KR20180118141A - 암 치료를 위한 조합 - Google Patents

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KR20180118141A
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tumor
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앤드류 제이. 앤드류스
비크람 바타차르지
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에볼 사이언스 엘엘씨
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Abstract

본 발명의 명세서는 암, 예컨대 BRAF 및/또는 KRAS 돌연변이와 무관하게 암을 치료하기 위해 사용될 수 있는 화합물, 조성물, 및 이의 조합을 기재한다.

Description

암을 치료하기 위한 조합
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 2월 5일 출원된 미국 가출원 번호 62/291,931, 2016년 6월 2일 출원된 미국 가출원 번호 62/344,612, 및 2016년 11월 21일 출원된 미국 가출원 번호 62/424,792에 관련되고, 이들 각각은 참고로 그 전체가 본 명세서에 통합된다.
분야
본 개시내용은 일반적으로 암, 예컨대 야생형 또는 돌연변이된 Raf 또는 Ras를 가진 암을 치료하기 위한 화합물의 조합에 관한 것이다.
B-raf 억제제는 말기 단계 흑색종, 예컨대 전이성 흑색종 또는 절제불가능 흑색종을 치료하는데 승인되어 왔다. 그러나, 이들은 BRAF 돌연변이, 예컨대 V600E 또는 V600K를 갖는 흑색종에서만 승인되어 왔다. 추가적으로, 이들 화합물은 야생형 BRAF를 가진 환자에서 종양을 실제로 악화시킬 수 있는 것으로 쉽게 용인된다. 게다가, 이들 화합물의 유효성은 영구적이지 않고 돌연변이체 BRAF를 가진 종양은 종종 그와 같은 치료에 내성을 갖게 된다. 돌연변이체 KRAS를 가진 종양이 이들 화합물로 치료된 경우 더욱 더 빠르게 진행하는 것이 또한 밝혀졌다. 따라서, 야생형 및 돌연변이체 BRAF를 가진 종양 및 또한 흑색종 이상의 이들 화합물의 유효성을 증가시키는 것이 필요하다. 본 명세서에 기재된 구체예는 이들 필요성뿐만 아니라 다른 것들을 충족시킨다.
요약
본 발명의 명세서에서 제공된 구체예는 대상체에 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제 투여를 포함하는 대상체에서의 종양 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 명세서에서 제공된 구체예는 대상체에 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제 투여를 포함하는 대상체에서의 종양 상태 유지 방법을 제공한다.
본 발명의 명세서에서 제공된 구체예는 BRAF V600E 또는 V600K 돌연변이 없이 종양을 가진 대상체의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 BRAF V600E 또는 V600K 돌연변이를 갖지 않는 대상체에 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제 투여를 포함한다.
본 발명의 명세서에서 제공된 구체예는 대상체에서의 전이성 종양의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제 투여를 포함한다.
본 발명의 명세서에서 제공된 구체예는 약물 저항성 종양의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제 투여를 포함한다.
본 발명의 명세서에서 제공된 구체예는 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 명세서에서 제공된 구체예는 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 포함하는 고정된 단위 투약 형태를 제공한다.
본 발명의 명세서에서 제공된 구체예는 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 포함하는 주사가능한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 명세서에서 제공된 구체예는 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 포함하는 주사가능한 약제학적 조성물의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 혼합시켜 주사가능한 약제학적 조성물을 형성하는 것을 포함한다.
본 발명의 명세서에서 제공된 구체예는 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 명세서에서 제공된 구체예는 B-raf 억제제를 포함하는 약제학적 제제 및 처방 정보를 포함하는 컨테이너를 제공하고, 상기 처방 정보는 야생형 RAF로서 특성규명된 종양을 가진 대상체에 DNA 손상제와 B-raf 억제제를 투여하기 위한 지침을 포함한다.
도 1a 및 1b는 지시된 대로 다양한 암 세포주에서 48 사멸 곡선을 설명한다. 약물 A는 베무라페닙(vemurafenib)이고 약물 B는 젬시타빈(gemcitabine)이다. KRAS 및 BRAF의 돌연변이 상태는 이 도면에서 나타난다.
도 2a 및 2b는, WT-BRAF 및 KRAS-G12C 돌연변이를 가진 간엽 췌장 암 세포주에서 베무라페닙 및 젬시타빈의 조합 처리로 감수성에서 100배 증가를 보여주는, 48시간 사멸 곡선(비선형 회귀)을 설명한다. 약물 A는 베무라페닙이고 약물 B는 젬시타빈이다. KRAS 및 BRAF의 돌연변이 상태는 이 도면에서 나타난다.
도 3a 및 3b는 본 명세서에 기재된 바와 같이 베무라페닙 및 젬시타빈 처리의 % 콜로니 억제를 설명한다.
도 4a 및 4b는 SK-MEL-28VR1 세포의 특성을 설명한다. 도 4a: SK-MEL-28 및 SKMEL-28VR1 세포의 성장률 비교(n=3). 시점 0에서 플레이팅된 100000 세포. 도 4b: 베무라페닙의 차등 용량으로 처리 이후 SK-MEL-28 및 SKMEL-28VR1 세포의 콜로니 형성 검정(n=5)(p<0.0001).
도 5a 및 5b는 SK-MEL-28VR1 세포의 특성을 설명한다. 도 5a: 비편향된 질량 분석법: SK-MEL-28 및 SK-MEL-28VR1 세포의 차등 처리 이후 FAM129B 단백질 존재도(n=3). 도 5b: SK-MEL-28VR1 세포의 특성을 설명한다. 차등적으로 처리된 SK-MEL-28 및 SK-MEL-28VR1 세포에서 PHGDH 단백질 발현의 웨스턴 블롯(Western blot). 추가 대조군으로서 사용된 알파 튜불린. 각각의 레인에서 추가된 50μg의 단백질.
도 6a-6e는 SK-MEL-28VR1 세포에서 베무라페닙 저항에 대한 세린 생합성 경로의 중요성을 설명한다: 도 6a: 베무라페닙의 차등 용량으로 대조군 또는 PHGDH siRNAs 처리 이후 SKMEL-28 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p=0.3052). 도 6b: 베무라페닙의 차등 용량으로 대조군 또는 PHGDH siRNAs 처리 이후 SK-MEL-28VR1 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p<0.0001). 도 6c: 베무라페닙 +/- 메토트렉세이트(75nM)의 차등 용량으로 처리 이후 SK-MEL-28 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p=0.9203). 도 6d: 베무라페닙 +/- 메토트렉세이트(75nM)의 차등 용량으로 처리 이후 SK-MEL-28VR1 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p<0.0001). 도 6e: SK-MEL-28VR1 세포에서 베무라페닙 저항에 대한 세린 생합성 경로의 중요성을 설명한다. 배지에서 베무라페닙 +/- 세린의 차등 용량으로 처리 이후 SK-MEL-28VR1 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p<0.0001).
도 7a-7g는 젬시타빈이 SKMEL-28VR1 세포를 베무라페닙에 민감화시키는 것을 설명한다. 도 7a: 베무라페닙 +/- 젬시타빈(50nM)의 차등 용량으로 처리 이후 SKMEL-28 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p<0.0001). 도 7b: 베무라페닙 +/- 젬시타빈(50nM)의 차등 용량으로 처리 이후 SK-MEL-28VR1 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p<0.0001). 도 7c: 베무라페닙 +/- 젬시타빈(50nM)의 차등 용량으로 대조군 또는 PHGDH siRNAs 처리 이후 SK-MEL-28 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p=0.9816). 도 7d: 베무라페닙 +/- 젬시타빈 (50nM)의 차등 용량으로 대조군 또는 PHGDH siRNAs 처리 이후 SK-MEL-28VR1 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p=0.0189). 도 7e: 베무라페닙 + 젬시타빈(50nM) +/- 메토트렉세이트(75nM)의 차등 용량으로 처리 이후 SK-MEL-28 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p=0.6585). 도 7f: 베무라페닙 + 젬시타빈(50nM) +/- 메토트렉세이트(75nM)의 차등 용량으로 처리 이후 SK-MEL-28VR1 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p<0.0001). 도 7g: 젬시타빈과 베무라페닙 사이 상승효과를 나타내는 Fa-CI 플롯. 약물 사이 상승효과를 나타내는 라인 밑에 해당하는 데이터 포인트. 데이터 포인트는 특정 용량에서 CI 계산을 나타낸다. 표 3은, 본 명세서에서, CI 값을 포함한다.
도 8a-8c는 젬시타빈이 췌장 암 및 NSCLC 세포주를 베무라페닙에 민감화시키는 것을 설명한다. 도 8a: 젬시타빈 +/- 베무라페닙(1μM)의 차등 용량으로 처리 이후 BxPC3M1 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p<0.0001). 도 8b: 젬시타빈과 베무라페닙 사이 상승효과를 나타내는 Fa-CI 플롯. 라인 밑에 해당하는 데이터 포인트는 약물 사이 상승효과를 지시한다. 데이터 포인트는 특정 용량에서 CI 계산을 나타낸다. CI 값에 대하여 표 3을 참조한다. 도 8c: 젬시타빈 +/- 베무라페닙(1μM)의 차등 용량으로 처리 이후 NCI-H2122 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p<0.0001).
도 9a-9h는 췌장 암 세포주에서 베무라페닙 유도된 세포 증식 및 세린 합성을 설명한다. 도 9a: 베무라페닙(10μM)으로 처리된 BxPC3 세포의 세포 증식 검정. 0일에서 플레이팅된 100000 세포. 도 9b: 베무라페닙(10μM)으로 처리된 BxPC3M1 세포의 세포 증식 검정. 0일에서 플레이팅된 100000 세포. 도 9c: 베무라페닙(10μM)으로 처리된 패널 세포의 세포 증식 검정. 0일에서 플레이팅된 100000 세포. 도 9d: 베무라페닙(10μM)으로 처리된 MiaPaca2 세포의 세포 증식 검정. 0일에서 플레이팅된 100000 세포. 도 9e: 질량 분석법: DMSO 또는 베무라페닙(10μM)으로 처리된 췌장 암 세포에서 PHGDH 단백질 발현(n=3). 도 9f: 질량 분석법: DMSO 또는 베무라페닙(10μM)으로 처리된 췌장 암 세포에서 PSAT1 단백질 발현(n=3). 도 9g: 질량 분석법: DMSO 또는 베무라페닙(10μM)으로 처리된 췌장 암 세포에서 PSPH 단백질 발현(n=3). 도 9h: 질량 분석법: DMSO 또는 베무라페닙(10μM)으로 처리된 췌장 암 세포에서 SARS 단백질 발현(n=3).
도 10a-1Oc는 BxPC3M1 및 NCI-H2122 세포의 베무라페닙 유도된 민감화 향상을 설명한다. 도 10a: 젬시타빈 +/- 베무라페닙(1μM) +/- 메토트렉세이트(75nM)의 차등 용량으로 처리 이후 BxPC3M1 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p=0.0258). 도 10b: 젬시타빈 +/- 베무라페닙(1μM) +/- 메토트렉세이트(75nM)의 차등 용량으로 처리 이후 NCI-H2122 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p=0020). 도 10c: 베무라페닙 +/- 세린의 차등 용량으로 처리 이후 BxPC3M1 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p<0.0001).
도 11a-11c는 젬시타빈에 BxPC3M1, NCI-H2122, 및 SK-MEL-28VR1 세포의 다브라페닙 유도된 민감화를 설명한다. 도 11a: 젬시타빈 +/- 다브라페닙(1μM)의 차등 용량으로 처리 이후 BxPC3M1 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p<0.0001). 도 11b: 젬시타빈 +/- 다브라페닙(1μM)의 차등 용량으로 처리 이후 NCI-H2122 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p<0.0001). 도 11c: 다브라페닙 +/- 젬시타빈(50nM)의 차등 용량으로 처리 이후 BxPC3M1 세포의 콜로니 형성 검정(n=3)(p<0.0001).
도 12a 및 12b는 젬시타빈 및 BRAF V600E 억제제와 순차적인 조합 처리를 통해 암 세포 민감화의 도식을 설명한다: 도 12a에서 캐스케이드(cascade)는 BRAF V600E 돌연변이 내에서 BRAF V600E 억제제(BRAFi)에 대한 SK-MEL-28 세포 반응을 나타낸다. 도 12b에서 좌측 캐스케이드는 돌연변이 프로파일 내에서 BRAFi에 대한 획득된 BRAFi 저항성 SKMEL-28VR1 세포 반응을 나타낸다. 획득된 내성은 젬시타빈 전처리 없이 MAPK 캐스케이드의 역설적 유도를 야기시킨다. BRAFi가 뒤따르는 젬시타빈 전처리는 세포가 저지되는 동안 MAPK 캐스케이드의 유도 및 세린 합성의 유도를 유발시킨다. 세린 합성의 유도는 뉴클레오타이드 합성을 위하여 폴레이트 사이클의 유도를 유발시킨다. 이들의 일련의 결과는 BRAF 억제제에 의해 MAPK 신호전달 경로의 활성화 및 젬시타빈-유도된 DNA 손상으로부터 세포 사이클 정지 신호를 야기시키는 세포 신호전달 경로의 활성화 상충으로 인한 세포사로 이어진다. 도 12b에서 우측 캐스케이드는 젬시타빈 전처리에 의해 BRAF 억제제에 대한 BRAF WT 췌장 암 BxPC3M1 및 비-소 세포 폐 암 NCI-H2122 세포의 민감화를 보여준다. 이들 BRAF WT 세포주에서, 젬시타빈은 세포 사이클 정지를 유도시킨다. 정지된 세포에 BRAF 억제제의 첨가는 증가된 세린 합성 및 폴레이트 합성을 초래하는 MAPK 캐스케이드를 유도시킨다. 이들 일련의 결과는 BRAF 억제제에 의해 MAPK 신호전달 경로의 활성화 및 젬시타빈-유도된 DNA 손상으로부터 세포 사이클 정지를 야기시키는 세포 신호전달 경로의 활성화 상충으로 인한 세포사로 이어진다. 세포사의 실제 기전은 아직 공지되지 않았다.
도 13은 SK-MEL-28VR1 세포의 PHGDH 유전자 절제를 설명한다: 레인 1: PHGDH siRNA + 베무라페닙. 레인 2: PHGDH siRNA + DMSO. 레인 3: 대조군 siRNA + 베무라페닙. 레인 4: 대조군 siRNA + DMSO. 추가 대조군으로서 사용된 알파 튜불린. 각각의 레인에서 추가된 50 μg의 단백질.
도 14a 및 14b는 베무라페닙에 대한 젬시타빈 민감화된 SK-MEL-28VR1 및 BxPC3M1 세포를 설명한다. 도 14a: SK-MEL28VR1 세포에서 젬시타빈 및 베무라페닙의 상승작용 효과를 보여주는 정규화된 아이소볼로그램. 라인의 좌측에 해당하는 데이터 포인트는 상승효과를 지시한다. 데이터 포인트는 특정 용량에서 CI 계산을 나타낸다(CI 값에 대하여 표 3 참조). 도 14b: BxPC3M1 세포에서 젬시타빈 및 베무라페닙의 상승작용 효과를 보여주는 정규화된 아이소볼로그램. 라인의 좌측에 해당하는 데이터 포인트는 상승효과를 지시한다. 데이터 포인트는 특정 용량에서 CI 계산을 나타낸다(CI 값에 대하여 표 4 참조).
도 15는 3D-회전타원체 성장 검정에서 베무라페닙 또는 다브라페닙에 대한 젬시타빈 민감화된 췌장 암 환자-유래된 및 ATCC 확립된 세포주를 설명한다: 0일에서 20,000 세포 플레이팅되었고(Corning 4515 회전타원체 플레이트), 2일에서 젬시타빈 첨가되었고(모든 회전타원체 적어도 500μm 직경), 젬시타빈 세정 제거되었고 B-raf 억제는 3일에서 첨가되었고, 5일에서 CTG3D 세포 생존력 검정(n=2).
상세한 설명
본 발명의 명세서는 화합물의 조합 및 이의 이용 방법을 기재한다. 화합물 및 조합물은 또한 단위 투약 형태로 또는 상이한 투약 형태로 투여될 수 있는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다.
베무라페닙은 식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 지칭한다:
Figure pct00001
다브라페닙은 식 II의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 지칭한다:
Figure pct00002
본 명세서 내내 B-raf 억제제가 참조된다. 그 예는, 비제한적으로, 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙, 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 다른 B-raf 억제제, 예컨대 소라페닙은 또한 치환될 수 있다. 따라서, 의심할 여지를 없애기 위해, 어느 한쪽 베무라페닙 또는 다브라페닙이 언급되는 경우, B-raf 억제제가 일반적으로 사용될 수 있거나 다른 특정 유형의 B-raf 억제제가 또한 사용될 수 있다는 것이 개시된다. 이러한 언급은 또한 본 명세서에서 기재된 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염을 지칭하는 것으로 해석될 수 있다. 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 다양한 암 처리 치료제, 예컨대 비제한적으로 DNA 손상제와 (동시에 또는 순차적으로) 조합될 수 있다. 그와 같은 DNA 손상제의 예는, 비제한적으로, 이중 가닥 절단(DSBs), 단일 가닥 절단을 야기시키는 제제, 항대사물질, DNA 가교제, 토포이소머라제 억제제, 폴리머라제 억제제, 또는 알킬화제를 포함한다. 일부 구체예에서, DNA 손상제는 젬시타빈, 5-FU, 시타라빈, 메토트렉세이트, 피리메타민, 블레오마이신, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 에토포시드, 독소루비신, 비노렐빈, 미톡산트론, 포도필로톡신, 아피디콜린, 포테무스틴, 카르무스틴, S-23906, S39, SN-38, 토포테칸, 캄프토테신, 레벡카마이신, 및 기타이다. 이들 제제는, 단독으로 또는 조합하여, B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과 조합될 수 있다. 이들은 또한 MEK 억제제, 예컨대 비제한적으로 트라메티닙 및 기타와 조합될 수 있다. 일부 구체예에서, MEK 억제제는 또한 본 명세서에서 기재된 바와 같이 B-raf 억제제(예를 들면, 베무라페닙 또는 다브라페닙) 및 DNA 손상제와 조합 또는 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, BRAF 억제제는 MEK 억제제와 조합으로 (동시에 또는 순차적으로) 투여되지 않는다.
화합물, 조성물, 및 이의 조합은, 비제한적으로, 대상체에서 암 또는 종양, 예컨대 흑색종, 췌장암, 폐암(예를 들면 NSCLC), 결장암, 난소암, 전립선암, 또는 유방암 치료를 포함하는, 본 명세서에서 기재된 임의의 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, DNA 손상제를 가진, 조성물, 예컨대 B-raf 억제제(예를 들면 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙)의 약제학적 조성물 또는 고정된 투약 형태, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 제공된다. 조성물은 또한 MEK 억제제 또는 EGFR 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 MEK 억제제 또는 EGFR 억제제가 없을 수 있다. B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제의 조합 그리고 본 명세서에서 제공된 조합의 용도는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 암 및 다른 의외의 결과를 치료하는 놀라운 의외의 능력을 입증한다. 일부 구체예에서, 조합물은 종양 진행을 지연시킨다. 일부 구체예에서, 조합물은 종양 크기를 감소시킨다. 일부 구체예에서, 조합물은 B-raf 억제제에 저항성이 되는 종양을 재-민감화시킨다. 일부 구체예에서, 조합물은 B-raf 억제제에 대해 저항성인 종양을 민감화시킨다. 재-민감화되는 종양은 내성기 생기는 또는 1차 치료, 예컨대 B-raf 억제제(예를 들면 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙)에 내성이 생기는 것으로 기대되는 종양을 지칭한다. 민감화되는 종양은 치료에 내성이 있었던 그리고 현재 치료로 처리될 수 있는 종양을 지칭한다. 예를 들어, B-raf 억제제에 반응하지 않는 종양은 종양이 DNA 손상제와 B-raf 억제제의 조합으로 처리되는 경우 B-raf 억제제에 민감화된다. 일부 구체예에서, 민감화는 B-raf 억제제와 DNA 손상제로 종양 전처리에 의해 제공된다. 임의의 특별한 이론에 구속됨이 없이, B-raf 억제제 및 DNA 손상제의 조합물(전처리 또는 없음)은 어느 한쪽 성분 단독에 비교된 경우 상승작용으로 작동한다. 일부 구체예에서, B-raf 억제제는 또한 DNA 손상제와 조합 때문에 이전에 사용되어 왔던 것보다 더 낮은 용량에서 사용될 수 있다. 그와 같은 용량의 비-제한 예는 본 명세서에서 기재된다. DNA 손상제는 또한 B-raf 억제제와 조합되기 때문에 전형적인 것보다 더 낮은 용량에서 사용될 수 있다. 그와 같은 용량의 비-제한 예는 본 명세서에서 기재된다. 이들 조합물은 또한 MEK 억제제와 무관하게 사용될 수 있다. MEK 억제제의 예는 본 명세서에서 기재되지만, 다른 것들도 또한 사용될 수 있다. 조합물은 또한 EGFR 억제제와 함께 투여될 수 있다. 조합물은 또한 EGFR 억제제 없이 투여될 수 있다. EGFR 억제제의 예는, 비제한적으로, 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 게피티닙 및 에를로티닙을 포함한다. 본 명세서에서 기재된 조합물은 동일한 제형 또는 단위 투약 형태로 조합될 수 있거나 별도로 투여될 수 있지만, 이들이 각각의 치료제로 암을 치료하기 위한 의도로 환자에 투여되고 있기 때문에 조합된 것으로 여전히 간주될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, DNA 손상제와 B-raf 억제제의 조합물은 유지 요법 및/또는 2차 요법에서 사용된다. 유지 요법, 또는 2차 요법은 암을 가졌던 그리고 1차 치료로 이미 처리되었고 종양이 1차 치료에 반응하였던 2차 요법을 가진 환자 치료를 지칭한다. 유지 요법은 종양이 완전히 제거되지 않은 경우, 성장하는 종양의 능력을 느리게 하는 데, 또는 종양이 완전히 제거되면 재발성으로부터 종양을 억제시키는 데 사용될 수 있다. 종종 유지 요법은 종양이 안정적이거나 환자가 완전한 반응을 가졌던 (예를 들면 차도가 있는 것으로 간주되는) 경우 사용된다. 그러나, 유지 요법은 또한 대상체가 부분적인 반응 또는 단순히 1차 요법에 대한 반응을 가졌던 경우 사용될 수 있다. 조합물은 또한 본 명세서에서 기재된 바와 같이 MEK 억제제 또는 EGFR 억제제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 암 전이의 치료 방법이 제공되고, 상기 방법은 대상체에 B-raf 억제제(예를 들면 베무라페닙, 다브라페닙 및/또는 소라페닙) 및 DNA 손상제 투여를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 MEK 억제제 또는 EGFR 억제제 투여를 포함하고, 이의 비-제한 예는 본 명세서에서 제공된다. 일부 구체예에서, 전이성 암은 전이성 흑색종, 췌장암, 폐암, 결장암, 난소암, 전립선암, 또는 유방암이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 본 명세서에서 기재된 다른 구체예와 유사한 또는 동일한 B-raf 억제제 전 DNA 손상제 투여를 포함한다.
암(종양)은 종종 치료 자체로부터 선택 압력으로 인해 치료에 저항성이 된다. 따라서, 치료 예컨대 B-raf 억제제는 초기에 작동할 수 있지만, 그 다음 저항 발생으로 인해 일정 기간 후 작동을 중단시킨다. 이러한 저항은 본 명세서에서 기재된 DNA 손상제와 B-raf 억제제 투여에 의해 극복 또는 축소될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 저항성 암의 치료 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 대상체에 저항성 암 치료 B-raf 억제제 및 DNA 손상제 투여를 포함한다. 이의 예들은 본 명세서에서 기재된다. 일부 구체예에서, 암은 베무라페닙 및/또는 다브라페닙에 저항성이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 MEK 억제제 또는 EGFR 억제제 투여를 포함하고, 이의 비-제한 예는 본 명세서에서 기재된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 본 명세서에서 기재된 다른 구체예와 유사한 또는 동일한 B-raf 억제제 전 DNA 손상제 투여를 포함한다.
약제학적 조성물/ 제형
약제학적 조성물은 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 이용하는 표준 기술에 의해 제형화될 수 있다. 제형은 완충제 및/또는 보존제를 함유할 수 있다. 화합물 및 그것의 생리적으로 허용가능한 염 및 용매화물은, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 비히클(vehicle)에서, 흡입을 통해, 국소적으로, 비강으로, 경구로, 비경구로(예를 들면, 정맥내로, 복강내로, 방광내로 또는 척추강내로) 또는 직장으로 포함하는, 임의의 적합한 경로에 의한 투여용으로 제형화될 수 있고, 이의 비율은 화합물의 용해도 및 화학적 성질, 투여의 선택된 경로 및 표준 생물학적 실시에 의해 결정된다.
약제학적 조성물은, 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 다른 담체와 함께 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 화합물(들)의 유효량을 포함할 수 있다. 그와 같은 조성물은 하기를 포함할 수 있다: 다양한 완충제 함량(예를 들면, TRIS 또는 다른 아민, 카보네이트, 포스페이트, 아미노산, 예를 들어, 글리신아미드 하이드로클로라이드(특히 생리적 pH 범위에서), N-글라이실글리신, 인산나트륨 또는 인산칼륨(이염기성, 삼염기성) 등 또는 트리스-HCl 또는 아세테이트), pH 및 이온 강도의 희석제; 첨가제 예컨대 세제 및 가용화제(예를 들면, 계면활성제 예컨대 Pluronics, Tween 20, Tween 80(폴리소르베이트 80), Cremophor, 폴리올 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등), 산화방지제(예를 들면, 아스코르브산, 나트륨 메타비설파이트), 보존제(예를 들면, Thimersol, 벤질 알코올, 파라벤, 등) 및 벌크화 서브스턴스(예를 들면, 당류 예컨대 수크로스, 락토스, 만니톨, 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈 또는 덱스트란 등); 및/또는 폴리머 화합물 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜 산 등의 미립자 제제 속으로 또는 리포좀 속으로 상기 물질의 편입. 하이알루론산이 또한 사용될 수 있다. 그와 같은 조성물은 본 명세서에 기재된 화합물의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출의 속도, 및 생체내 청소능의 속도에 영향을 미치는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에서 참고로 편입된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) 페이지 1435-1712 참조. 조성물은, 예를 들어, 액체 형태로 제조될 수 있거나, 건조된 분말, 예컨대 동결건조된 형태일 수 있다. 그와 같은 조성물의 특별한 투여 방법은 아래에 기재된다.
완충제가 본 명세서에서 기재된 제형에 포함되는 경우, 완충제는 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 시트레이트, 글라이실글리신, 히스티딘, 글리신, 라이신, 아르기닌, 나트륨 디하이드로젼 포스페이트, 디나트륨 수소 포스페이트, 인산나트륨, 및 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄, 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 완충제는 또한 글라이실글리신, 나트륨 디하이드로젼 포스페이트, 디나트륨 수소 포스페이트, 및 인산나트륨 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 보존제가 본 명세서에서 기재된 화합물 중 하나의 제형에 포함되는 경우, 보존제는 페놀, m-크레졸, 메틸 p-하이드록시벤조에이트, 프로필 p-하이드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-하이드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 및 티오메로살, 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
보존제는 농도 약 0.1 mg/ml 내지 약 50 mg/ml에서, 농도 약 0.1 mg/ml 내지 약 25 mg/ml에서, 또는 농도 약 0.1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml에서 존재한다.
약제학적 조성물에서 보존제의 용도는 당업자에게 공지된다. 편의상 하기가 참조된다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
제형은 킬레이트제가 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산, 및 아스파르트산의 염, 그리고 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있는 킬레이트제를 추가로 포함할 수 있다.
킬레이트제는 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 2 mg/ml 또는 2 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도에서 존재할 수 있다.
약제학적 조성물에서 킬레이트제의 용도는 당업자에게 공지된다. 편의상 하기가 참조된다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
본 발명의 명세서에서 기재된 화합물의 제형은 그와 같은 안정화제가, 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜(예를 들면 PEG 3350), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카복시메틸셀룰로스, 상이한 염(예를 들면 염화나트륨), L-글리신, L-히스티딘, 이미다졸, 아르기닌, 라이신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 및 트레오닌 또는 이의 임의의 혼합물을 포함하는 고분자량 폴리머 및 저분자량 화합물로부터 선택된 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 안정화제는 또한 L-히스티딘, 이미다졸 또는 아르기닌일 수 있다.
고분자량 폴리머는 0.1 mg/ml 내지 50 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 5 mg/ml 내지 10 mg/ml, 10 mg/ml 내지 20 mg/ml, 20 mg/ml 내지 30 mg/ml 또는 30 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도에서 존재할 수 있다.
저분자량 화합물은 0.1 mg/ml 내지 50 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 5 mg/ml 내지 10 mg/ml, 10 mg/ml 내지 20 mg/ml, 20 mg/ml 내지 30 mg/ml 또는 30 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도에서 존재할 수 있다.
약제학적 조성물에서 안정화제의 용도는 당업자에게 공지된다. 편의상 하기가 참조된다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
본 발명의 명세서에서 기재된 화합물의 제형은 추가로 계면활성제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 계면활성제는 하기로부터 선택될 수 있거나: 세제, 에톡실화된 피마자유, 폴리글리콜화된 글리세라이드, 아세틸화된 모노글리세라이드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴록사머, 예컨대 188 및 407, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 유도체 예컨대 알킬화된 및 알콕실화된 유도체(tweens, 예를 들면 Tween-20, 또는 Tween-80), 모노글리세라이드 또는 이의 에톡실화된 유도체, 디글리세라이드 또는 이의 폴리옥시에틸렌 유도체, 글리세롤, 콜산 또는 이의 유도체, 레시틴, 알코올 및 인지질, 글리세로인지질(레시틴, 케팔린, 포스파티딜 세린), 글리세로당지질(갈락토피란소이드), 스핑고인지질(스핑고미엘린), 및 스핑고당지질(세라미드, 강글리오사이드), DSS(도쿠세이트 나트륨, 도쿠세이트 칼슘, 도쿠세이트 칼륨, SDS(나트륨 도데실 설페이트 또는 나트륨 라우릴 설페이트), 디팔미토일 포스파티드산, 나트륨 카프릴레이트, 담즙산 및 이의 염 및 글리신 또는 타우린 콘주게이트, 우르소데옥시콜산, 나트륨 콜레이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 타우로콜레이트, 나트륨 글리코콜레이트, N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 음이온성 (알킬-아릴-설포네이트) 1가 계면활성제, 팔미토일 라이소포스파티딜-L-세린, 라이소인지질(예를 들면 에탄올아민, 콜린, 세린 또는 트레오닌의 1-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 에스테르), 알킬, 알콕실(알킬 에스테르), 라이소포스파티딜 및 포스파티딜콜린의 알콕시 (알킬 에테르)-유도체, 예를 들면 라이소포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린의 라우로일 및 미리스토일 유도체, 및 극성 헤드 그룹의 변형, 즉 콜린, 에탄올아민, 포스파티드산, 세린, 트레오닌, 글리세롤, 이노시톨, 및 양으로 하전된 DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, 라이소포스파티딜세린 및 라이소포스파티딜트레오닌, 쯔비터이온성 계면활성제(예를 들면 N-알킬-N,N-디메틸암모니오-1-프로판설포네이트, 3-콜라미도-1-프로필디메틸암모니오-1-프로판설포네이트, 도데실포스포콜린, 미리스토일 라이소포스파티딜콜린, 헨 에그 라이소레시틴), 양이온성 계면활성제(4급 암모늄 염기)(예를 들면 세틸-트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드), 비-이온성 계면활성제, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌옥사이드 블록 코폴리머(Pluronics/Tetronics, 트리톤 X-100, 도데실 β-D-글루코피라노시드) 또는 폴리머 계면활성제(Tween-40, Tween-80, Brij-35), 후시딘산 유도체--(예를 들면 나트륨 타우로-디하이드로푸시데이트 등), 장쇄 지방산 및 이의 염 C6-C12(예를 들면 올레산 및 카프릴산), 아실카르니틴 및 유도체, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘의 Nα-아실화된 유도체, 또는 라이신 또는 아르기닌의 측쇄 아실화된 유도체, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘 및 중성 또는 산성 아미노산의 임의의 조합을 포함하는 디펩타이드의 Nα-아실화된 유도체, 중성 아미노산 및 2 하전된 아미노산의 임의의 조합을 포함하는 트리펩타이드의 Nα-아실화된 유도체, 또는 계면활성제는 이미다졸린 유도체의 그룹, 또는 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
약제학적 조성물에서 계면활성제의 용도는 당업자에게 공지된다. 편의상 하기가 참조된다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
약제학적으로 허용가능한 감미제는 본 명세서에서 기재된 화합물의 제형의 일부일 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 감미제는 적어도 하나의 강렬한 감미제 예컨대 사카린, 나트륨 또는 칼슘 사카린, 아스파르탐, 아세설팜 칼륨, 나트륨 사이클라메이트, 알리탐, 디하이드로칼콘 감미제, 모넬린, 스테비오시드 또는 수크랄로스 (4,1',6'-트리클로로-4,1',6'-트리데옥시갈락토수크로스), 사카린, 나트륨 또는 칼슘 사카린, 및 선택적으로 벌크 감미제 예컨대 소르비톨, 만니톨, 푸룩토스, 수크로스, 말토스, 아이소말트, 글루코스, 수소화된 글루코스 시럽, 자일리톨, 카라멜, 및 꿀을 포함한다.
강렬한 감미제는 저농도에서 편리하게 이용된다. 예를 들어, 나트륨 사카린의 경우에서, 농도는 최종 제형의 총 용적에 기반하여 0.04 % 내지 0.1 %(w/v)의 범위일 수 있거나, 저-투약 제형에서 약 0.06 % 그리고 고-투약량 제형에서 약 0.08 %이다. 벌크 감미제는 약 10 % 내지 약 35 %, 또는 약 10 % 내지 15 %(w/v) 범위의 더 큰 양에서 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 기재된 화합물의 제형은, 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985 또는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995에서 기재된 바와 같이, 종래의 기술에 의해 제조될 수 있고, 여기에서 제약 산업의 그와 같은 종래의 기술은 성분을 적절하게 용해 및 혼합시켜 원하는 최종 생성물을 제공하는 것을 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용가능한" 또는 "치료적으로 허용가능한"은, 인간에 투여된 경우, 생리적으로 내성이 있고 바람직하게는 알러지성 또는 유사한 유해한 반응, 예컨대 급성위연동이상항진, 현기증 및 기타를 전형적으로 생산하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 동물에서, 및 더 상세하게는 인간에서 사용하기 위하여 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식된 약전(예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985))에서 열거되는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 기재된 화합물의 투여는 당해 분야에서 공지된 임의의 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 투여는 경피, 비경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 근육내, 두개내, 안와내, 안과, 심실내, 관절내, 척수내, 낭내, 복강내, 뇌심실내, 척추강내, 비강내, 에어로졸, 좌약에 의한, 또는 경구 투여일 수 있다. 본 명세서에서 기재된 화합물의 약제학적 조성물은 주사용 투여, 또는 경구, 폐, 비강, 경피, 안구 투여를 위한 것일 수 있다.
경구 투여를 위하여, 본 명세서에서 기재된 화합물의 약제학적 조성물은 단위 투약 형태 예컨대 캡슐 또는 정제로 제형화될 수 있다. 정제 또는 캡슐은, 결합 제제, 예를 들어, 예비젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈, 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스; 충전제, 예를 들어, 락토스, 미세결정성 셀룰로스, 또는 칼슘 수소 포스페이트; 윤활제, 예를 들어, 스테아르산마그네슘, 탈크, 또는 실리카; 붕해제, 예를 들어, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글라이콜레이트; 또는 습윤 제제, 예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트를 포함하는, 약제학적으로 허용가능한 부형제로 종래의 수단에 의해 제조될 수 있다. 정제는 당해 분야에서 잘 알려진 방법으로 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액상 제제는, 예를 들어, 용액, 시럽, 또는 현탁액의 형태를 가질 수 있거나, 이들은 사용전 물 또는 다른 적합한 비히클을 가진 구성용 건조 생성물로서 제시될 수 있다. 그와 같은 액상 제제는 약제학적으로 허용가능한 첨가제, 예를 들어, 현탁제, 예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체, 또는 수소화된 식용 지방; 유화제, 예를 들어, 레시틴 또는 아카시아; 비-수성 비히클, 예를 들어, 아몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알코올, 또는 분획화된 식물성 오일; 및 보존제, 예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산으로 종래의 수단에 의해 제조될 수 있다. 제제는 또한 완충제 염, 풍미제, 착색제, 및/또는 감미제를 적절하게 함유할 수 있다. 원하는 경우, 경구 투여용 제제는 적합하게 제형화되어 활성 화합물의 조절 방출을 제공할 수 있다. 일부 구체예에서, 단위 투약 형태는 양쪽 B-raf 억제제 및 하나 이상의 DNA 손상제를 포함하는 조합 생성물로서 제형화될 수 있다. 일부 구체예에서, 단위 투약 형태는 B-raf 억제제를 포함하는 하나의 조성물 그리고 하나 이상의 DNA 손상제를 포함하는 제2 조성물을 지칭한다. 다중 DNA 손상 제제가 사용되면 동일한 수의 단위 투약 형태가 제조 및 사용될 수 있다.
비경구 투여를 위하여, 본 명세서에서 기재된 화합물은, 약제학적으로 허용가능한 비히클 또는 담체를 가진 조성물로, 어느 한쪽 정맥내, 피하, 또는 근육내 주사로 투여된다. 화합물은 주사로, 예를 들어, 볼러스 주사 또는 연속 주입으로 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은, 첨가된 보존제를 가진, 단위 투약 형태, 예를 들어, 앰풀 또는 다중-용량 용기로 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클내 현탁액, 용액, 또는 유탁액과 같은 형태를 가질 수 있고, 제형성 제제, 예를 들어, 현탁, 안정화, 및/또는 분산 제제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은, 사용 전, 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균된 무발열원 물을 가진 구성용 분말 형태일 수 있다.
주사로 투여하기 위하여, 화합물(들)은 다른 용질 예컨대 완충제 또는 보존제 뿐만 아니라 용액을 등장성으로 만들기 위해 약제학적으로 허용가능한 염 또는 글루코스의 충분한 양을 또한 함유할 수 있는 멸균된 수성 비히클내 용액에서 사용될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 화합물의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체로 제형화되어 주사가능한 투여용 멸균된 용액 또는 현탁액을 제공할 수 있다. 주사제는 종래의 형태로, 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전의 액체형의 용액 또는 현탁액에 적절한 고형 형태로서 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 레시틴, 알부민, 나트륨 글루타메이트, 시스테인 하이드로클로라이드, 또는 기타이다. 또한, 원하는 경우, 주사가능한 약제학적 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대 습윤 제제, pH 완충 제제, 및 기타를 함유할 수 있다. 원하는 경우, 흡수 향상 제제(예를 들면, 리포좀)가 이용될 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 E. W. Martin 저 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에서 기재된다. 주사 제형은 B-raf 억제제 및 하나 이상의 DNA 손상제의 조합을 포함할 수 있다. 주사 제형은 또한 별개의 제형을 하나로 조합시킴으로써 제조될 수 있다. 제형은 또한 순차적으로 또는 동시에 또는 거의 동시에 투여될 수 있다.
화합물은, 예를 들어, 종래의 좌약 베이스, 예를 들어, 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드를 함유하는 직장 조성물, 예를 들어, 좌약 또는 유지 관장제로 또한 제형화될 수 있다.
게다가, 화합물은 데포 제제로서 제형화될 수 있다. 그와 같은 지속성 제형은 이식으로(예를 들어, 피하로 또는 근육내로) 또는 근육내 주사로 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 화합물은 적합한 폴리머 또는 소수성 물질(예를 들어 허용가능한 오일에서 유탁액으로서) 또는 이온교환수지로, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
조성물은, 원하는 경우, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투약 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 분배기 디바이스로 제시될 수 있다. 팩은, 예를 들어, 금속 또는 플라스틱 포일, 예를 들어, 수포 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 분배기 디바이스는 투여용 지침에 의해 동반될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 기재된 화합물은 또한 변형이 모 화합물로, 어느 한쪽 일상적인 조작에서 또는 생체내, 절단되는 그와 같은 방식으로 화합물에서 존재하는 작용기 변형에 의해 제조될 수 있는, 전구약물로서 지칭된 유도체를 포함한다.
투약량
본 발명의 명세서에서 기재된 화합물은 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 질환, 예컨대 비제한적으로, 본 명세서에서 기재된 암을 예방, 치료, 또는 제어하기 위해 치료적으로 효과적인 용량으로 환자에 투여될 수 있다. 하나 이상의 본 명세서에서 기재된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 환자에서 효과적인 치료 반응을 유도하는 데 충분한 양으로 환자에 투여될 수 있다. 이것을 달성하기에 적절한 양은 "치료적으로 효과적인 용량"으로서 정의된다. 용량은 이용된 특정한 화합물의 효능 및 대상체의 상태뿐만 아니라 체중 또는 치료될 부분의 표면적에 의해 결정될 수 있다. 용량의 크기는 또한 특별한 대상체에서 특별한 화합물 또는 벡터의 투여를 동반하는 임의의 역효과의 존재, 성질, 및 정도에 의해 결정될 것이다.
그와 같은 화합물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50(모집단의 50 %에 치명적인 용량) 및 ED50(모집단의 50 %에 치료적으로 효과적인 용량) 결정에 의해, 세포 배양물 또는 실험적 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. LD50 및 ED50은 성분 단독 또는 조합에 대하여 결정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이 용량 비는 치료 지수이고 비, LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 일부 구체예에서, 큰 치료 지수를 나타내는 조합이 사용된다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있는 반면, 정상 세포에 잠재적 손상을 최소화하기 위해 그리고, 이로써, 부작용을 감소시키기 위해 감염된 조직의 부위에 그와 같은 화합물을 표적하는 전달 시스템을 설계하는 데 주의해야 한다. 부작용은, 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기재된 B-raf 억제제 및 하나 이상의 DNA 손상제의 조합 이용에 의해 회피될 수 있다. 부작용은 하나 이상의 치료제의 더 낮은 용량 이용에 의해 회피 또는 감소될 수 있다.
세포 배양물 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서의 사용을 위하여 투약 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 그와 같은 화합물의 투약량은 독성이 거의 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투약량은 이용된 투약 형태 및 투여의 경로에 의존하여 이러한 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 명세서에서 기재된 임의의 화합물을 위하여, 치료적으로 효과적인 용량은 세포 배양물 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정된 경우 IC50(증상의 절반-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 그와 같은 정보는 인간에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다. 혈장내 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정될 수 있다. 일반적으로, 모듈레이터의 용량 당량은 전형적인 대상체에 대하여 약 1 ng/kg 내지 10 mg/kg이다.
본 발명의 명세서에서 기재된 화합물 및/또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 투여 양 및 빈도는 환자의 연령, 병태 및 크기 뿐만 아니라 치료될 증상의 중증도와 같은 인자를 고려하여 주치 임상의의 판단에 따라 조절될 것이다. 통상적으로 숙련된 의사 또는 수의사는 병태의 진행을 예방, 대응 또는 정지하기 위해 요구된 약물의 유효량을 쉽게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로 유효량이 0.001 mg/kg 내지 10 mg/kg 체중, 및 특히 0.01 mg/kg 내지 1 mg/kg 체중일 것이 고려된다. 하루 내내 적절한 간격에서 2, 3, 4 또는 초과 하위-용량으로서 요구된 용량을 투여하는 것이 적절할 수 있다. 상기 하위-용량은, 예를 들어, 단위 투약 형태당 0.01 내지 500 mg, 및 특히 0.1 mg 내지 200 mg의 활성 성분을 함유하는 단위 투약 형태로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 약제학적 제제는 단위 투약 형태이다. 그와 같은 형태에서, 제제는 활성 성분의 적절한 양, 예를 들면, 원하는 목적을 달성하기 위한 유효량을 함유하는 적절한 크기의 단위 용량으로 세분된다. 제제의 단위 용량에서 활성 화합물의 양은, 특정한 적용에 따라, 약 0.01 mg 내지 약 1000 mg, 약 0.01 mg 내지 약 750 mg, 약 0.01mg 내지 약 500 mg, 또는 약 0.01mg 내지 약 250 mg으로 가변 또는 조정될 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체에 투여된, B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 양은 매일 2회 약 또는 하기, 960 mg, 720 mg, 480 mg, 240 mg, 150 mg, 100 mg, 50 mg, 또는 25 mg 미만이다. 이용된 실제 투약량은 환자의 요건 및 치료될 병태의 중증도에 따라 다양할 수 있다. 특별한 상황에 대하여 적절한 투약 요법의 결정은 기술 분야의 범위 이내이다. 편의상, 총 투약량은 요구되는 바와 같이 하루 동안 나누어서 분할 및 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 화합물은 또 다른 화합물과 투여된다. 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다. 조합물은 동일한 투약 형태일 수 있거나 별개의 용량으로서 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 화합물은 B-raf 억제제이고 다른 화합물은 하나 이상의 DNA 손상제이다. 일부 구체예에서, DNA 손상제는 젬시타빈, 5-FU, 시타라빈, 메토트렉세이트, 피리메타민, 블레오마이신, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 에토포시드, 독소루비신, 비노렐빈, 미톡산트론, 포도필로톡신, 아피디콜린, 포테무스틴, 카르무스틴, S-23906, S39, SN-38, 토포테칸, 캄프토테신, 레벡카마이신, 및 기타이다. 일부 구체예에서, DNA 손상제는 B-raf 억제제 전에 투여된다. 일부 구체예에서, DNA 손상제는 B-raf 억제제 전에 적어도, 또는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 120, 180, 240, 300, 또는 360분 전에 투여된다. 일부 구체예에서, DNA 손상제는 B-raf 억제제 적어도, 또는 약, 1, 2, 3, 4, 또는 5일 전에 투여된다. 일부 구체예에서, MEK 억제제가 대상체에 투여되기에 앞서 DNA 손상제가 대상체에 투여된다. 일부 구체예에서, DNA 손상제는 MEK 억제제 전에 적어도, 또는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 120, 180, 240, 300, 또는 360분 전에 투여된다. 일부 구체예에서, DNA 손상제는 MEK 억제제 전에 적어도, 또는 약, 1, 2, 3, 4, 또는 5일 전에 투여된다.
본 발명의 일부 구체예에서, B-raf 억제제의 양은 약 1 mg 내지 약 100 mg, 약 5 mg 내지 약 100 mg, 약 10 mg 내지 약 100 mg, 약 25 mg 내지 약 100 mg, 약 50 mg 내지 약 100 mg, 또는 약 75 mg 내지 약 100 mg일 수 있다. 일부 구체예에서, B-raf 억제제의 양은 약 1 mg 내지 약 80 mg, 약 1 mg 내지 약 60 mg, 약 1 mg 내지 약 40 mg, 약 1 mg 내지 약 20 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 10 mg일 수 있다. 일부 구체예에서, B-raf 억제제의 양은 약 5 mg 내지 약 80 mg일 수 있다. 일부 구체예에서, B-raf 억제제의 양은 약 5 mg 내지 약 240 mg이다. 일부 구체예에서, DNA 손상제는 약 1250 mg/m2, 1000 mg/m2, 800 mg/m2, 600 mg/m2, 400 mg/m2, 200 mg/m2, 100 mg/m2, 또는 50 mg/m2, 25 mg/m2, 10 mg/m2, 또는 5 mg/m2, 또는 미만 또는 그 사이 임의의 범위의 용량으로 투여된다. 일부 구체예에서, DNA 손상제의 용량은 환자 또는 대상체에 대하여 아치사 용량으로 간주된다.
본 발명의 명세서에서 기재된 화합물은 또한, 항-구토제로서도 지칭될 수 있는, 메스꺼움방지 제제와 투여될 수 있다. 그와 같은 제제의 예는, 비제한적으로, 돌라세트론, 그라니세트론, 온단세트론, 트로피세트론, 팔로노세트론, 미타자핀, 아프레피탄트, 카소피탄트, 및 기타를 포함한다.
의료 용도
본 발명의 명세서에서 기재된 조성물은 암 치료에 유용할 수 있다. 그와 같은 암의 예는, 비제한적으로, 흑색종, 췌장암, 폐암, 결장암, 난소암, 전립선암, 및 유방암으로서 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 종양은 BRAF 돌연변이에 대하여 음성이다. 일부 구체예에서, 종양은 야생형 BRAF이다. 일부 구체예에서, 종양은 BRAF에서 돌연변이를 갖는다. 일부 구체예에서, 종양은 BRAF V600E 돌연변이를 갖는다. 일부 구체예에서, 종양은 BRAF V600E 돌연변이가 없다. 일부 구체예에서, 종양은 BRAF V600K 돌연변이를 갖는다. 일부 구체예에서, 종양은 BRAF V600K 돌연변이가 없다. 일부 구체예에서, 종양은 KRAS 돌연변이를 갖는다. 일부 구체예에서, KRAS 돌연변이는 G12C, G12D, G12V, 또는 G13D이다. 일부 구체예에서, 종양은 KRAS 돌연변이가 없다. 일부 구체예에서, 종양은 야생형 KRAS이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 종양은 B-raf 억제제 및 하나 이상의 DNA 손상제의 조합 투여에 앞서 돌연변이에 대하여 분석된다. 일부 구체예에서, 종양은 BRAF V600E 돌연변이에 대하여 분석된다. 일부 구체예에서, 종양은 BRAF V600K 돌연변이에 대하여 분석된다. 일부 구체예에서, 종양은 KRAS G12C 돌연변이에 대하여 분석된다. 일부 구체예에서, 종양은 KRAS G12D 돌연변이에 대하여 분석된다. 일부 구체예에서, 종양은 KRAS G12V 돌연변이에 대하여 분석된다. 일부 구체예에서, 종양은 KRAS G13D 돌연변이에 대하여 분석된다. 일부 구체예에서, BRAF내 돌연변이가 발견되지 않으면 환자는 B-raf 억제제 및 DNA 손상제의 조합으로만 치료된다. 일부 구체예에서, BRAF내 돌연변이가 발견되면 환자는 B-raf 억제제 및 DNA 손상제의 조합으로만 치료된다. 일부 구체예에서, KRAS내 돌연변이가 발견되지 않으면 환자는 B-raf 억제제 및 DNA 손상제의 조합으로만 치료된다. 일부 구체예에서, KRAS내 돌연변이가 발견되면 환자는 B-raf 억제제 및 DNA 손상제의 조합으로만 치료된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 암의 치료 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 암은 흑색종, 췌장암, 폐암, 결장암, 난소암, 전립선암, 또는 유방암이다. 일부 구체예에서, 암은 본 명세서에서 기재된 암 중 하나로 유래된 전이성 암이다. 따라서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 전이성 암의 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기재된 방법은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 B-raf 억제제 및 하나 이상의 DNA 손상제의 조합 투여를 포함한다. 일부 구체예에서, B-raf 억제제는 하나 이상의 DNA 손상제와 동시에 또는 하나 이상의 DNA 손상제와 순차적으로 (이전 또는 이후) 대상체에 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 초기에 B-raf 억제제 투여 및 그 다음 억제제가 완전히 투여되기 전에 하나 이상의 DNA 손상제 투여 또는 그 반대를 포함한다. 그와 같은 투여는 치료제 중첩으로 지칭될 수 있다. 일부 구체예에서, 조합물은 또한 본 명세서에서 기재된 바와 같이 MEK 억제제 또는 EGFR 억제제와 투여된다. 화합물은 임의의 순서로 투여될 수 있고, 이들은 단순히 예일 뿐이고 제한되도록 의도되지 않는다. 일부 구체예에서, 대상체에는 BRAF 또는 MEK 억제제로 치료되기에 앞서 본 명세서에서 기재된 바와 같이 DNA 손상이 투여된다. 일부 구체예에서, 대상체에는 제1 단계에서 젬시타빈, 메토트렉세이트, 또는 피리메타민(또는 본 명세서에서 기재된 다른 DNA 손상제)이 투여되고 그 다음 후속적으로 대상체에는 BRAF 억제제가 투여된다. 이것은 또한 전처리로 지칭될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, B-raf 억제제가 대상체에 투여되기 전에 대상체는 DNA 손상제로 전처리된다. 일부 구체예에서, DNA 손상제와 B-raf 억제제 및/또는 MEK 억제제의 투여 사이 시간은 약, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 18, 20, 또는 24시간이다. 일부 구체예에서, DNA 손상제와 BRAF 및/또는 MEK 억제제의 투여 사이 시간은 약, 또는 적어도 1-24, 1-18, 1-12, 1-8, 1-6, 1-4, 4-12, 4-16, 4-20, 4-24, 8-12, 8-16, 8-20, 8-24, 12-16, 12-18, 12-24, 16-20, 16-24, 또는 20-24시간이다. 일부 구체예에서, BRAF 및/또는 MEK 억제제는 DNA 손상제가 투여된 후 1-10일에 투여된다. 일부 구체예에서, BRAF 및/또는 MEK 억제제는 DNA 손상제가 투여된 후 약, 또는 적어도, 1-10일에 투여된다. 일부 구체예에서, BRAF 및/또는 MEK 억제제는 약, 또는 적어도, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 DNA 손상제가 투여된 후 투여된다. 이러한 프로토콜은 필요에 따라, 예컨대, 및 단지 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8회 반복될 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 MEK 억제제가 투여되지 않는다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 대상체의 종양에서 BRAF 및/또는 KRAS 돌연변이의 검출 그리고 BRAF 및/또는 KRAS 돌연변이를 갖지 않는 대상체에서 B-raf 억제제 및 하나 이상의 DNA 손상제의 조합으로 대상체의 치료를 포함한다. 이것은 환자가 치료로부터 유익할 것임을 확보하기 위해 실시될 수 있다. 그러나, 이들이 그와 같은 돌연변이에 대하여 구체적으로 시험되어야 하는 요건은 없다. 일부 구체예에서, 검출되지 않는 돌연변이는 BRAF V600E 또는 V600K이다. 일부 구체예에서, BRAF 및/또는 KRAS 돌연변이를 가진 대상체는 본 명세서에서 기재된 조합으로 치료된다. 일부 구체예에서, 치료되는 대상체는 야생형 BRAF 및 돌연변이된 KRAS인 종양을 갖는다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 KRAS는 본 명세서에서 기재된 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 치료되는 대상체는 돌연변이된 BRAF 및 돌연변이된 KRAS를 가진 종양을 갖는다. 일부 구체예에서, 각각의 돌연변이는 본 명세서에서 기재되는 것들이다. 일부 구체예에서, 치료되는 대상체는 돌연변이된 BRAF 및 야생형 KRAS를 가진 종양을 갖는다. 돌연변이는 임의의 돌연변이, 예컨대 본 명세서에서 기재된 것일 수 있다. 종양에서 존재하는 돌연변이는 임의의 방법, 예컨대 PCR, RT-PCR, 게놈 서열분석, RNA 서열분석, 노던 블랏, 서던 블랏, 웨스턴 블랏, 또는 BRAF 및/또는 KRAS에서 돌연변이를 검출하는 데 사용될 수 있는 임의의 다른 분자 기술에 의해 검출될 수 있다. BRAF 및/또는 KRAS에서 돌연변이의 특정 검출 방법은 결정적이지 않다. 돌연변이는 임의의 종양 샘플에서 검출될 수 있다. 종양 샘플은, 예를 들어, 생검을 통해 수득될 수 있다. 혈액 샘플은 또한 종양의 돌연변이 상태를 확인하는 데 사용될 수 있다. 돌연변이의 존재 또는 부재 검출용 샘플 및 기술은 본 명세서에서 기재된 방법에 중요하지 않다.
본 발명의 일부 구체예에서, 약물 저항성 종양의 치료 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제 투여를 포함한다. 일부 구체예에서, 약물 저항성 종양은 B-raf 억제제로 구성되는 치료에 저항성이다. 일부 구체예에서, 약물 저항성 종양은 전이성 종양이다. 일부 구체예에서, 전이성 종양은 전이성 흑색종, 전이성 췌장 종양, 전이성 폐 종양, 전이성 결장 종양, 전이성 난소 종양, 전이성 전립선 종양, 전이성 폐 종양, 또는 전이성 유방 종양이다. 일부 구체예에서, 약물 저항성 종양은 흑색종, 췌장 종양, 폐 종양, 결장 종양, 난소 종양, 전립선 종양, 폐 종양, 또는 유방 종양이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 약물 저항성 종양은 야생형 BRAF로서 특징지어 진다. 일부 구체예에서, 약물 저항성 종양은 돌연변이체 BRAF로서 특징지어 진다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 BRAF는 BRAF V600E 또는 V600K이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 약물 저항성 종양은 야생형 KRAS로서 특징지어 진다. 일부 구체예에서, 약물 저항성 종양은 돌연변이체 KRAS로서 특징지어 진다. 일부 구체예에서, 약물 저항성 종양의 치료 방법은 추가로 투여 단계에 앞서 대상체에서 유래된 종양 샘플에서 BRAF V600E 또는 V600K 돌연변이의 존재 또는 부재의 검출을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 투여 단계에 앞서 대상체에서 유래된 종양 샘플에서 KRAS 돌연변이의 존재 또는 부재의 검출을 포함한다. B-raf 억제제는 본 명세서에서 기재된 임의의 그와 같은 억제제일 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, DNA 손상제는 본 명세서에서 기재된 임의의 것이다. 일부 구체예에서, 이는 젬시타빈, 5-FU, 시타라빈, 메토트렉세이트, 피리메타민, 블레오마이신, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 에토포시드, 독소루비신, 비노렐빈, 미톡산트론, 포도필로톡신, 아피디콜린, 포테무스틴, 카르무스틴, S-23906, S39, SN-38, 토포테칸, 캄프토테신, 레벡카마이신, 또는 임의의 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 일부 구체예에서, DNA 손상제는 젬시타빈, 메토트렉세이트 및/또는 피리메타민이다.
본 발명의 명세서에서 기재된 바와 같이, 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기재된 조합은, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 비히클에서, 비제한적으로, 흡입을 통해, 국소적으로, 비강으로, 경구로, 비경구로(예를 들면, 정맥내로, 복강내로, 방광내로 또는 척추강내로) 또는 직장으로, 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있고, 이의 비율은 화합물의 용해도 및 화학적 성질, 선택된 투여 경로 및 표준 실시에 의해 결정된다.
본 발명의 명세서에서 제공된 구체예는 또한 키트를 제공하였다. 일부 구체예에서, 키트는 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물, 및 DNA 손상제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나의 약제학적 조성물은 둘 다를 포함한다. 일부 구체예에서, 이들은 별개의 약제학적 조성물이다. 일부 구체예에서, 키트는 B-raf 억제제를 포함하는 제1 약제학적으로 허용가능한 컨테이너 그리고 DNA 손상제를 포함하는 제2 약제학적으로 허용가능한 컨테이너를 포함한다. 일부 구체예에서, 컨테이너는 멸균성이고 발열원이 없다. 일부 구체예에서, 키트는 처방 정보를 포함한다. 일부 구체예에서, 처방 정보는 야생형 B-raf 및/또는 돌연변이체 B-raf로서 특성규명된 종양을 가진 대상체에의 B-raf 억제제 및 DNA 손상제 투여용 지침을 포함한다. 일부 구체예에서, 처방 정보는 야생형 KRAS 또는 돌연변이체 KRAS로서 특성규명된 종양을 가진 대상체에의 B-raf 억제제 및 DNA 손상제 투여용 지침을 포함한다.
본 발명의 명세서에서 제공된 구체예는 또한 B-raf 억제제를 포함하는 약제학적 조성물 및 처방 정보를 포함하는 컨테이너를 제공하고, 상기 처방 정보는 야생형 RAF로서 특성규명된 종양을 가진 대상체에의 DNA 손상제와 B-raf 억제제 투여용 지침을 포함한다. 일부 구체예에서, 종양은 흑색종 종양이다. 일부 구체예에서, 컨테이너는 B-raf 억제제를 포함하는 캡슐, 정제, 또는 다른 경구 투약 형태를 포함한다. 일부 구체예에서, B-raf 억제제는 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 일부 구체예에서, DNA 손상은 이중 가닥 절단(DSBs), 단일 가닥 절단을 야기시키는 제제, 항대사물질, DNA 가교제, 토포이소머라제 억제제, 폴리머라제 억제제, 또는 알킬화제이다. 일부 구체예에서, DNA 손상제는 젬시타빈, 5-FU, 시타라빈, 메토트렉세이트, 피리메타민, 블레오마이신, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 에토포시드, 독소루비신, 비노렐빈, 미톡산트론, 포도필로톡신, 아피디콜린, 포테무스틴, 카르무스틴, S-23906, S39, SN-38, 토포테칸, 캄프토테신, 레벡카마이신, 또는 임의의 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 일부 구체예에서, 지침은 본 명세서에 기재되었으나, 이에 제한되지 않는 것과 같은, EGFR 억제제 또는 MEK 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 제공한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 당해 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 기재된 것과 유사한 또는 동등한 방법 및 물질이 본 명세서에서 기재된 조성물 및 화합물의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있어도, 적합한 방법 및 물질은 아래에 기재된다. 본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허출원, 특허, 및 다른 참조문헌은 참고로 그 전문이 편입된다. 충돌되는 경우, 정의를 포함하는, 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법, 및 그 예는 단지 설명적이고 제한되도록 의도되지 않는다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 화합물의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구항으로부터 분명해질 것이다.
본 발명의 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은, 건전한 의료 판단의 범위 내에서, 합리적인 유익/유해 비율에 비례한, 과도한 독성, 자극, 알러지성 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투약 형태를 지칭한다.
"약제학적 제형"은 추가로 담체, 용매, 부형제 및 염이 제형(예를 들면 본 명세서에 기재된 화합물)의 활성 성분과 양립가능해야 하는 것을 의미한다. 용어들 "약제학적 제형" 및 "약제학적 조성물"은 일반적으로 호환가능하고, 이들이 본 명세서의 목적을 위하여 그렇게 사용되는 것이 당업자에 의해 이해된다.
본 발명의 명세서에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 염"은 모 화합물이 이의 산 또는 염기 염 제조에 의해 변형되는 개시된 화합물의 유도체를 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 염의 예는, 비제한적으로, 염기성 잔기 예컨대 아민의 미네랄 또는 유기산염; 산성 잔기 예컨대 카복실산의 알칼리 또는 유기염; 및 기타를 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 염은 종래의 무독성 염 또는, 예를 들어, 무독성 무기 또는 유기 산으로부터 형성된 모 화합물의 4차 암모늄 염을 포함한다. 예를 들어, 그와 같은 종래의 무독성 염은, 비제한적으로, 하기로부터 선택된 무기 및 유기 산에서 유래된 것을 포함한다: 2-아세톡시벤조산, 2-하이드록시 에탄 설폰산, 아세트산, 아스코르브산, 벤젠 설폰산, 벤조산, 중탄산, 탄산, 시트르산, 에데트산, 에탄 디설폰산, 에탄 설폰산, 푸마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글라이콜산, 글리콜리아르사닐산, 헥실레조르신산, 하이드라밤산, 브롬화수소산, 염산, 하이드로아이오다이드, 하이드록시말레산, 하이드록시나프토산, 이세티온산, 락트산, 락토바이온산, 라우릴 설폰산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄 설폰산, 납실산, 질산, 옥살산, 파모산, 판토텐산, 페닐아세트산, 인산, 폴리갈락투론산, 프로피온산, 살리실산, 스테아르산, 서브아세트산, 석신산, 설팜산, 설파닐산, 황산, 탄닌산, 타르타르산, 및 톨루엔 설폰산. 본 개시내용은 본 명세서에서 기재된 임의의 화합물(들)의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
약제학적으로 허용가능한 염은 종래의 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 그와 같은 염은 물에서 또는 유기 용매에서, 또는 상기 두개의 혼합물에서; 일반적으로, 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세토니트릴, 및 기타 같은 비-수성 배지에서 적절한 염기 또는 산의 화학양론적 양과 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 적합한 염의 목록은 하기에서 발견된다: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, USA, p. 1445 (1990).
전구약물이 의약품의 수많은 바람직한 품질(예를 들면, 용해도, 생체이용률, 제조 등)을 향상시킨다고 알려졌기 때문에 본 명세서에 기재된 화합물은 전구약물 형태로 전달될 수 있고 질환의 치료를 위하여 이러한 형태로 투여될 수 있다. "전구약물"은 상기 전구약물이 포유동물 대상체에 투여되는 경우 생체내 본 명세서에 기재된 활성 모체 약물을 방출시키는 임의의 공유결합된 담체를 포함하도록 의도된다. 전구약물은 변형이, 어느 한쪽 일상적인 조작에서 또는 생체내, 모 화합물로 절단되는 그와 같은 방식으로 화합물에서 존재하는 작용기 변형에 의해 제조된다. 전구약물은 하이드록시, 아미노, 또는 설프하이드릴 기가, 전구약물이 포유동물 대상체에 투여되는 경우, 유리 하이드록실, 유리 아미노, 또는 유리 설프하이드릴 기, 각각을 형성하기 위해 절단하는 임의의 기에 결합되는 본 명세서에서 기재된 화합물을 포함한다. 전구약물의 예는, 비제한적으로, 본 명세서에서 기재된 화합물에서 알코올 및 아민 작용기의 아세테이트, 포르메이트, 및 벤조에이트 유도체를 포함한다.
본 발명의 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료하는" 또는 "치료"는, 병태, 질환, 장애 등의 개선을 초래하는, 임의의 효과 예를 들면, 축소, 감소, 조절, 또는 제거를 포함한다. 질환 상태의 "치료하는" 또는 "치료"는 포유동물에서, 특히 인간에서 질환-상태의 치료를 의미하고, 하기를 포함한다: (a) 현존하는 질환-상태의 억제, 즉, 그것의 발생 또는 그것의 임상 증상의 정지; 및/또는 (c) 질환-상태의 완화, 즉, 질환 상태의 퇴행 야기.
본 발명의 명세서에서 사용된 바와 같이, "포유동물" 또는 "대상체"는 인간 및 비-인간 환자를 지칭한다. 일부 구체예에서, 대상체는 필요로 하는 대상체이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "필요로 하는" 환자는 치료를 필요로 하는 것으로 확인되고 있거나 치료가 필요한 것으로 의심되는 대상체이다. 예를 들어, 암으로 진단되어 왔던 대상체는 필요로 하는 대상체로 간주될 수 있다. 종래에, BRAF 돌연변이가 없는 대상체는 그와 같은 치료에 대해 사용금지되기 때문에 B-raf 억제제에 대하여 필요로 하는 대상체로 간주되지 않을 것이다. 그러나, B-raf 억제제 및 하나 이상의 DNA 손상제의 본 명세서에서 기재된 조합은 그와 같은 BRAF 야생형 종양을 B-raf 억제제 치료에 민감화시키기 위한 조합물에 대한 능력 때문에 필요로 하는 대상체에 그 동일한 대상체를 변화시킬 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 생물학적 활성, 예를 들면 통증 완화를 유도하기에 충분한 양으로 수령체내 또는 수령체상에 존재하는 본 명세서에서 기재된, 화합물, 또는 화합물의 조합을 지칭한다. 일부 구체예에서, 화합물의 조합은 상승작용적 조합이다. 예를 들어, Chou and Talalay, Adv . Enzyme Regul. vol. 22, pp. 27-55 (1984)에 의해 기재된 바와 같이, 상승효과는 조합으로 투여된 경우 화합물의 효과가 단일 제제로서 단독 투여된 경우 화합물의 부가적 효과보다 더 큰 경우 발생한다. 일반적으로, 상승작용적 효과는 화합물의 하위-최적 농도에서 가장 명확히 실증된다. 상승효과는 더 낮은 세포독성, 통증에서 증가된 감소, 또는 개별 구성요소와 비교된 조합물의 일부 다른 유익한 효과에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용된 모든 백분율 및 비는, 달리 나타내지 않는 한, 중량 기준이다.
설명 내내, 조성물이 특정 성분을 갖는, 포함하는, 또는 포괄하는 것으로 기재된 경우, 또는 공정이 특정 공정 단계를 갖는, 포함하는, 또는 포괄하는 것으로 기재된 경우, 본 명세서에서 기재된 조성물이 또한 인용된 성분으로 본질적으로 구성되거나, 상기로 구성되는 것, 그리고 본 명세서에서 기재된 공정이 또한 인용된 가공 단계로 본질적으로 구성되거나, 상기로 구성되는 것이 고려된다. 또한, 공정이 여전히 작동가능한 한 단계의 순서 또는 특정 행위 수행용 순서가 중요하지 않다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 2 이상의 단계 또는 행위는 동시에 수행될 수 있다.
본 개시내용 내내 사용된 바와 같이, 단수 형태("a," "an," 및 "the")는 문맥이 명확히 달리 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "조성물" 참조는 복수의 그와 같은 조성물, 뿐만 아니라 단일 조성물을 포함하고, "치료 제제" 참조는 하나 이상의 치료적 및/또는 약제학적 제제 및 당해 분야의 숙련자에 공지된 이의 등가물, 및 기타 등등 참조이다. 따라서, 예를 들어, "숙주 세포" 참조는 복수의 그와 같은 숙주 세포를 포함하고, "항체" 참조는 하나 이상의 항체 및 당해 분야의 숙련가공지된 이의 등가물, 그리고 기타 등등 참조이다.
본 발명의 명세서에 기재된 화합물은 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물을 설명하지만, 제한하지는 않는다. 요법에서 정상적으로 마주치는 다양한 조건 및 파라미터의 다른 적합한 변형 및 적응 그리고 당해 분야의 숙련자에 명백한 것은 본 명세서에서 기재된 화합물 및 방법의 사상 및 범위 내에 있다.
실시예 1: 젬시타빈이 베무라페닙의 치료 효과를 향상시킨다
세포는 대략 250,000 세포/웰로 플레이팅되었다. 대략 24시간 후, 화합물은 도 1a 및 1b에서 나타낸 바와 같이 단독 또는 조합으로 투여되었다. 대략 48시간 후, 세포는 채취되었고 카운트되었다. 도 1a 및 1b는 베무라페닙 및 젬시타빈의 상승작용 효과를 설명한다. 놀라운 결과는 화합물의 조합이 야생형 BRAF인 세포 유형에서조차 효과적이었다는 것이었다.
도 2a 및 2b는 대략 100배만큼 베무라페닙에 대한 세포의 감수성을 증가시키는 베무라페닙 및 젬시타빈의 조합을 설명한다. 세포는 야생형 BRAF를 갖는 선암종에서 유래된다. 따라서, 베무라페닙이 세포 사멸에서 효과적일 것이 기대되지 않을 것이다. 그러나, 베무라페닙이 젬시타빈과 조합된 경우 세포가 민감화되고 베무라페닙 요법에 반응하였던 것이 밝혀졌다. 도 1a, 1b, 2a 및 2b에서 볼 수 있듯이, 결과는 각각의 제제가 단독 사용된 경우 관측되지 않았고, 조합으로 사용될 때 뿐이었다. 조합물은 또한 상당한 세포 사멸을 달성시키기 위해 하나 이상의 각각의 화합물의 더 적은 양을 사용할 수 있었다. 조합물은 또한 어느 한쪽 화합물 단독보다 그리고 상승작용 양에서 더 나은 콜로니 형성을 억제시켰다(데이터 도시되지 않음).
야생형 B-raf 및 돌연변이체 KRAS(G12C)를 가진 전이성 암 세포주는 다양한 병태 하에 젬시타빈 및 베무라페닙으로 처리되었다. 세포는 어느 한쪽 양쪽 제제로 동시에 또는 순차적으로, 즉 어느 한쪽 젬시타빈을 먼저 이어서 베무라페닙 또는 베무라페닙을 먼저 이어서 젬시타빈으로 처리되었다. 제제가 세포로부터 세정된 후, 세포는 콜로니를 형성하게 되었다. 세포는 고정되었고 (농축된 메탄올) 20 % 에탄올내 0.4 % 크리스탈 바이올렛으로 염색되었고 콜로니는 595nm에서 흡광도 판독에 의해 정량화되었다. 하기 표에서 설명된 바와 같이 결과는 젬시타빈 이어서 베무라페닙의 순차적 첨가가 동시 치료에 비교된 경우 또는 베무라페닙(약물 A)이 젬시타빈(약물 B)에 앞서 첨가된 경우 감소된 콜로니 형성을 초래하였다는 것을 보여준다.
Figure pct00003
이들 결과는 또한 도 3a 및 3b에서 설명된다.
임의의 특정 이론에 의한 구속됨 없이 이러한 결과는 세포를 S-상(젬시타빈)에서 정지시키는 DNA 손상제의 아치사 용량으로 WT BRAF/돌연변이체 KRAS 세포 프라이밍때문인 것으로 여겨지거나, 다른 DNA 손상제가 G2 상(독소루비신, 에토포시드)에서 사용되었다면, 베무라페닙, 또는 다른 B-raf 억제제 예컨대 본 명세서에서 개시된 것의 첨가가, 세포 사이클 정지 이후 MAPK 경로를 활성화시키고 정지된 세포가 손상된 미복제된 DNA를 증식하려고 시도한다. 세포는 그 다음 생존할 수 없고 죽는다. DNA 손상제를 이용하여 세포의 프라이밍 없이, B-raf 억제제는 정상적으로 MAPK 경로를 활성화시키고, B-raf 억제제의 표지에서 금기되는, 야생형 B-Raf를 가진 종양 세포의 향상된 증식을 유발시킨다.
이들 결과는, 야생형 B-raf 종양내 그와 같은 억제제의 사용이 가질 수 없는 유해한 효과 때문에 베무라페닙의 치료에 앞서 종양 시료에서 BRAF V600E 돌연변이를 입증하기 위해 임상의에게 나타나는, 베무라페닙, 및 다른 B-raf 억제제용 표지의 면에서 놀랍다. 따라서, 베무라페닙이 처리된 세포 유형에서 효과적이었을 것 그리고 베무라페닙의 효과가, 이중 가닥 절단을 야기시키는 제제인, DNA 손상제, 예컨대 젬시타빈과 이것을 조합시킴으로써 상승작용으로 향상되지 않았을 것이 기대되지 않을 것이다. 세포를 사멸시키는 능력은 KRAS 돌연변이와 무관하였고, 이것은 베무라페닙이 KRAS 돌연변이된 종양에서 효과적이지 않았다는 것을 나타내는 이전의 입증 때문에 또한 놀랍고 의외이었다.
실시예 2:
베무라페닙 저항성 SK-MEL-28VR1 세포의 확인 및 특성규명.
SK-MEL-28 베무라페닙 저항성 세포주는 SK-MEL-28 친계 세포로부터 약물 선택을 통해 단리되었다. SK-MEL-28VR1의 증식 속도는 또한 친계 세포주보다 더 높았다(도 4a). SK-MEL-28VR1 세포는 16시간의 배가 시간을 가졌고 반면 친계 세포는 23.1시간의 배가 시간을 가졌다. 콜로니 형성 검정은 SK-MEL-28VR1 세포가 그것의 친계 세포주에 비교된 베무라페닙에 저항성인 것이 드러났다(도 4b). SK-MEL-28VR1 세포는 ~30 μM의 베무라페닙에서 IC50(데이터 도시되지 않음)을 가졌고 반면 친계 세포주는 ~1 μM에서 IC50을 가졌다(도 4b). 질량 분석법(MS) 분석은 SK-MEL-28VR1이 베무라페닙 처리에 반응하여 친계 세포주에 비교된 상이한 단백체 프로파일을 가졌다는 것을 드러냈다. FAM129B는 베무라페닙으로 처리된 SK-MEL-28VR1 세포 대 비히클로 처리된 SK-MEL-28VR1 세포 사이 제3 최고 차등 발현을 가진 것으로서 확인되었다(표 2).
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
표 2: 비편향된 질량 분석법: SK-MEL-28VR1 대 SK-MEL-28 세포 사이 베무라페닙 처리 이후 최대 차등 발현을 가진 단백질. 확인된 단백질은 SK-MEL-28VR1 세포에서 약물 처리로 존재도가 증가하고 SK-MEL-28 세포에서 약물 처리로 존재도가 감소한다. 배수 차등은 친계 SK-MEL-28 세포에 비하여 SK-MEL-28VR1 세포의 베무라페닙 처리로 특정 단백질의 증가된 존재도의 정량적 측정이다.
세포질 FAM129B 존재도는 비히클 처리에 비하여 베무라페닙 처리로 ~6배 증가하였다(도 5a). 흥미롭게도, FAM129B 존재도는 친계 SK-MEL-28 세포에서 베무라페닙 처리에 반응하여 감소하였다. 이들 경향은 SK-MEL-28VR1 세포에서 활성 MAPK 경로를 나타냈지만 SK-MEL-28 세포에서는 아니었다. 게다가, FAM129B 단백질 경향은 세포 증식의 관측된 유도를 뒷받침하였고 SK-MEL-28 세포에 비하여 SK-MEL-28VR1 세포의 침습성 잠재력에서 증가를 제시하였다.
중요하게는, 세린 생합성 경로 단백질은 베무라페닙에 반응하여 감수성 세포와 저항성 사이 정의된 경로 이내 최고 차등적으로 발현된 단백질이었다. 경로의 모든 3효소(PHGDH, PSAT1, PSPH) 및 세린-tRNA 리가제 SARS(세포질성) 및 SARS2(미토콘드리아성)는 비히클보다 베무라페닙에 노출된 SK-MEL-28VR1 세포에서 동등 또는 더 높은 존재도로 발현되었고, 반면 반대편 추세는 친계 세포에서 관측되었다(데이터 도시되지 않음). PHGDH 항체를 이용하는 웨스턴 블랏팅은 MS 분석을 통해 관측된 경향을 확인하였다(도 5b). MS 데이터와 일치하는, 웨스턴 블랏은 SK-MEL-28VR1 세포가 친계 세포에 비하여 증가된 기준선 PHGDH 발현을 가졌다는 것을 드러냈다(도 5b). 추가적으로, 웨스턴은 PHGDH 수준이, MS 데이터(도시되지 않음)와 일치하는, SK-MEL-28VR1 세포(도 5b)에서 베무라페닙 처리 이후 증가하였다는 것을 드러냈다.
PHGDH는 SK- MEL - 28VR1 세포의 베무라페닙 저항에 필수적이다: PHGDH는 세린 합성 경로의 제1 단계를 포함하는 3-포스포하이드록시피루베이트로의 3-포스포글리세레이트의 전환을 촉매화시키는 효소이다. 세린 합성이 베무라페닙 저항에 결정적이었는지를 직접적으로 시험하기 위해, 우리는 SK-MEL-28VR1 및 SK-MEL-28 세포주에서 PHGDH를 고갈시키기 위해 siRNA를 사용하였다(도 13). PHGDH siRNA는 베무라페닙 처리 이후 SK-MEL-28VR1 세포사를 상당히 향상시키면서 베무라페닙에 의해 친계 SK-MEL-28 세포사에서 임의의 부가적 효과를 갖지 않았다(도 6a 및 6b). 대조군 siRNA 처리는 각각의 세포주에 대하여 베무라페닙 처리 이후 세포 생존력의 기준선을 확립시켰다. PHGDH siRNA + 베무라페닙 처리는 SK-MEL-28VR1 세포에서 기준선 아래 감소된 세포 생존력을 나타냈고(도 6b) 반면 친계 세포는 그러지 못했다(도 6a).
메토트렉세이트는 SK- MEL -28 VR1 세포를 베무라페닙에 선택적으로 민감화시킨다: 세린 생합성 단백질이 친계 SK-MEL-28 세포가 아닌 SK-MEL-28VR1 세포에서 선택적으로 유도됨에 따라, 우리는 세린이 폴레이트 사이클의 직접적인 유입이기 때문에 세린 합성이 폴레이트 사이클에 기여하고 있는지를 조사하였다. 폴레이트 사이클은 암 세포에서 DNA 합성 및 치유에 결정적인 타이미딜레이트의 생산을 초래하는 테트라하이드로폴레이트(THF)의 생산에 필요하다(Tedeschi 등, 2013). 추가적으로, 동일한 연구는 세린의 글리신으로의 전환 그리고 폴레이트 사이클 양쪽이 종양-유래된 세포주의 사이토졸에서 ATP 생산의 1-탄소 대사성 사이클에 전구체를 제공하는 것을 실증하였다. 메토트렉세이트, 항엽산제는 디하이드로폴레이트 환원효소 및 타이미딜레이트 합성효소를 억제시키고 따라서 뉴클레오타이드 합성을 억제시킨다(Sneader, 2006). 메토트렉세이트는 또한 종양-유래된 세포주에서 ATP 수준을 감소시키는 것으로 알려졌다(Tedeschi 등, 2013). 폴레이트 사이클에 세린의 중요성과 일치하는, 메토트렉세이트(75nM)는 베무라페닙 처리 이후 세포의 SK-MEL-28VR1 사멸을 상당히 향상시켰다(도 6d). 반대로, 메토트렉세이트/베무라페닙 처리에 의한 상당한 사멸은 친계 SK-MEL-28 세포에서 관측되지 않았다(도 6c).
세린 고갈은 베무라페닙에 SK- MEL - 28VR1 세포를 민감화시킨다: 메토트렉세이트로 세린 합성의 폴레이트 사이클 다운스트림 방해가 베무라페닙에 SK-MEL- 28VR1 세포를 민감화시켰기 때문에, 우리는 SK-MEL-28VR1 베무라페닙 저항에서 세포외 세린 고갈의 효과를 검사하였다. 우리는 콜로니 형성 검정에서 SK-MEL-28VR1 세포의 약물 처리 및 세포 플레이팅 동안 세린, 글루코스, 및 글리신 고갈된 배지를 사용하였다. 세포는 약물 처리 이후 완전한 배지로 재공급되었고 콜로니 속으로 성장하게 되었다. 콜로니 형성 검정의 정량화는 세린 고갈된 병태 하에 베무라페닙 처리 이후 SK-MEL-28VR1 세포사에서 증가를 드러냈다(도 6e). 2.5μM 및 5μM의 베무라페닙 용량에서, SK-MEL-28VR1 세포는 완전한 배지가 아닌 세린 고갈로 >50 % 세포사를 보여주었다. 우리는 또한 SK-MEL-28VR1 세포의 베무라페닙 저항에서 높은 세포외 세린 수준의 효과를 검사하였다. 다량의 세포외 세린은 SK-MEL-28VR1 세포의 베무라페닙 저항에 영향을 주지 않았다(데이터 도시되지 않음). 종합하면, 이러한 데이터는 기준선 세포외 세린 수준이 베무라페닙 스트레스 상태 하에 SK-MEL-28VR1 세포 생존에 결정적이라는 것을 보여준다.
베무라페닙에 SK- MEL - 28VR1 세포의 감작제로서 젬시타빈의 확인: 폴레이트 사이클은 DNA 치유 동안 뉴클레오타이드 생산에 결정적이고, PHGDH, PSAT1, 및 PSPH 단백질 수준은 게놈 불안정의 병태 하에 증가하는 것으로 알려졌다(Markkanen 등, 2015). 따라서, 우리는 DNA 가교결합 제제, 토포이소머라제 억제제, 및 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 베무라페닙에 SK-MEL-28VR1 세포의 잠재적인 감작제로서 DNA 손상제의 몇 개의 부류를 시험하였다. 뉴클레오사이드 유사체 젬시타빈은 조합하여 사용될 때 베무라페닙에 SK-MEL-28VR1 세포를 상당히 민감화시켰고 반면 조합 처리는 단일 베무라페닙 처리에 대해 SK-MEL-28 세포를 민감화시키지 못했다(도 7a 및 7b). 50nM 용량의 젬시타빈은 콜로니 형성 검정에서 베무라페닙의 가변성 용량에 첨가되었다. 중요하게는, PHGDH siRNA 처리는 젬시타빈/베무라페닙 조합 처리로 관측된 세포사를 넘는 SK-MEL-28VR1 세포사를 향상시켰던 반면 젬시타빈/베무라페닙 조합으로 처리된 SK-MEL-28 친계 세포의 세포사를 향상시키지 못했다(도 7c 및 7d). 추가적으로, 메토트렉세이트는 젬시타빈/베무라페닙 조합과 함께 처리된 경우 SK-MEL-28 세포가 아닌 SK-MEL-28VR1 세포의 세포사를 상당히 향상시켰다(도 7e 및 7f). 중요하게는, 조합 지수(CI) 계산은 시험된 모든 용량에서 SK-MEL-28VR1 세포내 젬시타빈과 베무라페닙 사이 상승효과를 보여주었다(도 7g, 표 3(아래), 도 14a).
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표 3: SK-MEL-28VR1 세포내 젬시타빈/베무라페닙 조합용 CI 값(CI<1 = 상승효과, CI=1 = 부가적, CI>1 = 길항작용/경쟁적).
베무라페닙은 젬시타빈에 췌장 및 비-소 세포 폐 암 세포를 민감화시킨다: 젬시타빈은 췌장 암에서 1차 요법이다. 따라서, 우리는 베무라페닙 처리를 통해 젬시타빈 민감화에 대하여 4 췌장 세포주(BxPC3, Panc1, MiaPaca2, 및 BxPC3M1)를 시험하였다. 가변성 젬시타빈 용량 및 1 μM의 일정한 베무라페닙 용량을 이용하여, 콜로니 형성 검정은 BxPC3M1 세포가 베무라페닙에 의해 젬시타빈에 상당히 민감화되었다는 것을 드러냈다(도 8a). 중요하게는, 조합 지수(CI) 계산은 특정 용량에서 BxPC3M1 세포내 젬시타빈과 베무라페닙 사이 상승효과를 보여주었다(도 8b, 표 4, 도 14b). 최고(5000 nM) 및 최저(5 nM 및 10 nM) 젬시타빈 용량은 젬시타빈과 베무라페닙 사이 경쟁성을 보여주었다. 그러나, 25 nM-1000 nM의 젬시타빈 용량은 2 약물 사이 상승효과를 보여주었다. 추가적으로, 젬시타빈은 또한 진전된 비-소 세포 폐암(NSCLC)의 치료에서 특히 나이든 또는 부적응 환자에서 효과적이었다(Hayashi 등, 2011). 우리는 4기 선암종 NSCLC 세포주 NCI-H2122를 시험하였다. 우리는 1 μM 베무라페닙이 젬시타빈에 NCI-H2122 세포를 민감화시켰다는 것을 관측하였다(도 8c).
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표 4: BxPC3M1 세포내 젬시타빈/베무라페닙 조합용 CI 값(CI<1 = 상승효과, CI=1 = 부가적, CI>1 = 길항작용/경쟁적).
베무라페닙은 췌장 암 세포에서 세린 합성 단백질을 유도한다: 다음으로, 우리는 췌장암 세포 증식에서 베무라페닙 처리의 효과를 시험하였다. 시험된 모든 4개의 세포주(BxPC3M1, BxPC3, Panc1, 및 MiaPaca2)는 WT BRAF를 발현시킨다. 2010 Nature 연구(Georgia Hatzivassiliou 등, 2010)에 기반하여, 기대된 대로 베무라페닙 처리(10 μM)는 모든 4 세포주의 증가된 증식을 초래하였다 도 9a, 9b, 9c, 및 9d). 세린 합성이 종양 세포의 증가하는 증식과 상관관계가 있다고 나타났기 때문에, 우리는 췌장 세포주 대 MS의 단백체 프로파일을 비교하였다. 기대된 대로, PHGDH, PSAT1, PSPH, 및 SARS 단백질 존재도는 시험된 모든 4 세포주에서 증가하였다(도 9e, 9f, 9g, 및 9h). 중요하게는, BxPC3M1 세포는 시험된 다른 3 세포주에 비하여 모든 4 단백질의 단백질 존재도에서 최고 증가를 나타내었다. 추가적으로, 젬시타빈 + 베무라페닙과 조합으로 메토트렉세이트 처리는 메토트렉세이트 없이 젬시타빈 + 베무라페닙 처리에 비하여 BxPC3M1 및 NCI-H2122 세포의 세포사를 증가시켰다(도 10a 및 10b). 다음으로, 우리는 BxPC3M1 베무라페닙 저항에서 세포외 세린 고갈의 효과를 검사하였다. 우리는 콜로니 형성 검정에서 BxPC3M1 세포의 약물 처리 및 세포 플레이팅 동안 세린, 글루코스, 및 글리신 고갈된 배지를 사용하였다. 세포는 약물 처리 이후 완전한 배지로 재공급되었고 콜로니 속으로 성장하게 되었다. 콜로니 형성 검정의 정량화는 세린 고갈된 병태 하에 베무라페닙 처리 이후 BxPC3M1 세포사에서 유의미한 증가를 드러냈다(도 1Oc). 5 μM 베무라페닙 용량에서, BxPC3M1 세포는 완전한 배지가 아닌 세린 고갈된 배지로 >50 % 세포사를 보여주었다.
다브라페닙 , 또 다른 BRAF 억제제는 젬시타빈에 암 세포를 민감화시킨다: 베무라페닙에 유사한, 다브라페닙은 전이성 흑색종에 대해 효능을 갖는 BRAF V600E 억제제이다(Menzies 등, 2012; Spagnolo 등, 2015). 우리는 SK-MEL-28 VR1, BxPC3M1, 및 NCI-H2122 세포를 민감화시키기 위해 다브라페닙의 유효성을 시험하였다. 각각의 질환 상태의 1차 약물은 가변성 용량으로 제공되었다. 다브라페닙은 BRAF V600E 돌연변이를 가진 전이성 흑색종에서 1차 요법으로 간주되는 반면 젬시타빈은 췌장암 및 NSCLC에서 1차 요법이다. SK-MEL-28VR1 세포에 대하여, 젬시타빈 용량은 다브라페닙의 가변성 용량과 50 nm에서 일정하게 유지되었다. 그에 반해서, 다브라페닙 용량은 췌장암 및 NSCLC 세포주에서 젬시타빈의 가변성 용량과 1 μM에서 일정하게 유지되었다. 흥미롭게도, 다브라페닙 처리는 젬시타빈에 BxPC3M1 및 NCI-H2122 세포를 민감화시켰고(도 11a 및 11b), 젬시타빈은 다브라페닙에 SK-MEL-28VR1 세포를 민감화시켰다(도 11c).
논의: 우리는 BRAF V600E 억제제 저항의 기전을 연구하기 위해 베무라페닙 저항성 SK-MEL-28 세포(SK-MEL-28VR1)를 단리시켰다. 우리의 단백체 데이터는 베무라페닙에 반응하여 그것의 친계 SK-MEL-28 세포로부터 SK-MEL-28VR1 세포의 단백질 시그니처를 분화시켰다. 세린 생합성 경로 효소 수준(PHGDH, PSAT1, 및 PSPH, 뿐만 아니라 세린 tRNA-리가제 SARS1/2)은 SK-MEL-28VR1 세포의 베무라페닙 처리에 반응하여 상승되는 것으로 관측되었다. 반대로, 언급된 단백질의 5개 모두는 SK-MEL-28 친계 세포의 베무라페닙 처리에 반응하여 감소하였다. 후속적인 웨스턴 블랏팅은 MS 검정으로부터 관측된 단백질 경향을 확인하였다. 이들 결과로부터, 우리는 세린 합성이 SK-MEL-28VR1 세포의 베무라페닙 저항에 결정적이었다고 상정한다. 세린 합성은 암 세포 증식에 결정적이었던 것으로 나타났다(Labuschagne 등, 2014). Labuschagne 등에 의한 최근 연구는 글리신이 아닌 세린이 암 세포 증식 동안 뉴클레오타이드 및 아미노산 합성에 결정적이었다는 것을 보여주었다. 사실상, SK- MEL-28VR1 세포는 SK-MEL-28 세포(23.1시간 배가 시간)에 비하여 더 높은 증식 속도(16시간 배가 시간)를 가졌다. SK-MEL-28VR1 세포내 베무라페닙에 반응하여 세린 생합성 유도의 단백체 관찰은 암 세포 생존 증가에 세린 합성이 양성으로 상관관계가 있다는 공개된 보고를 뒷받침한다(Mattaini 등, 2016; Possemato 등, 2011).
siRNA를 통해 PHGDH 절제 이후 콜로니 형성 검정은 베무라페닙에 SK-MEL-28VR1 저항에 대한 PHGDH 유전자 생성물의 중요성을 확인하였다. 메토트렉세이트 처리 이후 콜로니 형성 검정과 함께 이러한 데이터는 SK-MEL-28VR1 세포의 저항 시그니처의 결정적 구성요소로서 세린 합성을 확인하였다. PHGDH는 3-포스포글리세레이트를 3-포스포하이드록시푸루베이트로 전환시키는 세린 생합성 경로의 제1 단계를 촉매화시킨다. 또한, PHGDH 유전자 증폭은 유방 암 및 흑색종에서 보고되어 왔다(Beroukhim 등, 2010; Locasale 등, 2011; Possemato 등, 2011). 사실상, 특정 유방암 세포 유형은 더 높은 PHGDH 유전자 발현을 통해 증가된 세린 합성 플럭스에 의존적인 것을 보여주었다(Possemato 등, 2011). 추가적으로, NSCLC에서, PHGDH 유전자 증폭 및 과-발현은 공격성 질환과 양성으로 상관관계가 있다(DeNicola 등, 2015). 중요하게는, PHGDH 유전자는 종종 전이성 흑색종에서 증폭되고 그것의 녹다운은 세포 생존력에 부정적으로 영향을 준다(Mullarky 등, 2011). PHGDH 절제 유도된 베무라페닙 민감화는 유방 암에서 BRCA1 절제 및 백금 기반 화학요법 줄거리를 연상시킨다.
세린 생합성은 업스트림으로 놓이고 뉴클레오타이드 및 아미노산 대사에서 관여된 다중 경로로 공급한다. 구체적으로, 폴레이트 사이클은 뉴클레오타이드 대사에 기여한다. 우리는 SK-MEL-28 및 SK-MEL-28VR1 세포 생존력에서 베무라페닙과 조합으로 항엽산제 약물 메토트렉세이트를 시험하였다. 메토트렉세이트는 베무라페닙에 SK-MEL-28VR1 세포를 선택적으로 민감화시켰다. 메토트렉세이트는 증식 동안 암 세포에서 활성화되는 SOG(세린-온 탄소 사이클-글리신 절단)로서 공지된 대안적인 대사성 경로에서 세린 생합성의 다운스트림으로 위치하는 폴레이트 사이클을 억제시킨다고 공지된다(Tedeschi 등, 2013). 또한, 세린 고갈 실험은 SK-MEL-28VR1 베무라페닙 저항에 대하여 세포외 세린의 기준선 수준에 대한 필요성을 실증하였다. 최근 연구는 BRAF 억제제 저항성 흑색종 세포가 세포 증식의 유도 동안 산화적 대사를 스위칭하는 것이 필요함을 확인하였다(Baenke 등, 2016). 사실상, 저항성 세포는 증식에 대하여 글루코스보다는 글루타민에 과도하게 의존적인 것으로 보고된다. 흥미롭게도, 글루타민으로부터 촉매화된, 글루타메이트는 세린 생합성 경로의 제2 단계의 전구체이다. 효소 PSPH는 3-포스포하이드록시피루베이트의 포스포세린으로의 전환 동안 글루타메이트의 α-케토글루타레이트로의 전환을 촉매화시킨다. 우리는 세린 합성이 증식 동안 산화적 대사로 상기 기재된 스위치의 결과로서 잠재적으로 우리의 SK-MEL-28VR1 세포에서 활성인 것을 상정한다. 추가 연구는 SK-MEL-28VR1 세포의 글루타민에의 의존성을 시험하는 데 필요하다.
다른 높은 확신의 적중 사이에서, FAM129B는 베무라페닙 처리에 관해 2세포주 사이 가장 차등적으로 발현된 단백질 중 하나로 확인되었다. FAM129B는 Niban-유사 단백질 1로서 또한 공지된 접착 연접-관련된 단백질이다. FAM129B는 B-RAF/MAPKK/ERK 신호전달 캐스케이드에 의해 4 세린 잔기에서 인산화되고(Old 등, 2009) FAM129B는 MAPK 경로가 활성인 경우 병태 하에서만 흑색종 세포의 세포질 전반에 분산되는 것으로 공지된다. 화학적 억제제 UO126으로의 MAPK 캐스케이드 억제는 FAM129B를 세포 막에 국소화시켰다. Smalley 등은 FAM129B 과발현이 흑색종 세포의 침습성 잠재력을 증가시켰다는 것을 보여주었다(Smalley 등, 2006). FAM129B는 MAPK 캐스케이드의 흑색종 다운스트림에서 다중 신호전달 경로에 영향을 준다(Conrad 등, 2013). 우리의 검정에서, 세포질 FAM129B 단백질 존재도는 베무라페닙 처리 이후 SK-MEL-28VR1 세포에서 증가하였지만 SK-MEL-28 세포에서 감소하였다. 따라서, 우리의 MS 검정에서 FAM129B 단백질 경향은 베무라페닙이 SK-MEL-28 세포가 아닌 SK-MEL-28VR1 세포에서 MAPK 경로 활성화를 유도시켰다는 것을 제시하였다. 또한, MAPK 활성화 제시된 베무라페닙은 세린 합성 유도의 관찰을 뒷받침하는 SK-MEL-28VR1 세포에서 세포 증식을 유도시킬 수 있다. 우리는 현재 전이성 흑색종 세포에서 베무라페닙 저항용 잠재적인 바이오마커로서 FAM129B를 조사중이다.
흥미롭게도, 폴레이트 사이클은 세포 증식 동안 뉴클레오타이드 풀의 보급에 기여하는 것으로 공지되고, DNA 손상은 뉴클레오타이드의 생산을 유도한다. 또한, 3 세린 합성 효소 수준은 모두 DNA 손상 및 게놈 불안정의 병태 하에 증가하는 것으로 나타났다(Markkanen 등, 2015). 우리는 베무라페닙에 SK-MEL-28VR1 세포의 감작제로서 몇 개의 DNA 손상제를 시험하였다. SK-MEL-28VR1 세포가 베무라페닙의 첨가 전 약물로 전처리된 경우 젬시타빈은 감작제로서 확인되었다. 조합 지수 계산은 SK-MEL-28VR1 세포의 젬시타빈과 베무라페닙 사이에서 상승효과를 드러냈다. 젬시타빈은, 췌장(Feldmann 등, 2009; Morgan 등, 2008; Rubin and de Sauvage, 2006) 및 폐암(Brodowicz 등, 2006; Clegg 등, 2001; Edeiman 등, 2001; Tham 등, 2008)을 포함하는 다중 종양 유형에 대해 1차 화학요법이었던, 데옥시시티딘 유사체이다. 젬시타빈은 p53 돌연변이된 세포에서 세포 사이클의 S-상에서 복제 분기점 붕괴의 결과로서 DNA 이중 가닥 절단(DSBs)를 야기시키거나 p53 WT 세포내 G1에서 PUMA(Pietenpol 등, 1994; Qian 등, 2002) 및 Bax(Chipuk 등, 2004; Erster 등, 2004) 매개된 세포사 프로그램을 통해 세포자멸사를 유도시킨다. 그러나, 췌장 및 폐 암 종양 세포의 다른 유전자 및 p53에서 통상적으로 발생하는 돌연변이(Muller and Vousden, 2014)는 무질환 생존의 낮은 속도(Paulson 등, 2013; Wolfgang 등, 2013)를 초래하는 젬시타빈(Bergman 등, 2002; Fryer 등, 2011; Ohhashi 등, 2008)에 획득된 저항을 구동시킨다. p53 돌연변이된 암 세포는 nM 용량에서 젬시타빈으로 처리 이후 S-상에서 정지되지만 죽지 않는다. 반면에, p53 WT 세포는 동일한 용량에서 G1 정지 이후 죽는다(Senturk and Manfredi, 2013). p53, BRAF, 및 KRAS 같은 게이트키퍼 유전자내 돌연변이는 천연 암 세포 진행에서 공통 이벤트이고(Bardeesy and DePinho, 2002; Meacham and Morrison, 2013); 따라서, 이들이 전이 쪽으로 진행함에 따라 약물의 DNA 손상 효과를 저항시키기 위한 암 세포의 타고난 능력은 특히 어려운 문제다. 그럼에도 불구하고, 젬시타빈은 진전된 췌장암(PCa)에 대해 여전히 1차 요법이다.
약물 첨가의 순서는 SK-MEL-28VR1 세포에서 우리의 젬시타빈/베무라페닙 조합의 성공에 결정적이었다. 동시 약물 처리 또는 베무라페닙 또는 다브라페닙 전처리 이어서 젬시타빈 처리로 실험은 상당한 민감화를 나타내지 않았다(데이터 도시되지 않음). 우리는 SK-MEL-28VR1 세포가 젬시타빈에 의해 야기된 DNA 이중 가닥 절단의 결과로서 S-상에서 정지되는 것을 상정한다. 그 결과, 우리가 정지된 세포를 베무라페닙으로 처리하는 경우, 세린 생합성 및 폴레이트 사이클을 유도하는 MAPK 캐스케이드는 활성화된다. 우리는 이들 일련의 이벤트가 궁극적으로 SK-MEL-28VR1 세포에서 세포사로 이어진다고 믿는다. 추가 실험과정은 젬시타빈/베무라페닙 조합을 통해 SK-MEL-28VR1 세포사를 완전하게 특성규명하기 위해 보증된다. 우리는 DNA 손상이 폴레이트 사이클 및 뉴클레오타이드 합성 활성화에 착수하기 위해 DNA 치유용 SK-MEL28VR1 세포에서 세포 사이클 정지를 유도한다는 것을 상정한다. 세포가 정지되는 동안, BRAF V600E 억제제 처리는 세린 합성 및 뉴클레오타이드 합성을 유도하는 MAPK 경로를 활성화시킨다. 세포의 뉴클레오타이드 풀을 고갈시키는 2개의 상충 경로는 세포사를 야기시킨다.
다음으로, 우리는 약물에 자연적으로 반응성이 아닌 BRAF WT 암 세포주에서 우리의 베무라페닙 연구를 복제하였다. 베무라페닙이 BRAF WT 배경으로 세포의 증식을 증가시킨다고 공지되기 때문에, 우리는 세린 생합성이 베무라페닙 처리 병태 하에 세포 생존 및 증식에 결정적일 수 있다는 것을 상정하였다. 우리는 BRAF WT인 그리고 베무라페닙에 본질적으로 저항성인 다중 암 세포주를 검사하였다. 우리는 췌장, NSCL, 유방, 및 결장 암 세포를 시험하였다. 사실상, MS 연구는 베무라페닙 처리에 반응하여 BRAF WT 췌장 암 세포에서 크게 유도된 경우 세린 생합성 경로를 확인하였다. BxPC3M1 세포는 약물 처리로 췌장 암 세포주의 세린 합성 효소에서 최고 증가를 가졌다. 그 다음 우리는 가변성 용량에서 젬시타빈을 시험하였고 베무라페닙 용량을 일정하게 유지시켰다. 하나의 췌장(BxPC3M1) 및 하나의 NSCL(NCI-H2122) 암 세포주는 젬시타빈/베무라페닙 조합 처리에 민감화되었다. 약물 첨가의 순서는 민감화에 상당한 역할을 하였다. 젬시타빈 전처리는 B-raf 억제제와 조합된 경우 민감화에 상승작용 효과를 실증하였다. 조합 지수 계산은 25 nM-1000 nM의 젬시타빈 용량에서 젬시타빈과 베무라페닙 사이 상승효과를 드러냈다. 2 약물은 5 nM, 10 nM, 및 5000 nM의 젬시타빈 용량에서 경쟁적 관계를 가졌다. 이러한 데이터는 5000 nM 용량의 젬시타빈 단독이 세포사를 야기하였다는 것을 보여주었고 1 μM 베무라페닙의 첨가가 실제로 젬시타빈의 독성을 감소시킨다. 그러나, 젬시타빈의 더 낮은 용량(25 nM-1000 nM)은 베무라페닙으로 상승작용하였다. 젬시타빈의 최저 용량(5 nM 및 10 nM)에서 2 약물은 경쟁적 관계를 갖는다. 젬시타빈의 이들 용량은 우리의 CI 플롯에서 임의의 효과를 갖기에 너무 낮은 것처럼 보인다. 우리는 세포 사이클 정지가 BxPC3M1 세포에서 베무라페닙 유도된 세포사에 필요하다는 것을 믿는다. 추가적으로, BxPC3M1 세포 증식은 베무라페닙 처리에 의해 유도되었다. 세린 고갈 실험은 BxPC3M1 베무라페닙 저항을 위하여 세포외 세린의 기준선 수준에 대한 필요성을 실증하였다. 중요하게는, 젬시타빈은 제2 BRAF V600E 억제제 다브라페닙에 SK-MEL-28VR1, BxPC3M1, 및 NCI-H2122 세포를 민감화시켰다. 집합적으로, 우리의 데이터는 베무라페닙 또는 다브라페닙에 대한 BxPC3M1 및 NCI-H2122 세포의 고유 저항 및 SK-MEL-28VR1 세포의 획득된 저항이 젬시타빈 첨가를 통해 역전될 수 있다는 것을 보여주었다. 젬시타빈 및 베무라페닙은 SK-MEL-28VR1 및 BxPC3M1 세포에서 상승효과를 보여주었다.
우리가 시험된 모든 췌장암 및 NSCLC 세포주를 거쳐 젬시타빈/베무라페닙 조합으로 민감화를 관찰하지 않았기 때문에, 우리는 반응군, SK-MEL28VR1, BxPC3M1, 및 NCI-H2122 세포 중에서 일체화 특징을 조사하는 것을 개시하였다. 우리는 이전의 RNA 서열분석 데이터(데이터 도시되지 않음)로부터 BxPC3M1 세포가 NCI-H2122 세포주와 동일한 동종접합성 KRAS G12C 돌연변이를 갖는다는 것을 안다. 우리는 현재 KRAS 돌연변이가 SK-MEL-28VR1 세포에서 발생하였는지를 조사중이다. 추가적으로, NCI-H2122 세포 및 BxPC3M1 세포는 BRAF에 대하여 WT이다. 그러나, 우리가 추가로 탐구하고 있는 흥미로운 관찰은 SK-MEL-28VR1, BxPC3M1, 및 NCI-H2122 세포에 공통인 정성적 특징이다. 모든 3 세포주는 탈착된 표현형을 갖는다(데이터 도시되지 않음). 이러한 표현형은 간엽 암 세포의 탈착된 표현형과 일치한다. 베무라페닙 저항에 대한 경로인 간엽 전이(EMT)보다 상피성이 우선이다(Fedorenko 등, 2016; Li 등, 2015; Paulitschke 등, 2015). 우리는 현재 EMT 척도에서 SK-MEL-28VR1, BxPC3M1, 및 NCI-H2122 세포의 완전한 특성규명 뿐만 아니라 3D 겔 침습 연구 및 게놈 서열분석을 통해 그것의 전이성 잠재력의 시험에 관해 연구 중이다. 우리는 전이성 잠재력 뿐만 아니라 돌연변이 프로파일이 개인화된 요법에 대하여 잠재력을 입증하는 젬시타빈/베무라페닙 조합에 대한 세포 감수성의 중요한 결정인자라는 것을 상정한다. 또한, 우리는 메토트렉세이트 + 베무라페닙 또는 다브라페닙 처리에 추가의 저항성 흑색종 세포주의 반응을 추가로 시험 중이다.
이러한 연구는 암 세포에서 BRAF 억제제 저항의 신규한, 중요한 결정인자로서 세린 생합성을 확인하였다. 추가적으로, 우리는 BRAF V600E 억제제에 흑색종 세포의 감작제로서 메토트렉세이트를 실증하였다. 미래의 실험은 BRAF 억제제에 세포의 감작제로서 그것의 효능에 대하여 SOG 경로의 추가의 억제제를 시험할 것이다. 중요하게는, 우리는, B-raf 억제제인, 베무라페닙 또는 다브라페닙에 암 세포의 감작제로서 젬시타빈 전처리를 실증하였다. 궁극적으로, 우리의 연구는 BRAF 억제제, 베무라페닙 또는 다브라페닙에 BRAF V600E 및 BRAF WT 암 세포의 저항을 역행시키기 위해 파괴될 수 있는 신규한 단백질 및 경로 표적을 확인하기 위해 정량적 단백체 프로파일링의 성공적인 용도를 입증한다. 임의의 특정 이론에 의한 구속됨 없이, 도 12a 및 12b는 본 명세서에서 기재된 데이터 및 경로를 설명한다. 이들 조합은, 예를 들어, 췌장암 및 흑색종 뿐만 아니라 본 명세서에서 기재된 바와 같이 다른 유형의 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
물질 및 방법:
세포 배양물 및 화학물질: Panc1, BxPC3, MiaPaca2, 및 NCI-H2122 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 구매되었다. SK-MEL-28 세포는 Fox Chase Cancer Center(FCCC)에서 Dr. Alfonso Bellacosa로부터 후한 선물이었다. 세포주 SK-MEL-28VR1은 진행성 베무라페닙 선택을 통해 확인되었다. 간단히, 100,000 SK-MEL-28 세포는 10 μM 베무라페닙에 48시간 동안, 그 다음 20 μM의 베무라페닙에 48시간 동안, 그 다음 30 μM의 베무라페닙에 48시간 동안 노출되었다. 생존한 세포는 SK-MEL-28VR1 세포주로서 풀링되었고(pooled) 확인되었다. 세포주 BxPC3M1은 BxPC3 세포의 수동적인 선택을 통해 확인되었다. 단일 BxPC3 세포는 플레이팅되었고 하위-클론에서 성장하게 되었다. 고도로 점착된 BxPC3 친계 세포와 정성적으로 상이한 탈착된 표현형을 가진 하위-클론은 BxPC3M 세포주로서 확인되었고 단리되었다. 하나의 그와 같은 세포주는 BxPC3M1이다. 모든 세포주는 2 mM 글루타민(Life Technologies; 25030081)으로 보충된 DMEM/10%FB S(GenDepot) 또는 RPMI 1640/10%FBS(GenDepot)에서 배양되었고 5 % CO2에서 37 ℃에 유지되었다. 글루코스, 글리신, 또는 세린(Teknova)/10 % 투석된 FBS(Life Technologies; 26400036)이 없는 RPMI1640은 세린 박탈 연구에 사용되었다. 베무라페닙, 다브라페닙, 메토트렉세이트, 및 젬시타빈-HCL은 Selleckchem으로부터 수득되었다. PHGDH siRNA는 Ambion(AMI 6708)로부터 수득되었고, 리포펙타민 RNAiMax는 Invitrogen(100014472)로부터 수득되었다.
세포 생존력 검정: 콜로니 형성 검정을 위하여, 400 세포/웰은 0일에서 24-웰 플레이트 속에 씨딩되었다(seeded). 세포는 24시간 동안 1일에서 다양한 용량으로 DMSO 또는 젬시타빈으로 처리되었다. 젬시타빈은 2일에서 세정 제거되었고, 베무라페닙, 다브라페닙, 및 메토트렉세이트는 첨가되었다. 4일에서, 2일에서 첨가된 약물은 세정 제거되었다. 세포는 이전에 기재된 바와 같이 정량화를 위하여 고정되기 (10 % 메탄올 + 10 % 아세트산) 및 크리스탈 바이올렛(20 % 에탄올내 0.4 %)으로 염색되기 전 후속적인 7일 동안 성장하게 되었다(Bhattacharjee 등, 2014).
질량 분석법: 샘플은 건조되었고 U3000 RSLCnano HPLC 디바이스(Thermo Fisher Scientific)로 커플링된 Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific)에서 수행된 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 분석을 위하여 2.5% ACN/0.1% 포름산에 재용해되었다. 5 μL의 샘플은 10 μL min-1의 유량으로 C18 포착 칼럼(PepMap100; 300-μm i.d. x 5mm, 5-μm 입자 크기, 100 Å; Thermo Fisher Scientific) 상에 장입되었다. 펩타이드 분리는 0.26 μL min-1의 유량 및 하기 구배로 C18 칼럼(ACQUITY UPLC M-Class Peptide CSH C18; 130Å 1.7μm 75μm x 250 mm, Waters)에서 수행되었다: 0 내지 3min, 2 % B 등용매; 3 내지 76min, 2 % 내지 30 % B; 76 내지 90min, 30 % 내지 45 % B; 90 내지 98min, 45 % 내지 98 % B. 이동상 A는 0.1 % 포름산이었고, 이동상 B는 80:20 아세토니트릴:물내 0.1 % 포름산이었다. 운행은 프로테오믹스용 Progenesis-QI(비선형 동력학)을 이용하여 분석되었다. 크로마토그램은 정렬되었고 MS/MS 데이터는 Mascot(Matrix Science, London, UK; 버전 2.5.1)를 이용하는 펩타이드 확인을 위하여 추출되었다. Mascot는 cRAP 데이터베이스, QMC 펩타이드 서열을 포함하는 구입 데이터베이스 및 소화 효소 트립신을 추정하는 (호모사피엔스를 위하여 선택된) SwissProt 데이터베이스를 검색하기 위해 준비되었다. Mascot는 0.06Da의 단편 이온 질량 내성 및 15PPM의 모체 이온 내성으로 검색되었다. 아스파라긴 및 글루타민의 탈아미드화된, 메티오닌의 산화, 라이신의 아세틸, 라이신의 프로피오닐 및 시스테인의 카바미도메틸화는 가변성 변형으로서 Mascot에서 특정되었다. FDR<1 %를 이용하여 확인된 펩타이드는 추출되었고 피크의 배정을 위하여 조기생식에 역으로 유입되었다. 적어도 두 특유의 펩타이드를 가진 유일한 단백질 및 20의 Mascot 스코어는 추가 분석에 사용되었다. 펩타이드 및 단백질 정량화는 샘플을 거쳐 정규화를 위하여 합성 대조군 펩타이드를 사용하였다. 모든 MS 운행은 Donald Danforth Plant Science Center for Proteomics and Mass Spectrometry에서 그리고 Proteomics and Metabolomics facility at University of Nebraska, Lincoln에서 수행되었다.
데이터 플롯팅 및 통계: 모든 단백체 경향 플롯은 Evol Science 소프트웨어 제품군(ESSv1.0)을 이용하여 구성되었다. 볼케노 플롯팅은 양쪽 그것의 발현 비 및 그것의 통계적 유의도에 의해 두 축에서 데이터 포인트를 시각적으로 분리시키는 작용을 한다. 이것은 주어진 비교 내에서 가장 유의미한, 차등적으로 발현된 단백질의 단순 결정 방법을 가능하게 한다. 각각의 단백질에 대하여, 복제 값은 값의 두 분포를 창출하기 위해 비교되도록 각각의 실험으로부터 모아진다. 동일한 수단의 스튜던트 T-시험은 값의 두 독립적인 샘플 사이 사용되어 분포를 비교하고 통계적 유의도의 p-값을 생성한다. p-값의 -log10은 그 다음 그래픽 도면에서 Y 좌표를 제공하기 위해 취해졌다. X 좌표, 비는 주어진 실험에 대하여 복제 비 값의 평균의 log 10으로 주어진다. 조합 지수 계산, Fa-CI 플롯, 및 아이소볼로그램은 Chou-Tulalay 방법(Chou and Martin, 2007)을 이용하는 Compusyn 소프트웨어 프로그램을 이용하여 구성되었다. 콜로니 형성 검정을 나타내는 모든 플롯은 Prism7 소프트웨어(Graphpad.com)를 이용하여 작제되었다. 2-식 Anova 시험은 p 값을 계산하는 데 사용되었다.
웨스턴 블랏팅: 세포는 수확되었고, PBS에서 세정되었고 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 가진 NP40 세포용해 완충액(1 % NP40/PBS/10 % 글리세롤)에서 용해되었다. 단백질 농도는 총-단백질-검정-키트(ITSI Biosciences; K-0014-20)로 결정되었고 그 다음 SDS 샘플 완충액은 용해물에 첨가되었다. 50ug의 비등된 용해물은 SDS-PAGE에 의해 분리되었고 그 다음 Immobilon P 막(Millipore; IPVH00010) 상에 전달되었다. 면역블로팅에 사용된 PHGDH 항체는 Abcam(ab211365)로부터 수득되었다. 면역블로팅에 사용된 α-튜불린 항체는 Abcam(ab7291)로부터 수득되었다. α-튜불린이 장입 대조군으로서 사용되었던 것은 그것의 발현이 임의의 세포주 또는 약물 처리에서 다양하지 않았기 때문이었다.
실시예 3. DNA 손상제는 3D-회전타원체 성장 검정에서 베무라페닙 또는 다브라페닙에 췌장암 환자-유래된 세포 및 ATCC 확립된 세포주를 민감화시킨다. 20,000 세포는 3D-회전타원체 성장 검정에서 성장하도록 플레이팅되었다(Corning 4515 회전타원체 플레이트). 2일 후 모든 회전타원체가 직경이 적어도 500μm이었던 경우, 젬시타빈은 플레이팅 후 2일에 첨가되었다. 젬시타빈은 다음 날 세정 제거되었고 B-raf 억제제는 3일에서 첨가되었다(3일 플레이팅후). CTG3D 세포 생존력 검정은 5-일 플레이팅후(즉, 5일에서, n=2)에 수행되었다. 도 15에서 데이터가 설명한 바와 같이, DNA 손상제, 예컨대 젬시타빈으로 세포의 전처리는 B-raf 억제제에 췌장암 세포를 감수성으로 만들고 그것의 성장을 억제시킬 뿐만 아니라, 세포사를 유발시킨다. 이것은 이들 세포가 이러한 조합으로 사멸될 수 있는 놀랍고 의외의 효과이었다.
참조문헌:
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결론적으로, DNA 손상제, 예컨대, 비제한적으로, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 또는 피리메타민과 조합으로, B-raf 억제제, 예컨대, 베무라페닙 및 다브라페닙의 조합은 이들 부류의 화합물에 비감수성인 것으로 이전에 생각되었던 베무라페닙 및 다브라페닙에 세포주를 민감화시킨다고 알려졌다. 이들 결과는 놀랍고 의외이었다.
본 발명의 명세서에서 기재된 구체예가 실시예와 관련하여 기재된 동안, 당해 분야의 숙련자는 다양한 변형이 이의 사상 및 범위에서 이탈 없이 실시될 수 있다는 것을 인식한다.
본 발명의 명세서에서 참조된 및/또는 출원 데이터 시트에서 열거된 모든 상기 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 해외 특허, 해외 특허 출원 및 비-특허 공보는 그 전문이 본 명세서에서 참고로 편입된다.

Claims (143)

  1. DNA 손상제 및 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체에서의 종양 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 베무라페닙(vemurafenib), 다브라페닙(dabrafenib), 또는 소라페닙(sorafenib), 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 이중 가닥 절단(DSBs), 단일 가닥 절단을 야기시키는 제제, 항대사물질, DNA 가교제, 토포이소머라제 억제제, 폴리머라제 억제제, 또는 알킬화제인 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 젬시타빈(gemcitabine), 5-FU, 시타라빈(cytarabine), 메토트렉세이트(methotrexate), 피리메타민(pyrimethamine), 블레오마이신(bleomycin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin), 에토포시드(etoposide), 독소루비신(doxorubicin), 비노렐빈(vinorelbin), 미톡산트론(mitoxantrone), 포도필로톡신(podophyllotoxin), 아피디콜린(aphidicolin), 포테무스틴(fotemustine), 카르무스틴(carmustine), S-23906, S39, SN-38, 토포테칸(topotecan), 캄프토테신(camptothecin), 레벡카마이신(rebeccamycin), 또는 임의의 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 젬시타빈, 메토트렉세이트, 및/또는 피리메타민, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 상기 DNA 손상제가 순차적으로, 동시에, 또는 중첩 방식으로 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 B-RAF 억제제가 상기 대상체에 투여되기에 앞서 상기 DNA 손상제가 상기 대상체에 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 상기 대상체에 투여된 후 적어도 1-24시간에 상기 B-raf 억제제가 상기 대상체에 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 상기 대상체에 투여되기 전에 상기 대상체가 상기 DNA 손상제로 전처리되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 상기 DNA 손상제가 경구로 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 상기 DNA 손상제가 정맥내로 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 경구로 투여되고 상기 DNA 손상제가 정맥내로 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 정맥내로 투여되고 상기 DNA 손상제가 경구로 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  14. 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 종양이 췌장 종양, 흑색종 종양, 폐 종양, 결장 캔 종양 서, 난소 종양, 전립선 종양, 또는 유방 종양인 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 종양이 췌장 종양인 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 종양이 흑색종 종양인 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 종양이 전이성 종양인 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 종양이 야생형 BRAF로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 종양이 야생형 KRAS로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 종양이 돌연변이체 BRAF로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 종양이 돌연변이체 BRAF V600E 또는 V600K로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 종양이 돌연변이체 KRAS로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 종양이 야생형 BRAF 및 돌연변이체 KRAS로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 종양이 돌연변이체 BRAF 및 야생형 KRAS로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 대상체에, 약 960 mg, 720 mg, 480 mg, 240 mg, 150 mg, 100 mg, 50 mg, 또는 25 mg 또는 미만인, 상기 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 용량이 매일 2회 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 약 1250 mg/m2, 1000 mg/m2, 800 mg/m2, 600 mg/m2, 400 mg/m2, 200 mg/m2, 100 mg/m2, 또는 50 mg/m2, 25 mg/m2, 10 mg/m2, 또는 5 mg/m2 또는 미만의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 매일, 매주 2회, 1주 3회, 1주 4회, 1주 5회, 매주, 매 2주, 매 3주, 또는 매월 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 이중 가닥 절단 DNA 손상제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 젬시타빈, 메토트렉세이트, 또는 피리메타민, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  31. 제1항에 있어서, MEK 억제제 투여를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 상기 대상체에 투여된 후 상기 MEK 억제제가 상기 대상체에 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  33. 제2항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, MEK 억제제 투여를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 MEK 억제제가 트라메티닙인 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  35. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR 억제제 투여를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  36. 제28항에 있어서, 상기 EGFR 억제제가 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 게피티닙 또는 에를로티닙인 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  37. 제1항에 있어서, 상기 종양 크기가 상기 대상체에서 감소되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 종양 크기가 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 % 감소되는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  39. 제1항에 있어서, 상기 종양이 치료후 크기가 증가하지 않는 것을 특징으로 하는 종양 치료 방법.
  40. B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체에서 종양의 상태의 유지 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 B-RAF 억제제가 상기 대상체에 투여되기에 앞서 상기 DNA 손상제가 상기 대상체에 투여되는 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 상기 대상체에 투여된 후 적어도 1-24시간에 상기 B-raf 억제제가 상기 대상체에 투여되는 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 상기 대상체에 투여되기 전 상기 대상체가 상기 DNA 손상제로 전처리되는 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  44. 제40항에 있어서, 상기 종양이 상기 대상체에서 재발하지 않는 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  45. 제40항에 있어서, 상기 종양이 상기 대상체에서 크기가 증가하지 않는 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  46. 제40항에 있어서, 상기 대상체가 상기 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 상기 DNA 손상제 투여되기에 앞서 흑색종 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 결장 종양, 난소 종양, 또는 전립선 종양에 대하여 치료되어 왔던 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  47. 제40항에 있어서, 상기 종양을 가진 상기 대상체가, DNA 손상제와 무관하게, B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이전에 치료되어 왔던 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  48. 제40항에 있어서, 상기 종양이 야생형 BRAF로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  49. 제40항에 있어서, 상기 종양이 돌연변이체 BRAF로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  50. 제40항에 있어서, 상기 종양이 돌연변이체 BRAF가 V600E 또는 V600K로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  51. 제40항에 있어서, 상기 종양이 야생형 KRAS로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  52. 제40항에 있어서, 상기 종양이 돌연변이체 KRAS로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  53. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  54. 제40항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 이중 가닥 절단(DSBs), 단일 가닥 절단을 야기시키는 제제, 항대사물질, DNA 가교제, 토포이소머라제 억제제, 폴리머라제 억제제, 또는 알킬화제인 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 젬시타빈, 5-FU, 시타라빈, 메토트렉세이트, 피리메타민, 블레오마이신, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 에토포시드, 독소루비신, 비노렐빈, 미톡산트론, 포도필로톡신, 아피디콜린, 포테무스틴, 카르무스틴, S-23906, S39, SN-38, 토포테칸, 캄프토테신, 레벡카마이신, 또는 임의의 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  56. 제40항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, MEK 억제제 또는 EGFR 억제제 투여를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 종양의 상태의 유지 방법.
  57. BRAF V600E 또는 V600K 돌연변이 없이 종양을 가진 대상체의 치료 방법으로서, 상기 BRAF V600E 또는 V600K 돌연변이를 갖지 않는 상기 대상체에 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  58. 제57항에 있어서, B-raf 억제제가 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 이중 가닥 절단(DSBs), 단일 가닥 절단을 야기시키는 제제, 항대사물질, DNA 가교제, 토포이소머라제 억제제, 폴리머라제 억제제, 또는 알킬화제인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 젬시타빈, 5-FU, 시타라빈, 메토트렉세이트, 피리메타민, 블레오마이신, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 에토포시드, 독소루비신, 비노렐빈, 미톡산트론, 포도필로톡신, 아피디콜린, 포테무스틴, 카르무스틴, S-23906, S39, SN-38, 토포테칸, 캄프토테신, 레벡카마이신, 또는 임의의 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, MEK 억제제 또는 EGFR 억제제 투여를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계에 앞서 상기 대상체에서 유래된 종양 샘플에서 BRAF V600E 또는 V600K 돌연변이의 상기 존재 또는 부재 검출을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BRAF V600E 또는 V600K 돌연변이 없이 상기 종양이 KRAS 돌연변이를 갖지 않거나 상기 BRAF V600E 또는 V600K 돌연변이 없이 상기 종양이 KRAS 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  64. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 KRAS 돌연변이 또는 상기 BRAF 돌연변이의 상기 존재 또는 부재 검출을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  65. 제57항에 있어서, 상기 B-RAF 억제제가 상기 대상체에 투여되기에 앞서 상기 DNA 손상제가 상기 대상체에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  66. 제57항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 상기 대상체에 투여된 후 적어도 1-24시간에 상기 B-raf 억제제가 상기 대상체에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  67. 제57항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 상기 대상체에 투여되기 전 상기 대상체가 상기 DNA 손상제로 전처리되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  68. 제57항에 있어서, 상기 종양이 췌장 종양 또는 흑색종 종양인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  69. 대상체에서 전이성 종양의 치료 방법으로서, B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 전이성 종양이 전이성 흑색종, 전이성 췌장 종양, 전이성 폐 종양, 전이성 결장 종양, 전이성 난소 종양, 전이성 전립선 종양, 또는 전이성 유방 종양인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  71. 제69항에 있어서, 상기 종양이 야생형 BRAF로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  72. 제69항에 있어서, 상기 종양이 돌연변이체 BRAF로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 돌연변이체 BRAF가 BRAF V600E 또는 V600K인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  74. 제69항에 있어서, 상기 종양이 야생형 KRAS로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  75. 제69항에 있어서, 상기 종양이 돌연변이체 KRAS로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  76. 제69항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계에 앞서 상기 대상체에서 유래된 종양 샘플에서 BRAF V600E 또는 V600K 돌연변이의 상기 존재 또는 부재 검출을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  77. 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계에 앞서 상기 대상체에서 유래된 종양 샘플에서 KRAS 돌연변이의 상기 존재 또는 부재 검출을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  78. 제69항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  79. 제69항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 이중 가닥 절단(DSBs), 단일 가닥 절단을 야기시키는 제제, 항대사물질, DNA 가교제, 토포이소머라제 억제제, 폴리머라제 억제제, 또는 알킬화제인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 젬시타빈, 5-FU, 시타라빈, 메토트렉세이트, 피리메타민, 블레오마이신, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 에토포시드, 독소루비신, 비노렐빈, 미톡산트론, 포도필로톡신, 아피디콜린, 포테무스틴, 카르무스틴, S-23906, S39, SN-38, 토포테칸, 캄프토테신, 레벡카마이신, 또는 임의의 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  81. 제69항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에 EGFR 억제제 또는 MEK 억제제 투여를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  82. 제69항에 있어서, 상기 B-RAF 억제제가 상기 대상체에 투여되기에 앞서 상기 DNA 손상제가 상기 대상체에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  83. 제69항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 상기 대상체에 투여된 후 적어도 1-24시간에 상기 B-raf 억제제가 상기 대상체에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  84. 제69항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 상기 대상체에 투여되기 전 상기 대상체가 상기 DNA 손상제로 전처리되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  85. 약물 저항성 종양의 치료 방법으로서, B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 포함하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 약물 저항성 종양이 B-raf 억제제로 구성되는 치료에 저항성인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 약물 저항성 종양이 전이성 종양인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 전이성 종양이 전이성 흑색종, 전이성 췌장 종양, 전이성 폐 종양, 전이성 결장 종양, 전이성 난소 종양, 전이성 전립선 종양, 전이성 폐 종양, 또는 전이성 유방 종양인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  89. 제85항에 있어서, 상기 약물 저항성 종양이 흑색종, 췌장 종양, 폐 종양, 결장 종양, 난소 종양, 전립선 종양, 폐 종양 또는 유방 종양인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  90. 제85항에 있어서, 상기 종양이 야생형 BRAF로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  91. 제85항에 있어서, 상기 종양이 돌연변이체 BRAF로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 돌연변이체 BRAF가 BRAF V600E 또는 V600K인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  93. 제85항에 있어서, 상기 종양이 야생형 KRAS로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  94. 제85항에 있어서, 상기 종양이 돌연변이체 KRAS로서 특성규명되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  95. 제85항에 있어서, 상기 투여 단계에 앞서 상기 대상체에서 유래된 종양 샘플에서 BRAF V600E 또는 V600K 돌연변이의 상기 존재 또는 부재 검출을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  96. 제85항에 있어서, 상기 투여 단계에 앞서 상기 대상체에서 유래된 종양 샘플에서 KRAS 돌연변이의 상기 존재 또는 부재 검출을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  97. 제85항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  98. 제85항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 이중 가닥 절단(DSBs), 단일 가닥 절단을 야기시키는 제제, 항대사물질, DNA 가교제, 토포이소머라제 억제제, 폴리머라제 억제제, 또는 알킬화제인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 젬시타빈, 5-FU, 시타라빈, 메토트렉세이트, 피리메타민, 블레오마이신, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 에토포시드, 독소루비신, 비노렐빈, 미톡산트론, 포도필로톡신, 아피디콜린, 포테무스틴, 카르무스틴, S-23906, S39, SN-38, 토포테칸, 캄프토테신, 레벡카마이신, 또는 임의의 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  100. 제85항에 있어서, 상기 B-RAF 억제제가 상기 대상체에 투여되기에 앞서 상기 DNA 손상제가 상기 대상체에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  101. 제85항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 상기 대상체에 투여된 후 적어도 1-24시간에 상기 B-raf 억제제가 상기 대상체에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  102. 제85항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 상기 대상체에 투여되기 전 상기 대상체가 상기 DNA 손상제로 전처리되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  103. B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  104. 제103항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 이중 가닥 절단 제제인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  105. 제103항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 젬시타빈, 메토트렉세이트, 또는 피리메타민, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  106. 제103항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 경구 전달에 적합한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  107. 제103항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 주사에 적합한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  108. 제103항에 있어서, MEK 억제제 및/또는 EGFR 억제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  109. B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 포함하는 것을 특징으로 하는 고정된 단위 투약 형태.
  110. 제109항에 있어서, 상기 형태가 150mg, 240mg, 또는 약 150mg 또는 약 240mg 또는 미만의 상기 B-raf 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 고정된 단위 투약 형태.
  111. 제109항에 있어서, 상기 형태가 약 5 내지 약 200mg의 상기 B-raf 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 고정된 단위 투약 형태.
  112. 제109항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 고정된 단위 투약 형태.
  113. 제109항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 이중 가닥 절단(DSBs), 단일 가닥 절단을 야기시키는 제제, 항대사물질, DNA 가교제, 토포이소머라제 억제제, 폴리머라제 억제제, 또는 알킬화제인 것을 특징으로 하는 고정된 단위 투약 형태.
  114. 제113항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 젬시타빈, 5-FU, 시타라빈, 메토트렉세이트, 피리메타민, 블레오마이신, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 에토포시드, 독소루비신, 비노렐빈, 미톡산트론, 포도필로톡신, 아피디콜린, 포테무스틴, 카르무스틴, S-23906, S39, SN-38, 토포테칸, 캄프토테신, 레벡카마이신, 또는 임의의 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 고정된 단위 투약 형태.
  115. 제113항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 약 1250 mg/m2, 1000 mg/m2, 800 mg/m2, 600 mg/m2, 400 mg/m2, 200 mg/m2, 100 mg/m2, 또는 50 mg/m2, 25 mg/m2, 10 mg/m2, 또는 5 mg/m2 또는 미만의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 고정된 단위 투약 형태.
  116. 제109항에 있어서 상기 고정된 단위 투약 형태가 EGFR 억제제 또는 MEK 억제제를 포함하거나 EGFR 억제제 또는 MEK 억제제가 없는 것을 특징으로 하는 고정된 단위 투약 형태
  117. B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 포함하는 것을 특징으로 하는 주사가능한 약제학적 조성물.
  118. 제117항에 있어서, 상기 조성물이 150 mg, 240 mg, 또는 약 150 mg 또는 약 240 mg 또는 미만의 상기 B-raf 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 주사가능한 약제학적 조성물.
  119. 제117항에 있어서, 상기 조성물이 약 5 내지 약 200 mg의 상기 B-raf 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 주사가능한 약제학적 조성물.
  120. 제117항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 주사가능한 약제학적 조성물.
  121. 제117항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 이중 가닥 절단(DSBs), 단일 가닥 절단을 야기시키는 제제, 항대사물질, DNA 가교제, 토포이소머라제 억제제, 폴리머라제 억제제, 또는 알킬화제인 것을 특징으로 하는 주사가능한 약제학적 조성물.
  122. 제117항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 젬시타빈, 5-FU, 시타라빈, 메토트렉세이트, 피리메타민, 블레오마이신, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 에토포시드, 독소루비신, 비노렐빈, 미톡산트론, 포도필로톡신, 아피디콜린, 포테무스틴, 카르무스틴, S-23906, S39, SN-38, 토포테칸, 캄프토테신, 레벡카마이신, 또는 임의의 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 주사가능한 약제학적 조성물.
  123. 제117항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 약 1250 mg/m2, 1000 mg/m2, 800 mg/m2, 600 mg/m2, 400 mg/m2, 200 mg/m2, 100 mg/m2, 또는 50 mg/m2, 25 mg/m2, 10 mg/m2, 또는 5 mg/m2 또는 미만의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 주사가능한 약제학적 조성물.
  124. 제117항에 있어서, 상기 조성물 형태가 EGFR 억제제 또는 MEK 억제제를 포함하거나 EGFR 억제제 또는 MEK 억제제가 없는 것을 특징으로 하는 주사가능한 약제학적 조성물.
  125. 제117항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 젬시타빈, 메토트렉세이트, 또는 피리메타민인 것을 특징으로 하는 주사가능한 약제학적 조성물.
  126. B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 포함하는 주사가능한 약제학적 조성물의 제조 방법으로서, 상기 B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 혼합시켜 주사가능한 약제학적 조성물을 형성하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  128. 제126항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 이중 가닥 절단(DSBs), 단일 가닥 절단을 야기시키는 제제, 항대사물질, DNA 가교제, 토포이소머라제 억제제, 폴리머라제 억제제, 또는 알킬화제인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  129. 제126항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 젬시타빈, 5-FU, 시타라빈, 메토트렉세이트, 피리메타민, 블레오마이신, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 에토포시드, 독소루비신, 비노렐빈, 미톡산트론, 포도필로톡신, 아피디콜린, 포테무스틴, 카르무스틴, S-23906, S39, SN-38, 토포테칸, 캄프토테신, 레벡카마이신, 또는 임의의 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  130. B-raf 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 DNA 손상제를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  131. 제130항에 있어서, 상기 B-raf 억제제를 포함하는 제1 약제학적으로 허용가능한 컨테이너 및 상기 DNA 손상제를 포함하는 제2 약제학적으로 허용가능한 컨테이너를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  132. 제130항에 있어서, 상기 컨테이너가 멸균성이고 발열원이 없는 것을 특징으로 하는 키트.
  133. 제130항에 있어서, 처방 정보를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  134. 제133항에 있어서, 상기 처방 정보가 대상체에 상기 B-raf 억제제 및 상기 DNA 손상제 투여용 지침을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  135. 제133항에 있어서 상기 처방 정보가 야생형 RAF로서 특성규명된 종양을 가진 대상체에 상기 B-raf 억제제 및 상기 DNA 손상제 투여용 지침을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  136. 제133항에 있어서, 상기 처방 정보가 상기 B-raf 억제제 투여 전 상기 대상체에 상기 DNA 손상제 투여용 지침을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  137. B-raf 억제제 및 처방 정보를 포함하는 약제학적 제제를 포함하는 컨테이너로서, 상기 처방 정보가 야생형 RAF로서 특성규명된 종양을 가진 대상체에 DNA 손상제와 상기 B-raf 억제제 투여용 지침을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨테이너.
  138. 제137항에 있어서, 종양이 흑색종 종양인 것을 특징으로 하는 컨테이너.
  139. 제137항에 있어서, 상기 B-raf 억제제를 포함하는 캡슐, 정제, 또는 다른 경구 투약 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 컨테이너.
  140. 제137항에 있어서, 상기 B-raf 억제제가 베무라페닙, 다브라페닙, 또는 소라페닙, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 컨테이너.
  141. 제137항에 있어서, 상기 DNA 손상이 이중 가닥 절단(DSBs), 단일 가닥 절단을 야기시키는 제제, 항대사물질, DNA 가교제, 토포이소머라제 억제제, 폴리머라제 억제제, 또는 알킬화제인 것을 특징으로 하는 컨테이너.
  142. 제141항에 있어서, 상기 DNA 손상제가 젬시타빈, 5-FU, 시타라빈, 메토트렉세이트, 피리메타민, 블레오마이신, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 에토포시드, 독소루비신, 비노렐빈, 미톡산트론, 포도필로톡신, 아피디콜린, 포테무스틴, 카르무스틴, S-23906, S39, SN-38, 토포테칸, 캄프토테신, 레벡카마이신, 또는 임의의 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 컨테이너.
  143. 제137항에 있어서, EGFR 억제제 또는 MEK 억제제를 추가로 포함하는, 또는 EGFR 억제제 또는 MEK 억제제가 없는 것을 특징으로 하는 컨테이너.
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