y en el control de reacciones inmunes, por ejemplo de enfermedades autoinmunes. Las nuevas carboxamidas de piridilalcanos, piridilalquenos y piridilalquinos sustituidas con una imida cíclica y con un resto hidrocarburo saturado, una o varias veces insaturado en la porción del ácido carboxílico, procedimientos para la síntesis de estos compuestos, medicamentos que los contienen y su producción, así como sus uso terapéutico, especialmente como agentes citostáticos y como agentes inmunosupresores, por ejemplo, en el tratamiento o la prevención de diversos tipos de tumores, la inhibición de un crecimiento celular anormal y el control de reacciones inmunes, por ejemplo, de enfermedades autoinmunes, es el tema del documento WO 99/31087, publicado el 24 de junio de 1999. En el documento WO 99/31064, publicado el 24 de junio de 1999 se describen nuevas carboxamidas de piridilalcanos, piridilalquenos y piridilalquinos sustituidas con un resto hidrocarburo saturado, una o varias veces insaturado en el grupo del ácido carboxílico, procedimientos para la síntesis de estos compuestos, medicamentos que los contienen y su producción, así como su uso terapéutico, especialmente como agentes citostáticos y como agentes inmunosupresores, por ejemplo, en el tratamiento o la prevención de diversos tipos de tumores y en el control de reacciones inmunes, por ejemplo, de enfermedades autoinmunes. Todas estas solicitudes describen compuestos o el uso de compuestos que tienen actividad citostática y/o que son útiles en el tratamiento de afecciones tumorales, sin embargo, ninguna de estas solicitudes proporciona ningún indicio de que la biosíntesis de NAD se inhiba por estos compuestos ni describe implícitamente a estos compuestos como inhibidores específicos de la niacinamida fosforribosiltransferasa
(NAPRT).
Por lo tanto, en resumen, el estado de la técnica no permite sacar conclusiones sobre lo que puede esperarse de una inhibición primaria y específica de la síntesis celular de NAD porque los compuestos que se sabe que disminuyen la concentración celular de NAD ejercen otros efectos primarios que pueden afectar por sí mismos a la supervivencia celular. No existe otro medio fiable para resolver esta cuestión que el uso de un inhibidor específico de la síntesis de NAD. Pero un compuesto de este tipo no estaba disponible en el pasado.
Morton (R. K. Morton: Nature 181, págs. 540-543, 1958) propone que la terapia de cáncer humano se centre en compuestos que inhiben la NAD pirofosforilasa (Enzima \ding{205} en la Fig. 1), ya que se supone que la actividad de esta enzima es el factor limitante de la síntesis de NAD. Obsérvese que la ruta de biosíntesis tanto a partir de niacina como de niacinamida, y también a partir de triptófano, se bloquearía por una inhibición de la NAD pirofosforilasa, ya que actúa en una etapa tardía de la ruta de biosíntesis en la que las rutas inicialmente separadas partiendo de los diferentes precursores triptófano, niacina o niacinamida se unen y se ven afectadas por igual. No ese ha encontrado un inhibidor específico de esta enzima hasta ahora. Por lo tanto, no hay pruebas disponibles que indiquen si esta suposición es adecuada.
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Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que, en tipos celulares específicos, la utilización de niacinamida para la biosíntesis de NAD(P) celular es de vital importancia. No pueden utilizarse ni niacina ni triptófano, que constituyen precursores alternativos en muchos otros tipos celulares examinados hasta ahora, o al menos no en un grado suficiente para la supervivencia celular.
Por consiguiente; la presente invención proporciona un procedimiento para seleccionar y detectar compuestos biológicamente activos según la reivindicación 1, que comprende:
incubar células cultivadas seleccionadas de entre células HepG2, células U-87 MG, células MCF-7 M1, células Caki-1, células HL-60, células PC3, células U-373 MG, células A549 y células KG-1a en presencia de [^{14}C]-niacinamida y un compuesto a ensayar para determinar su actividad para inhibir la formación celular de mononucleótido de niacinamida; efectuar la lisis de las células;
aislar y separar los compuestos marcados con [^{14}C] y medir la cantidad de mononucleótido de niacinamida, NAD y NADP marcados formados.
Las reivindicaciones subordinadas 2 a 14 se refieren a realizaciones preferidas del procedimiento de la reivindicación 1, compuestos que pueden obtenerse por este procedimiento y preparaciones farmacéuticas que comprenden tales compuestos.
Preferiblemente, los compuestos a concentraciones de \leq10 \muM presentan actividad inhibidora sobre la biosíntesis de NAD celular a partir del precursor niacinamida de al menos el 50%, más preferentemente de al menos el 80% y más preferentemente de al menos el 90% en un ensayo de este tipo.
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Figuras
Figura 1: Rutas Bioquímicas de la Biosíntesis de NAD(P)^{+}.
Figura 2A: Curva de tiempo de la acción de 6-Amino-nicotinamida en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2B: Curva de tiempo de la acción de Tiazofurina en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2C: Curva de tiempo de la acción de Selenazofurina en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2D: Curva de tiempo de la acción de Azaserina en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2E: Curva de tiempo de la acción de 6-Diazo-5-oxo-L-norleucina en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de
SRB.
Figura 2F: Curva de tiempo de la acción de K22130 en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2G: Curva de tiempo de la acción de K22132 en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2H: Curva de tiempo de la acción de K22133 en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2I: Curva de tiempo de la acción de K22158 en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2J: Curva de tiempo de la acción de K22234 en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2K: Curva de tiempo de la acción de K22265 en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2L: Curva de tiempo de la acción de K22299 en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2M: Curva de tiempo de la acción de K22316 en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2N: Curva de tiempo de la acción de K22339 en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 20: Curva de tiempo de la acción de K22350 en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2P: Curva de tiempo de la acción de K22365 en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2Q: Curva de tiempo de la acción de K22387 en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 2R: Curva de tiempo de la acción de K22408 en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y un patrón interno determinado por el ensayo de SRB.
Figura 3A: Influencia de nicotinamida sobre la inhibición del crecimiento celular de 6-Amino-nicotinamida a diferentes concentraciones.
Figura 3B: Influencia de nicotinamida sobre la inhibición del crecimiento celular de Tiazofurina a diferentes concentraciones.
Figura 3C: Influencia de nicotinamida sobre la inhibición del crecimiento celular de Selenazofurina a diferentes concentraciones.
Figura 3D: Influencia de nicotinamida sobre la inhibición del crecimiento celular de Azaserina a diferentes concentraciones.
Figura 3E: Influencia de nicotinamida sobre la inhibición del crecimiento celular de 6-Diazo-5-oxo-L-norleucina a diferentes concentraciones.
Figura 3F: Influencia de nicotinamida sobre la inhibición del crecimiento celular de Doxorrubicina a diferentes concentraciones.
Figura 3G: Influencia de nicotinamida sobre la inhibición del crecimiento celular de K22339 a diferentes concentraciones.
Figura 3H: Influencia de nicotinamida sobre la inhibición del crecimiento celular de K22387 a diferentes concentraciones.
Figura 4: Acción inhibidora de K22234 sobre la biosíntesis de NAD(P) a partir de [^{14}C]-niacinamida en células HepG2. Los metabolitos radiactivos de los extractos celulares se separaron en PEI celulosa usando LiCl 0,05 M como disolvente.
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Con los compuestos detectables por la presente invención, es posible por primera vez dañar exclusivamente aquellas células que usan principalmente niacinamida como precursor para la biosíntesis de NAD salvando aquellas células que pueden sintetizar adicionalmente NAD a partir de niacina o triptófano (Figura 1). Resultó ser que usando estos compuestos se afectan muchas células malignas, mientras que las células no malignas pueden salvarse. Esto mismo se aplica a ciertos linfocitos que desempeñan un papel en reacciones inmunes. Este comportamiento no se ha observado antes y es también absolutamente sorprendente: ni había indicios en la técnica anterior ni podía esperarse según los dados conocidos que las células somáticas normales que típicamente pueden usar los tres tipos de precursores pierden su capacidad de captar triptófano y niacina, o que al menos pierden su capacidad en un grado suficiente para la supervivencia celular y se vuelven dependientes de niacinamida cuando se vuelven malignas.
Por lo tanto, los compuestos biológicamente activos que bloquean selectivamente la ruta de la niacinamida de la biosíntesis de NAD, es decir, que inhiben la formación del mononucleótido de niacinamida a nivel celular, ofrecerán un nuevo procedimiento para terapia tumoral selectiva: las células malignas dependientes de niacinamida como el precursor principal o único sufrirán tales daños y finalmente serán destruidas debido a la inhibición de la formación de mononucleótido de niacinamida y a la posterior disminución de NAD(P). Por otro lado, las células somáticas normales pueden compensar la vía de la niacinamida inhibida utilizando todavía niacina y/o triptófano como precursores, proporcionando de este modo suficientes niveles de NAD para garantizar la supervivencia de las células.
Los compuestos detectables por esta invención son los primeros que inhiben principal y específicamente la biosíntesis de NAD a partir de niacinamida. Por lo tanto, estos compuestos pueden usarse como una herramienta para la investigación sobre el efecto de este hecho primordial sobre la supervivencia de células tumorales y otras células del cuerpo.
Además, era completamente sorprendente que los nuevos inhibidores específicos de la síntesis de NAD por la ruta de la niacinamida que disminuyen el NAD en células tumorales en sólo unas horas no produjeran la muerte de las células tan rápidamente como se ha demostrado con los "inhibidores" de la síntesis de NAD conocidos (véase la Tabla 1) pero sí producían un fenómeno característico de "muerte celular retardada" (DCD) en estas células cuando se proporcionaban por encima de un cierto nivel, el nivel de DCD: se observó crecimiento continuo durante hasta 3 días en presencia de los nuevos compuestos antes de que prácticamente todas las células experimentaran una muerte celular apoptótica. Era además sorprendente que muchas células no malignas son muy resistentes al efecto inductor de apoptosis de los nuevos inhibidores específicos de la biosíntesis de NAD. Por ejemplo, es necesaria una concentración 10000 veces mayor para matar células de médula ósea humana en comparación con la mayoría de las líneas celulares de cáncer humanas ensayadas. Por lo tanto, la característica de "muerte celular retardada" puede usarse en un ensayo para seleccionar a favor de compuestos según la presente invención.
La capacidad de los compuestos detectables por la invención para inhibir la biosíntesis de NAD a partir de niacinamida puede demostrarse con un sistema de ensayos fácilmente reproducible que mide la incorporación de niacinamida radiactiva en NAD y NADP. Este ensayo proporciona un sistema de exploración adicional para examinar cualquier compuesto químico para determinar su capacidad de inhibir selectivamente la formación de mononucleótido de niacinamida celular. Este ensayo permite explorar y seleccionar los compuestos inhibidores de la presente invención sin ligarse a ninguna caracterización estructural particular. Por consiguiente, no hay limitación sobre la estructura química de estos compuestos siempre que muestren dicha actividad inhibidora específica, y puede usarse cualquier procedimiento de preparación conocido.
El hecho de que la muerte de células tumorales iniciada por estos compuestos se debe en realidad únicamente a la inhibición de la biosíntesis de NAD a partir de niacinamida y que no se debe a ningún otro efecto pudo verificarse de manera inequívoca: la adición de un exceso de niacinamida al medio extracelular en el que las células se cultivan in vitro revierte completamente el efecto inductor de apoptosis de los nuevos compuestos.
Se han examinado los efectos de los compuestos según la invención sobre el crecimiento celular en condiciones de alta densidad con el fin de simular bastante fielmente la situación in vivo de tumores sólidos. Con este fin, los inventores sembraron un alto número de células y llevaron a cabo experimentos de cultivos celulares de alta densidad con los compuestos que se muestran en la Tabla 2 a continuación. El crecimiento celular se controló a diversos tiempos hasta los 10 días, como se describe en la parte experimental a continuación. Se usaron, por ejemplo, células humanas de hepatocarcinoma (HepG2).
La curva de tiempo de la acción de los compuestos se caracteriza por la inducción de la "muerte celular retardada" que se distingue claramente por una disminución rápida de la cantidad de células que se produce después de la aplicación de compuestos tóxicos. El fenómeno de "muerte celular retardada" se describe usando, por ejemplo, los resultados obtenidos con K22339. La Figura 2N demuestra la curva de tiempo característica de la inhibición del crecimiento por el compuesto K22339. Durante la incubación con K22339 a concentraciones de al menos 0,3 \muM, el número de células HepG2 aumentó hasta los tres días, después de lo cual el cultivo ya no pudo crecer y la cantidad de células disminuyó del día 7 al día 10. La muerte celular se produjo en el día 4, y las células se despegaron gradualmente hasta el día 10. Por el contrario, los compuestos tóxicos son menos activos en cultivos de alta densidad y las concentraciones eficaces indujeron una rápida disminución en la cantidad de células en comparación con el control que se observó en sólo de uno a tres días de incubación, véase, por ejemplo la Figura 2D, en la que para Azaserina, la concentración eficaz (tóxica) es de 100 \muM. Usando K22339, sin embargo, fue suficiente una concentración de 0,3 \muM para provocar el efecto a gran escala. Una concentración hasta diez veces superior no demostró una citotoxicidad aguda, ni fue capaz de acelerar el tiempo que tardaba en disminuirse gradualmente el número de células. Esta acción característica se denominó muerte celular retardada. Las curvas de tiempo de la acción sobre el crecimiento de células HepG2 en comparación con un control y con un patrón interno se proporcionan como Figuras 2A-2F y como Figuras 2G-2R para los compuestos tóxicos y para ejemplos de los compuestos específicos altamente eficaces según la invención, respectivamente.
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TABLA 2
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El valor de DCD se definió como la concentración mínima del compuesto respectivo, que -a pesar del crecimiento inicial del cultivo- inducía la muerte celular por debajo del número de células sembradas inicialmente. Todos los compuestos eran activos en cultivos de alta densidad de células HepG2 a concentraciones de 3 \muM o menos. Por lo tanto, se prefiere que los compuestos de la presente invención sean activos en el ensayo de "muerte celular retardada" a una concentración de 3 \muM o menos, con preferencia particularmente a una concentración de 1 \muM o menos. Los compuestos indicados en la Tabla 2 se prepararon según procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Las concentraciones eficaces (tóxicas) de los compuestos tóxicos se indican en la Tabla 5.
En una realización preferida, los compuestos según la presente invención comprenden la característica estructural correspondiente a un grupo piridilo sustituido en la posición 3 del anillo. En otras palabras, el compuesto biológicamente activo según la invención se representa por la fórmula general (A):
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8 
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en la que
\quad
Z es CH o N,
\quad
R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan independientemente entre sí entre grupos carbohidrato que contienen opcionalmente uno o más de los elementos seleccionados entre N, O, P, F, Cl, Br e I; y
\newpage
sales farmacéuticamente aceptables del mismo. En una realización preferida, R_{4} se representa por la fórmula (B)
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9 
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en la que
\quad
A es un enlace o un grupo carbohidrato bivalente que contiene opcionalmente uno o más de los elementos seleccionados entre N, O, P, F, Cl, Br e I;
\quad
X es O, S o NR_{8};
\quad
R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} tienen el mismo significado que R_{1} en la fórmula (A);
\quad
cada uno de a, b y c es independientemente 0 ó 1, con la condición de que si cada uno de a y c es 1, entonces b también sea 1.
El curso de tiempo del efecto de los compuestos sugería que no se producía una toxicidad aguda inespecífica sobre las células tumorales. Este curso de tiempo contrasta claramente con los resultados descritos en el documento JP-459555. Los autores escribieron que un periodo de incubación de las células tumorales de 20 min con el extracto descrito era suficiente para inducir muerte celular. Por otro lado, los compuestos de la presente invención parecen imponer alguna limitación fisiológica a las células, a las que se les debe dejar tiempo suficiente para detectar la restricción y suicidarse antes de que pueda producirse una necrosis incontrolada. La "muerte celular retardada" inducida por los compuestos se produjo en forma de apoptosis, que es una manera favorable de eliminar células que ya no son viables, ya que evita la liberación no regulada de contenidos celulares en los tejidos circun-
dantes.
En una realización preferida para los compuestos según la invención, la "muerte celular retardada" inducida por los compuestos puede antagonizarse mediante la adición de niacinamida, como puede observarse en las Figuras 3A a 3H, del mismo modo que para 6-Aminonicotinamida, Tiazofurina, Selenazofurina, Azaserina, 6-Diazo-5-oxo-L-norleucina y Doxorrubicina no se observa una influencia medible de la adición de nicotinamida sobre la acción de estos compuestos tóxicos sobre el crecimiento celular, mientras que puede antagonizarse el DCD desencadenado por, por ejemplo, K22339 y K22387, como se describe en el Ensayo de Reversibilidad de Nicotin-
amida.
El efecto de los compuestos sobre la síntesis de NAD(P) partiendo de niacinamida se investigó usando, por ejemplo, la línea celular tumoral HepG2 según la técnica descrita en la parte experimental a continuación. Como se muestra en la Tabla 3a, los ejemplos de los compuestos según la invención inhibían casi completamente la síntesis de novo de NAD(P) a partir de su precursor niacinamida. Los compuestos tóxicos enumerados en la Tabla 3b mostraron una escasa o ninguna influencia sobre la síntesis de novo de NAD(P) a partir de su precursor niacinamida, ya que la inhibición máxima relativa al control siempre era inferior al 30%.
TABLA 3a
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TABLA 3b
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La inhibición de la síntesis de NAD(P) a partir de niacinamida por estos compuestos se investigó en células HepG2 como se describe en la sección de "Materiales y Procedimientos". Los compuestos de la Tabla 3a se usaron a una concentración de 10^{-5} M. Los compuestos de la Tabla 3b se usaron a concentraciones de al menos 10^{-5} M, excepto para Doxorrubicina, en la que la concentración fue de 0,3 X 10^{-5} M. Como control, se usaron células tratadas o no tratadas con vehículo.
En estos experimentos, se usó un periodo de preincubación de 17 h con los compuestos, pero resultó que el periodo de preincubación podía acortarse, por ejemplo hasta 2 h, u omitirse completamente sin afectar al perfil de inhibición. Análisis adicionales de los metabolitos de niacinamida radiomarcados revelaron que los compuestos bloqueaban exclusivamente la formación del mononucleótido de niacinamida. La Figura 4 muestra cromatogramas representativos de metabolitos de [^{14}C]-niacinamida extraídos de células HepG2 tratadas con vehículo y con K22234. Se obtuvieron resultados similares con los otros compuestos específicos.
Comparando los dos cromatogramas de la Figura 4, es claramente evidente que los compuestos inhibían la síntesis de NAD(P) a partir de su precursor niacinamida. La niacina radiomarcada observada en el extracto de las células tratadas con vehículo y con compuesto se obtuvo como resultado de la desamidación enzimática de [^{14}C]-niacinamida. Los picos de NAD y niacina en los cromatogramas están muy próximos, pero los inventores verificaron la identificación mediante el segundo sistema de cromatografía en capa fina, como se describe en la sección de "Materiales y Procedimientos". Puesto que no se detectó acumulación del mononucleótido de niacinamida intermedio en las células tratadas con compuesto, los compuestos inhiben la biosíntesis de NAD(P) en la etapa de formación del mononucleótido de niacinamida. Por lo tanto, los compuestos inhiben la enzima niacinamida pirofosfato fosforribosil transferasa ([EC 2.4.2.12], NAPRT; un segundo nombre de esta enzima es niacinamida mononucleótido pirofosforilasa). La realización del mismo tipo de experimentos usando [^{14}C]-niacina en lugar de [^{14}C]-niacinamida como precursor reveló que los compuestos no bloquean la síntesis de NAD(P) a partir del precursor niacina en células que pueden usar la ruta de la niacina. La observación de que la ruta de la niacina de la síntesis de NAD(P) no se bloquea por los compuestos hace poco probable que los compuestos inhiban la ruta que parte del triptófano.
El efecto de los compuestos sobre la enzima niacinamida fosforribosiltransferasa (NAPRT, EC 2.4.2.12) se investigó usando, por ejemplo, la fracción citoplasmática tratada con protamina de células K-562 como fuente de enzima según el ensayo de NAPRT descrito en la parte experimental a continuación. Los compuestos investigados se usaron en concentraciones de 10 \muM, excepto para K22387 y K22133, en los que la concentración fue de 1 \muM.
El ensayo se basa en la cantidad de incorporación radiactiva a partir de niacinamida marcada con ^{14}C en el mononucleótido de niacinamida (NAM). Posteriormente, la NAM se separa de la niacinamida (NA) mediante cromatografía en capa fina y se determina su cantidad por autorradiografía. Como se muestra en la Tabla 4, los compuestos inhibían completamente la síntesis de novo de NAD(P) a partir de su precursor niacinamida.
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TABLA 4
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En la siguiente Tabla 5 se muestra un resumen de los resultados de los ejemplos de los compuestos según la presente invención junto con los resultados obtenidos para la citostática tóxica conocida previamente. Como puede observarse claramente, todos los ejemplos ensayados cumplían los límites requeridos.
TABLA 5 Resumen de los resultados para los compuestos tóxicos ensayados junto con los resultados para los ejemplos de los compuestos según la presente invención (n.e.: no ensayado)
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Antes de la llegada de la presente invención, no se habían descrito compuestos que inhibieran exclusivamente la síntesis de NAD(P) en esta etapa. Por consiguiente, este modo de acción es totalmente diferente del propuesto por Morton (Nature 181: 540-543, 1958) para terapia tumoral. Propuso inhibir la enzima NAD pirofosforilasa, pero la inhibición de esta enzima bloquearía la síntesis de NAD(P) a partir de los tres precursores (niacinamida, niacina y triptófano, compárese la Figura 1). Fue absolutamente sorprendente que la inhibición de la síntesis de NAD en la etapa de la formación del mononucleótido de niacinamida en la ruta de la niacinamida fuera suficiente para destruir la mayoría de las células tumorales. Los presentes compuestos son las primeras herramientas que investigan la importancia de la ruta de la niacinamida en las células tumorales. Los presentes inventores descubrieron que la mayoría de las células tumorales, por ejemplo, HepG2 (carcinoma hepático), U-87 MG (glioblastoma, astrocitoma), U-373 MG (glioblastoma, astrocitoma), Caki-1 (carcinoma renal de células claras), KG-1a (leucemia mielogénica), HL-60 (leucemia promielocítica), A549 (carcinoma pulmonar), MCF-7 M1 (carcinoma mamario), PC3 (carcinoma prostático), pueden utilizar solamente la ruta de la niacinamida para la síntesis de NAD(P). A partir de este descubrimiento se deduce que estos compuestos pueden usarse para la terapia de los cánceres correspondientes (por ejemplo, de mama, próstata, pulmón, colon, cuello del útero, ovario, piel, CNS, vejiga, páncreas y leucemia y linfoma). Las líneas celulares anteriores son conocidas y están disponibles en el mercado.
Además, bloquear únicamente la ruta de la niacinamida protege a las células que también pueden usar niacina o triptófano como precursores del efecto de los compuestos. Estas células son típicamente células somáticas sanas, por ejemplo, células hepáticas, células de Kupffer, células del epitelio pulmonar, células del epitelio renal, linfocitos, células epiteliales del colon o fibroblastos dérmicos. Con respecto a los efectos secundarios, esta inhibición de esencialmente sólo la ruta de la niacinamida es enormemente ventajosa para el tratamiento del cáncer.
Para la detección de inhibidores específicos de la formación del mononucleótido de niacinamida, es especialmente útil el siguiente ensayo de exploración que comprende las siguientes etapas: incubar células cultivadas seleccionadas de entre células HepG2, células U-87 MG, células MCF-7 M1, células Caki-1, células HL-60, células PC3, células U-373 MG, células A549 y células KG-1a en presencia de [^{14}C]-niacinamida y de un compuesto a ensayar para determinar su actividad para inhibir la formación celular de mononucleótido de niacinamida; efectuar la lisis de las células; aislar y separar los compuestos marcados con [^{14}C] y medir la cantidad de mononucleótido de niacinamida, NAD y NADP marcados formados. Más concretamente, las células cultivadas se siembran en placas de cultivo a una densidad definida, seguido de la incubación en presencia de un compuesto de ensayo y de la adición de [^{14}C]-niacinamida durante aproximadamente 0,1 a 6 h. Después, las células se lisan con ácido perclórico y se neutraliza el extracto resultante. Finalmente, los compuestos marcados con [^{14}C] se separan mediante cromatografía en capa fina sobre matrices de celulosa seguido de detección UV y autorradiografía. Se usan derivados no radiactivos de niacinamida como patrones. Este ensayo permite una exploración y selección sencilla y eficaz de los compuestos según la invención.
La presente invención también proporciona un procedimiento para ensayar la dependencia de un tipo celular dado de niacinamida como precursor para la síntesis de NAD. Este procedimiento permite determinar qué tipos celulares (malignos) son particularmente sensibles a los compuestos según la invención y puede ser útil para desarrollar un régimen adecuado para combatir diversos tumores. Por consiguiente, dicho ensayo comprenderá incubar las células a ensayar con un compuesto según la invención en un medio que contiene solamente niacinamida como precursor de la síntesis de NAD; y realizar un ensayo de citotoxicidad después del periodo de incubación. Dicho ensayo de citotoxicidad puede ser, por ejemplo, el "ensayo de alta densidad celular" descrito en la parte
experimental.
En una realización preferida de la invención, puede usarse el ensayo denominado en la Sección de Ejemplos como Ensayo de Reversibilidad de Nicotinamida para la detección de inhibidores específicos de niacinamida fosforribosiltransferasa (NAPRT).
En una realización preferida de la invención, puede usarse el ensayo denominado en la Sección de Ejemplos como Ensayo de Niacinamida Fosforribosiltransferasa (NAPRT) para la detección de inhibidores específicos de niacinamida fosforribosiltransferasa (NAPRT).
Ejemplos Materiales y Procedimientos Reactivos
Tripsina/EDTA:
Tripsina a 0,05% (p/v) (Difco, Detroit, Estados Unidos) + EDTA a 0,016% (p/v) (Sigma, Deisenhofen, Alemania).
[^{14}C]-Niacinamida:
ARC794, American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, Estados Unidos, 0,25 mCi/ml; actividad específica 50 mCi/mmol.
Tampón de lisis:
Ácido perclórico 0,5 M (Merck, Darmstadt, Alemania).
Reactivo de Neutralización:
Cloruro potásico 0,5 mM, hidróxido potásico 2,0 M, disueltos en agua purificada. Los compuestos químicos se obtuvieron de Merck, Darmstadt, Alemania.
Láminas de TLC:
Celulosa F, Art. 1.05565, Merck, Darmstadt, Alemania Poli(etilenoimina) Celulosa F, Art. 1.05579, Merck Darmstadt, Alemania.
Disolventes de TLC:
Cloruro de litio 0,05 M o 3 partes de acetato amónico 1 M a pH 5,0 + 7 partes de etanol (Merck, Darmstadt, Alemania).
Patrones:
Se prepararon soluciones de 10 a 20 mg/ml de los siguientes derivados de niacinamida: niacina, niacinamida, mononucleótido de niacina (dNAM), mononucleótido de niacinamida (NAM), dinucleótido de niacina adenina (dNAD), dinucleótido de niacinamida adenina (NAD), fosfato de dinucleótido de niacinamida adenina (NADP). Todos los patrones se adquirieron de Sigma, Deisenhofen, Alemania.
Solución de TCA:
500 g de ácido tricloroacético, disuelto en H_{2}O a 2:1 (25% p/v).
Tampón Tris 10 mM:
121,1 mg de trishidroximetilaminometano (Sigma, Deisenhofen, Alemania) disueltos en 100 ml de H_{2}O, ajustado a pH = 10,4 con NaOH.
Solución de SRB:
400 mg de sulforrodamina B (Sigma, Deisenhofen, Alemania), disueltos en 100 ml de ácido acético al 1% (v/v).
Compuestos de ensayo:
Se sintetizaron compuestos K22 por el departamento de química de Klinge Pharma GmbH, Munich, Alemania.
Soluciones madre:
Se preparó una solución 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) y se almacenó a -18ºC; se realizaron etapas de dilución adicionales en etanol.
Línea celular:
Se obtuvo la línea celular tumoral HepG2 derivada de seres humanos (carcinoma hepático) de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, Maryland, Estados Unidos.
Medio de cultivo Medio Esencial Mínimo Mejorado de Richter, Opción con Cinc
(IMEM-ZO), se adquirió en Gibco BRL, Life Technologies (Eggenstein, Alemania) (Richter, A., Sanford, K. K. y Evans, V. J. (1972), J. Natl. Cancer Inst. 49: 1705-1712). Se disolvió el medio en polvo en agua desionizada, se ajustó el pH a 7,2 con HCl/NaOH y se esterilizó por filtración. El medio se suplementó con suero bovino fetal al 5% o a 10% (FCS), PAN Systems GmbH, Aidenbach, Alemania; insulina 100 \mug/l (Boehringer Mannheim, Alemania) y penicilina 50.000 IU/l + estreptomicina 50 mg/l (Sigma, Deisenhofen, Alemania).
IMEM-ZO tamponado con HEPES: Se usó este medio para la incubación de células HepG2 con el precursor radiomarcado. Al contrario que el IMEM-ZO de Richter descrito anteriormente, no contenía niacinamida, NaHCO_{3} ni FCS. Este medio se preparó específicamente por Gibco BRL, Life Technologies (Eggenstein, Alemania). El medio se tamponó con HEPES 20 mM (Sigma, Deisenhofen, Alemania) y el pH se ajustó a 7,2. El medio se esterilizó por filtración.
Determinación de la síntesis de NAD(P) a partir de [^{14}C]-niacinamida Cultivo celular
Las células se despegaron de matraces de 75 cm^{2} retirando el medio de cultivo y añadiendo 3 ml de una solución de tripsina/EDTA a cada matraz. Después de aproximadamente 5 minutos de incubación a 37ºC, cuando las células se despegaron de la superficie de las placas, se detuvo la tripsinización añadiendo 3 ml de medio IMEM-ZO de Richter que contenía FCS a 10%. Las células se suspendieron mediante pipeteo repetido. Para una predilución, se añadió una alícuota de 20 \mul a 10 ml de solución isotónica de Casyton (Nº 04390037P, Schärfe System, Reutlingen, Alemania) usando un Sysmex AutoDilutor Type AD-260 (Toa, Medical Electronics Co. Ltd., Kobe, Japón). Se determinó el número de células mediante mediciones electrónicas del volumen celular y recuento con un CASY 1 Cell Counter + Analyzer System, Model TTC (Schärfe System, Reutlingen, Alemania) equipado con un capilar de 60 \mum. Después de la dilución en IMEM-ZO que contenía FCS a 10%, las células se sembraron finalmente a una densidad de 4 x 10^{6}/10 ml por muestra en placas de cultivo tisular de 10 cm de diámetro (Greiner, Frickenhausen, Alemania) y se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5% en aire.
Después de un día, cuando las células se adhirieron a las placas, los cultivos se rellenaron con IMEM-ZO que contenía FCS al 5% más el compuesto de ensayo o el vehículo. Las concentraciones de disolventes orgánicos en el medio después de la adición del compuesto de ensayo no excedían del 0,1% en ningún caso. Después, las células se incubaron a 37ºC durante 17 horas en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5% en aire. Este periodo de preincubación no es necesario para conseguir una acción inhibitoria clara de los compuestos y puede acortarse, por ejemplo, a 2 ó 0 horas. Después de este periodo de tiempo, el medio se retiró de nuevo y se añadieron 4 ml de IMEM-ZO tamponado con HEPES que contenía el compuesto de ensayo o el vehículo y [^{14}C]-niacinamida 0,5 mCi/ml a cada cultivo durante 5 horas más a 37ºC y 100% de humedad. Justo antes de recoger las células con un con raspador de células y de transferirlas a tubos de polipropileno de 15 ml, se tomó una alícuota de 100 \mul del medio de incubación para determinar la radiactividad. Las placas de cultivo se aclararon con 4 ml de solución salina suplementada con niacinamida 10 mM y se combinaron las soluciones con la suspensión celular respectiva. Las células se recogieron por centrifugación a 250 g durante 5 minutos a 4ºC.
Extracción de nucleótidos de piridina
Se extrajeron los nucleótidos de piridina mediante una modificación del procedimiento de Chatterjee y col. (Chatterjee, S., Hirschler, N. V., Petzold, S. J., Berger, S. J. y Berger, N. A. (1989) Mutant Cells Defective in Poly(ADP-ribose) Synthesis due to Stable Alterations in Enzyme Activity or Substrate Availability. Exp. Cell Res. 184: 1-15). En resumen, cada sedimento celular se suspendió en 200 \mul de ácido perclórico 0,5 M enfriado en hielo y se incubó en hielo durante 20 minutos. Después de este periodo de tiempo, los extractos ácidos se neutralizaron añadiendo 55 \mul de una solución de KCl/KOH y se centrifugaron a 2500 g durante 10 minutos a 4ºC. Se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -20ºC hasta la separación por cromatografía. Se tomó una alícuota de 10 \mul de cada sobrenadante para medir la cantidad total de radiactividad en el extracto celular.
Cromatografía en capa fina
Los componentes marcados con ^{14}C de los extractos celulares se separaron e identificaron usando dos sistemas de cromatografía en capa fina (TLC). Se transfirieron 2 \mul de cada extracto celular a una lámina de TLC de celulosa y poli(etilenoimina) (PEI) celulosa usando un DC-Probenautomat III (CAMAG, Muttenz, Suiza). Las láminas de celulosa se revelaron usando acetato de NH_{4} 1 M:etanol (3:7) como disolvente (Pinder, S., Clark, J. B. y Greenbaum, A. L. (1971) The Assay of Intermediates and Enzymes Involved in the Synthesis of the Nicotinamide Nucleotides in Mammalian Tissues. Methods in Enzymology. Academic Press, Nueva York. Vol. XVIIIB págs. 20-46). Las placas de celulosa PEI se revelaron con cloruro de litio 0,05 M (Barton, R. A., Schulman, A., Jacobson, E. L. y Jacobson, M. K. (1977) Chromatographic Separation of Pyridine and Adenine Nucleotides on Thin Layers of Poly(ethyleneimine) Cellulose. J. Chromatogr. 130: 145-150)
Los cromatogramas se realizaron con patrones no radiactivos añadidos de NAD, NADP, NAM, dNAM, dNAD, niacina y niacinamida, y las manchas se identificaron por absorción de UV. Véase la Tabla 6 para los valores de R_{F}. Los resultados se expresan como media \pm D.T. Para la autorradiografía, los cromatogramas se expusieron a una placa de formación de imágenes BAS-IIIs (Fuji Photo Film Co., Ltd., Japón) en un casete de revelado Hypercassette (Amersham Buchler GmbH & Co. KG, Braunschweig, Alemania) durante al menos dos días. Para evitar la actividad de fondo, el casete se colocó en una caja de plomo. Después de la exposición, la placa de formación de imágenes se leyó en el analizador de formación de imágenes biológicas FUJIFILM BAS1500 (Fuji Photo Film Co., Ltd., Japón). La porción de cada componente marcado con [^{14}C] en los extractos celulares se determinó como porcentaje de la radiactividad total con el programa informático TINA 2.0 (raytest Isotopenmessgeräte GmbH, Straubenhardt, Alemania).
TABLA 6 Valores R_{F} para NAD, NADP, NAM, dNAM, dNAD, niacina y niacinamida
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La cantidad de derivados marcados con ^{14}C se calculó multiplicando la radiactividad total del extracto celular por el porcentaje recuperado en cada derivado. Los resultados del ensayo mostrados en la Tabla 3a y en la Tabla 3b anteriores se expresan como pmol de [^{14}C]-NAD(P) por 10^{6} células y como pmol de [^{14}C]-NAD(P) por mg de proteína. El recuento celular y las proteínas celulares se determinaron a partir de cultivos preparados en paralelo sin precursores radiactivos.
Determinación de proteínas
La proteína celular se determinó con el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) adquirido en Pierce, Rockford, IL, Estados Unidos, según las instrucciones del fabricante. El color de las muestras producido por la reacción se midió por espectrofotometría (COBAS FARA //, F. Hoffmann-La Roche AG, Basel, Suiza).
Determinación del crecimiento celular en condiciones de alta densidad (Ensayo de SRB) Cultivo celular
Las células se despegaron de los matraces de 75 cm^{2} retirando el medio de cultivo y añadiendo 3 ml de una solución de tripsina/EDTA a cada pocillo. Después de una incubación de 5 minutos a 37ºC, cuando las células se despegaron de la superficie de las placas, se detuvo la tripsinización añadiendo 3 ml de medio IMEM-ZO de Richter que contenía FCS a 10%. Las células se suspendieron mediante pipeteo repetido. Para una predilución, se añadió una alícuota de 20 \mul a 10 ml de solución isotónica de Casyton (Nº 043-90037P, Schärfe System, Reutlingen, Alemania) usando un Sysmex AutoDilutor Type AD-260 (Toa, Medical Electronics Co. Ltd., Kobe, Japón). Se determinó el número de células mediante mediciones electrónicas del volumen celular y recuento con un CASY 1 Cell Counter + Analyzer System, Model TTC (Schärfe System, Reutlingen, Alemania) equipado con un capilar de 60 \mum. Después de la dilución en medio de cultivo las células se sembraron finalmente a una densidad de 200.000 células por ml y pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos (Greiner, Frickenhausen, Alemania). Además, Se incubaron tres pocillos de control negativo en medio de cultivo sin células.
Después de un día, cuando las células se adhirieron a las placas, los cultivos se rellenaron con medio fresco que contenía FCS al 5% más diferentes concentraciones de los compuestos de ensayo o del vehículo. Se prepararon muestras por triplicado de cada concentración y las células se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5% en aire. La concentración de disolventes orgánicos en el medio después de la adición de los compuestos de ensayo no excedió del 0,1% en ningún caso.
Ensayo de sulforrodamina B (SRB)
La determinación del crecimiento celular se realizó mediante tinción inespecífica de proteínas con sulforrodamina B según Skehan y col. (Skehan, P. y col. (1990) New Colorimetric Cytotoxicity Assay for Anticancer-Drug Screening. J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112).
El periodo de incubación de las células con el fármaco se detuvo mediante la adición de 250 \mul de una solución de TCA enfriada en hielo al medio de cultivo. Después de una hora de incubación en la nevera, se eliminó el sobrenadante, se aclararon las placas cinco veces con agua desionizada, se secaron a temperatura ambiente (RT) y finalmente se almacenaron en la nevera hasta la tinción. Se pipetearon 0,5 ml de una solución de SRB en cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos; después de esto, se decantó la solución de tinción, se lavaron las placas cuatro veces con ácido acético al 1% (v/v) y se secaron de nuevo a temperatura ambiente. La tinción de SRB unida inespecíficamente a proteína se liberó añadiendo 1 ml de tampón Tris 10 mM por pocillo y agitando suavemente durante 5 minutos. Se transfirieron alícuotas de 100 \mul de cada pocillo a una placa de microtitulación de 96 pocillos y se midió la extinción de luz a 490 nm o a 515 nm de longitud de onda en un lector de ELISA (Bio-Tek, Deelux, Gödensdorf, Alemania). Se restó el valor medio de los pocillos de control negativo de las lecturas de las muestras de ensayo.
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Ensayo de Reversibilidad de Nicotinamida
Se sembraron en placas células HepG2 obtenidas de un carcinoma hepático humano a una densidad de 20.000 células/ml en placas de plástico de 12 pocillos. Se realizó el cultivo en medio nutritivo IMEM-ZO de Richter con suero bovino fetal al 5% (FCS) en un incubador de cultivos tisulares con una mezcla de gases de CO_{2} al 5% y aire a 95% a una temperatura de 37ºC. Un día después de la siembra, se aspiró el medio de cultivo de las células y se reemplazó por medio fresco que contenía las concentraciones respectivas de los compuestos de ensayo y de la nicotinamida cuando fuera aplicable. Para las concentraciones individuales y los controles sin compuestos de ensayo, se realizaron tres lotes de cada. Tres días después del comienzo del tratamiento, se renovó de nuevo el medio con los compuestos de ensayo y con la nicotinamida cuando fuera aplicable. Después de seis días de la incubación de compuestos, se finalizó el ensayo y se determinó la cantidad de proteína en los pocillos individuales mediante el procedimiento de la sulforrodamina B (según P. Skehan y col.: New Colorimetric Cytotoxicity Assay for Anticancer-Drug Screening. J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112, 1990). Se obtuvieron los valores de la CI_{50} a partir de las curvas de respuesta a la dosis y se proporcionaron como una medición comparativa de la actividad de los compuestos de ensayo.
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Ensayo de Niacinamida Fosforribosiltransferasa (NAPRT) Materiales y Procedimientos Línea celular
La línea celular humana K-562 (leucemia mielógena crónica) se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC CCL 243), Rockville, Maryland, Estados Unidos. Las células K-562 se cultivan en RPMI (Sigma, Deisenhofen, Alemania, Producto Nº: R6504) que contiene suero bovino fetal a 10% (PAN Systems GmbH, Aidenbach, Alemania), NaHCO_{3} 2,2 g/l (Merck, Darmstadt, Alemania), penicilina 50.000 IU/l y estreptomicina 50 mg/l (Sigma).
Matraces de cultivo celular:
{}\hskip1cm Se adquirieron dos tamaños de matraces de cultivo celular en Greiner, Frickenhausen, {}\hskip1cm Alemania: 75 cm^{2} (Producto Nº: 658 175) y 182 cm^{2} (Producto Nº: 660 175).
Tubos:
Tubos Eppendorf de 2 ml (Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg Alemania, Producto Nº: 0030 120.094). Tubos de polipropileno de 15 ml (Greiner, Producto Nº: 188 271). Tubos de polipropileno de 50 ml (Greiner, Producto Nº: 210 270).
Centrífugas:
Megafuge 1.0 (Heraeus Sepatech, Munich, Alemania).
\quad
Allegra 64R (Beckman Coulter, Munich, Alemania).
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Reactivos
CMF-PBS:
Se prepara una solución salina tamponada con fosfato sin Ca^{2+} ni Mg^{2+} como se indica a continuación: Solución A: 1 g de KH_{2}PO_{4} (Producto Nº: 4873.0250), 40 g de NaCl (Producto Nº: 6400), 1 g de KCl (Producto Nº: 4933) y 5,75 g de Na_{2}HPO_{4} x 2H_{2}O (Producto Nº: 6580) se disuelven en 400 ml de agua purificada. Todos los compuestos químicos se obtienen en Merck. Solución de Trabajo: 320 ml de solución A, 133,4 mg de sulfato de gentamicina, 606,1 mg de penicilina G a 4:1 en agua purificada. El pH se ajusta a 7,2 y la solución se esteriliza por filtración.
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Tampón de lisis:
NaH_{2}PO_{4} 0,01 M x H_{2}O (Merck, Producto Nº: 6346), pH 7,4, (PM = 137,99, 1,38 g/l de agua purificada).
Sulfato de protamina:
Sulfato de protamina al 1% p/v (Sigma, Producto Nº: P4020), (100 mg/10 ml de agua purificada). La solución se almacena a temperatura ambiente.
El agua se purifica con el sistema Milli-Q UF Plus (Millipore, Eschborn, Alemania).
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Procedimiento
Las células K-562 se cultivan en RPMI suplementado con FCS a 10% a 37ºC y 100% de humedad en una atmósfera de CO_{2} al 5% a una densidad de hasta 2 x 10^{6} células por ml. En estas condiciones, las células presentan un crecimiento logarítmico con un tiempo de generación de 24 horas. Las células se recogen por aspiración y centrifugación (250 x g, 10 min, RT). Después de esto, las células se lavan al menos 3 veces mediante centrifugación repetida (250 x g, 10 min, RT) y resuspensión en CMF-PBS. Después de hacer un recuento de la suspensión celular en un hematocitómetro, se centrifugan las células en un sedimento compacto (390 x g, 10 min, RT) y se seca el sobrenadante cuidadosamente retirándolo con una pipeta Pasteur. Después las células se agitan vorticialmente en suspensión en tampón de lisis suficiente para dar una concentración final de 3 x 10^{7} células por ml. La suspensión se congela a -80ºC durante al menos un día y se descongela lentamente a temperatura ambiente para romper las células. La ruptura es habitualmente superior a 95%, determinada por exclusión de azul tripán. Después de la centrifugación a 23.000 x g durante 90 min a 0ºC, se recupera el sobrenadante clarificado en hielo y se añaden 70 \mul de sulfato de protamina al 1% por ml de sobrenadante. Después de 15 min en hielo, la suspensión turbia se centrifuga 30 min más a 23,000 x g y 0ºC. El sobrenadante final se almacena en pequeñas alícuotas a -80ºC. Este sobrenadante contiene de aproximadamente 950 a 1440 \mug de proteína por ml. Se usan de 120 a 140 \mug de proteína por muestra en el ensayo de NAPRT (volumen de ensayo total: 0,5 ml).
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Ensayo enzimático Materiales
Bloques térmicos:
Grant QBT 1 (RT-150ºC) con inserciones de aluminio para tubos Eppendorf de 2 ml QB-E2 (CLF, Emersacker, Alemania).
Centrífuga:
Minifuge T (Heraeus Sepatech).
Tubos:
Tubos Eppendorf de 2 ml (Eppendorf-Netheler-Hinz, Producto Nº: 0030 120.094). Viales de polipropileno de 250 \mul de cuello de rosca (Waters, Eschborn, Alemania, Producto Nº: WAT094172) con tapón (Producto Nº: WAT094174).
Contador beta:
Liquid scintillation analyser 2500 TR (Canberra-Packard, Dreieich, Alemania).
Fluido de centelleo:
Ultima Gold MV (Canberra-Packard).
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Reactivos
ATP:
Adenosina trifosfato 20 mM (Sigma, Producto Nº: A7699), (PM = 551,1, 110,2 mg/10 ml de agua purificada). La solución se almacena a -20ºC.
PRPP:
Pirofosfato de fosforribosilo 5 mM (aproximadamente a 80%, Sigma, Producto Nº: P8296), (PM = 390,1, 25 mg/10,25 ml de agua purificada). La solución se almacena a -70ºC.
MgCl_{2}:
MgCl_{2} x 6 H_{2}O 500 mM (Sigma, Producto Nº: M0250), (PM = 203,3, 10,17 g/100 ml de agua purificada). La solución se almacena a 4ºC.
Tampón Tris:
TRIS 250 mM-HCl a pH 8,8 (Preajustado a pH 8,6, Sigma, Producto Nº: T5503), (PM = 129,6, 3,24 g/100 ml de agua purificada). La solución se almacena a 4ºC.
[^{14}C]-Niacinamida:
0,25 mCi/ml (American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, Estados Unidos, Producto Nº: ARC 794, actividad específica: 50 mCi/mmol). La solución madre tiene una concentración de 5 x 10^{-3} M de niacinamida y se diluye con agua purificada para dar la concentración deseada.
Niacinamida:
Niacinamida 100 mM (Sigma, Producto Nº: N0636), (PM = 1221, 1,22 g/100 ml de agua purificada). La solución se almacena a -20ºC.
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Procedimiento
La actividad de la niacinamida fosforribosiltransferasa se determina en una solución de reacción de 0,5 ml que consiste en MgCl_{2} 5 mM, ATP 2 mM, PRPP 0,5 mM, y [^{14}C]-niacinamida (10^{-5} M a 10^{-7} M) en tampón Tris 50 mM a pH 8,8 (concentraciones finales en el ensayo). La reacción se inicia añadiendo de 100 a 120 \mul de extracto celular. Después de la incubación durante 1 hora a 37ºC, se detiene la reacción enzimática añadiendo niacinamida fría (50 \mul de una solución de niacinamida 100 mM por 0,5 ml de mezcla de reacción) y calentando en un bloque térmico (2 min, 105ºC). El precipitado se retira por centrifugación (2.500 x g, 10 min, 4ºC) y el sobrenadante se recoge en un vial de polipropileno de 250 \mul con tapón de rosca y se almacena a -20ºC hasta su posterior análisis. Se toma una alícuota de 10 \mul del sobrenadante para determinar la cantidad total de radiactividad.
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Cuantificación de los compuestos marcados con ^{14}C Materiales
DC-Probenautomat III de muestras automático (CAMAG, Muttenz, Suiza).
Analizador de formación de imágenes biológicas:
{}\hskip0.9cm FUJIFILM BAS-1500 (Fuji Photo Film Co., Ltd., Japón).
Placa de formación de imágenes:
BAS-IIIs (Fuji Photo Film Co., Ltd.).
Casete de revelado Hypercassette:
(Amersham Buchler GmbH & Co. KG, Braunschweig, Alemania)
Láminas de TLC:
Celulosa F 20 x 20 cm (Merck, Producto Nº: 1.05565).
Cámaras de TLC:
Cámaras de vidrio 22 x 22 x 12 cm (Desaga, Heidelberg, Alemania)
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Reactivos
Disolvente de TLC:
3 partes de acetato amónico 1M (Sigma, Producto Nº: A7330) a pH 5,0 + 7 partes de etanol absoluto (Merck, Producto Nº: 1.00983).
Patrones:
Se prepararon soluciones a 20 mg/ml de los siguientes derivados de niacinamida: niacinamida, mononucleótido de niacinamida, dinucleótido de niacinamida adenina, fosfato de dinucleótido de niacinamida adenina. Todos los patrones se adquirieron en Sigma.
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Procedimiento
Los componentes marcados con ^{14}C de la mezcla de reacción se separan y se identifican usando cromatografía en capa fina (TLC). Se transfieren de 5 a 7,5 \mul de cada muestra a una lámina de celulosa de TLC aplicador de muestra automático. La lámina de celulosa se revela usando acetato de NH_{4} 1 M:etanol (3:7) como disolvente. Se realizó el cromatograma con adición de patrones no radiactivos de NAD, NADP, NAM y niacinamida, y se identificaron las manchas mediante absorción UV (véanse los valores R_{F} en la Tabla 7). Para la autorradiografía, se expuso el cromatograma en una placa de formación de imágenes BAS-IIIs en un casete de revelado Hypercassette durante al menos dos días. Para evitar una elevada actividad de fondo, el casete se colocó en una caja de plomo. Después de la exposición, se leyó la placa de formación de imágenes en un analizador de formación de imágenes biológicas FUJIFILM BAS-1500. Se determinó la porción de cada componente marcado con ^{14}C en la muestra como un porcentaje de la radiactividad total con el programa informático TINA 2.0 (raytest Isotopenmessgeraete GmbH, Straubenhardt, Alemania). La cantidad de derivados marcados con ^{14}C se calcula multiplicando la radiactividad total del extracto celular por el porcentaje recuperado de cada derivado.
TABLA 7 Valores R_{F} de niacinamida y sus derivados. Los resultados se expresan como media \pm D.T. n se refiere al número de mediciones 
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16 
\vskip1.000000\baselineskip
Como procedimiento alternativo para la cuantificación de NAM, puede aplicarse la precipitación con acetona según la siguiente descripción:
Elliott y col. Anal. Biochem. 107: 199-205 (1980)
\bullet
Después de terminar el ensayo de NAPRT, retirar muestras de 50 \mul por duplicado de la mezcla de reacción para separar alícuotas de 2 ml de acetona. (Este procedimiento detendrá la reacción enzimática. No es necesaria ninguna adición más de niacinamida fría a la mezcla de reacción ni calentamiento a 100ºC.)
\bullet
Colocar para cada muestra filtros Whatman GF/A de 2,5 cm previamente empapados en acetona en un colector de succión.
\bullet
Aclarar el filtro una vez con 2 ml de acetona antes de hacer pasar la muestra a través del filtro. Mantener una succión suave de tal modo que los 2 ml de acetona pasen a través del filtro en 3 a 5 s.
\bullet
Mezclar la muestra (vorticialmente) y hacerla pasar a través del filtro.
\bullet
Aclarar el filtro dos veces con alícuotas de 2 ml de acetona.
\bullet
Proceder como se ha descrito anteriormente con la siguiente muestra.
\bullet
Transferir los filtros a viales de centelleo vacíos y dejarlos secar.
\bullet
Añadir 15 ml de fluido de centelleo y agitar vorticialmente los viales enérgicamente.
\bullet
Determinar la radiactividad en un contador beta.
\vskip1.000000\baselineskip
Bibliografía
Pinder, S., Clark, J. B. y Greenbaum, A. L. (1971) The Assay of Intermediates and Enzymes Involved in the Synthesis of the Nicotinamida Nucleotides in Mammalian Tissues. Methods in Enzymology. Academic Press, Nueva York. Vol XVIIIB págs. 20-46 Elliott, G. C., Rechsteiner, M.C. (1982) Evidence for a Physiologically Active Niacinamida Phosphoribosyltransferase in Cultured Human Fibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 104: 996-1002
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Abreviaturas
ATP
adenosina trifosfato
CMF-PBS
solución salina tamponada con fosfato sin Ca^{2+} ni Mg^{2+}
g
fuerza gravitatoria
Min
minutos
NAD
dinucleótido de niacinamida adenina
NADP
fosfato de dinucleótido de niacinamida adenina
NAM
mononucleótido de niacinamida
Pi, PPi
fosfato inorgánico
PRPP
pirofosfato de fosforribosilo
RT
temperatura ambiente
TLC
cromatografía en capa fina
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Forma de administración terapéutica
La producción de medicamentos con una cantidad de uno o más compuestos según la invención y/o su uso en la aplicación según la invención se produce de la manera habitual por medio de procedimientos de tecnología farmacéutica comunes. Para esto, los ingredientes activos como tales o en forma de sus sales se procesan junto con adyuvantes y vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables hasta formas medicinales adecuadas para las diversas indicaciones y tipos de aplicación. De este modo, los medicamentos pueden producirse de tal modo que se obtenga el respectivo índice de liberación deseado, por ejemplo, una liberación brusca rápida y/o un efecto sostenido o
prolongado.
Las preparaciones para uso por vía parenteral, a las que pertenecen las inyecciones e infusiones, están entre los medicamentos empleados por vía sistémica más importantes para el tratamiento de tumores así como para otras indicaciones.
Preferiblemente, se administran inyecciones para el tratamiento de tumores. Éstas se preparan en forma de viales o también como las denominadas preparaciones de inyección listas para usar, por ejemplo como jeringas listas para usar o jeringas de un solo uso junto con frascos de tapón perforable para múltiples extracciones. La administración de las preparaciones de inyección se produce mediante aplicación por vía subcutánea (s.c.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.) o intracutánea (i.c.). Las respectivas formas de inyección adecuadas pueden producirse especialmente como soluciones, suspensiones cristalinas, sistemas de dispersión nanoparticular o coloidal, tal como, por ejemplo, hidrosoles.
Las formulaciones inyectables pueden producirse también también como polvos, como, por ejemplo, liofilizados, que después preferentemente se disuelven o dispersan inmediatamente antes de la aplicación con diluyentes adecuados. Las infusiones pueden formularse también en forma de soluciones isotónicas, emulsiones grasas, formulaciones de liposomas, microemulsiones y líquidos basados en micelas mixtas, por ejemplo, basados en fosfolípidos. Como con las preparaciones para inyección, las formulaciones para infusión pueden prepararse también en forma de concentrados para diluir. Las formulaciones inyectables pueden aplicarse también en forma de infusiones continuas estacionarias o en terapia externa, por ejemplo, en forma de mini-bombas.
Puede añadirse albúmina, expansores plasmáticos, compuestos tensioactivos, disolventes orgánicos, compuestos modificadores del pH, compuestos formadores de complejos o compuestos poliméricos a las formas medicinales parenterales, especialmente como compuestos para modificar la adsorción de los ingredientes activos a proteínas o polímeros o también con el objetivo de disminuir la adsorción del ingrediente activo a materiales tales como los instrumentos de inyección o los materiales de envasado, por ejemplo plástico o vidrio.
Los ingredientes activos pueden estar unidos a nanopartículas en las preparaciones para uso parenteral, por ejemplo, en partículas finamente dispersas basadas en poli(met)acrilatos, poliacetatos, poliglicolatos, poliaminoácidos o polieteruretanos. Las formulaciones parenterales también pueden modificarse de manera constructiva como preparaciones de liberación prolongada, por ejemplo, según el principio de la unidad múltiple, en el que se incorporan los ingredientes activos en una forma suspendida muy finamente distribuida y/o dispersa o como suspensiones cristalinas, o según el principio de la unidad única, en el que el ingrediente activo se incluye en una forma medicinal, por ejemplo, un comprimido o una semilla que posteriormente se implanta. Con frecuencia, estos implantes o medicamentos de liberación prolongada en formas medicinales de unidad única y de unidad múltiple, consisten en los denominados polímeros biodegradables, tales como, por ejemplo, polieteruretanos de ácido láctico y glicólico, polieteruretanos, poliaminoácidos, poli(met)acrilatos o polisacáridos.
Son adecuados como adyuvantes y vehículos en la producción de preparaciones para uso parenteral agua esterilizada, compuestos modificantes del pH como, por ejemplo, ácidos o bases orgánicos o inorgánicos así como sus sales, compuestos tamponantes para ajustar el valor de pH, agentes de isotonicidad tales como, por ejemplo, cloruro sódico, carbonato monosódico, glucosa y fructosa, tensioactivos y/o compuestos tensioactivos y emulsionantes, tales como, por ejemplo, ésteres parciales de ácidos grasos de polioxietileno de sorbitán (Tween®) o, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos de polioxietileno (Cremophor®), ácidos grasos tales como, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite de ricino, ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como, por ejemplo, oleato etilo, miristato de isopropilo y aceite neutro (Miglyol®) así como adyuvantes de polímeros tales como, por ejemplo, gelatina, dextrano, polivinilpirrolidona, aditivos disolventes orgánicos que aumentan la solubilidad, tales como, por ejemplo, propilenglicol, etanol, N,N-dimetilacetamida, propilenglicol o compuestos formadores de complejos tales como, por ejemplo, citratos y urea, conservantes, tales como, por ejemplo benzoato hidroxipropilo y benzoato de hidroximetilo, alcohol bencílico, antioxidantes, tales como, por ejemplo, sulfito sódico y estabilizadores, tales como, por ejemplo
EDTA.
En suspensiones, la adición de agentes espesantes para evitar la sedimentación de los ingredientes activos de tensioactivos y peptizantes, para asegurar la capacidad del sedimento de agitarse, o formadores de complejos, tales como EDTA, resulta. Esto también puede conseguirse con los diversos complejos de agentes poliméricos, por ejemplo, con polietilenglicoles, poliestirol, carboximetilcelulosa, Pluronics® o ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol de sorbitán. El ingrediente activo puede incorporarse también en formulaciones líquidas en forma de compuestos de inclusión, por ejemplo con ciclodextrinas. Como adyuvantes adicionales, también son adecuados agentes de dispersión. Para la producción de liofilizados, pueden usarse también aditivos, como por ejemplo manitol, dextrano, sacarosa, albúmina humana, lactosa, PVP o variedades de gelatina.
En tanto en cuanto los ingredientes activos no se incorporen en las formulaciones líquidas medicinales en forma de una base, se usan en forma de sus sales de adición de ácidos, hidratos o solvatos en las preparaciones para uso parenteral.
Otra forma de aplicación sistémica de importancia es la administración por vía oral como comprimidos, cápsulas de gelatina duras o blandas, comprimidos recubiertos, polvos, gránulos, microcápsulas, comprimidos alargados, gránulos, comprimidos masticables, pastillas, caramelo o sobrecito. Estas formas sólidas de administración por vía oral pueden prepararse también como sistemas de acción sostenida y/o liberación prolongada. Entre éstos están medicamentos con una cantidad de uno o más ingredientes activos micronizados, difusiones y formas erosionables basadas en matrices, por ejemplo, usando grasas, compuestos de tipo cera y/o poliméricos o los denominados sistemas de depósito. Como agente retardante y/o agente para liberación controlada, los compuestos formadores de películas o de matrices, tales como, por ejemplo, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, derivados de poli(met)acrilato (por ejemplo Eudragit®), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa son adecuados en soluciones inorgánicas así como en forma de dispersiones acuosas. A este respecto, deben señalarse también las denominadas preparaciones bioadhesivas en las que se consigue un aumento del tiempo de retención en el cuerpo mediante el contacto intensivo con las membranas mucosas del cuerpo. Un ejemplo de polímero bioadhesivo es el grupo de Carbomers®.
Para la aplicación por vía sublingual, comprimidos, tales como por ejemplo comprimidos no disgregantes de forma alargada de un tamaño adecuado con una liberación lenta del ingrediente activo, son especialmente adecuados. Con el fin de una liberación dirigida de ingredientes activos en las diversas secciones del tracto gastrointestinal, se emplean mezclas de gránulos que se liberan en diversas localizaciones, por ejemplo, mezclas de gránulos solubles en fluidos gástricos y solubles en intestino delgado y/o resistentes en fluidos gástricos y solubles en intestino grueso. El mismo objetivo de liberación en diversas secciones del tracto gastrointestinal puede concebirse también mediante comprimidos laminados adecuadamente producidos con un núcleo, en los que el recubrimiento del agente se libera rápidamente en el fluido gastrointestinal y el núcleo del agente se libera lentamente en el entorno del intestino delgado. El objetivo de la liberación controlada en diversas secciones del tracto gastrointestinal puede conseguirse también mediante comprimidos multicapa. Las mezclas de gránulos con liberación de agentes diferencial pueden cargarse en cápsulas de gelatina duras.
Se usan agentes antiadherentes, lubricantes y separadores, agentes de dispersión tales como dióxido de silicio dispersado a la llama, disgregantes, tales como diversos tipos de almidón, PVC, ésteres de celulosa como agentes de granulación o retardantes, tales como compuestos de tipo cera y/o poliméricos basados en Eudragit®, celulosa o Cremophor®, como adyuvantes adicionales para la producción de comprimidos tal como por ejemplo comprimidos o cápsulas de gelatina duras y blandas así como comprimidos recubiertos y granulados.
Se usan antioxidantes, agentes edulcorantes, como por ejemplo, sacarosa, xilitol o manitol, enmascaradores del sabor, aromatizantes, conservantes, colorantes, compuestos tamponantes, agentes directos para la formación de comprimidos, tales como por ejemplo, celulosa microcristalina, almidón y almidones hidrolizados (por ejemplo Celutab®), lactosa, polietilenglicoles, polivinilpirrolidona y fosfato dicálcico, lubricantes, cargas, tales como lactosa o almidón, agentes aglutinantes en forma de lactosa, variedades de almidón, tales como por ejemplo, almidón de trigo o maíz y/o arroz, derivados de celulosa, por ejemplo metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa o sílice, polvo de talco, estearatos, tales como por ejemplo estearato de magnesio, estearato de aluminio, estearato de calcio, talco, talco siliconado, ácido esteárico, alcohol acetílico y grasas hidrogenadas.
A este respecto, los sistemas terapéuticos por vía oral construidos especialmente según principios osmóticos, tales como por ejemplo GIT (sistema terapéutico gastrointestinal) u OROS (sistema osmótico oral), deben mencionarse también.
Comprimidos o comp. efervescentes, que representan formas medicinales instantáneas inmediatas ingeribles que se disuelven rápidamente o se suspenden en agua están entre los comprimidos administrables por vía oral. Entre las formas administrables por vía oral están también soluciones, por ejemplo, gotas, jugos y suspensiones que pueden producirse según el procedimiento proporcionado anteriormente y pueden todavía contener conservantes para aumentar la estabilidad y opcionalmente aromatizantes por razones de facilitar la ingestión, y colorantes para una mejor diferenciación así como antioxidantes y/o vitaminas y edulcorantes tales como azúcar o agentes edulcorantes artificiales. Esto también sirve para jugos insípidos que se formulan con agua antes de ingerirse. También deben mencionarse resinas de intercambio iónico junto con uno o más ingredientes activos para la producción de formas ingeribles líquidas.
Una forma de liberación especial consiste en la preparación de las denominadas formas medicinales flotantes, por ejemplo, basadas en comprimidos o gránulos que desarrollan gas después de contactar con fluidos corporales y que por lo tanto flotan en la superficie del fluido gástrico. Además, pueden formularse también los denominados sistemas de liberación electrónicamente controlados, mediante los que la liberación del ingrediente activo puede ajustarse selectivamente a las necesidades individuales.
Un grupo de administración por vía sistémica adicional y también opcionalmente formas medicinales eficaces por vía tópica está representado por medicamentos aplicables por vía rectal. Entre estos se encuentran las formulaciones de supositorios y enemas. Las formulaciones de enemas pueden prepararse basándose en comprimidos con disolventes acuosos para producir esta forma de administración. Pueden hacerse disponibles también cápsulas rectales basadas en gelatina y otros vehículos.
Son adecuados como bases de supositorios grasas sólidas, como por ejemplo Witepsol®, Massa Estarinum®, Novata®, grasa de coco, mezclas de glicerol-gelatina, geles de glicerol-jabón y polietilenglicoles.
Para la aplicación de larga duración con una liberación sistemática de ingrediente activo durante hasta varias semanas, son adecuados implantes comprimidos que se formulan preferentemente basados en los denominados polímeros biodegradables.
Como un grupo importante adicional de medicamentos activos por vía sistémica, deben enfatizarse también sistemas transdérmicos que se distinguen de las formas rectales mencionadas anteriormente porque evitan la circulación sistémica hepática y/o el metabolismo hepático. Estos parches pueden prepararse especialmente como sistemas transdérmicos que son capaces de liberar el ingrediente activo de manera controlada durante periodos de tiempo más largos o más cortos basándose en diferentes capas y/o mezclas de adyuvantes y vehículos adecuados. Aparte de adyuvantes y vehículos adecuados tales como disolventes y componentes poliméricos, por ejemplo, basados en Eudragit®, compuestos que aumentan la infiltración en membranas y/o potenciadores de la permeabilidad, tales como, por ejemplo ácido oleico, Azone®, derivados de ácido adipínico, etanol, urea, propilglicol son adecuados en la producción de sistemas transdérmicos de este tipo con el fin de una penetración mejorada y/o acelerada.
Como medicamentos de administración por vía tópica, local o regional, los siguientes son adecuados como formulaciones especiales: emulsiones aplicables por vía vaginal o genital, cremas, comprimidos de espuma, implantes de liberación prolongada, soluciones para instilación de administración ovular o transuretral. Para la aplicación por vía oftalmológica, son adecuadas pomadas oculares altamente estériles, soluciones y/o gotas o cremas y emulsiones.
Del mismo modo, pueden diseñarse gotas, pomadas o cremas otológicas correspondientes para la aplicación en el oído. Para las dos aplicaciones mencionadas anteriormente, la administración de formulaciones semisólidas, como por ejemplo, geles basados en Carbopols® u otros compuestos de polímeros tales como, por ejemplo, polivinilpirrolidona y derivados de celulosa también es posible.
Para aplicación rutinaria en la piel o también en la membrana mucosa, pueden señalarse emulsiones, geles, pomadas y cremas normales o sistemas de emulsión de fase mezclada y/o anfífila (fase mezclada aceite/agua-agua/aceite) así como liposomas y transfersomas. Alginato sódico como un aditivo en gel para la producción de una cimentación adecuada o derivados de celulosa, como por ejemplo goma guar o xantana, aditivos de gel inorgánicos, tales como por ejemplo, hidróxidos de aluminio o bentonitas (denominados aditivos de gel tixotrópico), derivados de ácido poliacrílico, como por ejemplo Carbopol®, polivinilpirrolidona, celulosa microcristalina o carboximetilcelulosa son adecuados como adyuvantes y/o vehículos. Además, son adecuados compuestos anfífilos de bajo y alto peso molecular así como fosfolípidos. Los geles pueden estar presentes como hidrogeles basados en agua o como organogeles hidrófobos, por ejemplo basados en mezclas de hidrocarburos de parafina de bajo y alto peso molecular y vaselina.
Pueden emplearse tensioactivos aniónicos, catiónicos o neutros como emulsionantes, por ejemplo, jabones alcalinizados, jabones de metilo, jabones de amina, compuestos sulfonados, jabones catiónicos, alcoholes de alto contenido en grasas, ésteres parciales de ácidos grasos de sorbitán y de polioxietileno de sorbitán, por ejemplo, cera de tipo lanette, cera de lana, lanolina, u otros productos sintéticos para la producción de emulsiones de aceite/agua y/o agua/aceite.
Pueden formularse organogeles hidrófilos, por ejemplo, a base de polietilenglicoles de alto peso molecular. Estas formas de tipo gel son lavables. Vaselina, ceras naturales o sintéticas, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, por ejemplo como monoglicéridos, diglicéridos, o triglicéridos, aceite de parafina o aceites vegetales, aceite de ricino o de coco solidificado, manteca de cerdo, grasas sintéticas, por ejemplo, basadas en ácido acrílico, caprínico, láurico y esteárico, como por ejemplo Softisan® o mezclas de triglicéridos tales como Miglyol® se emplean como lípidos en forma de componentes de tipo grasa y/o aceite y/o cera para la producción de pomadas, cremas o emulsiones.
Ácidos y bases osmóticamente eficaces, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido cítrico, solución de hidróxido sódico, solución de hidróxido potásico, carbonato monosódico, sistemas tamponantes adicionales, tales como por ejemplo citrato, fosfato, tampón Tris o trietanolamina se usan para ajustar el valor de pH.
Conservantes, por ejemplo tales como benzoato de metilo o propilo (parabenos) o ácido sórbico pueden añadirse para aumentar la estabilidad.
Deben mencionarse pastas, polvos o soluciones como formas aplicables por vía tópica adicionales. Las pastas con frecuencia contienen agentes auxiliares lipófilos e hidrófilos con cantidades muy elevadas de materia grasa como base que confiere consistencia.
Los polvos o polvos aplicables por vía tópica pueden contener, por ejemplo, variedades de almidón como almidón de trigo o de arroz, dióxido de silicio o sílice dispersado a la llama, que también sirven como diluyentes, para aumentar la fluidez así como la lubricidad así como para evitar que se formen aglomerados.
Las gotas nasales o pulverizaciones nasales sirven como formas de aplicación por vía nasal. A este respecto, pueden usarse nebulizadores o cremas o pomadas nasales.
Además, las formulaciones de pulverizaciones nasales o polvo seco así como los aerosoles de dosificación controlada, son también adecuados para la administración por vía sistémica de los ingredientes activos.
Estos aerosoles de presión y/o dosificación controlada y formulaciones de polvo seco pueden inhalarse y/o insuflarse. Las formas de administración de este tipo tienen también importancia para la aplicación directa y regional en el pulmón o los bronquios y en la laringe. De este modo, pueden formularse composiciones de polvo seco, por ejemplo, como gránulos blandos de ingrediente activo, como una mezcla de gránulos de ingrediente activo con vehículos adecuados, tales como por ejemplo lactosa y/o glucosa. Para inhalación o insuflado, son adecuados aplicadores comunes que son adecuados para el tratamiento de la nariz, la boca y/o la faringe. Los ingredientes activos pueden aplicarse también por medio de un dispositivo de nebulización ultrasónica. Como gas propulsor para las formulaciones de pulverizaciones de aerosol y/o aerosoles de dosificación controlada, son adecuados tetrafluoroetano o HFC 134a y/o heptafluoropropano o HFC 227, en los que pueden preferirse hidrocarburos no fluorados u otros propulsores que son gaseosos a presión normal y temperatura ambiente, tal como, por ejemplo propano, butano o éter dimetílico. En lugar de aerosoles de dosificación controlada, pueden usarse también sistemas de bombeo manual sin
propulsores.
Los aerosoles de gas propulsor pueden contener también adecuadamente adyuvantes tensioactivos, tales como por ejemplo miristato de isopropilo, ésteres de ácidos grasos de polioxietileno de sorbitán, trioleato de sorbitán, lecitinas o lecitina de soja.
Para la aplicación regional in situ, son adecuadas soluciones para instilación, por ejemplo, para administración transuretral en tumores de vejiga o genitales, o para perfusión en tumores hepáticos u otros carcinomas de órganos.
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Claims (14)

1. Un procedimiento para seleccionar y detectar compuestos biológicamente activos que comprende:
incubar células cultivadas seleccionadas entre células HepG2, células U - 87 MG, células MCF-7 M 1, células Caki-1, células HL-60, células PC3, células U-373 MG, células A549 y células KG-1 a en presencia de [^{14}C]-niacinamida y un compuesto a ensayar para determinar su actividad para inhibir la formación celular del mononucleótido de niacinamida; realizar el lisado de las células;
aislar y separar los compuestos marcados con [^{14}C] y medir la cantidad de mononucleótido de niacinamida, NAD y NADP marcados formados.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el compuesto biológicamente activo tiene una actividad inhibidora sobre la biosíntesis celular de NAD a partir del precursor niacinamida a concentraciones de < 10 \muM de 50%, preferentemente de 80%, más preferentemente de 90%.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto biológicamente activo es un inhibidor de la niacinamida fosforribosil transferasa (NAPRT).
4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el compuesto biológicamente activo se representa por la fórmula (A):
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
\quad
Z es CH o N,
R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan independientemente entre sí entre grupos hidrocarburo que contienen opcionalmente uno o más de los elementos seleccionados entre N, O, P, F, Cl, Br e I;
y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que R_{4} se representa por la fórmula (B):
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
\quad
A es un enlace o un grupo hidrocarburo bivalente que contiene opcionalmente uno o más de los elementos seleccionados entre N, O, P, F, Cl, Br e I;
\quad
X es O, S o NR_{8};
\quad
R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} tienen el mismo significado que R_{1};
\quad
a, b y c son 0 ó 1, con la condición de que si cada uno de a y b es 1, entonces c también sea 1.
\global\parskip0.930000\baselineskip
6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que el compuesto biológicamente activo se selecciona entre:
1-[4-(1-benzhidril-piperidina-4-il)-butil]-3-piridina-3-il-urea;
[6-(3-piridina-3-il-metilureido)-hexil]-amida del ácido 4-benzhidril-piperazina-1-carboxílico;
1-(3,3-difenilpropil)-3-[6-(3-piridina-3-il-metilureido)-hexil]-urea;
1-[5-(1-benzhidril-piperidina-4-il)-pentil]-3-piridina-3-il-tiourea;
(2-piridina-3-il-etil)-amida del ácido 6-(4-benzhidril-piperazina-1-il)-hexanoico;
1-(6,6-difenil-5-hexenil)-3-(piridina-3-il-metileno-amino)-tiourea;
amida del ácido N-(4-{1-[4-(1-benzhidril-piperidina-4-il)-butil]-piperidina-4-il}-butil)-3-piridina-3-il-propanoico;
1-[4-(1-benzhidril-piperidina-4-il)-butil]-3-(2-piridina-3-il-etil)-urea;
N-{2-[5-(4-benzhidril-piperazina-1-il-metil)-1-metil-1 H-pirrol-2-il]-etil}-3-piridina-3il-acrilamida;
1-{4-[1-(naftalin-2-sulfonil)-piperidina-4-il)-butil}-3-piridina-3-il-urea;
1-{4-[1-(10,11-dihidro-dibenceno[b,f]azepina-5-carbonil)-piperidina-4-il]-butil}-3-piridina-3-il-urea;
ácido 2-amino-3-[4-hidroxi-3-(2-{4-[4-(3-piridina-3-il-acriloilamino)-butil]-piperidina-1-carbonil}-fenilazo)-
fenil]-propanoico trihidrato, y
N-(8,8-difenil-octil)-3-pirid-3-il-acrilamida.
7. Un procedimiento para determinar la dependencia de un tipo celular de la niacinamida como un precursor para la síntesis de NAD que comprende:
incubar las células a ensayar en presencia de un compuesto biológicamente activo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en un medio que contiene únicamente niacinamida como un precursor de la síntesis de NAD; y
realizar un ensayo de citotoxicidad después del periodo de incubación.
8. Un compuesto biológicamente activo seleccionado entre:
1-[4-(1-benzhidril-piperidina-4-il)-butil]-3-piridina-3-il-urea;
[6-(3-piridina-3-il-metilureido)-hexil]-amida del ácido 4-benzhidril-piperazina-1-carboxílico;
1-(3,3-difenilpropil)-3-[6-(3-piridina-3-il-metilureido)-hexil]-urea;
1-[5-(1-benzhidril-piperidina-4-il)-pentil]-3-piridina-3-il-tiourea;
(2-piridina-3-il-etil)-amida del ácido 6-(4-benzhidril-piperazina-1-il)-hexanoico;
1-(6,6-difenil-5-hexenil)-3-(piridina-3-il-metileno-amino)-tiourea;
amida del ácido N-(4-{1-[4-(1-benzhidril-piperidina-4-il)-butil]-piperidina-4-il}-butil)-3-piridina-3-il-propanoico;
1-[4-(1-benzhidril-piperidina-4-il)-butil]-3-(2-piridina-3-il-etil)-urea;
N-{2-[5-(4-benzhidril-piperazina-1-il-metil)-1-metil-1H-pirrol-2-il]-etil}-3-piridina-3-il-acrilamida;
1-{4-[1-(naftalin-2-sulfonil)-piperidina-4-il)-butil}-3-piridina-3-il-urea;
1-{4-[1-(10,11-dihidro-dibenceno[b,f]azepina-5-carbonil)-piperidina-4-il]-butil}-3-piridina-3-il-urea;
ácido 2-amino-3-[4-hidroxi-3-(2-{4-[4-(3-piridina-3-il-acriloilamino)-butil]-piperidina-1-carbonil}-fenilazo)-
fenil]-propanoico trihidrato, y
N-(8,8-difenil-octil)-3-pirid-3-il-acrilamida.
9. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto biológicamente activo según la reivindicación 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente junto con uno o más aditivos de formulación farmacéuticamente aceptables.
\global\parskip1.000000\baselineskip
10. La composición farmacéutica según la reivindicación 9 para la inmunosupresión o el tratamiento del cáncer en mamíferos.
11. La composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la que el cáncer se selecciona entre cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer del cuello del útero, cáncer de ovario, cáncer de piel, cáncer del SNC, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, leucemia y linfoma.
12. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que se formula para la administración por vía intraperitoneal, subcutánea, oral, intravenosa, rectal, bucal, intramuscular, intravaginal, tópica o pulmonar.
13. Uso de un compuesto biológicamente activo según la reivindicación 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de una composición farmacéutica para la inmunosupresión o el tratamiento del cáncer en mamíferos.
14. El uso según la reivindicación 13, en el que el cáncer se selecciona entre cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer del cuello del útero, cáncer de ovario, cáncer de piel, cáncer del SNC, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, leucemia y linfoma.
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