EP1155130A2 - Glucose-dehydrogenase-fusionsproteine und ihre verwendung in expressionssystemen - Google Patents

Glucose-dehydrogenase-fusionsproteine und ihre verwendung in expressionssystemen

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Publication number
EP1155130A2
EP1155130A2 EP00903672A EP00903672A EP1155130A2 EP 1155130 A2 EP1155130 A2 EP 1155130A2 EP 00903672 A EP00903672 A EP 00903672A EP 00903672 A EP00903672 A EP 00903672A EP 1155130 A2 EP1155130 A2 EP 1155130A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
recombinant
gicdh
fusion protein
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00903672A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Winfried Linxweiler
Christa Burger
Oliver Pöschke
Uwe Hofmann
Andrea Wolf
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of EP1155130A2 publication Critical patent/EP1155130A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid

Definitions

  • the invention relates to new recombinant fusion proteins which contain, as a component, a protein sequence with the biological activity of glucose dehydrogenase (GIcDH) and their use for the simple and efficient detection of any proteins / polypeptides, preferably serving as fusion partners, or for the rapid optimization of expression systems which said proteins / polypeptides are able to express.
  • GIcDH glucose dehydrogenase
  • the GIcDH or the sequence that exhibits the biological activity of GIcDH, takes on the role of a marker or detector protein.
  • a specialty of this enzyme is its exceptional stability against denaturing agents such as SDS.
  • GIcDH as a marker or detector protein shows an undiminished enzymatic activity even after the reducing and denaturing conditions of SDS-PAGE gels. Fusion proteins containing GIcDH can therefore be detected with a sensitive enzymatic reaction based on this surprising behavior. By labeling with GIcDH, the desired expressed protein can also be detected quickly, cheaply and effectively.
  • GIcDH protein / polypeptide fusion proteins can be expressed in higher yield and stability than without GIcDH.
  • Corresponding fusion proteins per se can thus be used for the production and production of proteins / Serve polypeptides.
  • the in vivo expression of recombinant proteins plays an increasingly important role in biotechnology.
  • the ability to obtain, purify and detect cloned gene products from pro- and eukaryotic expression systems such as bacteria, yeast, insect or mammalian cells is also often used for studies of protein structure and function, of protein-protein and protein DNA interactions as well as antibody production and mutagen nese used.
  • pro- and eukaryotic expression systems such as bacteria, yeast, insect or mammalian cells
  • recombinant DNA technology it is possible to specifically change natural proteins so that their function is improved or varied.
  • the recombinant proteins are synthesized in constantly evolving expression systems, the optimization of which can take place at the most varied places in the system.
  • the entire process of recombinant protein synthesis can be divided into two sections.
  • a first step the molecular biological gene isolation and expression of the target protein takes place and in the subsequent step the detection and purification from the recombinant cells or their growth medium.
  • the gene of a protein is cloned into an expression vector provided for this purpose, then introduced into a host cell (pro or eukaryote cell) and expressed there.
  • Bacterial cells prove to be simple and inexpensive systems that deliver high yields.
  • the gram-negative bacterium E. coli is most often used as the host cell.
  • the aim of the expression of foreign genes in E. coli is to obtain the largest possible amount of biologically active, recombinant proteins, the so-called overexpression. It is known that foreign eukaryotic proteins can lose their biological activity through aggregation, as inclusion bodies, through incorrect folding or proteolytic degradation. One way of avoiding these frequently occurring difficulties is to remove the expressed proteins from the cell as secretion proteins or to use so-called fusion proteins, by means of which insoluble recombinant proteins can be present in soluble form in the cell.
  • proteins are mostly expressed in eukaryotic cells.
  • the post-transcriptional modifications important for the function and the correct compartmentalization can take place there.
  • proteins important for correct folding and processing Eukaryotic expression systems are also suitable for the expression of larger proteins and of proteins which require post-transcriptional modifications such as SS bridging, glycosylation, phosphorylation, etc. for correct folding. Since these systems are generally complex and expensive and the expression rate is lower than that of E.coli, it is particularly important to have a detection system that is fast, secure, sensitive and inexpensive.
  • a sensitive detection system is necessary to determine the correct expression, the amount expressed, the molecular weight and the functional activity of the fusion protein formed.
  • the number of functionally unknown proteins is increasing rapidly and it is becoming increasingly important to develop fast and inexpensive detection systems for this.
  • Most gene fusion systems use immunological methods such as e.g. B. the "enzyme-linked immunosorbent assay” (ELISA) or the Western blot, in which recombinantly formed fusion proteins are detected with the help of specific antibodies.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Western blot in which recombinantly formed fusion proteins are detected with the help of specific antibodies.
  • Corresponding fusion proteins not only have the described advantage that the foreign protein can be easily detected and analyzed indirectly, but they often make it possible to express the desired protein in higher yields than would be the case without its fusion partner.
  • Each fusion partner has advantages in a certain expression system, which he is often able to transfer to the other partner. For example, the sensitivity of some proteins to protolytic degradation can be reduced if it is present as a fusion protein. Fusion proteins also often have more favorable solubility and secretion properties than the individual components. There are therefore numerous reasons for performing gene fusions for the expression of recombinant proteins in heterologous hosts.
  • test systems differ considerably in time, throughput and sensitivity.
  • fusion proteins Two types can be distinguished for the purposes mentioned above. Firstly, fusion proteins, which consist of the desired protein and a mostly short oligopeptide. This oligopeptide ("tag”) acts as a marker or recognition sequence for the desired protein. In addition, one day can make cleaning easier.
  • tag oligopeptide
  • His tag which consists of a peptide sequence with six successive histidine residues, which is linked directly to the recombinant protein. With the help of the attached His residue, the fusion protein can be easily purified via a metal affinity column (Smith et al., 1988). This His tag is easily detected with the aid of the highly specific monoclonal antibody His-1 (Pogge v. Strandmann et al., 1995).
  • GFP green fluorescent protein
  • Aepuorea victoria Another marker used in fusion proteins is GFP, a "green fluorescent protein” (GFP) from the jellyfish Aepuorea victoria, which is used as a bioluminescent protein in various biotechnological applications (Kendali and Badminton, 1998; Chalfie et al. , 1994; Inouye et al., 1994). Because of its autofluorescence zenz are easily detected in living cells, gels and even living animals.
  • tags that are not to be explained in more detail are the strep tag system (Uhlen et al., 1990) or the myc epitope tag (Pitzurra et al., 1990).
  • fusion proteins which consist of a recombinant protein and a functionally active protein, lies, in addition to the detection described above, in the simplified purification of the expressed fusion proteins.
  • Various systems are known, some of which will be briefly mentioned below.
  • fusion vectors enable the expression of complete genes or gene fragments in fusion with glutathione-S-transferase.
  • the GST fusion protein can easily be purified from the cell lysates by affinity chromatography on glutathione-Sepharose (Smith, Johnson, 1988). Biochemical and immunological detection is available.
  • MBP maltose-binding protein
  • MBP is a periplasmic protein from E. coli, which is involved in the transport of maltose and maltodextrins through the bacterial membrane (Kellermann et al., 1982). It was mainly used for expression and purification of alkaline phosphatase on a cross-linked amylose column.
  • the Intein system is especially suitable for the rapid purification of a target protein.
  • the inteingen has the sequence for the intein-chitin binding domain (CBD), whereby the fusion protein can be bound to a chitin column directly from the cell extract and thus purified (Chong et al., 1997).
  • CBD intein-chitin binding domain
  • Glucose dehydrogenase is a key enzyme during the early phase of spore formation in Bacillus megaterium (Jany et al., 1984). It specifically catalyzes the oxidation of ß-D-glucose to D-gluconolactone, with NAD + and NADP + acting as coenzymes. In addition to bacterial spores, the enzyme is also found in mammalian liver. There are two in B. megaterium M1286 mutually independent glucose dehydrogenase genes (gdh) (Heilmann et al., 1988).
  • GdhA and gdhB differ considerably in their nucleotide sequence, whereas GIcDH-A and GIcDH-B have approximately the same substrate specificity despite different protein sequences. Further information and the corresponding DNA and amino acid sequences are also z.
  • fusion proteins which contain GIcDH or a sequence which have the biological activity of GIcDH are outstandingly suitable for detecting any desired “foreign or target protein” more quickly, simply and thus more efficiently than with the prior art described .
  • This property is based on the surprising finding that GIcDH retains its enzymatic activity under conditions under which other enzymes are inactivated (e.g. in SDS-PAGE).
  • glucose dehydrogenase therefore facilitates purification of the fusion protein in an egg-like state due to its affinity for dyes immobilized on a gel, for example, which are commercially available. step.
  • GIcDH can be detected as a component of a fusion protein by coupling the enzymatic reaction to a sensitive color reaction, preferably with iodophenylnitrophenylphenyltetrazolium salt (INT) or nitroblue tetrazoium salt (NBT) (under the conditions mentioned), as a result of which the indirect detection of the foreign protein is further simplified.
  • the staining method for GIcDH as a marker enzyme also has the advantage that it does not hinder the usual staining of proteins with, for example, Coomassie dyes or silver staining in the same gel.
  • the fusion protein in addition to GIcDH and the foreign protein, additionally consists of a tag peptide, which can be used for additional characterizations of the proteins bound to the tag peptide.
  • the characterization takes place, for example, via the polyhistidine tag, which is recognized as an antigen by specific antibodies.
  • the detection of the resulting antigen-antibody complex is then carried out, for example, with the aid of a peroxidase (POD) -labeled antibody using methods known per se.
  • POD peroxidase
  • the bound peroxidase creates a chemiluminescent product after adding an appropriate substrate (e.g. ECL system, Western Exposure Chemiluminescent Detection System, Amersham), which can be detected with a suitable film.
  • the immunological detection can also be carried out using a special antibody tag, e.g. B. the myc day.
  • a special antibody tag e.g. B. the myc day.
  • the polyhistidine tag alone or in combination with the myc tag, has the additional advantage that the fusion protein can be purified by binding to a metal chelate column.
  • the GIcDH fusion protein can also be linked directly to a specific anti-GIcDH antibody, e.g. was immobilized on a chromatographic gel such as agarose, purified or isolated using affinity chromatography.
  • GIcDH can be expressed in high yield in soluble form, preferably in E. coli using the known expression systems (see above). So was recombinant glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium M1286 successfully expanded in E. coli with high enzymatic activity (Heilmann 1988). The expression of other eukaryotic genes in E. coli is often limited by the instability of the polypeptide chain in the bacterial host. Incorrect folding can lead to aggregation ("inclusion bodies"), reduced or missing biological activity and proteolytic degradation.
  • a corresponding fusion gene in which the GIcDH gene or a fragment with biological activity of GIcDH has been ligated to the gene of the desired foreign protein can now be converted into the fusion protein according to the invention with an almost unchanged expression rate and yield compared to the GIcDH gene without a fusion partner .
  • This can also take place if the foreign protein cannot be expressed on its own or only in reduced yields or only in an incorrectly folded state or only using additional techniques.
  • the desired foreign protein can thus be obtained by subsequent cleavage of the marker protein GIcDH or the target protein, for example with endoproteases.
  • tridegin serves as an example of a target protein which can be successfully expressed in E. coli as a fusion protein together with GIcDH.
  • Tridegin is an extremely effective peptide inhibitor for the blood coagulation factor Xllla and comes from the leech Haementeria ghilianii (66 AS, 7.6 kD; Finney et al., 1997).
  • the invention is not limited to the expression of the fusion proteins according to the invention in E. coli. Rather, such proteins can also advantageously be synthesized in mammalian, yeast or insect cells with good expression rates using methods known per se and corresponding stable vector constructions (e.g. using the human cytomegalovirus (CMV) promoter).
  • CMV human cytomegalovirus
  • the invention thus relates to a recombinant fusion protein consisting of at least a first and a second amino acid sequence, the first sequence having the biological activity of glucose dehydrogenase.
  • the invention relates in particular to a corresponding recombinant fusion protein, in which said second sequence is any recombinant protein / polypeptide X or represents parts thereof.
  • the fusion proteins according to the invention can additionally contain recognition sequences, in particular tag sequences.
  • the invention thus also relates to a corresponding fusion protein which can additionally have at least one further recognition sequence or tag sequence suitable for the detection.
  • the fusion proteins according to the invention can be used in various ways.
  • the properties of glucose dehydrogenase play a decisive role here.
  • the invention thus relates to the use of glucose dehydrogenase as a detector protein for any recombinant protein / polypeptide X in one of said fusion proteins.
  • the invention furthermore relates to the use of glucose dehydrogenase in a detection system for the expression of a recombinant protein / polypeptide X as part of a corresponding fusion protein.
  • the invention furthermore relates to the use of GlcDH for the detection of protein-protein interactions, one partner corresponding to the recombinant protein / polypeptide X, as defined above and below.
  • GIcDH can serve as a detector protein for any third protein / polypeptide which is not part of the fusion protein but is able to bind to the second sequence of the protein / polypeptide X of said fusion protein.
  • GIcDH can be used as a marker protein by a partner in ELISA systems, Western blot and related systems. Since it uses recombinant techniques, the invention naturally also includes corresponding vectors, host cells and expression systems.
  • the invention also relates to the use of appropriate expression vectors in optimizing the expression of a recombinant protein / polypeptide X in a recombinant production process and the use of a corresponding host cell in optimizing the expression of a recombinant protein / polypeptide X. in such a manufacturing process.
  • the invention also relates to a method for the rapid detection of any recombinant protein / polypeptide X by means of gel electrophoresis, in particular SDS-PAGE gel electrophoresis, a corresponding fusion protein being produced, separated by means of gel electrophoresis and the recombinant protein / polypeptide to be detected in the gel via the enzyme activity of the Glucose dehydrogenase is made visible.
  • a color reaction based on tetrazolium salts in particular iodophenylnitrophenylphenyltetrazolium salt (INT) or nitroblue tetrazolium salt (NBT), is used to detect the enzyme activity of glucose dehydrogenase, with a color reaction possibly occurring before or after said color reaction general protein staining can follow according to the prior art.
  • tetrazolium salts in particular iodophenylnitrophenylphenyltetrazolium salt (INT) or nitroblue tetrazolium salt (NBT)
  • Fig. 1 Construction scheme of the vector pAW2.
  • the vector contains the
  • Fig. 2 Construction scheme of the vector pAW3.
  • Fig. 3 Construction scheme of the vector pAW4.
  • the vector contains the
  • GIcDH Sequence for GIcDH and tridegin. The full sequence is in Seq. Id. No. 3 shown.
  • Fig. 4 Staining GIcDH on an SDS-PAA gel. The dyeing method is described in more detail in the examples. 1_: rainbow marker; 2: 0.1 ⁇ g GIcDH; 3: 0.05 ⁇ g GIcDH; 4: 0.001 ⁇ g GIcDH; 5: Lysate HC11 cells; 6: Prestained SDS marker.
  • Fig. 5 Detection of the expressed GIcDH enzyme (15% SDS-PAA gel,
  • Fig. 6 Dilution series from pAW2 expression (15% SDS-PAA gel, INT-
  • 1_ rainbow marker
  • 2 10 ul cell extract / 100 ul suspension
  • 3 10 ul cell extract / 1: 5 dilution
  • 4 10 ⁇ l cell extract / 1:10 dilution
  • 5 10 ul cell extract / 1:20 dilution
  • 6 0.5 ⁇ g GIcDH
  • 7 broad-range SDS marker
  • 8 Prestained SDS marker
  • Cell extract volume 100 ⁇ l.
  • Fig. 7 Detection of the expressed tridegin / GIcDH fusion protein (10%
  • Fig. 8 Immunodetection of tridegin / His- and tridegin / His / GIcDH-
  • Fusion protein (from 10% SDS-PAA gel, ECL detection) and comparison with Trideegin / His / GIcDH (10% SDS-PAA gel, INT-CBB staining); 1: broad range marker; 2: 1 ml cell extract (pAW2 expression); 3: 100 ⁇ l cell extract (pST106-
  • Fig. 9 SDS gel, which illustrates the sensitivity of the detection of GIcDH. 1, 5, 10, 25, 50 ng GIcDH and molecular weight markers are shown (left column).
  • GIcDH glucose dehydrogenase protein
  • gdh glucose dehydrogenase gene
  • NAD Nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate), free acid Od x optical density at x nm ompA outer membrane protein A ori origin of replication
  • RNAse ribonuclease rpm revolutions per minute rRNA ribosomal RNA
  • the methods and techniques used in this invention are well known and described in the relevant literature.
  • the disclosure content of the above-mentioned publications and patent applications especially by Sambrook et al. and Harlow & Lane and EP-B-0290 768 according to the invention.
  • the plasmids and host cells used according to the invention are generally exemplary and can in principle be replaced by modified or differently constructed vector constructions or other host cells, provided that they still have the constituents essential to the invention.
  • the production of such vector constructions as well as the transfection of corresponding host cells and the expression and purification of the desired proteins largely correspond to known standard techniques and can also be modified within a wide range according to the invention.
  • the Bacillus megaterium GIcDH structural gene was modified by means of PCR, the plasmid pJH115 (EP 0290 768) acting as a template.
  • the amplified fragment (0.8 kb) which had a Pstl and an Eco47lll recognition sequence at one end, was digested with these enzymes and cloned in the cytoplasmic (pRG45) or periplasmic (pST84) E. coli expression vector ( Fig1, 2).
  • the resulting plasmids, pAW2 and pAW3 now had a GIcDH gene that encodes a protein of approximately 30 kD (261 AS) and is below the strong Tet promoter.
  • the cytoplasmic pAW2 expression vector has a size of approx. 4 kb.
  • the periplasmic pAW3 secretion vector is slightly larger and differs from pAW2 only in one omp A- upstream of the multiple cloning site (MCS).
  • Both vectors also have an MCS with 12 different restriction sites, which in frame cloning with the subsequent enable his day.
  • the polyhistidine (6His) Taq makes it possible to purify the recombinant protein on a metal affinity column.
  • the vector pAW4 finally contains the tridegin gene and the GIcDH gene, which were linked to one another via an MCS, and the polyhistidine (6 His) tag, which is ligated downstream with the GIcDH gene.
  • the individual constructions are shown in Figs. 1, 2 and 3.
  • the selected plasmid constructions are only exemplary and do not limit the invention. They can be replaced by other suitable constructions which contain the DNA sequences mentioned.
  • the preparation of the vectors, the clones and the expression of the proteins is further specified in the examples.
  • the activity staining sensitivity was carried out in the reduced SDS gel for native GlcDH.
  • the SDS gel shown in Fig. 3 was obtained.
  • the GIcDH could be detected up to a concentration of 50 ng.
  • the negative control in which there is no GIcDH, shows no band as expected.
  • Cell extract can be used directly in SDS-PAGE (1 h) l
  • the plasmid pAW2 / clone 9 (pAW2 / K9) was transformed into the competent E. coli expression strain W3110 and two clones from the obtained transformation plate were used to inoculate a 5 ml preculture.
  • the anhydrotetracycline induction took place 2 hours after the inoculation of the main culture.
  • the entire expression lasted 5 h and was terminated at an OD value of 1.65 for clone 1 and 1.63 for clone 2.
  • a strong GleDH band (approx. 35 kD) from 1 ml cell suspension could be detected per clone.
  • the Haemente ⁇ a g an / VTridegin structural gene with coupled His tag was modified by PCR, the plasmid pST106 acting as a template.
  • the resulting plasmid pAW4 now had a tridegin-His-GlcDH fusion protein gene which codes for a protein of approximately 44 kD and is below the strong Tet promoter.
  • the sensitivity and specificity of the GIcDH fusion protein detection enable a quick and easy screening of recombinant foreign proteins.
  • the sensitivity of the GIcDH detection system was determined using native GIcDH.
  • the proof of activity of the native GIcDH showed a red-violet colored band at approx. 30-35 kD in the SDS-PAA gel.
  • the cytoplasmic expression in the E. coli strain W3110 of the recombinant GIcDH from pAW2 gave the same molecular weight.
  • the sensitivity comparison of the native GIcDH to the recombinant GIcDH could be done by comparing the band intensities.
  • the developed test system (see examples) also offers the possibility of double staining of the SDS gels.
  • the specific detection of the GIcDH bands takes place.
  • a conventional protein staining e.g. B. Coomassie staining of the remaining proteins take place.
  • the GIcDH Under reducing conditions in the presence of SDS, the GIcDH surprisingly maintains its full activity in accordance with the invention, which enables rapid detection in the SDS gel.
  • GIcDH activity detection it is also possible to increase the sensitivity of the GIcDH activity detection by using nitroblue tetrazolium salt (NBT) as a substrate for the GIcDH.
  • NBT nitroblue tetrazolium salt
  • the reaction rate of GIcDH detection using INT can, however, be further increased by using Triton X-100 (1% final solution) or adding NaCl (1 M final solution).
  • the recombinant fusion proteins Tridegin / His and Tridegin / His / GleDH were obtained by expression of the pST106 and pAW4 plasmids (Fig. 1, 2). After cell disruption of the respective expression batch, the samples were separated in the SDS-PAGE and transferred to a membrane.
  • the tridegin-His-GIcDH fusion protein was able to be immunologically immunized via its His tag by using an anti- RGS * His antibody in a Western blot.
  • the anti- RGS 'His antibody was able to detect a band at approx. 37 kD and another band at approx. 43 kD for the recombinant tridegin / His / GIcDH fusion protein (Fig. 6).
  • a comparison of the band sizes obtained with the bands obtained after activity staining in the SDS gel shows that the 43 kD band is the tride- gin-His-GIcDH fusion protein and the 37 kD band is the His-GIcDH degradation product of the entire fusion protein.
  • the calin / His tag protein resulted in a band of approximately 26 kD.
  • the somewhat smaller recombinant tridegin / His tag protein resulted in a band with approximately 23 kD, as well as further bands which indicate a binding of the His antibody to other expressed proteins.
  • the immunological detection with the anti- RGS 'His antibody thus proves that the protein detected at 43 kD and the protein at 37 kD contained a His tag.
  • this protein size corresponded approximately to the theoretical size (36.5 kD) of the GIcDH protein with coupled His tag.
  • the biological activity of the tridegin as part of the tridegin-GIcDH fusion protein was examined. This test is based on the inhibition of factor Xllla by native glandular homogenate from leeches or purified tridegin (Finney et al., 1997). The modified test is described in the examples. As a control, the corresponding fusion protein was expressed from pST106 and the GIcDH protein from pAW2.
  • the GIcDH fusion system according to the invention is shown in E. coli as shown in Table 2.
  • the N-terminal fusion protein can be cleaved from the C-terminal target or foreign protein (Collins-Racie et al., 1995).
  • a very great advantage of the GlcDH detection system according to the invention is the fact that no antibodies or other materials such as membranes, blot apparatus, development, etc. machine with films, microtiter plates, titer plate reader, etc. are required. This makes the detection of recombinant fusion proteins with the GIcDH system much cheaper and faster.
  • the corresponding size of the fusion protein can also be determined directly in the SDS-PAA gel without transfer to a membrane. If the activity of the GIcDH is detectable in the fusion protein, the fusion partner should generally also be functionally active. GIcDH does not disturb the folding of the fusion partner.
  • Table 3 an efficient method for obtaining and detecting a fusion protein obtained in E. coli was selected from the literature, which shows the advantages of the GIcDH fusion protein system according to the invention in a comparison.
  • the GIcDH fusion protein system according to the invention is also particularly suitable for increasing the solubility of proteins which are formed as inclusion bodies, particularly in E. coli, and which therefore make subsequent protein purification difficult and expensive. Normally, proteins that have been created as inclusion bodies have to be converted into their native state by complex processes. This does not apply when using the fusion proteins according to the invention.
  • Sensitive GIcDH-specific enzymatic color test • Sensitivity up to at least 50 ng
  • Example 1 The following examples further illustrate the invention without restricting it.
  • Example 1 Example 1 :
  • the above oligonucleotides were used (Tab. 4) -
  • the following table 5 gives an overview of the microorganisms used. All microorganisms are derived from E. coli K12 and belong to risk group 1.
  • Donor organism Expression strain M 7037 (E. coli N 4830 / pJH 115) v. 10/21/96 (Merck).
  • pJH 115 pUC derivative, 5.9 kb, 0 P L promoter, gdh, to (terminator), galk (galactosidase gene), bla (ß-lactamase gene), oh (origin of replication), 2 Hindill, 2 BamHI and one EcoRI and one Clal interface.
  • Transformation of plasmids into competent E. coli cells SOC medium: 20 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Yeast extract, 0.5 g NaCI, 0.2 g KCI ad 1 l H 2 O b i d. , autoclave. Before use, add 0.5 ml 1 M MgCl 2/1 M MgS0 4 (sterilized), 1 ml of 1 M glucose (sterile-filtered) LB (Amp) agar plates: combine 1 l LB medium (without ampicillin), 15 g agar agar, autoclave, cool to approx. 60 ° C and 1 ml ampicillin solution (100 mg / ml). Execution:
  • TOPO-TA-Cloning ® is a five-minute cloning process for PCR products amplified with Taq polymerase.
  • the TOPO-TA-Cloning ® kit (version C) from Invitrogen was developed for the direct cloning of PCR products.
  • the system uses the property of thermostable polymerases, which attach a single deoxyadenosine to the 3 'end of all duplex molecules in a PCR (3' A overhang). With the help of these 3'-A overhangs, the PCR products can be linked directly with a vector which has 3'-T overhangs.
  • the kit supplies the specially developed pCR ® 2.1 TOPO vector.
  • the 3.9 kb vector has an / acZ gene for blue / white selection, ampicillin and kanamycin resistance genes.
  • the cloning site is flanked on both sides by a unique EcoRI interface. Ligation approach:
  • the plasmid is isolated from successfully sequenced clones and transformed into the expression strain W3110
  • a clone is picked from the transformation plate and a 5 ml pre-culture is prepared with it. • Spread out the pre-culture on an LB (Amp) plate and inoculate later expressions with clones of this plate • With 1 ml of the pre-culture, the 50 ml main culture is inoculated (ratio 1:50) and the OD 60 o value is determined (reference measurement with unvaccinated LB (Amp) medium)
  • the glucose dehydrogenase band can be specifically detected in the SDS gel with the aid of iodophenylnitrophenyiphenyltetrazolium chloride (INT). This is only possible because the SDS treatment does not destroy the activity of the GIcDH.
  • the GIcDH is detected using a color reaction. The hydrogen formed in the reaction is transferred to the tetrazolium salt INT, producing a violet formazan. Phenanzin methosulfate serves as an electron carrier.
  • Reaction buffer (0.08% INT, 0.005% phenanzin methosulfate, 0.065% NAD, 5% Glc in 0.1 M Tris / HCl (pH 7.5)
  • Proteins that are linked to a His tag are detected indirectly with two antibodies.
  • the anti- RGS 'His Antibody QIAGEN
  • QIAGEN The anti- RGS 'His Antibody
  • the detection of the resulting antigen-antibody complex is then carried out using the Peroxidase (POD) -labeled AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H + L) antibody.
  • POD Peroxidase
  • the bound peroxidase creates a chemiluminescent product after adding the ECL-substrate mixture, which can be detected with a high-performance chemiluminescence film.
  • Ponceau S solution (0.5% Ponceau S, 7.5% TCA) 1.25 g Ponceau S 18.75 g TCA to 250 ml bidist. Fill up with water. 10x PBS buffer pH 7.4
  • the buffer is used in the 1x concentration.
  • POD-labeled AK 1: 1000 diluted in PBS / 5% skimmed milk powder (new tube) incubate at 37 ° C for 1 h
  • Tridegin detection by inhibition of factor Xllla (method according to Finney et al., 1997, modified according to the invention):
  • synthetic amines are also incorporated into suitable protein substrates. These synthetic amines have intramolecular markers that enable detection.
  • the amine incorporation test is a solid phase test. The titer plates are coated with casein.
  • the substrate biotinamidopentyiamine is incorporated into this casein by factor Xllla.
  • the casein-biotinamidopentylamine product can be produced by the fusion protein streptavidin-alkaline phosphatase (Strep / AP) be detected. This "sandwich” can be done by detecting the phosphatase activity using p-nitrophenyl phosphate. The following reaction takes place:
  • the formation of the 4-nitrophenolate is determined photometrically at 405 nm and is directly proportional to the AP activity. Due to the high affinity of biotin and streptavidin, the phosphatase activity is also proportional to the factor Xllla activity, ie the stronger the absorption (yellowing) the greater the factor Xllla activity (Janowski, 1997).
  • EDTA is a non-specific inhibitor for factor Xllla, whose cofactor Ca 2+ is bound by EDTA in a chelate complex. For this reason, the protein samples used must not contain EDTA and have been pretreated with an EDTA-free protease inhibitor cocktail (Boehringer). Wash buffer: 100 mM Tris / HCl, pH 8.5
  • Solution A Dissolve 0.5% skimmed milk powder in washing buffer
  • Solution B 0.5 mM biotinamidopentylamine, 10 mM DTT, 5 mM CaCl 2 in
  • Solution C Dissolve 200 mM EDTA in washing buffer Solution D Dissolve 1.7 ⁇ g / ml streptavidin-alkaline phosphatase in solution A.
  • Solution F Dissolve 1 mg / ml p-nitrophenyl phosphate, 5 mM MgCl 2 in washing buffer Coating:
  • Pre-incubation buffer 0.1 M Tris / HCl, pH 7.5 0.5 M NaCl

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue rekombinante Fusionsproteine, welche als ein Bestandteil eine Proteinsequenz mit der biologischen Aktivität von Glucose-Dehydrogenase enthalten sowie ihre Verwendung zum einfachen und effizienten Nachweis von beliebigen Proteinen/Polypeptiden in SDS-PAGE-Gelen und zur raschen Optimierung von Expressionsystemen, welche besagte Proteine/Polypeptide zu exprimieren in der Lage sind.

Description

Glucose-Dehydrogenase-Fusionsproteine und ihre
Verwendung in Expressionssystemen
Die Erfindung betrifft neue rekombinante Fusionsproteine, welche als ein Bestandteil eine Proteinsequenz mit der biologischen Aktivität von Glucose- Dehydrogenase (GIcDH) enthalten sowie ihre Verwendung zum einfachen und effizienten Nachweis von beliebigen, vorzugsweise als Fusionspartner dienenden Proteinen / Polypeptiden bzw. zur raschen Optimierung von Expressionsystemen, welche besagte Proteine / Polypeptide zu exprimieren in der Lage sind.
Dabei übernimmt die GIcDH, bzw. die Sequenz, die die biologische Aktivität von GIcDH aufweist, die Rolle eines Marker- bzw. Detektorproteins. Dieses Enzym besitzt als Besonderheit eine außerordentliche Stabilität gegenüber denaturierenden Agenzien wie SDS. GIcDH als Marker- bzw. Detektorprotein zeigt selbst nach den reduzierenden und denaturierenden Bedingungen von SDS-PAGE- Gelen eine unverminderte enzymatische Aktivität. Fusionsproteine, die GIcDH enthalten, sind daher mit einer auf diesem überraschenden Verhalten beruhenden sensitiven enzymatischen Reaktion nachzuweisen. Durch Markierung mit GIcDH kann somit auch schnell, billig und effektiv das gewünschte exprimierte Protein nachgewiesen werden.
Darüber hinaus können in einer Reihe von Fällen insbesondere in E. coli (GIcDH- Protein/Polypeptid-Fusionsproteine, , in höherer Ausbeute und Stabilität expri- miert werden, als ohne GIcDH. Entsprechende Fusionsproteine können somit per se zur Gewinnung und Herstellung von Proteinen / Polypeptiden dienen.
Die in vivo Expression von rekombinanten Proteinen spielt eine immer größer werdende Rolle in der Biotechnologie. Die Fähigkeit, klonierte Genprodukte aus pro- und eukaryontischen Expressionsystemen wie beispielsweise Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen, zu erhalten, aufzureinigen und nachzuweisen, wird häufig auch für Studien der Proteinstruktur und -funktion, von Protein- Protein- und Protein-DNA-Interaktionen sowie Antikörperproduktion und Mutage- nese verwendet. Mit Hilfe der DNA-Rekombinationstechnik ist es möglich, natürliche Proteine gezielt zu verändern, so daß ihre Funktion verbessert oder variiert wird. Die rekombinanten Proteine werden in ständig weiterentwickelten Expressionssystemen synthetisiert, deren Optimierung an den verschiedensten Stellen im System stattfinden kann.
Der gesamte Prozeß der rekombinanten Proteinsynthese ist in zwei Abschnitte aufteilbar. In einem ersten Schritt findet die molekularbiologische Genisolierung und Expression des Zielproteins statt und im darauffolgenden Schritt der Nach- weis und die Aufreinigung aus den rekombinanten Zellen oder ihrem Wachstumsmedium. Auf molekularer Ebene wird das Gen eines Proteins in einen dafür vorgesehenen Expressionsvektor kloniert, anschließend in eine Wirtszelle (Prooder Eukaryonten-Zelle) eingeschleust und dort exprimiert. Bakterienzellen erweisen sich dabei als einfache und kostengünstige Systeme, die hohe Ausbeuten liefern. Am häufigsten wird das gramnegative Bakterium E. coli als Wirtszelle eingesetzt.
Ziel bei der Expression von Fremdgenen in E. coli ist die Gewinnung einer möglichst großen Menge an biologisch aktiven, rekombinanten Proteinen, die soge- nannte Überexpression. Bekannt ist, daß eukaryontische Fremdproteine ihre biologische Aktivität dabei durch Aggregation, als Einschlußkörperchen, durch inkorrekte Faltung oder proteolytischen Abbau verlieren können. Eine Möglichkeit, diese häufig auftretenden Schwierigkeiten zu vermeiden, bietet die Ausschleusung der exprimierten Proteine als Sekretionsproteine aus der Zelle oder aber die Verwendung sogenannter Fusionsproteine, durch die unlösliche rekom- binante Proteine in der Zelle in löslicher Form vorliegen können.
Um die Funktion von Proteinen sowie ihre für die Funktion wichtigen Interaktionspartner zu untersuchen, werden Proteine meistens in eukaryontischen Zellen ex- primiert. Dort können die für die Funktion wichtigen posttranskriptionalen Modifikationen und die richtige Kompartimentierung erfolgen. Außerdem sind andere für die korrekte Faltung und Prozessierung wichtigeProteine vorhanden. Auch bei der Expression von größeren Proteinen und von Proteinen, die post- transkriptionale Modifikationen wie etwa S-S Brückenbildung, Glykosylierung, Phosphorylierung usw. für die korrekte Faltung benötigen bieten sich eukaryonti- sche Expressionssysteme an. Da diese Systeme in der Regel aufwendig und teuer sind und die Expressionsrate unter der von E.coli liegt, ist es besonders wichtig, ein Nachweissystem zu haben, das schnell, sicher, sensitiv und preiswert ist.
Für den Nachweis von rekombinant gebildeten Fremdproteinen, deren biologi- sehe Funktion nicht bekannt ist, existieren zahlreiche Gen-Fusions-Systeme. Darin wird das exprimierte Fusionsprotein über den funktioneil bekannten Fusionsproteinanteil nachgewiesen.
Ein empfindliches Nachweissystem ist nötig, um die korrekte Exprimierung, die exprimierter Menge, das Molekulargewicht und die funktioneile Aktivität des gebildeten Fusionsproteins zu bestimmen. Die Zahl der funktioneil unbekannten Proteine nimmt immer rascher zu und es wird immer wichtiger, dafür schnelle und kostengünstige Nachweissysteme zu entwickeln. Bei den meisten Gen-Fusions- Systemen werden immunologische Verfahren wie z. B. der "enzym-linked- immuno-sorbent-assay" (ELISA) oder der Westem-Blot eingesetzt, bei denen rekombinant gebildete Fusionsproteine mit Hilfe von spezifischen Antikörpern detektiert werden.
Entsprechende Fusionsproteine haben aber nicht nur den beschriebenen Vorteil, daß das Fremdprotein indirekt leicht nachgewiesen und analysiert werden kann, sondern sie ermöglichen vielfach, das gewünschte Protein in höheren Ausbeuten zu exprimieren, als es ohne seinen Fusionspartner der Fall wäre. Jeder Fusionspartner hat in einem bestimmten Expressionssystem Vorteile, die er auf den anderen Partner nicht selten zu übertragen in der Lage ist. So kann beispielsweise die Empfindlichkeit mancher Proteine gegenüber protolytischem Abbau verringert werden, wenn es als Fusionsprotein vorliegt. Auch weisen Fusionsproteine häufig günstigere Löslichkeits- und Sekretionseigenschaften auf als die einzelnen Komponenten. Es gibt daher zahlreiche Gründe Genfusionen für die Expression rekombinanter Proteine in heterologen Wirten durchzuführen. Diese sind: Erhöhung der Löslichkeit von Fremdproteinen, Erhöhung der Stabilität von löslichen Fremdproteinen, Lokalisation des Fremdproteins in einem spezifischen Zellabschnitt, schnelle Gewinnung von Fremdproteinen durch vereinfachte Reinigungsstrategien, Möglichkeit der spezifischen Abspaltung des Fusionsproteins, schnelle Nachweismöglichkeit des Fremdproteins aus unaufgereinigten Zellextrakten.
Zur Zeit existieren viele Funktionstests zur Expressionstestung rekombinanter Proteine mit Hilfe von Gen-Fusions-Systemen. Hierbei handelt es sich um einfache Tests, die meist den direkten Nachweis aus ungereinigten Zellextrakten ermöglichen. Die Testsysteme unterscheiden sich jedoch erheblich in Zeitaufwand, Durchsatz und Sensitivität.
Für die oben genannten Zwecke können zwei Arten von Fusionsproteinen unterschieden werden. Zum einen Fusionsproteine, die aus dem gewünschten Protein und einem meist kurzen Oligopeptid bestehen. Dieses Oligopeptid ("Tag") hat die Aufgabe einer Marker- oder Erkennungssequenz für das gewünschte Protein. Zusätzlich kann ein Tag die Reinigung vereinfachen.
Die Hauptanwendung des Tag besteht einmal im Testen der Expression, zum anderen bei der Proteinreinigung. Ein Beispiel hierfür ist der sogenannte His-Tag, der aus einer Peptidsequenz mit sechs aufeinanderfolgenden Histidin-Resten besteht, die direkt mit dem rekombinanten Protein verknüpft ist. Mit Hilfe des an- gehängten His-Restes kann das Fusionsprotein leicht über eine Metall- Affinitätssäule gereinigt werden (Smith et al., 1988). Eine einfache Detektierung dieses His-Tags findet mit Hilfe des hoch spezifischen monoklonaien Antikörpers His-1 statt (Pogge v. Strandmann et al., 1995). Ein weiterer in Fusionsproteinen verwendeter Marker ist das GFP, ein aus der Qualle Aepuorea victoria stammen- des "green fluorescent protein" (GFP), das als Biolumineszenz-Protein in diversen biotechnologischen Anwendungen eingesetzt wird (Kendali und Badminton, 1998; Chalfie et al., 1994; Inouye et al., 1994). Es kann durch seine Autofluores- zenz einfach detektiert werden in lebenden Zellen, Gelen und sogar lebenden Tieren.
Weitere Beispiele für Tags, die nicht näher erläutert werden sollen, sind das Strep-Tag-System (Uhlen et al., 1990) oder das myc-Epitop-Tag (Pitzurra et al., 1990).
Die Hauptanwendung von Fusionsproteinen, die aus einem rekombinanten Protein und einem funktionell aktiven Protein bestehen, liegt neben dem oben be- schriebenem Nachweis in der vereinfachten Reinigung der exprimierten Fusionsproteine. Verschiedene Systeme sind hierunter bekannt, von denen einige nachfolgend kurz erwähnt werden sollen.
Im GST-System ermöglichen Fusionsvektoren die Expression von kompletten Genen oder Genfragmenten in Fusion mit Glutathion-S-transferase. Durch Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose kann das GST-Fusionsprotein leicht aus den Zelllysaten aufgereinigt werden (Smith, Johnson, 1988). Es ist ein biochemischer und ein immunologischer Nachweis verfügbar. Im MBP-System ist das Maltose bindende Protein (maltose-binding protein, MBP) ein periplasmati- sches Protein aus E.coli, das am Transport von Maltose und Maltodextrinen durch die Bakterienmembran beteiligt ist (Kellermann et al., 1982). Es wurde vor allem für Expression und Reinigung von alkalischer Phosphatase an einer quervernetzten Amylose-Säule verwendet. Das Intein-System ist speziell für die schnelle Aufreinigung eines Target-Proteins geeignet. Das Inteingen besitzt die Sequenz für die Intein-Chitin Bindungs Domäne (CBD), wodurch das Fusionsprotein direkt aus dem Zellextrakt an eine Chitinsäule gebunden und damit aufgereinigt werden kann (Chong et al., 1997).
Glucose-Dehydrogenase (GIcDH) ist ein Schlüsselenzym während der frühen Phase der Sporenbildung bei Bacillus megaterium (Jany et al., 1984). Es katalysiert spezifisch die Oxidation von ß-D-Glucose zu D-Gluconolacton, wobei NAD+ bzw. NADP+ als Coenzym fungieren. Außer in Bakteriensporen, kommt das Enzym auch in der Säugetierleber vor. Es existieren in B. megaterium M1286 zwei voneinander unabhängige Glucose-Dehydrogenase-Gene (gdh) (Heilmann et al., 1988). GdhA und gdhB unterscheiden sich in ihrer Nucleotid-Sequenz erheblich, wogegen GIcDH-A und GIcDH-B trotz unterschiedlicher Proteinsequeπz annähernd die gleiche Substratspezifität besitzen. Weitere Angaben sowie die ent- sprechenden DNA- und Aminosäuresequenzen sind auch z. B. der EP-B-0290 768 zu entnehmen.
Die oben beschriebenen Systeme für den Nachweis von rekombinant gebildeten Fremdproteinen, deren biologische Funktion entweder nicht oder nur unzurei- chend bekannt ist, sind meist kompliziert und zeitaufwendig. Dadurch ist die Verbesserung und Optimierung der Expressionsbedingungen oft nicht schnell oder einfach genug möglich.
Deshalb stellt es einen großen Fortschritt dar, einen Fusionsproteinpartner ent- wickelt zu haben, der einen schnelleren Nachweis des Fusionsproteins ermöglicht, bzw. die im Stand der Technik beschriebenen Nachteile vergleichbarer Systeme nicht aufweist.
Es wurde nun gefunden, daß Fusionsproteine, die GIcDH oder eine Sequenz, welche die biologische Aktivität von GIcDH aufweisen, hervorragend geeignet sind, um ein beliebiges gewünschtes "Fremd- oder Zielprotein" rascher, einfacher und damit effizienter nachzuweisen als mit dem beschriebenen Stand der Technik. Diese Eigenschaft beruht auf der überraschenden Erkenntnis, daß GIcDH seine enzymatische Aktivität unter Bedingungen, unter denen andere Enzyme inaktiviert werden (z. B. bei SDS-PAGE), behält.
Bekannt ist die Möglichkeit, Dehydrogenasen aufzureinigen über immobilisierte Farbstoffe wie Cibachron Blue 3 G oder andere NAD analoge Verbindungen wie Aminohexyl-AMP, welche durch ihre Struktur dem Coenzym NAD+ ähnlich sind und gleichfalls an alle Dehydrogenasen binden.
Als Teil eines Fusionsproteins erleichtert deshalb Glucose-Dehydrogenase aufgrund seiner Affinität zu diesen z.B. an einem Gel immobilisierten Farbstoffen, welche kommerziell erhältlich sind, die Aufreinigung des Fusionsproteins in ei- nem Schritt. Ferner kann GIcDH als Bestandteil eines Fusionsproteins durch die Kopplung der enzymatischen Reaktion an eine sensitive Farbreaktion, vorzugsweise mit lodphenylnitrophenyl-phenyltetrazolium-Salz (INT) oder Nitroblau- tetrazoiium-Salz (NBT) (unter den genannten Bedingungen) nachgewiesen wer- den, wodurch sich der indirekte Nachweis des Fremdproteins weiter vereinfacht. Die Anfärbungsmethode für GIcDH als Markerenzym hat zudem den Vorteil, daß sie die übliche Anfärbung von Proteinen mit z.B. Coomassie-Farbstoffen oder Silberfärbung im selben Gel nicht behindert.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das Fusionsprotein neben GIcDH und dem Fremdprotein noch zusätzlich aus einem Tag-Peptid, welches für zusätzliche Charakterisierungen der an das Tag-Peptid gebundenen Proteine verwendet werden kann. Die Charakterisierung erfolgt zum Beispiel über den Polyhistidin-Tag, der von spezifischen_Antikörpern als Antigen erkannt wird. Der Nachweis des entstandenen Antigen-Antikörper-Komplexes erfolgt dann beispielsweise mit Hilfe eines Peroxidase (POD)-markierten Antikörpers nach an sich bekannten Methoden. Durch die gebundene Peroxidase entsteht nach Zugabe eines entsprechenden Substrats (z.B. ECL-System, Western Exposure Chemiluminescent Detektion System, Fa. Amersham) ein chemilumineszierendes Produkt, das mit einem hierfür geeigneten Film detektiert werden kann. Der immunologische Nachweis kann aber auch nach an sich bekannter Technik durch ein spezielles Antikörper-Tag, z. B. dem myc-Tag, erfolgen. Der Polyhistidin-Tag, allein oder in Kombination mit dem myc-Tag, hat überdies den Vorteil, daß das Fusionsprotein durch Bindung an einer Metall-Chelatsäule aufgereinigt werden kann.
Das GIcDH-Fusionsprotein kann aber auch direkt an einen spezifischen anti- GIcDH-Antikörper, der z.B. auf einem Chromatographiegel wie Agarose immobilisiert wurde, mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt bzw. isoliert werden.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, daß GIcDH vorzugsweise in E. coli durch die bekannten Expressionssysteme (s. oben) in hohen Ausbeuten in löslicher Form exprimiert werden kann. So wurde rekombinante Glucose-Dehydrogenase aus Bacillus megaterium M1286 erfolgreich in E. coli mit hoher enzymatischer Aktivität exp hm iert (Heilmann 1988). Die Expression anderer eukaryontischer Gene in E. coli ist oft durch die Instabilität der Polypeptidkette im bakteriellen Wirt begrenzt. Eine inkorrekte Faltung kann zu Aggregation ("inclusion bodies"), ver- minderter oder fehlender biologischen Aktivität und proteolytischen Abbau führen. Ein entsprechendes Fusionsgen, bei dem das GIcDH-Gen oder ein Fragment mit biologischer Aktivität von GIcDH an das Gen des gewünschten Fremdproteins ligiert wurde, kann nun erfindungsgemäß mit nahezu unveränderter Expressionsrate und Ausbeute, verglichen mit dem GIcDH-Gen ohne Fusionspartner, zum Fusionsprotein umgesetzt werden. Dies kann auch dann erfolgen, wenn das Fremdprotein allein an sich nicht oder nur in verminderten Ausbeuten oder nur in inkorrekt gefaltetem Zustand oder nur unter Anwendungen zusätzlicher Techniken exprimiert werden kann. Durch anschließende Abspaltung des Markerproteins GIcDH bzw. des Zielproteins beispielsweise mit Endoproteasen kann somit das gewünschte Fremdprotein erhalten werden.
Als Beispiel für ein Zielprotein, welches als Fusionsprotein zusammen mit GIcDH erfolgreich in E. coli exprimiert werden kann, dient erfindungsgemäß Tridegin. Tridegin ist ein extrem wirksamer Peptid-Inhibitor für den Blutgerinnungsfaktor Xllla und stammt aus dem Blutegel Haementeria ghilianii (66 AS, 7,6 kD; Finney et al., 1997).
Erfindungsgemäß sind aber keinerlei Einschränkungen in bezug auf die Art und die Eigenschaften des eingesetzten Fremdproteins zu nennen.
Die Erfindung beschränkt sich nicht nur auf die Expression der erfindungsgemäßen Fusionsproteine in E. coli. Vielmehr können derartige Proteine auch vorteilhaft mittels an sich bekannter Methoden und entsprechender stabiler Vektorkonstruktionen (z. B. mit Hilfe des humanen Cytomegalovirus (CMV)-Promotors) in Säuger-, Hefe- oder Insektenzellenmit guten Expressionsraten synthetisiert werden. Aus dem oben beschriebenen kann die Erfindung demnach wie folgt, bzw. wie in den Patentansprüchen angegeben, zusammenfassend charakterisiert werden:
Gegenstand der Erfindung ist somit ein rekombinantes Fusionsprotein, bestehend aus mindestens einer ersten und zweiten Aminosäuresequenz, wobei die erste Sequenz die biologische Aktivität von Glucose-Dehydrogenase aufweist. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein entsprechendes rekombinantes Fusionsprotein, bei dem die besagte zweite Sequenz ein beliebiges rekombinantes Protein / Polypeptid X ist oder Teile davon darstellt.
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können zusätzlich Erkennungssequenzen, insbesondere Tag-Sequenzen enthalten. Gegenstand der Erfindung ist somit ferner ein entsprechendes Fusionsprotein, welches zusätzlich mindestens eine weitere für die Detektion geeignete Erkennungssequenz oder Tag-Sequenz aufweisen kann.
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können verschiedenartig eingesetzt werden. Dabei spielt die Glucose-Dehydrogenase mit ihren Eigenschaften die entschiedende Rolle. So ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung von Glu- cose-Dehydrogenase als Detektorprotein für ein beliebiges rekombinantes Protein / Polypeptid X in einem der besagten Fusionsproteine. Weiter ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung von Glucose-Dehydrogenase in einem Nachweissystem für die Expression eines rekombinanten Proteins / Polypeptids X als Bestandteil eines entsprechenden Fusionsproteins. Ferner ist Gegenstand der Er- findung die Verwendung von GlcDH zum Nachweis für Protein-Protein Interaktionen, wobei ein Partner dem rekombinanten Protein / Polypeptid X , wie oben und unten definiert, entspricht. Schließlich kann GIcDH entsprechend der Erfindung als Detektorprotein für ein beliebiges drittes Protein / Polypeptid dienen, welches nicht Bestandteil des Fusionsproteins ist, aber an die zweite Sequenz des Proteins / Polypetids X des besagten Fusionsproteins zu binden vermag. Ferner kann GIcDH als Markerprotein von einem Partner in ELISA-Systemen, Western-blot und verwandten Systemen eingesetzt werden. Die Erfindung umfaßt, da sie rekombinante Techniken einsetzt, natürlich auch entsprechende Vektoren, Wirtszellen und Expressionssysteme. Gegenstand der Erfindung ist neben diesen Vektoren und Wirtszellen als solche auch die Verwendung entsprechender Expressionsvektoren bei der Optimierung der Expres- sion eines rekombinanten Proteins / Polypeptids X in einem rekombinanten Herstellungsverfahren sowie die Verwendung einer entsprechenden Wirtszelle bei der Optimierung der Expression eines rekombinanten Proteins / Polypeptids X in einem solchen Herstellungsverfahren.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum schnellen Nachweis eines beliebigen rekombinanten Proteins / Polypeptids X mittels Gelelektrophorese, insbesondere SDS-PAGE-Gelelektrophorese, wobei ein entsprechendes Fusionsprotein hergestellt, mittels Geielektrophorese aufgetrennt wird und das nachzuweisende rekombinante Protein / Polypeptid im Gel über die Enzymaktivität der Glucose-Dehydrogenase sichtbar gemacht wird.
Erfindungsgemäß wird dabei zum Nachweis der Enzymaktivität der Glucose- Dehydrogenase eine Farbreaktion auf Basis von Tetrazoliumsalzen, insbesondere lodphenylnitrophenyl-phenyltetrazolium-Salz (INT) oder Nitroblau-tetrazolium- Salz (NBT), eingesetzt, wobei sich gegebenenfalls vor oder nach der besagten erfolgten Farbreaktion eine generelle Proteinanfärbung gemäß des Standes der Technik anschließen kann.
Im folgenden sind die Abbildungen kurz erklärt:
Abb. 1 : Konstruktionsschema des Vektors pAW2. Der Vektor enthält die
Sequenz für GIcDH. Die vollständige Sequenz ist in Seq. Id. No. 1 dargestellt.
Abb. 2: Konstruktionsschema des Vektors pAW3. Abb. 3: Konstruktionsschema des Vektors pAW4. Der Vektor enthält die
Sequenz für GIcDH und Tridegin. Die vollständige Sequenz ist in Seq. Id. No. 3 dargestellt. Abb. 4: Anfärbung von GIcDH auf einem SDS-PAA-Gel. Die Färbemethode ist in den Beispielen näher beschrieben. 1_: Rainbow-Marker; 2: 0,1 μg GIcDH; 3: 0,05 μg GIcDH; 4: 0,001 μg GIcDH; 5: Lysat HC11-Zellen; 6: prestained SDS- Marker.
Abb. 5: Nachweis des exprimierten GIcDH-Enzyms (15% SDS-PAA-Gel,
INT-Färbung); 1 : Rainbow-Marker; 2: 0,2 μg native GIcDH; 3: 10μl Zellextrakt / 1ml Suspension Klon 2, 4: 10μl Zellextrakt / 1 ml Suspension Klonl ; 5 : prestained SDS-Marker; Zellextraktvolumen: 100 μl.
Abb. 6: Verdünnungsreihe aus pAW2-Expression (15% SDS-PAA-Gel, INT-
Färbung); 1_: Rainbow-Marker; 2: 10 μl Zellextrakt / 100 μl Suspension; 3: 10 μl Zellextrakt / 1 :5 Verdünnung; 4: 10 μl Zeilextrakt / 1 :10 Verdünnung; 5: 10 μl Zellextrakt / 1 :20 Verdünnung; 6: 0,5 μg GIcDH; 7: Broad-Range SDS-Marker; 8: prestained SDS-Marker; Zellextraktvolumen: 100 μl.
Abb. 7: Nachweis des exprimierten Tridegin/GIcDH-Fusionproteins (10%
SDS-PAA-Gel, INT/CBB); 1: Broad-Range SDS-Marker; 2: 1 μg GIcDH; 3: 0,5 μg GIcDH; 4: 0,1 μg GIcDH; 5: 500 μl Zellextrakt; 6: 200 μl Zellextrakt; 7: 100 μl Zellextrakt; 8: 500 μl Zellextrakt (pAW2-Expression); Zellextraktvolumen: 100 μl.
Abb. 8: Immundetektion von Tridegin/His- und Tridegin/His/GIcDH-
Fusionsprotein (aus 10% SDS-PAA-Gel, ECL-Detektion) und Vergleich mit Tride- gin/His/GIcDH (10% SDS-PAA-Gel, INT-CBB-Färbung); 1 : Broad-Range-Marker; 2: 1 ml Zellextrakt (pAW2-Expression); 3: 100 μl Zellextrakt (pST106-
Expression); 4: 200 μl Zellextrakt (pST106-Expression); 5: 300 μl Zellextrakt (pAW4-Expression); 6: 2,5 μg Calin-His-Positivkontrolle; 7: Broad-Range-Marker; 8: 100 μl (pAW4-Expression); Zellextraktvolumen: 100 μl. Abb. 9: SDS-Gel, welches die Empfindlichkeit der Detektion von GIcDH verdeutlicht. Aufgetragen sind 1 , 5, 10, 25, 50 ng GIcDH sowie Molekularge- wichtsmarker (linke Spalte).
Im folgenden sind die oben und unten verwendeten Abkürzungen erläutert A Adenin
Ax Absorption bei x nm
AK Antikörper
Amp Ampicillin AP Alkalische Phosphatase
APS Ammoniumperoxodisulfat
AS Aminosäure bla ß-Lactamase-Gen
BIS N,N'-Methyienbisacrylamid bp Basenpaare
BSA Bovines (Rinder)-Serumalbumin
C Cytosin cDNA copy (complementary) DNA
CBB Coomassie Brilliant Blue CIP calf intestinal phosphatase dNTP 2'-Desoxyribonucelosid-5'-triphosphat ddNTP 2',3'-Desoxyribonuceiosid-5'-triphosphat
DMF Dimethylformamid
DMSO Dimethyl-Sulfoxid DNA Desoxyribonucleinsäure dsDNA Doppelstrang-DNA
DTT Dithiothreitol
ECL Exposure™ Chemiluminescence
EDTA Ethyiendiamin-N,N,N',N'-Tetraessigsäure, Dinatriumsalz ELISA Enzyme linked immuno sorbent assay
EtBr Ethidiumbromid
EtOH Ethanol f. c. final concentration
FACS Fluorescent activatet cell sorting G Guanin
GFP Green fluorescent protein
GIcDH Glucose-Dehydrogenase (Protein) gdh Glucose-Dehydrogenase (Gen) GST Glutathion-S-Transferase
His Histidin-Rest
HRP Horseradish peroxidase
IB Inclusion Body IgG Immunglobulin G
INT lodnitrotetrazoliumviolett kb Kilobasenpaare kD KiloDalton mA Milliampere m-RNA messenger-RNA
MBP Maltose-binding protein
MCS Multiple cloning site
Mr relatives Molekulargewicht
NAD (P) Nicotinamid-adenin-dinucleotid (-Phosphat), freie Säure Odx optische Dichte bei x nm ompA outer membrane protein A ori origin of replication
PAA Polyacrylamid
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PCR Polymerase Chain Reaction
POD Peroxidase
PVDF Polyvinylidendifluorid
RNA Ribonucleinsäure
RNAse Ribonuclease rpm Umdrehungen pro Minute rRNA ribosomale RNA
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat ssDNA Einzelstrang-DNA Strep Streptavidin
T Thymin τm Schmelzpunkt (DNA-Duplex) t-RNA transfer-RNA Taq Thermophilus aquaticus
TCA Trichloressigsäure
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
Tet Tetracyclin
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
U Unit = Einheit der Enzymaktivität
U Uracil
UV Ultraviolette Strahlung
ÜN Über Nacht
V Volt
VI S visible (sichtbarer Bereich) w/v weight per volume
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Falls nicht anderweitig dargelegt, entsprechen die bei dieser Erfindung verwendeten Methoden und Techniken hinlänglich bekannten und in der einschlägigen Literatur beschriebenen Methoden und Verfahren. Insbesondere sind die Offenbarungsgehalte der oben genannten Publikationen und Patentanmeldungen, vor allem von Sambrook et al. und Harlow & Lane sowie die EP-B-0290 768 erfindungsgemäß mit umfaßt. Die gemäß der Erfindung verwendeten Plasmide und Wirtszellen sind in der Regel exemplarisch und können im Prinzip durch modifi- zierte oder anders aufgebaute Vektorkonstruktionen oder andere Wirtszellen ersetzt werden, sofern sie noch die genannten erfindungswesentlichen Bestandteile aufweisen. Die Herstellung solcher Vektorkonstruktionen sowie die Transfektion entsprechender Wirtszellen und die Expression und Aufreinigung der gewünschten Proteine entsprechen weitgehend bekannten Standardtechniken und können erfindungsgemäß ebenfalls innerhalb eines weiten Rahmens modifiziert werden.
Im folgenden wird die Erfindung näher beschrieben. Weitere Datails sind in den Beispielen erläutert.
Das Bacillus megaterium GIcDH-Strukturgen wurde mittels PCR modifiziert, wobei das Plasmid pJH115 (EP 0290 768) als Template fungierte. Das amplifizierte Fragment (0,8 kb), das an einem Ende eine Pstl- und am anderen eine Eco47lll- Erkennungssequenz besaß, wurde mit diesen Enzymen verdaut und in den cytoplasmatischen (pRG45) oder periplasmatischen (pST84) E. coli- Expressionsvektor Moniert (Abb1 , 2). Die resultierenden Plasmide, pAW2 und pAW3, besaßen nun ein GIcDH-Gen, das ein Protein von etwa 30 kD (261 AS) verschlüsselt und unterhalb des starken Tet-Promotors liegt. Der cytoplasmati- sche pAW2-Expressionsvektor besitzt eine Größe von ca. 4 kb. Der periplasmati- sche pAW3-Sekretionsvektor ist geringfügig größer und unterscheidet sich von pAW2 nur in einer der multiple-cloning-site (MCS) vorgeschalteten omp A-
Signalsequenz, die dazu führt, daß das rekombinante Protein in das Periplasma sezerniert werden kann. Beide Vektoren besitzen zudem eine MCS mit 12 unterschiedlichen Restriktionsschnittstellen, die in frame-Klonierung mit dem nachfol- genden His-Tag ermöglichen. Durch den Polyhistidin (6His)-Taq wird die Reinigung des rekombinanten Proteins an einer Metall-Affinitätssäule möglich. Der Vektor pAW4 enthält schließlich das Tridegin-Gen und das GIcDH-Gen, welche über eine MCS miteinander verbunden wurden sowie den Polyhistidin (6 His)- Tag, der stromabwärts mit dem GIcDH-Gen ligiert ist. Die einzelnen Konstruktionen sind in den Abb. 1 , 2 und 3 dargestellt. Die gewählten Plasmidkonstruktionen sind aber nur beispielhaft und schränken die Erfindung nicht ein. Sie können durch andere geeignete Konstruktionen, welche die genannten DNA-Sequenzen enthalten, ersetzt werden. Die Herstellung der Vektoren, der Klone und die Ex- pression der Proteine ist in den Beispielen weiter spezifiziert.
Die Empfindlichkeit der Aktivitätsanfärbung wurde im reduzierten SDS-Gel für native GlcDH durchgeführt. Hierfür wurde eine Konzentrationsreihe mit der nati- ven GIcDH (c = 1 mg/ml; A = 200 U/ml) angefertigt und eine Negativkontrolle vor- bereitet. Nach SDS-PAGE und Aktivitätsanfärbung mittels INT wurde das in Abb. 3 dargestellte SDS-Gel erhalten. Mit Hilfe des eingesetzten Tests konnte die GIcDH bis zu einer Konzentration von 50 ng nachgewiesen werden. Die Negativkontrolle, in der keine GIcDH vorhanden ist, zeigt wie erwartet keine Bande auf.
Mit Hilfe von Markerproteinen läßt sich über eine Eichkurve das genaue Molekulargewicht der nativen GIcDH ermitteln. Hierfür wurden die relativen Laufstrecken der Markerproteine bestimmt und gegen deren zugehöriges logarithmisches Molekulargewicht aufgetragen. Die durchgeführten Expressionen wurden gemäß dargestellten Schema ausge- führt (Tab. 1): Tab. 1
Transformation der GlcDH-Expressionsvektoren in W3110-Zellen i Vorkultur in LB(Amp)-Medium bei 37°C (12 h) l
Zellwachstum bei 37°C in Hauptkultur mit Induktion (5 h) i Zentrifugation zur Zellmassegewinnung ,
Suspendierung der Zellen in lx SDS-Ladepuffer ,
Zellaufschluß 5 min bei 95°C i
Zellextrakt direkt in SDS-PAGE (1 h) einsetzbar l
Aktivitätsanfärbung GlcDH im SDS-Gel (30 min) i Bandenanalyse des Gels
Das Plasmid pAW2/Klon9 (pAW2/K9) wurde in den kompetenten E. coli- Expressions-stamm W3110 transformiert und zwei Klone von der erhaltenen Transformationsplatte zur Beimpfung einer 5 ml-Vorkultur verwendet. Die Anhy- drotetracyclin-lnduktion fand 2 h nach der Beimpfung der Hauptkultur statt. Die gesamte Expression dauerte 5 h und wurde bei einem OD-Wert von 1 ,65 für Klon 1 und 1 ,63 für Klon 2 abgebrochen. Nach SDS-PAGE und GIcDH- Aktivitätsanfärbung konnten je Klon eine starke GleDH-Bande (ca. 35 kD) aus 1 ml Zellsuspension nachgewiesen werden.
Bei der Durchführung von SDS-PAGE unter reduzierten und nicht reduzierten Bedingungen wurde kein Unterschied zwischen den erhaltenen GIcDH-Banden deutlich. Hierfür wurden jeweils 500 bis 100 μl der Zellsuspension im SDS-Gel durch GleDH-Aktivitätsanfärbung mit INT untersucht.
Um die Empfindlichkeit der GleDH-Aktivitätsanfärbung gegenüber der Coomas- sie-Färbung zu verdeutlichen wurden Proben aus 100 μl Zellsuspension, sowie 1/5-, 1/10- und 1/20-Verdünnungen der Zellsuspension hergestellt. Das Endvolumen der Verdünnungen betrug ebenfalls 100 μl. Mit dem erhaltenen SDS-Gel wurde nach der GleDH-Aktivitätsanfärbung eine Coomassie-Färbung durchgeführt, um weitere Proteinbanden sichtbar zu machen. Das daraus resultierende SDS-Gel ist in Abbildung 4 dargestellt. Mittels der GleDH-Aktivitätsanfärbung ist bei der 1/20-Verdünnung noch eine deutliche Bande erkennbar, wohingegen Coomassie-gefärbte Banden kaum noch wahrnehmbar sind.
Das Haementeήa g an/VTridegin-Strukturgen mit gekoppeltem His-Tag wurde mittels PCR modifiziert, wobei das Plasmid pST106 als Template fungierte. Das amplifizierte Fragment (0,25 kb), das von einer Clal- und Pstl- Erkennungssequenz flankiert wird, wurde mit diesen Enzymen verdaut und in den cytoplasmatischen E. co//-GlcDH-Fusionsvektor pAW2 Moniert. Das resultierende Plasmid pAW4 besaß nun ein Tridegin-His-GIcDH-Fusionsproteingen, das für ein Protein von etwa 44 kD codiert und unterhalb des starken Tet-Promotors liegt. Der Zellextrakt aus dem E. co//-Stamm W 3110, der das cytoplasmatische pAW4- Plasmid beinhaltet, wurde mit Hilfe der SDS-PAGE und GIcDH- Aktivitätsanfärbung analysiert. Dabei konnten mehrere rotviolett gefärbte Banden bei 35, 37, 40 und 43 kD nachgewiesen werden. Bei der 43 kD-Bande handelte es sich um das gewünschte Tridegin-His-GIcDH-Fusionsprotein, dessen Molekulargewicht jedoch etwas kleiner als der theoretische Wert von 44 kD war. Die restlichen nachweisbaren Banden wurden vermutlich durch einen proteolytischen Abbau des Fusionsproteins im E. coli erzeugt, denn die kleinste angefärbte Bande von 35 kD entspricht in etwa der Größe der GIcDH. Aufgrund eines Größen- Vergleichs konnte die gebildete 37 kD-Bande als das His-GIcDH-Abbauprodukt identifiziert werden.
Die Durchführung einer Expressionskinetik ergab, daß 2 Stunden nach der Induktion des Tet-Promotors mit Anhydrotetracyclin der proteolytische Abbau des gebildeten Fusionsproteins eintrat, d.h. ab diesem Zeitpunkt waren zusätzliche Banden im SDS-Gel durch Aktivitätsanfärbung nachweisbar. Das gebildete Fusionsprotein war nicht gegenüber den E. co//-Proteasen stabil, was sich in seinem relativ schnellen Proteinabbau zeigt. Durch den Einsatz des konstruierten peri- plasmatischen GIcDH-Fusionsvektors pAW3, konnte der proteolytische Abbau des Fusionsproteins in der Zeile vermieden werden, da hierbei das exprimierte Fusionsprotein in den periplasmatischen Zwischenraum der E. co//'-Zellen sezer- niert würde. Die E. co//-Proteasen befinden sich vornehmlich im Cytoplasma.
Die Sensitivität und Spezifität des GIcDH-Fusionsprotein-Nachweises ermöglichen ein schnelles und einfaches Screening von rekombinanten Fremdproteinen. Die Sensitivität des GIcDH-Nachweissystems wurde mit Hilfe von nativer GIcDH bestimmt. Der Aktivitätsnachweis der nativen GIcDH ergab im SDS-PAA-Gel eine rotviolett gefärbte Bande bei ca. 30-35 kD. Die cytoplasmatisehe Expression im E. coli-Stamm W3110 der rekombinanten GIcDH aus pAW2 ergab das gleiche Molekulargewicht. Der Sensitivitätsvergleich der nativen GIcDH zur rekombinanten GIcDH konnte durch einen Vergleich der Bandenintensitäten stattfinden. Das entwickelte Testsystem (siehe Beispiele) bietet zudem die Möglichkeit, eine doppelte Anfärbung der SDS-Gele durchzuführen. In der ersten Färbung findet die spezifische Detektion der GIcDH-Banden statt. Zur Hintergrundfärbung kann anschließend eine übliche Proteinfärbung, z. B. eine Coomassie-Anfärbung der restlichen Proteine stattfinden. Die GIcDH behält unter reduzierenden Bedingungen in Gegenwart von SDS überraschenderweise und erfindungsgemäß ihre vollständige Aktivität, wodurch der schnelle Nachweis im SDS-Gel ermöglicht wird.
Erfindungsgemäß ist es weiterhin möglich, die Empfindlichkeit des GIcDH- Aktivitätsnachweises, durch Verwendung von Nitroblautetrazolium-Salz (NBT) als Substrat für die GIcDH, zu steigern. Die Reaktionsgeschwindigkeit des GIcDH- Nachweises mittels INT kann jedoch durch den Einsatz von Triton X-100 (1 % Endlösung) oder NaCI-Zugabe (1 M Endlösung) weiter gesteigert werden.
Die rekombinanten Fusionsproteine Tridegin/His und Tridegin/His/GleDH wurden durch Expression des pST106- und pAW4-Plasmids gewonnen (Abb. 1 , 2). Nach Zellaufschluß des jeweiligen Expressionsansatzes wurden die Proben in der SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Membran transferiert. Das Tridegin-His- GIcDH-Fusionsprotein konnte über seinen enthaltenen His-Tag immunologisch durch die Verwendung eines Anti-RGS*His-Antikörpers im Western-Blot nachgewiesen werden. Als Kontrollen dienten gereinigtes rekombinantes Calin (Blutegelprotein), welches einen terminalen His-Tag besitzt, sowie der Zellextrakt der exprimierter rekombinanter GIcDH, die keinen His-Tag besitzt. Der Anti-RGS'His- Antikörper konnte für das rekombinante Tridegin/His/GIcDH-Fusionsprotein eine Bande bei ca. 37 kD und eine weitere Bande bei ca. 43 kD detektieren (Abb. 6). Vergleicht man die erhaltenen Bandengrößen mit den nach Aktivitätsanfärbung im SDS-Gel erhaltenen Banden, so zeigt sich, daß die 43 kD-Bande das Tride- gin-His-GIcDH-Fusions-protein und die 37 kD-Bande das His-GIcDH- Abbauprodukt des gesamten Fusionsproteins darstellt. Das Calin/His-Tag-Protein ergab eine Bande mit ca. 26 kD. Das etwas kleinere rekombinante Tridegin/His- Tag-Protein ergab eine Bande mit ca. 23 kD, sowie weitere Banden, die auf eine Bindung des His-Antikörpers mit weiteren exprimierten Proteinen hinweisen. Der immunologische Nachweis mit dem Anti-RGS'His-Antikörper beweist also, daß das bei 43kD und das bei 37 kD detektierte Protein einen His-Tag enthielt. Zudem entsprach diese Proteingröße annähernd der theoretischen Größe (36,5 kD) des GIcDH-Proteins mit gekoppeltem His-Tag.
Zusätzlich zum Expressions-Nachweis des rekombinanten Tridegins wurde die biologische Aktivität des Tridegins als Bestandteil des Tridegin-GIcDH Fusionsproteins, im speziellen Fall aus pAW4, untersucht. Dieser Test beruht auf der Hemmung von Faktor Xllla durch natives Drüsenhomogenat aus Blutegeln, bzw. gereinigtes Tridegin (Finney et al., 1997). Der modifizierte Test ist in den Beispielen beschrieben. Zur Kontrolle wurde das entsprechende Fusionsprotein aus pST106 und das GIcDH-Protein aus pAW2 exprimiert. Im Vergleich der enzyma- tischen Aktivität mit rekombinanten Tridegin, das entweder als GIcDH-Tridegin Fusionsprotein oder als Tridegin-His-Tag in E. coli exprimiert worden ist., konnten keine wesentlichen Unterschiede festgestellt werden. Darüberhinaus zeigten die rekombinanten Tridegin-Proteine aus den beiden unterschiedlichen Expressionen vergleichbare biologische Aktivitäten wie das native Homogenat aus Blutegeldrüsen. Daraus kann gefolgert werden, daß die Fusion mit GIcDH keinerlei störenden Einfluß auf die biologische Aktivität des coexprimierten Fremdgens ausübt. Tridegin selbst (d. h. nicht als Fusionsprotein) besitzt nach Durchführung einer E. co/7-Expression keine Aktivität und wird als Inclusion Body gebildet. Wird GIcDH in E. coli exprimiert, erhält man ein Enzym mit hoher spezifischer Aktivität und Stabilität in löslicher Form. In Expressionsversuchen konnte nachgewiesen wer- den, daß Proteine, die ein hohes Lösllchkeitsvermögen bei der E. co//-Expression besitzen, das Lösllchkeitsvermögen der Fremdproteinexpression erhöhen, wenn sie mit diesen fusioniert werden (LaVallie, 1995). Die Fusion von Tridegin mit GIcDH erhöhte auch in diesem Fall die Löslichkeit des Tridegins, denn durch einen biologischen Nachweis, bei dem Tridegin den Faktor Xllla inhibiert, konnte die Aktivität des Tridegins nach der E. co//-Expression als Tridegin-His-GIcDH- Fusionprotein nachgewiesen werden. Das GIcDH-Fusionsprotein wird in E. coli in hoher Ausbeute exprimiert.
Die Möglichkeit, klonierte Gene als Fusionsproteine zu exprimieren, die ein Protein von bekannter Größe und biologischer Funktion enthalten, vereinfacht den Nachweis des Genprodukts merklich. Aus diesem Grund sind, wie einleitend bereits erwähnt, zahlreiche Fusionsexpressions-Systeme entwickelt worden, die verschiedene Nachweisstrategien aufweisen.
Im Vergleich zu den bekannten Systemen stellt sich das erfindungsgemäße GIcDH-Fusionssystem in E. coli wie in Tab. 2 gezeigt, dar. In einigen Systemen kann das N-terminale Fusionsprotein vom C-terminalen Ziel- oder Fremdprotein abgespalten werden (Collins-Racie et al., 1995).
Tab 2:
Ein sehr großer Vorteil des erfindungsgemäßen GlcDH-Nachweissystem ist die Tatsache, daß hierfür wie z.B. für den Nachweis mittels Western-blot keine Antikörper oder sonstige Materialien wie z.B. Membranen, Blot-Apparatur, Entwick- lermaschine mit Filmen, Mikrotiterpiatten, Titerplattenlesegerät, u.s.w. benötigt werden. Dadurch entwickelt sich der Nachweis rekombinanter Fusionsproteine mit dem GIcDH-System sehr viel günstiger und schneller. Mit Hilfe des GIcDH- Nachweises kann neben der Information über die Menge des exprimierten Fusi- onsproteins, auch die entsprechende Größe des Fusionsproteins direkt im SDS- PAA Gel ohne Transfer auf eine Membran festgestellt werden. Ist die Aktivität der GIcDH im Fusionsprotein nachweisbar, so sollte der Fusionspartner in der Regel auch funktionell aktiv sein. GIcDH stört die Faltung des Fusionspartners nicht. Nachfolgend (Tab. 3, unten) wurde ein effizientes Verfahren zur Gewinnung und zum Nachweis eines in E. coli gewonnenen Fusionsproteins aus der Literatur ausgewählt, welches die Vorteile des erfindungsgemäßen GIcDH- Fusionsproteinsystems in einem Vergleich zeigt.
Das erfindungsgemäße GIcDH-Fusionsproteinsystem ist ferner besonders geeignet, die Löslichkeit von Proteinen zu erhöhen, die insbesondere in E. coli als In- clusion Bodys gebildet werden und deshalb eine anschließende Proteinaufreinigung schwierig und teuer gestalten. Normalerweise müssen Proteine, die als In- clusion Bodys gebildet wurden, durch aufwendige Verfahren in ihren nativen Zustand überführt werden. Dies entfällt bei Anwendung der Fusionsproteine gemäß der Erfindung.
Zusammenfassend stellen sich die Vorteile der erfindungsgemäßen Fusionsproteine in ihrer Verwendung als GlcDH-Nachweissystem wie folgt, dar.
• Stabilität unter SDS und reduzierenden (denaturierenden) Bedingungen
• Sensitiver GIcDH-spezifischer enzymatischer Farbtest • Sensitivität bis mindestens 50 ng
• Schneller Nachweis direkt im SDS-Gel mit Bestimmung des Molekulargewichts des Fusionspartners
• Möglichkeit zusätzlicher Proteinanfärbungen
• Kostengünstige Materialien, geringer apparativer Aufwand • gute Expression in E. coli, einschließlich des Zielproteins unter Erhaltung der biologischen Aktivität
• Möglichkeit der Vermeidung von Inclusion Bodies des Fremd-/Zielproteins oder anderer durch falsche Faltung erzeugte Aggregate. Möglichkeit der Aufreinigung des Fusionsproteins über Affinitätschromatographie z.B. an Farbstoffen (Cibacron Blue 3G)
Tab. 3
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter, ohne sie zu beschränken. Beispiel 1 :
Erfindungsgemäß wurden die oben stehenden Oligonucleotide verwendet (Tab. 4)- Die folgende Tabelle 5 gibt eine Übersicht über die verwendeten Mikroorganismen. Alle Mikroorganismen stammen von E. coli K12 ab und gehören der Risikogruppe 1 an.
Tab. 5
Spenderorganismus: Expressionsstamm M 7037 (E.coli N 4830/pJH 115) v. 21.10.96 (Fa. Merck). pJH 115: pUC-Abkömmling, 5,9 kb, 0 PL-Promotor, gdh, to (Terminator), galk (Galaktosidase-Gen), bla (ß-Lactamase-Gen), oh (Replikationsursprung), 2 Hindill-, 2 BamHI-und je eine EcoRI- und Clal-Schnittstelle.
Beispiel 2:
Transformation von Plasmiden in kompetente E.coli-Zellen: SOC-Medium: 20 g Bacto-Trypton,5 g Bacto-Yeast-Extract, 0,5 g NaCI, 0,2 g KCI ad 1 l H2Obid., autoklavieren. Vor Gebrauch zugeben: 0,5 ml 1 M MgCI2 / 1 M MgS04 (sterilfiltriert), 1 ml 1 M Glucose (sterilfiltriert) LB (Amp)-Agarplatten: 1 I LB-Medium (ohne Ampicillin), 15 g Agar-Agar zusammengeben, autoklavieren, auf ca. 60°C abkühlen und 1 ml Ampicillin-Lösung (100 mg/ml). Durchführung:
Ansatz 1-5 μl Ligationsprodukt oder Plasmid-DNA (5-50 ng/μl)
50 μl kompetente Zellen
450 μl SOC-Medium kompetente Zellen 10 min auf Eis auftauen
DNA zu den kompetenten Zellen geben
30 min auf Eis inkubieren
Hitzeschock: 30 sek bei 42° C (Wasserbad)
Zellen für 2 min auf Eis stellen
450 μl vorgewärmtes SOC-Medium zugeben
1 h bei 37° C und 220 rpm inkubieren je 100 μl des Ansatzes auf einer vorgewärmten LB(Amp)-Platte ausstreichen
Platten bei 37° C über Nacht inkubieren
Beispiel 3:
TOPO-TA-Cloning® und -Ligation
TOPO-TA-Cloning® ist ein fünf-minütiges Klonierungsverfahren für mit Taq- Polymerase amplifizierte PCR-Produkte.
Der TOPO-TA-Cloning®-Kit (Version C) der Firma Invitrogen wurde zur direkten Klonierung von PCR-Produkten entwickelt. Das System nutzt die Eigenschaft thermostabiler Polymerasen, die am 3'-Ende aller Duplex-Moleküle bei einer PCR ein einzelnes Deoxyadenosin anhängen (3'-A-Überhang). Mit Hilfe dieser 3'-A- Überhänge können die PCR-Produkte direkt mit einem Vektor verknüpft werden, der 3'-T-Überhänge besitzt. Der Kit liefert für diesen Zweck den speziell entwik- kelten pCR®2.1-TOPO-Vektor. Der 3,9 kb große Vektor besitzt ein /acZ-Gen für blau/weiß-Selektion, Ampicillin- und Kanamycinresistenzgene. Die Klonierungs- stelle wird beidseitig von einer einmaligen EcoRI-Schnittstelle flankiert. Ligationsansatz:
2 μl Frisches PCR-Produkt (10 ng/μl)
1 μl pCR®-TOPO-Vektor
2 μl steriles Wasser 5 μl Gesamtvolumen
• Ansatz vorsichtig mischen und 5min bei RT inkubieren ■ kurz anzentrifugieren und Tube auf Eis legen
• Ligationsprodukte sofort in der One Shot™-Tranformation einsetzen
Zur Kontrolle dient ein 5 μl-Ansatz ohne PCR-Produkt, der nur aus Vektor und
Wasser besteht.
Die One-Shot™-Tranformation wurde nach folgender Vorschrift durchgeführt:
2 μl 0,5 M ß-Mercaptoethanol zu den 50 μl auf Eis aufgetauten One Shot™ TOP10 kompetenten Zellen geben;
2 μl der TOPO-TA-Cloning® Ligation pro Vial kompetente Zellen zugeben;
30 min auf Eis inkubieren
Hitzeschock: 30 sek bei 42° C;
2 min auf Eis abkühlen; 250 μl SOC-Medium (RT) zugeben;
Inkubation der Vials bei 37° C und 220 rpm für 30 min;
100 μl jedes Transformationsansatzes auf 37° C vorgewärmten LB(Amp)-Platten ausstreichen;
Platten über Nacht bei 37° C inkubieren; die erhaltenen Transformanden werden nach Minipräparation (3.2.2.1) mit geeigneten Enzymen im analytischen Restriktionsverdau analysiert.
Beispiel 4:
Genexpression in E.coli-Zellen: Die Durchführung ist wie folgt skizziert:
• aus erfolgreich sequenzierten Klonen wird das Plasmid isoliert und in den Expressionsstamm W3110 transformiert
• von der Transformationsplatte wird ein Klon gepickt und damit eine 5 ml ÜN- Vorkultur hergestellt • Vorkultur auf einer LB(Amp)-Platte ausstreichen und später durchzuführende Expressionen mit Klonen dieser Platte beimpfen • mit 1 ml der Vorkultur wird nun die 50 ml-Hauptkultur angeimpft (Verhältnis 1 :50) und der OD60o-Wert bestimmt (Referenzmessung mit unbeimpftem LB(Amp)-Medium)
• Hauptkultur (in 200 ml-Erlenmeyerkolben) bei 37° C und 220 rpm inkubieren • ODβoo-Wert alle 30 min bestimmen
• wird ein OD von 0,5 erreicht findet die Induktion der Zellen mit 10 μl Anhydro- tetracyclin (1 mg/ml) pro 50 ml Zellsuspension statt (f. c. 0,2 μg Anhydrotetracy- clin pro ml Zellsuspension) und es wird erneut der OD-Wert bestimmt (0-Wert)
• jede Stunde OD-Wert bestimmen und 3 h nach Induktionszeitpunkt Wachstum beenden
• 1 ml gut durchmischte Bakteriensuspension in Tube geben und 5 min bei 6000 rpm abzentrifugieren (nach Bedarf kann auch weniger Suspension verwendet werden)
• Überstand absaugen und Pellet in 100 μl 1x red. Probenpuffer homogenisie- ren;
• Homogenat 5 min kochen, auf Eis abkühlen und kurz abzentrifugieren;
• 10 μl Probe pro Tasche eines SDS-Gels auftragen und Elektrophorese (3.2.16; durchführen;
• Gel mittles Coomassieblau-Färbung und/oder gemäß Methode nach Beispiel 5 anfärben.
Zellaufschluß:
Zellen einer 50 ml-Übemacht-Kultur bei 3500 rpm und 4°C für 15 min abzentrifugieren. Den entstandenen Überstand abschütten und die Zeilen in 40 ml 100 mM Tris/HCI (pH 8,5) resuspendieren. Die suspendierten Zellen werden mit Hilfe der French-Press in einem 1 Zoll Zylinder mit 18000 psi aufgeschlossen. Hierbei werden die Zellen durch eine enge Öffnung (< 1 mm) gepreßt und einem plötzlichen Druckabfall ausgesetzt. Durch die Druckdifferenz beim Durchqueren der Öffnung zerplatzen die Zellen. Die Struktur der Zellproteine bleibt dabei erhalten. Damit das gewünschte Protein nicht proteolytisch abgebaut wird, sollte man so- fort nach dem Zellaufschluß einen Protease-Hemmer zugeben. Hierfür wird je 40 ml Proteinlösung 1 Tablette des EDTA-freien Complete™- Proteasen-Inhibitoren- Cocktail (Röche) zugegeben und bei RT gelöst. Die anschließende 20-minütige Zentrifugation bei 6000 rpm führt zum Abtrennen der Zelltrümmer sowie großer Teile DNA und RNA. Die Proben werden anschließend bei -20° C eingefroren.
Beispiel 5: Aktivitätsanfärbung der GleDH-Bande im SDS-Gel:
Die Glucose-Dehydrogenase-Bande kann mit Hilfe von lodphenylnitrophenyiphe- nyltetrazoliumchlorid (INT) spezifisch im SDS-Gel nachgewiesen werden. Dies ist nur möglich, weil durch die SDS-Behandiung die Aktivität der GIcDH nicht zerstört wird. Der Nachweis der GIcDH erfolgt mit Hilfe einer Farbreaktion. Dabei wird der bei der Reaktion gebildete Wasserstoff auf das Tetrazoliumsalz INT übertragen, wobei ein violettes Formazan entsteht. Phenanzinmethosulfat dient als Elektronenüberträger.
Vorinkubationspuffer (0,1 M Tris/HCI, pH 7,5) 15,76 g Tris/HCI ad 1 I H2Obid., mit NaOH pH 7,5
Reaktionspuffer (0,08% INT, 0,005% Phenanzinmethosulfat, 0,065% NAD, 5% Glc in 0,1 M Tris/HCI (pH 7,5)
0,8 g lodphenylnitrophenyltetrazoliumchlorid (INT)
0,05 g Methylphenaziniummethosulfat
(Phenanzinmethosulfat)
0,65 g NAD 50 g D-(+)-Glucose-monohydrat (Glc) ad 1 I 0,1 M Tris/HCI (pH 7,5)
Lagerpuffer für GlcDH: 26,5 g EDTA 15 g Na2HPO4 ad 1 I, pH 7,0 (NaOH) Probenvorbereitung:
• Proben und Marker in Probenpuffer verdünnen.
• 3 min in Wasserbad kochen und auf Eis abkühlen und abzentrifugieren
SDS-Gelelektrophorese nach Standardmethoden.
Aktivitätsanfärbung:
• SDS-Gel mit aufgetrennten Proteinbanden 5 min in Vorinkubationspuffer bei 37° C unter leichtem Schütteln inkubieren
• Puffer abgießen und mit ausreichender Menge Reaktionspuffer (RT) überschichten, bei 37° C unter leichtem Schütteln inkubieren (Puffer mind. 1 x wechseln)
• nach ca. 30 min Inkubation sind die Banden mit GlcDH rotviolett angefärbt. • Gel in Vorinkubationspuffer waschen, fotogafieren und trocknen
• bei Bedarf eine anschließende Coomassie-Färbung durchführen und Gel danach trocknen
Beispiel 6:
Immunologischer Nachweis mit dem ECL-System (Western Exposure™ Chemilu- minescent Detektion System):
Der Nachweis von Proteinen, die an einen His-Tag gekoppelt sind, erfolgt indirekt mit zwei Antikörpern. Als erster AK wird der Anti-RGS'His Antibody (QIAGEN) für die Detektierung von δxHis-getaggten Proteinen eingesetzt. Der Nachweis des entstandenen Antigen-Antikörper-Komplexes erfolgt dann mit Hilfe des Peroxidase (POD)-markierten AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)-Antikörpers. Durch die gebundene Peroxidase entsteht nach Zugabe des ECL-Substrat-Gemisch ein chemilumineszierendes Produkt, das mit einem High Performance Chemilumi- nescence Film detektiert werden kann. Ponceau S-Lösung (0,5 % Ponceau S, 7,5 % TCA) 1 ,25 g Ponceau S 18,75 g TCA auf 250 ml bidest. Wasser auffüllen. 10x PBS-Puffer pH 7,4
14,98 g Di-natrium-hydrogenphosphat x 2 H2O 2,13 g Kalium-di-hydrogenphosphat 87,66 g Natriumchlorid auf 1 I auffüllen, pH 7,4 überprüfen.
Der Puffer wird in der 1x Konzentration eingesetzt.
Biometra-Blotpuffer 25 mM Tris
150 mM Glycin 10 % Methanol
Blockierungsreagenz 5 % Magermilchpulver in Ix PBS-Puffer lösen.
Waschpuffer
0,1 % Nonidet™ P-40 (Sigma) in 1x PBS-Puffer lösen
Der Nachweis wurde wie folgt, duchgeführt:
• PVDF-Membran (Immobilon P, Millipore) und 6x Blotting-Filterpapier auf Gelgröße zuschneiden
• PVDF-Membran 15 sek in Methanol und anschließend in Biometra-Blotpuffer equilibrieren, ebenso mit dem SDS-Gel und den Filterpapieren verfahren
■ Blot-Aufbau: 3 Lagen Filterpapier, Membran, Gel, 3 Lagen Filterpapier in Blot- kammer aufbauen (Luftblasen müssen dabei zwischen den Lagen herausgedrükt werden, da sonst an diesen Stellen kein Proteintransfer stattfindet)
• Blotten: 1-1 ,5 mA/cm2 Gel für 1 h ■ Kontrolle des Proteintransfers:
• Nach dem Blotten wird der Proteintransfer auf die PVDF-Membran durch Anfärbung mit Ponceau S kontrolliert: Membran mindestens 2 min mit 0,5 % Ponceau S-Lösung in einer Schale unter leichtem Schütteln inkubieren. Farbstoff abgießen (wiederverwendbar) und Membran unter fließendem VE-Wasser entfärben. Dabei werden nur starke Proteinbanden gefärbt. Der Molekulargewichts- marker wird mit einem Kugelschreiber markiert. • Entwicklung des Blots: Alle Inkubationen sollten in einer Schale auf einem Celloshaker und im Rollerschrank in 50 ml-Falcon-Röhrchen durchgeführt werden, denn die Membran darf bei den folgenden Schritten keinesfalls austrocknen. (1) Absättigen
30 min bei 37° C im Rollerschrank mit PBS/5% Magermilchpulver (2) 1. Antikörper: 1 :2000 verdünnt in PBS/5% Magermilchpulver (Volumen ca. 7 ml/Membran) 1 h bei 37° C inkubieren
(3) Waschen: Membran mit reichlich Waschlösung PBS/0,1% NP-40 waschen 3 x 5 min waschen
(4) POD-markierter AK: 1 : 1000 verdünnt in PBS/5% Magermilchpulver (neues Röhrchen) 1 h bei 37° C inkubieren
(5) Waschen: Membran mit reichlich Waschlösung PBS/0,1% NP-40 waschen 3 x 5 min waschen
(6) Entwickeln: Membran gut schwenken (nicht trocknen lassen) und auf eine Plastikfolie legen, mit dem ECL-Entwicklungslösung (Amersham) vollständig für 1 min überschichten, Membran schwenken und in eine Doppelfolie geben, Polaro- id-Hyperfilm auflegen und entwickeln
Beispiel 7:
Tridegin-Nachweis durch Inhibierung von Faktor Xllla (Methode nach Finney et al., 1997, erfindungsgemäß modifiziert):
Anstelle des natürlichen Substrates von Faktor Xllla, nämlich aminogruppenhalti- gen Seitenketten von Aminosäuren, werden auch synthetische Amine in geeignete Proteinsubstrate eingebaut. Diese synthetischen Amine verfügen über intramolekulare Marker, die den Nachweis ermöglichen. Der Amineinbau-Test ist ein Festphasen-Test. Die Beschichtung der Titerplatten erfolgt mit Casein. In dieses Casein erfolgt der Einbau des Substrates Biotinami- dopentyiamin durch Faktor Xllla. Das Casein-Biotinamidopentylamin-Produkt kann durch das Fusionsprotein Streptavidin-alkalische Phosphatase (Strep/AP) nachgewiesen werden. Dieser "Sandwich" kann durch Detektion der Phosphata- seaktivität mittels p-Nitrophenyl-phosphat erfolgen. Dabei läuft folgende Reaktion ab:
4 - Nitrophenylphosphat + H2O — ^→ Phosphat + 4 - Nitrophenolat
Die Bildung des 4-Nitrophenolats wird photometrisch bei 405 nm bestimmt und ist der AP-Aktivität direkt proportional. Durch die hochaffine Wechselwirkung von Biotin und Streptavidin ist die Phosphataseaktivität der Faktor Xllla-Aktivität ebenfalls proportional, d.h., je stärker die Absorption (Gelbfärbung) desto größer die Faktor Xllla-Aktivität (Janowski, 1997). EDTA ist ein unspezifischer Inhibitor für Faktor Xllla, dessen Cofaktor Ca2+ durch EDTA in einem Chelat-Komplex gebunden wird. Aus diesem Grund dürfen die verwendeten Proteinproben kein EDTA enthalten und wurden mit einem EDTA-freien Protease-Inhibitoren-Cocktail (Boehringer) vorbehandelt. Waschpuffer: 100 mM Tris/HCI, pH 8,5
Lösung A: 0,5 % Magermilchpulver in Waschpuffer lösen
Lösung B: 0,5 mM Biotinamidopentylamin, 10 mM DTT, 5 mM CaCI2 in
Waschpuffer lösen
Lösung C 200 mM EDTA in Waschpuffer lösen Lösung D 1 ,7 μg/ml Streptavidin-alkalische Phosphatase in Lösung A lösen
Lösung E 0,01 % (w/v) Triton X-100 in Waschpuffer lösen
Lösung F 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat, 5 mM MgCI2 in Waschpuffer lösen Coating:
• 200 μl / Well Lösung A nach Probenanzahl auf Titerplatte verteilen 30 min bei 37° C schütteln (Thermoshaker)
Waschen:
• 2 mal mit 300 μl / Well Waschpuffer waschen Einbaureaktion:
• 10 - 150 μl/Well Proben verteilen, je 5 μl/Well Faktor Xllla und 200 μl/Well Lö- sung B zugeben
30 min bei 37° C schütteln Stop:
• 2 mal mit 300 μl/Well Lösung C (Faktor Xllla Inhibierung) waschen • 2 mal mit 300 μl/Well Waschpuffer waschen Strep/AP-Bindung (spezifisch):
• 250 μl/Well Lösung D zugeben
• 60 min bei RT inkubieren Waschen:
• mit 300 μl/Well Lösung E waschen (löst die nicht kovalent gebundenen Proteine ab)
• 4 mal mit 300 μl/Well Waschpuffer waschen Substrat: • 50 μl/Well Lösung F + 200 μl/Well Waschpuffer zugeben
• 30 min bei RT inkubieren
Messung mit computergestützter Auswertung in einem Microtiterplattenreader bei 405 nm durchführen.
Beispiel 8: Empfindlichkeit der Detektion von GIcDH
Die angebene Menge an aufgereinigtem GIcDH wurde auf ein SDS-Gel gegeben. Nach dem Lauf wurde das SDS-Gel 5 Minuten lang bei 37°C im Vorinkubationspuffer inkubiert. Der Puffer wurde verworfen und das Gel wurde im Reaktionpuffer bei 37°C geschüttelt. In einem weiteren Schritt wurde das Gel mit Coo- massie Blue angefärbt. Reaktionspuffer für 1 Liter: 0,1 M Tris/HCL, pH 7,5 0,5M NaCI 0,2% Triton-X-100 0,8g lodphenylnitrophenyltetrazoliumchlorid 0,05g Methylphenaziniummethosulfat 0,65g NAD 50g D-(+)-Glucose-monohydrat
Pre-Inkubations-Puffer: 0,1 M Tris/HCI, pH 7,5 0,5 M NaCI

Claims

Patentansprüche
1. Rekombinantes Fusionsprotein, bestehend aus mindestens einer ersten und zweiten Aminosäuresequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Se- quenz die biologische Aktivität von Glucose-Dehydrogenase aufweist.
2. Rekombinantes Fusionsprotein nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Sequenz ein beliebiges rekombinantes Protein / Polypeptid X ist oder Teile davon darstellt.
3. Rekombinantes Fusionsprotein nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens eine weitere für die Detektion geeignete Erkennungssequenz ("Tag-Sequenz") aufweisen kann.
4. DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Fusionsprotein gemäß der Ansprüche 1 - 3 kodiert.
5. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNA gemäß Anspruch 4 enthält.
6. Wirtszelle zur Expression von rekombinanten Proteinen / Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 5 enthält.
7. Verwendung von Glucose-Dehydrogenase als Detektorprotein für ein beliebiges rekombinantes Protein / Polypeptid X in einem Fusionsprotein gemäß der Ansprüche 1 bis 3.
8. Verwendung von Glucose-Dehydrogenase in einem Nachweissystem für die Expression eines rekombinanten Proteins / Polypeptids X als Bestandteil eines Fusionsproteins gemäß der Ansprüche 1 bis 3.
. Verwendung von Glucose-Dehydrogenase zum Nachweis für Protein-Protein Interaktionen, wobei ein Partner dem rekombinanten Protein / Polypeptid X in den Ansprüche 1 bis 3 entspricht.
10.Verwendung von Glucose-Dehydrogenase in einem Fusionsprotein gemäß Ansprüche 1- 3 als Detektorprotein für ein beliebiges drittes Protein / Polypeptid, welches nicht Bestandteil des Fusionsproteins gemäß der Ansprüche 1 - 3 ist und an die zweite Sequenz des Proteins / Polypetids X des besagten Fusionsproteins zu binden vermag.
11.Verwendung eines Expressionsvektors nach Anspruch 5 bei der Optimierung der Expression eines rekombinanten Proteins / Polypeptids X in einem rekombinanten Herstellungsverfahren.
12. Verwendung eines Wirtszelle nach Anspruch 6 bei der Optimierung der Expression eines rekombinanten Proteins / Polypeptids X in einem rekombinanten Herstellungsverfahren.
13. Verfahren zum schnellen Nachweis eines beliebigen rekombinanten Proteins / Polypeptids X mittels Gellektrophorese, dadurch gekennzeichnet, daß ein Fusionsprotein gemäß der Ansprüche 1 bis 4 hergestellt, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt wird und das nachzuweisende rekombinante Protein / Polypeptid im Gel über die Enzymaktivität der Glucose-Dehydrogenase sichtbar gemacht wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Gelelektrophoresemethode die SDS-Poiyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) verwendet wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der Enzymaktivität der Glucose-Dehydrogenase eine Farbreaktion auf Basis von Tetrazoliumsalzen eingesetzt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als Tetrazolium- salz lodphenylnitrophenyl-phenyltetrazoiium-Salz (INT) oder Nitroblau- tetrazolium-Salz (NBT) eingesetzt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß nach der spezifischen Anfärbung der Glucose-Dehydrogenase eine generelle Protein-
Anfärbung erfolgt.
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