EP0805868A1 - Cellules pour la production d'adenovirus recombinants - Google Patents

Cellules pour la production d'adenovirus recombinants

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EP0805868A1
EP0805868A1 EP96901417A EP96901417A EP0805868A1 EP 0805868 A1 EP0805868 A1 EP 0805868A1 EP 96901417 A EP96901417 A EP 96901417A EP 96901417 A EP96901417 A EP 96901417A EP 0805868 A1 EP0805868 A1 EP 0805868A1
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EP
European Patent Office
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region
adenovirus
cell
plasmid
orf6
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96901417A
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German (de)
English (en)
Inventor
Jean-François DEDIEU
Martine Latta
Cécile Orsini
Michel Perricaudet
Emmanuelle Vigne
Patrice Yeh
Eduard Prost
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
Aventis Pharma SA
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Publication date
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Priority claimed from FR9510541A external-priority patent/FR2738575B1/fr
Application filed by Rhone Poulenc Rorer SA, Aventis Pharma SA filed Critical Rhone Poulenc Rorer SA
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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Definitions

  • the present invention relates to new cell lines which can be used for the production of defective recombinant adenoviruses. It also relates to the purified viral preparations produced in these lines, as well as the plasmids allowing their construction. More particularly, the new cell lines according to the invention allow the transcomplementation of the E4 region and a clonal production with high titers of defective recombinant adenoviruses in particular for all or part of the E4 region.
  • Adenoviruses have certain properties which are particularly advantageous for use as a vector for gene transfer in gene therapy. In particular, they have a fairly broad host spectrum, are capable of infecting quiescent cells, do not integrate into the genome of the cell. infected, and have not been associated to date with significant pathologies in humans Adenoviruses have thus been used to transfer genes of interest into the muscle (Ragot et al., Nature 361 (1993) 647), the liver (Jaffe et al., Nature genetics 1 (1992) 372) the nervous system (Akh et al., Nature genetics 3 (1993) 224) was
  • Adenoviruses are linear double-stranded DNA viruses approximately 36 kb in size. Their genome includes in particular a repeated inverted sequence (ITR) at each end, an encapsidation sequence (Psi), early genes and late genes (see FIG. 1).
  • the main early genes are contained in the regions E 1, E2, E3 and E4. Among these, the genes contained in the region E 1 in particular are necessary for viral propagation.
  • the main late genes are contained in regions L 1 to L5
  • the genome of the adenovirus Ad5 has been completely sequenced and is accessible on database (see in particular Genebank M73260) Likewise parts, or even all other adenoviral genomes (Ad2, Ad7, Ad 12, summer) have also been sequenced.
  • adenovirus constructs described in the prior art are delete adenoviruses of the E1 region, essential for viral replication, at the level of which heterologous DNA sequences are inserted (Levrero et al ., Gene 101 (1991) 195, Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161).
  • adenoviruses are produced in a complementation line (line 293) in which part of the adenovirus genome has been integrated More specifically line 293 contains 1 left end (approx iron I 1 - 12%) of the genome of the adenovirus serotvpe 5 (Ad5), comprising the left ITR the encapsidation region the E1 region including E1 a, E1b the region coding for the pIX protein and part of the region coding for the pIVd2 protein.
  • This line is capable of transcomplementing recombinant adenoviruses defective for the E 1 region. that is to say devoid of all or part of the E1 region, and of producing viral stocks having high titers.
  • vectors deficient for the E1 region have certain disadvantages for therapeutic use In particular, they may not be totally defective for replication in vivo, in particular due to the existence of certain transcomplementing cellular functions.
  • a transcomplementation activity of E1 has been demonstrated in the cells of embryonic carcinoma F9. (Imperial et al., Mol Cell Biol 4, 1984 867-874).
  • a similar activity, regulated by interleukin-6 has also been demonstrated (Spergel et al., J Virol. 66, 1992, 1021 - 1030)
  • Other disadvantages linked to these vectors are the presence of numerous genes viral, capable of being expressed in vivo after gene transfer, and of inducing an immune and / or inflammatory response.
  • E4 region is indeed involved in the regulation of late gene expression, in the stability of late nuclear RNA, in the quenching of expression of host cell proteins and in the efficiency of replication of viral DNA Adenoviral vectors in which the E 1 and E4 regions are deleted therefore have very reduced transcription background and expression of viral genes (see in particular application PCT / FR94 / 00851)
  • the construction and the industrial and therapeutic exploitation of such vectors involves the provision of an efficient system for transcomplementing these two functions for the production of viral stocks.
  • the present invention provides a solution to this problem.
  • the present invention indeed provides cell lines allowing the transcomplementation of the E4 region and a clonal production and with high titers of recombinant adenoviruses defective for this region.
  • the lines according to the invention are advantageously capable of transcomplementing the two functions E1 and E4, and therefore make it possible to produce viruses deficient for these two functions.
  • the present invention also provides plasmids allowing the construction of these lines; a process for the preparation of defective recombinant adenoviruses and purified viral stocks More particularly, the Applicant has now shown that production lines capable of efficiently transcomplementing the E4 region are obtained by introducing only part of the E4 region. Thus, lines having particularly advantageous properties are obtained when only a reduced functional unit of the E4 region, corresponding to the reading phase ORF6 or to the reading phases ORF6 and ORF6 / 7, are present.
  • a first object of the invention therefore resides in a cell which can be used for the production of defective recombinant adenoviruses comprising, inserted into its genome, part of the E4 region of an adenovirus genome comprising the reading phase ORF6 under the control of 'a functional promoter.
  • the cells of the invention comprise a part of the E4 region of an adenovirus genome comprising the reading phases ORF6 and ORF6 / 7 under the control of a functional promoter.
  • the cell lines according to the present invention have particularly advantageous properties. They allow first of all the transcomplementation of the functions E1 and E4. However, in a particularly advantageous manner, they are capable of inducing the formation of plaques of viruses deficient in these functions, which is essential for the cloning of the recombinant viruses, then for their amplification and their purification.
  • the Applicant has indeed shown that lines possessing the entire E4 region or larger functional units, including for example the ORF4 reading phase, are incapable of forming ranges of viruses deficient for the E4 region .
  • the identification of specific functional units of the E4 region allows the creation of a very efficient system of transcomplementation and production of defective viruses for the E1 and E4 functions.
  • Other advantages of the lines according to the invention are in particular their aptitude for the amplification in a liquid medium of such deficient viruses for regions E 1 and E4 the high titers of such viruses which they produce, and the absence of production of contaminating replicative viral particles.
  • the E4 region of the adenoviral genome consists of 7 open reading phases, designated ORF 1, ORF2, ORF3, ORF4 ORF3 / 4 ORF6 and ORF6 / 7 ( Figures 2 and 3)
  • ORF 1 open reading phases
  • ORF2 ORF3
  • ORF6 ORF6 / 7
  • Figures 2 and 3 the cells of the invention are characterized in particular by the presence of only part of this region, comprising the ORF6 reading phase possibly associated with the ORF6 / 7 reading phase. It is particularly important that the part of the E4 region present in the cells of the invention does not contain the functional ORF4 reading phase.
  • the E4 region present in the cells of the invention does not contain the ORF 1 reading phases.
  • the E4 region present in the cells of the invention is deleted from at least part of the reading phases ORF 1 -ORF4
  • the cell lines of the invention comprise an inserted fragment containing less than 2 kb of the E4 region of an adenovirus genome containing all of the phases.
  • the ORF6 reading phase can be isolated from the E4 region in the form of a fragmen t BglII-PvuII, corresponding to nucleotides 341 15-33126, and the reading phases ORF6-ORF6 / 7 can be isolated from the E4 region in the form of a BglII-BglII fragment corresponding to nucleotides 341 15-32490 of the genome of l 'Ad5
  • the reading phase ORF6 is merged in the translational phase with the domain of a nuclear receptor which is responsible for the recognition of its specific ligand
  • the domain for binding to the hormone (HBD Hormone Binding Domain) of the glucocorticoid receptor (GCR HoUenberg et al 1985, Nature, 318, 635-341) is advantageously chosen because it makes it possible to retain, in the cytoplasmic compartment of the cell, the fusion protein
  • Another particularly preferred embodiment of the invention consists of a cell comprising, inserted into its genome, a BglII-PvuII fragment corresponding to the nucleotides 341 15-33126 of the Ad5 genome
  • the ORF6 region at least, is coupled to the HBR of the GCR, either at its C-terminal end (fusion GCR-ORF6), or at its end N-terminal (ORF6-GCR fusion).
  • the sequence of the virus coding for ORF6 and ORF7 is advantageously inserted in the translational phase downstream of the sequence specifying the HBD of the GCR.
  • the expression of the chimeric gene then generates a primary RNA whose translation product is the protein GCR-ORF6 (SEQ ID No. 7).
  • the alternative splicing of this transcript generates a messenger RNA which codes for the fusion protein GCR-ORF6 / 7 (cf. Example 1.5).
  • the part of the E4 region present in the cells according to the invention can come from adenoviruses of different origins or serotypes. There are in fact different adenovirus serotypes, the structure and properties of which vary somewhat, but which have a comparable genetic organization. More particularly, the E4 region present in the cells according to the invention can be derived from an adenovirus of human or animal origin.
  • adenoviruses of human origin there may be preferably mentioned those classified in group C. More preferably still, among the various serotypes of human adenovirus, it is preferred to use, within the framework of the present invention, adenoviruses of type 2 or 5 ( Ad 2 or Ad 5).
  • Ad 2 or Ad 5 adenoviruses of type 2 or 5
  • adenoviruses of animal origin it is preferred to use, within the framework of the invention, adenoviruses of canine origin, and in particular all the strains of adenoviruses CAV2 [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC NR-800) for example] .
  • Other adenoviruses of animal origin are cited in particular in application WO94 / 26914 incorporated herein by reference.
  • the part of the E4 region comes from a genome of human adenovirus of group C. More preferably, it comes from the genome of an adenovirus Ad2 or Ad5.
  • the part of the E4 region present in the cells of the invention is placed under the control of a functional promoter in said cells.
  • a functional promoter in said cells.
  • it is an inducible promoter, making it possible to control the levels and / or the periods of expression of these genes.
  • it is the promoter of the LTR of MMTV (Pharmacia), which is induced by dexamethasone or of a promoter regulated by tetracycline (WO94 / 29442, WO94 / 04672) It is understood that others promoters can be used, and in particular variants of the LTR of MMTY carrying, for example, heterologous regulatory regions (“enhancer” regions in particular).
  • the expression of the hybrid genes is under the control of regulated promoters in order to avoid a constitutive accumulation of the fusion protein in the cytoplasm, or to minimize "leakage" towards the nuclear compartment and a certain cytotoxicity
  • the chimeric gene is under the control of an inducible promoter which responds to glucocorticoids such as the GRE5 promoter (S. Mader and J White, 1993, PNAS, 90, 5603-5607. cf Example 1 .5).
  • the cells according to the invention can be prepared from different pharmaceutically usable cells, that is to say cultivable under industrially acceptable conditions and not having a recognized pathogenic character II can be established cell lines or primary cultures and in particular of human embryonic retina cells. These are advantageously cells of human origin, which can be infected with an adenovirus. In this regard, mention may be made of KB, Hela, 293, Vero, gmDBP6, etc. cells.
  • the cells of the KB line are derived from a human epidermal carcinoma. They are accessible to ATCC (ref. CCL17) as well as the conditions allowing their culture.
  • the human cell line Hela comes from a carcinoma of the human epithelium. It is also accessible to ATCC (ref. CCL2) as well as the conditions allowing its cultivation.
  • the cells of line 293 are human embryonic kidney cells (Graham et al, J Gen Virol 36 (1977) 59). This line contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome of the human adenovirus Ad5 (12%).
  • the gm DBP6 cell line (Brough et al., Virology 190 (1992) 624) consists of Hela cells carrying the E2 adenovirus gene under the control of the LTR of MMTV. It can also be cells of canine origin (BHK, MDCK, ete) In this regard, the cells of the canine line MDCK are preferred.
  • the culture conditions of MDCK cells have been described in particular by Macatney et al., Science 44 (1988) 9.
  • the cell lines according to the invention can be constructed in different ways In general, they are prepared by transformation of a cell culture with a plasmid carrying the selected fragment of the E4 region under the control of a functional promoter
  • the transfection of the cells can be carried out by any technique known to those skilled in the art, and in particular in the presence of calcium phosphate, by electroporation, ete
  • the plasmid used also carries a marker gene making it possible to identify and select the cells transformed They may especially be any gene for resistance to an antibiotic (geneticin, hygromycin, etc.).
  • the marker gene can also be carried by a separate construct, co-transfected with the plasmid After transfection and selection for the marker gene, the cells obtained can be selected for their capacity to transcomplement adenoviruses lacking the E4 region.
  • different adenoviruses mutants defective for different parts of the E4 region can be used, such as in particular the adenoviruses Ad2dl808 (Weinberg and Ketner, J Virol 57 (1986) 833), Ad5dll 004, dl 1007 or dl 1014 (Bridge and Ketner, J Virol 63 ( 1989) 631), d1101 1 (Bridge et al., Virology 193 (1993) 794), as shown in the examples.
  • the cells according to the invention are also capable of transcomplementing for the E1 region.
  • These can be constructed as described above from cells which already transcomplement the E 1 region (example cells 293), or by sequential introduction of a construct providing the E1 region and of a construct providing the part of the E4 region according to the invention, for example in retinoblasts of human origin.
  • the cells according to the invention derive from the cell line 293
  • particularly advantageous results have been obtained with cells of the line 293 transformed by the plasmid pORF6Gen or the plasmid pGG0 which codes for the proteins HBD-ORF6 and HBD-ORF6 / 7.
  • the present invention also describes the construction of plasmids comprising a part of the E4 region of an adenovirus genome carrying the reading phase ORF6 or ORF6 and ORF6 / 7 under the control of an inducible promoter (see in particular the plasmids pORF6Gen and pGG0 ). These plasmids can be used directly to transfect a selected cell population, then, by selection, for the identification of cells which have stably acquired the E4 function. Another object of the invention resides in the use of the cells described above for the production of defective recombinant adenoviruses at least for the E4 region.
  • the invention indeed provides a method for producing defective recombinant adenoviruses at least for the particularly advantageous E4 region, using the above cells.
  • a culture of cells as described above is transformed with one or more plasmids providing the different regions of the genome of said defective recombinant adenovirus and then harvesting the viruses produced
  • This process is particularly advantageous for the production of adenoviruses having non-functional E1 and E4 regions.
  • These are in particular vectors in which the E1 and E4 regions have been inactivated or made non-functional by total or partial deletion.
  • Such modifications can be obtained in vitro (from isolated DNA) or in situ, for example, using in genetic engineering techniques, or even by treatment with mutagenic agents
  • the said genetic modification (s) can be localized in a coding part of the region, or outside a coding region and for example in the regions responsible for the expression and / or transcriptional regulation of said genes
  • the deletion can be carried out by digestion using appropriate restriction enzymes, then ligation, according to conventional techniques of molecular biology.
  • the method of the invention is used for the production of recombinant adenoviruses in which the E1 region is inactivated by deletion of a PvuII-BglII fragment going from nucleotide 454 to nucleotide 3328, on the sequence of l adenovirus Ad 5
  • the E1 region is inactivated by deletion of a HinfII-Sau3A fragment ranging from nucleotide 382 at nucleotide 3446
  • the process allows the production of vectors comprising a deletion of the entire E4 region.
  • the cell lines according to the invention are indeed capable of transcomplementing and amplifying adenoviruses carrying any type of deletion or inactivation of the reg ion E4
  • a functional part of E4 is deleted.
  • This part comprises at least the ORF3 and ORF6 phases.
  • these coding phases can be deleted from the genome in the form of Pvull-AluI and BglII- fragments.
  • the cells of the invention are particularly advantageous for the production of virus comprising an inactive E1 region and a deletion in the E4 region of the type present in the genome of Ad5 d11014. that is to say of virus E4- retaining the reading phase ORF4.
  • the present invention therefore also describes defective recombinant adenoviruses the genome of which comprises a deletion in the E1 region and a deletion in the E4 region. More particularly, it describes defective recombinant adenoviruses the genome of which comprises a deletion in the E1 region and a deletion in the E4 region corresponding at least to the ORF3 and ORF6 reading phases.
  • the adenoviruses according to the invention preferably comprise the following deletions affecting all or part of the E1 and E4 regions.
  • This double strand sequence represents the right part of the adenoviral genome, including the E4 region and the right ITR of nucleotide 32749 (1 in SEQ ID No. 4) at 35935 (3186 in SEQ ID n ° 4). It is a purely illustrative sequence and other published sequences can also be used.
  • the different reading phases of the E4 region are represented, in particular ORF7, ORF6, ORF4, ORF3, ORF2 and ORF1
  • An adenovirus ⁇ E1, ⁇ E4, ORF1 + of the invention advantageously comprises a deletion in the E1 region and a deletion of a fragment whose 5 'end is included in the ORF7 reading phase and whose 3' end is located in the ORF2 Encore reading phase more preferably, the deletion relates to a fragment whose 5 'end is between nucleotides 32920 to 33190 of the adenovirus genome and whose 3' end is between nucleotides 34710 to 35090 of the adenoviral genome This deletion corresponds approximately at nucleotides 1 70 to 440 (5 'end) and 1960 to 2340 (3' end) on the sequence SEQ ID No. 4.
  • ⁇ E1, ⁇ E4, ORF4 + adenovirus of the invention advantageously comprises a deletion in the E1 region, a deletion of a fragment whose end 5 is included in the phase of this ORF7 and whose end 3 'is located in the reading phase ORF6 (with the exception of the part overlapping the reading phase ORF4), and a deletion of 'a fragment whose I 5' end is included in the reading phase ORF3 and whose 3 'end is located in the reading phase ORF1 or in the promoter region of E4 More preferably, these adenoviruses according to the invention comprise:
  • the corresponding positions of the deletion (n) on the sequence SEQ ID n ° 4 are 180 to 445 (5 'end) and 450 to 1250 (end 3')
  • the corresponding positions of the deletion (iii) on the sequence SEQ ID n ° 4 are 1610 to 1950 (5 'end) and 2410 to 2870 (3' end).
  • deletions in the E4 region preferentially cover nucleotides 33093 (SmaI) -33695 and 34634 (SspI) -35355 (SmaI) They can be obtained for example from the Ad5 mutant d11014.
  • - Adenovirus ⁇ E 1, ⁇ E4 deletion of all or part of the E 1 region and of nucleotides 32720-35835, or 33466-35355 this deletion can be obtained for example from the mutant Ad5 d11007) or 33093-35355 (this deletion be obtained for example from the mutant Ad5 d1101 1).
  • These 3 deletions cover the entire E4 region.
  • the deletion in the E1 region advantageously covers all or part of the E1 A and E1B regions. This deletion must be sufficient to render the virus incapable of autonomous replication in a cell.
  • the part of the E region is deleted in the adenoviruses.
  • nucleotides 454-3328 or 382-3446 The positions given above refer to the sequence of the wild-type Ad5 adenovirus as published and accessible on the database. Although minor variations may exist between the different adenovirus serotypes, these positions are generally applicable to the construction of recombinant adenoviruses according to the invention from any serotype, and in particular from adenoviruses Ad2 and Ad7.
  • the adenoviruses of the invention may have other alterations in their genome.
  • other regions can be deleted to increase the capacity of the virus and reduce these side effects linked to the expression of viral genes.
  • all or part of the E3 or IVa2 region in particular can be deleted.
  • the E3 region it may however be particularly advantageous to keep the part coding for the gp 19K protein. This protein in fact makes it possible to prevent the adenov irus vector from undergoing an immune reaction which (i) would limit its action and (ii) could have undesirable side effects
  • the E3 region is deleted and the sequence coding for the protein gp19k is reintroduced under the control of a heterologous promoter.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention have properties which are particularly attractive for use in gene therapy. These vectors indeed combine infection, safety (the risks of immune and / or inflammatory reaction are greatly reduced) and transfer capacity. very high genes
  • the lines of the invention allow the production of viral stocks totally devoid of contaminating replicative particles (RCA).
  • RCA contaminating replicative particles
  • viruses according to the invention lies in their increased cloning capacity, allowing the insertion of large transgenes (greater than 10 kb). This allows in particular the use of transcription regulatory sequences making it possible to improve the efficiency, the regulation and the duration of expression. This also makes it possible to use lower doses of virus and to obtain a comparable therapeutic effect with very reduced cytopathic side effects.
  • adenoviruses constitute very efficient gene transfer vectors for gene and cell therapy applications. For this, a heterologous nucleic acid sequence whose transfer and / or expression in a cell, an organ or a organism is research can be inserted into their genome This sequence can include!
  • one or more therapeutic genes such as a gene whose transcription and possibly translation into the target cell generate products before a therapeutic effect
  • therapeutic products mention may be made more particularly of enzymes, blood derivatives, hormones, interleukin lymphokines, interferons, TNF, ete (FR 9203120), growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors BDNF.
  • CNTF NGF, IGF. GMF, aFGF, bFGF, NT3 NT 5, etc.
  • the therapeutic gene can also be an antisense gene or sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs.
  • Such sequences can for example be transcribed, in the target cell, into RNAs complementary to cellular mRNAs and blocks; thus their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308
  • the therapeutic gene may also be a gene coding for an antigenic peptide, capable of generating in humans an immune response, with a view to producing vaccines II may in particular be antigenic peptides specific for the epstein barr virus, the HIV virus, the hepatitis B virus (EP 185 573), the pseudo-rabies virus, or even specific for tumors (EP 259 212 )
  • the heterologous nucleic acid sequence also comprises a promoter region for functional transcription in the infected cell, as well as a region located 3 ′ of the gene of interest, and which specifies a transcriptional end signal and a site for polyadenylation All of these elements constitute the expression cassette.
  • the promoter region it may be a promoter region naturally responsible for the expression of the gene considered when it is capable of functioning in the infected cell. II may also be regions of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic).
  • they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes or any promoter sequence or derivative, stimulating or expressing the transcription of a gene in a specific way or not and in an inducible way or not
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect, or of the genome of a virus, and in particular, the promoters of the E1 A, MLP genes of adenovirus, the CMV promoter, LTR-RSV, ete
  • ubiquitous promoters HPRT vimentin ⁇ -actin tubulin ete
  • promoters of intermediate filaments desmin neurofilaments, keratin, GFAP, ete
  • promoters of therapeutic genes type MDR, CFTR, factor VIII, ete
  • tissue-specific promoters pyruvate kinase, villin.
  • intestinal protein promoter of fatty acids promoter of actin ⁇ of smooth muscle cells, specific promoters for the liver
  • Apo AI Apo AII, human albumin ete
  • promoters responding to a stimulus hormone receptor s teroids, retinoic acid receptor, ete,
  • these expression sequences can be modified by addition of activation sequences, regulation, or allowing tissue-specific or majority expiession
  • the acid inserted nucleic acid does not contain expression sequences, it can be inserted into the genome of the defective virus downstream of such a sequence.
  • heterologous nucleic acid sequence may also comprise, in particular upstream of the therapeutic gene, a signal sequence directing the therapeutic product synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of the product. therapeutic, but it can also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence
  • the therapeutic gene expression cassette can be inserted at different sites in the genome of the recombinant adenovirus, according to the techniques described in the prior art. It can first of all be inserted at the E1 deletion. It can also be inserted at the E3 region, in addition to or in substitution for sequences. It can also be located at the deleted E4 region.
  • the cells according to the invention can also be used for the production of recombinant adeno-associated viruses (AAV).
  • AAV adeno-associated viruses
  • the present invention also relates to the use of a cell comprising, inserted into its genome, all or part of the E4 region of the genome of an adenovirus comprising at least the ORF6 reading phase for the production of recombinant AAVs
  • the cells are advantageously as defined above
  • AAV is a DNA virus from the family of human parvoviruses, of relatively small size, which integrates into the genome of the cells which it infects, in a stable and site-specific manner.
  • AAVs are capable of infecting a large spectrum of cells, without inducing an effect on cell growth, morphology or differentiation Moreover, they do not seem to be involved in pathologies in humans
  • the genome of AAVs has been cloned, sequenced and characterized It comprises approximately 4700 bases , and contains at each end an inverted repeat region (ITR) of approximately 145 bases, serving as the origin of replication for the virus
  • ITR inverted repeat region
  • the rest of the genome is divided into 2 essential regions carrying the packaging functions the left part of the genome, which contains the rep gene involved in viral replication and expression of viral genes, the right part of the genome, which contains the cap gene encoding the capsid proteins of the virus
  • ITR inverted repeat region
  • AAV adenovirus or l virus.
  • a helper virus for example an adenovirus
  • a plasmid containing a nucleic sequence of interest bordered of two inverted repeat regions (ITR) of AAV and a plasmid carrying the packaging genes (rep and cap genes) of AAV.
  • the major drawback of this system is that it uses a helpei virus. It is generally replicative and present in mixture with the AAVr products. The viral stocks are therefore potentially contaminated by a helper virus, which makes these stocks incompatible with therapeutic use. In addition, due to the high number of components involved in this process, the virus titers obtained are quite low, of the order of 10 8 .
  • the present invention makes it possible to remedy these drawbacks.
  • the present invention in fact provides an effective method for producing AAVr, making it possible to obtain stocks of virus with very high titers (greater than 10), not contaminated by a replicative virus.
  • AAV E1 A, E1B, E2A, VA and E4 Five genes of the adenovirus are necessary for the replication of the AAV E1 A, E1B, E2A, VA and E4 These genes must be present and expressed in the producer cell for optimal production of infectious particles
  • the method of l he invention now uses a production cell line already containing in its genome some of these genes, and in particular all or part of the E4 region, preferably combined with the E1 region.
  • the advantage of using this type of cell line is that it makes it possible to use a defective adenovirus helper, that is to say not capable of autonomously generating infectious particles.
  • the inventories of AAVi produced are not contaminated
  • the functions integrated into the line can be deleted from the genome of the adenovirus helper. This is particularly advantageous for the use of an adenov irus helper of human origin.
  • helper of human origin (ad5 or ad2 for example) defective for these functions
  • Such an helper adenovirus could not be used effectively in the procedures of the prior art because the absence of regions essential for the production of AAVr (E 1 and E4) considerably limited the effectiveness of the process.
  • such an adenovirus is totally incapable of autonomously generating infectious particles. Therefore, its possible presence in a stock of AAVr does not affect the pharmaceutical quality of this preparation.
  • adenovirus helper of animal origin preferably canine
  • the method according to the invention makes it possible to obtain particularly high virus titers.
  • the titles produced which can exceed 10 viral genomes per ml, are read up to 1000 times greater than the titles observed in the prior art.
  • These results are completely unexpected and of capital importance in terms of industrial exploitation.
  • the results are particularly remarkable with the cell lines derived from the line 293 and which express ORF6, possibly associated with ORF6 / 7, or all of E4, under the control of the promoter MMTV (they therefore contain E1 constitutively expressed and E4 or a part of E4 comprising at least ORF6 conditionally expressed in the presence of dexamethasone) .
  • a cell line which is particularly advantageous for implementing the method according to the invention is represented by a cell of the line 293 comprising. inserted into its genome, a BglII-BglII fragment corresponding to nucleotides 341 15- 32490 of the Ad5 genome. It is, for example, a cell of line 293 transformed by the plasmid pORF6Gen (see examples).
  • adenovirus helper for example human with wild phenotype, or deleted for E1, or a double deletion for E1 and E4, or canine adenovirus
  • a plasmid- AAV carrying the AAV ITRs framing a nucleic acid of interest
  • a plasmid carrying the rep and cap functions it is possible to produce, in the presence of dexamethasone, particles of infectious AAV virus at high titers.
  • genome titers of 10 11 genomes / ml can be obtained when operating on small quantities of cells.
  • Another object of the invention resides in a process for producing recombinant AAVs characterized in that a part of the E4 region of the genome of a genome is introduced into a culture of cells comprising, inserted into their genome adenovirus comprising at least the ORF6 reading phase:
  • AAV plasmid carrying a nucleic acid of interest bordered with AAV dTTRs, - an adenovirus helper.
  • the producer cell is a cell comprising the entire E4 region
  • the producer cell is a cell comprising part of the E4 region comprising at least the reading phase ORF6 and possibly the reading phase ORF6 / 7.
  • It is particularly preferably a cell as defined above for the production of adenovirus.
  • it is advantageously a cell capable of transcomplementing the E1 and E4 functions of the adenovirus.
  • a preferred example is represented by a cell of line 293 containing inserted into its genome, the whole E4 region or a part of the E4 region comprising at least the reading phase ORF6 and optionally the reading phase ORF6 / 7.
  • the adenovirus helper can be a human adenovirus with a wild phenotype, or defective for the E1 region, or a double deletion agent for E1 and E4, or also canine adenovirus
  • the advantage of the method according to the invention resides on the one hand in the titles very high in AAVr, and also in the safety character of the stocks which it allows to produce
  • a defective adenovirus helper that is to say incapable of generating autonomously infectious particles
  • the adenovirus helper according to the method of the invention is advantageously a human adenovirus having a deletion in the E4 region More preferably still, it is a human adenovirus defective for the E1 and E4 regions
  • it is a canine adenovirus, preferably chosen from the CAV2 strains
  • the rep and cap functions of the AAV are preferably provided by co-transfection of the cells with a plasmid carrying the rep and cap regions of the AAV These regions can be under the control of the homologous P5 promoter or a constitutive promoter such as LTR-RSV These functions can also be provided directly by the helper virus used II is indeed possible to insert into the adenovirus helper a cassette containing the rep and cap regions of the AAV
  • the transfection of the plasmid (s) (plasmid-AA V and plasmid-RepCap if necessary) can be carried out by any technique known to those skilled in the art.
  • the Applicant has now developed a particularly effective method for transfection of plasmids into production cells
  • This method is based on the use of a polycationic lipid and an acid-compacting agent
  • One of the advantages of this method lies in the fact that it does not seem to alter the morphology or physiological state of the cells.
  • Different types of cationic lipids can be used, such as hpofectamine, Transfectam, ete
  • DNA compacting agents peptides derived from nuclear proteins such as histones, nucleolin, and the like can advantageously be cited.
  • the different plasmids and helper viruses can be introduced into the productive cell concomitantly or separately. In the case of a separate introduction, the order in which the different components are introduced does not seem to be essential for obtaining high titers. As illustrated in the examples, important titles have been obtained when, in the first stage, the plasmids are co-transfected in the cells then, in the second stage, the cells are infected with the helper virus
  • a specific embodiment of the invention resides in a process for producing recombinant AAV characterized in that, in a culture of cells transcomplementing the E1 and E4 functions of the adenov irus, one cotransfects, in the presence of a lipid canonical polv and of an agent compacting an AAV plasmid carrying a nucleic acid of interest bordered by AAV ITRs and a plasmid carrying the rep and cap regions of AAV, said culture is co-infected with a selected helper adenovirus among human adenoviruses of Ad2 or Ad5 origin defective for regions E1 and E4 and canine adenoviruses of CAV2 origin, then the viruses produced are harvested
  • the present invention also relates to the purified viral preparations (adenovirus and AAV) obtained according to the process of the invention, as well as any pharmaceutical composition comprising one or more defective recombinant adenovirus or AAV prepared according to this process
  • the pharmaceutical compositions of the invention can be formulated for administration by parenteral oral topical route intranasal intravenous intramuscular, subcutaneous, transdermal intraocular, ete
  • the pharmaceutical composition contains pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation. It can be in particular saline solutions (monosodium phosphate, disodium, sodium chloride potassium, calcium or magnesium, ete, or mixtures of such salts), sterile.
  • a hydrogel can be prepared from any biocompatible and non-cytotoxic (homo or hetero) polymer
  • biocompatible and non-cytotoxic (homo or hetero) polymer Such polymers have for example been described in application WO93 / 08845 Some of them, such as in particular those obtained from ethylene oxide and / or propylene are commercial
  • the doses of virus used for injection can be adapted according to different ts parameters, and in particular depending on the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or even the duration of the treatment sought
  • the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered under in the form of doses between 10 4 and 10 14 pfu, and preferably 10 6 to 10 10 pfu and the AAV, between 10 6 and 10 11 particles.
  • pfu plaque forming unit
  • plaque forming unit corresponds to the infectious power of an adenovirus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 15 days, the number of plaques of infected cells.
  • the techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • viruses thus produced can be used for the treatment or prevention of many pathologies, including genetic diseases
  • ALS ete
  • cancers pathologies linked to coagulation disorders or dyslipoproteinemias
  • pathologies linked to viral infections hepatitis, AIDS, summer
  • the present invention will be described more fully with the aid of the following examples, which should be considered as illustrative and not limiting.
  • FIG. 1 Genetic organization of the Ad5 adenovirus The complete sequence of Ad5 is available on the database and allows those skilled in the art to select or create any restriction site, and thus to isolate any region of the genome .
  • Figure 2 Genetic organization of the E4 region
  • Figure 3 Genetic organization of the E4 region in wild and defective E4 adenoviruses. The size of the deletion is represented by a thick bar.
  • FIG. 4 (A) Schematic representation of the MMTV LTR / (ORF6 +
  • AAA Polyadenylation site.
  • Figure 5 Analysis of the production of adenoviral fiber by immunological detection using a polyclonal serum against the fiber (Boulanger et al.).
  • Cell extracts are prepared after 72 hours of viral infection, dexamethazone is added at the same time as the virus (final concentration 600 nM)
  • A) Infection with the d1010 virus (MOI 10)
  • (wt) Infection with the Ad5 virus (ME 10).
  • the pBR322, pUC and phage plasmids of the M13 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories).
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracts with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol then incubations in the presence of DNA ligase from phage T4 (Biolabs) according to the recommendations of the supplier
  • the filling of the prominent 5 ′ ends can be carried out with the fragment of Klenow of E. DNA Polymerase I. coli (Biolabs) according to the supplier's specifications.
  • the destruction of the protruding 3 ′ ends is carried out in the presence of the DNA polymerase of phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by a gentle treatment with nuclease S1.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al [Nucleic Acids Res 13 (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham
  • the enzymatic amplification of DNA fragments by the technique called PCR can be performed using a "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) according to the manufacturer's specifications
  • Sequence verification nucleotides can be performed by the method developed by Sanger et al. [Proc Natl Acad Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] using the kit distributed by Amersham.
  • Example 1 Construction of plasmids carrying different functional units of the E4 region under the control of a promoter 1.1. Construction of the plasmid pE4Gen
  • the plasmid pPY2 corresponds to the cloning of the Avr2-Sall fragment (approximately 13 kb including the MMTV promoter) of the plasmid pMSG (Pharmacia) between the XbaI and Sali sites of the plasmid pIC20H prepared from an E. coli dam + context.
  • the plasmid pPY4 is derived from the plasmid pPY2 by deletion of a fragment of 35 bp after cleavage with BamHI and Bgl2 then religation
  • the plasmid pPY5 corresponds to the plasmid pIC20H in which the TaqI -Bgl2 fragment including the E4 region of the adenovirus type 5 located between positions 35576 (Taq 1) and 32490 (Bgl2), has been cloned between the ClaI and BamHI sites
  • the E4 region of the plasmid pPY5 is therefore included in an EcoRV-Sphl fragment which can be cloned after partial digestion between the sites Smal and Sphl of the plasmid pPY4, which generates the plasmid pPY6.
  • the main donor 5 ′ site for splicing located upstream of the reading phase ORF1 (towards position 35548) is therefore preserved to ensure correct alternative splicing, making it possible to generate the various expression products of all the coding phases of the E4 region and in a comparable manner to the alternative splicing observed during the viral cycle
  • the plasmid pPY13 corresponds to the cloning of the Bgl2-Xbal fragment of the plasmid pPY6 between the corresponding sites of the plasmid pIC20H.
  • This 1.6 kb fragment therefore includes the adenovirus type 5 sequence from position 341 (Bgl2) to position 32490 (Bgl2, followed by the Xbal site from the cloning multisite of the plasmid pIC20H)
  • the plasmid pPY13 therefore contains the all of the open reading phases ORF6 and ORF7 of the adenovirus, now included in an Xho l -Sph l fragment.
  • the cloning of this fragment between the Sal l and Sph l sites of the plasmid pPY4 generates the plasmid pPY 15.
  • the insertion of the Xhol fragment of the plasmid pKIXX, which carries a gene conferring resistance to geneticin in 293 cells, in the plasmid pPY 15 generates the plasmid pORF6Gen.
  • This plasmid therefore carries a selectable gene and the open reading phases ORF6 and ORF7 of the E4 region of the adenovirus expressed from the promoter of MMTV. In this particular plasmid these two genes follow each other and the respective coding sequences are carried by the same strand of DNA.
  • the first codon for initiating translation is that of the open phase ORF6 (position 34077 in the genome of Ad5). , and it is separated from the CAP site of the MMTV promoter by 235 nucleotides. Insofar as the alternative splicing is sequential and involves first of all the recognition of the 5 ′ donor site, the main 5 ′ donor site located upstream of the reading phase ORF1 (towards position 35548) has therefore not been included in the construction of the plasmid pORF6Gen to subsequently allow efficient expression of the products of the reading phases ORF6 and ORF6 / 7 (FIG. 4A).
  • the plasmid pPY14 corresponds to the cloning of the Bgl2-Xba l fragment of 1.9 kb (obtained after partial digestion with the enzyme Bgl2), of the plasmid pPY6 between the corresponding sites of the plasmid pIC20H.
  • This 19 kb fragment therefore includes the adenovirus type 5 sequence from position 34387 (Bgl2) to position 32490 (Bgl2, followed by the site
  • the plasmid pPY14 is therefore isogenic with the plasmid pPY13 with the exception that it additionally includes a Bgl2 fragment corresponding to almost all of the open reading phase ORF4.
  • This plasmid therefore contains all of the open reading phases ORF4, ORF6 and ORF7 of the adenovirus, now included in an Xho1-Sph1 fragment. The cloning of this fragment between the SalI and Sphl sites of the plasmid pPY4 generates the plasmid pPY16.
  • the insertion of the Xhol fragment of the plasmid pKIXX, which carries a gene conferring resistance to geneticin in 293 cells, into the plasmid pPY16 generates the plasmid pORF4Gen.
  • This plasmid therefore carries a selectable gene and the open reading phases ORF4, ORF6 and ORF7 of the E4 region of the adenovirus expressed from the promoter of MMTV.
  • these two genes follow each other and the respective coding sequences are carried by the same strand of DNA.
  • This example describes the construction of a plasmid comprising a functional unit of E4 (Cf example 1.2.) Under the control of a promoter derived from MMTV More particularly, this promoter is a derivative of MMTV comprising 5 elements of response to glucocorticoids, c ' ie a derivative highly inducible by glucocorticoids This plasmid was constructed in the following manner.
  • the Ad5 BglII fragment (position 341 15 to 32490) includes the sequences (ORF6 + ORF7) from the E4 region. This fragment was first cloned between the BglII and BamHI sites of the plasmid pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481), which generates the plasmid pPY13 in which the Bglll site located upstream of ORF6 is conserved. The BglII-SalI fragment of the plasmid pPY13 therefore includes all of the sequences (ORF6 + ORF7) of the E4 region of Ad5. This fragment was cloned between the BamHI and SalI sites of the plasmid pIC20H, which generates the plasmid pPY45.
  • the Xbal fragment (approximately 1 kb) of the plasmid pGRE5-1 corresponds to a promoter derived from MMTV, highly inducible by glucocorticoids.
  • This fragment was isolated and cloned between the Xbal sites of the plasmid pIC20H isolated from a dam context.
  • the plasmid obtained was designated pPY21.
  • the BglII site originating from the cloning multisite of the plasmid pIC20H is located immediately upstream of the 5 elements of the promoter capable of binding the receptor nuclear to glucocorticoids.
  • a derivative of pJY1 was also constructed containing a gene for resistance to geneticin.
  • the XhoI-SalI fragment of the plasmid pMSCV contains a bacterial gene conferring resistance to eukaryotic cells to geneticin (APH), expressed from a strong and ubiquitous promoter (PGK) in cells This fragment was cloned in the plasmid pJY 1. at the soiled site The plasmid obtained was designated pJY2
  • This plasmid contains the expression cassettes pGRE5 / (ORF6 + ORF7) and PGK / APH transcribed in the same direction. 1.5. Construction of the plasmid pGG0
  • the assembly of the GCR (HBD) and ORF6 + ORF7 parts of the E4 region of Ad5 is carried out after PCR amplification using the plasmid pSG5HGR as matrix and the deoxyoligonucleotides SEQ ID N ° 5
  • the oligonucleotide SEQ ID No. 5 therefore makes it possible to position an ATG specifying the initiation of translation upstream of the HBD domain of the GCR ranging from amino acids 539 to 777 of the GCR.
  • the oligonucleotide SEQ ID No. 6 makes it possible to position a restriction site Tth1 11 1I downstream of the HBD.
  • the PCR amplification fragment was first cloned into the commercial plasmid pCRII and the white-blue screening made it possible to select a clone whose identity was verified by sequencing (plasmid pCRII / GCR).
  • This plasmid is therefore the source of a Smal-Xhol fragment which carries the HBD domain of the GCR which has undergone PCR amplification with the oligos SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6.
  • the plasmid pMEL3 is an intermediate construction which contains the "polylinker 'EcoRl-PstI of the plasmid pSL1 180 inserted between the EcoRl and PstI sites of a derivative of the plasmid pIC20H in which the Hind3 site locates in the immediate vicinity of the Nru1 site on the" polylinker "was treated with the Klenow fragment of E coli Polymerase I and then rehgated on itself, which transforms the Hind3 site into an Nhel site
  • the plasmid pMEL3 also contains a BamHI fragment corresponding to the polyadenylation signal of SV40, previously inserted into the Bgl2 site of the "polylinker" of pIC20H
  • the Smal -Xhol fragment of the plasmid pCRII / GCR which contains the HBD domain of the GCR was then inserted between the corresponding sites of the plasmid pMEL3, which generates
  • the plasmid pPY13 ( ⁇ Hinc2-Sspl) is generated which contains a Hind3 fragment of approximately 14 kb containing the entire sequence ORF6 + ORF7 of the E4 region of Ad5, including its polyadenylation site
  • the plasmid pPY13 ( ⁇ Hinc2-Ssp1) was digested with Hind3 and its ends were filled using Klenow Polymerase This plasmid is then digested with Xhol, and the ORF6 + ORF7 sequences (approximately 1.4 kb) are then cloned between the Xhol and Nrul sites of the plasmid pMEL3 / GCR, which generates the plasmid pMEL3 / GCR-Tth1 11 1- (ORF6 + ORF7).
  • GRE5 the cloning of which between the Apal sites treated with the Klenow fragment and BamHI of the plasmid pMEL3 / GCR- (ORF6 + ORF7) generates the plasmid pMEL3 / GRE- (GCR- ORF6 + ORF7)
  • This plasmid is the source of a Bgl2-Nhe 1 fragment corresponding to the expression cassette coding for the GCR- fusion (ORF6 + ORF7) expressed from the GRE5 promoter and the cloning of which between the Bgl2 and Xbal of the plasmid pCI-Neo (Promega) generates the plasmid pGG0.
  • This example describes the construction of complementary cell lines for the E1 and E4 regions of the adenoviruses according to the invention. These lines allow the construction and propagation of recombinant adenoviruses deleted for these regions, without using a helper virus.
  • the lines of the invention were constructed by co-transfection of the selected cells in the presence of calcium phosphate, by the plasmids described in Example 1 and a construct coding for the glucocorticoid receptor (Hollenberg et al., Nature, 3 18, (1985) 635-641).
  • the cells of line 293 in dishes 5 cm in diameter were transfected with 1 to 5 ⁇ g of plasmid E4 (pE4Gen, pORF6Gen, pORF4Gen, pGG0 or pJY2) and optionally 5 ⁇ g of a receptor expression plasmid human with glucocorticoids expressed from the SV40 virus early promoter (plasmid pSG5HGR), in the presence of calcium phosphate, according to the protocol described by Graham and Van der Eb (Virology 52 (1973) 456).
  • plasmid E4 pE4Gen, pORF6Gen, pORF4Gen, pGG0 or pJY2
  • plasmid pSG5HGR a receptor expression plasmid human with glucocorticoids expressed from the SV40 virus early promoter
  • Ad2d1808 (Weinberg and Ketner, J. Virol. 57 (1986) 833).
  • Ad5d11004, d11007 or d11014 (Bridge and Ketner, J. Virol 63 (1989) 631), d1101 1 (Bridge et al., Virology 193 (1993) 794) are deletion mutants carrying significant deletions in the E4 region . These mutants are unable to replicate in 293 cells, but can be produced in W162 cells (Weinberg and Ketner, PNAS 80 (1983) 5383).
  • the 50 clones resistant to geneticin were tested for their capacity to produce these E4 viruses and therefore to transcomplement the E4 region.
  • 60 clones transfected with the plasmid pJY2, resistant to geneticin were also screened for this. ability to transcomplement the E4 region
  • each clone is infected in a liquid medium with the d1808 virus at a multiplicity of infection of approximately 0.1 PFU / cell (the viral titer is obtained on the W162 line)
  • the infection was carried out at an ego of 0.5 pfu / cell for the pJY2 clones, in a medium supplemented with dexamethazone (1 ⁇ M)
  • dexamethazone (1 ⁇ M)
  • the appearance of an amplifiable cytopathic effect by successive reinfection of the cells with the cell lysate obtained is indicative of a certain viral spread of dl808 by the cells of the clone considered
  • This transcomplementation is then objectified both by analysis of the level of viral replication and the faculty of the cells to form viral plaques (a possible protocol is described by Hitt, M; Bett, AJ; Prevec, L.
  • This step made it possible to highlight several particular clones exhibiting effective properties of transcomplementation of the E4 region.
  • the first designates Clone # 2, results from the transfection of the plasmid pORF6Gen; the second, designated Clone # 4, was isolated after transfection of the plasmid pE4Gen.
  • Stable clones capable of transcomplementing for the E4 region, and highly inducible by glucocorticoids were also obtained after transfection of the 293 cells with the plasmid pJY2.
  • other stable clones capable of efficiently propagating viruses defective for the E4 region, and highly inducible by a non-steroid compound have also been prepared.
  • clones were obtained by co-transfection of 293 cells with the plasmid pJY2 and by a plasmid expressing an artificial transactivator composed of a transactivating region (VP 16), of the region which binds DNA from the glucocorticoid receptor, and of a C-terminal truncated part of the progesterone receptor, such so this receiver hybrid is capable of transactivating the GRE's promoter in the presence of RU486 and not of steroids.
  • the clones obtained are effectively capable of effectively propagating E4-defective viruses in the presence of RU486.
  • the plasmid pGG0 alone, or an equimolecular combination of the plasmids pGG0 and pSG5HGR are transfected into permissive cells for adenovirus type 2 or 5, and the stable clones are selected in the presence of 400 mg / l of geneticin.
  • transfection of the plasmid pGG0 in 293 cells generates the clone IGRP18 which allows the propagation of the doubly defective viruses for E1 and E4 in the presence of dexamethasone (1 ⁇ M), which is not the case in the absence of addition.
  • 2.3. Ability to propagate adenoviruses deficient for E1.
  • the capacity of the prepared lines to complement the E1 region was verified after infection with the adenovirus Ad-RSVBGal
  • Ad-RSVBGal This first generation adenovirus (deficient in E1 only), comprises the LacZ gene of E.coli under the control of the virus LTR promoter RSV (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest, 90 (1992) 626).
  • the cells of clones # 2, # 4 and cells obtained with pJY2 were infected with the Ad-RSVßGal virus and viral spread was observed for each clone.
  • the cells of clones # 2 and # 4 were analyzed in Southern blot to verify the expression of the viral proteins. More particularly, the Southern Blot analysis (analysis of genomic DNA hybridizing with a radioactive probe originating from the adenoviral E4 region) was carried out according to the protocol described by Maniatis et al. To this end, the genomic DNA of cells 293 and # 2 has been prepared. 2 ⁇ g of this DNA were used as a template in a PCR reaction carried out in the presence of Taq Polymerase, oligo 1 of sequence SEQ ID No. 1 (corresponding to nucleotides 52 to 71 of the promoter MMTV) and of the oligo 2 of sequence SEQ ID No. 2 (corresponding to positions 32921-32940 of the Ad5 genome).
  • oligo amplify a 2617 bp fragment of the plasmid pORF6Gen
  • the amplification was carried out under the following conditions: denaturation at 94 ° C. for 5 min, 30 amplification cycles by denaturation at 94 ° C for 1 min, hybridization at 60 ° C for 2 min, and extension at 70 ° C for 3 min, the extension during the last cycle being extended for 10 min
  • the products amplification were then analyzed by SDS electrophoresis 1% agarose and identified by Southern Blot and hybridization with a labeled probe covering the region (ORF6 + ORF7) of the adenovirus or the MMTV region.
  • oligo 2 SEQ ID No. 2
  • oligo 3 SED ID No. 3
  • oligo 3 SED ID No. 3
  • the amplification products were analyzed in SDS 1% agarose gel and identified in Southern Blot and Hybridization with the labeled probe (ORF6 + ORF7).
  • Southern blot analyzes more particularly indicate that clone # 2 contains a copy of the MMTV- (ORF6 + ORF7) cassette integrated into its genome.
  • the integrity of this cassette has also been demonstrated by amplification using oligos 1 and 2 which generates an expected 2.6 Kb fragment, which can be specifically detected by a radiolabelled probe corresponding to the unit (ORF6 + ORF7) or to the MMTV promoter (FIG.
  • ORF6 has also been demonstrated by immunodetection of the fiber protein
  • the results obtained show that the 293 cells infected with the adenovirus Ad5 dl 1007 do not produce fibers
  • a fiber-specific signal is detected in the cells of the invention (clone # 2 in particular) after infection with this mutant, and not in the other uninfected cells
  • the presence of the fiber has also been demonstrated in the cells of the invention infected with the mutants d1808, d11004 (ORF1 + ), d1101 1 or d1 1014 (ORF4 + ) in the presence of dexamethazone.
  • clone # 2 Another advantageous property of clone # 2 according to the invention resides in the regulated and inducible character of the expression of the E4 activity.
  • the results obtained show that the formation of virus plaques is observed only in the presence of dexamethazone.
  • the expression of the adenovirus fiber protein after infection with the mutant Ad5dl1007 is significantly increased under the induction conditions (FIG. 6).
  • the same results were obtained with the mutants Ad5d1808, Ad5d11004, Ad5d1101 1 and Ad5d11014.
  • the expression of the E4 activity in clone # 4 is constitutive.
  • This example describes the use of the cell lines according to the invention for the production of deficient recombinant viruses in the E1 and E4 regions.
  • These adenoviruses were produced by homologous recombination, after co-transfection, in the cells of the invention, of two DNA fragments, one bringing the left part of the genome of the recombinant virus (having a deletion in the E1 region), the other bringing the right part of the genome of the recombinant virus (having a deletion in the E4 region)
  • the 293E4 cells (clone # 2 and # 4) were cotransfected with 10 mg of DNA from the Ad-RSVBGal virus (Stratford-Perricaudet et al.) Digested with Srf1 (or 5 mg of DNA from the plasmid having used for the construction of this virus and digested with Xmn 1), and 10 mg of the DNA of the virus providing the functional deletion of the E4 region (for example Ad2d1808, Ad5d11004, Ad5d11007 or Ad5d11014) digested with the enzyme Clal. After the cytopathic effect has appeared, the viruses are purified by at least two consecutive solid spreading cycles to form plaques on clone 2.
  • Ad-RSVBGal virus Stratford-Perricaudet et al.
  • Srf1 or 5 mg of DNA from the plasmid having used for the construction of this virus and digested with Xmn 1
  • 10 mg of the DNA of the virus providing the functional deletion of the E4 region for example
  • plaques corresponding to the infection of the virus sought are then amplified by consecutive infection cycles.
  • High titer stocks are prepared by purification on a cesium chloride gradient.
  • Viruses are stored at -80 ° C according to conventional techniques of those skilled in the art.
  • it allows propagation in a liquid medium which is particularly effective for the AD5d11014 virus (E 1 + E4- but ORF4 + ) or for the E1-E4- virus constructed from the d11014 virus.
  • clone 4 obtained after transfection of the plasmid pE4Gen is not very efficient in making plaques because it is difficult to maintain the cell confluence for a time long enough for the viral lysis plaques to be easily identifiable (and especially if the recombinant virus sought does not code for ⁇ -galactosidase)
  • An alternative production method is based on the clonal construction of the viruses according to the invention. More particularly, according to this method, the adenoviruses ⁇ E1 ⁇ E4 are produced by homologous double-recombination in vivo after co-transfection of 3 overlapping DNA fragments, each providing part of the virus genome.
  • Ad5 d11014 II overlaps fragment II on 1652 nucleotides ( Figure 7)
  • This fragment provides the right part of the genome of the recombinant virus, containing the modified E4 region ( ⁇ E4, ORF4 + ). Its contamination is once again more than improbable since it was purified after complete digestion with Nsil generating 7 fragments of size between 178 nucleotides and 4 kb.
  • the purified fragments were co-transfected into clone # 2 cells according to the protocol described for 293 cells, in the presence of 1 ⁇ M of dexamethazone in the medium (added every 4 days for 3 weeks).
  • the cells were harvested, frozen and thawed 3 times in an ice / ethanol bath, then centrifuged at 3000 g for 20 min. The cell lysate was then added to a fresh culture of clone # 2 cells (also designated IGRP2) in the presence of dexamethazone (1 ⁇ M) After 5 days, a cytopathic effect was observed, demonstrating the production of viruses.
  • a stock of this recombinant virus Ad ⁇ E1, ⁇ E4, ORF4 + was obtained after gradual amplification of the mixture inducing the cytopathic effect on 100 10 cm dishes containing clone # 2 cells under confluence, in the presence of 1 ⁇ M dexamethazone After purification on a cesium chloride gradient and dialysis at 4 ° C, the viral stock was titrated on monolayers of clone # 2 cells supplemented with dexamethazone (1 ⁇ M), before staining in vitro with X-Gal As all the plates are positive, the titer may be expressed either in pfu / ml or in viral plaque expressing ⁇ -gal.
  • a stock of 10 10 pfu was prepared The absence of RCA in this stock was then checked by restriction analyzes and in southern
  • the viral DNA of a recombinant of the stock was prepared according to the technique de Challberg (Virology 1 14 (1981) 196). 2 ⁇ g of this DNA were subjected to a restriction analysis and 1% agarose gel. The fragments were transferred to a Hybond-N membrane (Amersham) and hybridized with a radioactive probe corresponding to the ITRs of the adenovirus to specifically detect the fragments. located at the ends of the viral genome.
  • StuI generates only 2 fragments hybridizing with the ITR probe
  • One of these fragments has a mobility corresponding to that of the 1,125 bp fragment of AdRSV ⁇ gal encoding ⁇ gal, the other migrates like the StuI fragment of 2,673 bp of Ad5d11014 carrying the E4 deletion
  • Prolonged exposure of the autoradiogram does not reveal any additional band having a size corresponding to the E1 + (3158 bp) or E4 + (3980 bp) fragment.
  • This example describes the use of cell lines containing all or part of the E4 region of an adenoviral genome for the production of AAV. These AAVs were produced by co-transfection, in said cells, of an ITR-AAV plasmid and a Rep / Cap plasmid, and by co-infection with an adenovirus helper.
  • This plasmid contains a nucleic acid of interest (E. coli ⁇ -gal expression cassette composed of the LTR promoter-
  • RVS of the LacZ gene preceded by a nuclear localization signal, and of the polyadenylation site of the SV40 virus borders on 2 AAV ITRs.
  • the plasmid pMA10 was obtained by digesting the plasmid pXL2582 by Spel and by closing by treatment with the DNA ligase of the bacteriophage T4. This treatment makes it possible to remove the palindromic sequences downstream of the left ITR of the AAV.
  • the plasmid pXL2582 was obtained by ligating the following fragments into the EcoRI-KpnI sites of pXL2359 (described in application FR94 02445): a) EcoRI-Xbal (containing the left ITR of AAV up to nucleotide 155, site HinfI on the published AAV sequence) of pXL2580, and, b) XbaI-KpnI of pXL2359 (containing the expression cassette for the LacZ gene)
  • the plasmid pXL2580 was obtained from pXL2359 as follows: pXL2359 a was digested with EcoRI-Xbal and deposited on 1% agarose gel, from which a 650 bp fragment was purified This fragment was redigested by Hinfl and treated with DNA Polymerase from bacteriophage T4, cut with PstI and then deposited on 2% agarose gel, from which a 200 bp fragment was purified This fragment,
  • the plasmid used denotes p ⁇ Bal, has been described by Lebkowski et al (Mol. Cel. Biol. 8 (1988) 3988). This plasmid contains the rep and cap regions of the AAV under the control of the endogenous promoter P5. Other promoters can be substituted for the P5 promoter, such as in particular the promoter constituting the LTR-RVS.
  • the adenovirus helper used is a wild Adenovirus Ad5. It is understood that other helper viruses can be used, and in particular an Ad5 defective for the E1 and / or E4 region, or a canine adenovirus.
  • the advantage of using a canine adenovirus lies in their capacity to support the replication of AAVs while being defective viruses in humans. Therefore, the AAVr preparations obtained are totally devoid of RCA and of contaminating human adenovirus. .
  • the production was carried out by transfection of 20 dishes of 5 cm in diameter of Clone # 2 cells (IGRP2), at a density of approximately 3.10 cells per dish, previously inoculated 24 to 48 hours in 10% FCS MEM medium.
  • IGRP2 Clone # 2 cells
  • In each dish were co-transfected 1 ⁇ g of plasmid pMA10 and 5 ⁇ g of plasmid p ⁇ Bal in the presence of 16 ⁇ g of peptide H1, 16.5 ⁇ l of lipofectamine (Gibco-BRL, Life Technologies) and OPTIMEM lipofectamine (Gibco- BRL, Life Technologies) according to the supplier's recommendations
  • the transfection mixture was removed and the cells were infected for one hour with the adenovirus helper, with an infectivity of 10 virus pfu per cell in a final volume of 500 ⁇ l MEM10% FCS medium + 10 M dexamethasone was then added.
  • the cells were harvested 5 days later, taken up in a 10 mM Tris HCl buffer, pH 8, lysed by 3 freezing and thawing, then treated with sodium deoxycholate and trypsin at the respective concentrations of 0.25% and 1% for 30 min at 37C.
  • the recombinant AAVs produced were then purified on a gradient of cesium chloride at a density of 1.4, in a rotor SW55.1 at 35000rpm for 20 hours.

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Abstract

L'invention concerne des cellules utilisables pour la production d'adénovirus défectifs comprenant, insérée dans leur génome, une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus portant la phase de lecture ORF6 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel.

Description

C ELLULES POUR LA PRODUCT ION D'ADENOVIRUS RECOMBINANTS
La présente invention concerne de nouvelles lignées cellulaires utilisables pour la production d'adénovirus recombinants defectifs. Elle concerne également les préparations virales purifiées produites dans ces lignées, ainsi que les plasmides permettant leur construction. Plus particulièrement, les nouvelles lignées cellulaires selon l'invention permettent la transcomplementation de la région E4 et une production clonale avec des titres élevés d'adénovirus recombinants defectifs notamment pour tout ou partie de la région E4.
Les adenovirus présentent certaines propriétés particulièrement avantageuses pour une utilisation comme vecteur de transfert de gènes en thérapie genique Notamment, ils ont un spectre d'hôte assez large, sont capables d'infecter des cellules quiescentes, ne s'intègrent pas au génome de la cellule infectée, et n'ont pas ete associes a ce jour a des pathologies importantes chez l'homme Les adenovirus ont ainsi ete utilises pour transférer des gènes d'intérêt dans le muscle (Ragot et al., Nature 361 ( 1993) 647), le foie (Jaffe et al., Nature genetics 1 ( 1992) 372) le systeme nerveux (Akh et al., Nature genetics 3 ( 1993) 224) ete
Les adenovirus sont des virus a ADN double brin linéaire d'une taille de 36 kb environ. Leur génome comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) a chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs (Cf figure 1 ). Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions E 1, E2, E3 et E4 Parmi ceux-ci les gènes contenus dans la région E 1 notamment sont nécessaires a la pi opagation virale . Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions L 1 à L5 Les génome de l'adenovirus Ad5 a ete entièrement séquence et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260) De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adenoviraux (Ad2, Ad7, Ad 12, ete) ont également ete sequencees. Pour leur utilisation en thérapie genique, différents vecteurs dérives des adenovirus ont ete prépares, incorporant différents gènes (β-gal, OTC, α-1AT, cytokines, ete) Dans chacune de ces constructions, l'adenovirus a ete modifie de manière à le rendre incapable de replication dans la cellule infectée Ainsi, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adenovirus deletes de la région E1 , essentielle à la replication virale, au niv eau de laquelle sont insérées les séquences d'ADN heterologue (Levrero et al., Gène 101 ( 1991 ) 195, Gosh-Choudhury et al., Gène 50 (1986) 161). Ces adenovirus sont produits dans une lignée de complémentation (lignée 293) dans laquelle une partie du génome de l'adenovirus a ete intégrée Plus précisément la lignée 293 contient 1 extrémité gauche (env iron I 1 - 12%) du génome de l'adenovirus serotvpe 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche la région d encapsidation la région E1 incluant E1 a, E1b la région codant pour la protéine pIX et une partie de la région codant pour la protéine pIVd2. Cette lignée est capable de transcomplementer des adenovirus recombinants defectifs pour la région E 1 . c est-a-dire dépourvus de tout ou partie de la région E1, et de produire des stocks viraux ayant des titres élevés Cependant, les vecteurs déficients pour la région E1 (vecteurs E l -, dits de première génération) présentent certains inconvénients pour une utilisation thérapeutique En particulier, ils pourraient ne pas être totalement defectifs pour la replication in vivo, en raison notamment de l'existence de certaines fonctions cellulaires transcomplementantes Ainsi une activité de transcomplementation de E1 a ete mise en évidence dans les cellules de carcinome embryonnaire F9 (Impériale et al., Mol Cell Biol 4, 1984 867-874). Une activité de même type, régulée par l'interleukine-6 a également ete mise en évidence (Spergel et al., J Virol . 66, 1992, 1021 - 1030) D autres inconvénients lies a ces v ecteurs sont la présence de nombreux gènes viraux, susceptibles d'être exprimes in vivo après transfert de gènes, et d'induire une réponse immunitaire et/ou inflammatoire.
Pour pallier a ces inconvénients, il a ete propose de créer d'autres deletions ou modifications dans le génome de l'adenovirus Ainsi, une mutation ponctuelle thermosensible a ete introduite dans le mutant tsl 25, permettant d inactiver la protéine de liaison a l'ADN (DBP) de 72kDa (Van der Vliet et Sussenbach Virology 67 197S 41 5-426) Ces vecteurs peuvent également être produits av ec des titres élevés dans les cellules de la lignée 293 a la température permissive (32°C) Toutefois, ce type de vecteur présente aussi un certain nombre d'inconvénients tels qu'une surexpression in vivo de la région E4; la présence d'une mutation ponctuelle, donc sujette a reversion, un risque d'activité partielle a 37°C ete
Une autre approche pour remédier a ces problèmes réside dans la deletion d'une autre région essentielle a la replication et/ou a la propagation virale A cet égard, la demanderesse s'est intéressée plus particulièrement a la région E4 La région E4 est en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la replication de l'ADN viral Des vecteurs adenoviraux dans lesquels les régions E 1 et E4 sont deletees possèdent donc un bruit de fond de transcription et une expression de gènes viraux très réduits (voir notamment la demande PCT/FR94/00851 ) Toutefois, la construction et l'exploitation industrielle et thérapeutique de tels vecteurs implique la mise à disposition d'un système efficace de transcomplémentation de ces deux fonctions pour la production des stocks viraux.
La présente invention apporte une solution à ce problème. La présente invention fournit en effet des lignées cellulaires permettant la transcomplémentation de la région E4 et une production clonale et avec des titres élevés d'adénovirus recombinants defectifs pour cette région. Les lignées selon l'invention sont avantageusement capables de transcomplémenter les deux fonctions E1 et E4, et permettent donc de produire des virus déficients pour ces deux fonctions. La présente invention fournit également des plasmides permettant la construction de ces lignées; un procédé de préparation d'adénovirus recombinants defectifs et des stocks viraux purifiés Plus particulièrement, la demanderesse a maintenant montré que des lignées de production capables de transcomplémenter efficacement la région E4 sont obtenues par introduction d'une partie seulement de la région E4. Ainsi, des lignées ayant des propriétés particulièrement avantageuses sont obtenues lorsque seulement une unité fonctionnelle réduite de la région E4, correspondant à la phase de lecture ORF6 ou aux phases de lecture ORF6 et ORF6/7, sont présentes.
Un premier objet de l'invention réside donc dans un cellule utilisable pour la production d'adénovirus recombinants defectifs comprenant, insérée dans son génome, une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus comportant la phase de lecture ORF6 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel. Selon un mode préféré, les cellules de l'invention comprennent une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus comportant les phases de lecture ORF6 et ORF6/7 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel.
Comme indiqué ci-avant, les lignées cellulaires selon la présente invention présentent des propriétés particulièrement avantageuses Elles permettent tout d'abord la transcomplémentation des fonctions E1 et E4. Mais, de manière particulièrement avantageuse, elles sont capables d'induire la formation de plages de virus déficients dans ces fonctions, ce qui est indispensable au clonage des virus recombinants, puis à leur amplification et à leur purification. A cet égard, la demanderesse a en effet montré que des lignées possédant l'ensemble de la région E4 ou des unités fonctionnelles plus grandes, incluant par exemple la phase de lecture ORF4, sont incapables de former des plages de virus déficients pour la région E4. L'identification d'unités fonctionnelles spécifiques de la région E4 permet la réalisation d'un système très efficace de transcomplémentation et de production de virus defectifs pour les fonctions E1 et E4. D'autres avantages des lignées selon l'invention sont notamment leur aptitude pour l'amplification en milieu liquide de tels virus déficients poui les régions E 1 et E4 les titres élev és de tels v irus qu elles produisent, et l'absence de production de particule virale replicative contaminante.
La région E4 du génome adenoviral est constituée de 7 phases ouvertes de lecture, désignées ORF 1 , ORF2, ORF3, ORF4 ORF3/4 ORF6 et ORF6/7 (figures 2 et 3) Comme indique ci-avant les cellules de l'invention sont caractérisées particulièrement par la présence d'une partie seulement de cette région, comprenant la phase de lecture ORF6 éventuellement associée a la phase de lecture ORF6/7. Il est particulièrement important que la partie de la région E4 présente dans les cellules de l'invention ne contiennent pas la phase de lecture ORF4 fonctionnelle Avantageusement, la région E4 présente dans les cellules de l'invention ne contient pas les phases de lecture ORF 1 -ORF4 fonctionnelles De manière particulièrement préférée, la région E4 présente dans les cellules de l'invention est deletee d'une partie au moins des phases de lecture ORF 1 -ORF4 Ces différentes parties de la région E4 peuvent être obtenues par coupures en/vmatiques ou modifiées selon les méthodes connues de l'homme du métier Selon un mode de réalisation préfère les lignées cellulaires de l'invention comprennent un fragment insère contenant moins de 2 kb de la région E4 d'un génome d'adénovirus contenant la totalité des phases de lecture ORF6 et éventuellement ORF6/7 A titre d'exemples préfères, la phase de lecture ORF6 peut être isolée de la région E4 sous forme d'un fragment BglII-PvuII, correspondant aux nucleotides 341 15-33126, et les phases de lecture ORF6-ORF6/7 peuvent être isolées de la région E4 sous forme d'un fragment BglII-BglII correspondant aux nucleotides 341 15-32490 du génome de l'Ad5 Selon un mode particulier de l'invention, la phase de lecture ORF6 est fusionnée en phase traductionnelle avec le domaine d un i ecepteui nucleaire qui est responsable de la reconnaissance de son ligand spécifique Le domaine de fixation a l'hormone (HBD Hormone Binding Domain) du récepteur aux glucocorticoides (GCR HoUenberg et al 1985, Nature, 318, 635-341) est avantageusement choisi car il permet de retenir, dans le compartiment cytoplasmique de la cellule, la protéine de fusion en absence d'hormone (T MATTIONI et al., 1994, Methods in Cell Biologv Chapter 16 335-352) grâce a l'interaction stable du HBD (GCR) avec la protéine cytoplasmique hsp90 et d'autres cofacteurs (S P BOHEN et al., 1995, Science, 268, 1303- 1304) La présence de l'hormone provoque alors la translocation de la protéine de fusion du cytoplasme dans le nov au, ce qui permet la fonctionnalité de l'activité ORF6 de E4 dans le compartiment nucléaire II est également possible que l'ajout d'hormone provoque un "demasquage" des domaines fonctionnels de l'activité ORF6 par un changement transconformationnel de la protéine hybride A cet égard, un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention est constitué par une cellule comprenant, inséré dans son génome, un fragment BglII-BglII correspondant aux nucleotides 341 15-32490 du génome de l'Ad5 Ce fragment est présent notamment dans le plasmide pORF6Gen décrit dans les exemples, utilisé pour la construction de la lignée cellulaire clone#2 Un autre mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention est constitué par une cellule comprenant, inséré dans son génome, un fragment BglII-PvuII correspondant aux nucleotides 341 15-33126 du génome de l'Ad5 Dans un autre mode de l'invention, la région ORF6 au moins, est couplée au HBD du GCR, soit à son extrémité C-terminale (fusion GCR-ORF6), soit à son extrémité N-terminale (fusion ORF6-GCR). Dans le cas de la fusion C-terminale, la séquence du virus codant pour ORF6 et ORF7 est avantageusement insérée en phase traductionnelle en aval de la séquence spécifiant le HBD du GCR. Dans cette réalisation particulière, l'expression du gène chimérique génère alors un ARN primaire dont le produit de traduction est la protéine GCR-ORF6 (SEQ ID N°7). L'épissage alternatif de ce transcript génère quant à lui un ARN messager qui code pour la protéine fusion GCR-ORF6/7 (cf Exemple 1.5).
La partie de la région E4 présente dans les cellules selon l'invention peut être issue d'adénovirus de différentes origines ou sérotypes. Il existe en effet différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable Plus particulièrement, la région E4 présente dans les cellules selon l'invention peut être issue d'un adenovirus d'origine humaine ou animale.
Concernant les adenovirus d'origine humaine, on peut citer préférentiellement ceux classés dans le groupe C. Plus préférentiellement encore, parmi les différents sérotypes d'adénovirus humain, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adenovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5). Parmi les différents adenovirus d'origine animale, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention des adenovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adenovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC NR-800) par exemple] . D'autres adenovirus d'origine animale sont cités notamment dans la demande WO94/26914 incorporée à la présente par référence.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention; la partie de la région E4 est issue d'un génome d'adénovirus humain du groupe C. De manière plus préférentielle, elle est issue du génome d'un adenovirus Ad2 ou Ad5.
Comme indiqué précédemment, la partie de la région E4 présente dans les cellules de l'invention est placée sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans lesdites cellules Avantageusement, il s'agit d'un promoteur inductible, permettant de contrôler les niv eaux et/ou les périodes d'expression de ces gènes. De manière particulièrement avantageuse, il s'agit du promoteur du LTR de MMTV (Pharmacia), qui est induit par la déxaméthasone ou d'un promoteur régulé par la tétracycline (WO94/29442, WO94/04672) Il est entendu que d'autres promoteurs peuvent être utilisés, et notamment des variants du LTR de MMTY portant par exemple des régions hétérologues de régulation (régions "enhancer" notamment).
Dans un mode de réalisation particulier, l'expression des gènes hybrides est sous le contrôle de promoteurs régulés afin d'éviter une accumulation constitutive de la protéine de fusion dans le cytoplasme, ou pour minimiser la "fuite" vers le compartiment nucléaire et une certaine cytotoxicité Dans un mode de réalisation encore plus particulier, le gène chimérique est sous le contrôle d'un promoteur inductible qui répond aux glucocorticoides tel que le promoteur GRE5 (S. Mader and J White, 1993, PNAS, 90, 5603-5607. cf Exemple 1 .5). Les cellules selon l'invention peuvent être préparées à partir de différentes cellules pharmaceutiquement utilisables, c'est-à-dire cultivables dans des conditions industriellement acceptables et n'ayant pas de caractère pathogène reconnu II peut s'agir de lignées cellulaires établies ou de cultures primaires et notamment de cellules de rétine embryonaire humaine II s'agit avantageusement de cellules d'origine humaine, infectables par un adenovirus A cet égard, on peut citer les cellules KB, Hela, 293, Vero, gmDBP6, etc.
Les cellules de la lignée KB sont issues d'un carcinome épidermique humain. Elles sont accessibles a l'ATCC (réf. CCL17) ainsi que les conditions permettant leur culture La lignée de cellules humaines Hela est issue d'un carcinome de l'épithelium humain. E1le est également accessible à l'ATCC (réf. CCL2) ainsi que les conditions permettant sa culture. Les cellules de la lignée 293 sont des cellules de rein embryonnaire humain (Graham et al , J Gen Virol 36 ( 1977) 59). Cette lignée contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome de l'adenovirus humain Ad5 ( 12 %). La lignée de cellules gm DBP6 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624) est constituée de cellules Hela portant le gène E2 d'adénovirus sous le contrôle du LTR de MMTV. II peut s'agir également de cellules d'origine canine ( BHK, MDCK, ete) A cet égard, les cellules de la lignée canines MDCK sont préférées Les conditions de culture des cellules MDCK ont ete décrites notamment par Macatney et al., Science 44 ( 1988) 9. Les lignées cellulaires selon l'invention peuvent ètie construites de différentes manières De façon générale, elles sont préparées par transformation d'une culture cellulaire avec un plasmide portant le fragment sélectionné de la région E4 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel La transfection des cellules peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment en présence de phosphate de calcium, par électroporation, ete Selon un mode particulier de réalisation, le plasmide utilisé porte également un gène marqueur permettant d'identifier et de sélectionner les cellules transformées II peut s'agir notamment de tout gène de résistance à un antibiotique (généticine, hygromycine, ete). Le gène marqueur peut également être porté par une construction séparée, co-transfectée avec le plasmide Après transfection et sélection pour le gène marqueur, les cellules obtenues peuvent être sélectionnées pour leur capacité à transcomplémenter des adenovirus dépourvus de la région E4 Pour cela, différents adenovirus mutants defectifs pour différentes parties de la région E4 peuvent être utilisés, tels que notamment les adenovirus Ad2dl808 (Weinberg et Ketner, J Virol 57 ( 1986) 833), Ad5dll 004, dl 1007 ou dl 1014 (Bridge et Ketner, J Virol 63 (1989) 631 ), d1101 1 (Bridge et al., Virology 193 ( 1993) 794), comme indiqué dans les exemples.
Avantageusement, les cellules selon l'invention sont également capables de transcomplémenter pour la région E1. Celles-ci peuvent être construites comme décrit ci-avant a partir de cellules qui transcomplémentent déjà la région E 1 (exemple cellules 293), ou par introduction séquentielle d'une construction apportant la région E1 et d'une construction apportant la partie de la région E4 selon l'invention, par exemple dans des retinoblastes d'origine humaine.
Selon un mode particulièrement préféré, les cellules selon l'invention dérivent de la lignée cellulaire 293 A cet égard, des résultats particulièrement avantageux ont été obtenus avec des cellules de la lignée 293 transformées par le plasmide pORF6Gen ou le plasmide pGG0 qui code pour les protéines HBD-ORF6 et HBD-ORF6/7.
La présente invention décrit également la construction de plasmides comprenant une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus portant la phase de lecture ORF6 ou ORF6 et ORF6/7 sous contrôle d'un promoteur inductible (voir notamment les plasmides pORF6Gen et pGG0). Ces plasmides peuvent être utilisés directement pour transfecter une population cellulaire choisie, puis, par sélection, pour l'identification de cellules ayant acquis stablement la fonction E4. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation des cellules décrites ci-avant pour la production d'adénovirus recombinants defectifs au moins pour la région E4 L'invention fournit en effet un procédé de production d'adénovirus recombinants defectifs au moins pour la région E4 particulièrement avantageux, mettant en oeuvre les cellules ci-avant Selon ce procédé, on transforme une culture de cellules telles que décrites ci-avant avec un ou plusieurs plasmides apportant les difïei entes régions du génome dudit adenovirus recombinant défectif puis on récolte les virus produits Ce procède est particulièrement avantageux pour la production d'adénovirus possédant des régions E1 et E4 non fonctionnelles II s'agit notamment de vecteurs dans lesquels les régions E1 et E4 ont été inactivées ou rendues non fonctionnelles par délétion totale ou partielle De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyen des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes La ou lesdites modifications génétiques peuvent être localisées dans une partie codante de la l égion, ou en dehors d'une région codante et pai exemple dans les régions responsables de l'expression et/ou de la régulation transcriptionelle desdits gènes La deletion peut être effectuée par digestion au moyen d'enzymes de restriction appropriées, puis ligature, selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
Selon un mode particulièrement avantageux, le procédé de l'invention est utilisé pour la production d'adénovirus recombinants dans lesquels la région E1 est inactivée par délétion d'un fragment PvuII-BglII allant du nucléotide 454 au nucléotide 3328, sur la séquence de l'adenovirus Ad 5 Cette séquence est accessible dans la littérature et également sur base de données (voir notamment Genebank nº M73260) Dans un autre mode de réalisation préfère, la région E1 est inactivée par délétion d'un fragment HinfII-Sau3A allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446 Dans un mode particulier, le procède permet la production de vecteurs comprenant une délétion de la totalité de la région E4 Ceci peut être réalisé par excision d'un fragment Maell-Mscl correspondant aux nucleotides 35835- 32720 Les lignées cellulaires selon l'invention sont en effet capables de transcomplémenter et d'amplifier des adenovirus portant tout type de délétion ou inactivation de la région E4 Dans un autre mode particulier, seule une partie fonctionnelle de E4 est deletee Cette partie comprend au moins les phases ORF3 et ORF6 A titre d'exemple, ces phases codantes peuvent être déletees du génome sous forme de fragments Pvull-AluI et BglII-Pvull respectivement, correspondant aux nucleotides 34801 -34329 et 341 15-33126 respectivement Les délétions de la région E4 du virus Ad 2 dl808 ou des virus Ad5 dl 1004, Ad5 d11007, Ad5 d1101 1 ou Ad5 d11014 peuvent également être utilisées dans le cadre de l'invention A cet égard, les cellules de l'invention sont particulièrement avantageuses pour la pi oduction de virus comprenant une région E1 inactive et une deletion dans la région E4 du type de celle présente dans le génome de Ad5 d11014. c'est-a-dire de virus E4- conservant la phase de lecture ORF4.
La présente invention décrit donc également des adenovirus recombinants defectifs dont le génome comprend une délétion dans la région E1 et une délétion dans la région E4 Plus particulièrement, elle décrit des adenovirus recombinants defectifs dont le génome comprend une deletion dans la région E1 et une deletion dans la région E4 correspondant au moins aux phases de lectures ORF3 et ORF6 Ainsi, les adenovirus selon l'invention comportent préférentiellement les délétions suivantes affectant tout ou partie des régions E1 et E4
- Adenovirus ΔE1,ORF3-,ORF6-: délétion de tout ou partie de la région E1 et des nucleotides 34801-34329 et 341 15-33126 de la région E4;
- Adenovirus ΔE l ,ΔE4,ORF l -r délétion de tout ou partie de la région E l et de la région E4 à l'exception de la phase de lecture ORF1 Cette délétion dans la région E4 couvre préférentiellement les nucleotides 33093 (Smal) à 35053 (AccIII) Elle est obtenue par exemple à partir du mutant Ad5 dl1004 D'autres délétions peuvent être utilisées pour la réalisation d'adénovirus ΔE1,ΔE4,ORF1+ de l'invention, sur la base des informations données dans le présente demande et de la séquence nucléotidique SEQ ID n° 4 Cette séquence double brin représente la partie droite du génome adénoviral, incluant la région E4 et 1'ITR droite du nucléotide 32749 (1 sur SEQ ID n°4) à 35935 (3186 sur SEQ ID n°4). Il s'agit d'une séquence purement illustrative et d'autres séquences publiées sont également utilisables Les différentes phases de lecture de la région E4 sont représentées, notamment ORF7, ORF6, ORF4, ORF3, ORF2 et ORF1 Un adenovirus ΔE1 ,ΔE4,ORF1+ de l'invention comprend avantageusement une délétion dans la région E1 et une délétion d'un fragment dont l'extrémité 5' est comprise dans la phase de lecture ORF7 et dont l'extrémité 3' est située dans la phase de lecture ORF2 Encore plus préférentiellement, la délétion concerne un fragment dont l'extrémité 5' est comprise entre les nucleotides 32920 à 33190 du génome de l'adenovirus et dont l'extrémité 3' est comprise entre les nucleotides 34710 à 35090 du génome adénoviral Cette deletion correspond environ aux nucleotides 1 70 à 440 (extrémité 5') et 1960 à 2340 (extrémité 3') sur la séquence SEQ ID n°4.
- Adenovirus ΔE 1 ,ΔE4,ORF4+ délétion de tout ou partie de la région E1 et de la région E4 à l'exception de la phase de lecture ORF4 Un adenovirus ΔE1 ,ΔE4,ORF4+ de l'invention comprend avantageusement une délétion dans la région E1 , une délétion d'un fragment dont l exti emité 5 est comprise dans la phase de ieciui e ORF7 et dont l'extremite 3' est située dans la phase de lecture ORF6 (à l'exception de la partie chevauchant la phase de lecture ORF4), et une délétion d'un fragment dont I extrémité 5' est comprise dans la phase de lecture ORF3 et dont l'extrémité 3' est située dans la phase de lecture ORF1 ou dans la région promotrice de E4 Plus préférentiellement, ces adenovirus selon l'invention comprennent :
(i) une délétion de tout ou partie de E1,
(ii) une délétion d'un fragment dont l'extrémité 5' est comprise entre les nucleotides 32920 à 33190 du génome de l'adenovirus et dont 1 extrémité 3' est comprise entre les nucleotides 33200 à 34000 du génome adénoviral, et,
(iii) une délétion d'un fragment dont l'extrémité 5' est comprise entre les nucleotides 34360 à 34700 du génome de l'adenovirus et dont I 'extrémité 3' est comprise entre les nucleotides 35150 à 35530 du génome adénoviral.
Les positions correspondantes de la délétion (n ) sur la séquence SEQ ID n° 4 sont 180 à 445 (extrémité 5') et 450 à 1250 (extrémité 3') Les positions correspondantes de la délétion (iii) sur la séquence SEQ ID n° 4 sont 1610 a 1950 (extrémité 5') et 2410 à 2870 (extrémité 3').
Ces délétions dans la région E4 couvrent préférentiellement les nucleotides 33093(SmaI)-33695 et 34634 (SspI)-35355(SmaI ) Elles peuvent être obtenues par exemple à partir du mutant Ad5 d11014.
- Adenovirus ΔE 1 ,ΔE4 délétion de tout ou partie de la région E 1 et des nucleotides 32720-35835, ou 33466-35355 (cette délétion peut être obtenue par exemple a partir du mutant Ad5 d11007) ou 33093-35355 (cette délétion peut être obtenue par exemple a partir du mutant Ad5 d1101 1 ). Ces 3 délétions couvrent la totalité de la région E4. Comme indiqué ci-avant, la délétion dans la région E1 couvre avantageusement tout ou partie des régions E1 A et E1B Cette délétion doit être suffisante pour rendre le virus incapable de replication autonome dans une cellule La partie de la région E l delétee dans les adenovirus selon l'invention couvre avantageusement les nucleotides 454-3328 ou 382-3446 Les positions données ci-dessus font référence a la séquence de l'adenovirus Ad5 sauvage telle que publiée et accessible sur base de donnée Bien que des variations mineures puissent exister entre les différents sérotypes d'adénovirus, ces positions sont généralement applicables a la construction d'adénovirus recombinants selon l'invention a partir de tout serotype, et notamment des adenovirus Ad2 et Ad7.
Par ailleurs, les adenovirus de l'invention peuvent posséder d'autres altérations au niveau de leur génome. En particulier, d'autres région peuvent être délétées pour augmenter la capacité du virus et réduire ces effets secondaires lies a l'expression de gènes viraux Ainsi, tout ou partie de la région E3 ou IVa2 notamment peut être délétée. Concernant la région E3, il peut cependant être particulièrement avantageux de conserver la partie codant pour la protéine gp 19K Cette protéine permet en effet d'év iter que le vecteur adenov irus fasse l'objet d'une reaction immunitaire qui (i) limiterait son action et (ii) pourrait avoir des effets secondaires indésirables Selon un mode particulier, la région E3 est délétée et la séquence codant pour la protéine gp19k est réintroduite sous contrôle d'un promoteur heterologue.
Les adenovirus recombinants selon l'invention possèdent des propriétés particulièrement attractives pour une utilisation en thérapie genique Ces vecteurs combinent en effet des propriétés d'infection, de sécurité (les risques de réaction immunitaire et/ou inflammatoire sont fortement réduits) et de capacité de transfert de gènes très élevées De plus, les lignées de l'invention permettent la production de stocks viraux totalement dépourv us de particules replicatives contaminantes (RCA) Ainsi, les résultats présentes montrent la construction et la production par les lignées de l'invention d'adénovirus defectifs pour les régions E1 et E4, dépourvus de RCA En particulier, l'apparition de particules contaminantes replicatives E4+ lors de la production des virus ΔE1,ΔE4,ORF1+, ΔE1,ΔE4,ORF4+ ou ΔE1,ΔE4 selon l'invention n'est pas possible avec les lignées de l'invention puisque (i) ces virus ne contiennent pas de séquences recouvrantes de part et d'autres de la région intégrée dans le génome de la cellule (Figure 3) et (ii) un événement de recombinaison homologue simple entre les régions cellulaires et virales générerait un virus non viable dépourvu d'ITR droite. Un autre avantage des virus selon l'invention réside dans leur capacité de clonage accrue, permettant l'insertion de transgenes de grande taille (supérieure a 10kb). Ceci permet en particulier l'utilisation de séquences régulatrices de la transcription permettant d'améliorer l'efficacité, la régulation et la durée d'expression. Ceci permet en outre d'utiliser des doses plus faibles de virus et d'obtenir un effet thérapeutique comparable avec des effets secondaires cytopathiques très réduits Comme indique avant, les adenovirus constituent des vecteurs de transfert de gènes très efficaces pour des applications de thérapie genique et cellulaire Pour cela, une séquence d'acides nucléiques heterologue dont le transfert et/ou l'expression dans une cellule, un organe ou un organisme est recherche peut être insérée dans leur génome Cette séquence peut comporte! un ou plusieurs gènes thérapeutiques, tels qu'un gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits avant un effet thérapeutique Parmi les produits thérapeutiques, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérives sanguins, les hormones, les lymphokines interleukines, interférons, TNF, ete (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques BDNF. CNTF, NGF, IGF. GMF, aFGF, bFGF, NT3 NT 5, etc. les apolipoproteines ApoA1, Apo AIV, ApoE, ete (WO94/25073), la dystrophine ou une minidystrophine (WO93/06223 ), les gènes suppresseurs de tumeurs p53, Rb, Rap lA, DCC, k-rev, ete (WO94/24297), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation Facteurs VII, VIII, IX, ete, les gènes suicides Thymidine kinase, cytosine désaminase, ete, ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, ete, WO94/29446), ete Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloque; ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308 Le gène thérapeutique peut peut aussi être un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme une réponse immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins II peut s'agir notamment de peptides antigeniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212)
Généralement, la séquence d'acides nucléiques heterologue comprend également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule infectée, ainsi qu'une région située en 3' du gène d'intérêt, et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadenylation L'ensemble de ces éléments constitue la cassette d'expression Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule infectée II peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques) Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux ou de toute séquence promotrice ou dérivée, stimulant ou ieprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de façon inductible ou non A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes E1 A, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, ete Parmi les promoteurs eucarvotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires (HPRT vimentine α-actine tubuline ete), les promoteurs des filaments intermédiaires (desmine neurofilaments, kératine, GFAP, ete) les promoteurs de gènes thérapeutiques (type MDR, CFTR, facteur VIII, ete) les promoteurs spécifiques de tissus (pyruvate kinase, villine. promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras, promoteur de l'actine α des cellules du muscle lisse, promoteurs spécifiques pour le foie ; Apo AI, Apo AII, Albumine humaine ete) ou encore les promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroides, récepteur de l'acide rétinoique, ete,) En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées pai addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expiession tissu-specifique ou majoritaire Par ailleurs, lorsque l'acide nucléique insère ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être insère dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence.
Par ailleurs, la séquence d'acides nucléiques heterologue peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle
La cassette d'expression du gène thérapeutique peut être insérée en différents sites du génome de l'adenovirus recombinant, selon les techniques décrites dans l'art antérieur Elle peut tout d'abord être insérée au niveau de la délétion E1. Elle peut également être insérée au niveau de la région E3, en addition ou en substitution de séquences Elle peut également être localisée au niveau de la région E4 délétée.
Les cellules selon l'invention peuvent également être utilisées pour la production de virus adeno-associes (AAV) recombinants Ceci constitue une autre application particulièrement avantageuse des cellules de l'invention Ces cellules permettent en effet d'obtenir des titres élevés d'AAVr, totalement dépourvus de virus réplicatifs contaminants A cet effet, la présente invention concerne également l'utilisation d'une cellule comprenant, insérée dans son génome, tout ou une partie de la région E4 du génome d'un adenovirus comportant au moins la phase de lecture ORF6 pour la production d'AAV recombinants Les cellules sont avantageusement telles que définies ci-av ant
L'AAV est un virus a ADN de la famille des parvovirus humains, de taille relativement réduite, qui s'intègre dans le génome des cellules qu'il infecte, de manière stable et site-spécifique Les AAV sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé II comprend environ 4700 bases, et contient a chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de replication pour le virus Le reste du génome est divise en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation la partie gauche du génome, qui contient le gène rep implique dans la replication virale et l'expression des gènes viraux, la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus L'utilisation de vecteurs dérives des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088, WO 93/09239; US 4,797,368, US5, 139,941 , EP 488 528) Dans les AAV recombinants, les gènes rep et cap sont généralement déletes et remplacés par un gène d'intérêt
L'une des difficultés limitant l'utilisation des AA V comme vecteur de thérapie genique provient du fait que l'AAV ne se réplique efficacement que dans les cellules co-infectées par un virus helper comme par exemple l'adenovirus ou le virus de l'herpès La préparation d'AAV recombinants defectifs implique donc la présence de 3 composants qui doivent être cotransfectés et co-infectés dans la cellule de production un v irus auxiliaire (par exemple un adenovirus), un plasmide contenant une séquence nucléique d'intérêt bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV.
L'inconvénient majeur de ce système est qu'il utilise un virus helpei Celui-ci est généralement réplicatif et présent en mélange avec les AAVr produits Les stocks viraux sont donc potentiellement contaminés par un virus helper ce qui rend ces stocks incompatibles avec une utilisation thérapeutique En outre, en raison du nombre élevé de composants impliques dans ce procédé, les titres de virus obtenus sont assez faibles, de l'ordre de 108. La présente invention permet de remédier à ces inconvénients La présente invention fournit en effet un procède efficace de production d'AAVr, permettant d'obtenir des stocks de virus a titres très élevés (supérieurs à 10 ), non contamines par un virus replicatif.
Cinq gènes de l'adenovirus sont nécessaires à la replication de l'AAV E1 A, E1B, E2A, VA et E4 Ces gènes doivent être présents et s'exprimer dans la cellule productrice pour une production optimale de particule infectieuses Selon le procédé de l'invention, on utilise maintenant une lignée cellulaire de production contenant déjà dans son génome certains de ces gènes, et notamment tout ou partie de la région E4, préférentiellement combinée a la région E1. L'intérêt d'utiliser ce type de lignée cellulaire est que cela permet d'utiliser un adenovirus helper défectif, c'est-a-dire non capable de générer de manière autonome des particules infectieuses Ainsi, les stocks d'AAVi produits sont non contaminés
En effet, les fonctions intégrées dans la lignée peuvent être deletees du génome de l'adenovirus helper. Ceci est particulièrement avantageux poui l'utilisation d un adenov irus helper d'origine humaine Ainsi, dans une lignée cellulaire telle que décrite ci-dessus capable de transcomplémenter les fonctions E1 et E4 de l'adenovirus, il est possible d'utiliser un adenovirus helper d'origine humaine (ad5 ou ad2 par exemple) défectif pour ces fonctions Un tel adenovirus helper ne pouvait être utilisé efficacement dans les procèdes de l'art antérieur car l'absence de régions essentielles à la production d'AAVr (E 1 et E4) limitait considérablement l'efficacité du procédé Or, un tel adenovirus est totalement incapable de générer de manière autonome des particules infectieuses De ce fait, sa présence éventuelle dans un stock d'AAVr n'affecte pas la qualité pharmaceutique de cette préparation.
Ceci permet également l'utilisation plus efficace d'un adenovirus helper d'origine animale, de préférence canine
En plus des considération de qualité du stock viral produit, de manière tout a fait avantageuse, le procédé selon l'invention permet d'obtenir des titres de virus particulièrement élevés Ceci est une autre propriété tout à fait remarquable du procède selon l'invention. Ainsi, les titres produits, pouvant dépasser 10 génomes v iraux par ml sont lusqu'à 1000 fois supérieurs aux titres observes dans l'art antérieur Ces résultats sont tout a fait inattendus et d'une importance capitale en terme d'exploitation industrielle. Les résultats sont particulièrement remarquables avec les lignées cellulaires dérivées de la lignée 293 et qui expriment ORF6, éventuellement associée à ORF6/7, ou la totalité de E4, sous le contrôle du promoteur MMTV (elles contiennent donc E1 exprimé constitutivement et E4 ou une partie de E4 comprenant au moins ORF6 exprimé conditionnellement en présence de dexaméthasone). Même en l'absence de tout virus helper, ces lignées cellulaires sont capables de répliquer des virus AAV Ainsi, quand on infecte ces lignées avec un AAV sauvage ou quand on transfecte ces lignées par un plasmide infectieux pAV2 (Mac Laughlin, Gène, 23. 67-73, 1983), on peut faire répliquer l'ADN de l'AAV L'efficacité de la replication reste certes inférieure à celle obtenue en présence d'un adenovirus helper, mais démontre les propriétés particulièrement remarquables des cellules selon l'invention.
Une lignée cellulaire particulièrement avantageuse pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention est représentée par une cellule de la lignée 293 comprenant. insérée dans son génome, un fragment BglII-BglII correspondant aux nucleotides 341 15- 32490 du génome de l'Ad5. Il s'agit par exemple d'une cellule de la lignée 293 transformée par le plasmide pORF6Gen (Cf exemples).
En coinfectant une cellule de ce type avec un adenovirus helper (par exemple humain au phénotype sauvage, ou délété pour E1 , ou un double délétant pour E1 et E4, ou de l'adenovirus canin), et en cotransfectant deux plasmides: un plasmide- AAV. portant les ITRs de l'AAV encadrant un acide nucléique d'intérêt, et un plasmide portant les fonctions rep et cap, on peut produire en présence de dexaméthasone des particules de virus AAV infectieuses à des titres élevés. Comme indique dans les exemples, des titres en génomes de 10 11 génomes /ml peuvent être obtenus lorsque l'on opère sur des quantités faibles de cellules. En opérant sur des quantités de cellules plus importantes, des titres plus élevés peuvent être obtenus, jusqu'à 1012 De plus en utilisant de l'adenovirus canin comme virus helper, le procédé de l'invention permet d'avoir des stocks d'AAV à des titres élevés sans contamination par de l'Ad humain. Ainsi, un autre objet de l'invention réside dans un procédé de production d'AAV recombinants caractérisé en ce que l'on introduit dans une culture de cellules comprenant, insérées dans leur génome, une partie de la région E4 du génome d'un adenovirus comportant au moins la phase de lecture ORF6 :
- un plasmide AAV portant un acide nucléique d'intérêt bordé dTTRs d' AAV, - un adenovirus helper. et,
- les fonctions Rep et Cap de l'AAV, puis on récolte les virus produits
Selon un mode de réalisation particulier, la cellule productrice est une cellule comportant l'intégralité de la région E4 Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, la cellule productrice est une cellule comportant une partie de la région E4 comportant au moins la phase de lecture ORF6 et éventuellement la phase de lecture ORF6/7. Il s'agit de manière particulièrement préférée d'une cellule telle que définie précédemment pour la production d'adénovirus En particulier, il s'agit avantageusement d'une cellule capable de transcomplémenter les fonctions E1 et E4 de l'adenovirus Un exemple préféré est représenté par une cellule de la lignée 293 contenant inséré dans son génome, toute la région E4 ou une partie de la région E4 comportant au moins la phase de lecture ORF6 et éventuellement la phase de lecture ORF6/7. A titre d'exemple on peut citer les cellules Clone# 2 (IGRP2) et Clone#4 (IGRP4). Comme indique précédemment, l'adenovirus helper peut être un adenovirus humain au phénotype sauvage, ou défectif pour la région E1, ou un double délétant pour E1 et E4, ou encore de l'adenovirus canin L'avantage du procédé selon l'invention réside d'une part dans les titres très élevés en AAVr, et également dans le caractère sécuritaire des stocks qu'il permet de produire Ainsi, il est particulièrement avantageux d'utiliser un adenovirus helper défectif, c'est-à-dire incapable de générer de manière autonome des particules infectieuses L'adenovirus helper selon le procédé de l'invention est avantageusement un adenovirus humain possédant une délétion dans la région E4 Plus préférentiellement encore, il s'agit d'un adenovirus humain défectif pour les régions E1 et E4 Selon un autre mode de réalisation avantageux, il s'agit d'un adenovirus canin, de préférence choisi parmi les souches CAV2
Dans le procède selon l'invention, les fonctions rep et cap de l'AAV sont préférentiellement apportées par co-transfection des cellules avec un plasmide portant les régions rep et cap de l'AAV Ces régions peuvent être sous contrôle du promoteur P5 homologue ou d'un promoteur constitutif comme LTR-RSV Ces fonctions peuvent également être apportées directement par le virus helper utilise II est en effet possible d'insérer dans l'adenovirus helper une cassette contenant les régions rep et cap de l'AAV Dans le procède de l'invention la transfection du ou des plasmides (plasmide-AA V et plasmide-RepCap le cas échéant) peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier Cependant, plus le taux de transfection est bon plus les niveaux de production peuvent être améliores A cet égard la demanderesse a maintenant mis au point une méthode particulièrement efficace pour la transfection des plasmides dans les cellules de production Cette méthode repose sur l'utilisation d'un lipide polycationique et d'un agent compactant les acides nucléiques L'un des avantages de cette méthode réside en outre dans le fait qu'elle ne semble pas altérer la morphologie ou l'état physiologique des cellules Différents types de lipides cationiques peuvent être utilises, tels que la hpofectamine, le Transfectam, ete Parmi les agents compactant l'ADN, on peut citer de manière avantageuse des peptides dérives de protéines nucléaires telles que les histones la nucleoline, ete
Les différents plasmides et virus helper peuvent être introduits dans la cellule productive de manière concomitante ou séparée Dans le cas dune introduction séparée l'ordre dans lequel les différents composants sont introduits ne semble pas être essentiel pour obtenir des titres élevés Comme illustre dans les exemples, des titres importants ont ete obtenus lorsque, dans un premier temps, les plasmides sont co-transfectes dans les cellules puis, dans un deuxième temps, les cellules sont infectées par le virus helper
Un mode de réalisation spécifique de l'invention réside dans un procède de production d'AAV recombinants caractérise en ce que, dans une culture de cellules transcomplementant les fonctions E1 et E4 de l'adenov irus, on cotransfecte, en présence d'un lipide polv canonique et d'un agent compactant un plasmide AAV portant un acide nucléique d'intérêt borde d'ITRs d'AAV et un plasmide portant les régions rep et cap de l'AAV, on co-infecte ladite culture avec un adenovirus helper choisi parmi les adenovirus humains d'origine Ad2 ou Ad5 defectifs pour les régions E1 et E4 et les adenovirus canins d'origine CAV2, puis on récolte les virus produits
C e mode de réalisation permet d obtenir des titres de virus élevés et des stocks de qualité pharmaceutique
La présente invention concerne également les préparations virales purifiées (adenovirus et AAV) obtenues selon le procède de l'invention, ainsi que toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adenovirus ou AAV recombinants defectifs prépares selon ce procède Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique orale parent erale intranasale intrav eineuse intramusculaire, sous-cutanee, întraoculaire transdermique, ete Pieferentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable II peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium potassium, calcium ou magnésium, ete, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables D'autres excipients peuvent être utilisés tels que par exemple un hydrogel Cet hydrogel peut être prépare a partir de tout polymère (homo ou hétéro) bio-compatible et non cytotoxique De tels polymères ont par exemple été décrits dans la demande WO93/08845 Certains d'entre eux, comme notamment ceux obtenus à partir d'oxyde d'éthylène et/ou de propylène sont commerciaux Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilise, de la pathologie concernée, du gène a exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée D'une manière générale, les adenovirus recombinants selon l'invention sont formules et administres sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de préférence 106 a 1010 pfu et les AAV, entre 106 et 1011 particules. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution d'adénovirus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Selon le gène thérapeutique, les virus ainsi produits peuvent être utilises pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques
(dystrophie, fibrose cystique, ete), les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkmson,
ALS, ete), les cancers, les pathologies liées aux désordres de la coagulation ou aux dyslipoprotéinémies, les pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, ete), etc . La présente invention sera plus complètement décrite a l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures
Figure 1 : Organisation génétique de l'adenovirus Ad5 La séquence complète de l'Ad5 est disponible sur base de données et permet à l'homme du métier de sélectionner ou de créer tout site de restriction, et ainsi d'isoler toute région du génome.
Figure 2 Organisation génétique de la région E4 Figure 3 Organisation génétique de la région E4 dans les adenovirus sauvage et E4 defectifs. La taille de la délétion est représentée par une barre épaisse .
Figure 4 (A) Représentation schématique de la cassette MMTV LTR/(ORF6 +
ORF7). Les oligos 1, 2 et 3 utilisés pour l'amplification ou la RT-PCR sont localisés + 1 = Site d'initiation de la transcription . AAA = Site de polyadénylation. (B) Structure des produits obtenus par RT-PCR. SD = Site 5' donneur d'épissage SA = Site 3' accepteur d'epissage.
Figure 5 Analyse de la production de la fibre adénovirale par détection immunologique à l'aide d'un sérum polyclonal contre la fibre (Boulanger et al.). Les extraits cellulaires sont préparés après 72h d'infection virale, la dexaméthazone est ajoutée en même temps que le virus (concentration finale 600 nM) (A) Infection par le virus dl1014 (MOI = 10), (B) Infection par le virus d11001 (MOI = 1 ); Infection par le virus dll 004 (MOI = 10); (wt) Infection par le virus Ad5 (MOI = 10).
Figure 6 lnductibilite de E4 dans les cellules du clone # 2 Analyse des extraits cellulaires non infectes (contrôle inférieur à 0) ou infectes par le virus d11007, 72 après infection. DM = dexaméthazone (600 nM).
Figure 7 Stratégie de construction clonale des virus ΔE 1 , ΔE4
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions preparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution. les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, ete sont bien connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature [Maniatis T et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1982, Ausubel F M et al (eds), "Current Protocols in Molecular Biology". John Wiley & Sons. New Yor k, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorese en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubes en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al [Nucleic Acids Res 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R K et al . Science 230 ( 1985) 1350-1354, Mullis K B et Faloona F A , Meth Enzym 155 ( 1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc Natl Acad Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemple 1. Construction de plasmides portant différentes unités fonctionnelles de la région E4 sous contrôle d'un promoteur 1.1. Construction du plasmide pE4Gen
Le plasmide pPY2 correspond au clonage du fragment Avr2-Sall (environ 1 3 kb incluant le promoteur du MMTV) du plasmide pMSG (Pharmacia) entre les sites XbaI et Sali du plasmide pIC20H préparé à partir d'un contexte E. coli dam+. Le plasmide pPY4 dérive du plasmide pPY2 par délétion d'un fragment de 35 pb après coupure par BamHl et Bgl2 puis religature Le plasmide pPY5 correspond au plasmide pIC20H dans lequel le fragment TaqI -Bgl2 incluant la région E4 de l'adenovirus de type 5 située entre les positions 35576 (Taq 1 ) et 32490 (Bgl2), a été clone entre les sites Clal et BamHI La région E4 du plasmide pPY5 est donc incluse dans un fragment EcoRV-Sphl que l'on peut cloner après digestion partielle entre les sites Smal et Sphl du plasmide pPY4, ce qui génère le plasmide pPY6. L'insertion du fragment Xhol du plasmide pKIXX (Pharmacia) , qui porte un gène conférant la résistance à la généticine chez les cellules 293, dans le plasmide pPY6 génère le plasmide pE4Gen Ce plasmide porte donc un gène sélectionnable et la totalité de la région E4 de l'adenovirus exprimée à partir du promoteur du MMTV Dans ce plasmide particulier ces deux gènes se suivent et les séquences codantes respectiv es sont portées par le même brin d'ADN. Dans ce plasmide, le site principal 5' donneur pour l'épissage localisé en amont de la phase de lecture ORF1 (vers la position 35548) est donc conservé pour assurer un épissage alternatif correct, permettant de générer les différents produits d'expression de toutes les phases codantes de la région E4 et de manière comparable à l'épissage alternatif observé lors du cycle viral
1.2. Construction du plasmide pORF6Gen
Le plasmide pPY13 correspond au clonage du fragment Bgl2-Xbal du plasmide pPY6 entre les sites correspondants du plasmide pIC20H. Ce fragment de 1.6 kb inclus donc la séquence de l'adenovirus de type 5 de la position 341 15 (Bgl2) à la position 32490 (Bgl2, suivi du site Xbal provenant du multisite de clonage du plasmide pIC20H) Le plasmide pPY13 contient donc la totalité des phases ouvertes de lecture ORF6 et ORF7 de l'adenovirus, maintenant incluses dans un fragment Xho l -Sph l Le clonage de ce fragment entre les sites Sal l et Sph l du plasmide pPY4 génère le plasmide pPY 15. L'insertion du fragment Xhol du plasmide pKIXX, qui porte un gène conférant la résistance à la généticine chez les cellules 293, dans le plasmide pPY 15 génère le plasmide pORF6Gen. Ce plasmide porte donc un gène sélectionnable et les phases ouvertes de lecture ORF6 et ORF7 de la région E4 de l'adenovirus exprimée à partir du promoteur du MMTV. Dans ce plasmide particulier ces deux gènes se suivent et les séquences codantes respectives sont portées par le même brin d'ADN Le premier codon d'initiation de la traduction est celui de la phase ouverte ORF6 (position 34077 dans le génome de l'Ad5 ), et il est sépare du site CAP du promoteur du MMTV par 235 nucleotides. Dans la mesure ou l'épissage alternatif est séquentiel et implique en premier lieu la reconnaissance du site 5' donneur, le site principal 5' donneur localisé en amont de la phase de lecture ORF1 (vers la position 35548) n'a donc pas été inclus dans la construction du plasmide pORF6Gen pour permettre ultérieurement une expression efficace des produits des phases de lecture ORF6 et ORF6/7 (figure 4A).
1 3. Construction du plasmide pORF4Gen
Le plasmide pPY14 correspond au clonage du fragment Bgl2-Xba l de 1 ,9 kb (obtenu après digestion partielle par l'enzyme Bgl2), du plasmide pPY6 entre les sites correspondants du plasmide pIC20H. Ce fragment de 1 9 kb inclus donc la séquence de l'adenovirus de type 5 de la position 34387 (Bgl2) à la position 32490 (Bgl2, suivi du site
XbaI provenant du multisite de clonage du plasmide pIC20H). Le plasmide pPY14 est donc isogénique au plasmide pPY13 à l'exception qu'il inclus en plus un fragment Bgl2 correspondant à la quasi totalité de la phase ouverte de lecture ORF4. Ce plasmide contient donc la totalité des phases ouvertes de lecture ORF4, ORF6 et ORF7 de l'adenovirus, maintenant incluses dans un fragment Xho1-Sph1. Le clonage de ce fragment entre les sites Sali et Sphl du plasmide pPY4 génère le plasmide pPY16. L'insertion du fragment Xhol du plasmide pKIXX, qui porte un gène conférant la résistance à la généticine chez les cellules 293, dans le plasmide pPY16 génère le plasmide pORF4Gen. Ce plasmide porte donc un gène sélectionnable et les phases ouvertes de lecture ORF4, ORF6 et ORF7 de la région E4 de l'adenovirus exprimée à partir du promoteur du MMTV. Dans ce plasmide particulier ces deux gènes se suivent et les séquences codantes respectives sont portées par le même brin d'ADN. Comme pour le plasmide pORF6Gen, le site principal 5' donneur localisé en amont de la phase de lecture ORF1 (vers la position 35548) n'a pas été inclus dans la construction du plasmide pORF4Gen pour permettre ultérieurement une expression efficace des produits des phases de lecture ORF4, ORF6 et ORF6/7. 1.4. Construction des plasmides pJY 1 et pJY2
Cet exemple décrit la construction d'un plasmide comportant une unité fonctionnelle de E4 (Cf exemple 1.2.) sous contrôle d'un promoteur dérivé du MMTV Plus particulièrement, ce promoteur est un dérivé du MMTV comprenant 5 éléments de réponse aux glucocorticoïdes, c'est à dire un dérivé hautement inductible par les glucocorticoïdes Ce plasmide a été construit de la manière suivante.
Le fragment BglII de l'Ad5 (position 341 15 a 32490) inclus les séquences (ORF6+ORF7) de la région E4. Ce fragment a d'abord été clone entre les sites BglII et BamHI du plasmide pIC20H (Marsh et al., Gène 32 (1984) 481), ce qui génère le plasmide pPY13 dans lequel le site Bglll situé en amont de ORF6 est conservé. Le fragment BglII-SalI du plasmide pPY13 inclus donc la totalité des séquences (ORF6+ORF7) de la région E4 de l'Ad5. Ce fragment a été clone entre les sites BamHl et SalI du plasmide pIC20H, ce qui génère le plasmide pPY45.
Le fragment Xbal (environ 1 kb) du plasmide pGRE5-1 (Mader et White, PNAS 90 (1993) 5603) correspond à un promoteur dérivé du MMTV, hautement inductible par les glucocorticoïdes. Ce fragment a été isolé et clone entre les sites Xbal du plasmide pIC20H isolé à partir d'un contexte dam-. Le plasmide obtenu a été désigné pPY21. Dans ce plasmide, le site BglII provenant du multisite de clonage du plasmide pIC20H est localisé immédiatement en amont des 5 éléments du promoteur capables de lier le récepteur nucléaire aux glucocorticoïdes. Le fragment BglII-EcoRI du plasmide pPY21. contenant le promoteur hautement inductible par les glucocorticoïdes, a ensuite été clone entre les sites BglII et EcoRI du plasmide pIC20H, ce qui génère le plasmide pPY26.
Le clonage du fragment EcoRI-SphI du plasmide pPY45 entre les sites correspondants du plasmide pPY26 génère le plasmide pJY I qui contient les séquences (ORF6+ORF7) de l'Ad5 sous contrôle du promoteur hautement inductible par les glucocorticoïdes (cassette pGRE5/(ORF6+ORF7)).
Un dérivé de pJY1 a également été construit contenant un gène de résistance à la généticine. Le fragment XhoI-SalI du plasmide pMSCV contient un gène bactérien conférant la résistance aux cellules eucaryotes à la généticine (APH), exprimé à partir d'un promoteur fort et ubiquitaire (PGK) chez les cellules Ce fragment a été clone dans le plasmide pJY 1. au site sali Le plasmide obtenu a ete désigne pJY2 Ce plasmide contient les cassettes d'expression pGRE5/(ORF6+ORF7) et PGK/APH transcrites dans la même direction. 1.5. Construction du plasmide pGG0
L'assemblage des parties GCR (HBD) et ORF6+ORF7 de la région E4 de l'Ad5 est réalisé après amplification PCR en utilisant le plasmide pSG5HGR comme matrice et les déoxyoligonucléotides SEQ ID N°5
5'-GGCCCGCCGCCACCATGGATATTGAACCTGAAGTGTTATATGCAGGA-3'. (le site SmaI est en italique, la séquence consensus Kozak d'initiation de la traduction est en gras, le codon spécifiant le résidu 539 du GCR est souligné) et SEQ ID N°6
5'-CTCGAGAACGCCGGACGTAGTCTTTTGATGAAACAGAAG-3'
(le site XhoI est en italique; le site Tth1 1 11 est en gras, le codon spécifiant le résidu 777 du GCR est souligné). L'oligonucléotide SEQ ID N°5 permet donc de positionner un ATG spécifiant l'initiation de la traduction en amont du domaine HBD du GCR allant des acides aminés 539 à 777 du GCR. L'oligonucléotide SEQ ID N°6 permet de positionner un site de restriction Tth1 1 1I en aval du HBD. Le fragment d'amplification PCR a d'abord été clone dans le plasmide commercial pCRII et le criblage blanc-bleu a permis de sélectionner un clone dont l'identité a été vérifiée par séquençage (plasmide pCRII/GCR). Ce plasmide est donc la source d'un fragment Smal -Xhol qui porte le domaine HBD du GCR ayant subi l'amplification PCR avec les oligos SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6.
Le plasmide pMEL3 est une construction intermédiaire qui contient le "polylinker' EcoRl-PstI du plasmide pSL1 180 insère entre les sites EcoRl et PstI d'un dérive du plasmide pIC20H dans lequel le site Hind3 situe à proximité immédiate du site Nru1 sur le "polylinker" a ete traite par le fragment Klenow de la Polymérase I d'E coli puis rehgature sur lui-même, ce qui transforme le site Hind3 en un site Nhel Le plasmide pMEL3 contient également un fragment BamHl correspondant au signal de polyadénylation de SV40, préalablement inséré dans le site Bgl2 du "polylinker" de pIC20H Le fragment Smal -Xhol du plasmide pCRII/GCR qui contient le domaine HBD du GCR a alors été inséré entre les sites correspondants du plasmide pMEL3, ce qui génère le plasmide pMEL3/GCR
Apres digestion totale du plasmide pPY13 par Hinc2, digestion partielle par Sspl puis religature du plasmide sur lui-même, on génère le plasmide pPY13 (Δ Hinc2-Sspl ) qui contient un fragment Hind3 d'environ 1 4 kb contenant la totalité de la séquence ORF6+ORF7 de la région E4 de l'Ad5, incluant son site de polyadénylation
Le plasmide pPY13 (Δ Hinc2-Ssp1) a été digéré par Hind3 et ses extrémités ont été remplies a l'aide de la Polymérase Klenow Ce plasmide est ensuite digère par Xhol, et les séquences ORF6 +ORF7 (environ 1.4 kb) sont alors clonees entre les sites Xhol et Nrul du plasmide pMEL3/GCR, ce qui génère le plasmide pMEL3/GCR-Tth1 1 1I-(ORF6+ORF7). Le couplage du site Tth1 1 1I introduit à l'aide de l'oligonucléotide SEQ ID N°6 avec le site Tthl 1 11 situé immédiatement en aval de l'ATG traductionnel de ORP6 sur la séquence de l'Ad5 (position 34070) permet de réaliser un couplage traductionnel entre le domaine HBD du GCR et la protéine ORF6. Le plasmide pMEL3/GCR-Tth1 11I- (ORF6+ORF7) est donc digéré par Tth1 1 1I puis religaturé sur lui-même, ce qui génère le plasmide pMEL3/GCR-(ORF6+ORF7) Cette construction a été séquencée pour s'assurer du couplage traductionnel entre le domaine HBD du GCR et ORF6 La séquence du gène chimérique obtenue est présentée séquence SEQ ID N°7 Celle de la protéine résultante GCR-ORF6 est présentée séquence SEQ ID N°8
Le traitement du plasmide pPY26 par EcoR1 et le fragment Klenow de la Polymérase 1 d'E coli, puis par Bgl2 génère un fragment incluant le promoteur inductible
GRE5, dont le clonage entre les sites Apal traité par le fragment Klenow et BamHl du plasmide pMEL3/GCR-(ORF6+ORF7) génère le plasmide pMEL3/GRE-(GCR- ORF6+ORF7) Ce plasmide est la source d'un fragment Bgl2-Nhe 1 correspondant à la cassette d'expression codant pour la fusion GCR-(ORF6+ORF7) exprimée a partir du promoteur GRE5 et dont le clonage entre les sites Bgl2 et Xbal du plasmide pCI-Neo (Promega) génère le plasmide pGG0.
Exemple 2 - Construction des lignées cellulaires
Cet exemple décrit la construction de lignées cellulaires complémentantes pour les régions E1 et E4 des adenovirus selon l'invention. Ces lignées permettent la construction et la propagation d'adénovirus recombinants délétés pour ces régions, sans avoir recours à un virus helper. Les lignées de l'invention ont été construites par co-transfection des cellules choisies en présence de phosphate de calcium, par les plasmides décrits dans l'exemple 1 et une construction codant pour le récepteur aux glucocorticoïdes (Hollenberg et al., Nature, 3 18, ( 1985) 635-641 ). Plus précisément, les cellules de la lignée 293 en boites de 5cm de diamètre ont été transfectées par 1 à 5 μg de plasmide E4 (pE4Gen, pORF6Gen, pORF4Gen, pGG0 ou pJY2) et éventuellement 5 μg d'un plasmide d'expression du récepteur humain aux glucocorticoïdes exprimé à partir du promoteur précoce du virus SV40 (plasmide pSG5HGR), en présence de phosphate de calcium, selon le protocole décrit par Graham et Van der Eb (Virology 52 (1973) 456).
2. 1. Sélection des clones résistants à la généticine Après transfection des cellules, celles ci sont lavées, puis le milieu de culture (MEM,
Sigma) supplémenté en sérum de voeu foetal (7% final) est ajouté et les cellules sont mises à incuber pendant 20 heures. Le lendemain, on sélectionne les cellules en présence de généticine à la concentration effective de 350 mg/l. La généticine est changée tous les trois jours et les clones sélectionnables apparaissent après environ 3 semaines. Quand toutes les cellules non transfectées sont mortes, seules les cellules ayant inséré le gène de résistance subsistent et se divisent pour générer des clones cellulaires Quand les clones cellulaires sont suffisamment gros pour être visibles à l'oeil nu, ils sont individuellement transférer dans les puits de culture d'une plaque de culture "24 trous". Chaque clone est ensuite progressivement amplifié en présence de généticine d'abord dans les puits d'une plaque de culture " 12 trous", puis "6 trous" pour être ensuite amplifié en boites de culture cellulaires. Chaque clone cellulaire est alors conservé par congélation dans l'azote liquide. 2 2 Sélection des clones capables de produire des virus déficients pour E4 .
Les adenovirus Ad2d1808 (Weinberg et Ketner, J. Virol. 57 ( 1986) 833). Ad5d11004, d11007 ou d11014 (Bridge et Ketner, J. Virol 63 (1989) 631), d1101 1 (Bridge et al., Virology 193 (1993) 794) sont des mutants de délétion portant des délétions importantes au niveau de la région E4. Ces mutants sont incapables de se répliquer dans les cellules 293, mais peuvent être produits dans les cellules W162 (Weinberg et Ketner, PNAS 80 (1983) 5383). Dans une seconde étape, les 50 clones résistants a la généticine ont ete testés pour leur capacité à produire ces virus E4- et donc à transcomplémenter la région E4 60 clones transfectés par le plasmide pJY2, résistant à la généticine, ont également été criblés pour cette capacité à transcomplémenter la région E4
Pour cela, chaque clone est infecté en milieu liquide par le virus d1808 à une multiplicité d'infection d'environ 0,1 PFU/cellule (le titre viral est obtenu sur la lignée W162) L'infection a été réalisée à une moi de 0,5 pfu/cellule pour les clones pJY2, dans un milieu supplémenté en dexaméthazone ( 1 μM) L'apparition d'un effet cytopathique amplifiable par réinfection successive des cellules par le lysat cellulaire obtenu est indicateur d'une certaine propagation virale de dl808 par les cellules du clone considéré Cette transcomplémentation est ensuite objectivée à la fois par analyse du niveau de replication virale et la faculté des cellules à former des plages virales (un protocole possible est décrit par Hitt, M ; Bett, A.J.; Prevec, L. et Graham, F.L "Construction and propagation of human adenovirus vectors" in Cell Biology; a Laboratory Handbook Volume 1. J.E. Celis (Ed), Académie Press Inc (San Diego, CA, USA) p479-490) après infection par d1808
Cette étape a permis de mettre en évidence plusieurs clones particuliers présentant des propriétés efficaces de transcomplémentation de la région E4. Le premier, désigne Clone#2, résulte de la transfection du plasmide pORF6Gen; le second, désigné Clone#4, a été isolé après transfection du plasmide pE4Gen. Des clones stables, capables de transcomplémenter pour la région E4, et hautement inductibles par les glucocorticoïdes ont également été obtenus après transfection des cellules 293 par le plasmide pJY2. Par ailleurs, d'autres clones stables, capables de propager efficacement des virus defectifs pour la région E4, et hautement inductibles par un composé non stéroide ont encore été préparés Ces clones ont été obtenus par co-transfection des cellules 293 par le plasmide pJY2 et par un plasmide exprimant un transactivateur artificiel composé d'une région transactivatrice (VP 16), de la région qui lie l'ADN provenant du récepteur aux glucocorticoïdes, et d'une partie tronquée en C-terminal du récepteur à la progestérone, de telle sorte que ce récepteur hybride soit capable de transactiver le promoteur GRE's en présence de RU486 et non de stéroïdes. Les clones obtenus sont effectivement capables de propager efficacement des virus E4-défectifs en présence de RU486.
Le plasmide pGG0 seul, ou une combinaison équimoléculaire des plasmides pGG0 et pSG5HGR sont transfectés dans des cellules permissives pour l'adenovirus de type 2 ou 5, et les clones stables sont sélectionnés en présence de 400 mg/l de généticine Par exemple, la transfection du plasmide pGG0 dans les cellules 293 génère le clone IGRP18 qui permet la propagation des virus doublement defectifs pour E1 et E4 en présence de dexaméthasone ( 1 μM), ce qui n'est pas le cas en l'absence d'addition. 2.3. Capacité à propager des adenovirus déficients pour E1.
La capacité des lignées préparées à complémenter la région E1 a été vérifiée après infection par l'adenovirus Ad-RSVBGal Cet adenovirus de première génération (déficient dans E1 seulement), comprend le gène LacZ de E.coli sous contrôle du promoteur du LTR du virus RSV (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest, 90 ( 1992) 626). Les cellules des clones #2, #4 et des cellules obtenues avec pJY2 ont été infectées par le virus Ad-RSVßGal et une propagation virale a été observée pour chaque clone.
Ces résultats montrent que la capacité des cellules à transcomplémenter la région E1 n'a pas été affectée par l'introduction supplémentaire de la partie distale de la région E4 (clone #2, cellules pJY2) ou de la région E4 complète (clone #4).. 2.4. Analyse en Southern, Northern blot et RT-PCR pour vérifier l'intégration d'une unité E4 fonctionnelle dans le génome.
Les cellules des clones #2 et #4 ont été analysées en Southern blot pour vérifier l'expression des protéines virales. Plus particulièrement, l'analyse en Southern Blot (analyse du DNA génomique hybridant avec une sonde radioactive provenant de la région E4 adènovirale) a été réalisée selon le protocole décrit par Maniatis et al A cet effet, l'ADN génomique des cellules 293 et #2 a été préparé. 2 μg de cet ADN ont été utilisés comme matrice dans une réaction de PCR réalisée en présence de Polymérase Taq, de l'oligo 1 de séquence SEQ ID n°1 (correspondant aux nucleotides 52 à 71 du promoteur MMTV) et de l'oligo 2 de séquence SEQ ID n°2 (correspondant aux positions 32921-32940 du génome de I'Ad5). Ces oligo amplifient un fragment de 2617 pb du plasmide pORF6Gen L'amplification a été réalisée dans les conditions suivantes : dénaturation à 94°C pendant 5 min, 30 cycles d'amplification par dénaturation à 94°C pendant 1 min, hybridation à 60°C pendant 2 min, et extension à 70°C pendant 3 min, l'extension lors du dernier cycle étant prolongée pendant 10 min Les produits d'amplification ont ensuite été analysés par electrophorèse SDS 1 % d'agarose et identifiés en Southern Blot et hybridation avec une sonde marquée couvrant la région (ORF6 + ORF7) de l'adenovirus ou la région MMTV.
L'analyse en Northern Blot et RT-PCR (analyse des ARNs cellulaires des clones 2 et 4 hybridant avec une sonde radioactive provenant de la région E4 adènovirale) a été réalisée selon le protocole décrit par Maniatis et al., les ARNs cellulaires polyadénylés ayant été préparés selon le protocole décrit par R E. Farrell Jr. "RNA isolation stratégies", in RNA Méthodologies; a Laboratory Guide for Isolation and Characterization Académie Press Inc (San Diego, CA, USA) p46-92) . Pour la RT-PCR, 500 ng des ARN polyA+ ont été traités avec 0,5 unité de DNAse I puis soumis à une transcription inverse avec une amorce oligo(dT) . Un dixième de la préparation d'ADNc simple brin ainsi obtenue a été utilise comme matrice dans une réaction de PCR réalisée au moyen de l'oligo 2 (SEQ ID n°2) et de l'oligo 3 (SED ID n°3), correspondant aux nucleotides 227-246 par rapport au site cap du promoteur MMTV (voir figure 4). Ces oligo ont été construits pour amplifier un fragment de 1255 pb de l'ARNm non épissé ORF6 et un fragment de 545 pb de l'ARNm épissé ORF6/7 Les produits d'amplification ont été analysés en gel SDS 1 % d'agarose et identifiés en Southern Blot et Hybridation à la sonde (ORF6+ORF7) marquée . Ces analyses ont permis de montrer que ces 2 clones possèdent leur unité fonctionnelle E4 respective intégrée à raison de quelques copies par cellules De plus, ces études démontrent que ces deux clones expriment la protéine de la fibre de l'adenovirus après infection avec les mutants de délétion Ad5d11004, Ad5d11011 et Ad5d11014 (Figure 5). Cette protéine est une protéine tardive du cycle réplicatif et infectieux de l'adenovirus, dont la synthèse implique l'expression de E4. La présence de cette protéine dans les cellules infectées par les mutants E4- confirme que ces cellules expriment bien une activité E4 fonctionnelle.
Les analyses en Southern Blot indiquent plus particulièrement que le clone #2 contient une copie de la cassette MMTV-(ORF6+ORF7) intégrée dans son génome L'intégrité de cette cassette a en outre été démontrée par l'amplification au moyen des oligos 1 et 2 qui génère un fragment de 2,6 Kb attendu, qui peut être spécifiquement détecté par une sonde radiomarquée correspondant à l'unité (ORF6+ORF7) ou au promoteur MMTV (figure 4) L'occurrence d'un épissage alternatif correct dans les cellules de l'invention a également ete démontrée par RT-PCR Ainsi 2 signaux principaux ont ete détectes spécifiquement avec la sonde radiomarquée (ORF6+ORF7) dans le clone #2 non infecte, cultivé en présence de dexaméthazone (conditions inductrices) Le signal le plus important est un fragment de 1 ,3 kb environ, taille qui correspond parfaitement à un produit non épissé dérivé de ORF6/ORF7. L'autre signal est un fragment de 0,6 kb environ, taille en accord avec l'excision (lors de l'épissage) de l'intron de 712 nucleotides générant le messager ORF6/7. Ces résultats montrent clairement qu'un épissage alternatif correct se produit dans les cellules de l'invention, et que les deux produits ORF6 et ORF6/7 de la région E4 sont bien exprimés dans ces cellules. La capacité des cellules de l'invention à exprimer un produit fonctionnel de la région
ORF6 a par ailleurs été démontrée par immunodétection de la protéine de la fibre Les résultats obtenus montrent que les cellules 293 infectées par l'adenovirus Ad5 dl 1007 ne produisent pas de fibres Au contraire, un signal fibre-specifique est détecté dans les cellules de l'invention (clone #2 notamment) après infection par ce mutant, et pas dans les autres cellules non infectées La présence de la fibre a également été démontrée dans les cellules de l'invention infectées par les mutants d1808, d11004 (ORF1 +), d1101 1 ou d1 1014 (ORF4+) en présence de dexaméthazone.
2 5 Formation de plages
Cette analyse montre clairement les propriétés particulièrement avantageuses des lignées selon l'invention. En effet, alors que les deux clones (clone#2 et clone#4) sont capables de transcomplémenter la région E4 et de propager avec une efficacité comparable les mutants Ad2d1808 ou Ad5d11004 par exemple, ils présentent une différence très significative en ce qui concerne la formation de plages de virus après infection par les mutants Ad2d1808, Ad5d11004, Ad5d11007, Ad5d1101 1 ou Ad5d11014. La capacité de former des plages de virus est une propriété essentielle des lignées de production. C'est en effet sous cette condition que des clones de virus recombinants peuvent être isolés, puis amplifiés et purifiés. Les résultats obtenus montrent clairement que la formation de plages de virus est toujours observée avec le clone#2, alors que cela ne se produit que rarement avec le clone#4 Ces résultats démontrent clairement les propriétés très supérieures des lignées de l'invention dans lesquelles seulement une unité fonctionnelle particulière de la région E4 est intégrée. 2.6. Expression régulée de l'activité E4
Une autres propriété avantageuse du clone#2 selon l'invention réside le caractère régulé et inductible de l'expression de l'activité E4. Ainsi, les résultats obtenus montrent que la formation de plages de virus n'est observée qu'en présence de dexaméthazone. De même, dans le clone#2, l'expression de la protéine de fibre de l'adenovirus après infection par le mutant Ad5dl1007 est significativement augmentée dans les conditions d'induction (figure 6). Les mêmes résultats ont été obtenus avec les mutants Ad5d1808, Ad5d11004, Ad5d1101 1 et Ad5d11014. En revanche, l'expression de l'activité E4 dans le clone#4 est constitutive.
L'ensemble de ces résultats démontre clairement les avantages des lignées cellulaires de l'invention dans lesquelles seulement une unité fonctionnelle particulière de la région E4 est intégrée. Ces avantages résident en particulier dans la capacité à former des plages de virus et à permettre l'amplification des virus defectifs en milieu liquide. Ces avantages sont également dans le caractère régulé de l'expression de l'activité E4, contrairement aux lignées dans lesquelles des unités fonctionnelles plus grandes de E4 sont présentes. Exemple 3 - Production de virus defectifs pour les fonctions E1 et E4
Cet exemple décrit l'utilisation des lignées cellulaires selon l'invention pour la production de virus recombinants déficients dans les régions E1 et E4 Ces adenovirus ont été produits par recombinaison homologue, après co-transfection, dans les cellules de l'invention, de deux fragments d'ADN, l'un apportant la partie gauche du génome du virus recombinant (possédant une délétion dans la région E1), l'autre apportant la partie droite du génome du virus recombinant (possédant une délétion dans la région E4)
Plus précisément, les cellules 293E4 (clone#2 et #4) ont été cotransfectées par 10 mg de l'ADN du virus Ad-RSVBGal (Stratford-Perricaudet et al.) digéré par Srf1 (ou 5 mg d'ADN du plasmide ayant servi à la construction de ce virus et digéré par Xmn 1 ), et 10 mg de l'ADN du virus apportant la délétion fonctionnelle de la région E4 (par exemple Ad2d1808, Ad5d11004, Ad5d11007 ou Ad5d11014) digéré par l'enzyme Clal . Après apparition de l'effet cytopathique, les virus sont purifiés par au moins deux cycles consécutifs d'étalement en solide pour la formation de plages sur clone 2. Les plages correspondant à l'infection du virus recherché (analyse de l'ADN démontrant la double délétion E1 et E4) sont alors amplifiées par des cycles d'infection consécutives. Des stocks à titre élevés sont préparés par purification sur gradient de chlorure de césium. Les virus sont conservés à -80°C selon les techniques classiques de l'homme de l'art. Outre la faculté du clone 2 a faire des plages virales, il permet une propagation en milieu liquide particulièrement efficace pour le virus AD5d11014 (E 1 +E4- mais ORF4+) ou pour le virus E1-E4- construit à partir du virus d11014.
Par contre le clone 4 obtenu après transfection du plasmide pE4Gen n'est pas très performant pour faire des plages car il a du mal à tenir la confluence cellulaire pendant un temps suffisamment long pour que les plages de lyse virale soient facilement reperables (et surtout si le virus recombinant recherché ne code pas pour la β-galactosidase)
Une méthode alternative de production repose sur la construction clonale des virus selon l'invention Plus particulièrement, selon cette méthode, les adenovirus ΔE1 ΔE4 sont produits par double-recombinaison homologue in vivo après co-transfection de 3 fragments d'ADN recouvrants, apportant chacun une partie du génome du virus.
Plus particulièrement, les 3 fragments recouvrants suivants, dérivés des génomes AdRSVβgal et Ad d11014, ont été purifiés par électroélution (Figure 7) : i) Fragment I Ce fragment est un fragment Narl de 6,8 kb codant pour la βgal correspondant à la partie gauche (ΔE 1 ) du génome de AdRSVβgal Sa contamination par un génome AdRSVβgal non coupe (et donc réplicatif) est fortement improbable car la digestion complète par Narl génère ce fragment parmi 25 autres allant de 26 nucleotides a
3,8 kb. ii) Fragment II Ce fragment est un fragment Dral de 9,4 kb également dérivé du génome de AdRSVβgal, et qui se chevauche avec le fragment I sur 1 509 nucleotides (of Figure 7) La contamination de ce fragment par un génome infectieux est également impossible dans la mesure où ce fragment a été purifié à partir de 10 fragments supplémentaires de taille comprise entre 494 nucleotides et 4,8 kb, après digestion totale par Dral et Afl II. iii) Fragment III Ce fragment est un fragment Nsil de 21,3 kb dérivé du génome de
Ad5 d11014 II chevauche le fragment II sur 1652 nucleotides (Figure 7) Ce fragment apporte la partie droite du génome du virus recombinant, contenant la région E4 modifiée (ΔE4,ORF4+). Sa contamination est encore une fois plus qu'improbable puisqu'il a ete purifie après digestion complète par Nsil générant 7 fragments de taille comprise entre 178 nucleotides et 4 kb. Les fragments purifiés ont ete co-transfectés dans les cellules clone #2 selon le protocole décrit pour les cellules 293, en présence de 1 μM de dexaméthazone dans le milieu (ajouté tous les 4 jours pendant 3 semaines) Au terme de cette culture, les cellules ont été récoltées, congelées et décongelées 3 fois dans un bain glace/éthanol, puis centrifugées à 3000 g pendant 20 min Le lysat cellulaire a ensuite été ajouté à une culture fraîche de cellules clone #2 (également désignées IGRP2) en présence de dexaméthazone (1 μM) Après 5 jours, un effet cytopathique a été observé, démontrant la production des virus. Un stock de ce virus recombinant AdΔE1, ΔE4, ORF4+ a été obtenu après amplification progressive du mélange induisant l'effet cytopathique sur 100 boites de 10 cm contenant des cellules clone #2 à sous-confluence, en présence de l μM dexaméthazone Après purification sur gradient de chlorure de césium et dialyse à 4°C, le stock viral a été titré sur monocouches de cellules clone #2 supplementees de dexaméthazone ( l μM), avant coloration in vitro avec du X-Gal Dans la mesure où toutes les plaques sont positives, le titre peut-être exprimé soit en pfu / ml soit en plaque virale exprimant la β-gal. Selon cette procédure, un stock de 1010 pfu a été préparé L'absence de RCA dans ce stock a ensuite été contrôlée par analyses de restriction et en southern Pour cela l'ADN viral d'un recombinant du stock a été préparé selon la technique de Challberg (Virology 1 14 (1981) 196). 2μg de cet ADN ont été soumis à une analyse de restriction et gel d'agarose 1 % Les fragments ont été transférés sur membrane Hybond-N (Amersham) et hybrides avec une sonde radioactive correspondant aux ITRs de l'adenovirus pour détecter spécifiquement les fragments localisés aux extrémités du génome viral.
L'analyse de restriction par les enzymes SmaI, AflII ou StuI a donné les profils attendus, pour des préparations non contaminées par des fragments E1+ ou E4 + comme en témoigne la stoechiométrie relative des différents fragments de restriction. L'analyse en Southern après transfert sur membranes montre que la digestion par
StuI génère seulement 2 fragments hybridant avec la sonde ITR Un de ces fragments présente une mobilité correspondant à celle du fragment de 1 125 pb de AdRSVβgal codant pour la βgal, l'autre migre comme le fragment StuI de 2673 pb de Ad5d11014 portant la délétion E4 Une exposition prolongée de l'autoradiogramme ne fait apparaître aucune bande supplémentaire ayant une taille correspondant au fragment E1+ (3158 bp) ou E4+ (3980 pb). De même, un fragment correspondant en taille (3267 pb) à l'introduction de l'unité E4 fonctionnelle (ORF4 + ORF6 + ORF7) dans le génome du recombinant n'a pas été détecté, démontrant qu'il n'y a pas eu d'événement de double recombinaison pendant la production entre le génome viral et l'unité E4 intégrée dans la cellule. Ces résultats démontrent donc que les cellules de l'invention peuvent être utilisées pour produire efficacement des lots de virus ΔE1, ΔE4 dépourvus de RCA.
Exemple 4 - Production d'AAV recombinants
Cet exemple décrit l'utilisation des lignées cellulaires contenant tout ou une partie de la région E4 d'un génome adénoviral pour la production d'AAV. Ces AAV ont été produits par co-transfection, dans lesdites cellules, d'un plasmide ITR- AAV et d'un plasmide Rep/Cap, et par co-infection avec un adenovirus helper.
Plasmides et virus utilises
- Plasmide ITR-AAV, désigne pMA10 . Ce plasmide comporte un acide nucléique d'intérêt (cassette d'expression du gène β-gal d'E. coli composée du promoteur du LTR-
RVS, du gène LacZ précédé d'un signal de localisation nucléaire, et du site de polyadénylation du virus SV40) borde de 2 ITR d'AAV. Le plasmide pMA10 a été obtenu en digérant le plasmide pXL2582 par Spel et en refermant par traitement à l'ADN ligase du bactériophage T4. Ce traitement permet de supprimer les séquences palindromiques en aval de l'ITR gauche de l'AAV. Le plasmide pXL2582 a été obtenu en ligaturant les fragments suivants dans les sites EcoRI-KpnI de pXL2359 (décrit dans la demande FR94 02445) : a) EcoRI-Xbal (contenant l'ITR gauche de l'AAV jusqu'au nucléotide 155, site HinfI sur la séquence publiée de l'AAV) de pXL2580, et, b) XbaI-KpnI de pXL2359 (contenant la cassette d'expression du gène LacZ) Le plasmide pXL2580 a été obtenu à partir de pXL2359 de la manière suivante : pXL2359 a été digéré par EcoRI-Xbal et déposé sur gel d'agarose 1%, d'où un fragment de 650 pb a été purifié Ce fragment a été redigéré par Hinfl et traité à l'ADN Polymérase du bactériophage T4, recoupe par PstI puis déposé sur gel d'agarose 2%, d'où un fragment de 200 pb a été purifié Ce fragment, contenant l'ITR gauche de l'AAV jusqu'au nucléotide 1 55 a été introduit entre les sites Pstl-Smal de pBSKS+ (Stratagene).
- Plasmide Rep/Cap : Le plasmide utilise, désigne pΔBal, a été décrit par Lebkowski et al (Mol. Cel. Biol. 8 (1988) 3988). Ce plasmide contient les régions rep et cap de l'AAV sous contrôle du promoteur endogène P5. D'autres promoteurs peuvent être substitues au promoteur P5, tels que notamment le promoteur constitutif du LTR-RVS. - L'adenovirus helper utilise est un adenovirus sauvage Ad5. Il est entendu que d'autres virus helper peuvent être utilises, et notamment un Ad5 défectif pour la région E1 et/ou E4, ou un adenovirus canin. L'intérêt d'utiliser un adenovirus canin réside dans leur capacité à supporter la replication des AAV tout en étant des virus defectifs chez l'homme De ce fait, les préparations d'AAVr obtenues sont totalement dépourvues de RCA et d'adénovirus humain contaminant.
Protocole
La production a été réalisée par transfection de 20 boites de 5cm de diamètre de cellules Clone#2 (IGRP2), à la densité de 3.10 cellules par boite environ, préalablement inoculées 24 à 48 heures dans du milieu MEM 10%SVF. Dans chaque boite ont été co-transfectés 1 μg de plasmide pMA10 et 5 μg de plasmide pΔBal en présence de 16 μg de peptide H1, de 16,5 μl de lipofectamine (Gibco-BRL, Life Technologies) et de OPTIMEM lipofectamine (Gibco-BRL, Life Technologies) selon les recommandations du fournisseur Apres 4 à 16 heures de contact du mélange sur les cellules, le mélange de transfection a été retire et les cellules ont été infectées pendant une heure avec l'adenovirus helper, avec un infectivité de 10 pfu de virus par cellule dans un volume final de 500 μl Du milieu MEM10%SVF + dexaméthasone 10 M a ensuite été ajoute. Les cellules ont été récoltées 5 jours après, reprises dans un tampon Tris HCl 10 mM, pH 8, lysées par 3 congélations décongélations, puis traitées avec du déoxycholate de sodium et à la trypsine aux concentrations respectives de 0.25% et de 1% pendant 30 min à 37C. Les AAV recombinants produits ont ensuite été purifies sur gradient de chlorure de césium à la densité de 1 .4, dans un rotor SW55.1 à 35000rpm pendant 20 heures.
Ces expériences ont permis d'obtenir des titres élevés de virus recombinants : 10 génomes par ml Ce procédé permet donc de produire des quantités très élevées d'AAV recombinants (les procédés décrits dans l'art antérieur conduisent à des titres 10 à 100 fois inférieurs), ayant des qualités propres à un usage thérapeutique chez l'homme. En outre, il est très facile d'utiliser des quantités de cellules 10 fois plus importantes, et donc d'obtenir un titre en virus plus élevé.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Cellule utilisable pour la production d'adénov irus defectifs caractérisée en ce qu'elle comprend, insérée dans son génome, une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus portant la phase de lecture ORF6 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel.
2. Cellule selon la revendication 1 caractérisée en ce la partie de la région E4 comprend les phases de lecture ORF6 et ORF6/7
3 . Cellule selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que la partie de la région E4 est issue d'un génome d'adénovirus humain du groupe C.
4. Cellule selon la revendication 3 caractérisée en ce que la région E4 est issue du génome d'un adenovirus Ad2 ou Ad5.
5. Cellule selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le promoteur est un promoteur inductible.
6. Cellule selon la revendication 5 caractérisée en ce que le promoteur est choisi parmi le promoteur MMTV et ses dérivés.
7. Cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que la partie de la région E4 comprend la phase de lecture ORF6 fusionnée en phase traductionnelle avec le domaine d'un récepteur nucléaire qui est responsable de la reconnaissance de son ligand spécifique.
8. Cellule selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'il s'agit du domaine de fixation de l'hormone du récepteur aux glucocorticoïdes (HBD-GCR).
9. Cellule selon la revendication 8 caractérisée en ce que la phase de lecture ORF6 fusionnée en phase traductionnelle avec le domaine d'un récepteur nucléaire responsable de la reconnaissance de son ligand spécifique est placé sous contrôle d'un promoteur inductible qui répond aux glucocorticoïdes.
10. Cellule selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'il s'agit du promoteur GRE5.
1 1 . Cellule selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle dérive d'une cellule qui transcomplémente pour la région E 1.
12. Cellule selon la revendication 1 1 caractérisée en ce qu'elle dérive de la lignée cellulaire 293.
13. Cellule selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisée en ce qu'elle dérive des cellules KB, Hela, MDCK, Véro ou gmDBP6.
14. Cellule selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisée en ce qu'elle dérive d'une culture de cellules primaires.
15. Cellule utilisable pour la production d'adénovirus defectifs caractérisée en ce qu'elle comprend, inséré dans son génome, un fragment BglII-BglII correspondant aux nucleotides 341 15-32490 du génome de l'Ad5.
16. Cellule selon la revendication 15 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de la lignée 293.
17. Cellule selon la revendication 15 ou 16 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de la lignée 293 transformée par le plasmide pORF6Gen.
18. Cellule utilisable pour la production d'adénovirus defectifs caractérisée en ce qu'elle comprend, inséré dans son génome, un fragment BglII-PvuII correspondant aux nucleotides 34115-33126 du génome de l'Ad5.
19. Cellule utilisable pour la production d'adénovirus defectifs caractérisée en ce qu'elle comprend, inséré dans son génome, un gène chimérique comprenant la phase de lecture ORF6 du génome d'un adenovirus fusionnée, à l'une de ses extrémités, au domaine de liaison de l'hormone du récepteur aux glucocorticoïdes .
20. Cellule selon la revendication 19 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de la lignée 293 transformée par le plasmide pGG0
21. Plasmide comprenant une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus portant la phase de lecture ORF6 sous contrôle d'un promoteur inductible.
22. Plasmide selon la revendication 21 caractérisé en ce que la partie de la région E4 du génome d'adénovirus porte les phases de lecture ORF6 et ORF6/7.
23. Plasmide selon la revendication 22 caractérise en ce qu'il s'agit du plasmide pORF6Gen
24. Plasmide selon la revendication 21 caractérise en ce que la phase de lecture ORF6 est fusionnée en phase traductionnelle avec le domaine d'un récepteur nucléaire responsable de la reconnaissance de son ligand spécifique
25. Plasmide selon la revendication 24 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pGG0.
26. Utilisation d'une cellule selon l'une des revendications 1 à 20 pour la production d'adénovirus recombinants defectifs au moins pour la région E4.
27. Procédé de production d'adénovirus recombinants defectifs au moins pour la région E4 caractérisé en ce que l'on transforme une culture de cellules selon l'une des revendications 1 a 20 avec un ou plusieurs plasmides apportant les différentes régions du génome dudit adenovirus recombinant défectif puis on récolte les virus produits.
28. Piocede selon la revendication 27 pour la production d'adénovirus recombinants defectifs pour les régions E1 et E4.
29. Procédé selon la revendication 27 ou 28 caractérisé en ce que la culture de cellules est une culture de cellules selon l'une des revendications 15 à 20.
30. Stock d'adénovirus recombinant defectifs purifié obtenu selon le procédé des revendications 27 à 29.
3 1 . Adenovirus recombinant défectif ΔE1 ,ORF3-,ORF6- comprenant une délétion de tout ou partie de la région E1 et des nucleotides 34801-34329 et 341 15-33126 de la région E4.
32. Adenovirus recombinant défectif ΔE1,ΔE4,ORF1+ comprenant une délétion de tout ou partie de la région E1 et une délétion de la région E4 à l'exception de la phase de lecture ORF1.
33. Adenovirus recombinant défectif selon la revendication 32 caractérisé en ce qu'il comprend une deletion dans la région E1 et une délétion d'un fragment dont l'extrémité 5' est comprise dans la phase de lecture ORF7 et dont l'extrémité 3' est située dans la phase de lecture ORF2.
34. Adenovirus recombinant défectif selon la revendication 33 caractérisé en ce qu'il comprend une délétion dans la région E4 couvrant les nucleotides 33093 à 35053.
35. Adenovirus recombinant défectif ΔE1,ΔE4,ORF4+ comprenant une délétion de tout ou partie de la région E1 et une délétion de la région E4 à l'exception de la phase de lecture ORF4.
36. Adenovirus recombinant défectif selon la revendication 35 caractérisé en ce qu'il comprend une délétion dans la région E1, une délétion d'un fragment dont l'extrémité 5' est comprise dans la phase de lecture ORF7 et dont l'extrémité 3' est située dans la phase de lecture ORF6, et une délétion d'un fragment dont l'extrémité 5' est comprise dans la phase de lecture ORF3 et dont l'extrémité 3' est située dans la phase de lecture ORF1 ou dans la région promotrice de E4.
37. Adenovirus recombinant défectif selon la revendication 36 caractérisé en ce qu'il comprend une délétion dans la région E1, une délétion couvrant les nucleotides
33093(SmaI)-33695 et une délétion couvrant les nucleotides 34634-35355(SmaI).
38. Adenovirus recombinant défectif ΔE1,ΔE4 comprenant une délétion de tout ou partie de la région E1 et une délétion couvrant la totalité de la région E4. choisie parmi les délétions suivantes : nucleotides 32720-35835, ou 33466-35355 ou 33093-35355.
39. Utilisation d'une cellule selon l'une des revendications 1 à 20 pour la production d'AAN recombinants.
40. Utilisation selon la revendication 39 d'une cellule comprenant, insérée dans son génome, tout ou une partie de la région E4 du génome d'un adenovirus comportant au moins la phase de lecture ORF6.
41 . Procédé de production d'AAV recombinants caractérisé en ce que l'on introduit dans une culture de cellules comprenant, insérées dans leur génome, une partie de la région E4 du génome d'un adenovirus comportant au moins la phase de lecture ORF6 : - un plasmide AAV portant un acide nucléique d'intérêt borde d'ITRs d' AAV ,
- un adenovirus helper, et,
- les fonctions Rep et Cap de l'AAV, puis on récolte les virus produits.
42. Procédé selon la revendication 41 caractérisé en ce que la culture de cellules est une culture de cellules comportant l'intégralité de la région E4.
43. Procédé selon la revendication 41 caractérisé en ce que la culture de cellules est une culture de cellules comportant la phase de lecture ORF6 et éventuellement la phase de lecture ORF6/7.
44. Procédé selon la revendication 43 caractérisé en ce que la culture de cellules est une culture de cellules telles que définies dans les revendications 1 à 20.
45. Procédé selon la revendication 41 caractérisé en ce que l'adenovirus helper est un adenovirus humain défectif pour la région E4.
46. Procédé selon la revendication 45 caractérisé en ce que l'adenovirus helper est un adenovirus humain défectif pour les régions E1 et E4.
47. Procédé selon la revendication 41 caractérisé en ce que l'adenovirus helper défectif est un adenovirus canin, de préférence choisi parmi les souches CAV2.
48. Procède selon la revendication 41 caractérise en ce que les fonctions rep et cap sont apportées par co-transfection des cellules avec un plasmide portant les régions rep et cap de l'AAV .
49. Procédé selon la revendication 41 caractérise en ce que les plasmides sont transfectés en présence d'un agent compactant les acides nucléiques et d'un lipide cationique.
50. Procédé de production d'AAV recombinants, caractérise en ce que. dans une culture de cellules transcomplementant des fonctions E 1 et E4 de l'adenovirus, on cotransfecte en présence d'un lipide polycationique et d'un agent compactant un plasmide AAV portant un acide nucléique d'intérêt bordé d'ITRs d'AAV et un plasmide portant les régions rep et cap de l'AAV, on co-infecte ladite culture ec un adenovirus helper choisi parmi les adenovirus humains d'origine Ad2 ou Ad5 defectifs pour les régions E1 et E4 et les adenovirus canins d'origine CAV2, puis on récolte les virus produits.
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Inventor name: ORSINI, CECILE

Inventor name: LATTA, MARTINE

Inventor name: DEDIEU, JEAN-FRANCOIS

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Inventor name: PROST, EDUARD

Inventor name: YEH, PATRICE

Inventor name: VIGNE, EMMANUELLE

Inventor name: PERRICAUDET, MICHEL

Inventor name: ORSINI, CECILE

Inventor name: LATTA, MARTINE

Inventor name: DEDIEU, JEAN-FRANCOIS

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