ES2253929T3 - Luciferasas termoestables de photuris pennsylvanica y pyrophorus plagliophthalamus y procedimiento de produccion. - Google Patents
Luciferasas termoestables de photuris pennsylvanica y pyrophorus plagliophthalamus y procedimiento de produccion.Info
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Abstract
Una luciferasa termoestable que tiene una semi vida de al menos 2 horas a 50ºC, caracterizada porque dicha luciferasa termoestable comprende la SEC.ID.Nº: 44 y la SEC.ID.Nº 45, o una porción enzimáticamente activa de la misma; y es resistente a un inhibidor de reacción bioluminiscente.
Description
Luciferasas termoestables de Photuris
pennsylvanica y Pyrophorus plagliophthalamus y
procedimiento de producción.
Esta invención se hizo con subvenciones del
Gobierno de los Estados Unidos de América (subvenciones IR43 GM506
23-01 y 2R44 GM506 23-02 de los
Nacional Institutes of Health y las subvenciones
ISI-9160613 y III-9301865 de la
Nacional Science Foundation). El gobierno puede tener ciertos
derechos sobre la invención.
La invención se refiere a enzimas luciferasa
mutantes que tienen termoestabilidad enormemente aumentada en
comparación con luciferasas naturales de las que se obtienen como se
mide, por ejemplo, por semividas de al menos 2 horas a 50ºC en
solución acuosa y que son resistentes a la inhibición por un
sustrato inhibidor, por ejemplo, un análogo del sustrato. La
invención también se refiere polinucleótidos que codifican las
nuevas luciferasas, y a huéspedes transformados para expresar las
luciferasas. La invención se refiere adicionalmente al uso de estas
luciferasas en cualquier procedimiento en el que se emplean
convencionalmente luciferasas conocidas previamente. Algunos usos
emplean kits.
Las luciferasas se definen por su capacidad de
producir luminiscencia. Beetle luciferases form a distinct class
with unique evolutionary origins and chemical mechanisms (Wood,
1995).
Aunque algunas enzimas conocidas como luciferasas
del escarabajo están ampliamente reconocidas para su uso en ensayos
de luminiscencia altamente sensibles, su utilidad general se ha
limitado debido a la baja termoestabilidad. Las luciferasas del
escarabajo que tienen secuencias de aminoácidos codificadas por
secuencias de ADNc clonadas de escarabajos luminosos no son estables
incluso a temperaturas moderadas. Por ejemplo, incluso la más
estable de las luciferasas, LucPpe2, obtenida de una
luciérnaga tiene muy poca estabilidad a la temperatura moderada de
37ºC. Las luciferasas de luciérnaga son un sub-grupo
de las luciferasas del escarabajo. Históricamente, el término
"luciferasa de luciérnaga" se refiera a la enzima LucPpy
de una especie única Photinus pyralis (Luc+ es una versión
mutante de LucPpy, véase Patente de Estados Unidos Nº
5.670.356).
Se ha informado de intentos de mutar secuencias
de ADNc naturales que codifican luciferasa y de seleccionar mutantes
para termoestabilidad mejorada (White y col., 1994; de P.
pyralis, y Kajiyama y Nekano, 1993; de Luciola
lateralis). Sin embargo, aún hay una necesidad de mejorar las
características y versatilidad de esta clase importante de
enzimas.
La invención se refiere a luciferasas nuevas y
extraordinariamente termoestables, incluyendo enzimas luciferasa con
semi-vidas de al menos 2 horas a 50ºC, o al menos 5
horas a 50ºC, en una solución acuosa, y que tienen resistencia a la
inhibición por un inhibidor de luciferasa. Como se describe a
continuación, después de 2 horas a 50ºC en una solución acuosa, una
luciferasa termoestable de la invención pierde menos del 5% de
actividad de luminiscencia. Las luciferasas mutantes de la presente
invención presentan una termoestabilidad extraordinaria y no
conseguida con anterioridad a 22ºC en una solución acuosa y a
temperaturas al menos tan altas como 60ºC en una solución acuosa.
Por ejemplo, las luciferasas de la invención son termoestables
durante al menos 10 horas a 50ºC; durante al menos 2 horas,
preferiblemente al menos 5 horas, más preferiblemente al menos 10
horas, e incluso más preferiblemente al menos 24 horas, a 60ºC; y/o
durante al menos 100 días, preferiblemente al menos 200 días, más
preferiblemente al menos 500 días, e incluso más preferiblemente al
menos 800 días, a 22ºC, en solución acuosa. Por ejemplo, después de
30 días a 22ºC en una solución acuosa, una luciferasa termoestable
de la invención pierde menos del 5% de actividad de luminiscencia.
Preferiblemente, las luciferasas termoestables de la invención tiene
intensidad de luminiscencia potenciada, estabilidad de señal
potenciada, utilización de sustrato potenciada, y/o Km disminuida,
con relación a una luciferasa de referencia, por ejemplo, una de
tipo silvestre nativo. La invención se refiere adicionalmente a los
genes de luciferasa mutantes (por ejemplo, ADNc o ARN) que
codifican las nuevas enzimas luciferasa. La terminología usada en
este documento es, por ejemplo, para los mutantes en el experimento
90, número de placa 1, pocillo B5, la cepa de E. coli es
90-1B5, el gen mutante es
luc90-IB5, y la luciferasa mutada es
Luc90-1B5.
Como se define en este documento, una enzima
"termoestable", por ejemplo, una luciferasa, o una enzima que
tiene "termoestabilidad", es una enzima que en ciertas
condiciones, por ejemplo, a cierta temperatura, en solución acuosa
y/o durante ciertos periodos de tiempo, tiene una retención
aumentada de la actividad con relación a una enzima de referencia.
Por ejemplo, para una luciferasa termoestable, una luciferasa de
referencia puede ser luciferasa de tipo silvestre nativa o
luciferasa de tipo silvestre recombinante. Preferiblemente, para
luciferasas del escarabajo, la actividad es la luminiscencia en
condiciones de saturación con luciferina y ATP. Una medida de una
enzima es la semi-vida de la enzima en una solución
acuosa (el tiempo sobre el que el 50% de la actividad se pierde) a
una temperatura establecida.
La invención incluye adicionalmente vectores de
expresión y otras construcciones genéticas que contienen las
luciferasas mutantes, así como huéspedes, bacterianos u otros,
transformados para expresar las luciferasas mutantes. La invención
también se refiere a composiciones y kits que contienen las nuevas
luciferasas, y el uso de estas luciferasas en cualquier metodología
en la que se empleen luciferasas.
Se emplearon diversos medios de mutagénesis
aleatoria a un gen de luciferasa (secuencia de nucleótidos), más
particularmente síntesis génica que usa una polimerasa propensa a
errores, para crear bibliotecas de genes de luciferasa modificados.
Esta biblioteca se expresó en colonias de E. coli y se
exploraron visualmente para luminiscencia eficaz para seleccionar un
subconjunto de la biblioteca de las luciferasas modificadas. Después
se hicieron lisados de estas cepas de E. coli, y se midieron
cuantitativamente para la actividad luciferasa y termoestabilidad. A
partir de esto, se eligió un subconjunto más pequeño de luciferasas
modificadas, y las mutaciones seleccionadas se combinaron para
fabricar luciferasas compuestas modificadas. Se fabricaron nuevas
bibliotecas a partir de las luciferasas compuestas modificadas por
mutagénesis aleatoria y se repitió el procedimiento. Las luciferasas
con el mejor rendimiento global se seleccionaron después de varios
ciclos de este procedimiento.
Los procedimientos para producir luciferasas
mejoradas incluyen evolución dirigida usando una secuencia
polinucleotídica que codifica una primera luciferasa del escarabajo
como secuencia de partida (parental), para producir una secuencia
polinucleotídica que codifica una segunda luciferasa con
termoestabilidad aumentadas, en comparación con la primera
luciferasa, manteniendo otras características de las enzimas. Un
ADNc denominado lucPpe2 codifica una luciferasa de luciérnaga
obtenida de Photuris pennsylvanica que presenta
termoestabilidad aumentada en comparación con la luciferasa
utilizada ampliamente denominada LucPpy de Photinus
pyralis. El ADNc que codifica LucPpe2 se aisló, se
secuenció y se clonó (véase Leach y col., 1997). Un mutante de este
gen codifica una primera luciferasa LucPpe2 [T249M].
Una secuencia de aminoácidos de luciferasa
mutante es la de LucPpe2 mostrada en la Figura 45 con la
excepción de que en el resto 249 hay una M (denominado T249M) en
lugar de la T presentada por Leach y col. El resto subrayado (249)
muestra una mutación de T a M. Esta enzima produjo aproximadamente 5
veces más luz in vivo cuando se expresó en E.
coli.
Los extractos diluidos de E. coli
recombinante que expresaba luciferasas mutantes fabricadas por
procedimientos de la invención se exploraron simultáneamente para
una pluralidad de características incluyendo intensidad de luz,
estabilidad de señal, utilización de sustrato (K_{m}), y
termoestabilidad. Se usó un sistema robótica completamente
automático para explorar grandes cantidades de mutantes en cada
generación de la evolución. Después de varios ciclos de mutagénesis
y exploración, creando de este modo bibliotecas mutantes de
luciferasas, se consiguió una termoestabilidad aumentada en
comparación con LucPpe2 [T249M] de aproximadamente 35ºC para
el clon Luc90-1B5 que también mantuvo esencialmente
la actividad enzimática (hubo sólo una perdida insignificante en la
actividad del 5%) cuando se mantuvo en solución acuosa durante 2
horas a 50ºC, 5 horas a 65ºC, o durante 6 semanas a
22ºC.
22ºC.
Las luciferasas mutantes de la presente invención
presentan termoestabilidad aumentada durante al menos 2 horas a
50ºC, preferiblemente al menos 5 horas a 50ºC, y en el intervalo de
al menos 2 horas, preferiblemente al menos 24 horas, y más
preferiblemente al menos 50 horas, a temperaturas que incluyen 50ºC,
60ºC, y/o a temperaturas hasta 65ºC. En particular, la presente
invención comprende luciferasas mutantes termoestables que, cuando
se solubilizan en una solución acuosa adecuada, tienen una
termoestabilidad superior a aproximadamente 2 horas a
aproximadamente 50ºC, más preferiblemente superior a aproximadamente
10 horas a 50ºC, y más preferiblemente superior aún a 5 horas a
50ºC. La presente invención también comprende luciferasas mutantes
que, cuando se solubilizan en una solución acuosa adecuada, tienen
un termoestabilidad superior a aproximadamente 2 horas, más
preferiblemente al menos 5 horas, incluso más preferiblemente
superior a aproximadamente 10 horas, e incluso más preferiblemente
aún superior a 24 horas, a aproximadamente 60ºC. La presente
invención comprende adicionalmente luciferasas mutantes que cuando
se solubilizan en una solución acuosa adecuada tienen una
termoestabilidad superior a 3 meses a aproximadamente 22ºC, y más
preferiblemente una termoestabilidad de al menos 6 meses a 22ºC. Una
realización de la invención es una luciferasa mutante que tiene
termoestabilidad a 65ºC, en la que la pérdida de actividad de
aproximadamente 5-6% se encontró después de 6 horas
(equivalente a una semi-vida de 2 días). Las
semi-vidas de las enzimas de los clones más estables
de la presente invención, extrapoladas de los datos que muestran
cambios relativos pequeños, es superior a 2 días a 65ºC (que
corresponde a una pérdida de 6% durante 6 horas), y aproximadamente
2 años a 22ºC (que corresponde a una pérdida del 5% durante
9 semanas).
9 semanas).
Las enzimas luciferasas con secuencias de
aminoácidos descritas en este documento (por ejemplo, luciferasas
mutantes denominadas Luc49-7C6,
Luc78-0B10, Luc90-1B5,
Luc133-1B2, y Luc146-1H2) tienen
termoestabilidad medida como semi-vidas de al menos
2 horas a 50ºC. También se describen secuencias polinucleotídicas
mutadas que codifican enzimas luciferasa que contienen cualquier
mutación simple o cualquier combinación de mutaciones del tipo que
convierte un aminoácido de la luciferasas del escarabajo de
referencia en un aminoácido consenso. Los aminoácidos conservados se
definen como los que se encuentran en una posición particular en
todas las secuencias en un conjunto dado de enzimas relacionadas.
Los aminoácidos consenso se definen como los que se encuentran en
una posición particular en más del 50% de las secuencias en un
conjunto dado de enzimas. Un ejemplo es el conjunto de secuencias de
luciferasa del escarabajo mostradas en la Figura 19, excluyendo
LucPpe2.
Las secuencias de nucleótidos que codifican
luciferasas del escarabajo se alinean en la Figura 19. Once
secuencias se encuentran en la naturaleza en diversos géneros, y las
especies en los géneros, se alinean, incluyendo lucPpe2. Hay
al menos tres mutaciones presentes en cada luciferasa mutante que
muestra termoestabilidad aumentada. En general, las mutaciones no
son de un resto de aminoácido conservado. Las mutaciones en las
luciferasas mutadas se indican en las Figuras 22-47
por subrayado.
La memoria descriptiva también describe
procedimientos para preparar enzimas que tienen una o más
propiedades deseadas, por ejemplo, resistencia a la inhibición por
un análogo de sustrato de la enzima o propiedades enzimológicas
potenciadas. El procedimiento comprende seleccionar al menos una
secuencia polinucleotídica que codifica una enzima con la propiedad
deseada, por ejemplo, una propiedad enzimológica, a partir de una
primera población de secuencias polinucleotídicas mutadas. La
secuencia polinuleotídica asilada seleccionada después se muta para
producir una segunda población de secuencias polinucleotídicas
mutadas. Preferiblemente, se muta una mezcla de secuencias
polinucleotídicas aisladas seleccionadas para producir una segunda
población de secuencias polinucleotídicas mutadas. El procedimiento
puede repetirse hasta que se obtiene una secuencia polinucleotídica
adicional, por ejemplo, seleccionada y/o aislada, codificando dicha
secuencia polinucleotídica adicional una enzima que tiene al menos
una de las propiedades deseadas. Como se usan en este documento, los
términos, "aislado y/o purificado" se refieren a aislamiento
in vitro de una molécula de ARN, ADN o polipeptídica a partir
de su medio celular natural, y a partir de la asociación con otros
componentes de la célula, tales como ácido nucleico o polipéptido,
por ejemplo, de modo que puedan secuenciarse, replicarse, y/o
expresarse.
La Figura 1 es una representación gráfica de la
termoestabilidad a 37ºC de LucPpe2[T249M];
Luc39-5B10; y Luc49-7C6, normalizada
a t = 0 [el eje X es el tiempo en minutos; el eje Y es el % de
actividad restante; y "t" es tiempo].
La Figura 2 es una representación gráfica de la
actividad restante de Luc49-7C6 y
Luc78-0B10 a 50ºC normalizada a lectura a t = 0 [el
eje X es el tiempo en horas; el eje Y es el % de actividad restante;
y t es tiempo].
La Figura 3 es una representación gráfica de la
luminiscencia producida por Luc49-7C6 y
Luc78-0B10 a 60ºC normalizada a t = 0 [el eje X es
el tiempo en horas; el eje Y es el % de actividad restante; y t es
tiempo].
La Figura 4 es una representación gráfica de la
termoestabilidad de las luciferasas, LucPpe2[T249M];
Luc49-7C6; y Luc78-0B10 a 22ºC [el
eje X es el tiempo en días; el eje Y es unidades de luz
normalizadas].
La Figura 5 es una representación gráfica del log
de luminiscencia observada producida por (Y)
Luc78-0B10 en comparación con el log de
luminiscencia previsto por la ecuación de regresión Y = 0,0043X +
10,91; la semi vida de la enzima se calcula como 144 horas (6 días)
[el eje X es el tiempo en horas; el eje Y es el log de
luminiscencia].
La Figura 6 es una representación gráfica del log
de luminiscencia observada producida por Luc78-0B10
a 60ºC en comparación con el log de luminiscencia calculado por la
ecuación de regresión Y = 0,154X + 10,86; la semi vida de la enzima
se calcula como 38 horas (1,58 días) [el eje X es el tiempo en
horas; el eje Y es el log de
luminiscencia].
luminiscencia].
La Figura 7 es una representación gráfica del log
de luminiscencia observada producida por Luc49-7C6
a 50ºC en comparación con el log de luminiscencia previsto por la
ecuación de regresión Y = -0,0059X + 8,757; la semi vida de la
enzima se calcula como 100,5 horas (4,2 días) [el eje X es el tiempo
en horas; el eje Y es el log de
luminiscencia].
luminiscencia].
La Figura 8 es una representación gráfica del log
de luminiscencia observada producida por Luc49-7C6
a 60ºC en comparación con el log de luminiscencia calculado por la
ecuación de regresión Y = -0,169X + 8,647; la semi vida calculada de
la enzima es 2,9 horas [el eje X es el tiempo en horas; el eje Y es
el log de luminiscencia].
La Figura 9 es una representación gráfica del log
de luminiscencia observada producida por Luc78-0B10
a 22ºC en comparación con un log de luminiscencia previsto; la semi
vida de la enzima es 109 días [el eje X es el tiempo en días; el eje
Y es el log de luminiscencia].
La Figura 10 es una representación gráfica del
log de luminiscencia observada producida por
Luc49-7C6 a 22ºC en comparación con un log de
luminiscencia previsto; la semi vida de la enzima es 64 días [el eje
X es el tiempo en días; el eje Y es el log de luminiscencia].
La Figura 11 es una representación gráfica del
log de luminiscencia observada producida por
Luc49-7C6 a 37ºC en comparación con el log de
luminiscencia previsto [el eje X es el tiempo en minutos; el eje Y
es el log de luminiscencia].
La Figura 12 es una representación gráfica del
log de luminiscencia observada producida por la luciferasa
LucPpe2
[T249M] a 22ºC en comparación con un log de luminiscencia previsto [el eje X es el tiempo en días; el eje Y es el log de luminiscencia].
[T249M] a 22ºC en comparación con un log de luminiscencia previsto [el eje X es el tiempo en días; el eje Y es el log de luminiscencia].
La Figura 13 es una representación gráfica del
log de luminiscencia observada producida por la luciferasa
LucPpe2
[T249M] a 37ºC en comparación con el log de luminiscencia previsto [el eje X es el tiempo en minutos; el eje Y es el log de luminiscencia].
[T249M] a 37ºC en comparación con el log de luminiscencia previsto [el eje X es el tiempo en minutos; el eje Y es el log de luminiscencia].
La Figura 14 es un cuadro de flujo que muestra
las etapas de un ensato de luminiscencia (Li); estabilidad
enzimática (t); cinética de ensayo (S); y unión de sustrato (Km)
in vivo e in vitro.
La Figura 15 es una representación esquemática de
un robot de distribución de sobremesa.
La Figura 16A es una representación gráfica de la
luminiscencia de la luciferasa mutante Luc90-1B5
medida a 65ºC, pH 6,5 (el eje X es el tiempo en horas; el eje Y es
el % de luminiscencia).
La Figura 16B es una representación gráfica de la
luminiscencia de la luciferasa mutante Luc90-1B5
medida a 22ºC, pH 6,5 (el eje X es el tiempo en horas; el eje Y es
el % de luminiscencia).
La Figura 17 es un diagrama que muestra las
relaciones evolutivas entre luciferasas de escarabajo en base a las
secuencias de aminoácidos.
La Figura 18A es una representación de las
estructuras secundarias de enzimas luciferasa de escarabajo (las
hélices se simbolizan por cilindros, la hojas por grupos de flechas,
los bucles conectan hélices con las hojas).
La Figura 18B muestra los aminoácidos
(estructuras terciarias) de la luciferasa LucPpe2, en la que
las pequeñas espirales corresponden a cilindros de la Figura
18A.
La Figura 18C muestra que la arquitectura general
de escarabajo coincide (está superpuesta sobre) la de
Luc90-1B5.
La Figura 19A representa el alineamiento de la
secuencia de aminoácidos (SEC.ID.Nº 27-37) para
luciferasas de diversas especies de escarabajo (Lcr, Lla, Lmi, Pmi,
Ppy, Lno, Ppe1, Phg, GR, YG, Ppe2, respectivamente) y luciferasas
mutantes (Luc49-7C6; Luc78-0B10;
Luc90-1B5, Luc133-1B2; y
Luc146-1H2, SEC.ID.Nº 14, 19, 24, 44, y 45,
respectivamente); las secuencias se alinean, los espacios donde no
se pueden alinear las secuencias se muestran por puntos (por
ejemplo, ...); se muestran sólo los aminoácidos en las luciferasas
mutantes que difieren de los de algunas especies de escarabajo, no
las secuencias completas. "Cons" es una secuencia que muestra
aminoácidos conservados por letras únicas, y se indican aminoácidos
no conservados por "-".
La Figura 19B representa el alineamiento de la
secuencia de aminoácidos (SEC.ID.Nº 27-37) para
luciferasas de diversas especies de escarabajo (Lcr, Lla, Lmi, Pmi,
Ppy, Lno, Ppe1, Phg, GR, YG, Ppe2) y luciferasas de la presente
invención (Luc30-4B02 y Luc81-6G01,
SEC.ID.Nº 47 y 26, respectivamente); las secuencias se alinean, los
espacios donde no se alinean las secuencias se muestran por puntos
(por ejemplo, ...); se muestran en negrita los aminoácidos que
difieren en las luciferasas de la presente de los de algunas
especies de escarabajo.
La Figura 19C representa el alineamiento de la
secuencia de aminoácidos (SEC.ID.Nº 27-34 y
36-37) para luciferasas de diversas especies de
escarabajo (Lcr, Lla, Lmi, Pmi, Ppy, Lno, Ppe1, Phg, YG, Ppe2, Ppl);
las secuencias se alinean, los espacios donde no se alinean las
secuencias se muestran por puntos (por ejemplo, ...); en la línea
por debajo de YG, la X indica posiciones en las que podrían
producirse un aminoácido consenso; O indica posiciones en YG en las
que las mutaciones no podrían producir un aminoácido consenso.
La Figura 20 es el mapa de vector Ppe2 de
7216 pb en una estructura Prat.
La Figura 21 es un gráfico de barras que compara
la luminiscencia expresada en colonias recombinantes de E.
coli; las colonias difieren en la identidad del vector que
codifica la luciferasa (Luc+; Luc90-1B5;
Luc78-1B10; Luc49-7C6;
LucPpe2[T249M] y LucPpe2); en la colonia recombinantes
en el eje Y [el eje X es las unidades de luz
normalizadas].
normalizadas].
La Figura 22 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 1) que codifica la enzima luciferasa mutante
Luc49-7C6; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 23 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 2) que codifica la enzima luciferasa mutante
Luc49-6C10; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 24 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 3) que codifica la enzima luciferasa mutante
Luc49-0G12; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 25 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 4) que codifica la enzima luciferasa mutante
Luc49-7A5; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 26 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 5) que codifica la enzima luciferasa mutante
Luc49-4G11; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 27 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 14) de la luciferasa mutante denominada
Luc49-7C6; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 28 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 15) de la enzima luciferasa mutante
Luc49-6C10; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 29 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 16) de la enzima luciferasa mutante
Luc49-0G12; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 30 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 17) de la enzima luciferasa mutante
Luc49-7A5; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 31 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 18) de la enzima luciferasa mutante
Luc49-4G11; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 32 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 6) que codifica la enzima luciferasa mutante
Luc78-0B10; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 33 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 7) que codifica la enzima luciferasa mutante
Luc78-0G8; las mutaciones se indican por subrayado;
X significa identidades desconocidas de nucleótidos en ciertas
posiciones.
La Figura 34 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 8) que codifica la enzima luciferasa mutante
Luc78-1E1; las mutaciones se indican por subrayado;
X significa que la identidad de un nucleótido en una posición es
desconocida.
La Figura 35 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 9) que codifica la luciferasa mutante
Luc78-2B4; los nucleótidos subrayados son
mutaciones; X significa identidades desconocidas de nucleótidos en
ciertas
posiciones.
posiciones.
La Figura 36 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 19) de la luciferasa mutante Luc78-0B10;
los aminoácidos subrayados son mutaciones.
La Figura 37 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 20) de la enzima luciferasa mutante
Luc78-0G8; los aminoácidos subrayados son
mutaciones; X significa aminoácidos desconocidos en una
posición.
La Figura 38 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 21) de la enzima luciferasa mutante
Luc78-1E1; los aminoácidos subrayados son
mutaciones; X significa aminoácidos desconocidos en una
posición.
La Figura 39 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 22) de la enzima luciferasa mutante
Luc78-2B4; los aminoácidos subrayados son
mutaciones; X significa aminoácidos desconocidos en una
posición.
La Figura 40 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 10) que codifica la enzima luciferasa mutante
Luc85-4F12; los nucleótidos subrayados son
mutaciones; X significa un aminoácido desconocido en esa
posición.
La Figura 41 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 23) de la enzima luciferasa mutante
Luc85-4F12; los aminoácidos subrayados son
mutaciones; X significa un aminoácido desconocido en esa
posición.
La Figura 42 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 11) que codifica la enzima luciferasa mutante
Luc90-1B5; los nucleótidos subrayados son
mutaciones.
La Figura 43 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 24) de la luciferasa mutante denominada
Luc90-1B5; los aminoácidos subrayados son posiciones
mutadas.
La Figura 44 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 12) que codifica la enzima luciferasa
LucPpe2 [T249M].
La Figura 45 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 25) para LucPpe2 [T249M]; el aminoácido subrayado
es una mutación de Thr a Mat en el resto 249.
La Figura 46 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 26) para la enzima luciferasa
LucPpl81-6G1; los aminoácidos subrayados son
mutaciones de una secuencia de partida; X muestra ambigüedad.
La Figura 47 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 13) que codifica la enzima luciferasa
Luc81-6G1; los nucleótidos subrayados son
mutaciones.
La Figura 48 es una representación gráfica de la
luminiscencia de las luciferasas mutantes Luc49-7C6
y Luc78-0B10 a 60ºC normalizada a t = 0 [el eje X es
el tiempo en horas, el eje Y es el log de la luminiscencia
normalizada].
La Figura 49 es una representación gráfica de la
termoestabilidad de las luciferasas LucPpe2 [T249M],
Luc49-7C6, y Luc78-0B10, a 4ºC,
normalizada a valores iniciales [el eje X es el tiempo en días, el
eje Y es el log de las unidades de luz normalizadas].
La Figura 50 es una representación gráfica de la
luminiscencia de las luciferasas mutantes Luc49-7C6
y Luc78-0B10 a 50ºC normalizada a t = 0 [el eje X es
el tiempo en horas, el eje Y es el log de la luminiscencia].
La Figura 51 es una representación gráfica de la
luminiscencia de las luciferasas mutantes Luc49-7C6
y Luc78-0B10 a 50ºC normalizada a t = 0.
La Figura 52 es una representación gráfica de la
luminiscencia de las luciferasas mutantes Luc49-7C6
y Luc78-0B10 a 60ºC normalizada a t = 0 [el eje X es
el tiempo en horas, el eje Y es la luminiscencia].
La Figura 53 es una representación gráfica de la
termoestabilidad de las luciferasas LucPpe2 [T249M],
Luc49-7C6, y Luc78-0B10, a 22ºC [el
eje X es el tiempo en días, el eje Y es el log de
luminiscencia].
La Figura 54A es una representación gráfica de la
luminiscencia de Luc90-1B5;
Luc133-1B2; y Luc146-1H2, a pH 4,5 y
48ºC, normalizada a t = 0.
La Figura 54B es una representación gráfica de la
semi-vida de Luc90-1B5;
Luc133-1B2; y Luc146-1H2, a pH 4,5
y 48ºC. La semi-vida de Luc90-1B5 en
estas condiciones es aproximadamente 3 minutos,
Luc133-1B2 aproximadamente 20 minutos, y
Luc146-1H2 aproximadamente 62 minutos.
La Figura 55 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 42) que codifica la enzima luciferasa
Luc133-1B2; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 56 es una secuencia de nucleótidos
(ADN) (SEC.ID.Nº 43) que codifica la enzima luciferasa
Luc146-1H2; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 57 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 44) de la luciferasa mutante Luc133-1B2;
las mutaciones se indican por subrayado.
La Figura 58 es una secuencia de aminoácidos
(SEC.ID.Nº 45) de la luciferasa mutante Luc146-1H2;
las mutaciones se indican por subrayado.
La Figura 59 es una representación gráfica de la
cinética de señales de los clones Luc49-7C6;
Luc78-0B10; Luc90-1B5;
Luc133-1B2; y Luc146-1H2 a pH 7,8 a
temperatura ambiente.
La Figura 60 es una representación gráfica de la
luminiscencia normalizada a 50ºC pH 7,8 de
Luc49-7C6; Luc78-0B10;
Luc90-1B5; Luc133-1B2; y
Luc146-1H2; de t = 0 a aproximadamente 8 horas.
La Figura 61 es una representación gráfica de la
resistencia de las luciferasas seleccionadas a un sustrato
inhibidor. Los datos se representan como el log de la luminiscencia
frente al tiempo para Luc90-1B5;
Luc133-1B5; y Luc146-1H2.
La Figura 62 es una representación gráfica del
log de la luminiscencia en el tiempo a 22ºC, pH 6,5 para
Luc90-1B5 y LucPpe2[T249M].
La Figura 63 es una representación gráfica de la
termoestabilidad de luciferasas mutantes seleccionadas y
LucPpl
YG a temperatura ambiente en una solución acuosa que contiene Triton X-100 al 1%.
YG a temperatura ambiente en una solución acuosa que contiene Triton X-100 al 1%.
La Figura 64 es una representación gráfica de la
actividad de luminiscencia sostenida (expresada como
luminiscencia/D.O.) en el tiempo para ciertas luciferasas.
La Figura 65 es una secuencia de nucleótidos
(SEC.ID.Nº 46) que codifica la enzima luciferasas
Luc81-0B11; las mutaciones se indican por
subrayado.
La Figura 66 es una secuencia de aminoácidos de
la luciferas mutante Luc81-0B11; las mutaciones se
indican por subrayado.
La invención se refiere a enzimas, por ejemplo,
luciferasas del escarabajo, que se crean por mutaciones hechas en
los genes codificantes, generalmente por mutagénesis recursiva,
teniendo dichas enzimas mutadas dos o más propiedades deseadas, es
decir, termoestabilidad aumentada, resistencia aumentada a
inhibidores, y propiedades enzimológicas posiblemente potenciadas,
con relación a una enzima de referencia, por ejemplo, la enzima de
tipo silvestre. La secuencia polinucleotídica que codifica una
enzima de la invención comprende mutaciones que codifican una
pluralidad de sustituciones de aminoácidos con relación a la
secuencia polinucleotídica que codifica la enzima de la que se
obtiene la enzima de la invención. Por ejemplo, la invención se
refiere a enzimas, por ejemplo, luciferasas, que son termoestables.
La termoestabilidad aumentada permite el almacenamiento de enzimas
tales como luciferasas sin alterar su actividad, y mejora la
reproducibilidad y precisión de los ensayos que usan las luciferasas
mutadas. Por tanto, una realización de la invención comprende
secuencias polinucleotídicas aisladas (ADNc) que codifican
luciferasas mutantes con termoestabilidad aumentada y resistencia
aumentada a inhibidor de luciferasa, vectores que contienen las
secuencias polinucleotídicas, y huéspedes transformados para
expresar las secuencias polinucleotídicas. La Tabla 1 muestra los
resultados de aproximadamente 250 clones y características de las
luciferasas de los clones incluyendo termoestabilidad. La invención
también incluye el uso de las luciferasas mutantes en cualquier
aplicación en la que las luciferasas se utilicen de manera
convencional, y kits útiles para algunas de las aplicaciones.
Inesperadamente, se consiguieron luciferasas del
escarabajo después de buscar propiedades mejoradas en la presente
invención a través del procedimiento de mutagénesis recursiva y
selección (algunas veces mencionado como "evolución directa").
Una estrategia de mutagénesis recursiva y selección es un aspecto de
la presente invención, en particular el uso de exploraciones
automáticas multi-parámetro. Por tanto, en lugar de
explorar sólo para un atributo único tal como termoestabilidad, se
hace una exploración simultánea para características adicionales de
actividad enzimática y eficacia. Por este procedimiento, una
propiedad es menos probable de "desarrollarse" a costa de otra,
provocando termoestabilidad aumentada, pero actividad disminuida,
por ejemplo.
La Tabla 1 presentan ejemplos de valores de
parámetros (Li, Tau, K_{m}, y S, véase a continuación) obtenidos
de experimentos usando diferentes luciferasas como secuencias de
partida (parentales). Los subtítulos se refieren a designaciones de
la temperatura a la que se mide la estabilidad enzimática y la
luciferasa de partida, por ejemplo, Luc39-5B10 a
51ºC etc. Todos los parámetros en cada experimento se registran como
valores relativos a la secuencia de partida respectiva, por ejemplo,
los valores de parámetro para la secuencia de partida en cualquier
experimento es igual a "1". (Véase el Ejemplo 2 en este
documento para las definiciones.)
La termoestabilidad ha evolucionado en la
naturaleza para diversas enzimas, como es evidente por las isozimas
termoestables encontradas en bacterias termófilas. La evolución
natural funciona mediante un procedimiento de mutagénesis aleatoria
(sustituciones de basas, deleciones génicas, inserciones génicas),
seguida de la selección de los mutantes con características
mejoradas. El procedimiento es recursivo en el tiempo. Aunque la
existencia de enzimas termoestables en la naturaleza sugiere que la
termoestabilidad puede conseguirse a través de la mutagénesis en una
escala evolutiva, la viabilidad de conseguir un nivel dado de
termoestabilidad para una clase particular de enzimas usando
procedimiento de laboratorio de corta duración fue impredecible. El
procedimiento natural de la evolución, que generalmente implica
poblaciones extremadamente grandes y muchos millones de generaciones
y genes, por mutación y selección no puede usarse para predecir las
capacidades de un laboratorio moderno para producir genes mejorados
por evolución dirigida hasta que dichos mutantes se produzcan.
Después de dicho éxito, como la estructura
tridimensional global de todas las luciferasas del escarabajo es
bastante similar, se ha demostrado que es posible para un miembro de
esta clase hacer predecible que pueda conseguirse termoestabilidad
alta para otras luciferasas del escarabajo por procedimientos
similares. La Figura 17 muestra una relación evolutiva entre las
luciferasas del escarabajo, todas las cuales tienen arquitectura
global similar. La clase estructural a la que pertenecen las
luciferasas del escarabajo se determina por la estructura
secundaria (por ejemplo, las hélices se simbolizan por cilindros,
las hojas por conjuntos de flechas, y los bucles conectan las
hélices con las hojas (Figura 18A). La Figura 18B muestra los
aminoácidos de la luciferasa LucPpe2 en la que las pequeñas
espirales corresponden a cilindros de la Figura 18A; la Figura 18C
muestra que la arquitectura de escarabajo general coincide (se
superpone sobre) la de LucPpe2. Esto es la base para la
esperanza de que los procedimientos usados en la presente invención
puedan generalizarse a todas las luciferasas del escarabajo.
Las enzimas pertenecen a diferentes clases
estructurales en base al ordenamiento tridimensional de los
elementos secundarios tales como hélices, hojas, y bucles. La
termoestabilidad se determina mediante cómo se compactan de manera
eficaz los elementos secundarios entre sí en una estructura
tridimensional. Para cada clase estructural, también existe un
límite teórico para la termoestabilidad. Todas las luciferasas del
escarabajo pertenecen a una clase estructural común como es evidente
por su ancestro común (Figura 17), secuencias de aminoácidos
homólogas, y mecanismos catalíticos comunes.
La aplicación de una cantidad limitada de
sustituciones de aminoácidos por mutagénesis es improbable que
afecte de manera significativa a la arquitectura tridimensional
global (es decir, no se espera que cambie la clase estructural para
las luciferasas mutantes). Como el límite teórico para la
termoestabilidad para cualquier clase estructural no es conocido, la
termoestabilidad potencial de las luciferasas del escarabajo no fue
conocido hasta las demostraciones de la presente invención.
A priori las dificultades en conseguir los
objetivos de la presente invención incluyendo:
1. Los tipos de mutaciones que pueden
hacerse por procedimientos de laboratorio son limitados.
- i)
- Por mutación puntual aleatoria (por ejemplo, PCR propensa a errores), más de un cambio de base por codón es raro. Por tanto, los cambios de aminoácidos más potenciales son raros.
\newpage
- ii)
- Otros tipos de cambios genéticos aleatorios son difíciles de conseguir para áreas de más de 100 pb (por ejemplo, deleciones o inserciones génicas aleatorias).
2. La cantidad de mutantes de luciferasa
posibles que puede explorarse es limitada.
- i)
- En base a las comparaciones de secuencia de luciferasas naturales, ignorando deleciones e inserciones, más de 10^{189} secuencias de enzimas funcionales pueden ser posibles.
- ii)
- Si se pudieran explorar 100.000 clones por día, serían necesarios más de 10^{179} siglos para explorar todos los posibles mutantes suponiendo que la misma mutación no se exploraría dos veces (la velocidad de exploración real para la presente invención fue de menos de 5000 por día).
3. La probabilidad de encontrar mejora
funcional que requiere mutaciones cooperativas es rara (la
probabilidad de encontrar un par cooperativo específico es de 1 de
10^{8} clones).
Por tanto, incluso si los límites teóricos de
termoestabilidad son conocidos, a como sólo una cantidad muy pequeña
de los posibles mutantes de luciferasa pueden explorarse, la
probabilidad a priori de encontrar dicha enzima termoestable
fue baja.
Sin embargo, la presente invención ahora muestra
que es posible y viable crear nuevas luciferasas del escarabajo que
tienen alta termoestabilidad.
a) Los aproximadamente 250 mutantes
producidos por los procedimientos usados en la presente invención en
los que la secuencia inicial fue de lucPpe2 o lucPplYG
demuestran que es posible y viable para al menos un miembro de esta
clase de enzimas conseguir alta termoestabilidad.
b) Cualquier luciferasa del escarabajo
puede mejorarse por medios similares porque las luciferasas
pertenecen a la misma clase estructural.
- i)
- Como todas las luciferasas del escarabajo pertenecen a la misma clase estructural, también comparten el mismo conjunto de mutaciones potencialmente estabilizadoras (esta conclusión se mantiene por la ob-servación que un alto porcentaje de las mutaciones estabilizadoras encontradas en los clones de la presente invención fueron conversiones a "aminoácidos consenso" en otras luciferasas del escarabajo es decir, aminoácidos que aparecen en la mayoría de las secuencias de luciferasa del escarabajo (véase Figura 19).
- ii)
- Se consiguieron resultados similares usando luciferasa del escarabajo, compuesta ampliamente por una secuencia de aminoácidos diferentes, del escarabajo luminoso Pyrophorus plagiophthalamus (LucPplYG). El lucPplYG de tipo silvestre tienen un 48% de identidad de secuencia de nucleótidos con la lucPpe2 de tipo silvestre. Los mutantes LucPplYG se sometieron a menos ciclos de evolución dirigida que los mutantes LucPpe2 descritos en este documento. Además, en algunos casos, los mutantes se seleccionaron con menos énfasis hacia su termoestabilidad relativa. El clon más estable resultante de esta evolución (Luc80-5E5) tiene una semivida de aproximadamente 3,8 horas a 50ºC en solución.
Para compensar un efecto estadístico provocado
por la gran cantidad de mutaciones aleatorias perjudiciales
esperadas con relación a las mutaciones beneficiosas, se emplearon
procedimientos para maximizar la precisión del ensayo y para
re-explorar las mutaciones seleccionadas previamente
en nuevas permutaciones. Entre los procedimientos para maximizar la
precisión de ensayo estaban el control estricto de las condiciones
de cultivo usando medios especializados, la reducción de las
velocidades de crecimiento, el control de la transferencia de calor,
y el análisis de los parámetros de crecimiento
semi-logarítmico del cultivo. Los procedimientos
robóticos maximizaron la precisión incluyen controlar la mezcla, las
transferencias de calor, y la evaporación de muestras en los
procedimientos de exploración robótica; y los datos de normalización
para muestras de control distribuidas espacialmente. Se crearon
nuevas permutaciones de las mutaciones seleccionadas por un
procedimiento de arrastre del ADN usando polimerasas correctoras de
errores.
La dificultad para predecir el resultado del
procedimiento recursivo se ejemplifica por el suceso variable con
las otras características de luciferasa que también se seleccionaron
para ello. Aunque el objetivo principal fue la termoestabilidad
enzimática, también se intentó la selección de mutantes que
produzcan luminiscencia más luminosa, con utilización de sustrato
más eficaz, y una señal de luminiscencia prolongada. Las
definiciones se dan por ecuaciones adjuntas. El procedimiento de
selección se determinó por cambios con relación a los clones
parentales para cada iteración del procedimiento recursivo. La
cantidad de los cambios fue cuanto se observó durante el
procedimiento de exploración. La expresión de luciferasa en E.
coli fue relativamente ineficaz, para LucPpe2, en
comparación con Luc+. Otras luciferasas variaron (véase Figura
21).
Para mejorar la eficacia global de la utilización
de sustrato, se buscó la reducción en la constante de utilización
aparente del compuesto (es decir, Km[ATP+luciferina]) tanto
para luciferina como para ATP. Aunque hubo un cambio sistemático
inesperado en cada constante de utilización (Km[ATP],
Km[luciferina]), hubo poco cambio global. Finalmente, la
señal de luminiscencia pudo afectarse sólo moderadamente sin reducir
sustancialmente la eficacia enzimática. Por tanto, aunque la
termoestabilidad se aumentó enormemente por procedimientos de la
presente invención, otras características de la enzima se mucho
menos afectadas.
Las Figuras 1-13, 16,
48-53, 60 y 62 representan medidas de
termoestabilidad de luciferasas mutantes. Las Figuras
48-53 representan otros resultados de las
luciferasas mutantes. Las composiciones de la invención incluyen
luciferasas que tienen termoestabilidad superior al nivel natural.
Cada luciferasa mutante es nueva, porque sus características
individuales no se han documentado. Se conocen luciferasas
específicas tanto por su secuencia proteica como génica. Se aislaron
muchas otras luciferasas que tienen alta termoestabilidad aumentada,
pero cuyas secuencias no son conocidas. Estas luciferasas se
identificaron durante el procedimiento de evolución dirigida, y se
reconocieron como distintas por sus características enzimológicas.
Las luciferasas mutantes de la presente invención pueden presentar
termoestabilidad extraordinaria y sin realizar hasta ahora a
temperaturas que varían de 22ºC a al menos tan alto como
60ºC.
60ºC.
Otros aspectos de la invención incluyen
procedimientos que incorporan las luciferasas termoestables,
específicamente luciferasas del escarabajo que tienen alta
termoestabilidad y resistencia a la inhibición por un
sustrato
inhibidor.
inhibidor.
A partir de una población de secuencias
polinucleotídicas que codifican la enzima que se obtiene de una
primera secuencia polinucleotídica que codifica la enzima que se
somete a mutación, se selecciona y aísla al menos una secuencia
polinucleotídica que codifica una enzima que tiene la actividad
enzimológica potenciada. En una realización, la mutagénesis mediada
por oligonucleótido después se emplea para introducir al menos un
codón que codifica un aminoácido consenso en al menos una de las
secuencias polinucleotídicas seleccionadas aisladas que codifican
las enzimas para producir una secuencia polinucleotídica adicional
que codifica la enzima y que tiene el codón que codifica el
aminoácido consenso, donde el codón que se introduce no está
presente en la primera secuencia
polinucleotídica.
polinucleotídica.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento de fabricar luciferasas con
termoestabilidad aumentada es mutagénesis recursiva seguida de
selección. Las realizaciones de las luciferasas altamente
termoestables de la invención se generaron por un procedimiento
reiterativo de mutaciones puntuales aleatorias que comienzan con una
secuencia de nucleótidos fuente, por ejemplo, el ADNc de
lucPpe2 [T249M]. La mutagénesis por recombinación es una
parte del procedimiento de mutagénesis, junto con mutagénesis
puntual. Tanto la mutagénesis por recombinación como la mutagénesis
puntual se realizan de manera recursiva. Como el procedimiento de
mutación provoca recombinación de mutantes individuales de un modo
similar a la recombinación de elementos genéticos durante la
reproducción sexual, el procedimiento a veces se menciona como la
reacción en cadena de la polimerasa sexual (sPCR). Véase, por
ejemplo, Stemmer, Patente de Estados Unidos Nº 5.605.793, expedida
el 25 de febrero de 1997.
Tomando la secuencia de ADNc de lucPpe2
como punto de partida, el gen se mutó para producir luciferasas
mutantes que son mucho más estables. Una única mutación puntual en
la secuencia de lucPpe2 produjo la luciferasa cuya secuencia
se representa como T249M. Este mutante es aproximadamente 5 veces
más brillante in vivo que lucPpe2, se utilizó como
molde para mutación adicional. También se usó una medida inicial
para medir la termoestabilidad de las otras luciferasas mutantes
descritas en este documento.
La Figura 45 muestra la secuencia de aminoácidos
de la luciferasa LucPpe2 (T249M). La secuencia contienen una
mutación única en la posición 249 de T a M (subrayado) que la
distingue de la secuencia presentada por Leach y col. (1997). Esta
luciferasa tiene un máximo espectral de 552 nm, que cambia a
amarillo del de la luciferasa de Leach y col. Este mutante se
seleccionó para su uso como molde original en alguno de los Ejemplos
porque es aproximadamente 5 veces más brillante in vivo, que
la forma presentada por Leach y col. que permitió una exploración
más eficaz por el ensayo. Estas secuencias muestran cambios de la
secuencia de partida (T249M) por subrayado. Obsérvese que "x"
en la secuencia indica una ambigüedad en la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
La evolución dirigida es un procedimiento
recursivo para crear diversidad a través de mutagénesis y
exploración para cambios deseados. Para propiedades enzimológicas
provocadas por la acción acumulativa de múltiples aminoácidos, la
evolución dirigida proporciona un medio para alterar estas
propiedades. Cada etapa del procedimiento típicamente produce
pequeños cambios en la función enzimática, pero el efecto cumulativo
de muchas rondas de este procedimiento puede conducir a un cambio
global sustancial.
La característica, "termoestabilidad" es un
candidato para la evolución dirigida porque se determina por la
acción combinada de muchos de los aminoácidos que componen la
estructura enzimática. La producción de luminiscencia y eficacia de
la unión de sustrato de la luciferasa modificada también se
exploraron. Esto fue para asegurar que los cambios en
termoestabilidad no sólo produjo cambios no deseables en otras
propiedades enzimológicas
importantes.
importantes.
Como la frecuencia de mutaciones prejudiciales es
mucho mayor que la de mutaciones útiles, es probable que los clones
indeseables se seleccionen en cada exploración en los límites de
precisión de la presente invención. Para compensar esto, la
estrategia de exploración incorporó múltiples
re-exploraciones de las mutaciones seleccionadas en
un principio. Sin embargo, antes de volver a explorar, las
mutaciones seleccionadas se "arrastraron" para crear una
biblioteca de recombinaciones intragénicas aleatorias. Este
procedimiento permite que se recombinan entre sí mutaciones
beneficiosas entre diferentes clones en menos secuencias
codificantes comunes, y que se segreguen y omitan mutaciones
perjudiciales. Por tanto, aunque se exploró otra vez esencialmente
el mismo conjunto de mutaciones seleccionadas, se exploraron en
diferentes permutaciones como resultado de la recombinación o
arrastre.
arrastre.
Aunque los resultados de cada etapa del proceso
evolutivo se ensayaron por medidas cuantitativas, estas medidas se
hicieron mutuamente en lisados celulares en lugar de en enzimas
purificadas. Además, cada etapa sólo midió cambios en el rendimiento
enzimático con relación a la etapa anterior, de modo que los cambios
globales en la función enzimática fueron difíciles de juzgar.
La Tabla 1 resume las características de diversos
clones obtenidos usando los procedimientos anteriores.
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\vskip1.000000\baselineskip
El Control es Luc39-5B10 a
51ºC
| Experimento | ID del | Luminiscencia | Estabilidad | Unión de | Estabilidad |
| Clon | (Li) | enzimática | sustrato | de señal | |
| (tau) | (Km) | (S) | |||
| 40 | 0a7 | 1,04 | 45 | 0,78 | 1 |
| 40 | 5h4 | 1,29 | 1,61 | 1,16 | 0,953 |
| 40 | 0c2 | 1,13 | 1,54 | 0,91 | 0,998 |
| 40 | 5g4 | 1 | 1,4 | 0,85 | 1 |
| 40 | 6d3 | 1,02 | 1,37 | 0,79 | 1 |
| 40 | 1g4 | 1,06 | 1,28 | 0,77 | 0,985 |
| 40 | 1d4 | 1,69 | 1,23 | 0,73 | 1 |
| 40 | 0h9 | 1,26 | 1,21 | 0,63 | 0,998 |
| 40 | 2f6 | 3 | 1,07 | 0,49 | 0,981 |
| 40 | 7d6 | 3,09 | 1,058 | 1,09 | 1,013 |
| 40 | 5a7 | 4,3 | 1,025 | 0,93 | 1,008 |
| 40 | 4c8 | 1 | 1 | 0,33 | 1,004 |
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 41 | 7h7 | 0,73 | 2,4 | 2,1 | 0,995 |
| 41 | 5a5 | 0,77 | 1,93 | 2,7 | 1,002 |
| 41 | 2c12 | 1,06 | 1,7 | 0,91 | 1,003 |
| 41 | 6e5- | 1,16 | 1,62 | 1,53 | 0,997 |
| 41 | 4e5- | 1,08 | 1,37 | 1,4 | 1,004 |
| 41 | 6g7 | 1,3 | 1,27 | 1,39 | 0,999 |
| 41 | 1h4 | 1,36 | 1,24 | 0,56 | 0,994 |
| 41 | 0c11 | 4,1 | 1,23 | 1,24 | 0,996 |
| 41 | 2h9 | 5,3 | 1,01 | 0,83 | 0,986 |
| 42 | 6b10 | 0,97 | 3,6 | 0,97 | 0,997 |
| 42 | 1c3 | 0,91 | 2,1 | 0,6 | 0,998 |
| 42 | 7h9 | 0,8 | 1,8 | 0,8 | 0,982 |
| 42 | 6b2 | 0,77 | 1,72 | 0,8 | 0,978 |
| 42 | 6d6 | 0,83 | 1,7 | 0,733 | 0,975 |
| 42 | 4e10- | 0,77 | 1,63 | 1,8 | 0,954 |
| 42 | 1b5 | 0,83 | 1,41 | 1,05 | 0,955 |
| 42 | 6e6- | 0,71 | 1,16 | 0,89 | 0,955 |
| 42 | 3a9 | 0,85 | 1,3 | 0,86 | 0,997 |
| 42 | 6b6 | 2,7 | 1,3 | 0,91 | 1,02 |
| 42 | 6e9- | 1,5 | 1,27 | 0,98 | 1,01 |
| 42 | 3h11 | 1,73 | 1,21 | 0,63 | 0,985 |
| 42 | 1a2 | 1,11 | 1,17 | 0,77 | 1,005 |
| 42 | 3f7 | 0,49 | 1,16 | 1,13 | 0,944 |
| 42 | 1a4 | 2 | 1,01 | 0,76 | 0,996 |
El control es Luc40-0A7 a
54ºC
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 46 | 2h3 | 0,86 | 6,4 | 0,37 | 0,96 |
| 46 | 4a9 | 0,67 | 5,7 | 0,66 | 0,997 |
| 46 | 2g4 | 0,65 | 5,3 | 0,78 | 0,96 |
| 46 | 5d12 | 0,94 | 4,9 | 0,94 | 1,002 |
| 46 | 1h11 | 1,02 | 4,8 | 0,84 | 0,998 |
| 46 | 5a10 | 1,23 | 4,4 | 0,81 | 0,9842 |
| 46 | 0a8 | 1,35 | 4,3 | 0,89 | 1 |
| 46 | 4d3 | 0,51 | 3,6 | 0,65 | 0,975 |
| 46 | 2a3 | 1,17 | 2,9 | 0,57 | 0,988 |
| 46 | 3b11 | 1,39 | 2,5 | 0,63 | 1,02 |
| 46 | 7g12 | 1,49 | 2,5 | 0,91 | 1,02 |
| 46 | 0g9 | 1,86 | 2,25 | 0,5 | 0,998 |
| 46 | 7h8 | 1,07 | 1,36 | 0,52 | 0,99 |
| 46 | 1g8 | 0,3 | 1,31 | 0,72 | 0,92 |
| 46 | 1d3 | 1,74 | 1,13 | 1,02 | 1,001 |
| 46 | 0c3 | 1,68 | 1,01 | 0,74 | 1,01 |
| 46 | 5c11 | 0,82 | 1,01 | 0,6 | 0,95 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El control es Luc46-2H3 a
54ºC
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 49 | 6c10 | 0,57 | 2,2 | 0,98 | 1 |
| 49 | 7c6 | 1,12 | 1,9 | 0,93 | 1,01 |
| 49 | 0g12 | 1 | 1,58 | 0,69 | 1,08 |
| 49 | 7a5 | 1,08 | 1,44 | 1,1 | 0,99 |
| 49 | 1f6 | 0,66 | 1,13 | 1,04 | 1,006 |
| 49 | 0b5 | 0,76 | 1,07 | 1,03 | 0,98 |
| 49 | 4a3 | 0,94 | 1,06 | 0,77 | 1 |
El control es Luc49-7C6 a
56ºC
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 56 | 2d12 | 0,97 | 2,9 | 0,29 | 1,006 |
| 56 | 5g10 | 1,01 | 2,77 | 0,64 | 1,007 |
| 56 | 3d5 | 1,32 | 2,25 | 1,85 | 1,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 57 | 3d1 | 1,06 | 2,9 | 1,05 | 1,02 |
| 57 | 6g12 | 1 | 2,7 | 0,87 | 1,004 |
| 57 | 4c1 | 0,79 | 2,6 | 0,93 | 1,014 |
| 57 | 5f10 | 0,72 | 1,9 | 0,64 | 1,03 |
| 57 | 1e6- | 0,84 | 1,49 | 0,984 | 0,9871 |
| 57 | 1h2 | 0,94 | 1,43 | 0,68 | 0,991 |
| 57 | 2a6 | 1,08 | 1,08 | 0,89 | 0,9976 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 58 | 1g6 | 1,57 | 8,9 | 1,78 | 1,02 |
| 58 | 0a5 | 1,53 | 8,5 | 1,56 | 1,05 |
| 58 | 1b1 | 0,84 | 8,5 | 0,6 | 1,04 |
| 58 | 3g1 | 1 | 7,34 | 0,62 | 1,006 |
| 58 | 0f3 | 1,31 | 6,9 | 0,57 | 0,98 |
| 58 | 3e12- | 1,06 | 6,3 | 0,47 | 0,996 |
| 58 | 0c7 | 1,9 | 4 | 0,64 | 1,06 |
| 58 | 0d1 | 1,03 | 3,76 | 0,49 | 1,03 |
| 58 | 3c7 | 1,49 | 3,4 | 0,55 | 1,04 |
| 58 | 2a2 | 1,4 | 2,2 | 0,5 | 1,05 |
| 58 | 2a8 | 3,2 | 2 | 0,81 | 1,05 |
| 58 | 0f2 | 2,2 | 1,92 | 0,45 | 1,04 |
| 58 | 1b4 | 5,1 | 1,87 | 1,08 | 1,09 |
| 58 | 2b3 | 2,7 | 1,55 | 0,57 | 1,04 |
| 58 | 4g1 | 4,9 | 1,2 | 0,72 | 1,06 |
El control es Luc58-0A5 a
58ºC
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 61 | 4e9- | 1,03 | 1,84 | 0,76 | 1,01 |
| 61 | 1f1 | 1,02 | 1,43 | 0,7 | 1 |
| 61 | 2e12- | 1,56 | 1,34 | 0,48 | 1,003 |
| 61 | 2f2 | 1,5 | 1,3 | 0,32 | 1,01 |
| 61 | 6b4 | 1,2 | 1,26 | 0,88 | 0,98 |
| 61 | 4c10 | 1,46 | 1,12 | 1,06 | 0,99 |
| 61 | 4g11 | 1,31 | 1,03 | 1,43 | 1,03 |
| 61 | 2f1 | 1,41 | 1,02 | 0,79 | 0,995 |
| 61 | 2g1 | 1,3 | 1 | 1,17 | 1 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 65 | 6g12 | 0,87 | 2,3 | 0,73 | 0,9605 |
| 65 | 1h6 | 0,84 | 2,2 | 1,62 | 0,9598 |
| 65 | 7f5 | 1,2 | 1,56 | 2,07 | 1,0087 |
| 65 | 5g5 | 2,3 | 1,49 | 0,45 | 0,9985 |
| 65 | 7h2 | 1,56 | 1,27 | 0,91 | 1,0658 |
| 65 | 7b2 | 1,98 | 1,16 | 0,6 | 0,9289 |
| 65 | 0g9 | 1,36 | 1,09 | 1,46 | 0,9927 |
| 65 | 6c7 | 1,48 | 1,06 | 0,86 | 0,9967 |
| 65 | 1e12- | 1,59 | 1,05 | 1,03 | 0,9582 |
| 65 | 4e2- | 1,21 | 1,05 | 1,11 | 0,943 |
| 65 | 6a10 | 1,7 | 1,04 | 0,93 | 0,992 |
| 65 | 4b9 | 1,48 | 1,04 | 1,61 | 1,0009 |
| 65 | 6c1 | 1,36 | 1,02 | 0,72 | 0,9978 |
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 68 | 2g6 | 1,39 | 3,9 | 1,17 | 0,9955 |
| 68 | 4g3 | 2 | 2,5 | 0,27 | 0,9927 |
| 68 | 5a3 | 1,04 | 1,64 | 0,65 | 0,8984 |
| 68 | 2b7 | 1,04 | 1,64 | 5,2 | 0,9237 |
| 68 | 5d10 | 2,75 | 1,36 | 0,73 | 1,0078 |
| 68 | 7d12 | 1,85 | 1,32 | 0,66 | 1,0084 |
| 68 | 7b9 | 1,8 | 1,19 | 0,56 | 1,0052 |
| 68 | 7b3 | 1,2 | 1,16 | 0,55 | 0,9951 |
| 68 | 1g10 | 1,48 | 1,05 | 1,22 | 1,0025 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 70 | 2a7 | 1,94 | 4,6 | 0,7 | 1,0015 |
| 70 | 3d6 | 3,5 | 4,2 | 0,18 | 1,03 |
| 70 | 4f8 | 1,87 | 4,2 | 0,69 | 0,9979 |
| 70 | 7h5 | 2,4 | 2,6 | 0,18 | 1 |
| 70 | 5h6 | 3,1 | 2,3 | 0,6 | 0,999 |
| 70 | 7d6 | 3 | 2,2 | 2,29 | 0,9989 |
| 70 | 5a3 | 3,1 | 1,5 | 0,18 | 1,0058 |
| 70 | 7d2 | 2,5 | 1,4 | 0,66 | 1,0126 |
| 70 | 3h7 | 3,2 | 1,22 | 0,23 | 1,002 |
| 70 | 0h5 | 2,5 | 1,15 | 0,36 | 0,9992 |
| 70 | 0d7 | 1,86 | 1 | 1,83 | 0,993 |
| 70 | 1g12 | 2,42 | 1 | 0,26 | 0,965 |
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 71 | 1d10 | 1,6 | 4,5 | 1,06 | 1,0065 |
| 71 | 6f11 | 1,8 | 4,3 | 0,98 | 0,953 |
| 71 | 7h4 | 3,4 | 3,6 | 0,56 | 1,0045 |
| 71 | 4h3 | 3,1 | 3,1 | 0,42 | 1,0171 |
| 71 | 1h5 | 1,31 | 3,01 | 1,31 | 0,9421 |
| 71 | 5e4- | 5,4 | 2,3 | 0,35 | 0,994 |
| 71 | 5c1 | 2,2 | 2,3 | 0,89 | 0,9746 |
| 71 | 0h7 | 3,6 | 1,8 | 0,59 | 1,0197 |
| 71 | 6h9 | 23,7 | 1,71 | 0,91 | 1,0064 |
| 71 | 7e3- | 5,3 | 1,7 | 0,7 | 1,0028 |
| 71 | 5d4 | 11,1 | 1,48 | 0,35 | 1,0213 |
| 71 | 2e3- | 4 | 1,47 | 0,45 | 0,9654 |
| 71 | 6h11 | 17,7 | 1,15 | 2,8 | 1,0064 |
| 71 | 2e10- | 3 | 1,1 | 0,66 | 0,9588 |
| 71 | 2g2 | 4,4 | 1,01 | 0,44 | 1,0046 |
\vskip1.000000\baselineskip
El control es Luc71-5D4 a
60ºC
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 72 | 2g6 | 0,38 | 3,1 | 1,58 | 1,0052 |
| 72 | 5f12 | 0,81 | 1,53 | 1,02 | 0,9678 |
| 72 | 0d7 | 0,76 | 1,44 | 1,4 | 0,9838 |
| 72 | 5c12 | 0,87 | 1,43 | 1,04 | 0,9718 |
| 72 | 1e1- | 1,04 | 1,41 | 1,15 | 0,9956 |
| 72 | 5b12 | 0,83 | 1,41 | 1,02 | 0,9731 |
| 72 | 0b7 | 1,11 | 1,04 | 0,91 | 1,0049 |
| 72 | 3b4 | 0,49 | 1,03 | 2,2 | 0,9581 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 73 | 2h8 | 0,85 | 1,9 | 1,08 | 1,0123 |
| 73 | 4e6- | 0,95 | 1,76 | 0,94 | 0,9939 |
| 73 | 3g8 | 0,86 | 1,53 | 1,04 | 1 |
| 73 | 1g3 | 1,7 | 1,14 | 0,97 | 0,9921 |
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 74 | 2a9 | 0,96 | 1,77 | 0,86 | 0,999 |
| 74 | 4e10- | 0,8 | 1,36 | 1,33 | 0,09897 |
| 74 | 0d5 | 1,69 | 1,28 | 0,61 | 0,9927 |
| 74 | 6g7 | 1,75 | 1,07 | 1,33 | 1,0022 |
| 74 | 5d8 | 0,46 | 1,06 | 0,95 | 0,899 |
| 74 | 5e7- | 1,22 | 1,05 | 0,87 | 0,9977 |
| 74 | 6e1- | 1,19 | 1,02 | 0,96 | 0,999 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 76 | 6c3 | 2,3 | 6,4 | 1,2 | 0,9865 |
| 76 | 2a9 | 0,93 | 4,7 | 1,08 | 0,999 |
| 76 | 3h9 | 1,26 | 2,6 | 1,02 | 0,9973 |
| 76 | 0b10 | 1,52 | 2,4 | 1,4 | 0,992 |
| 76 | 0h9 | 1,71 | 1,44 | 1,05 | 1,018 |
| 76 | 2e9- | 0,44 | 1,15 | 1,2 | 0,9318 |
| 76 | 0e10- | 1,67 | 1,1 | 1,02 | 1,014 |
| 76 | 0c10 | 1,13 | 1,05 | 1 | 0,9974 |
| 76 | 3e8- | 1,35 | 1,03 | 1,1 | 0,9894 |
| 76 | 0d12 | 0,69 | 1 | 0,92 | 0,932 |
| 76 | 0f10 | 0,62 | 1 | 1,2 | 0,9478 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 78 | 1e1- | 0,54 | 8,9 | 1,15 | 0,9877 |
| 78 | 0h7 | 1,4 | 5 | 0,97 | 1,014 |
| 78 | 0a6 | 1 | 4,3 | 1,5 | 0,9967 |
| 78 | 0b10 | 1,93 | 2 | 1 | 0,9926 |
| 78 | 0f11 | 1,6 | 2 | 0,91 | 0,9905 |
| 78 | 3f1 | 2,4 | 1,7 | 1,09 | 0,9936 |
| 78 | 2b4 | 1,97 | 1,36 | 0,98 | 1,0094 |
| 78 | 5b3 | 3,2 | 1,19 | 1,03 | 0,9735 |
| 78 | 2g12 | 2,5 | 1,03 | 1 | 1,0134 |
| 78 | 0h2 | 1,6 | 1 | 1,15 | 1,0168 |
El control es Luc78-0B10 a
62ºC
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 82 | 2g12 | 0,9811 | 2,09 | 0,8851 | 0,9939 |
| 82 | 4b9 | 1,0845 | 1,8419 | 0,8439 | 1,0078 |
| 82 | 0d1 | 0,7622 | 1,5171 | 1,11 | 0,9998 |
| 82 | 3g1 | 0,8805 | 1,504 | 0,9629 | 0,9927 |
| 82 | 1d1 | 0,9741 | 1,4497 | 0,8936 | 0,9986 |
| 82 | 1e8- | 0,8206 | 1,4433 | 0,9876 | 0,9968 |
| 82 | 0h9 | 1,1355 | 1,3626 | 0,9171 | 1,0094 |
| 82 | 2c6 | 1,0931 | 1,3402 | 0,9482 | 1,0022 |
| 82 | 3g9 | 1,0364 | 1,251 | 0,968 | 1,0009 |
| 82 | 4h8 | 0,8816 | 1,1667 | 0,9165 | 1,0045 |
| 82 | 0a10 | 1,0535 | 1,1128 | 1,0413 | 1 |
| 82 | 4g1 | 1,4305 | 1,0862 | 1,1734 | 1,0059 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 84(121) | 6h7 | 0,3755 | 29,3639 | 2,3636 | 0,8905 |
| 84(121) | 2h9 | 0,4264 | 28,7958 | 1,819 | 0,904 |
| 84(121) | 3f7 | 0,4161 | 25,3058 | 1,8079 | 0,8988 |
| 84(121) | 2h10 | 0,9667 | 14,4658 | 0,8073 | 0,9947 |
| 84(121) | 3a2 | 0,3329 | 12,6 | 2,5444 | 0,855 |
| 84(121) | 3a6 | 1,2299 | 7,2384 | 0,7866 | 1,0046 |
| 84(121) | 5b12 | 1,0535 | 6,0315 | 0,7824 | 1,0056 |
| 84(121) | 5a7 | 1,0413 | 4,9054 | 0,8864 | 1,0071 |
| 84(121) | 3d2 | 0,2032 | 4,8 | 2,4623 | 0,7973 |
| 84(121) | 2a9 | 1,0847 | 4,7486 | 0,7746 | 1,0051 |
| 84(121) | 5e11- | 1,1918 | 4,0988 | 0,872 | 1,008 |
| 84(121) | 7h2 | 0,9115 | 3,9929 | 0,909 | 1,0077 |
| 84(121) | 3b5 | 1,2014 | 3,8251 | 0,7509 | 1,0086 |
| 84(121) | 1f8 | 1,07 | 3,06 | 0,8276 | 1,0093 |
| 84(121) | 2e2- | 1,4356 | 1,9315 | 0,7863 | 1,0175 |
El control es Luc84-3A6 a
64ºC
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 85(86) | 2a2 | 0,2266 | 12,9013 | 3,326 | 0,8705 |
| 85(86) | 4f12 | 1,1167 | 4,7851 | 0,7439 | 1,0092 |
| 85(86) | 4e9- | 1,0869 | 4,4953 | 0,8539 | 1,0068 |
| 85(86) | 1f11 | 0,6994 | 4,0976 | 0,842 | 1,0124 |
| 85(86) | 5a4 | 1,2273 | 4,09 | 0,9683 | 1,0098 |
| 85(86) | 3e10- | 0,8902 | 3,5342 | 0,8106 | 1,0069 |
| 85(86) | 3e12- | 1,0512 | 3,4883 | 0,583 | 1,0054 |
| 85(86) | 5e4- | 0,9562 | 3,3886 | 1,0328 | 1,0069 |
| 85(86) | 0e6- | 0,1494 | 3,0145 | 3,6293 | 0,8269 |
| 85(86) | 6b1 | 0,7615 | 2,5712 | 0,8695 | 1,0055 |
| 85(86) | 6h7 | 1,0285 | 2,5401 | 0,8963 | 1,0057 |
| 85(86) | 4b11 | 0,9816 | 2,3899 | 0,7927 | 1,0063 |
| 85(86) | 6d7 | 1,1087 | 2,0607 | 0,9042 | 1,0088 |
| 85(86) | 2e10- | 0,3028 | 2,0603 | 1,9649 | 0,8738 |
| 85(86) | 2a9 | 1,448 | 1,1819 | 0,9722 | 1,0046 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El control es Luc85-4F12 a
65ºC
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 88 | 3c1 | 1,4439 | 2,0938 | 0,9874 | 0,9976 |
| 88 | 6g1 | 1,0184 | 1,2665 | 1,2184 | 1,0019 |
| 88 | 3e4- | 1,331 | 1,0996 | 1,0669 | 0,9983 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 89 | 1a4 | 1,2565 | 2,4796 | 1,0338 | 0,997 |
| 89 | 3b1 | 0,7337 | 1,9976 | 0,9628 | 1,0001 |
| 89 | 2b12 | 1,0505 | 1,8496 | 1,0069 | 1,0012 |
| 89 | 0b5 | 1,5671 | 1,1362 | 1,0912 | 0,9995 |
| 89 | 1f1 | 1,378 | 1,1018 | 0,9804 | 0,996 |
| 89 | 2f1 | 1,4637 | 1,0894 | 0,9189 | 0,9992 |
| Experimento | Clon ID | Li | tau | Km | S |
| 90 | 0f1 | 1,4081 | 1,3632 | 1,027 | 0,9987 |
| 90 | 1b5 | 1,4743 | 1,1154 | 1,0812 | 1,0011 |
| 90 | 6g5 | 1,2756 | 1,0605 | 1,0462 | 1,0012 |
| 90 | 5e6- | 1,0556 | 1,0569 | 1,1037 | 1,0011 |
| 90 | 4e3- | 1,2934 | 1,0291 | 1,0733 | 1,0002 |
Para evaluar el impacto de la evolución dirigida
sobre la función enzimática, se purificaron y analizaron los clones
del principio, el centro y el final del procedimiento (Tabla 2). Los
clones seleccionados para este análisis fueron Luc[T249M],
Luc49-7C6, y Luc78-0B10. Otro clon,
Luc90-1B5, creado por una estrategia posterior de
mutagénesis dirigida por oligonucleótidos y exploración también se
purificó para el análisis.
| Temperatura | ||||
| ambiente * | 37ºC | 50ºC | 60ºC | |
| Luc[T249M] | 110 | 0,59 | 0,01 | |
| Luc49-7C6 | 430 | 68 | 31 | 6,3 |
| Luc78-0B10 | 3000 | 220 | 47 | 15 |
| * aproximadamente 25ºC |
El efecto de la evolución dirigida sobre la
termoestabilidad fue drástico. A altas temperaturas, a las que el
clon parental se inactivó casi instantáneamente, las enzimas
mutantes de los clones relacionados mostraron termoestabilidad
durante varias horas (véase también Tabla 1 y Figuras
1-3, 5-8, 11, 13,
50-52 y 60). Incluso a temperatura ambiente, estos
mutantes son varias veces más termoestables que la enzima parental
(véase también Figuras 4, 9-10, 12, 53 y 62). El
análisis posterior de Luc90-1B5 mostró que esta
enzima es incluso más termoestable, teniendo una
semi-vida de 27 horas a 65ºC cuando se ensaya en las
mismas condiciones de tampón (Figura 16A). Con alguna optimización
de las condiciones tamponantes, esta enzima mostró muy poca perdida
de actividad a 65ºC durante varias horas (tampón citrato a pH 6,5;
Figura 16A). Esta luciferasa fue estable a 22ºC durante varias
semanas cuando se incubó a pH 6,5 (Figura 16A). En tiempos por
encima de 100 días a 4ºC, las enzimas mutantes tuvieron
termoestabilidad aumentada. A tiempos de menos de 15 días a 4ºC, las
termoestabilidades de los mutantes Luc49-7C6 y
Luc78-0B10 no fueron distinguibles de la enzima
parental (Figura 49).
Kajiyama y Nakamo (1993) demostraron que una
sustitución de un único aminoácido de A en la posición 217; a I, L,
o V, en la luciferasa de luciérnaga de Luciola lateralis,
provoca una luciferasa que tiene termoestabilidad aumentada. La
sustitución con leucina produjo una luciferasa que mantuvo un 70% de
su actividad después de incubación durante 1 hora a 50ºC. Todas las
enzimas de la presente invención creadas a través de evolución
dirigida, son mucho más estables que este mutante de L.
lateralis. Un mutante anterior, Luc90-1B5,
mantiene el 75% de la actividad después de incubación durante 120
horas (5 días) en condiciones similares (50ºC, 25 mol/l de citrato
pH 6,5, 150 mmol/l de NaCl, 1 mg/ml de BSA, 0,1 mmol/l de EDTA,
glicerol al 5%). Es interesante observar que, la LucPpe2
presentada por Leach y col. ya contiene isolucina en la posición
homologa descrita para el mutante L. lateralis.
Aunque la termoestabilidad fue la característica
de interés, los clones se seleccionaron en base a otros parámetros
enzimológicos en las exploraciones. Seleccionando clones que tienen
mayor expresión de luminiscencia, se descubrieron mutantes que
produjeron mayor intensidad de luminiscencia en colonias de E.
coli. Sin embargo, el procedimiento mostró poca capacidad de
alterar el perfil cinético de luminiscencia por las enzimas. Este
fallo sugiere que la capacidad de mantener la luminiscencia en
estado estacionario está integrado en el mecanismo catalítico, y no
se influye fácilmente por un efecto acumulativo de muchos
aminoácidos.
La unión del sustrato se exploró midiendo una
K_{m} de compuesto aparente (véase Ejemplo 2) para luciferina y
ATP. Aunque la K_{m} de compuesto aparente permaneció
relativamente constante, un análisis posterior mostró que las
K_{m} individuales cambiaban sistemáticamente. La K_{m} para
luciferina aumentó mientras que la K_{m} para ATP disminuyó (Tabla
3). La razón de este cambio es desconocida, aunque puede especularse
que una liberación más eficaz de inhibidores de oxiluciferina o
luciferina podría conducir a un cambio enzimático más rápido.
Cada mutación puntual, por sí misma, aumenta (a
un grado mayor o menor) la termoestabilidad de la enzima mutante con
relación a la luciferasa de tipo silvestre. El efecto acumulativo de
combinar mutaciones puntuales individuales produce luciferasas
mutantes cuya termoestabilidad se aumenta enormemente a partir de la
de tipo silvestre, a menudo en el orden de una magnitud o más.
| K_{m}-luciferina | K_{m}-ATP | ||
| Luc[T249M] | 0,32 \muM | 18 \muM | |
| Luc49-7C6 | 0,99 \muM | 14 \muM | |
| Luc78-0B10 | 1,6 \muM | 3,4 \muM | |
| Luc90-1B5 | 2,2 \muM | 3,0 \muM |
Ejemplo 1
anterior
Una estrategia de mutagénesis ilustrativa es la
siguiente: A partir del "mejor" clon de luciferasa tipo
silvestre, que es un clon con termoestabilidad aumentada y valores
disminuidos no apreciables para otros parámetros, se realizó
mutagénesis aleatoria por tres variaciones de PCR propensa a
errores. De cada ciclo de mutagénesis aleatoria, se seleccionaron 18
de los mejores clones. Se preparo el ADN a partir de estos clones
produciendo un total de 54 clones. Estos clones representan nueva
diversidad genética.
Estos 54 clones se combinaron y se realizó
mutagénesis de precombinación. Los 18 mejores clones de esta
población se seleccionaron.
Estos 18 clones se combinaron con los 18 clones
de la población previa y se realizo mutagénesis de recombinación. A
partir de esta exploración, se seleccionó una nueva población de
luciferasa de 18 clones que representan 6 grupos de propiedades
funcionales. En esta exploración, las nuevas mutaciones de los 54
clones seleccionados en sus configuraciones de secuencia original o
en recombinantes de los mismos se exploraron una segunda vez. Cada
mutación se analizó aproximadamente 10 veces de media. De los 90
clones usados en la mutagénesis de recombinación, fue probable que
al menos 10 fueran funcionalmente equivalentes al mejor clon. Por
tanto, el mejor clon o recombinantes del mismo deben explorarse al
menos 100 veces. Como esto fue superior al numero de clones usados
en la recombinación, hubo una probabilidad significativa de
encontrar recombinación productiva del mejor clon con otros
clones.
Las transferencias de calor se controlaron en el
procedimiento con robot usando aluminio grueso en muchas posiciones
en las que se colocaron placas de 98 pocillos por el brazo robótico.
Por ejemplo, todos los compartimientos de las incubadoras o
refrigeradores se construyeron de aluminio de 0,64 cm (1/4
pulgadas). Una posición en particular, localizada a temperatura
ambiente, se construyo a partir de un bloque de aluminio de
dimensiones 11,43 x 17,78 x 16,51 cm (4,5 x 7 x 6,5 pulgadas).
Cuando se movió cualquier placa de 96 pocillos a alta temperatura
(por ejemplo, incubadoras) o baja temperatura (por ejemplo,
refrigerador) a un dispositivo a temperatura ambiente, primero se
colocó en el gran bloque de aluminio para equilibrar la temperatura.
Por este medio, la placa completa podía alcanzar rápidamente la
nueva temperatura, minimizando de este modo la evaporación desigual
para los diversos pocillos en la placa debido a diferencias de
temperatura. Las transferencias de calor en una pila de placas de 96
pocillos colocada en una incubadora (por ejemplo, para crecimiento
durante una noche de E. coli) se controlaron colocando hojas
de 1 mm de grosor de aluminio entre las placas. Esto permitió una
transferencia de calor más eficaz de los extremos de la pila al
centro. La mezcla en los procesos robóticos se controlaron teniendo
la placa colocada en un agitador durante varios segundos después de
cada adición de reactivo.
Hágase referencia a la Figura 14 para un esquema
del orden en el que las placas se analizan y a la Figura 15 para un
aparato robótico que puede programarse para realizar las siguientes
funciones:
Un placa con tapa (Falcon 3075) que contiene
células (JM109 de E. coli) se coloca en un agitador y se
mezcla durante 3-5 minutos.
Una placa (con tapa) se obtiene de un carrusel y
se coloca en el dispensador del reactivo. Se añaden 180 \mul de
medios (medios mínimos M9) después de retirar la tapa y colocarla en
el indicador cerca del pipeteador. La placa después se coloca en el
pipeteador.
\newpage
La placa en el agitador se coloca en el
pipeteador, y la tapa se retira y se coloca en el indicador. Las
células se transfieren a la nueva placa usando un procedimiento de
pipeteo (véase "Dilution of Cells into Cell Plate").
Las tapas se vuelven a colocar en ambas placas.
La nueva placa se coloca en el refrigerador y la placa antigua se
devuelve al carrusel.
Una placa que contiene células se retira del
carrusel y se coloca en el agitador durante 3-5
minutos para mezclar completamente las células. Las células tienden
a asentarse de la solución después de reposo.
Para medir la Densidad Óptica (D.O.), la placa se
retira del agitador al indicador cerca del luminómetro; la tapa se
retira y la placa se coloca en el luminómetro. La D.O. se mide
usando un filtro de 620 nm.
Cuando se finaliza, la placa después se coloca en
el refrigerador para su almacenamiento.
Las etapas anteriores se completan para todas las
placas antes de proceder con el siguiente procesamiento.
Para preparar un lisado celular, la placa de
células primero se retira del refrigerador y se mezcla en el
agitador para resuspender las células. Una nueva placa del carrusel
sin la tapa se coloca en el dispensador de reactivo y se añaden 20
ml de tampón a cada pocillo. Esto se coloca en la estación de
pipeteo.
La placa de células en el agitador se coloca en
la estación de pipeteo. Se prepara una placa hija usando
procedimiento de pipeteo (véase "Pipetting Cells into the Lysis
Plate") para preparar una placa hija de células.
Después del pipeteo, la nueva placa hija se
coloca en el agitador para su mezcla.
Después de mezclar, la placa de lisado se coloca
en una estación de congelación con CO_{2} sólido para congelar las
muestras. La placa después se retira al bloque de descongelación
para descongelar durante 10 minutos.
La placa después se mueve al dispensador de
reactivo para añadir 175 \mul de tampón B, y después se mezcla en
el agitador durante aproximadamente 15 minutos o mas. La combinación
de la congelación/descongelación y tampón B provocara que las
células se lisen.
Se usa una nueva placa con una tapa del carrusel
para preparar la placa de dilución a partir de la cual derivaran
todos los ensayos. La placa se coloca en el dispensador de reactivo
y se retira la tapa al indicador cerca del pipeteador. Se añaden 285
\mul de tampón C a cada pocillo con el dispensador de reactivo,
después la placa se coloca en la estación de pipeteo.
La Placa de Lisado en el agitador se retira a la
estación de pipeteo y se usa procedimiento de pipeteo (véase
"Dilution from Lysis Plate to Incubation Plate"). Después del
pipeteo, la nueva placa hija se coloca en el agitador para su
mezcla. La placa de lisado se desecha.
Se obtienen dos placas de ensayo blancas
(Labsystems Nº 9502887) del alimentador de placas y se colocan en el
pipeteador. La placa de incubación del agitador se coloca en el
pipeteador y la tapa se retira y se coloca en el indicador cercano.
Se producen dos placas hijas usando el procedimiento de pipeteo
(véase "Create Pair of Daughter Plates from Incubation Plate").
Después de esto, la tapa se reemplaza en la placa parental, y la
placa se coloca en una incubadora de alta temperatura. [que varía de
31ºC a aproximadamente 65ºC dependiendo del clon].
Se coloca una placa hija en el luminómetro y se
usa el procedimiento de ensayo 1X. Después del ensayo, la placa se
coloca en el incubador a temperatura ambiente, y la segunda placa
hija se coloca en el luminómetro. Para la segunda placa, se usa el
procedimiento de ensayo 0,02X. Esta placa se desecha, y la primera
placa se devuelve de la incubadora al luminómetro. Se usa el
procedimiento de ensayo repetido (es decir, no se inyecta reactivo).
Después de esto, la placa se devuelve otra vez a la incubadora a
temperatura ambiente.
Las anteriores etapas se completan para todas las
placas antes de proceder con el procesamiento.
Para comenzar el segundo conjunto de medidas, la
placa de la incubadora a alta temperatura se coloca en el agitador
para mezclarse.
La placa de la incubadora a temperatura ambiente
se devuelve al luminómetro y se usa otra vez el procedimiento de
ensayo repetido. La placa se devuelve después de esto a la
incubadora a temperatura ambiente.
Se obtienen otra vez dos placas de ensayo blancas
del alimentador de placas y se colocan en el pipeteador. La placa
del agitador se coloca en el pipeteador, y la tapa se retira y se
coloca en el indicador cercano. Se producen otra vez dos placas
hijas usando el procedimiento de pipeteo (véase "Create Pair of
Daughter Plates from Incubation Plate"). Después de esto, la tapa
se reemplaza en la placa parental, y la placa se devuelve a la
incubadora de alta temperatura.
Una placa hija se coloca en el luminómetro y se
usa otra vez el procedimiento de ensayo 1X. La placa se desecha
después del ensayo. La segunda placa hija después se coloca en el
luminómetro y se usa el procedimiento de ensayo 0,06X. Esta placa
también se desecha.
Las anteriores etapas se completan para todas las
placas antes de proceder con el procesamiento.
En el conjunto final de medidas, la placa de la
incubadora a alta temperatura se coloca otra vez en el agitador para
su mezcla.
La placa en la incubadora a temperatura ambiente
se devuelve al luminómetro y se usa otra vez el procedimiento de
ensayo repetido. La placa se desecha después de esto.
Se toma una placa de ensayo blanca del
alimentador de placas y se coloca en el pipeteador. La placa del
agitador se coloca en el pipeteador, y la tapa se retira y se coloca
en el localizador cercano. Se produce una placa hija usando el
procedimiento de pipeteo (véase "Create Single Daughter Plate from
Incubation Plate"). La tapa se reemplaza en la placa parental y
la placa se desecha.
La placa hija se coloca en el luminómetro y se
usa el procedimiento de ensayo 1X. La placa se desecha después del
ensayo.
Tampón A: K_{2}HPO_{2} 325 mM; CDTA
6,5 mM; Triton X-100 al 0,1%
Tampón B: CCLR 1X (Promega E153A); 1,25
mg/ml de lisozima; gelatina al 0,04%
Tampón C: HEPES 10 mM; NaCl 150 mM; 1
mg/ml de BSA; glicerol al 5%; EDTA 0,1 mM
Reactivo de ensayo 1X: luciferina 5
\muM; ATP 175 \muM; Tricina 20 mM, pH 8,0; EDTA 0,1 mM.
Reactivo de Ensayo 0,02X: Dilución 1:50 de
reactivo de Ensayo 1X
Reactivo de Ensayo 0,06X: Dilución 1:16,7
de reactivo de Ensayo 1X
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento no aséptico usando puntas
fijadas
En el bloque pipeteador:
- se coloca una placa que contiene
aproximadamente 200 \mul de células JM109 por pocillo sin tapa
- Placa de Lisado que contiene 20 \mul de
tampón A
Procedimiento:
1. Se mueven las puntas a la estación de lavado y
se lavan con 1 ml.
2. Se mueve la placa celular y se retiran 60
\mul.
3. Se mueve la Placa de Lisado y se dispensan 45
\mul.
4. Se repiten las etapas 1-3 para
las 96 muestras.
5. Al final del procedimiento, se repite la etapa
1 para lavar las puntas.
Después del procedimiento:
- Se coloca la Placa de Lisado en el
agitador.
- Se coloca la tapa en la placa con células y se
coloca en el carrusel.
- Se coloca la Placa de Lisado en el congelador
de CO_{2}.
En el bloque pipeteador:
- Placa de Lisado que contiene 240 \mul de
lisado
- Placa de Incubación sin tapa que contiene 285
\mul de tampón C
Procedimientos:
1. Se mueven las puntas a la estación de lavado y
se lavan con 0,5 ml.
2. Se mueve a la Placa de Lisado y se retiran 30
\mul.
3. Se mueve a la Placa de Incubación y se
dispensan 15 \mul por contacto directo con la solución tampón.
4. Se repiten las etapas 1-3 para
las 96 muestras.
5. Al final del procedimiento, se repite la etapa
1 para lavar las puntas.
Después del procedimiento:
- Se coloca la Placa de Incubación en el
agitador.
- Se desecha la Placa de Lisado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este procedimiento se hace dos veces
En el bloque pipeteador:
- Placa de Incubación que contiene
100-300 \mul de solución sin tapa
- Dos Placas de Ensayo vacías (blanca)
Procedimientos:
1. Se mueven las puntas a la estación de lavado y
se lavan con 0,5 ml.
2. Se mueve a la Placa de Incubación y se extraen
50 \mul.
3. Se mueve a la primera Placa de ensayo y se
dispensan 20 \mul.
4. Se mueve a la segunda Placa de Ensayo y se
dispensan 20 \mul.
5. Se repiten las etapas 1-4 para
las 96 muestras.
6. Al final del procedimiento, se repite la etapa
1 para lavar las puntas.
Después del procedimiento:
1. Se vuelve a colocar la tapa en la Placa de
Incubación.
2. Se coloca la Placa de Incubación en la
incubadora.
3. Se coloca la primera Placa de Ensayo en el
luminómetro.
4. Se coloca la segunda Placa de Ensayo en el
carrusel.
\newpage
En el bloque de pipeteo:
- Se coloca la Placa de Incubación que contiene
100-300 \mul de solución sin tapa y
- Placa de Ensayo vacía (blanca)
Procedimiento:
1. Se mueven las puntas a la estación de lavado y
se lavan con 0,5 ml.
2. Se mueve a la Placa de Incubación y se extraen
40 \mul.
3. Se mueve a la Placa de Ensayo y se dispensan
20 \mul.
4. Se repiten las etapas 1-3 para
las 96 muestras.
5. Al final del procedimiento, se repite la etapa
1 para lavar las puntas.
Después del procedimiento:
- Se desecha la Placa de Incubación y la tapa de
la Placa de Incubación.
- Se coloca la Placa de Ensayo en el
luminómetro.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento aséptico usando puntas fijadas
En el bloque de pipeteo:
- placa que contiene aproximadamente 200 \mul
de células sin tapa
- nueva placa celular que contiene 180 \mul de
Medio de Crecimiento sin tapa
Procedimiento:
1. Se mueve a la placa celular y se extraen 45
\mul.
2. Se mueve a la Placa Celular y se dispensan 20
\mul de volumen por transferencia líquido a líquido directa.
3. Se mueve a la reserva de desechos y se
expulsan las células en exceso.
4. Se mueve a la estación de lavado con
isopropanol que aspira isopropanol para esterilizar las puntas.
5. Se mueve a la estación de lavado, expulsa el
isopropanol y se lavan las puntas.
6. Se repiten las etapas 1-4 para
las 96 muestras.
Después del procedimiento:
- Se reemplaza la tapa de la placa original de
células y se coloca en el carrusel.
- Se reemplaza la tapa de la nueva placa celular
y se coloca en el refrigerador.
\vskip1.000000\baselineskip
Notas
Este procedimiento se usa para preparar las
placas celulares usadas en el procedimiento de análisis principal.
Se añaden 180 \mul de medio de crecimiento mínimo M9 por el
dispensador de reactivo a cada una de las placas celulares nuevas
justo antes de iniciar el procedimiento de pipeteo. El dispensador
se lava abundantemente con isopropanol al 75% antes de imprimarlo
con medio. El medio también contiene antibióticos selectivos para
reducir la contaminación potencial.
- 1.
- Se coloca la placa en el luminómetro.
- 2.
- Se inyectan 100 ml de reactivo de Ensayo 1X.
- 3.
- Se mide la luminiscencia durante 1 a 3 segundos.
- 4.
- Se repite para el siguiente pocillo.
- 5.
- Se continúa hasta que se hayan medido todos los pocillos.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Se coloca la placa en el luminómetro.
- 2.
- Se inyectan 100 \mul de reactivo de Ensayo 0,02X.
- 3.
- Se mide la luminiscencia durante 1 a 3 segundos.
- 4.
- Se repite para el siguiente pocillo.
- 5.
- Se continúa hasta que se hayan medido todos los pocillos.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Se coloca la placa en el luminómetro.
- 2.
- Se inyectan 100 \mul de reactivo de Ensayo 0,06X.
- 3.
- Se mide la luminiscencia durante 1 a 3 segundos.
- 4.
- Se repite para el siguiente pocillo.
- 5.
- Se continúa hasta medir todos los pocillos.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Se coloca la placa en el luminómetro.
- 2.
- Se mide la luminiscencia durante 1 a 3 segundos.
- 3.
- Se repite para el siguiente pocillo.
- 4.
- Se continúa hasta medir todos los pocillos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se exploran de cinco a siete placas de
nitrocelulosa que tienen 200-500 colonias por placa
(1000-3500 colonias totales) por 2 microplacas (176
clones) (Wood y Peluca, 1987). Los clones se exploran a altas
temperaturas usando condiciones de exploración convencionales.
Se reservan ocho posiciones en cada microplaca de
un clon de referencia usando la "mejor" luciferasa (el clon
parental para mutagénesis aleatoria y mutagénesis de codón). Las
posiciones de los pocillos reservados se muestran como "X" a
continuación.
Los clones de referencia se producen colocando
colonias de ADN transformado del clon parental en los pocillos de
referencia. Para identificar estos pocillos antes de la inoculación
de la microplaca, los pocillos se marcan con un bolígrafo de marcaje
negro en la parte inferior de cada pocillo.
Los siguientes criterios se usaron para
propósitos de exploración. La temperatura elegida para el parámetro
de estabilidad enzimática fue tal que la enzima parental se
disminuiría de 100 a 1000 veces en 10 horas (véase Tabla 1). El
criterio 1 se consigue manualmente; los datos para los criterios
2-6 se generan por análisis robótico. Para todos los
criterios, se selecciona el valor máximo según se describe.
1. Exploración in vivo . Se
seleccionan los clones más brillantes a una temperatura dada.
2. Expresión-actividad
específica. El valor para luminiscencia normalizada se calcula
como la proporción de luminiscencia a densidad óptica. El valor se
presenta como la proporción con el valor de referencia.
3. Estabilidad enzimática. Las medidas de
luminiscencia normalizada de las muestras incubadas (3 tomadas en
aproximadamente 15 horas) se ajustan a ln(L)=ln
(L_{0})-(t/\tau), donde L es luminiscencia normalizada y t es el
tiempo. \tau es una medida de la estabilidad enzimática. El valor
se presenta como la proporción con el valor de referencia, y se
calculan los coeficientes de correlación.
4. Unión de sustrato. Las medidas de
luminiscencia normalizada con 1X y 0,02X se toman en el ajuste de
lectura inicial, y 1X y 0,06X se toman en el ajuste a las 5 horas.
La proporción de 0,02X:1X y 0,06X:1X da la luminiscencia relativa a
concentraciones 0,02X y 0,06X. Estos valores, junto con la
luminiscencia relativa a 1X (es decir, 1), se ajustan a la
representación de Lineweaver-Burk para producir la
Km:ap,total para los sustratos ATP, luciferina, y CoA. Los valores
se presentan como la proporción inversa con el valor de referencia,
y se calculan los coeficientes de correlación.
5. Estabilidad de la señal. La
luminiscencia de las reacciones luminiscentes 1X iniciales se
vuelven a medir 3 veces adicionales durante aproximadamente 15
horas. Estos valores se ajustan a ln(L)=ln
(L_{0})-(t/\tau) y se calcula la integral sobre t (15 horas).
Después se calcula la estabilidad de la señal como
S=(-int(L)/L_{0}t)^{2}. Los valores se presentan
como la proporción inversa con el valor de referencia, y se calculan
los coeficientes de correlación.
6. Estado físico del compuesto. Se
combinan los valores de los criterios 2 a 5 en un único valor de
estado físico del compuesto (o utilidad comercial). Este valor se
basa en el juicio de la importancia relativa de los otros criterios.
Este juicio se da a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
| Criterios | Valor relativo |
| Estabilidad enzimática | 5 |
| Estabilidad de la señal | 2 |
| Unión de sustrato | 2 |
| Expresión/actividad | 1 |
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto, C=Suma (criterios
2-5 pesados por valor relativo, por ejemplo, se da
mayor peso a la estabilidad porque esta fue un objetivo
principal).
\newpage
Ejemplo 2
anterior
Cada archivo creado por un luminómetro (96
pocillos, Anthos, Austria) representa los datos de una microplaca.
Estos archivos se almacenan en el ordenador que controla el
luminómetro, y se conecta al ordenador de base de datos por un
enlace de red de trabajo. Para cada microplaca de muestras, se leen
nueve microplacas por el luminómetro (la microplaca original para
densidad óptica y ocho microplacas hijas para luminiscencia).
Se crean noventa archivos en total; manteniendo
cada uno conjuntos de datos para 96 muestras. Cada conjunto de datos
contiene el número de muestra, el tiempo de cada medida con relación
a la primera medida de la placa, la lectura del luminómetro, y la
lectura de luminómetro corregida de fondo. También se da otra
información de encabezamiento de archivo. El tiempo que se lee cada
microplaca también es necesario para el análisis. Esto puede
obtenerse del robot o el tiempo de creación del archivo. Se usa un
convenio de nombramiento para los archivos por el robot durante la
creación de archivos que puede reconocerse por SQL (por ejemplo,
YYMMDDPR.DAT donde YY es el año, MM es el mes, DD es el día, P es la
placa inicial [0-9], y R es la lectura
[0-8]).
Normalización de datos de luminiscencia:
Para cada medida de luminiscencia en las ocho placas hijas, se
calcula la luminiscencia normalizada dividiendo las unidades de luz
relativas por la densidad óptica de la placa original. Si cualquier
valor de luminiscencia normalizada es de menos de cero, se asigna el
valor de 0,1 sL donde sL es la desviación típica para medidas de
luminiscencia normalizada.
Cálculo del tiempo de medida relativo:
Para cada medida de luminiscencia normalizada, el tiempo de la
medida se calcula con relación a la primera medida de la muestra.
Por ejemplo, los tiempos de todas las medidas de luminiscencia de la
muestra B6 en la placa 7 (es decir, 7:B06) se calculan con relación
a la primera lectura de 7:B06. Este cálculo del tiempo implica tanto
el tiempo durante el que se lee la placa como el tiempo relativo
durante el que se lee la muestra en la placa.
Cálculo de la estabilidad enzimática
(\tau): Para cada muestra, se usa regresión lineal para ajustar
ln(L_{1x})=ln(L_{0})-(t/\tau) usando las tres
medidas de luminiscencia con concentraciones de sustrato 1X (placas
1, 5, 8). También se calcula el coeficiente de regresión.
Cálculo de la unión de sustrato
(K_{m:ap,total}): Usando microplacas del primer conjunto de
lecturas (placas 1 y 2), se calcula el L_{0,2x,rel} dividiendo las
medidas producidas con concentraciones de sustrato de 0,02X por las
de 1X. De manera similar se calcula el L_{0,06x,rel} usando
microplacas del segundo conjunto de lecturas (placas 5 y 6),
dividiendo las medidas producidas con concentraciones de sustrato de
0,06X por las de 1X.
Para cada muestra, se usa regresión lineal para
ajustar 1/L=(K _{m:ap,total}/L_{max:ap}) (1/[S] +
(1/L_{max:ap}) usando
| L | [S] |
| L_{0,2x,rel} | 0,02 |
| L_{0,06x,rel} | 0,06 |
| 1(L_{ix,rel}) | 1 |
K_{m:ap,total} se calcula como la
pendiente/corte. También se calcula el coeficiente de regresión.
Cálculo de la estabilidad de señal
(S): Para cada muestra, se usa regresión lineal para ajustar
ln(L)=ln(L_{0})-(t/\tau) usando las cuatro medidas
de luminiscencia de la microplaca inicial con concentraciones de
sustrato 1X (Placas 1, 3, 4, y 7). También se calcula el coeficiente
de regresión. A partir de los valores calculados de \tau y
L_{0}, se calcula la integral de la luminiscencia por
int(L)=\tauL_{0}(1-exp(-t/\tau)),
donde t_{f} es el tiempo medio de la última medida (por ejemplo,
15 horas). La estabilidad de señal se calcula como
S=(1-int(L)/L_{i}t_{f})^{2},
donde L_{i} es la medida inicial de luminiscencia normalizada con
concentración de sustrato 1x (Placa 1).
[Nota: Para corregir la evaporación, puede usarse
una ecuación
S=(1+K-int(L)/L_{i}t_{f})^{2},
donde 1/K=2 (cambio relativo de volumen líquido a t_{f})].
Cálculo de las superficies de valor de
referencia: Puede definirse un sistema de coordenadas de tres
dimensiones usando las posiciones de rejilla de las muestras en una
microplaca como coordenadas horizontales, y los valores calculados
para las muestras (L_{i,}\tau, K_{m:ap,total}, o S) como las
coordenadas verticales. Este sistema de tres dimensiones se menciona
como "mapa de placa". Puede determinarse una superficie lisa en
los mapas de placas que representan un nivel de referencia por
ajuste de mínimos cuadrados de los valores determinados para los 8
clones de referencia en cada microplaca. Para cada una de las 10
microplacas iniciales de muestras, se determinan superficies de
referencia respectivas para los parámetros de los criterios L_{i},
t K_{m:ap,total} y S (40 superficies totales).
En el ajuste de mínimos cuadrados, las
coordenadas verticales (es decir, los parámetros de los criterios)
son las variables dependientes, las coordenadas horizontales son las
variables independientes. Se ajusta una superficie de primer orden
(es decir, z=ax+by+c) a los valores de los clones de referencia.
Después de calcular la superficie, se calculan los restos para cada
clon de referencia. Si cualquiera de estos restos está fuera de un
intervalo de límite dado, la superficie de referencia se vuelve a
calcular con la omisión del clon de referencia aberrante.
Si una superficie de primer orden no representa
de manera suficiente los valores de los clones de referencia, se usa
una superficie de segundo orden restringida (es decir,
z=a(x_{2}+ky_{2})+bx+cy+d, donde k es una constante).
Cálculo de los valores normalizados de
referencia: Para los parámetros de los criterios de cada
muestra, se determina un valor normalizado de referencia calculando
la proporción o proporción inversa con el valor de referencia
respectivo. Los valores normalizados de referencia son
L_{i}/L_{ir}, \tau/\tau_{m}, K_{mr}/K_{m:ap:total}, y
S_{r} /S, donde los valores de referencia se calculan a partir de
las ecuaciones de la superficie de referencia apropiada.
Cálculo de los valores de compuesto: Para
cada muestra, se calcula C=5(\tau/\tau_{\tau}
)+2(S_{r}/S)+2(K_{mr}/K_{m:ap:total})+(L_{i}/L_{ir}).
Determinación de subagrupaciones: para los
parámetros de los criterios L_{i}, \tau, K_{m:ap:total}, S, y
C, se definen valores delimitantes (es decir, tamaños de
recipientes) para subagrupaciones como gL, g\tau, gKm, gS, y gC.
Comenzando con los valores más altos para L_{i}, \tau, o C, o
los valores más bajos de K_{m:ap:total} o S, las muestras se
asignan a recipientes para cada parámetro de los criterios (siendo
el primer recipiente el Nº 1, etc).
Presentación de una tabla clasificada de
valores normalizados de referencia: se presenta una tabla de
datos para cada muestra que muestra en cada casilla los siguientes
datos:
- -
- número de la identificación de la muestra (por ejemplo, 7:B06)
- -
- valor del compuesto (C)
- -
- estabilidad enzimática normalizada de referencia (\tau/\tau_{r})
- -
- coeficiente de correlación para la estabilidad enzimática
- -
- número de recipiente para estabilidad enzimática
- -
- estabilidad de señal normalizada de referencia (S_{r}/S)
- -
- coeficiente de correlación para la estabilidad de señal
- -
- número del recipiente para estabilidad de señal
- -
- unión de sustrato normalizado de referencia (K_{mr}/K_{m:ap:total})
- -
- coeficiente de correlación para la unión de sustrato
- -
- número de recipiente para unión de sustrato
- -
- expresión/actividad específica normalizada de referencia (L_{i}/L_{ir})
- -
- número de recipiente para expresión/actividad específica
La tabla se clasifica por el valor de compuesto
(C).
Se presenta una tabla de datos para cada muestra
que muestra en cada casilla los siguientes datos:
- -
- número de identificación de la muestra
- -
- valor del compuesto (C)
- -
- estabilidad enzimática (\tau)
- -
- coeficiente de correlación para estabilidad enzimática
- -
- número de recipiente para estabilidad enzimática
- -
- estabilidad de señal (S)
- -
- coeficiente de correlación para estabilidad de señal
- -
- número de recipiente para estabilidad de señal
- -
- unión de sustrato (K_{m:ap:total})
- -
- coeficiente de correlación para unión de sustrato
- -
- número de recipiente para unión de sustrato
- -
- expresión/actividad específica (L_{i})
- -
- número de recipiente para expresión/actividad específica.
La tabla se clasifica por el valor de compuesto
(C); los clones de referencia se excluyen de la tabla. El mismo
código de entrada por desviación típica como se ha descrito
anteriormente.
Este es el mismo procedimiento que la etapa final
del procedimiento de reducción de datos. La tabla mostrará:
- -
- número de identificación de la muestra
- -
- valor de compuesto (C)
- -
- estabilidad enzimática normalizada de referencia (\tau/\tau_{r})
- -
- coeficiente de correlación para estabilidad enzimática
- -
- número de recipiente para estabilidad enzimática
- -
- estabilidad de señal normalizada de referencia (S_{r}/S)
- -
- coeficiente de correlación para estabilidad de señal
- -
- número de recipiente para estabilidad de señal
- -
- unión de sustrato normalizada de referencia(K_{mr}/K_{m:ap:total})
- -
- coeficiente de correlación para unión de sustrato
- -
- número de recipiente para unión de sustrato
- -
- expresión/actividad específica normalizada de referencia (L_{i}/ L_{ir})
- -
- número de recipiente para expresión/ actividad específica.
La tabla se clasifica por el valor de compuesto
(C); los clones de referencia se excluyen de la tabla. Los mismos
códigos de entrada por desviación típica como se ha descrito
anteriormente.
Este es el mismo procedimiento que el descrito
anteriormente para los parámetros de criterio, excepto para clones
de referencia solo. La tabla mostrará:
- -
- número de identificación de la muestra
- -
- valor del compuesto (C)
- -
- estabilidad enzimática (\tau)
- -
- coeficiente de correlación para estabilidad enzimática
- -
- número de recipiente para estabilidad enzimática
- -
- estabilidad de señal (S)
- -
- coeficiente de correlación para estabilidad de señal
- -
- número de recipiente para estabilidad de señal
- -
- unión de sustrato (K_{m:ap:total})
- -
- coeficiente de correlación para unión de sustrato
- -
- número de recipiente para unión de sustrato
- -
- expresión/actividad de específica (L_{i})
- -
- número de recipiente para expresión/actividad específica.
La tabla se clasifica por el valor de compuesto
(C). Mismo código de entrada por desviación típica como se ha
descrito anteriormente.
Este es el mismo procedimiento que el descrito
anteriormente para valores normalizados de referencia, excepto que
es sólo para clones de referencia. La tabla mostrará:
- -
- número de identificación de muestras
- -
- valor de compuesto (C)
- -
- estabilidad enzimática normalizada de referencia (\tau/\tau_{r})
- -
- coeficiente de correlación para estabilidad enzimática
- -
- número de recipiente para estabilidad enzimática
- -
- estabilidad de señal normalizada de referencia (S_{r}/S)
- -
- coeficiente de correlación para estabilidad de señal
- -
- número de recipiente para estabilidad de señal
- -
- unión de sustrato normalizada de referencia (K_{mr}/K_{m:ap:total})
- -
- coeficiente de correlación para unión de sustrato
- -
- número de recipiente para unión en sustrato
- -
- expresión/actividad específica normalizada de referencia (L_{i}/L_{ir})
- -
- número de recipiente para expresión/actividad específica
La tabla se clasifica por el valor de compuesto
(C). El mismo código de entrada por desviación típica como se ha
descrito anteriormente.
Cualquier tabla puede clasificarse por cualquier
entrada como clave primaria y secundaria.
Para cualquier tabla, puede presentarse un
histograma de parámetros de criterios frente al número de recipiente
por cualquier parámetro de criterio.
Para cualquier placa, puede presentarse un mapa
de placa que muestra una elección de:
- -
- cualquier medida de luminiscencia o densidad óptica
- -
- L_{i}
- -
- superficie de referencia L_{i}
- -
- L_{i}/L_{ir}
- -
- \tau
- -
- superficie de referencia \tau
- -
- \tau/\tau
- -
- coeficiente de correlación de \tau
- -
- S
- -
- superficie de referencia S
- -
- S_{r}/S
- -
- coeficiente de correlación de S
- -
- K_{m:ap:total}
- -
- superficie de referencia K_{m}
- -
- K_{mr}/K_{m:ap:total}
- -
- coeficiente de correlación para K_{m:ap:total}
- -
- Valor de compuesto (C)
Los mapas de placas se presentan como un gráfico
de barras tridimensional. Preferiblemente, las barras que
representan los clones de referencia se indican por color o algún
otro medio.
Para L_{i}, \tau, K_{m:ap:total}, y S,
puede seleccionarse cualquier valor de entrada en una tabla para
presentar la luminiscencia y lectura de densidad óptica subyacente
al cálculo del valor, y una representación gráfica del ajuste en
curva cuando sea apropiado. Preferiblemente, las ecuaciones
implicadas y el resultado final y el coeficiente de correlación
también se presentarán.
\underline{L_{i} \ o \ L_{i}/L_{ir}}: Presenta
la densidad óptica y valor de luminiscencia de la muestra elegida en
la placa 0 y placa 1.
\underline{\tau \ o \ \tau/\tau_{r}}: Presenta
la densidad óptica y valor de luminiscencia de la muestra elegida en
la Placa 0, Placa 1, Placa 5, y Placa 8. Presenta un gráfico de
ln(LIX) frente a t, que muestra los datos puntuales y la
mejor línea.
\underline{S \ o \ S_{r}/S}: Presenta la
densidad óptica y valor de luminiscencia de la muestra elegida en la
Placa 0, Placa 1, Placa 3, Placa 4, y Placa 7. Presenta un gráfico
de ln(L) frente a t, que muestra los datos puntuales y la
mejor línea.
\underline{K_{m:ap:total} \ o \
K_{mr}/K_{m:ap:total}}: Presenta la densidad óptica y valor de
luminiscencia de la muestra elegida en la Placa 0, Placa 1, Placa 2,
Placa 5, y Placa 6. Presenta un gráfico de 1/L frente a 1/[S], que
muestra los datos puntuales y la mejor línea.
Ejemplo 3
anterior
El gen mostrado en la Figura 45 contiene una
única mutación del par de bases que codifica una sustitución de
aminoácidos en la posición 249, T a M. Este clon tiene un máximo
espectral de 552 nm que cambia a amarillo de la secuencia de Luc.
Este mutante se seleccionó como un molde original porque produce
luminosidad aproximadamente 5 veces más brillante in vivo
que permitió una exploración más eficaz.
Para eliminar la señal de dirección a peroxisoma
(SKL), se mutó el L a un codón de parada y los 3 codones
inmediatamente cadena arriba se aleatorizaron de acuerdo con el
procedimiento de mutagénesis con oligonucleótidos descrito en este
documento. El oligonucleótido mutagénico diseñado para conseguir
esto también introduce un sitio SpeI único para permitir la
identificación del mutante sin secuenciación. Los mutantes se
exploraron in vivo y se picaron 13 colonias, 12 de las
cuales contenían el sitio SpeI.
Para ensayar si la expresión podría mejorarse, se
aleatorizaron los 3 codones inmediatamente cadena debajo de la Met
de inicio como se describe en este documento. El oligo mutagénico
diseñado para conseguir esto también introduce un sitio ApaI único
para permitir la identificación del mutante sin secuenciación. Se
seleccionaron siete clones, y seis de los plásmidos aislados se
confirmó que eran mutantes.
Se realizó mutagénesis C y
N-terminal de lado a lado. Para combinarlos las
mutaciones N y C-terminales, los clones
seleccionados de cada experimento de mutagénesis se combinaron con
el uso de mutagénesis de recombinación de acuerdo con el protocolo
de mutagénesis de recombinación descrito en este documento. Los
mutantes arrastrados se subclonaron en el esqueleto amp^{s} pRAM
y se exploraron en DH5 F'IQ (BRL; Hanahan, 1985). Se picaron un
total de 24 colonias, conteniendo solo 4 mutaciones tanto N como
C-terminales. Estos 4 clones se usaron como moldes
para aleatorización de las posiciones de cisteína en el gen.
Hay 7 posiciones de cisteína en LucPpe2. Se sabe
que estas posiciones son susceptibles de oxidación que podría
provocar la desestabilización de la proteína. Se ordenaron siete
oligonucleótidos para aleatorizar las posiciones de cisteína.
Los oligonucleótidos se organizaron en dos grupos
en base a la conservación de la cisteína en otros genes de
luciferasa de diferentes familias. El grupo 1 aleatoriza las
posiciones de cisteína conservadas C-60,
C-80, y C-162. El grupo 2
aleatoriza las cisteínas que no están estrictamente conservadas en
las posiciones C-38, C-127,
C-221, y C-257.
Los cuatro moldes seleccionados de mutagénesis N
y C-terminal se subclonaron en un esqueleto sensible
a ampicilina y se preparó un ADN de hélice única para cada uno de
los moldes. Estos moldes se combinaron en cantidades iguales y se
completó la mutagénesis oligonucleotídica como se describe en este
documento. Se determinó por plaqueo una alícuota de la
transformación mutS antes de la incubación durante una noche cada
uno de los 2 grupos que contenían 2 x 10^{4} transformantes
independientes. Se preparó el ADN de MutS para los 2 grupos y
después se transformó en células JM109 para la exploración. Los
mutantes del grupo 1 se exploraron in vivo y se hicieron
elecciones para un recorrido robótico completo. Se seleccionaron
cinco clones que tenían características mejoradas. Los mutantes del
grupo 2 se exploraron in vivo y se hicieron elecciones para
un recorrido robótico completo. La incubadora de temperatura en el
robot se ajustó a 33ºC para este conjunto de experimentos. Se
seleccionaron diez clones que tuvieron características mejoradas.
Las quince mejores elecciones de ambos grupos de los experimentos
de mutagénesis de cisteína se arrastraron juntos como se describe en
este documento y 18 de los mejores clones se seleccionaron después
del procesamiento robótico.
El "mejor" clon del anterior experimento
(Luc31-1G8) se selecciono como molde para rondas
posteriores de mutagénesis. (La temperatura de la incubadora del
robot a alta temperatura se ajustó a 42ºC). Se completó otra ronda
completa de mutagénesis.
Los 18 mejores clones de la mutagénesis anterior
se picaron y se seleccionó el clon (Luc39-5B10) como
el mejor clon y se usó como molde para otra ronda de mutagénesis.
(La temperatura de la incubadora del robot a alta temperatura se
ajustó a 49ºC).
Después de este ciclo, se seleccionaron 6 de los
mejores clones para secuenciación (la secuencia de nucleótidos y
secuencia de aminoácidos deducida de cinco de los clones se muestra
en las Figuras 22-26 y 27-31,
respectivamente). En base a los datos de secuencia, se
seleccionaron nueve posiciones para aleatorización y se diseñaron
siete oligos para cubrir estas posiciones. En base a los datos
generados del robot, se determinó que el mejor clon del grupo de
seis clones que se secuenció fue el clon (Luc49-7C6,
Figuras 22 y 27). El gen de luciferasa de este clon se subclonó en
una estructura pRAM sensible a ampicilina y se preparó el ADN de
hélice única. La aleatorización de las posiciones seleccionadas se
completó de acuerdo con el procedimiento de mutagénesis con
oligonucleótido presentado en este documento.
Los oligonucleótidos de aleatorización se
dividieron en 4 grupos, y se picaron transformantes de estos
experimentos y se completaron dos recorridos robóticos. Se
seleccionaron diez clones de los dos experimentos. (La temperatura
de la incubadora del robot de alta temperatura se ajustó a
56ºC).
Las mejores 10 elecciones de los anteriores dos
experimentos, y las mejores 18 elecciones de la población de clones
previa se arrastraron juntos (protocolo de mutagénesis de
recombinación).
Los 18 mejores clones se seleccionaron y se
determinó que el clon Luc58-0A5 era el mejor clon.
Este clon después se usó como molde para otra ronda de mutagénesis.
La temperatura de la incubadora del robot de alta temperatura se
ajustó a 58ºC. El clon Luc71-504 se seleccionó como
un nuevo clon principal y se completó otra ronda de mutagénesis.
Ajuste de la incubadora a 60ºC.
Se seleccionaron las mejores 18 elecciones. La
secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida de 4
clones del experimento 78 se muestran en las Figuras
32-35 y 36-39, respectivamente, y se
determino que el mejor clon de este grupo fue el clon
Luc78-0B10. La termoestabilidad de los clones a
diversas temperaturas se representa en las Figuras.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
anterior
Se prepararon veintitrés oligonucleótidos para
cambiar 28 posiciones a consenso. Todos los oligonucleótidos se
ensayaron individualmente usando mutagénesis dirigida por
oligonucleótido con ADN de hélice única del clon
luc78-0B10 como molde para determinar qué
oligonucleótidos daban una mejora en la termoestabilidad. La Tabla 4
enumera los oligonucleótidos mutagénicos.
\vskip1.000000\baselineskip
| Descripción | Síntesis de oligo número | SEC.ID.Nº |
| A17 a T | 6215 | 48 |
| M25 a L | 6216 | 49 |
| S36 a P; retirar sitio Nsi i | 6217 | 50 |
| A101 a V, S105 a N | 6218 | 51 |
| L125 a V | 6219 | 52 |
| K139 a Q | 6220 | 53 |
| V145 a I | 6221 | 54 |
| V194 a I | 6222 | 55 |
| V203 a L, S204 a P | 6231 | 56 |
| A216 a V | 6232 | 57 |
| A229 a Q | 6233 | 58 |
| M249 a T (inversión) | 6234* | 59 |
| T266 a R, K270 a E | 6235 | 60 |
| E301 a D | 6236 | 61 |
| N333 a P, F334 a G | 6237 | 62 |
| R356 a K | 6238 | 63 |
| I363 a V | 6246 | 64 |
| A393 a P | 6247 | 65 |
| R417 a H | 6248 | 66 |
| G482 a V | 6249 | 67 |
| Descripción | Síntesis de oligo número | SEC.ID.Nº |
| N492 a T | 6250 | 68 |
| F499 a Y, S501 a A | 6251 | 69 |
| L517 a V | 6252 | 70 |
| F537 a L | 6253 | 71 |
| * \begin{minipage}[t]{155mm} Obsérvese que el oligonucleótido N^{o} 6234 no cambia una posición consenso. Este oligonucleótido provoca una inversión de la posición 249 al codón de Ppe-2 de tipo silvestre. Aunque la inversión de esta posición demostró aumentar la estabilidad a 62^{o}C, la inversión de esta posición disminuyo la producción de luz. \end{minipage} | ||
Se completaron tres experimentos de mutagénesis
dirigida por oligonucleótidos con el clon
luc78-0B10 como molde. Los oligonucleótidos
para estos experimentos se dividieron de la siguiente manera:
a. 6215, 6234, 6236, 6248 (encontrado que dan
termoestabilidad aumentada)
b. 6215, 6217, 6218, 6219, 6220, 6221, 6222,
6231, 6233, 6234, 6236, 6238, 6247, 6248, 6249, 6251, 6253
(encontrados que son neutros o tienen termoestabilidad
aumentada).
c. Los 23 oligonucleótidos.
Se exploraron selecciones de los tres
experimentos enumerados anteriormente con el procedimiento de
exploración robótica (experimento 84, véase Tabla 1) usando
luc78-0B10 como control. Se recombinaron las
selecciones del experimento 84 usando el procedimiento de
mutagénesis de precombinación y después se exploraron con el
procedimiento de exploración robótica (experimento 85).
Se preparó ADN de hélice única a partir de tres
clones, luc85-3E12,
luc85-4F12,
luc85-5A4. La secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos deducida de
luc85-4F12 se muestran en las Figuras 40 y
41, respectivamente. Estos clones se usaron como moldes para
mutagénesis dirigida por oligonucleótido para mejorar el uso de
codones. Las posiciones se seleccionaron en base a la tabla de uso
de codones publicada en Nucleic Acids Research, vol. 18
(suplemento) 1990, página 2402. La siguiente tabla enumera los
oligonucleótidos que se usaron para mejorar el uso de codones en
E. coli.
| Descripción | Síntesis de oligo nº | SEC ID Nº |
| L7 (tta-ctg), retirar sitio Apa 1 | 6258 | 72 |
| L29 (tta-ctg) | 6259 | 73 |
| T42 (aca-acc) | 6260 | 74 |
| L51, L56 (tta-ctg), L58 (ttg-ctg) | 6261 | 75 |
| L71 (tta-ctg) | 6262 | 76 |
| L85 (ttg-ctg) | 6263 | 77 |
| L95 (ttg-ctg), L97 (ctt-ctg) | 6273 | 78 |
| L113, L117 (tta-ctg) | 6274 | 79 |
| L151, L153 (tta-ctg) | 6275 | 80 |
| L163 (ctc-ctg) | 6276 | 81 |
| R187 (cga-cgt) | 6277 | 82 |
| Descripción | Síntesis de oligo nº | SEC ID Nº |
| L237 (tta-ctg) | 6279 | 83 |
| R260 (cga-cgc) | 6280 | 84 |
| L285, L290 (tta-ctg), L286 (ctt-ctg) | 6281 | 85 |
| L308 (tta-ctg) | 6282 | 86 |
| L318 (tta-ctg) | 6283 | 87 |
| L341 (tta-ctg), T342 (aca-acc) | 6284 | 88 |
| L380 (ttg-ctg) | 6285 | 89 |
| L439 (tta-ctg) | 6286 | 90 |
| L456 (ctc-ctg), L457 (tta-ctg) | 6293 | 91 |
| T506 (aca-acc), L510 (cta-ctg) | 6305 | 92 |
| R530 (aga,cgt) | 6306 | 93 |
\vskip1.000000\baselineskip
En el primer experimento, los tres moldes
enumerados anteriormente del experimento 85 se combinaron y se
usaron como moldes para mutagénesis dirigida por oligonucleótido.
Todos los oligonucleótidos se combinaron en un experimento y los
clones resultantes de la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos
se exploraron usando el procedimiento de exploración robótica como
en el experimento 88. Hubo un bajo porcentaje de colonias
luminiscentes que fueron el resultado de este experimento, de modo
que se completó otro experimento de mutagénesis dirigida por
oligonucleótidos en el que los oligonucleótidos se combinaron en los
siguientes grupos:
- a.
- 6258, 6273, 6280, 6286
- b.
- 6259, 6274, 6281, 6293
- c.
- 6260, 6275, 6282, 6294
- d.
- 6261, 6276, 6283, 6305
- e.
- 6262, 6277, 6284, 9306
- f.
- 6263, 6279, 6285
Se descubrió que las muestras del grupo b tenían
un numero inferior de colonias luminiscentes, y se hipotetizó que
uno de los oligonucleótidos del grupo b estaba provocando problemas.
Se hicieron selecciones de todos los experimentos con la excepción
del experimento b. Después, las muestras se procesaron a través del
procedimiento de exploración robótica (experimento 89). Las
selecciones de los experimentos 89 y 89 se arrastraron juntas con el
protocolo de mutagénesis de recombinación y después se exploraron
con el procedimiento de exploración robótica (experimento 90).
Las luciferasas mutantes descritas en este
documento se produjeron mediante mutagénesis aleatoria con
exploración in vivo posterior de los genes mutados para una
pluralidad de características incluyendo producción de luz y
termoestabilidad del producto génico de luciferasa codificado. La
mutagénesis se consiguió siguiendo en líneas generales un
procedimiento de tres etapas:
1. Creación de diversidad genética a través de
mutagénesis aleatoria. Aquí, se usó PCR propensa a errores de
una secuencia de partida para crear mutaciones puntuales en la
secuencia de nucleótidos. Como la PCR propensa a error produce casi
exclusivamente mutaciones puntuales únicas en una secuencia de ADN,
son posibles un máximo teórico de 7 cambios de aminoácidos por
mutación de nucleótidos. En la práctica, sin embargo, pueden
conseguirse aproximadamente 6,1 cambios de aminoácido por
nucleótido. Para los 550 aminoácidos de la luciferasa, son posibles
aproximadamente 3300 mutantes a través de mutagénesis puntual.
2. Consolidación de mutaciones
puntuales únicas a través de mutagénesis de recombinación. La
diversidad genética creada por la mutagénesis inicial se recombina
en un número más pequeño de clones por sPCR. Este procedimiento no
solo reduce el número de clones mutantes, sino que como la velocidad
de mutagénesis es alta, la probabilidad de unión a mutaciones
negativas es significativa. La mutagénesis de recombinación no une
mutaciones positivas de mutaciones negativas. La mutación se
"vuelven a unir" en nuevos genes por mutagénesis de
recombinación para producir las nuevas permutaciones.
Posteriormente, después de volver a explorar los mutantes de
recombinación, las permutaciones
genéticas que tienen las "mutaciones negativas" se eliminan al no ser seleccionadas. La mutagénesis de recombinación también sirve como exploración secundaria de los mutantes iniciales preparados por PCR propensa a error.
genéticas que tienen las "mutaciones negativas" se eliminan al no ser seleccionadas. La mutagénesis de recombinación también sirve como exploración secundaria de los mutantes iniciales preparados por PCR propensa a error.
3. Ampliación de la diversidad
genética a través de mutagénesis aleatoria de codones
seleccionados. Como la mutagénesis puntual aleatoria solo puede
conseguir una cantidad limitada de sustituciones de aminoácidos, se
consigue una aleatorización completa de codones seleccionados por
mutagénesis de oligonucleótidos. Los codones a mutar se seleccionan
de los resultados de los procedimientos de mutagénesis precedentes
asumiendo que para cualquier sustitución beneficiosa dada, otras
sustituciones de aminoácidos alternativas en las mismas posiciones
pueden producir beneficios incluso mayores. Las posiciones a mutar
se identifican por secuenciación de ADN de clones
seleccionados.
Tanto el extremo N-terminal como
el C-terminal de la secuencia de partida se
modificaron por mutagénesis dirigida por oligonucleótido para
optimizar la expresión y retirar la secuencia de marcaje
peroxisómica. En el extremo N-terminal, se
aleatorizaron nueve bases cadena abajo del codón de inicio. En el
extremo C-terminal, se aleatorizaron nueve bases
cadena arriba del codón de terminación. Los mutantes se analizaron
usando una exploración in vivo, que no provocó cambios
significativos en la expresión.
Seis clones de esta exploración se combinaron, y
se usaron para mutar los codones para siete cisteínas. Estos
co-
dones se aleatorizaron usando mutagénesis dirigida por oligonucleótido, y los mutantes se exploraron usando el procedimiento de exploración robótica. A partir de esta exploración, se seleccionaron 15 clones para evolución dirigida.
dones se aleatorizaron usando mutagénesis dirigida por oligonucleótido, y los mutantes se exploraron usando el procedimiento de exploración robótica. A partir de esta exploración, se seleccionaron 15 clones para evolución dirigida.
Se usan varios protocolos muy potentes y
ampliamente conocidos para generar y ensayar los clones de la
presente invención. Salvo que se indique otra cosa, estos
procedimientos de laboratorio son bien conocidos para un
especialista en la técnica. Obsérvese particularmente que para un
especialista en la técnica es bien conocida la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) ideada por Mullis y diversas modificaciones al
protocolo de PCR convencional (PCR propensa a errores, sPCR, y
similares), secuenciación de ADN por cualquier procedimiento
(metodología de Sanger o Maxxam & Gilbert), secuenciación de
aminoácidos por cualquier procedimiento (por ejemplo, la
degradación de Edman), y separación electroforética de
polinucleótidos y polipéptidos/proteínas.
Un vector preferido (pRAM) (véase la Figura 20)
usado para el procedimiento de mutagénesis contiene varias
características únicas que permiten que la estrategia de mutagénesis
funcione de manera eficaz:
El vector pRAM contiene un origen de fago
filamentoso f1, que es necesario para la producción de ADN de hélice
única.
Dos sitios SfiI flanquean el gen. Estos sitios se
diseñaron para que el gen a subclonar sólo pudiera insertarse en la
orientación apropiada.
El vector contiene un promotor tac.
Los moldes a usar para la mutagénesis de
oligonucleótidos contienen una deleción de cuatro pares de bases en
el gen bla que hace al vector sensible a ampicilina. El
procedimiento de mutagénesis por oligonucleótido usa un
oligonucleótido mutante así como un oligonucleótido de reparación de
ampicilina que restaura la función al gen bla. Esto permite
la selección de un alto porcentaje de mutantes. (Si no se usa
selección, es difícil obtener un alto porcentaje de mutantes).
Las luciferasas mutantes de la presente invención
son adecuadas para su uso en cualquier aplicación para la que usaban
las luciferasas conocidas previamente, incluyendo las
siguientes:
Ensayos de ATP. La mayor estabilidad
enzimática significa que los recibos diseñados para la detección de
ATP tienen una semivida superior y vida operativa a temperaturas más
altas (por ejemplo, temperatura ambiente). Por lo tanto, un
procedimiento para detectar ATP usando luciferasas con
termoestabilidad aumentada es nuevo y útil.
Marcadores luminiscentes para ácidos
nucleicos, proteínas u otras moléculas. De manera análoga las
ventajas de las luciferasas de la presente invención para ensayos de
ATP, su semivida superior y vida operativa es un beneficio para la
fiabilidad y reproducibilidad de marcadores luminiscentes. Esto es
particularmente ventajoso para el marcaje de ácidos nucleicos en
procedimientos de hibridación donde la temperatura de hibridación
puede ser relativamente alta (por ejemplo, superior a 40ºC). Por lo
tanto, un procedimiento de marcaje de ácidos nucleicos, proteínas u
otras moléculas que usan luciferasas de la presente invención es
nuevo y útil.
Información genética. En la aplicación
generalizada de luciferasa como informador genético, donde la
detección del informador se usa para deducir la presencia de otro
gen o procedimiento de interés, la termoestabilidad aumentada de las
luciferasas proporciona menos dependencia de la temperatura de su
expresión en células vivas y en traducciones sin células y sistemas
de transcripción/traducción. Por lo tanto, un procedimiento que usa
las luciferasas de la presente invención como informadores genéticos
es nuevo y útil.
Inmovilización de enzimas. Las enzimas
muy próximas a superficies físicas pueden desnaturalizarse por su
interacción con esa superficie. La inmovilización de alta densidad
de luciferasas sobre una superficie para proporcionar fuerte
luminiscencia localizada se mejora usando luciferasas termoestables.
Por lo tanto, un procedimiento para inmovilizar luciferasas sobre
una superficie sólida que usa luciferasas de la presente invención
es nuevo y útil.
Proteínas híbridas. Las proteínas híbridas
producidas por fusión genética de genes que codifican luciferasas y
otros genes, o por medio de un procedimiento de acoplamiento
químico, se benefician porque tienen una semivida y viva operativa
superior. Por lo tanto, un procedimiento para producir proteínas
híbridas a través de un medio genético o acoplamiento químico que
usa las luciferasas de la presente invención es nuevo y útil.
Reacciones a alta temperatura. La alta
intensidad de una reacción de luciferasa aumenta con la temperatura
hasta que la luciferasa comienza a desnaturalizarse. Como el uso de
luciferasas termoestables permite el uso a temperaturas de reacción
superiores, la luciferasas de la presente invención son nuevas y
útiles para realizar reacciones a temperaturas altas.
Soluciones luminiscentes. La luminiscencia
tiene muchos usos generales, incluyendo educativos, demostrativos, y
propósitos de entretenimiento. Estas aplicaciones se benefician de
tener enzimas con semivida y vida operativa superiores. Por lo
tanto, un procedimiento para producir soluciones luminiscentes
usando las luciferasas de la presente invención es nuevo y útil.
El gen de la luciferasa de luciérnaga elegido
para evolución dirigida fue LucPpe2 aislado de Photuris
pennsylvanica. La luciferasa se clonó a partir de luciérnagas
recogidas en Maryland por Wood y col. después se clonaron
independientemente por el Dr. Leach usando luciérnagas recogidas en
Oklahoma (Ye y col.,1997). Se produjo un mutante de esta luciferasa
(T249M) por Wood y col. y se usó en la presente invención porque
producía aproximadamente 5 veces más luz cuando se expresaba en
colonias de E. coli.
Visión de conjunto del procedimiento de
evolución: La evolución dirigida se consiguió a través de
procedimientos recursivos, constando cada etapa de múltiples ciclos
de 1) crear bibliotecas mutacionales de luciferasa de luciérnaga
seguido de 2) exploración de las bibliotecas para identificar nuevos
clones mutantes que tienen una pluralidad de características
enzimológicas deseadas.
Para comenzar el proceso, se crearon tres
bibliotecas mutacionales usando PCR propensa a errores (Fromant y
col.,1995). Cada biblioteca se exploró primero por evaluación visual
de luminiscencia en colonias de E. coli (Wood y De Luca,
1987), y después por medidas cuantitativas de propiedades
enzimológicas en lisados celulares de E. coli. Se examinaron
aproximadamente diez mil colonias en la exploración visual, de las
cuales 704 se seleccionaron para análisis cuantitativo. De cada
exploración cuantitativa, se seleccionaron 18 clones. Los tres
conjuntos de 18 clones se combinaron cada uno entre sí, y se creó
una nueva biblioteca mutacional usando arrastre de ADN para generar
recombinaciones intragénicas (sPCR; Stemmer, 1994). Los resultados
se exploraron para producir otro conjunto de 18 clones. El
procedimiento completo se completó combinando este conjunto de 18
clones con 18 clones de la ronda previa de evolución, creando otra
biblioteca mutacional por arrastre de ADN, y exploración como
antes.
Procedimiento de exploración: En la
exploración visual cualitativa, se seleccionaron colonias sólo por
su capacidad de sostener luminiscencia relativamente brillante. La
estabilidad térmica de la luciferasa en las colonias de E.
coli se estimuló progresivamente en sucesivas rondas de
evolución aumentando la temperatura de la exploración. Las colonias
seleccionadas se inocularon en pocillos de placas de 96 pocillos que
contenían cada uno 200 ml de medio de crecimiento.
En las exploraciones cuantitativas, se midieron
lisados de los cultivos de E. coli para 1) actividad de
luminiscencia, 2) estabilidad enzimática, 3) renovación enzimática
sostenida, y 4) unión de sustrato.
La "actividad de luminiscencia" se midió
como la proporción de intensidad de luminiscencia a la densidad
óptica del cultivo celular.
La "estabilidad enzimática" se determinó por
la velocidad de perdida de actividad de los lisados celulares en 10
horas. En sucesivas rondas de evolución, la temperatura de
incubación de los lisados se aumentó.
La "renovación enzimática sostenida" se
determinó por la velocidad de pérdida de luminiscencia de una
reacción enzimática de señalización en 10 horas a temperatura
ambiente.
La "unión de sustrato" se determinó por la
actividad relativa del lisado cuando se ensayó con mezclas de
sustrato diluidas. De estos cuatro parámetros, la prioridad más alta
para la selección se situó en la termoestabilidad.
Automatización robótica: La automatización
robótica se uso en las exploraciones cuantitativas para realizar de
manera precisa la gran cantidad de ensayos cuantitativos necesarios
sobre las células cultivadas. Primero se diluyeron cultivos de una
noche en medio fresco y se hicieron crecer durante tres horas para
producir cultivos en fase de crecimiento semilogarítmica. Las
densidades ópticas de cada cultivo se midieron después, y se lisaron
alícuotas de los cultivos por congelación/descongelación y lisozima.
Los lisados resultantes se diluyeron adicionalmente antes del
análisis y se incubaron a temperaturas elevadas. Se midió la
luminiscencia de alícuotas de los lisados diluidos, tomados a varios
tiempos, y se midieron en diversas condiciones como se prescribe por
el procedimiento analítico (véase el ejemplo 2). El análisis
informático de estos datos produjo los criterios de selección
cuantitativos descritos en este documento.
Resumen del progreso evolutivo: Después de
mutagénesis de los extremos N- y C-terminales y de
la aleatorización de los codones de cisteína, se sometió un conjunto
de 15 clones a dos rondas de evolución dirigida como se ha descrito
en este documento. Cinco de los 18 clones producidos por este
procedimiento se secuenciaron para identificar las mutaciones. Uno
de estos clones denominado, Luc49-7C6, se eligió
para un análisis más detallado y mutagénesis adicional. Este clon
contenía 14 nuevas sustituciones de aminoácidos en comparación con
la luciferasa Luc[T249M].
Para evaluar el potencial de los reemplazamientos
de otros aminoácidos en los sitios de estas sustituciones, se usó
mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para aleatorizar estos
codones. Los clones resultantes se exploraron como se ha descrito en
este documento, y se usaron 18 clones seleccionados para iniciar dos
nuevas rondas de evolución dirigida. De los 18 clones producidos por
este segundo conjunto de rondas, el clon denominado
Luc78-0B10 se eligió para estudio adicional y
mutagénesis. Este clon codificaba una luciferasa que contenía 23
nuevas sustituciones de aminoácidos en comparación con
Luc[T249M].
Usando mutagénesis dirigida por oligonucleótidos
con Luc78-0B10 como molde, se seleccionaron codones
para sustitución a aminoácidos consenso previamente conocidos entre
luciferasas de escarabajo. Las selecciones de este experimento de
mutagénesis se arrastraron juntas y tres clones, que se determinó
que eran los más estables, después se usaron como moldes para
mutagénesis con oligonucleótidos para mejorar el uso de codones en
E. coli. Un clon denominado Luc90-1B5
seleccionado de este experimento, contenía 34 sustituciones de
aminoácidos con relación a Luc[T249M] (véanse las Figuras 42
y 43 para la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos
deducida de luc90-1B5, y las Figuras 44 y 45
para la secuencia de nucleótidos codificante y la secuencia de
aminoácidos deducida de Luc[T249M]). De los 25 codones
seleccionados para el cambio a aminoácidos consenso, 11 se
reemplazaron en el clon denominado Luc90-1B5. Sólo
cinco de las 30 posiciones que se seleccionaron para un uso de
codones mejorado se sustituyeron y tuvieron poco efecto en la
expresión enzimática.
Purificación proteica: Se purificaron
cuatro mutantes que se han descrito en este documento
(Luc[T249M], Luc49-7C6,
Luc78-0B10, y Luc 90-1B5) usando un
procedimiento publicado previamente (Hastings y col., 1996).
Caracterización enzimológica: Se diluyeron
las proteínas purificadas en 25 mmol/l de HEPES pH 7,8, 150 mmol/l
de NaCl, 0,1 mmol/l de EDTA y 1 mg/ml de BSA. Se determinó la
estabilidad enzimática a partir de proteínas diluidas incubadas a
diferentes temperaturas, y se retiraron alícuotas a diferentes
puntos de tiempo. Se calculó una regresión lineal del logaritmo
natural de la luminiscencia y el tiempo. Se calculó la semivida como
el ln(0,5)/pendiente de la regresión.
1. Se prepara ADN plasmídico a partir del
vector que contiene el gen de interés, se estima la concentración de
ADN a partir de un gel.
2. Se producen dos reacciones de 50
\mul por grupo:
Hay tres grupos de condiciones mutagénicas que
usan diferentes concentraciones de nucleótidos sesgados.
Las condiciones enumeradas en este documento
producen, en el intervalo del 8 al 10%, colonias Luc de tipo
silvestre después de la subclonación fenotípica para cada clon
parental generado. La velocidad de mutagénesis se estima por la
cantidad de colonias luminiscentes que están presentes después de
mutagénesis. En base a los resultados de los clones mutados en el
intervalo del 8 al 10%, se determinó que a este nivel de mutagénesis
produce de media aproximadamente 2-3 cambios de
aminoácidos por gen. Si la velocidad de mutagénesis se selecciona de
modo que haya un cambio de aminoácido por gen, entonces un 50% de
media de los clones no tendrá mutaciones. (Bowie y col., 1990).
Para la mezcla maestra: se añaden todos los
componentes (véase tabla 6) excepto polimerasa, se agitan por
vórtice, se centrifuga brevemente, se añade polimerasa, y se mezcla
suavemente.
| Componente | A a T/T a A | A a C/T a G | G a A/C a T |
| dATP | 0,3 mM | 0,1 mM | 0,25 mM |
| dCTP | 2,75 mM | 4 mM | 1 mM |
| dGTP | 0,06 mM | 0,02 mM | 0,05 mM |
| dTTP | 0,625 mM | 0,3 mM | 0,6 mM |
| _{++}pRAMtailUP | 0,4 pmol/\mul | 0,4 pmol/\mul | 0,4 pmol/\mul |
| _{++}pRAMtailDN | 0,4 pmol/\mul | 0,4 pmol/\mul | 0,4 pmol/\mul |
| * Taq polimerasa | 1 U/\mul | 1 U/\mul | 1 U/\mul |
| º MgCl_{2} | 6,77 mM | 5,12 mM | 2,7 mM |
| º MnCl_{2} | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,3 mM |
| ADN | 50 ng total | 50 ng total | 50 ng total |
| Tampón de PCR 10X | 1X | 1X | 1X |
| Agua nanopura esterilizada en autoclave | Hasta 50 \mul | Hasta 50 \mul | Hasta 50 \mul |
| * \hskip0,5cmLa Taq polimerasa se adquiere de Perkin Elmer (N808-0101). | |||
| ^{o}\hskip0,5cm \begin{minipage}[t]{140mm} MnCl_{2} y MgCl_{2} se fabrican frescos a partir de soluciones madre 1 M. Las soluciones madre se esterilizan por filtración y se mezclan con agua estéril para producir las soluciones madre 10 mM y 25 mM que después se almacenan en recipientes de poliestirenol Nalgene a 4^{o}C. \end{minipage} | |||
| ++ \hskip0,1cm \begin{minipage}[t]{140mm} pRAMtailUP:\hskip0,2cm 5' - gtactgagacgacgccagcccaagcttaggcctgagtg-3' (SEC ID N^{o}: 38); \hskip0,1cm pRAMtailDN: 5' - ggcatgagcgtgaactgactgaactagcggccgccgag-3' (SEC ID N^{o}: 39) \end{minipage} |
- Tris HCl 100 mM pH 8,4 de solución madre 1
M
- KCl 500 mM
- Los cebadores se diluyen de una solución madre
de 1 nmol/ml a una solución madre de trabajo de 20 pmol/\mul.
Ciclo en el ciclador térmico: 94ºC durante 1
minuto (94ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 10 minutos) 10X
3. Se purifican los productos de reacción con el
kit de purificación de PCR Wizard (Promega Corporation, Madison,
Wisconsin, part número A718c):
- se trasfiere la reacción de PCR a un nuevo tubo
que contiene 100 \mul de tampón de purificación directo promega
(Promega parte nº A724a)
- se añade 1 ml de resina de purificación de PCR
Wizard (Promega parte nº A718c) y se incuba a temperatura ambiente
durante 1 minuto
- se empuja la resina a través de una minicolumna
Wizard
- se lava con etanol al 80%
- se centrifuga una microcentrífuga para retirar
el exceso de etanol
- se eluye en 50 \mul de agua nanopura estéril
(permite que el agua permanezca en la columna durante al menos 1
minuto).
1. Se colocan cinco reacciones 50 \mul (véase
Tabla 7) por grupo.
| Componentes | Concentración | Cantidad en 50 \mul | Concentración final |
| dATP | 10 mM | 1 \mul | 0,2 mM |
| dCTP | 10 mM | 1 \mul | 0,2 mM |
| dGTP | 10 mM | 1 \mul | 0,2 mM |
| dTTP | 10 mM | 1 \mul | 0,2 mM |
| +pRAM18UP | 20 pmol/\mul | 1 \mul | 0,4 pmol/\mul |
| +pRAM19DN | 20 pmol/\mul | 1 \mul | 0,4 pmol/\mul |
| Pfu polimerasa | 2 U/\mul | 1 \mul | 0,04 \mu/\mul |
| ºTampón 10X | 10X | 5 \mul | 1X |
| ADN | 10 \mul | ||
| Agua | 24,6 \mul | ||
| - \hskip0,2cm \begin{minipage}[t]{140mm} A la mezcla maestra: se añaden todos los componentes, excepto polimerasa, se agita con vórtice, se centrifuga brevemente, se añade polimerasa, se mezcla suavemente. \end{minipage} | |||
| º \hskip0,2cm \begin{minipage}[t]{140mm} Tampón de reacción 10X para Pfu polimerasa Nativa contiene MgCl_{2} 20 mM, de modo que no es necesario añadir MgCl_{2} adicional.\end{minipage} | |||
| + \hskip0,1cm cebadores: | |||
| \hskip0,4cm pRAM18UP-5'-gtactgagacgacgccag-3' (SEC.ID.N^{o} 40) | |||
| \hskip0,4cm pRAM19DN-5'-ggcatgagcgtgaactgac-3' (SEC.ID.N^{o} 41) | |||
Condiciones de ciclado: 94ºC durante 30 segundos
(94ºC durante 20 segundos, 65ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 3
minutos) 25X (Perkin-Elmer Gene Amp® PCR System
2400)
2. Se carga 1 \mul en un gel para comprobar los
productos de amplificación.
3. Se purifican productos de la reacción de
amplificación con el kit de purificación por PCR Wizard (Promega
Corporation, parte Nº A718c):
- se transfiere la Reacción de PCR en un nuevo
tubo que contiene 100 \mul de tampón de Purificación Directa
(Promega, Parte Nº A724a)
- se añade 1 ml de Resina de Purificación por PCR
Wizard (Promega Parte Nº A718c) y se incuba a temperatura ambiente
durante 1 min
- se empuja la resina a través De una minicolumna
Wizard
- se lava con Etanol al 80%
- se centrifuga en microcentrífuga para retirar
el exceso de Etanol
\newpage
- se eluye con 88 \mul de agua nanopura estéril
(se deja que el agua permanezca en la columna durante al menos 1
min)
1. Se digiere el ADN con Sfi I del
siguiente modo:
- 2 \mul de Sfi I (Promega Parte Nº
R639a)
- 10 \mul de tampón B 10X (Promega Parte Nº
R002a)
- 88 \mul de ADN de preparación de PCR Wizard
(véase etapa 3 anterior)
- se mezclan los componentes y se cubre con 2
gotas de aceite mineral; se incuba a 50ºC durante 1 hora
2. Se retiran las sales y Sfi I termina
con la Purificación de PCR Wizard como se ha descrito en este
documento, y se eluye en 50 \mul de agua nanopura estéril
3. Ligamiento en la estructura pRAM (+/r) (se
colocan 4 ligamientos por grupo):
- 0,025 pmol de estructura pRAM
- 0,05 pmol de inserto (habitualmente en el
intervalo de 6 a 12 \mul de inserto)
- 1 \mul de ADN ligasa T4 (Promega parte
M180a)
- 2 \mul de tampón ligasa 10X (Promega parte
C126b, se divide en alícuotas de 25 \mul, no se congela/descongela
más de dos veces)
- agua hasta 20 \mul
- se liga durante 2 horas a temperatura
ambiente
- reacciones de calor durante 15 minutos a 70ºC
para inactivar la ligasa.
1. Se precipitan con butanol las muestras para
retirar el exceso de sales (n-Butanol de Sigma, St. Louis,
Missouri, Parte Nº BT-105):
(si se usa precipitación con etanol en lugar de
butanol, se lava con etanol al 70% según sea necesario. El exceso de
sales provocará un arqueo durante la electroporación que provoca que
la reacción falle.)
- se añade agua hasta 50 \mul
- se añaden 500 \mul de n-butanol
- se mezclan hasta que la mezcla de
butanol/ligamiento es transparente y después se centrifuga durante
20 min a temperatura ambiente
- se drena el butanol en un recipiente de
deshechos en una campana extractora
- se resuspende en 12 ul de agua, se centrifuga
30 s a toda velocidad
2. Preparación de mezcla células/ADN (se colocan
4 transformaciones más una con ADN de clon de referencia):
- mientras se precipita el ADN, se colocan
cubetas de electroporación en hielo
- se cargan tubos con tapones con cierres de
resorte Falcon de 15 ml con 3 ml de medio S.O.C. y se colocan en
hielo
- se descongelan células electrocompetentes JM109
en hielo (50 \mul por reacción de ligamiento)
- se pipetean 10 \mul de la tapa inferior de la
etapa 1 (o 0,51 \mul de ADN del clones de ref.) en células
competentes (pequeñas cantidades de butanol remanentes no afectan de
manera adversa a la eficacia de transformación)
- se coloca la mezcla célula/ADN en hielo
3. Electroporación:
- se llevan los tubos, cubetas, y mezcla
célula/ADN en hielo para el dispositivo de electroporación
- se pipetea la mezcla célula-ADN
en una cubeta y se elimina. Ajustes del instrumento:
- Distancia de la cubeta: 0,2 cm
- Tensión: 2,5 kV
- Capacitancia: 25 \muF
- Resistencia: 200 Ohms
- Constante de tiempo: 4,5 ms
- se pipetea 1 ml de SOC (contiene KCl; medios de
prep Nº KCLM) en la cubeta, se vierte rápidamente en el tubo de
recuperación (la eficacia de transformación se reduce si las células
se dejan asentar en la cubeta)
- se coloca el tubo de recuperación en hielo
hasta que todas las muestras se procesan
- se dejan que las células se recuperen a 37ºC
durante 30-60 minutos
- se siembran en placas de LB + amp con filtros
de nitrocelulosa (el Nº de colonias es aproximadamente un 20% más
alto si las células se recuperan 60 minutos, posiblemente debido a
la replicación celular.)
(La mejor densidad de colonias para la
exploración es de 500 por placa. Para el lote actual de células se
siembran en placa aproximadamente 500 a 750 \mul).
1. Se prepara un gel de bajo punto de fusión al
2%
- se usan 0,8 g de agarosa en 40 ml (NuSieve Nº
50082)
- se usa una combinación de preparación
grande
- se asegura que solidifica antes de la
digestión
2. Se preparan 4 \mug de ADN plasmídico
combinado para la digestión
3. Se prepara una dilución de 1 U/\mul de
ADNasa en hielo de acuerdo con la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
| ADNasa I^{+} | 0,74 \mul |
| Tampón de ADNasaI 10X | 10 \mul |
| Gelatina al 1%* | 10 \mul |
| Agua hasta 100 \mul | |
| ^{+} ADNasa I de Sigma (D5791) | |
| * La gelatina se añadió para impedir que la ADNasa I se adhiera a las paredes de los tubos. |
\vskip1.000000\baselineskip
Esta dilución puede mantenerse en hielo durante
al menos 30 min sin pérdida de actividad.
\newpage
4. Se digiere (se coloca a temperatura ambiente):
se preparan dos digestiones con 1,0 U y 1,5 U de ADNasa I por 100
\mul de reacción:
- 10 \mul de tampón de ADNasa 10X (Tris 500 mM,
MgCl_{2} 10 mM pH 7,8)
- x \mul de ADN (2 \mug de ADN plasmídico
combinado de la etapa 2)
- 1 o 1,5 \mul de la dilución de enzima a
1U/\mul
- agua nanopura estéril hasta 100 \mul
- se incuba a temperatura ambiente durante 10
minutos
- se detiene la reacción por la adición de 1 ul
de CDTA 100 mM
1. Se procesan los fragmentos digeridos con
ADNasa en gel
- se añaden 10 \mul de tampón de carga 10X a
cada digestión con ADNasa
- se carga todo en un gel de agarosa de bajo
punto de fusión al 2%
- se procesa aproximadamente 30 min a
120-150 V
- se carga marcado de ADN de pGEM en el carril
central
2. Se aíslan los fragmentos
- se cortan rebanadas de agarosa que contienen
fragmentos en el intervalo de tamaño de 600-1000 pb
usando una cuchilla de afeitar
- se cortan en trozos que pesan aproximadamente
0,3 g
- se funden las rebanadas de gel a 70ºC
- se añaden 300 \mul de Fenol (equilibrado con
NaCl/Tris) a la agarosa fundida, se agita con vórtice durante
aproximadamente 1 minuto a velocidad máxima
- se centrifuga durante 10 min a 4ºC
- se retira la capa superior en un tubo que
contiene un volumen igual de
Fenol/Cloroformo/Isoamilo (saturado con NaCl 300
mM/ Tris 100 mM pH 8,0), se agita con vórtice y se centrifuga
durante 5 minutos a TA
- se retira la capa superior en un tubo que
contiene cloroformo y se agita con vórtice y se centrifuga.
- se retira la capa superior en un tubo con 2
vol. de Etanol frío al 95%; se coloca en un congelador a -70ºC
durante 10 min (no se necesitan sales adicionales a causa de Fenol
con Alto contenido Salino)
- se centrifuga a 4ºC durante 15 minutos.
- se lava con Etanol al 70%, se drena y se seca
al aire durante \sim10 min
- se resuspende en 25 a 50 \mul de agua
nanopura estéril
- se almacena a -70ºC hasta que está listo para
su uso
Se colocan 4 reacciones (véase Tabla 9) y se
combinan cuando se completan.
| Componente | Concentración | Cantidad en \mul | Concentración final |
| dATP | 10 mM | 1 | 200 \muM |
| dCTP | 10 mM | 1 | 200 \muM |
| dGTP | 10 mM | 1 | 200 \muM |
| dTTP | 10 mM | 1 | 200 \muM |
| ADN* | 1-10 ng | 5 | |
| Tli | 3 U/\mul | 0,4 | 0,24 U/\mul |
| Tampón térmico 10X | 10X | 5 | 1X |
| MgCl_{2} | 25 mM | 4 | 2 mM |
| gelatina | 1% | 5 | 0,1% |
| agua | Hasta 50 \mul | ||
| * \begin{minipage}[t]{155mm} Como el ADN usado para esta reacción se ha fragmentado, es difícil estimar una concentración. El modo más fácil es cargar 5 \mu l del ADN digerido con ADNasa a un gel de agarosa y procesar el gel hasta que el tinte entre en los pocillos (1-2 min). Los fragmentos de 2 \mu g de una digestión de ADN típica que se resuspendieron en 100 \mu l de agua dan una concentración de ADN de aproximadamente 1 a 10 ng/\mu l. \end{minipage} | |||
Condiciones de ciclado: 94ºC durante 30 segundos
(94ºC durante 20 segundos, 65ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 2
minutos) 25X
Habitualmente 5 reacciones de amplificación
(véase Tabla 10) producirán suficiente ADN para un recorrido
robótico completo de 8 placas.
\vskip1.000000\baselineskip
| Componente | Concentración | Cantidad en \mul | Concentración final |
| dATP | 10 mM | 1 | 200 \muM |
| dCTP | 10 mM | 1 | 200 \muM |
| dGTP | 10 mM | 1 | 200 \muM |
| dTTP | 10 mM | 1 | 200 \muM |
| pRAMtailUP* | 20 pmol/\mul | 2 | 0,8 pmol/\mul |
| pRAMtailDN* | 20 pmol/\mul | 2 | 0,8 pmol/\mul |
| Pfu polimerasa nativa^{+} | 2 U/\mul | 1 | 0,04 U/\mul |
| Tampón Pfu nativo 10Xº | 1X | 5 | 1X |
| ADN | 1-10 ng | 5 | |
| agua | agua hasta 50 \mul | ||
| * Obsérvese que la concentración de cebadores es dos veces tan alta como una reacción de amplificación típica. | |||
| ^{o} El tampón 10X Pfu contiene MgCl_{2} 20 mM, de modo que no es necesario añadir MgCl_{2}. | |||
| + \begin{minipage}[t]{155mm} La Pfu polimerasa se pide de Stratagene parte N^{o} 600135. Condiciones de ciclación: 94^{o}C durante 30 segundos (94^{o}C durante 20 segundos, 65^{o}C durante 1 minuto, 72^{o}C durante 3 minutos) 25x \end{minipage} |
Se purifican los productos de amplificación con
purificación por PCR Wizard:
- se combinan 5 reacciones de amplificación
- se transfieren en un nuevo tubo que contiene
100 \mul de tampón de Purificación Directa
- se añade 1 ml de Resina de Purificación por PCR
Wizard, se incuba a TA durante 1 minuto
- se empuja la Resina a través de una minicolumna
Wizard
- se lava con etanol al 80% y se centrifuga en un
microcentrífuga para retirar el exceso de etanol
- se eluye con 88 \mul de agua nanopura estéril
(se deja que el agua permanezca en la columna durante al menos 1
minuto)
2. Se digiere con Sfi I:
- 2 \mul de Sfi I
- 10 \mul de tampón B 10X
- 88 \mul de ADN de preparación de PCR
Wizard
- se mezclan los componentes y se cubre con 2
gotas de aceite mineral; se incuba a 50ºC durante 1 hora.
3. Aislamiento de bandas:
A veces después de la amplificación de la
reacción de ensamblaje, una banda es más pequeña que el fragmento
de tamaño del gen que se produce. Este fragmento pequeño ha
demostrado subclonarse aproximadamente 10 veces más frecuentemente
que el fragmento con el tamaño del gen si la muestra no es una banda
aislada. Cuando esta banda contaminante está presente, es necesario
aislar la banda después de la digestión con Sfi I.
Se produce una banda que es más pequeña que el
fragmento de tamaño génico.
- se carga el ADN a un gel de agarosa al 0,7%
- se aísla la banda y se purifica con el kit de
Limpieza de Genes de Bio 101
- se eluye el ADN 50 \mul agua nanopura
estéril, se comprueba la concentración en el gel (este tipo de
purificación con agarosa convencional produjo la cantidad más alta
de transformantes después de subclonación. Otros procedimientos
intentados: Baja fusión con Fenol cloroformo, limpieza de Genes con
resina de PCR Wizard de baja fusión con agarosa convencional,
columna de centrifugación Pierce Xtreme con Baja fusión (no funciona
con agarosa convencional)).
4. Se liga en la estructura pRAM [+/r]: (Véase el
protocolo de ligamiento y transformación anterior)
1. Se siembra en estrías en placa LB amp con
pRAMMCS [+/r] (Este vector contiene un inserto sintético con un
sitio Sac II en lugar de un gen. Este vector contiene el
nuevo sitio de unión al ribosoma, pero se corta cuando el vector se
digiere con Sfi I.
2. Se prepara un cultivo de 10 ml durante una
noche en LB suplementado con amp.
3. El siguiente día se inocula 1 l de LB
suplementado con amp y se hace crecer durante 16-20
horas.
4. Se purifica el ADN con el kit Wizard Maxi
Prep. (Promega Nº A7270) (se usan 4 preparaciones para 1 l de
células)
5. Se digiere el Plásmido con Sfi I. (Se
usan 5 U por microgramo) Se cubre con aceite mineral y se digiere
durante al menos dos horas.
6. Se precipita con etanol para retirar las
sales. Se resuspende en agua.
7. Se digiere con Sac II durante 2 horas.
(Se mantiene el volumen de digestión a 2 ml o menos). Es posible
que parte del plásmido pudiera digerirse parcialmente. Si el vector
se corta con una enzima que es interna a los dos sitios Sfi
I, evitará que los fragmentos parcialmente digeridos se unan en una
reacción de ligamiento.
8. Se carga se digirió completa en una columna
(véase 9). El volumen de la carga de muestra debe ser de no más de
2 ml. Si lo fuera será necesario precipitar con etanol.
9. La columna contiene Sephacryl
S-1000 y se almacena con etanol al 20% para evitar
la contaminación bacteriana. Antes de cargar la muestra, la columna
debe equilibrarse con tampón de procesamiento frío durante al menos
24 horas. Si la columna se ha dejado asentar más de un par de meses,
puede ser necesario vaciar la columna, equilibrar la resina con
3-4 lavados en tampón de procesamiento frío, y
después se vuelve a verter la columna. Después de que se vierta la
columna, debe equilibrarse durante una noche para que la resina se
compacte completamente.
10. Se recogen fracciones de aproximadamente 0,5
ml. Típicamente el ADN se libera entre las fracciones 25 y 50. Se
carga una alícuota de 5 \mul de un intervalo de fracciones para
determinar qué fracciones contienen el fragmento estructural. El
fragmento de inserto pequeño comenzará a liberarse de la columna
antes de que se eluya toda la estructura, de modo que será
necesario que sea conservativo cuando se combinan las fracciones.
Por esta razón, típicamente se pierde el 40-60% del
ADN en esta etapa.
11. Se combinan las fracciones que contienen la
estructura.
12. Se precipitan con etanol las muestras. Se
resuspenden en un volumen que produce aproximadamente
10-50 ng/\mul.
13. Se almacena a -70ºC.
Tampón de procesamiento de columna: (se almacena
a 4ºC)
EDTA 5 mM
NaCl 100 mM
Tris-HC 50 mM pH 8,0
10 \mug/ml de ARNt (R-8759,
Sigma)
Se prepara ADN de hélice única sensible a
ampicilina del molde a mutar. Se diseña un cebador mutagénico que
generará aleatoriamente todos los posibles codones de
aminoácidos.
| Componente | Concentración final |
| Molde de Hélice Única | 0,05 pmol |
| Oligonucleótido Mutagénico | 1,25 pmol |
| Oligo de Reparación resistente Ampicilina (Promega q631a) | 0,25 pmol |
| Tampón de hibridación 10X* | 1X |
| Agua hasta 20 \mul | |
| * Tampón de hibridación 10X: | |
| \hskip0,4cm - Tris-HCl 200 mM, pH 7,5 | |
| \hskip0,4cm - MgCl_{2} 100 mM | |
| \hskip0,4cm - NaCl 500 mM |
Se calienta la reacción a 60ºC durante 15 minutos
y después se coloca inmediatamente en hielo.
| Componente | Cantidad |
| Agua | 5 \mul |
| Tampón de síntesis 10X* | 3 \mul |
| ADN Polimerasa T4 (Promega m421a) | 1 \mul (10 Unidades) |
| ADN Ligasa T4 (Promega 180ª) | 1 \mul (3 Unidades) |
| * Tampón de síntesis 10X | |
| \hskip0,4cm Tris-HCl 100 mM, pH 7,5 | |
| \hskip0,4cm dNTP 5 mM | |
| \hskip0,4cm ATP 10 mM | |
| \hskip0,4cm DTT 20 mM |
Se incuba a 37ºC durante 90 minutos.
Se transforma en la cepa BMH
71-18 de Mut-S (cepa Q6321 de
Promega)
- Se coloca la reacción de Síntesis en un tubo de
17X100 mm.
- Se añaden células competentes BMH
71-18 que se ha descongelado en hielo para la
reacción de síntesis.
- Se incuba en hielo durante 30 min
- Las células se chocan con calor a 42ºC durante
90 segundos.
- Se añaden 4 ml de medio LB y se hacen crecer
las células a 37ºC durante 1 hora. Se añade Ampicilina a una
concentración final de 1,25 \mug/ml y después se hacen crecer
durante una noche a 37ºC.
Se aísla el ADN con el sistema de Purificación
Wizard Plus (Promega a7100).
Se transforma el ADN aislado en células
electrocompetentes JM109 y se transforman en placas de LB
Ampicilina.
Los clones JM109 (de una reacción de
transformación) se siembran en filtros de nitrocelulosa colocados en
placas LB amp a una densidad de exploración de aproximadamente 500
colonias por placa.
Como se explica en el procedimiento de
Mutagénesis Aleatoria, aproximadamente el 10% de los clones a
seleccionar tendrán que ser tan estables como los mismos
secuenciados o más que la fuente. O indicado de otro modo,
aproximadamente 50 colonias por placa serán adecuadas para la
selección. Hay 704 pocillos disponibles para un recorrido robótico
completo de ocho placas, de modo que al menos 15 placas LB amp serán
necesarias para un recorrido robótica completo.
Después de crecimiento durante una noche a 37ºC,
las placas que contienen transformantes se retiran de la incubadora
y se siembran en placas a temperatura ambiente.
El filtro de nitrocelulosa se mueve a un lateral
y se añaden 500 \mul de IPTG 10 mM a cada una de las placas. El
filtro se coloca después de vuelta sobre la palca para permitir la
difusión del IPTG en las colonias que contienen los diferentes
genes de luciferasa mutantes. Las placas después se incuban durante
aproximadamente 4 horas a temperatura ambiente.
Un (1) ml de una solución contiene luciferina 1
mM y se pipetea citrato sódico 100 mM en un calentador de
portaobjetos que esta ajustado a 50ºC. Después se coloca un filtro
de nitrocelulosa que contiene colonias de luciferasa mutante y se
ha tratado con IPTG en la parte superior de la solución de
luciferina. Después de varios minutos, se pican las colonias más
brillantes con palillos que se usan para inocular pocillos en una
placa de microtitulación que contiene medios mínimos M9 con gelatina
al 1%.
Después de haber picado suficientes colonias a 8
placas de microtitulación, las placas se colocan en una incubadora
a 350 rpm en incubación a 30ºC y se hacen crecer durante una
noche.
Por la mañana las placas de una noche se cargan
en el robot y se procesa el procedimiento de dilución celular.
(Este procedimiento diluye los cultivos 1:10 en medio de inducción).
Las nuevas placas se hacen crecer durante 3 horas a 350 rpm a
30ºC.
Después del crecimiento, las placas se cargan
para el procedimiento de ensayo principal.
\vskip1.000000\baselineskip
6 g/litro de Na_{2}HPO_{4}
3 g/litro de KH_{2}PO_{4}
0,5 g/litro de NaCl
1 g/litro de NH_{4}Cl
MgSO_{4} 2 mM
0,1 mM
Tiamina-HCl 1 mM
glucosa al 0,2%
12 \mug/ml de tetraciclina
100 \mug/ml de ampicilina
* Los medios de una noche contienen gelatina al
1%
* Los medios de inducción contienen IPTG 1 mM y
no gelatina.
\vskip1.000000\baselineskip
- NaCl 10 mM
- KCl 2,5 mM
- MgCl_{2} 20 mM
- glucosa 20 mM
- bactotriptona al 2%
- extracto de levadura al 0,5%
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se comienza con LucPpe2[T249M]
2. Se mutan 3 aminoácidos en los extremos N- y
C-terminales
3. Se mutan 7 cisteínas
4. Se realizan dos iteraciones de evolución
\rightarrow Luc49-7C6
5. Mutagénesis de los codones alterados (9)
6. Dos iteraciones de evolución \rightarrow
Luc78-0B10
7. Mutagénesis de codones consenso (28)
8. Mutagénesis de uso de codones (24)
\rightarrow Luc90-1B5
1. 1 clon \rightarrow 3 bibliotecas usando PCR
propensa a errores
- \bullet
- 3 x exploración visual (aproximadamente 10.000 clones cada una)
- \bullet
- 3 x exploración cuantitativa (704 clones cada una)
2. 3 x 18 clones \rightarrow biblioteca usando
sPCR
- \bullet
- exploración visual (aproximadamente 10.000 clones)
- \bullet
- exploración cuantitativa (704 clones)
3. 18 + 18 \rightarrow biblioteca usando
sPCR
- \bullet
- exploración visual (aproximadamente 10.000 clones)
- \bullet
- exploración cuantitativa (704 clones)
4. Producción: 18 clones
Después del almacenamiento, la luciferina se
degrada y los productos de degradación inhiben la luciferasa. La
producción de inhibidores provoca una inestabilidad aparente en el
reactivo que contiene tanto luciferasa como luciferina. Hay dos
medios para reducir este problema: 1) Almacenar la luciferina y
luciferasa a pH 5,6-6,0 para reducir la velocidad
de degradación de la luciferina, y/o 2) Desarrollar una enzima que
sea resistente a los productos de degradación de luciferina.
Los mutantes LucPpe2 que se desarrollaron
después del clon Luc90-1B5, se desarrollaron para
ser más estables a bajo pH y tener resistencia a los productos de
degradación de luciferina. Estas enzimas mutantes son útiles, por
ejemplo, en un kit de detección de ATP. Una realización de dicho kit
comprende una mezcla de luciferina y luciferasa. Sucede una reacción
luminiscente cuando se añade una muestra que contiene ATP a la
mezcla.
Se produjeron tres poblaciones de mutaciones
aleatorias usando el clon Luc91B5 como molde. Estas tres poblaciones
se exploraron en el robot como los experimentos 114, 115, y 117.
Las exploraciones robóticas para los experimentos 114, 115, 116,
117, 118, 119, y 122 se completaron como se ha descrito previamente
excepto en que se preparó tampón C con tampón citrato pH 4,5 en
lugar de tampón HEPES pH 7,8, y el reactivo de ensayo se preparó con
HEPES pH 7,1 con ATP 10 \muM en lugar de Tricita pH 8,0 y ATP 175
\muM. estas condiciones de exploración se influyeron para
seleccionar clones que tuvieran retención aumentada de actividad
luminiscente en el tiempo a pH 4,5 a 48ºC y actividad luminiscente
aumentada cuando se ensayan a pH 7,1 con ATP 10 \muM. Diecisiete
clones del experimento 114, siete clones del experimento 115, y
diez clones del experimento 116 se arrastraron juntos usando sPCR y
los mutantes seleccionados de esta exploración se procesaron en el
robot como el experimento 117. Dieciocho clones se seleccionaron
del experimento 117.
El clon que se determinó que tenía las
características más mejoradas (retención aumentada de actividad
luminiscente en el tiempo a pH 4,5 y 48ºC y actividad luminiscente
aumentada cuando se ensaya a pH 7,1 con ATP 10 \muM) fue el clon
Luc117-3C1 y se seleccionó como molde para
mutagénesis aleatoria. Dos poblaciones de mutantes aleatorios se
exploraron y después se procesaron en el robot como los experimentos
118 y 119. Se salvaron siete clones del experimento 118 y cinco
clones del experimento 119.
Los clones de los experimentos 114, 115, 116,
117, 118, y 119 se seleccionaron en base a las siguientes
características: luminiscencia más brillante que
Luc90-1B5, y retención aumentada de actividad
luminiscente en el tiempo a pH 4,5. Estos clones seleccionados se
arrastraron juntos y se procesaron en el robot como el experimento
122. Se salvaron once clones de este experimento.
Se prepararon tres poblaciones a partir del clon
Luc122-4D5 y se procesaron en el robot como los
experimentos 125, 126, y 127. Trece clones del experimento 125,
cuatro clones del experimento 126, y tres clones del experimento
127 se arrastraron juntos y se procesaron en el robot como el
experimento 128. Para los experimentos 125, 126, 127, y 128, la
exploración para K_{m} se alteró para seleccionar clones que
fueran más resistentes a los productos de degradación de
luciferina. Los clones también se exploraron para retención de
luminiscencia en el tiempo a pH 4,5.
En lugar de explorar para la utilización de
sustrato, se realizó una exploración para resistencia a inhibidor.
En lugar de la dilución 0,06X de los sustratos, se usó una mezcla
75:25 de D a L luciferina en tampón de ensayo 1X y se denominó como
"0,75X". En lugar de la dilución 0,02X de sustratos, se usó una
mezcla 50:50 de D a L luciferina en tampón de ensayo 1X y denominó
"0,5X". El tampón de ensayo 1X en estos experimentos contenía
los siguiente: ATP 10 \muM, HEPES 50 mM pH 7,8, MgSO_{4} 8 mM, y
EDTA 0,1 mM. La muestra 0,75X contenía D-luciferina
75 \muM y L-luciferina 25 \muM. La muestra 0,5X
contenía D-luciferina 50 \muM y
L-luciferina 50 \muM. La muestra 1X contenía
D-luciferina 250 \muM. Se usó una regresión
K_{m} como anteriormente y se calculó un valor K_{m}. Los
valores normalizados de más de 1 indican más resistencia al
inhibidor. Los clones de estos experimentos que se demostraron
tener mayor resistencia a L-luciferina también
fueron más resistentes a los productos de degradación de
luciferina.
Para medir más fácilmente la resistencia a
inhibidor en el sistema robótica, se diseñó una nueva variable
"Q". La nueva variable "Q" remplaza la variable K_{m}
usada previamente. La proporción de luminiscencia se calcula igual
que en la medida de K_{m}, después se calcula el log natural (ln)
de cada proporción de luminiscencia (eje Y). El eje X es un tiempo
arbitrario que se introduce por el usuario. El primer tiempo
puntual es cero y las muestras se miden con tampón de ensayo 1X que
contiene D-luciferina 250 \muM. Los siguientes
dos tiempos puntuales tienen el mismo valor temporal (es decir, 4
horas para estimular la incubación de luciferina) y las muestras se
miden con tampón de ensayo 1X que contiene una mezcla 50:50 (como se
ha descrito anteriormente) de D-luciferina a
L-luciferina. Se calcula una regresión lineal que
correlaciona ln(proporción de luminiscencia) al tiempo. Se
calcula Q como el ln(0,5)/pendiente. Los valores normalizados
de "Q" mayores de 1 indican más resistencia al inhibidor. Los
experimentos 133 y superiores se procesaron usando este
programa.
Dieciséis clones del experimento 128 se
arrastraron con clones del experimento 122 y se procesaron en el
robot como el experimento 133. Dos muestras,
Luc133-1B2 y Luc133-0D11, se
seleccionaron como moldes para mutagénesis aleatoria y se
procesaron en el robot como los experimentos 145 y 146,
respectivamente. El clon que mostró una retención aumentada de
luminiscencia en el tiempo a pH 4,5 y la mayor resistencia a
inhibidor fue el clon Luc146-1H2. Además, a pH 4,5
y 48ºC, Luc133-1B2 y Luc146-1H2
tuvieron termoestabilidad aumentada con relación a
Luc90-1B5, y resistencia aumentada a inhibidor
(Figuras 54-61). Se muestra una comparación de la
señal de luminiscencia para Luc49-7C6,
Luc78-0B10, Luc90-1B5,
Luc133-1B2, y Luc146-1H2 en la
Figura 59. Se muestra una comparación de la termoestabilidad a 50ºC
para los clones Luc49-7C6,
Luc78-0B10, Luc90-lB5,
Luc133-1B2, y Luc146-1H2 en la
Figura 60. Las Figuras 55-58 muestran la secuencia
de nucleótidos codificante y la secuencia de aminoácidos deducida de
Luc133-1B2 y Luc146-1H2.
Se incuba una solución madre 10 mM de luciferina
a 50ºC en HEPES 50 mM, pH 7,8, para acelerar la producción de
productos de descomposición de luciferina. Se retira una alícuota a
tiempos puntuales y después se coloca a -20ºC. Después de que se
complete la incubación, se prepara reactivo de ensayo (Luciferina
100 \muM, ATP 1 \muM, HEPES 50 mM, pH 7,8 y MgSO_{4} 8 mM)
con luciferina para cada tiempo puntual y después se ensaya un
lisado diluido con cada reactivo de ensayo.
El lisado se prepara del siguiente modo. Se
preparan cultivos de una noche de clones a ensayar en LB
suplementado con 100 \mug/ml de AMP. Los cultivos se diluyen 1:10
en medios mínimos M-9 suplementados con IPTG 1
\muM, 100 \mug/ml de AMP y se hacen crecer durante 3 horas a
30ºC. Se mezclan cuarenta y cinco \mul de células con 20 \mul
de Tampón A y se congelan. La mezcla se descongela, se añaden 175
\mul de Tampón B, y la mezcla resultante se diluye 1:10 en Tampón
C. Después se calcula una regresión de luminiscencia frente al
tiempo de incubación de luciferina, y a partir de este gráfico se
extrapola la semi-vida. Una
semi-vida más larga significa que el mutante que se
está ensayando es más resistente a los productos de descomposición
de luciferina.
Ejemplo 6
anterior
Las luciferasas del escarabajo luminoso,
Pyrophorus plagiophthalamus, han demostrado previamente que
generan diferentes colores de luminiscencia (LucPpl). El
análisis de estas luciferasas reveló que los diferentes colores
estaban provocados por sustituciones de aminoácidos discretas en sus
secuencias proteicas. Esto permitió la posibilidad de hacer un par
de informadores genéticos capaces de emitir una señal luminiscente
combinada, posibilitando de este modo la cuantificación de dos
sucesos biomoleculares simultáneamente en el mismo sistema
vivo.
Se preparó LucPpl con aminoácido
sustituido que tiene las siguientes propiedades:
Aunque la actividad luminiscente de LucPpl
en los clones de E. coli parecieron ser termoestables por
encima de 60ºC, en lisados estas luciferasas tuvieron estabilidad
relativamente baja. Fueron particularmente inestables en presencia
de detergente Triton X-100. Cuando se preparan los
lisados que contienen luciferasa de luciérnaga habitualmente usada,
la enzima mantiene más del 90% de actividad durante 5 horas a
temperatura ambiente. Por el contrario, la actividad de las
luciferasas LucPpl disminuiría varias veces durante el mismo
periodo de tiempo.
\newpage
Las termoestabilidades de las luciferasas
LucPpl también están cerca de la temperatura fisiológica de
las células de mamífero. La luciferasa que emite verde
(LucPplGR) y la luciferasa que emite rojo (LucPplRD)
tienen diferentes termoestabilidades que pueden provocar diferencias
en los comportamientos como informadores genéticos en las células.
La influencia de la temperatura debe ser superior a la cercana al
punto de desnaturalización de las enzimas, donde pequeños cambios
en la temperatura tendrán el mayor efecto en la estructura proteica.
Por el contrario, la temperatura tendrá mucho menos efecto sobre la
estructura proteica cuando está muy por debajo del punto de
desnaturalización. Por tanto, el efecto diferencial sobre dos
enzimas que tienen temperaturas de desnaturalización ligeramente
diferentes será de menor a temperaturas relativamente inferiores.
Por lo tanto, podría ser preferible tener la temperatura de
desnaturalización de la enzima informadora significativamente por
encima de la temperatura de crecimiento de las células de
mamífero.
Aunque se desarrolló un método para cuantificar
cada luciferasa en una mezcla usando filtros coloreados, la
capacidad de discriminar entre las luciferasas está limitada por su
solapamiento espectral. Este solapamiento reduce la capacidad de
medir de manera precisa ambas luciferasas si sus intensidades de
luminiscencia difieren en más de 10 veces. Si las intensidades
difieren en más de 50 veces, la señal de luminiscencia de la
luciferasa reguladora se oscurece por la otra. Por tanto, sería
preferiblemente separar adicionalmente los espectros de
luminiscencia de las dos luciferasas.
Se identificaron muchas mutaciones diferentes que
cambiaron el espectro de luminiscencia hacia el rojo. Pero el
límite de luminiscencia roja parece ser aproximadamente 620 nm. Un
intento adicional en el cambio del espectro de luciferasa que emite
rojo en longitudes de onda aún más largas podría tener algún
beneficio. Se descubrió que las mutaciones que cambian a verde eran
raras, sin embargo, no se realizó un análisis extensivo. Las medidas
de luciferasas nativas muestran algunos ejemplos de luminiscencia
por debajo de 530 nm, aproximadamente 15 nm menos que la enzima
prototipo que emite verde.
De manera ideal, los dos informadores de
luciferasa serían idénticos en todas las características excepto en
el color de la luminiscencia. Sin embargo, como se ha indicado
anteriormente, la estabilidad física de las luciferasas no fue
idéntica. También se descubrió que las mutaciones que provocaban
luminiscencia cambiada a rojo también provocaban un aumento en la
K_{m} para luciferina. Aunque algunas de estas diferencias pueden
ser inevitables, no está claro si las propiedades están
fundamentalmente asociadas. Por ejemplo, las luciferasas de
diferentes especies de escarabajos a veces tienen K_{m} que
difieren significativamente incluso cuando sus espectro de
luminiscencia son similares. Puede ser que muchas de las diferencias
asociadas al desarrollo de la luciferasa que emite rojo se deban a
perturbaciones concomitantes en la integridad de la estructura
enzimática, ya que la termoestabilidad de un prototipo de la
luciferasa que emite rojo se aumentó sin alterar significativamente
el espectro de luminiscencia.
Cuando se describió por primera vez la
luciferasas de la luciérnaga como informador genético, la señal
luminiscente era un destello relativamente breve después de la
inyección de los sustratos de reacción. El desarrollo posterior de
la química luminiscente hizo el ensayo más adecuado posibilitando
una señal estable durante varios minutos. Actualmente, dichos
ensayos estabilizados están normalizados para aplicaciones de
laboratorio generales. Sin embargo, para permitir una exploración
de alta producción en investigación farmacéutica, la señal
luminiscente se estabilizó adicionalmente para prolongarla durante
una hora. Esto fue necesario para permitir un tiempo suficiente
para ensayar varios miles de muestras en un lote. Aunque la señal
luminiscente de las nuevas luciferasas combinadas fue estable
durante minutos, no proporcionaron la estabilidad de señal
prolongada necesaria para una exploración de alta producción. Sería
preferible que la estabilidad de la señal pudiera aumentarse
adicionalmente optimizando otras propiedades.
Para preparar luciferasas que tengan cierto
rendimiento, se empleó un procedimiento para la evolución in
vitro de la función enzimática, como se ha descrito
anteriormente. Describiendo brevemente, el procedimiento es un
procedimiento recursivo de generación de mutaciones aleatorias y de
selección de las propiedades deseables. Originalmente se desarrolló
fundamentalmente para aumentar la termoestabilidad de luciferasas,
aunque otras características enzimológicas se someten también a
optimización mediante este criterio de selección. Se usó una
estrategia ligeramente diferente para conseguir las propiedades
descritas anteriormente ya que fue necesario optimizar
concomitantemente dos luciferasas relacionadas.
Inicialmente, un único prototipo de enzima se
somete a la evolución in vitro para optimizar la estabilidad
física y la señal de luminiscencia. En el procedimiento, las
bibliotecas de mutantes se seleccionan también para cualquier nueva
mutación que provoque cambios de color. Se pone un énfasis
particular en el aislamiento de mutantes desplazados al verde.
Después de una optimización inicial de un prototipo común, se crea
una forma de las enzimas que emite verde y rojo, y éstas se
optimizan aún más por separado para armonizar sus propiedades
físicas y químicas. Se da una atención particular al ajuste de sus
estabilidades físicas y sus constantes de unión a sustrato,
especialmente para luciferina.
La elección del prototipo inicial para la
optimización fue la luciferasa de tipo silvestre que emite
amarillo-verde aislada de escarabajos luminosos
(LucPplYG). De las luciferasas clonadas originalmente de
P. plagiophthalamus, esta produjo la luminiscencia más
brillante cuando se expresó en E. coli. Además, había
preocupación porque la falta de mutación de desplazamiento al verde
surgió porque los estudios anteriores sobre mutagénesis se
realizaron usando una luciferasa que ya tenía la mayor luminiscencia
verde. Fue posible que si existían mutaciones adicionales de
desplazamiento al verde, habrían sido más evidentes cuando se
seleccionaron en un fondo desplazado al rojo. La mutagénesis se
realizó del siguiente modo:
La señal de translocación en el extremo C
terminal de las luciferasas se retiró. Esto se realizó usando
mutagénesis dirigida al oligonucleótido para convertir la
KSKL-normal en -XXX* (donde X representa cualquier
aminoácido, y * representa un codón de terminación). Se
seleccionaron varias colonias que produjeron una luminiscencia
brillante y se usaron como moldes para la siguiente etapa de
mutagénesis.
Las luciferasas de P. plagiophthalamus
tienen 13 cisteínas, que son potencialmente sensibles a oxidación.
Esto está en contraste con la luciferasa de luciérnaga usada
habitualmente, que solo tiene 4 cisteínas. Para retirar cualquier
cisteína que pueda limitar la estabilidad de la enzima, se usó
mutagénesis dirigida a oligonucleótido para aleatorizar los codones
de cisteína. Se usaron tres conjuntos de oligonucleótidos: cisteínas
no conservadas en regiones de baja homología de secuencia
(posiciones 69, 114, 160, 194, 335, y 460), cisteínas no conservadas
en regiones de gran homología de secuencia (posiciones 127, 213,
310, y 311), y cisteínas altamente conservadas (posiciones 60, 80,
y 388). Se aislaron los mejores clones de cada una de estas
selecciones, y se preparó una nueva librería de mutantes mediante
sPCR y se seleccionó de nuevo. A la temperatura de selección de
29ºC, la actividad de la luciferasa de tipo silvestre que emite
amarillo-verde disminuyó aproximadamente 500 veces
en 10 horas. La actividad del mutante más estable
(Luc20-4C10) fue más estable, disminuyendo solo
aproximadamente 2 veces.
Usando el procedimiento desarrollado
anteriormente, se generaron tres bibliotecas de mutantes usando PCR
propensa a errores y se seleccionaron. Los mejores mutantes a
partir de estos se recombinaron en una nueva biblioteca mediante
sPCR y se seleccionaron de nuevo. Finalmente, los mejores clones de
esta selección se recombinaron con los mejores clones de la
mutagénesis dirigida a oligonucleótido anterior mediante sPCR, y se
seleccionaron de nuevo. A 41ºC, la actividad del mejor mutante a
partir de este procedimiento (Luc30-4B02) disminuyó
63 veces en 10 horas, mientras que la actividad del mutante
parental (Luc20-4C 10) disminuyó más de 100.000
veces.
Seis de los mejores mutantes de la última
selección se aislaron y secuenciaron. Esto puso de manifiesto que
los aminoácidos en 16 posiciones habían cambiado entre los seis
clones. Trece posiciones habían cambiado en el mutante preferido,
Luc34B02. Cuatro de los cambios fueron en el extremo C terminal en
todos los mutantes aislados, donde la mutagénesis de
oligonucleótido había cambiado la secuencia de tipo silvestre de
-KSKL a -AGG*. Solo dos de las cisteínas habían sido cambiadas por
la mutagénesis de oligonucleótido anterior; una cisteína altamente
conservada en la posición 60 se cambió a valina y una cisteína
moderadamente conservada en la posición 127 se cambió a treonina.
Los restantes cambios de aminoácidos se debieron todos a mutaciones
puntuales en el ADN, consistentes con PCR propensa a errores. Es
interesante, que tres de ellos cambiaron el aminoácido al
encontrado en la luciferasa de tipo silvestre que emite verde (dos
en el mutante Luc30-4B02). Cuatro de los cambios
restantes llevaron las secuencias mutantes más cerca del aminoácido
consenso entre otras luciferasas de escarabajo clonadas (dos en el
mutante Luc30-4B02) (Figura 19B). 4 codones
adicionales se cambiaron sin afectar a la secuencia de
aminoácidos.
Para explorar adicionalmente el potencial de las
mutaciones en los mutantes secuenciados, se realizaron experimentos
de mutagénesis adicionales usando oligonucleótidos. Ocho de los
codones mutados por PCR propensa a errores se aleatorizaron o se
aleatorizaron parcialmente usando mutagénesis dirigida a
oligonucleótido. Cuatro de los codones de cisteína restantes se
aleatorizaron; dos cisteínas altamente conservadas (posiciones 80 y
388) y dos cisternas en una región de homología de secuencia
(posiciones 310 y 311). Una leucina se mutó a leucina/prolina; la
prolina es el aminoácido consenso entre otras luciferases de
escarabajo.
La mutagénesis se realizó con cuatro conjuntos de
oligonucleótidos (Tabla 13), y se seleccionaron los mejores clones
de cada conjunto. Estos se recombinaron mediante sPCR junto con los
clones seleccionados de la mutagénesis aleatoria anterior y se
seleccionaron de nuevo. La actividad del mejor clon de este
procedimiento (Luc47-7A11) disminuyó 2,3 veces a
42ºC; la actividad del clon parental (Luc30-4B02)
disminuyó más de 2000 veces.
| Experimento | Mutaciones | |
| Conjunto A | C_{80}\rightarrowX + K_{84}\rightarrowX + I_{91}\rightarrow(F, L, I, M, V, S, P, T, A) | |
| Conjunto B | I_{288}\rightarrow (F, L, I, M, V, S, P, T, A) | C_{310}\rightarrowX + C_{311}\rightarrowX |
| Conjunto C | G_{351}\rightarrow(I, M, V, T, A, N, K, D, E, S, R, G) +L_{350}\rightarrow(L, P) + | |
| S_{356}\rightarrowP + L_{359}\rightarrow(F, L, I, M, V, S, P, T, A) | ||
| Conjunto D | C_{388}\rightarrowX + V_{389}\rightarrow(NYN) | K_{457}\rightarrowX |
El procedimiento de mutagénesis aleatoria usando
PCR propensa a errores se aplicó de nuevo al mejor clon de la
mutagénesis dirigida a oligonucleótido (Luc47-7A11).
De nuevo se crearon tres bibliotecas y los mutantes seleccionados
se recombinaron mediante sPCR y se seleccionaron de nuevo. Después
de la recombinación, la actividad del mejor mutante
(Luc53-0G01) disminuyó 1,2 veces a 43ºC. El clon
parental (Luc47-7A11) disminuyó 150 veces. Después
de recombinar los mejores de estos nuevos mutantes con los mejores
mutantes de la mutagénesis dirigida a oligonucleótido anterior, la
actividad del nuevo mejor mutante (Luc55-2E09)
disminuyó 31 veces a 47ºC, comparado con las 80 veces para el
parental (Luc53-0G01).
El procedimiento de mutagénesis aleatoria se
repitió usando el mejor clon del ciclo de mutagénesis anterior
(Luc53-0G01). Después de recombinar los mutantes
seleccionados con los mutantes del segundo ciclo de mutagénesis, la
actividad para el mejor clon (Luc81-6G01) disminuyó
100 veces a 47ºC, comparado con las 750 veces para el parental
(Luc53-0G01). La discrepancia en la actividad medida
de Luc53-0G01 en este ciclo de mutagénesis
comparada con el ciclo anterior puede deberse a cambios en el
procedimiento de ensayo y recalibrado de la temperatura de la
incubadora. Debería observarse que las termoestabilidades
registradas en cada etapa de mutagénesis se calculan a partir de
datos robóticos usando procedimientos de ensayo abreviados. Los
datos tienen por intención indicar las estabilidades relativas de
los mutantes enzimáticos cuando se ensayan en la misma selección, en
lugar de proporcionar una cuantificación precisa de la
termoestabilidad.
Antes de hacer una selección final del mejor clon
a partir del que crear las luciferasas que emiten verde y rojo, se
realizó un análisis adicional de los mejores clones a partir de la
selección final. Tres clones en particular fueron grandes
candidatos como elección final: Luc81-0B11,
Luc81-5F01, y Luc81-6G01. Las
propiedades de luminiscencia de estas tres enzimas mutantes se
compararon entre sí. Se compararon también con la luciferasa de
tipo silvestre que emite amarillo-verde para
calibrar el efecto del procedimiento de evolución in
vivo.
A partir de colonias de E. coli que
expresan las luciferasa, Luc81-5F01 y
Luc81-6G01 produjeron luminiscencia más rápidamente
a temperatura ambiente tras la adición de luciferina. La
luminiscencia fue más rápida y más brillante que la de las colonias
que expresaban las luciferasas de tipo silvestre que emiten verde y
amarillo-verde. La luminiscencia de todas las
colonias seleccionadas apareció desplazada al verde comparado con el
clon parental amarillo-verde. Cuando las colonias
se calientan a 65ºC, el clon amarillo-verde pierde
la mayor parte de su luminiscencia a 65ºC, aunque los tres clones
preferidos permanecen brillantes por encima de 70ºC. No hubo
cambios espectrales evidentes después de calentar las colonias hasta
aproximadamente 70ºC, donde aquellos clones que aún retienen
actividad empiezan a desplazarse ligeramente al rojo (en ocasiones,
las fases iniciales de desnaturalización enzimática van acompañadas
de un desplazamiento al rojo en la luminiscencia). Las
características de luminiscencia de los tres mutantes preferidos
son bastante similares.
La termoestabilidad de las luciferasas mutantes
en lisados celulares se comparó a temperatura ambiente (Figura 63).
Los lisados diluidos se tamponaron a pH 7,5 y contenían Triton
X-100 al 1%; en condiciones típicas para lisados de
células de mamífero. La actividad de luminiscencia de las tres
enzimas mutadas no mostró una disminución en 20 horas, mientras que
la actividad de la luciferasa de tipo silvestre que emite
amarillo-verde disminuyó sustancialmente.
Para los ensayos de luminiscencia que solo
requieren unos pocos segundos, la luciferasa de tipo silvestre que
emite amarillo-verde produce una señal muy estable
(la elevación inicial en la señal fue evidente en los primeros 2
segundos debido al tiempo de respuesta del luminómetro, no a la
cinética de la reacción de luminiscencia) (Figura 64A). Sin
embargo, la intensidad de la señal se redujo aproximadamente el 30%
por la presencia de Triton X-100 al 1% en el lisado
(diluido 1:5 con la adición del reactivo de ensayo). En contraste,
la intensidad de luminiscencia de las luciferasas mutantes no se
vio afectada por la presencia de Triton X-100. En
estas condiciones, la señal más estable la produjo
Luc81-6G01, aunque la intensidad de la señal fue
algo más brillante para Luc81-5F01. Sin embargo,
los datos no se corrigen para la eficacia de la expresión de la
enzima en E. coli. Por tanto, las diferencias en la
intensidad de luminiscencia puede que no se correlacionen con los
cambios den la actividad enzimática específica, ni la eficacia de la
expresión en E. coli es necesariamente pertinente para la
expresión en células de mamíferos.
Para lotes de ensayo que requieren más de una
hora para procesarse, la estabilidad de la señal de una luciferasa
de tipo silvestre que emite amarillo-verde no es
adecuada en las condiciones ensayadas. La intensidad de
luminiscencia disminuye varias veces por hora (Figura 64B). Los
intentos para corregir esto mediante la evolución in vitro
produjo resultados mixtos. La estabilidad de la señal de las tres
enzimas mutantes generalmente se mejoró mucho respecto a la enzima
amarillo-verde parental durante tres horas después
de la adición del sustrato. Sin embargo, esto fue acompañado de una
mayor disminución inicial en la luminiscencia durante la primera
media hora. Esta disminución inicial sería más aceptable si hubiera
ocurrido más rápidamente, de manera que el procesado discontinuo de
las muestras no tardara más de 30 minutos de espera hasta que se
estabilizara la señal. Puede ser posible mejorar este
comportamiento cinético ajustando las condiciones de ensayo.
A partir de estos resultados, el mutante
Luc81-6G01 se eligió como el mejor clon a partir del
que crear posteriormente las luciferasas que emiten
amarillo-verde. La secuencia de
Luc81-6G01 (Figuras 46-47) y
Luc81-0B11 se determinó y se comparó con las
secuencias de Luc30-4B02 del procedimiento anterior
de evolución in vitro, y la luciferasa de tipo silvestre que
emite amarillo-verde usada como clon parental
inicial (Figura 19B). Respecto a Luc30-4B02, el
mutante Luc81-6G01 adquirió nuevas mutaciones en 9
codones, de los cuales 8 provocaron cambios en la secuencia de
aminoácidos. Cuatro de estos 8 cambios de aminoácidos se adquirieron
probablemente por recombinación con clones generados antes del
aislamiento de Luc30-4B02. Dos son idénticos a las
mutaciones encontradas en los otros clones secuenciados junto con
Luc30-4B02, y dos son inversiones de la secuencia
parental de tipo silvestre. Los cuatro restantes son nuevos en la
secuencia de Luc81-6G01. Dos de las nuevas
mutaciones cambiaron el aminoácido por el aminoácido consenso entre
otras luciferasas clonadas.
Es interesante, que en cualquiera de las
secuencias Luc81-6G01 o Luc81-0B11,
no hay evidencia de que la mutagénesis dirigida a oligonucleótido
anterior tuviera un efecto beneficioso. No aparece ninguna secuencia
nucleotídica en ninguno de los codones diana. El rendimiento
enzimático mejorado después de la mutagénesis dirigida a
oligonucleótido se debió aparentemente a la recombinación de las
mutaciones adquiridas anteriormente. Todos los nuevos cambios de
aminoácidos en Luc81-6G01 y
Luc81-0B11 son en sitios no dirigidos por los
oligonucleótidos y se deben a modificaciones de una sola base de
los codones, consistentes con PCR propensa a errores. Aunque las
nuevas mutaciones en Luc81-6G01 no se encontraron
en datos de secuencias anteriores, no es seguro cuando se generaron
en el procedimiento. Más probablemente se produjeron en el segundo y
tercer ciclos de mutagénesis aleatoria; sin embargo, pueden estar
presentes entre otros mutantes seleccionados antes de
Luc30-4B02. Respecto a la luciferasa que emite
amarillo-verde inicial, el mutante
Luc81-6G01 ha adquirido 17 cambios de aminoácido y
3 mutaciones de codón que no afectan a la secuencia de
aminoácidos.
La observación del comienzo de la luminiscencia
en colonias de E. coli es más rápida para los nuevos
mutantes, y que la luminiscencia es más brillante a mayores
temperaturas, probablemente no se debe a las diferencias en la
expresión de la proteína. El análisis de inmunotransferencia de las
células que expresan las diferentes luciferasas no mostró
diferencias significativas en la cantidad de polipéptido presente.
Como se ha observado anteriormente, la mayor intensidad de la luz a
mayores temperaturas se debe al aumento de la termoestabilidad de
las luciferasas mutantes. Las K_{M} aparentes para ATP y
luciferina también han cambiado durante el transcurso de la
evolución in vitro (Tabla 14). Para estimar los valores de
K_{M}, las luciferasas mutantes se purificaron parcialmente a
partir de lisados de E. coli mediante precipitación
diferencial usando sulfato de amonio (fracción de saturación del
40-65%). Los resultados muestran que las K_{M}
para ambos ATP y luciferasa son más de 10 veces menores.
Cuando se añade luciferina a una colonia de E.
coli que expresa luciferasa, la concentración intracelular de
luciferina aumenta lentamente según se difunde a través de la
membrana celular. Por tanto, la concentración intracelular de
luciferina alcanza la saturación antes para las luciferasas que
tienen las menores K_{M}. Por lo tanto, las luciferasas mutantes
aparecen más brillantes antes que el clon parental de tipo
silvestre. Esto explica también por qué la luminiscencia del clon
prototipo que emite rojo aparece en colonias de E. coli
mucho más lentamente que la luciferasa que emite verde. El análisis
de las K_{M} muestra que las mutaciones que provocan la
luminiscencia roja aumentan también sustancialmente la K_{M} para
luciferina.
| Luciferasa | K_{M} para ATP (\muM) | K_{M} para luciferina (\muM) |
| YG w.t. | 140 | 21 |
| Luc30-4B02 | 12 | 7,8 |
| Luc81-6G01 | 8,0 | 1,9 |
A partir del análisis de la señal de
luminiscencia in vitro, sería de esperar que la luminiscencia
de las luciferasas mutantes perdiera intensidad más rápido que las
luciferasa de tipo silvestre durante los primeros 30 minutos.
Después de esto, la luminiscencia debería ser más estable en los
mutantes. Sin embargo, esto no se ha reconocido en las colonias de
E. coli, y puede ser que la cinética de luminiscencia sea
diferente en células comparadas con la enzima diluida en tampón.
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15-09-1999
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18-09-1998
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<150> PCT/US98/19494
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18-09-1998
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<150> US 60/059,379
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19-09-1997
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<212> PRT
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<220>
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<221> dudoso
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<222> (354) ... (355)
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desconocidos"
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<211> 544
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "luciferasa mutante"
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<221> dudoso
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desconocidos"
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<221> dudoso
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<211> 544
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<223> /nota = "luciferasa mutante"
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<211> 548
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Luciola lateralis
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<212> PRT
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<213> Pyrocoelia miyako
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 550
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Photinus pyralis
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 547
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lampyris noctiluca
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 552
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Photuris pennsylvanica
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 546
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Phengodes sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
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<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 543
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pyrophorus
plagiophthalamus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 543
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pyrophorus
plagiophthalamus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 545
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Photuris pennsylvanica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<212> ADN
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<220>
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<212> ADN
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<220>
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<223> /nota = "un cebador"
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<212> ADN
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<220>
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<223> /nota = "un cebador"
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<211> 1639
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<212> ADN
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<220>
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<220>
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<211> 29
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> /nota = "un cebador"
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
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<212> ADN
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<220>
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<223> /nota = "un cebador"
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtgcatta gttgataagt acgatttatc g
\hfill31
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<400> 62
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill28
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill28
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
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\hfill28
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
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\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagctgcagt tgttgtagta cag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaaatatct aaccgaacaa atc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatcgtacaa gattatgttg ccagtcaagt ttc
\hfill33
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipgggtgaaatt tgtggatgaa attc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipttaagacaaa tgctggaaaa acacac
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgtttgacg cactgtctcg ttatgcag
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> /nota = "un cebador"
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagcattga ccaatgctca tac
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagaaaatgt tctgtatgaa gagtttctga aactgtcgtg tcg
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 76
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaaaagtat ggactgaaac aaaacgac
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 77
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaaaatggt ctgcaatttt tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattgcatca ctgtatctgg gaataattg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgaacgtga actgatacac agtctgggta ttgtaaaac
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaactattat tatactggac ctgaatgaag acttag
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttatcaatg cctgaacaac tttatttc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttttaatc gtgacgatca gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacagcaat tctgacggta atacc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /note = "a primer"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtggattcc gcgttgttct aatgc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggaaagtac tctgctggta ccaacactga tggcatttc
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatttatcg cacctgaaag aaattgcatc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtggcgcac ctctgtcaaa agaaattggg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggtatgga ctgaccgaaa ccacttc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggaaaaatt ctggggcc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctgaagtc actgattaaa tataaagg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggaatact gctgcaacat ccg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtcaagtt tcaaccgcca aatggctgcg tggtgggg
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "un cebador"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaaaattga ccgtaaagtg ttaag
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
1. Una luciferasa termoestable que tiene
una semi vida de al menos 2 horas a 50ºC,
caracterizada porque dicha luciferasa
termoestable comprende la SEC.ID.Nº: 44 y la SEC.ID.Nº 45, o una
porción enzimáticamente activa de la misma; y es resistente a un
inhibidor de reacción bioluminiscente.
2. Una molécula de ácido nucleico aislada
y purificada que comprende un segmento de ácido nucleico que
codifica la luciferasa de la reivindicación 1 o el complemento de la
misma.
3. La molécula de ácido nucleico aislada
y purificada de la reivindicación 2 que comprende un segmento de
ácido nucleico que comprende la SEC.ID.Nº 42 o la SEC.ID.Nº: 43.
4. Un vector que contiene la molécula de
ácido nucleico de la reivindicación 2.
5. Una célula huésped, cuyo genoma se
aumenta con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación
2.
6. Un sustrato sólido que comprende la
luciferasa de la reivindicación 1.
7. Una proteína de fusión que comprende
la luciferasa de la reivindicación 1.
8. Una molécula de ácido nucleico aislada
y purificada que comprende un segmento de ácido nucleico que
codifica la proteína de fusión de la reivindicación 7.
9. Un procedimiento de uso de una
luciferasa, que comprende: unir un agente con la luciferasa de la
reivindicación 1 de manera que se produzca un agente marcado.
10. El uso de la luciferasa de la
reivindicación 1 para detectar ATP, para marcar una molécula, como
un informador genético, para inmovilizar sobre una superficie
sólida, para producir proteínas híbridas, para reacciones a alta
temperatura, o para crear soluciones luminiscentes.
11. Un procedimiento de utilización de un
vector que codifica una luciferasa que comprende:
- a)
- introducir el vector de la reivindicación 4 en una célula huésped; y
- b)
- detectar o determinar la presencia de luciferasa en al célula huésped.
12. Un kit que comprende: un recipiente que
comprende la luciferasa de la reivindicación 1.
13. El kit de la reivindicación 12 en el que
el recipiente comprende una mezcla acuosa que comprende la
luciferasa.
14. El kit de la reivindicación 12 en el que
el recipiente comprende luciferasa liofilizada.
15. El kit de la reivindicación 12 que
comprende además un recipiente que comprende luciferina.
16. El kit de la reivindicación 12 en el que
el recipiente comprende adicionalmente luciferina.
17. El kit de la reivindicación 14 en el que
el recipiente comprende adicionalmente luciferina liofilizada.
18. El kit de la reivindicación 15 en el que
el recipiente que comprende luciferina comprende luciferina
liofilizada.
19. El kit de la reivindicación 12 que
comprende adicionalmente un material de envasado que encierra,
envasado por separado, el recipiente y las instrucciones que dirigen
al usuario para correlacionar la actividad de luciferasa en una
muestra que se sospecha que tiene ATP con el nivel de ATP en la
muestra.
20. El kit de la reivindicación 12 que
comprende adicionalmente un material de envasado que encierra,
envasado por separado, el recipiente y las instrucciones que dirigen
al usuario para correlacionar la actividad de luciferasa en una
muestra que se sospecha que tiene un agente infeccioso que produce
ATP con el nivel o presencia del agente en la muestra.
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