EA028227B1 - Стабилизированные составы, содержащие антитела к человеческой пропротеиновой конвертазе субтилизин/кексин типа 9 (pcsk9) - Google Patents

Abstract

В настоящем изобретении предлагаются фармацевтические составы, содержащие человеческое антитело, которое специфически связывает человеческую пропротеиновую конвертазу субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9). Составы, кроме антитела к PCSK9, могут содержать по крайней мере одну аминокислоту, по крайней мере один сахар или по крайней мере одно неионогенное поверхностно-активное вещество. Фармацевтические составы настоящего изобретения демонстрируют значительный уровень стабильности антитела после хранения в течение нескольких месяцев.

Description

Настоящее изобретение относится к лекарственным препаратам на основе антител. Более конкретно, настоящее изобретение относится к области лекарственных средств, содержащих человеческое антитело, которое специфически связывает человеческую пропротеиновую конвертазу субтилизин/кексин типа 9 (РС8К9).

Перечень последовательностей

К настоящему описанию прилагается текстовой файл с перечнем последовательностей, соответствующий требованиям 8Т.25. Содержание текстового файла в силу ссылки на него включается в настоящий документ. Прилагаемая бумажная копия перечня последовательностей, идентичная по содержанию текстовому файлу, который соответствует требованиям 8Т.25, является частью настоящего описания.

Уровень техники

Лекарственные препараты на основе макромолекул (например, антител) должны составляться не только так, чтобы молекулы можно было бы вводить пациентам, но обеспечивать их стабильность во время хранения и последующего использования. Например, лекарственные препараты на основе антител в жидких растворах склонны к разложению, агрегированию или нежелательной химической модификации, если состав раствора не составлен надлежащим образом. Стабильность того или иного антитела в жидком составе зависит не только от природы вспомогательных средств, используемых в составе, но также и от количеств и относительного соотношения различных вспомогательных средств.

Более того, при подготовке жидких препаратов на основе антител следует учитывать и другие соображения, кроме стабильности. К примерам таких дополнительных соображений относятся вязкость раствора и концентрация антитела, которая может достигаться в определенном составе, а также визуальное качество или привлекательность состава. Поэтому к разработке состава лекарственного препарата на основе антител следует подходить с особым вниманием, с тем чтобы получить препарат, который сохраняет стабильность, содержит достаточную концентрацию антитела, а также обладает приемлемой вязкостью и другими свойствами, которые позволяют удобным образом вводить состав пациентам.

Антитела к человеческой пропротеиновой конвертазе субтилизин/кексин типа 9 (РС8К9) являются одним из примеров терапевтически важной макромолекулы, из которой необходимо надлежащим образом приготовить фармацевтический состав. Антитела к РС8К9 клинически используются для лечения или профилактики таких заболеваний, как гиперхолестеринемия и другие дислипидемии, а также других отклонений. Примеры антител к РС8К9 описаны, среди прочего, в заявках XVО 2008/057457, АО 2008/057458, АО 2008/057459, АО 2008/063382, АО 2008/125623, патенте США № 7572618, заявках АО 2010/077854, И8 2010/0166768 и И8 2011/0065902.

Несмотря на то что антитела к РС8К9 известны специалистам в области, по-прежнему сохраняется потребность в новых фармацевтических составах, содержащих антитела к РС8К9, которые достаточно стабильны и пригодны для введения пациентам.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение восполняет упомянутую выше потребность, предлагая лекарственные средства, содержащие человеческое антитело, которое специфически связывает человеческую пропротеиновую конвертазу субтилизин/кексин типа 9 (РС8К9).

В одном из аспектов предлагается жидкий лекарственный препарат, содержащий (ί) человеческое антитело, которое специфически связывает человеческую пропротеиновую конвертазу субтилизин/кексин типа 9 (РС8К9); (ίί) буфер; (ίίί) органический вспомогательный растворитель; (ίν) стабилизатор и в некоторых случаях (ν) понизитель вязкости.

В одном из осуществлений антитело используется в концентрации от примерно 50±7,5 до примерно 200±30 мг/мл. В другом осуществлении антитело используется в концентрации примерно 50±7,5 мг/мл. В другом осуществлении антитело используется в концентрации примерно 100±15 мг/мл. В другом осуществлении антитело используется в концентрации примерно 150±22,5 мг/мл. В другом осуществлении антитело используется в концентрации примерно 175±26,25 мг/мл. В другом осуществлении антитело используется в концентрации примерно 200±30 мг/мл.

В одном осуществлении антитело включает одну или несколько аминокислотных последовательностей 8ЕО ГО ЫО: 1-8. В одном осуществлении антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (НСУК), включающую определяющие комплементарность области тяжелой цепи 1, 2 и 3 (НСЭК1НСГОК2-НСГОК3). каждая из которых содержит последовательность 8ЕО ГО ЫО: 2, 8ЕО ГО ЫО: 3 и 8ЕО ГО ЫО: 4 соответственно; и (Ь) вариабельную область легкой цепи (ЬСУК), включающую определяющие комплементарность области легкой цепи 1, 2 и 3 (ЪСОК1-ЕСОК2-ЕСОК3), каждая из которых содержит последовательность 8ЕО ГО ЫО: 6, 8ЕО ГО ЫО: 7 и 8ЕО ГО ЫО: 8 соответственно. В конкретном осуществлении антитело содержит НСУК и ЬСУК, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ГО ЫО: 1 и 8ЕО ГО ЫО: 5 соответственно.

В одном осуществлении рН жидкого препарата составляет примерно 6,0±0,5, 6,0±0,4, 6,0±0,3, 6,0±0,2, 6,0±0,1, 6,0±0,05, 6,0±0,01 или 6,0. В конкретном осуществлении рН жидкого препарата составляет примерно 6,0±0,3. В одном осуществлении жидкий фармацевтический буфер содержит один или

- 1 028227 несколько буферов с эффективным диапазоном буферной емкости от примерно рН 5,5 до примерно рН 7,4 или рКа примерно 6,0.

В одном из осуществлений буфером является гистидин. В одном из осуществлений гистидин имеет концентрацию от 5±0,75 до 50±7,5 мМ. В одном из осуществлений гистидин имеет концентрацию 10± 1,5 или примерно 10 мМ. В одном из осуществлений гистидин имеет концентрацию 20±3 или примерно 20 мМ. В одном из осуществлений гистидин имеет концентрацию 40 нМ±6 мМ или примерно 40 нМ.

В одном из осуществлений в качестве органического вспомогательного растворителя используется неионогенный полимер, содержащий полиоксиэтилен. В некоторых осуществлениях органическим вспомогательным растворителем является любой или несколько из перечисленных: полисорбат 20, полоксамер 188 и полиэтиленгликоль 3350. В конкретном осуществлении органическим вспомогательным растворителем является полисорбат 20.

В одном осуществлении органический вспомогательный растворитель имеет концентрацию от примерно 0,005±0,00075 до примерно 1±0,15% веса к объему или вес./об., где, например, 0,1 г/мл = 10% и 0,01 г/мл = 1%. В одном осуществлении органическим вспомогательным растворителем является полисорбат 20, который присутствует в концентрации примерно 0,2±0,03% (вес./об.) В другом осуществлении органическим вспомогательным растворителем является полисорбат 20, который присутствует в концентрации 0,01±0,0015% (вес./об.) или примерно 0,01% (вес./об.).

В одном из осуществлений стабилизатором является сахар. В одном из осуществлений сахар выбирается из группы, содержащей сахарозу, маннитол и трегалозу. В конкретном осуществлении стабилизатором является сахароза.

В одном осуществлении стабилизатор имеет концентрацию от 1±0,15 до 20±3% (вес./об.) В конкретном осуществлении стабилизатором является сахароза в концентрации 5±0,75 или примерно 5% (вес./об.) В другом конкретном осуществлении стабилизатором является сахароза в концентрации 10±1,5 или примерно 10% (вес./об.) В другом конкретном осуществлении стабилизатором является сахароза в концентрации 12± 1,8 или примерно 12% (вес./об.).

В одном осуществлении понизителем вязкости является соль, выбираемая из группы, включающей аргинина гидрохлорид, тиоцианат натрия, тиоцианат аммония, сульфат аммония, хлорид аммония, хлорид кальция, хлорид цинка и ацетат натрия. В одном из осуществлений понизителем вязкости является Ь-аргинина гидрохлорид.

В одном осуществлении концентрация понизителя вязкости составляет от 10± 1,5 до 150±22,5 мМ. В одном осуществлении понизителем вязкости является Ь-аргинина гидрохлорид в концентрации 50±7,5 или примерно 50 мМ. В одном осуществлении понизителем вязкости является Ь-аргинина гидрохлорид в концентрации 40±6 мМ или примерно 40 мМ.

В одном осуществлении вязкость раствора или восстановленного лиофилизованного фармацевтического препарата при 25°С не превышает примерно 15 сП±10%. В одном осуществлении вязкость при 25°С составляет от 1,0± 10 до 18 сП±10%. В одном осуществлении вязкость при 25°С составляет 1,6± 10,

I, 7±10, 3,3±10, 3,5±10, 4,8±10, 6,0±10, 7,0±10, 7,1±10, 7,2±10, 7,9±10, 8,9±10, 10,0±10, 10,6±10, 11,4±10%,

II, 6±10, 11,8±10, 12,4±10, 13,9±10, 14,0±10, 15,5±10 или 17,9 сП±10%.

В одном осуществлении осмоляльность жидкого лекарственного препарата составляет от 100±15 до 460±69 мосмоль/кг. В одном осуществлении осмоляльность жидкого лекарственного препарата составляет 103±15 или примерно 103 мосмоль/кг. В одном осуществлении осмоляльность жидкого лекарственного препарата составляет 195±29 или примерно 195 мосмоль/кг. В одном осуществлении осмоляльность жидкого лекарственного препарата составляет 220±33 или примерно 220 мосмоль/кг. В одном осуществлении осмоляльность жидкого лекарственного препарата составляет 330±50 илим примерно 330 мосмоль/кг. В одном осуществлении осмоляльность жидкого лекарственного препарата составляет 435±65 или примерно 435 мосмоль/кг. В одном осуществлении осмоляльность жидкого лекарственного препарата составляет 440±66 или примерно 440 мосмоль/кг. В одном осуществлении осмоляльность жидкого лекарственного препарата составляет 458±69 или примерно 458 мосмоль/кг.

В одном осуществлении через три месяца хранения жидкого лекарственного препарата при -80°С из жидкого лекарственного препарата выделяется по крайней мере 96% или по крайней мере 97% неагрегированной и неразложившейся формы антитела к РС8К9, что подтверждают данные эксклюзионной хроматографии. В одном осуществлении через три месяца хранения жидкого лекарственного препарата при -80°С из жидкого лекарственного препарата выделяется по крайней мере 56% неосновной и некислой формы (т.е. главный пик или главная заряженная форма) антитела к РС8К9, что подтверждают данные ионообменной хроматографии.

В одном осуществлении через три месяца хранения жидкого лекарственного препарата при -30°С из жидкого лекарственного препарата выделяется по крайней мере 96 или по крайней мере 97% неагрегированной и неразложившейся формы антитела к РС8К9, что подтверждают данные эксклюзионной хроматографии. В одном осуществлении через три месяца хранения жидкого лекарственного препарата при -30°С из жидкого лекарственного препарата выделяется по крайней мере 56% главной заряженной фор- 2 028227 мы антитела к РС8К9, что подтверждают данные ионообменной хроматографии.

В одном осуществлении через три месяца хранения жидкого лекарственного препарата при -20°С из жидкого лекарственного препарата выделяется по крайней мере 96 или по крайней мере 97% неагрегированной и неразложившейся формы антитела к РС8К9, что подтверждают данные эксклюзионной хроматографии. В одном осуществлении через три месяца хранения жидкого лекарственного препарата при 20°С из жидкого лекарственного препарата выделяется по крайней мере 56% главной заряженной формы антитела к РС8К9, что подтверждают данные ионообменной хроматографии.

В одном осуществлении через шесть месяцев хранения жидкого лекарственного препарата при 5°С из жидкого лекарственного препарата выделяется по крайней мере 96% неагрегированной и неразложившейся формы антитела к РС8К9, что подтверждают данные эксклюзионной хроматографии. В одном осуществлении через три месяца хранения жидкого лекарственного препарата при 5°С из жидкого лекарственного препарата выделяется по крайней мере 58 или 59% главной заряженной формы антитела к РС8К9, что подтверждают данные ионообменной хроматографии.

В одном осуществлении через шесть месяцев хранения жидкого лекарственного препарата при 25°С из жидкого лекарственного препарата выделяется по крайней мере 94% неагрегированной и неразложившейся формы антитела к РС8К9, что подтверждают данные эксклюзионной хроматографии. В одном осуществлении через шесть месяцев хранения жидкого лекарственного препарата при 25°С из жидкого лекарственного препарата выделяется по крайней мере 45 или 47% неосновной и некислотной формы антитела к РС8К9, что подтверждают данные ионообменной хроматографии.

В одном осуществлении через 28 дней хранения жидкого лекарственного препарата при 45°С из жидкого лекарственного препарата выделяется по крайней мере 91 или 92% неагрегированной и неразложившейся формы антитела к РС8К9, что подтверждают данные эксклюзионной хроматографии. В одном осуществлении через 28 дней хранения жидкого лекарственного препарата при 45°С из жидкого лекарственного препарата выделяется по крайней мере 35 или 37% неосновной и некислотной формы антитела к РС8К9, что подтверждают данные ионообменной хроматографии.

В одном из аспектов предлагается жидкий лекарственный препарат, содержащий (ί) от 50±7,5 до 175±26 мг/мл человеческого антитела, которое специфически связывает человеческую РС8К9; (ίί) от 0 до 40±6 мМ гистидина; (ίίί) от 0 до 0,2±0,03% (вес./об.) полисорбата 20; (ίν) от 0 до 12±1,8% (вес./об.) сахарозы и (ν) от 0 до 50±7,5 мМ аргинина при рН от примерно 5,3 до примерно 6,7. Антитело к РС8К9 настоящего аспекта содержит вариабельную область тяжелой цепи (НСУК) и вариабельную область легкой цепи (ЬСУК), так что сочетание НСУК/ЬСУК включает определяющие комплементарность области тяжелой и легкой цепей (Ήί.ΌΒ1-Ηί.ΌΒ2-Ηί.ΌΒ3/ίί.ΌΒ1-ίί.ΌΒ2-ί<.ΌΒ3). которые содержат аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО N0: 2, 3, 4/8ЕЦ ГО N0: 6, 7,- 8 соответственно. В конкретном осуществлении антитело к РС8К9 содержит вариабельную область тяжелой цепи (НСУК) и вариабельную область легкой цепи (ЬСУК), каждая из которых содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 1 и 8ЕЦ ГО N0: 5 соответственно (в дальнейшем тЛЪ-316Р).

В одном осуществлении настоящего аспекта жидкий препарат содержит (ί) 50±7,5 мг/мл тАЪ-316Р; (ίί) 10±1,5 мМ гистидина; (ίίί) 0,1±0,015% (вес./об.) полисорбата 20 и (ίν) 6±0,9% (вес./об.) сахарозы при рН 6,0±0,3. В одном осуществлении данного конкретного препарата вязкость составляет примерно 1,7 сП. В одном осуществлении данного конкретного препарата осмоляльность составляет 220±44 мосмоль/кг.

В другом осуществлении жидкий препарат содержит (ί) 100±20 мг/мл тАЪ-316Р; (ίί) 20±4 мМ гистидина; (ίίί) 0,2±0,04% (вес./об.) полисорбата 20 и (ίν) 12±2,4% (вес./об.) сахарозы при рН 6,0±0,3. В одном осуществлении данного конкретного препарата вязкость составляет примерно 3,5 сП. В одном осуществлении данного конкретного препарата осмоляльность составляет 440±88 мосмоль/кг.

В другом осуществлении жидкий препарат содержит (ί) 150±22,5 мг/мл тАЪ-316Р; (ίί) 10±1,5 мМ гистидина; (ίίί) 0,2±0,03 или 0,01±0,0015% (вес./об.) полисорбата 20 и (ίν) 10±1,5% (вес./об.) сахарозы при рН 6,0±0,3. В одном осуществлении данного конкретного препарата вязкость составляет примерно 6 сП. В одном осуществлении данного конкретного препарата осмоляльность составляет 435±65,25 мосмоль/кг. В одном осуществлении настоящего конкретного препарата после хранения препарата при 45°С в течение 28 дней >92% антитела остается нативным и >35% антитела сохраняет главную заряженную форму. В одном осуществлении настоящего конкретного препарата после хранения препарата при 25°С в течение шести месяцев >94% антитела остается нативным и >45% антитела сохраняет главную заряженную форму. В одном осуществлении настоящего конкретного препарата после хранения препарата при 5°С в течение шести месяцев >96% антитела остается нативным и >58% антитела сохраняет главную заряженную форму. В одном осуществлении настоящего конкретного препарата после хранения препарата при -20°С в течение двенадцати месяцев >97% антитела остается нативным и >56% антитела сохраняет главную заряженную форму. В одном осуществлении настоящего конкретного препарата после хранения препарата при -30°С в течение двенадцати месяцев >97% антитела остается нативным и >56% антитела сохраняет главную заряженную форму. В одном осуществлении настоящего

- 3 028227 конкретного препарата после хранения препарата при -80°С в течение двенадцати месяцев >97% антитела остается нативным и >56% антитела сохраняет главную заряженную форму.

В некоторых осуществлениях настоящего конкретного препарата >85% антитела сохраняет свою биологическую активность после 28 дней при 45°С, >82% после 28 дней при 37°С и/или >98% после 28 дней при 25°С. В некоторых осуществлениях настоящего конкретного препарата >85% антитела сохраняет свою биологическую активность после шести месяцев при -20°С, >70% после шести месяцев при -30°С и/или >79% после шести месяцев при -80 °С. В некоторых осуществлениях настоящего конкретного препарата >81% антитела сохраняет свою биологическую активность после восьми циклов замораживания-оттаивания и/или >84% антитела сохраняет свою биологическую активность после 120 мин встряхивания.

В другом осуществлении настоящего аспекта жидкий препарат содержит (ί) 175±26,25 мг/мл шЛЬ-316Р; (ίί) 10±1,5 мМ гистидина; (ίίί) 0,01±0,0015% (вес./об.) полисорбата 20; (ίν) 5±0,75% (вес./об.) сахарозы и (ν) 50±7,5 мМ аргинина при рН 6,0±0,3. В одном осуществлении данного конкретного препарата вязкость составляет примерно 10,6 сП. В одном осуществлении данного конкретного препарата осмоляльность составляет 330±50 мосмоль/кг. В одном осуществлении настоящего конкретного препарата после хранения препарата при 45°С в течение 28 дней >91% антитела остается нативным и >38% антитела сохраняет главную заряженную форму. В одном осуществлении настоящего конкретного препарата после хранения препарата при 25°С в течение шести месяцев >94% антитела остается нативным и >47% антитела сохраняет главную заряженную форму. В одном осуществлении настоящего конкретного препарата после хранения препарата при 5°С в течение шести месяцев >96% антитела остается нативным и >59% антитела сохраняет главную заряженную форму. В одном осуществлении настоящего конкретного препарата после хранения препарата при -20°С в течение трех месяцев >96% антитела остается нативным и >56% антитела сохраняет главную заряженную форму. В одном осуществлении настоящего конкретного препарата после хранения препарата при -30°С в течение трех месяцев >96% антитела остается нативным и >56% антитела сохраняет главную заряженную форму. В одном осуществлении настоящего конкретного препарата после хранения препарата при -80°С в течение трех месяцев >96% антитела остается нативным и >56% антитела сохраняет главную заряженную форму.

В одном аспекте жидкий лекарственный препарат любого из приведенных выше осуществлений помещается в контейнер. В одном из осуществлений в качестве контейнера используется флакон из поликарбоната. В другом осуществлении в качестве контейнера используется стеклянный флакон. В одном из осуществлений стеклом является боросиликатное стекло типа 1 с пробкой из бутилкаучука, покрытой фторуглеводородами. В другом осуществлении в качестве контейнера используется микроинжектор. В другом осуществлении в качестве контейнера используется шприц. В конкретном осуществлении поршень шприца покрыт фторуглеводородами. В одном из конкретных осуществлений в качестве шприца используется длинный стеклянный шприц объемом 1 мл, содержащий менее 500 миллиардных долей вольфрама, с иглой размером 27-С, пробкой из бутилкаучука с покрытием фторуглеводородами, а также не содержащим латекса, нецитотоксическим защитным резиновым колпачком. В более конкретном осуществлении в качестве шприца используется длинный стеклянный шприц ΝυΟνΑ ΟΜΡΙ объемом 1 мл с тонкостенной иглой размером 27-С, с пробкой из бутилкаучука с покрытием РЬиКОТЕС 4023/50 и защитным резиновым колпачком ΡΜ 27. В другом конкретном осуществлении в качестве шприца используется пластиковый шприц объемом 1 мл или 3 мл с иглой размером 27-С. В более конкретном осуществлении пластиковый шприц поставляется компанией ΒЕСТΟN ΌΙΟΚΙΝδΟΝ.

В одном аспекте предлагается фармацевтический препарат, содержащий (а) 175±26,25 мг/мл антитела к РС8К9; (Ь) 10±1,5 мМ гистидина, рН 6±0,3; (с) 0,01±0,0015% (вес./об.) полисорбата 20; (4) 5±0,75% (вес./об.) сахарозы и (е) 50±7,5 мМ аргинина, в котором (а) антитело содержит НС'УЭ из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1 и Ь-СУЭ из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 5; (Ь) более 90% антител в препарате имеет молекулярный вес 155± 1 кДа; (с) более 50% антител в препарате имеет изоэлектрическую точку примерно 8,5 и (4) от 75 до 90% антител в препарате фукозилированы.

В одном осуществлении фармацевтический препарат содержит (а) 175±26,25 мг/мл антитела к РС8К9 из предыдущего абзаца; (Ь) 10± 1,5 мМ гистидина, рН 6±0,3; (с) 0,01±0,0015% (вес./об.) полисорбата 20; (4) 5±0,75% (вес./об.) сахарозы и (е) 50±7,5 мМ аргинина в воде.

В одном аспекте предлагается фармацевтический препарат, содержащий (а) 150±22,5 мг/мл антитела к РС8К9; (Ь) 10±1,5 мМ гистидина, рН 6±0,3; (с) 0,2±0,03% (вес./об.) полисорбата 20; (4) 10±1,5 % (вес./об.) сахарозы, в котором (ί) антитело содержит НСУЭ из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1 и Ь-СУЭ из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 5, (ίί) более 90% антител в препарате имеет молекулярный вес 155±1 кДа, (ίίί) более 50% антител в препарате имеет изоэлектрическую точку примерно 8,5 и (ίν) от 75 до 90% антител в препарате фукозилированы.

В одном осуществлении фармацевтический препарат содержит (а) 150±22,5 мг/мл антитела к РС8К9 из предыдущего абзаца; (Ь) 10± 1,5 мМ гистидина, рН 6±0,3; (с) 0,2±0,03% (вес./об.) полисорбата

- 4 028227

20; (Ц) 10±1,5 % (вес./об.) сахарозы в воде.

В одном аспекте предлагается фармацевтический препарат, содержащий (а) 150±22,5 мг/мл антитела к РС8К9; (Ь) 10±1,5 мМ гистидина, рН 6±0,3; (с) 0,01±0,0015% (вес./об.) полисорбата 20 и (ά) 10±1,5 % (вес./об.) сахарозы, в котором (ί) антитело содержит НСУЭ из §Еф ГО N0: 1 и ЬСУЭ из §Еф ГО N0: 5, (ίί) более 90% антител в препарате имеет молекулярный вес 155±1 кДа, (ίίί) более 50% антител в препарате имеет изоэлектрическую точку примерно 8,5 и (ιν) от 75 до 90% антител в препарате фукозилированы.

В одном осуществлении фармацевтический препарат содержит (а) 150±22,5 мг/мл антитела к РС8К9 из предыдущего абзаца; (Ь) 10± 1,5 мМ гистидина, рН 6±0,3; (с) 0,01±0,0015% (вес./об.) полисорбата 20 и (ά) 10± 1,5 % (вес./об.) сахарозы в воде.

В одном аспекте предлагается фармацевтический препарат, содержащий (а) 100±15 мг/мл антитела к РС8К9; (Ь) 20±3 мМ гистидина, рН 6±0,3; (с) 0,2±0,03% (вес./об.) полисорбата 20; (ά) 12± 1,8% (вес./об.) сахарозы, в котором (ι) антитело содержит НСУЭ из 8Еф ГО N0: 1 и ЬСУЭ из 8Еф ГО N0: 5, (ΐΐ) более 90% антител в препарате имеет молекулярный вес 155±1 кДа, (ίίί) более 50% антител в препарате имеет изоэлектрическую точку примерно 8,5 и (ιν) от 75 до 90% антител в препарате фукозилированы.

В одном осуществлении фармацевтический препарат содержит (а) 100± 15 мг/мл антитела к РС8К9 из предыдущего абзаца; (Ь) 20±3 мМ гистидина, рН 6±0,3; (с) 0,2±0,03% (вес./об.) полисорбата 20 и (ά) 12± 1,8% (вес./об.) сахарозы в воде.

В одном аспекте предлагается фармацевтический препарат, содержащий (а) 50±7,5 мг/мл антитела; (Ь) 10±1,5 мМ гистидина, рН 6±0,3; (с) 0,1±0,015% (вес./об.) полисорбата 20; (ά) 6±0,9% сахарозы, в котором (ι) антитело содержит НСУЭ из 8Еф ГО N0: 1 и ЬСУЭ из 8Еф ГО N0: 5, (и) более 90% антител в препарате имеет молекулярный вес 155±1 кДа, (ίίί) более 50% антител в препарате имеет изоэлектрическую точку примерно 8,5 и (ιν) от 75 до 90% антител в препарате фукозилированы.

В одном осуществлении фармацевтический препарат содержит (а) 50±7,5 мг/мл антитела к РС8К9 из предыдущего абзаца; (Ь) 10±1.5 мМ гистидина, рН 6±0,3; (с) 0,1±0,015% (вес./об.) полисорбата 20 и (ά) 6±0,9% (вес./об.) сахарозы в воде.

В одном аспекте приводится способ приготовления лиофилизованного препарата, который содержит антитело КРС8К9 и менее 0,3% воды. Способ включает следующие стадии:

(a) смешивание в стеклянном флаконе воды, антитела к РС8К9, гистидина, сахарозы и полисорбата 20;

(b) последующее выдерживание смеси примерно при 5°С в течение примерно 60 мин;

(c) последующее снижение температуры со скоростью примерно 0.5°С/мин;

(ά) последующее выдерживание смеси примерно при -45°С в течение примерно 120 мин;

(е) последующее снижение атмосферного давления примерно до 100 мТорр;

(ί) последующее повышение температуры со скоростью примерно 0.5°С/мин;

(д) последующее выдерживание смеси примерно при -25°С в течение примерно 78 ч;

(Ь) последующее увеличение температуры со скоростью 0.2°С/мин;

(ί) последующее выдерживание смеси примерно при 35°С в течение примерно 6 ч;

(ί) последующее снижение температуры со скоростью примерно 0.5°С/мин;

(k) а также последующее выдерживание смеси примерно при 25°С в течение примерно 60 мин до передачи на хранение.

В одном осуществлении способ также включает следующие стадии:

(l) заполнение стеклянного флакона, содержащего смесь после стадии (к), газообразным азотом; и (т) укупорка флакона под давлением на уровне примерно 80% от атмосферного.

В одном осуществлении смесь доводят до температуры 2-8°С после стадии (ι), (]) или (к) и перед стадией укупорки флакона.

В некоторых осуществлениях на стадии (а) концентрация антитела КРС8К9 составляет 50±7,5 мг/мл, концентрация гистидина составляет 10±1,5 мМ (рН 6,0), концентрация полисорбата 20 составляв 0,1±0,015%, а концентрация сахара составляет 6±0,9%. В одном осуществлении антитело к РС8К9 содержит НССН1 из 8Еф ГО N0: 2, НССН2 из 8Еф ГО N0: 3, 11С1)1С из 8Еф ГО N0: 4, 1.СПН1 из §Еф ГО N0: 6, ЬСПК.2 из 8Еф ГО N0: 7 и ЬСОК.3 из 8Еф ГО N0: 8.тАЬ-316Р. В одном осуществлении антитело КРС8К9 содержит НСУО из 8Еф ГО N0: 1 и ЬСУО из 8Еф ГО N0: 5. В одном осуществлении (ι) антитело содержит НСУО из 8Еф ГО N0: 1 и ЬСУО из 8Еф ГО N0: 5, (и) более 90% антител в смеси имеет молекулярный вес 155±1 кДа, (ίίί) более 50% антител в смеси имеет изоэлектрическую точку примерно 8,5 и (ιν) от 75 до 90% антител в смеси фукозилированы.

В одном аспекте приводится способ приготовления лиофилизованного препарата, который содержит антитело к РС8К9 и менее 0,3% воды, который готовится в соответствии со способом в предыдущем аспекте.

В одном аспекте предлагается фармацевтический препарат, который содержит лиофилизованный фармацевтический препарат предыдущего аспекта, разведенный в воде. В одном осуществлении фарма- 5 028227 цевтический препарат содержит 50±7,5 мг/мл антитела к РС8К9, 10±1,5 мМ гистидина (рН 6,0), 0,1±0,015% (вес./об.) полисорбата 20 и 6±0,9% (вес./об.) сахарозы в воде. В одном осуществлении фармацевтический препарат содержит 100±15 мг/мл антитела к РС8К9, 20±3 мМ гистидина (рН 6,0), 0,2±0,03% (вес./об.) полисорбата 20 и 12± 1,8% (вес./об.) сахарозы в воде. В другом осуществлении фармацевтический препарат содержит 150±22,5 мг/мл антитела к РС8К9, 30±4,5 мМ гистидина (рН 6,0), 0,3±0,045% (вес./об.) полисорбата 20 и 18±2,7% (вес./об.) сахарозы в воде. В еще одном осуществлении фармацевтический препарат содержит 175±26,25 мг/мл антитела к РС8К9, 35±5,25 мМ гистидина (рН 6,0), 0,35±0,0525% (вес./об.) полисорбата 20 и 21±3,15% (вес./об.) сахарозы в воде.

В некоторых осуществлениях антитело к РС8К9 содержит НСУЭ из 8ЕЦ ГО N0: 1 и ЬСУЭ из 8Е0 ГО N0: 5, и (Ь) более 90% антител в смеси имеет молекулярный вес 155± 1 кДа; (с) более 50% антител в смеси имеет изоэлектрическую точку примерно 8,5, и (б) от 75 до 90% антител в смеси фукозилированы.

В одном аспекте предлагается лекарственный препарат любого из приведенных выше осуществлений, причем упомянутый препарат помещается в контейнер. В одном осуществлении в качестве контейнера используется флакон, который в некоторых осуществлениях представляет собой стеклянный флакон. В другом осуществлении в качестве контейнера используется шприц. В некоторых приложениях в качестве шприца используют шприц из стекла с низким содержанием вольфрама. В одном осуществлении в качестве шприца используется длинный стеклянный шприц ΝυΟνΑ 0МР1 объемом 1 мл с тонкостенной иглой размером 27-0, с пробкой из бутилкаучука с покрытием РЬиКОТЕС 4023/50 и защитным резиновым колпачком РМ 27.

В одном аспекте предлагается комплект, в который входят лекарственный препарат любого из приведенных выше аспектов, контейнер и указания по применению. В одном осуществлении в качестве контейнера используется предварительно заполненный шприц. В конкретном осуществлении в качестве шприца используется длинный стеклянный шприц ΝυΟνΑ 0МР1 объемом 1 мл с тонкостенной иглой размером 27-0, с пробкой из бутилкаучука с покрытием РЬиК0ТЕС 4023/50 и защитным резиновым колпачком а РМ 27.

Другие осуществления настоящего изобретения станут очевидны при ознакомлении с приведенным ниже подробным описанием.

Подробное описание изобретения

Прежде чем приступить к описанию настоящего изобретения, необходимо отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными способами и изложенными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут меняться. Следует также понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена исключительно для описания конкретных осуществлений и не носит ограничительного характера, поскольку охват настоящего изобретения ограничивается только прилагаемой формулой изобретения.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, которое общеизвестно рядовым специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. Используемый в настоящем документе термин примерно в отношении конкретного упоминаемого численного значения или диапазона значений подразумевает, что значение может отклоняться от значения не более чем на 1%. Например, используемое в настоящем документе выражение примерно 100 охватывает 99 и 101 и все значения между ними (т.е. 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.д.).

Хотя на практике или при проверке настоящего изобретения могут использоваться любые способы и материалы, аналогичные или идентичные описанным в настоящем документе, ниже приводится описание предпочтительных способов и материалов. Все публикации, упоминаемые в настоящем документе, включаются в него полностью в силу ссылки на них.

Фармацевтические составы.

Используемое в настоящем документе выражение фармацевтический состав/препарат означает смесь по крайней мере одного активного ингредиента (например, малой молекулы, макромолекулы, соединения и пр., которые в состоянии оказывать биологическое воздействие на человека или на животных) и по крайней мере одного неактивного ингредиента, который в сочетании с активным ингредиентом или одним или несколькими неактивными ингредиентами пригоден для терапевтического применения на человеке или животном. Термин состав/препарат, используемый в настоящем документе, если специально не оговорено иначе, означает фармацевтический состав/препарат. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим составам, содержащим по крайней мере один лечебный полипептид. В соответствии с определенными осуществлениями настоящего изобретения под лечебным полипептидом понимается антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с человеческой пропротеиновой конвертазой субтилизин/кексин типа 9 (РС8К9). Более конкретно, настоящее изобретение включает фармацевтические препараты, которые содержат (ί) человеческое антитело, которое специфически связывается с человеческой РС8К9; (ίί) гистидиновый буфер; (ίίί) органический вспомогательный растворитель, который представляет собой неионогенное поверхностно-активное вещество; (ίν) термический стабилизатор, которым является углевод и в некоторых случаях (ν) понизитель вязко- 6 028227 сти, которым является соль. Конкретные примеры компонентов и составов, включенных в настоящее изобретение, подробно описаны ниже.

Антитела, которые специфически связываются с РС8К9.

Фармацевтические составы настоящего изобретения могут включать человеческое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с человеческой РС8К9. Используемый в настоящем документе термин РС8К9 означает пропротеиновую конвертазу человека, относящуюся к подсемейству протеиназ К семейства секреторных субтилаз. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что РС8К9 повышает уровень ЛНП в плазме за счет связывания с рецептором частиц липопротеинов низкой плотности и стимулирования его распада. Пример аминокислотной последовательности человеческой РС8К9 приводится в §ЕЦ ГО N0: 9. Антитела к человеческой РС8К9 описаны в публикациях патентных заявок υδ 2010/0166768, υδ 2011/0065902 и АО 2010/077854.

Используемый в настоящем документе термин антитело в общем случае предназначен для обозначения молекул иммуноглобулина, составленных из четырех полипептидных цепей, при этом две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ъ) цепи связываются друг с другом дисульфидными связями, а также для обозначения их мультимеров (например, 1дМ); при этом молекулы иммуноглобулина, содержащие только тяжелые цепи (т.е. без легких цепей), также включаются в охват термина антитело. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе НСУК, или У_Н) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе БСУК, или У_ь) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен (СЬ1). Области У_Н и У_ъ могут подразделяться на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (СОК), перемежаемые областями с более высоким уровнем консервативности, называемые остовными областями (РК). Каждая область У_Н и У_ъ образована тремя СГОК и четырьмя РК, расположенными от аминотерминального конца к карбокситерминальному концу в следующем порядке: РК1, СГОКЕ РК2, СИК2, РК3, СОК3, РК4.

Если специально не оговорено иначе, термин антитело, используемый в настоящем документе, следует понимать, как включающий полные молекулы антител, а также их антигенсвязывающие фрагменты. Используемый в настоящем документе термин антигенсвязывающая часть или антигенсвязывающий фрагмент антитела (или просто часть антитела или фрагмент антитела) обозначает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с РС8К9 человека или с его эпитопом.

Используемый в настоящем документе термин изолированное антитело предназначен для обозначения антитела, существенно свободного от других антител, обладающих иной антигенной специфичностью (например, изолированное антитело, которое специфически связывает РС8К9 человека, существенно свободно от антител, которые специфически связывают антигены, отличные от РС8К9 человека).

Термин специфически связываются или ему подобные означает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент образует комплекс с антигеном, который сравнительно стабилен в физиологических условиях. Специфическое связывание может описываться константой диссоциации по крайней мере примерно 1х10^-6 М или выше. Методы определения специфического связывания молекул известны специалистам в области и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и пр. Изолированное антитело, которое специфически связывает РС8К9 человека, тем не менее, может проявлять перекрестную реактивность к другим антигенам, например молекулам РС8К9 из других видов (ортологов). В контексте настоящего изобретения мультиспецифические (например, биспецифические) антитела, которые связываются с человеческой РС8К9, а также одним или несколькими другими антигенами, считаются специфически связывающимися с человеческой РС8К9. Более того, изолированное антитело может быть существенно свободно от иных клеточных материалов или химических реагентов.

Примеры античеловеческих антител РС8К9, которые могут входить в фармацевтические составы настоящего изобретения, приводятся в публикациях патентных заявок υδ 2010/0166768, И8 2011/0065902 и АО 2010/077854, раскрытие которых в силу ссылки на них полностью включается в текст настоящего документа.

В соответствии с определенными осуществлениями настоящего изобретения античеловеческое антитело РСδК9 тАЬ-316Р представляет собой человеческий 1дС1, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет субтип 1СНУ3-23, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет субтип 1СКУ4-1 (см. ВагЫе апй Бейлис, Тке Нитап 1ттипод1оЬи1ш Карра УапаЬ1е (1СКУ) Сепез апй Ιοίηίηβ (1СКТ) δедтеηΐ8, Ехр. С1ш. 1ттиподепе1. 1998; 15:171-183 и δсаνте^, Ό. е1 а1., Рго1еш Э1зр1ауз ой 1йе Нитап 1ттипод1оЬи1ш Неауу, Карра апй БатЬйа УапаЬ1е апй 1о1шпд Кедюпз, Ехр. С1ш. 1ттиподепе1., 1999; 16:234-240).

В некоторых осуществлениях античеловеческое антитело РСδК9 тАЬ-316Р содержит по крайней мере одно аминокислотное замещение, что приводит к изменению заряда на внешней поверхности антитела относительно эмбриональной последовательности 1СКУ4-1. Эмбриональная последовательность 1СКУ4-1 и номера позиций аминокислот, приведенные в настоящем документе, соответствуют Между- 7 028227 народной иммуногенетической информационной системе (ΙΜΟΤ), которая описана в Ье&аис, М.-Р., с1 а1., ΙΜΟΤ®, (Не 1и(егпайопа1 1тМипоСепеТ1С5 1и£огтайои 5ук(ет®, Ыис1. АсИк Кек, 37, Б1006-Б1012 (2009). В некоторых осуществлениях внешняя поверхность включает определяющую комплементарность область (СБК). В некоторых осуществления аминокислотное замещение или замещения выбираются из группы, включающей замещение незаряженной полярной аминокислоты на основную аминокислоту в пределах СБК1 (например, в положении 32) ЮКУ4-1. Уникальные пермутации в распределении зарядов антитела, особенно на границе со средой (например, в СБК), предположительно будут создавать непредсказуемые условия для поддержания или улучшения стабильности антитела в растворе.

В некоторых осуществлениях античеловеческое антитело РС8К9 тЛЬ-316Р содержит по крайней мере одно аминокислотное замещение, что приводит к изменению заряда в остовной области вариабельной области антитела относительно эмбриональной последовательности ЮНУ3-23 или эмбриональной последовательности ЮКУ4-1. В некоторых осуществления аминокислотное замещение или замещения выбираются из группы, включающей (а) замещение полярной аминокислоты в остовной области 3 (РК3) (например, в положении 77) ЮНУ3-23 на гидрофобную аминокислоту, и (Ь) замещение основной аминокислоты в остовной области 2 (РК2) (например, в положении 51) ЮКУ4-1 на полярную аминокислоту. Изменения в способности пептидной цепи к фолдингу, особенно в пределах остовной области, которая влияет на интерфейс между СБК и растворителем, будет, предположительно, создавать непредсказуемые условия для поддержания или улучшения стабильности антитела в растворе.

В соответствии с рядом осуществлений настоящего изобретения античеловеческое антитело РС8К9 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат тяжелую цепь определяющей комплементарность области (НСБК) 1 из 8 ЕС) 1Б N0: 2, НСБК2 из 8ЕС) 1Б N0: 3 и НСБК3 из 8ЕС) 1Б N0: 4. В некоторых осуществлениях античеловеческое антитело РС8К9 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат НСУБ из 8ЕС) 1Б N0: 1.

В соответствии с рядом осуществлений настоящего изобретения античеловеческое антитело РС8К9 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую (каппа) цепь определяющей комплементарность области (ЬСБК) 1 из 8Еф 1Б N0: 6, ЬСБК2 из 8Еф 1Б N0: 7 и ЬСБК3 из 8Еф 1Б N0: 8. В некоторых осуществлениях античеловеческое антитело РС8К9 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат ЬСУБ из 8ЕС) 1Б N0: 5.

Неограничивающий пример антитела, используемый в примерах, называют тАЬ-316Р. Такое антитело, которое в и8 7608693 также называлось Н4Н098Р. тАЬ-316Р (Н4Н098Р), содержит пару аминокислотных последовательностей НСУК/ЬСУК с 8Еф 1Б N0: 1/5, а также домены

НСБК1-НСБК2-НСБК3/РСБК1-РСБК2-РСБК3, представленные последовательностями 8Еф 1Б N0: 2, 3, 4/8ЕС 1Б N0: 6-7-8.

Количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащееся в фармацевтических составах настоящего изобретения, можно менять в зависимости от желаемых конкретных свойств составов, а также конкретных обстоятельств и целей, для достижения которых предполагается использовать составы. В определенных осуществлениях фармацевтическими составами являются жидкие препараты, которые могут содержать от 50±7,5 до 250±37,5 мг/мл антитела; от 60±9 до 240±36 мг/мл антитела;

от	70±10.5	до	230±34,5	мг/мл	антитела;	от	80±12	до	220±33	мг/мл	антитела;
от	90±13,5	до	210±31,5	мг/мл	антитела;	от	100±15	до	200±30	мг/мл	антитела;
от	110±16,5	до	190±28,5	мг/мл	антитела;	от	120±18	до	180±27	мг/мл	антитела;

от 130±19,5 до 170±25,5 мг/мл антитела; от 140±21 до 160±24 мг/мл антитела; 150±22,5 антитела или 175±26,25 мг/мл. Например, составы настоящего изобретения могут содержать примерно 50 мг/мл; примерно 60 мг/мл; примерно 65 мг/мл; примерно 70 мг/мл; примерно 75 мг/мл; примерно 80 мг/мл; примерно 85 мг/мл; примерно 90 мг/мл; примерно 95 мг/мл; примерно 100 мг/мл; примерно 105 мг/мл;

примерно	110	мг/мл;	примерно	115	мг/мл;	примерно	120	мг/мл; примерно	125	мг/мл;
примерно	130	мг/мл;	примерно	135	мг/мл;	примерно	140	мг/мл; примерно	145	мг/мл;
примерно	150	мг/мл;	примерно	155	мг/мл;	примерно	160	мг/мл; примерно	165	мг/мл;
примерно	170	мг/мл;	примерно	175	мг/мл;	примерно	180	мг/мл; примерно	185	мг/мл;
примерно	190	мг/мл;	примерно	195	мг/мл;	примерно	200	мг/мл; примерно	205	мг/мл;
примерно	210	мг/мл;	примерно	215	мг/мл;	примерно	220	мг/мл; примерно	225	мг/мл;
примерно	230	мг/мл;	примерно	235	мг/мл; примерно 240 мг/мл; примерно 245	мг/мл или

примерно 250 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с человеческим РС8К9.

Вспомогательные вещества и рН.

Лекарственные препараты настоящего изобретения могут также содержать одно или несколько вспомогательных веществ. Используемый в настоящем документе термин вспомогательное вещество означает любой нелекарственный агент, добавляемый к препарату для достижения необходимой консистенции, вязкости или стабилизирующего эффекта.

В некоторых осуществлениях фармацевтический препарат настоящего изобретения содержит по крайней мере один органический вспомогательный растворитель такого рода и в таких количествах, ко- 8 028227 торые стабилизируют человеческое антитело РС8К9 при грубом обращении или взбалтывании, например при встряхивании. В некоторых осуществлениях под стабилизируют понимается предупреждение образования более 3% агрегированного антитела от общего количества антитела (на молярной основе) при грубом воздействии. В некоторых осуществлениях под грубым воздействием понимают встряхивание раствора, содержащего антитело и органический вспомогательный растворитель в течение примерно 60 или примерно 120 мин.

В некоторых осуществлениях органическим вспомогательным растворителем является неионогенное поверхностно-активное соединение, например алкилполиэтиленоксид. К характерным неионогенным поверхностно-активным веществам, которые могут входить в препарат настоящего изобретения, относятся, например, полисорбаты, например полисорбат 20, полисорбат 28, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65, полисорбат 80, полисорбат 81 и полисорбат 85; полоксамеры, например полоксамер 181, полоксамер 188, полоксамер 407 или полиэтиленгликоль (РЕО). Полисорбат 20 также известен под названием Τ\νΕΕΝ 20, сорбитан монолаурат и полиоксиэтиленсорбитан монолаурат. Полоксамер 188 также известен как РЬиКО№С Р68.

Количество неионогенного поверхностно-активного вещества, содержащееся в фармацевтических составах настоящего изобретения, можно менять в зависимости от желаемых конкретных свойств составов, а также конкретных обстоятельств и целей, для достижения которых предполагается использовать составы. В некоторых осуществлениях составы могут содержать от 0,01±0,0015 до 0,2±0,03% поверхностно-активного вещества. Например, составы настоящего изобретения могут содержать примерно 0,0085%; примерно 0,01%; примерно 0,02%; примерно 0,03%; примерно 0,04%; примерно 0,05%; примерно 0,06%; примерно 0,07%; примерно 0,08%; примерно 0,09%; примерно 0,1%; примерно 0,11%; примерно 0,12%; примерно 0,13%; примерно 0,14%; примерно 0,15%; примерно 0,16%; примерно 0,17%; примерно 0,18%; примерно 0,19%; примерно 0,20%; примерно 0,21%; примерно 0,22% или примерно 0,23% (вес./об.) полисорбата 20 или полоксамера 188.

Фармацевтические препараты настоящего изобретения могут также содержать один или несколько стабилизаторов такого рода и в таких количествах, которые стабилизируют человеческое антитело РС8К9 в условиях теплового стресса. В некоторых осуществлениях стабилизируют означает сохранение более примерно 91% антитела в нативной конформации в условиях, когда раствор, содержащий антитело и термический стабилизатор, выдерживают при температуре примерно 45°С в течение примерно до 28 дней. В некоторых осуществлениях под стабилизируют означает агрегирование менее примерно 6% антитела в условиях, когда раствор, содержащий антитело и термический стабилизатор, выдерживают при температуре примерно 45°С в течение примерно 28 дней. Используемый в настоящем документе термин нативный означает основную форму антитела, которая определяется по эксклюзионной хроматографии и обычно представляет собой интактный мономер антитела.

В некоторых осуществлениях термическим стабилизатором является сахар или сахароспирт, выбираемый из сахарозы, трегалозы и маннитола, или любого их сочетания, количество которого в препарате можно менять в зависимости от конкретных обстоятельств и целей, для достижения которых предполагается использовать составы. В некоторых осуществлениях препараты могут содержать от примерно 3 до примерно 14% сахара или сахароспирта; от примерно 4 до примерно 13% сахара или сахароспирта; от примерно 5 до примерно 12% сахара или сахароспирта; от примерно 6 до примерно 11% сахара или сахароспирта; от примерно 7 до примерно 10% сахара или сахароспирта; от примерно 8 до примерно 9% сахара или сахароспирта; от примерно 4 до примерно 6% сахара или сахароспирта; от примерно 5 до примерно 7% сахара или сахароспирта; от примерно 9 до примерно 11% сахара или сахароспирта или от примерно 11 до примерно 13% сахара или сахароспирта. Например, фармацевтические препараты настоящего изобретения могут содержать 4± 0,6%; 5±0,75%; 6±0,9%; 7±1,05%; 8± 1,2%; 9± 1,35%; 10± 1,5%; 11±1,65%; 12±1,8%; 13±1,95% или примерно 14% ±2,1% сахара или сахароспирта (например, сахарозы, трегалозы или маннитола).

Фармацевтические препараты настоящего изобретения могут также содержать буфер или буферную систему, которые служат для поддержания стабильного рН и способствуют стабилизации человеческого антитела РС8К9. В некоторых осуществлениях термин стабилизируют означает агрегирование менее примерно 4,5±0,5% или менее 6,0±0,5% антитела в условиях, когда раствор, содержащий антитело и буфер, выдерживают при температуре примерно 45°С в течение примерно 28 дней. В некоторых осуществлениях стабилизируют означает агрегирование менее примерно 3±0,5% или менее 2,6±0,5% антитела в условиях, когда раствор, содержащий антитело и буфер, выдерживают при температуре примерно 37°С в течение примерно 28 дней. В некоторых осуществлениях под стабилизируют понимается, что по крайней мере 91±0,5% или по крайней мере 92±0,5% антитела по данным эксклюзионной хроматографии остается в своей нативной конформации в условиях, когда раствор, содержащий антитело и буфер, выдерживают при температуре примерно 45°С в течение примерно 28 дней. В некоторых осуществлениях под стабилизируют понимается, что по крайней мере 94±0,5 или по крайней мере 95±0,5% антитела по данным эксклюзионной хроматографии остается в своей нативной конформации в условиях, когда раствор, содержащий антитело и буфер, выдерживают при температуре примерно 37°С в течение примерно

- 9 028227 дней. Под нативным или нативной конформацией подразумевают долю антитела, которая не подверглась агрегированию или распаду. Это обычно определяется по результатам анализа, при котором определяется относительный размер частиц антитела, например, методом эксклюзионной хроматографии. Неагрегрированное и неразложившееся антитело элюируется во фракции, которая идентична нативному антителу и, как правило, является основной фракцией элюата. Агрегированное антитело элюируется во фракции, которая указывает на размеры, превышающие размеры нативного антитела. Разложившееся антитело элюируется во фракции, которая указывает на размеры, меньшие размеров нативного антитела.

В некоторых осуществлениях под стабилизируют понимается, что по крайней мере 38±0,5% или по крайней мере 29±0,5% антитела по данным катионообменной хроматографии остается в своей главной заряженной форме в условиях, когда раствор, содержащий антитело и буфер, выдерживают при температуре примерно 45°С в течение примерно 28 дней. В некоторых осуществлениях под стабилизируют понимается, что по крайней мере 46±0,5% или по крайней мере 39±0,5% антитела по данным катионообменной хроматографии остается в своей главной заряженной форме в условиях, когда раствор, содержащий антитело и буфер, выдерживают при температуре примерно 37°С в течение примерно 28 дней. Под главным зарядом или главной заряженной формой подразумевают фракцию антитела, которая элюируется с ионообменной смолы в главном пике, к которому с одной стороны примыкают более основные пики, а с другой стороны - более кислые пики.

Фармацевтические составы настоящего изобретения могут иметь рН от примерно 5,2 до примерно 6,4. Например, составы настоящего изобретения могут иметь рН примерно 5,5; примерно 5,6; примерно 5,7; примерно 5,8; примерно 5,9; примерно 6,0; примерно 6,1; примерно 6,2; примерно 6,3; примерно 6,4; или примерно 6,5. В некоторых осуществлениях рН составляет 6,0±0,4; 6,0±0,3; 6,0 ±0,2; 6,0±0,1; примерно 6,0.

В некоторых осуществлениях буфер или буферная система включают по крайней мере один буфер с диапазоном буферной емкости, который полностью или частично перекрывается с интервалом рН 5,57,4. В одном осуществлении буфер имеет рКа примерно 6,0±0,5. В некоторых осуществлениях буфером является гистидиновый буфер. В некоторых осуществлениях гистидин присутствует в концентрации от 5±0,75 до 15±2,25 мМ; от 6±0,9 до 14±2,1 мМ; от 7±1,05 до 13±1,95 мМ; от 8±1,2 до 12± 1,8 мМ; от 9±1,35 до 11±1,65 мМ; 10±1,5 мМ;или примерно 10 мМ. В некоторых осуществлениях буферная система содержит гистидин в концентрации 10±1,5 мМ при рН до 6,0±0,3.

Фармацевтические составы настоящего изобретения могут также содержать одно или несколько вспомогательных веществ, которые служат для поддержания низкой вязкости или для снижения вязкости препаратов, содержащих высокие концентрации лекарственного вещества на основе антитела к РС8К9 (например, как правило, >150 мг/мл антитела). В некоторых осуществлениях состав включает аргинин в количествах, достаточных для поддержания вязкости жидкого состава на уровне менее 20±3 сП, менее 15±2,25 или менее 11±1,65 сП. В некоторых осуществлениях препараты содержат аргинин в количестве, достаточном для поддержания вязкости на уровне не выше 10,6±1,59 сП. В некоторых осуществлениях фармацевтический состав настоящего изобретения содержит аргинин, предпочтительно в форме гидрохлорида Ь-аргинина в концентрации от 10±1,5 до 90±13,5 мМ, от 20±3 до 80±12 мМ, от 30±4,5 до 70±10,5, от 40±6 до 60±9 мМ или 50±7,5 мМ.

Примеры составов

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения фармацевтический состав представляет собой, как правило, физиологически изотонический жидкий состав с низкой вязкостью, который содержит (ί) человеческое антитело, которое специфически связывается с человеческой РС8К9 (например, тАЬ-316Р), в концентрации 50±7,5 мг/мл, 100±15 мг/мл, 150±22,5 мг/мл или 175±26,25 мг/мл; (ίί) буферную систему, которая поддерживает рН примерно на уровне 6,0±0,3; (ίίί) сахар, который также служит термическим стабилизатором; (ίν) органический вспомогательный растворитель, который защищает структурную целостность антитела; и (ν) соль аминокислоты, которая служит для поддержания достаточно низкой вязкости для инъекции подходящего объема для подкожного введения.

В соответствии с одним из осуществлений фармацевтический состав содержит (ί) человеческое антитело 1дС1, которое специфически связывает человеческую РС8К9 и которое содержит замещенную тяжелую цепь вариабельной области типа ЮНУ3-23 и замещенную легкую цепь вариабельной области типа ЮЬУ4-1 (например, тАЬ-316Р) в концентрации от примерно 50±7,5 до примерно 175±26,25 мг/мл; (ίί) буферную систему, содержащую гистидин, которая поддерживает рН примерно на уровне 6,0±0,3; (ίίί) сахарозу; (ίν) неионогенный детергент, например полисорбат; и в некоторых случаях (ν) соль аргинина.

В соответствии с одним из осуществлений фармацевтический состав содержит (ί) человеческое антитело 1дС1, которое специфически связывает человеческую РС8К9 и которое содержит НСЭК1 из 8ЕЦ ГО N0: 2, НСЭР2 из 8ЕЦ ГО N0: 3, НСЭР3 из 8ЕЦ ГО N0: 4, 1.СЭН1 из 8ЕЦ ГО N0: 6, 1,С1)Н2 из 8ЕЦ ГО N0: 7, а также ЬС0Р3 из 8ЕЦ ГО N0: 8, в концентрации 175±26,25 мг/мл; (ίί) гистидин в концен- 10 028227 трации 10±1,5 мМ, который обеспечивает рН на уровне 6,0±0,3; (ίίί) сахарозу в концентрации 5±0,75% вес./об.; (ίν) полисорбат 20 в концентрации 0,01±0,0015% (вес./об.) и (ν) гидрохлорид Ь-аргинина в концентрации 50±7,5 мМ.

В соответствии с одним из осуществлений фармацевтический состав содержит (ί) человеческое антитело 1дО1, которое специфически связывает человеческую РС8К9 и которое содержит НСЭК1 из 8ЕО ГО ЫО: 2, НСГОК2 из 8ЕО ГО ЫО: 3, НСГОК3 из 8ЕО ГО ЫО: 4, ЕС1Ж1 из 8ЕО ГО ЫО: 6, ЕС1Ж2 из 8ЕО ГО ЫО: 7, а также ЕСГОК3 из 8Еф ГО ЫО: 8, в концентрации 150±22,5 мг/мл; (ίί) гистидин в концентрации 10±1,5 мМ, который обеспечивает рН на уровне 6,0±0,3; (ίίί) сахарозу в концентрации 10±1,5% (вес./об.) и (ίν) полисорбат 20 в концентрации 0,2±0,03% или 0,01±0,0015% (вес./об.).

В соответствии с одним из осуществлений фармацевтический состав содержит (ί) человеческое антитело 1дО1, которое специфически связывает человеческую РС8К9 и которое содержит НСГОК1 из 8ЕО ГО ЫО: 2, НСГОК2 из 8ЕО ГО ЫО: 3, НСГОК3 из 8ЕО ГО ЫО: 4, ЕС1Ж1 из 8ЕО ГО ЫО: 6, ЕС1Ж2 из 8ЕО ГО ЫО: 7, а также ЕСГОК3 из 8Еф ГО ЫО: 8, в концентрации примерно 100± 15 мг/мл; (ίί) гистидин в концентрации 20±3 мМ, который обеспечивает рН на уровне 6,0±0,3; (ίίί) сахарозу в концентрации 12±1,8% вес./об.; и (ίν) полисорбат 20 в концентрации 0,2±0,03 или 0,01±0,0015% (вес./об.).

В соответствии с одним из осуществлений фармацевтический состав содержит (ί) человеческое антитело 1дО1, которое специфически связывает человеческую РС8К9 и которое содержит НСГОК1 из 8ЕО ГО ЫО: 2, НСГОК2 из 8ЕО ГО ЫО: 3, НСГОК3 из 8ЕО ГО ЫО: 4, ЕС1Ж1 из 8ЕО ГО ЫО: 6, ЕС1Ж2 из 8ЕО ГО ЫО: 7, а также ЕСГОК3 из 8Еф ГО ЫО: 8 в концентрации 50±7,5 мг/мл; (ίί) гистидин в концентрации 10±1,5 мМ, который обеспечивает рН на уровне 6,0±0,3; (ίίί) сахарозу в концентрации 6±0,9% (вес./об.) и (ίν) полисорбат 20 в концентрации 0,1±0,015 или 0,01±0,0015% (вес./об.).

В соответствии с одним из осуществлений фармацевтический состав содержит (ί) человеческое антитело 1дО1, которое специфически связывает человеческую РС8К9 и которое содержит вариабельную область тяжелой цепи из 8Еф ГО ЫО: 1 и вариабельную область легкой цепи из 8Еф ГО ЫО: 5 в концентрации 175±26,25 мг/мл; (ίί) гистидин в концентрации 10± 1,5 мМ, который обеспечивает рН на уровне 6,0±0,3; (ίίί) сахарозу в концентрации 5±0,75% вес./об.; (ίν) полисорбат 20 в концентрации 0,01±0,0015% (вес./об.) и (ν) гидрохлорид Ь-аргинина в концентрации 50±7,5 мМ.

В соответствии с одним из осуществлений фармацевтический состав содержит (ί) человеческое антитело 1дО1, которое специфически связывает человеческую РС8К9 и которое содержит вариабельную область тяжелой цепи из 8Еф ГО ЫО: 1 и вариабельную область легкой цепи из 8Еф ГО ЫО: 5 в концентрации примерно 150±22,5 мг/мл; (ίί) гистидин в концентрации 10± 1,5 мМ, который обеспечивает рН на уровне 6,0±0,3; (ίίί) сахарозу в концентрации 10±1,5% (вес./об.) и (ίν) полисорбат 20 в концентрации 0,2±0,03 или 0,01±0,0015% (вес./об.).

В соответствии с одним из осуществлений фармацевтический состав содержит (ί) человеческое антитело 1дО1, которое специфически связывает человеческую РС8К9 и которое содержит вариабельную область тяжелой цепи из 8Еф ГО ЫО: 1 и вариабельную область легкой цепи из 8Еф ГО ЫО: 5 в концентрации примерно 100±15 мг/мл; (ίί) гистидин в концентрации 20±3 мМ, который обеспечивает на уровне рН 6,0±0,3; (ίίί) сахарозу в концентрации 12±1,8% (вес./об.) и (ίν) полисорбат 20 в концентрации 0,2±0,03 или 0,01±0,0015% (вес./об.).

В соответствии с одним из осуществлений фармацевтический состав содержит (ί) человеческое антитело 1дО1, которое специфически связывает человеческую РС8К9 и которое содержит вариабельную область тяжелой цепи из 8Еф ГО ЫО: 1 и вариабельную область легкой цепи из 8Еф ГО ЫО: 5 в концентрации примерно 50±7,5 мг/мл; (ίί) гистидин в концентрации 10±1,5 мМ, который обеспечивает рН на уровне 6,0±0,3; (ίίί) сахарозу в концентрации 6±0,9% (вес./об.) и (ίν) полисорбат 20 в концентрации 0,1 ±0,015 или 0,01±0,0015% (вес./об.).

Дополнительные неограничивающие примеры фармацевтических составов, входящих в сферу охвата настоящего изобретения, раскрываются в других разделах настоящего документа, в том числе в демонстрационных примерах, приведенных ниже.

Стабильность и вязкость фармацевтических составов.

Фармацевтические составы настоящего изобретения, как правило, отличаются высокими уровнями стабильности. Термин стабильный, который используется в настоящем документе в отношении фармацевтических составов, означает, что антитела в фармацевтических составах сохраняют приемлемый уровень химической структуры или биологической функции после хранения в определенных условиях. Состав может быть стабильным, даже несмотря на то что содержащееся в нем антитело не сохраняет 100% своей химической структуры или биологической функции после хранения в течение определенного периода времени. В определенных обстоятельствах сохранение примерно 90%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99% структуры или функции антитела после хранения в течение определенного периода времени может рассматриваться как стабильность.

- 11 028227

Стабильность, кроме прочего, может измеряться по определяемому проценту нативного антитела, который остается в составе после хранения в течение определенного периода времени при определенной температуре. Процент нативного антитела может определяться, среди прочего, с помощью эксклюзионной хроматографии (например, высокоэффективной жидкостной эксклюзионной хроматографии [эксклюзионная ВЭЖХ]), при этом под нативным понимается неагрегированное и неразложившееся антитело. Используемое в настоящем документе выражение приемлемый уровень стабильности означает, что после хранения в течение определенного периода времени при заданной температуре в препарате может обнаруживаться по крайней мере 90% нативной формы антитела. В некоторых осуществлениях после хранения в течение определенного времени при определенной температуре в препарате можно зарегистрировать по крайней мере примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% нативной формы антитела. Заданный период времени, по истечении которого измеряется стабильность, может составлять по крайней мере 14 дней, по крайней мере 28 дней, по крайней мере 1 месяц, по крайней мере 2 месяца, по крайней мере 3 месяца, по крайней мере 4 месяца, по крайней мере 5 месяцев, по крайней мере 6 месяцев, по крайней мере 7 месяцев, по крайней мере 8 месяцев, по крайней мере 9 месяцев, по крайней мере 10 месяцев, по крайней мере 11 месяцев, по крайней мере 12 месяцев, по крайней мере 18 месяцев, по крайней мере 24 месяцев или более. Заданной температурой, при которой может храниться фармацевтический состав при определении стабильности, может быть любая температура от примерно -80 до примерно 45°С, например хранение примерно при -80°С, примерно -30°С, примерно -20°С, примерно 0°С, примерно 4-8°С, примерно 5°С, примерно 25°С, примерно 35°С, примерно 37°С или примерно 45°С. Например, фармацевтический состав может считаться стабильным, если через 6 месяцев хранения при 5°С с помощью эксклюзионной ВЭЖХ регистрируется более чем примерно 95, 96, 97 или 98% нативного антитела. Фармацевтический состав может считаться стабильным, если через 6 месяцев хранения при 25°С с помощью эксклюзионной ВЭЖХ регистрируется более чем примерно 94, 95, 96, 97 или 98% нативного антитела. Фармацевтический состав может считаться стабильным, если через 28 дней хранения при 45°С с помощью эксклюзионной ВЭЖХ регистрируется более чем примерно 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98% нативного антитела. Фармацевтический состав может считаться стабильным, если через три месяца хранения при -20°С с помощью эксклюзионной ВЭЖХ регистрируется более чем примерно 96, 97 или 98% нативного антитела. Фармацевтический состав может считаться стабильным, если через три месяца хранения при -30°С с помощью эксклюзионной ВЭЖХ регистрируется более чем примерно 96, 97 или 98% нативного антитела. Фармацевтический состав может считаться стабильным, если через три месяца хранения при -80°С с помощью эксклюзионной ВЭЖХ регистрируется более чем примерно 96, 97 или 98% нативного антитела.

Стабильность, кроме прочего, может измеряться по определяемому проценту антитела, которое образует агрегаты в составе после хранения в течение определенного периода времени при определенной температуре, причем стабильность обратно пропорциональна проценту образовавшегося агрегата. Процент агрегированного антитела может определяться, среди прочего, с помощью эксклюзионной хроматографии (например, высокоэффективной жидкостной эксклюзионной хроматографии [эксклюзионная ВЭЖХ]). Используемое в настоящем документе выражение приемлемый уровень стабильности означает, что после хранения в течение определенного периода времени при заданной температуре в препарате может обнаруживаться не больше 6% антитела в агрегированной форме. В некоторых осуществлениях после хранения в течение определенного времени при определенной температуре в препарате может регистрироваться не больше примерно 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1% агрегированного антитела. Заданный период времени, по истечении которого измеряется стабильность, может составлять по крайней мере недели, по крайней мере 28 дней, по крайней мере 1 месяц, по крайней мере 2 месяца, по крайней мере месяца, по крайней мере 4 месяца, по крайней мере 5 месяцев, по крайней мере 6 месяцев, по крайней мере 7 месяцев, по крайней мере 8 месяцев, по крайней мере 9 месяцев, по крайней мере 10 месяцев, по крайней мере 11 месяцев, по крайней мере 12 месяцев, по крайней мере 18 месяцев, по крайней мере 24 месяцев или более. Заданной температурой, при которой может храниться фармацевтический состав при определении стабильности, может быть любая температура от примерно -80 до примерно 45°С, например хранение примерно при -80°С, примерно -30°С, примерно -20°С, примерно 0°С, примерно 4-8°С, примерно 5°С, примерно 25°С, примерно 35°С, примерно 37°С или примерно 45°С. Например, фармацевтический состав может считаться стабильным, если через шесть месяцев хранения при 5°С регистрируется менее чем примерно 3, 2, 1, 0,5 или 0,1% антитела в агрегированной форме. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если через шесть месяцев хранения при 25°С регистрируется менее чем примерно 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1% антитела в агрегированной форме. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если через 28 дней хранения при 45°С регистрируется менее чем примерно 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1% антитела в агрегированной форме. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если через три месяца хранения при -20° -30°или -80°С регистрируется менее чем примерно 3, 2, 1, 0,5 или 0,1% антитела в агрегированной форме.

Стабильность, кроме прочего, может измеряться по определяемому проценту антитела, которое переходит в более кислую фракцию в процессе ионного обмена (кислая форма), по сравнению с главной фракцией антитела (главная заряженная форма), причем стабильность обратно пропорциональна доле

- 12 028227 антитела в кислой форме. Не накладывая какие-либо теоретические ограничения, можно отметить, что деамидирование антитела может привести к повышению отрицательного заряда антитела, а значит, к его более высокой кислотности по сравнению с недеамидированным антителом (см., например, КоЪшкои, Ν., Рго1сш ПеашШайои, ΡΝΑδ, Αρτίΐ 16, 2002, 99(8):5283-5288). Процент подкисленного антитела можно определять, среди прочего, с помощью ионообменной хроматографии (например, высокоэффективной жидкостной катионообменной хроматографии [катионообменная ВЭЖХ]). Используемое в настоящем документе выражение приемлемый уровень стабильности означает, что после хранения в течение определенного периода времени при заданной температуре в препарате может обнаруживаться не более 49% антитела в более кислой форме. В некоторых осуществлениях приемлемый уровень стабильности означает, что после хранения в течение определенного времени при определенной температуре в препарате может регистрироваться не более примерно 49, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1% антитела в кислой форме. Заданный период времени, по истечении которого измеряется стабильность, может составлять по крайней мере 2 недели, по крайней мере 28 дней, по крайней мере 1 месяц, по крайней мере 2 месяца, по крайней мере 3 месяца, по крайней мере 4 месяца, по крайней мере 5 месяцев, по крайней мере 6 месяцев, по крайней мере 7 месяцев, по крайней мере 8 месяцев, по крайней мере 9 месяцев, по крайней мере 10 месяцев, по крайней мере 11 месяцев, по крайней мере 12 месяцев, по крайней мере 18 месяцев, по крайней мере 24 месяцев или более. Заданной температурой, при которой можно хранить фармацевтический состав при определении стабильности, может быть любая температура от примерно -80 до примерно 45°С, например, хранение примерно при -80°С, примерно -30°С, примерно -20°С, примерно 0°С, примерно 4°-8°С, примерно 5°С, примерно 25°С или примерно 45°С. Например, фармацевтический состав может считаться стабильным, если через три месяца хранения при -80, -30 или -20°С менее чем примерно 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 9, 8, 7,

6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1% антитела оказывается в более кислой форме. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если через шесть месяцев хранения при 5°С менее чем примерно 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1% антитела оказывается в более кислой форме. Фармацевтический состав может считаться стабильным, если через шесть месяцев хранения при 25°С менее чем примерно 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1% антитела оказывается в более кислой форме. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если через 28 дней хранения при 45°С менее чем примерно 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 9, 8,

7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1% антитела оказывается в более кислой форме.

Для оценки стабильности составов настоящего изобретения могут использоваться и другие методы, например дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК), для определения термической стабильности, контролируемое встряхивание для определения механической стабильности и поглощение примерно при 350 или примерно при 405 нм для определения мутности раствора. Например, состав настоящего изобретения может считаться стабильным, если через 6 или более месяцев хранения при температуре от примерно 5 до примерно 25°С изменение ОЭ₄₀₅ состава будет менее примерно 0,05 (например, 0,04, 0,03, 0,02, 0,01 или менее) по сравнению с ОЭ₄₀₅ состава в начальный момент времени.

Измерение биологической активности или аффинности связывания антитела с его мишенью также может использоваться для оценки стабильности. Например, состав настоящего изобретения может считаться стабильным, если после хранения, например, при 5, 25, 45°С и пр. в течение определенного периода времени (например, от 1 до 12 месяцев) антитело к РС8К9, которое содержится в составе, связывается с РС8К9 с аффинностью, которая составляет по крайней мере 90, 95% или более от аффинности связывания антитела до упомянутого хранения. Аффинность связывания может определяться, например, с помощью ЕЫ8А или плазмонного резонанса. Биологическая активность может определяться по анализу активности РС8К9, например, взаимодействию клетки, которая экспрессирует РС8К9, с составом, содержащим антитело к РС8К9. Связывание антитела с такой клеткой может измеряться напрямую, например с помощью анализа РАС8. В альтернативном варианте последующая активность системы РС8К9 может измеряться в присутствии антитела и сопоставляться с активностью системы РС8К9 в отсутствие антитела. В некоторых осуществлениях РС8К9 может быть эндогенной для клетки. В других осуществлениях РС8К9 может эктопически экспрессироваться в клетке.

Дополнительные способы оценки стабильности антитела в составе изложены в примерах, представленных ниже.

Жидкие фармацевтические препараты настоящего изобретения в некоторых осуществлениях могут отличаться низкими или средними уровнями вязкости. Используемый в настоящем документе термин вязкость относится к кинематической вязкости или абсолютной вязкости. Кинематическая вязкость является показателем резистивного течения жидкости под действием силы тяжести. Если две жидкости равного объема поместить в одинаковые капиллярные вискозиметры и позволить им вытекать под действием силы тяжести, то для прохождения через капилляр вязкой жидкости потребуется больше времени, чем жидкости с меньшей вязкости. Например, если одной жидкости для полного вытекания потребуется 200 с, а другой жидкости требуется 400 с, то вторая жидкость считается вдвое более вязкой

- 13 028227 по сравнению с первой по шкале кинематической вязкости. Абсолютная вязкость, которую иногда называют динамической или простой вязкостью, представляет собой произведение кинематической вязкости и плотности жидкости (абсолютная вязкость = кинематическая вязкость х плотность). Размерность кинематической вязкости - Ь²/Т, где Ь - длина, а Т - время. Кинематическая вязкость обычно выражается в сантистоксах (сСт). Единицей кинематической вязкости в системе СИ является мм²/с, равная 1 сСт. Абсолютная вязкость выражается в сантипуазах (сП). В системе СИ единицей абсолютной вязкости является миллипаскаль-секунда (мПа-с), где 1 сП = 1 мПа-с.

Используемая в настоящем документе характеристика низкого уровня вязкости в отношении жидкого состава настоящего изобретения будет соответствовать абсолютной вязкости менее примерно 15 сП. Например, жидкий состав настоящего изобретения будет иметь низкую вязкость, если при регистрации с помощью стандартных методик измерения вязкости состав оказывается имеющим абсолютную вязкость примерно 15 сП, примерно 14 сП, примерно 13 сП, примерно 12 сП, примерно 11 сП, примерно 10 сП, примерно 9 сП, примерно 8 сП или менее. Используемая в настоящем документе характеристика среднего уровня вязкости в отношении жидкого состава настоящего изобретения будет соответствовать абсолютной вязкости в интервале между примерно 35 и примерно 15 сП. Например, жидкий состав настоящего изобретения будет иметь среднюю вязкость, если при регистрации с помощью стандартных методик измерения вязкости состав оказывается имеющим абсолютную вязкость примерно 34 сП, примерно 33 сП, примерно 32 сП, примерно 31 сП, примерно 30 сП, примерно 29 сП, примерно 28 сП, примерно 27 сП, примерно 26 сП, примерно 25 сП, примерно 24 сП, примерно 23 сП, примерно 22 сП, примерно 21 сП, примерно 20 сП, примерно 19 сП, 18 сП, примерно 17 сП, примерно 16 сП или примерно 15,1 сП.

Как явствует из приведенных ниже примеров, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что при добавлении в состав антитела аргинина в концентрации от примерно 25 до примерно 100 мМ можно получить жидкие составы с вязкостью от низкой до средней, содержащие высокие концентрации античеловеческого антитела РСЗК9 (например, от примерно 100 до по крайней мере 200 мг/мл). Кроме того, было также обнаружено, что вязкость состава можно будет снизить в еще большей степени за счет снижения содержания сахарозы до менее чем примерно 10%.

Контейнеры и способы введения.

Фармацевтические составы настоящего изобретения можно помещать в любой контейнер, пригодный для хранения лекарств и других лекарственных препаратов. Например, фармацевтические составы можно помещать в герметичный и стерилизованный пластиковый или стеклянный контейнер с определенным объемом, например флакон, ампулу, шприц, картридж или бутылку. Для хранения составов настоящего изобретения могут использоваться различные типы флаконов, в том числе, например, прозрачные и непрозрачные (например, янтарного цвета), стеклянные или пластиковые флаконы. Аналогичным образом, для хранения или введения фармацевтического состава настоящего изобретения могут использоваться шприцы любого типа.

Фармацевтические составы настоящего изобретения можно помещать в шприцы с обычным содержанием вольфрама или шприцы с низким содержанием вольфрама. Специалистам в области будет очевидно, что процесс изготовления стеклянных шприцев обычно предполагает использование горячего вольфрамового стержня для формирования отверстия в стекле, через которое будут набираться и подаваться жидкости. Такой процесс приводит к отложению следовых количеств вольфрама на внутренней поверхности шприца. Последующая промывка и другие производственные стадии могут использоваться для снижения содержания вольфрама в шприце. Используемый в настоящем документе термин обычное содержание вольфрама означает, что шприц содержит не менее 500 миллиардных долей вольфрама. Термин низкое содержание вольфрама означает, что шприц содержит менее 500 миллиардных долей вольфрама. Например, в соответствии с настоящим изобретением шприц с низким содержанием вольфрама содержит менее примерно 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 390, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 или меньше миллиардных долей вольфрама.

Резиновые поршни, используемые в шприцах, а также резиновые пробки, которыми закрывают флаконы, могут иметь покрытие для предотвращения загрязнения лекарственного содержимого шприца или флакона, или же для обеспечения его стабильности. Таким образом, фармацевтические составы настоящего изобретения в соответствии с определенными осуществлениями можно помещать в шприц с покрытым поршнем или же во флакон, который закупоривается резиновой пробкой с покрытием. Например, поршень или пробку можно покрывать пленкой фторуглеводородов. Примеры пробок или поршней с покрытием, пригодных для использования с флаконами и шприцами, содержащими фармацевтические составы настоящего изобретения, приводятся, например, в патентах США № 4997423; 5908686; 6286699; 6645635 и 7226554, содержание которых в силу ссылки на них полностью включается в текст настоящего документа. Конкретные примеры резиновых пробок и поршней с покрытием, которые могут использоваться в контексте настоящего изобретения, серийно выпускаются под торговой маркой ИигоТес®, поставляемой ХУсЧ РЬагтасеиЕса1 Зегуюек, 1пс. (Лайонвилль, штат Пенсильвания). ИигоТес® является примером фторуглеводородного покрытия, которое используется, чтобы свести к

- 14 028227 минимуму или предотвратить налипание лекарственного вещества на резиновые поверхности.

В соответствии с определенными осуществлениями настоящего изобретения фармацевтические составы можно помещать в шприц с низким содержанием вольфрама и поршнем с фторуглеводородным покрытием.

Фармацевтические составы могут вводиться пациенту парентерально, например посредством инъекции (например, подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно и пр.), или посредством чрескожного, чрезслизистого, назального, ингаляционного или перорального введения. Для подкожного введения фармацевтического состава настоящего изобретения могут применяться самые различные конструкции многоразовых шприцов-ручек и устройств для автоматической инъекции. К примерам, среди прочего относятся ΆυΤΘΡΕΝ™ (О\усп МитГогб. 1пс., Вудсток, Великобритания), шприц-ручка ΌΙδΕΤΚ,ΟΝΙΟ™ (О|5с1гоп1с МсФса1 §у8!ет8, Бергдорф, Швейцария), шприц-ручка НиМЛЬОС ΜΙΧ 75/25™, шприц-ручка НиМЛЬОС™, шприц-ручка ΗυΜΆΣΙΝ 70/30™ (Ей ЬШу апб Со., Индианаполис, штат Индиана), ΝΟνΟΡΕΝ™ I, II и ΙΙΙ (Νονο Νοτ6ίδΕ, Копенгаген, Дания), ΝΟνΟΡΕΝ Ш№ОК™ (Νονο Νοι^ίδΕ Копенгаген, Дания), шприц-ручка ВИ™ (ВесЮп ^^ск^ηδοη. Франклин-Лейке, Нью-Джерси), ΟΡΤΙΡΕΝ'™, ΟΡΤΙΡΕΝ ΡΚΌ™, ΟΡΤΙΡΕΝ δΤΑΚΕΕΤ™, и ОРТЮЫК™ (δапοГ^-аνепί^δ, Франкфурт, Германия). К примерам разовых шприцов-ручек или устройств для автоматической инъекции, которые могут применяться для подкожного введения фармацевтического состава настоящего изобретения, среди прочих, относятся шприц-ручка δΟ^ΟδΤАΚ™(δаηοГ^-аνеηΐ^δ), РЙ-ΕΧΡΕΝ'™ (Νονο ΝοΓ6ίδ1<) и ΚνΙΚΡΕΝ™ (Εΐϊ Ьб1у), автоматическое устройство §иΚΕС^IСΚ™ (Атдеп, Таусенд-Оакс, штат Калифорния), ΡΕΝΣΕΤ™ (Н;«е1те1ег Штуттгарт, Германия), ΕΡΙΡΕΝ (Иеу, Ε.Ρ.) и шприц-ручка ΗυΜΙΚΑ™ (ΑόΗοΙΙ йаУ Эббот-Парк, штат Иллинойс).

Также можно использовать микроинжектор для доставки фармацевтических составов настоящего изобретения. Используемый в настоящем документе термин микроинжектор означает устройство для подкожного введения, предназначенное для медленного вливания больших объемов (например, до 2,5 мл и выше) лекарственного состава в течение продолжительного периода времени (например, примерно 10, 15, 20, 25, 30 мин или более). См., например, и.8. 6629949; υδ 6659982; а также Меейап е1 а1., 1. ^ηΐτο1^6 Κе1еаδе, 46:107-116 (1996). Микроинжекторы особенно удобны для доставки больших доз лекарственных белков, содержащихся в высоких концентрациях (например, примерно 100, 125, 150, 175, 200 мг/мл или более), или вязких растворов.

В одном осуществлении жидкий фармацевтический препарат, содержащий примерно 175±26,25 мг/мл антитела к ΡСδΚ9 вводится подкожно в объеме примерно 1,14 мл±0,17 мл в предварительно заполненном шприце. В одном осуществлении в качестве шприца используется длинный стеклянный шприц объемом 1 мл с тонкостенной иглой размером 27-С, с поршнем из резины с фторуглеводородным покрытием и резиновым колпачком иглы. В одном осуществлении в качестве шприца используется длинный стеклянный шприц ΟΜΡI объемом 1 мл с иглой размером 27-С, с резиновым колпачком иглы РМ27 и поршнем из резины с покрытием Ρ^υΚΟΤΕС® 4023/50.

В одном осуществлении жидкий фармацевтический препарат, содержащий примерно 150±22,5 мг/мл антитела к ΡСδΚ9 вводится подкожно в объеме примерно 1 мл±0,15 мл в предварительно заполненном шприце. В одном осуществлении в качестве шприца используется длинный стеклянный шприц объемом 1 мл с тонкостенной иглой размером 27-С, с поршнем из резины с фторуглеводородным покрытием и резиновым колпачком иглы. В одном осуществлении в качестве шприца используется длинный стеклянный шприц ΟΜΡI объемом 1 мл с иглой размером 27-С, с резиновым колпачком иглы РМ27 и поршнем из резины с покрытием Ρ^υΚ.ΟΤΕС® 4023/50.

Терапевтическое применение фармацевтических составов.

Фармацевтические составы настоящего изобретения, среди прочего, применяются для лечения, профилактики или смягчения симптомов любого заболевания или нарушения, связанного с активностью ΡСδΚ9, в том числе заболеваний или нарушений, опосредованных ΡСδΚ9. К примерам неограничивающих заболеваний и нарушений, которые можно излечивать или предупредить посредством введения фармацевтических составов настоящего изобретения, относятся различные дислипидемии, например гиперхолестеринемия, наследственная гиперхолестеринемия, гиперлипидемия, наследственная гиперлипидемия, дисбеталипопротеинемия, наследственная дисбеталипопротеинемия, гипертриглицеридемия и наследственная гипертриглицеридемия.

- 15 028227

Примеры

Приведенные ниже примеры призваны дать специалистам в области полное раскрытие информации и описание того, как следует формулировать и использовать способы и препараты настоящего изобретения, и не призваны ограничивать сферу охвата того, что изобретатели рассматривают как предмет своего изобретения. Были приложены все усилия обеспечить точность в отношении используемых показателей (например, количеств, температуры и пр.), но необходимо учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, под частями понимаются части в молях, молекулярным весом называют усредненный молекулярный вес, температура приводится в градусах Цельсия, а давление находится на уровне атмосферного или близко к этому уровню.

Начальные этапы разработки состава включали скрининг органических вспомогательных растворителей, термических стабилизаторов и буферов в жидких и лиофилизованных составах шЛЬ-316Р (антител к РС8К9 изобретения), чтобы определить вспомогательные вещества, совместимые с белком и повышающие его стабильность, одновременно поддерживая близкую к физиологической осмоляльность и низкую вязкость для внутривенного и подкожного введения. Анализировали также буферные условия, чтобы определить оптимальный рН для максимальной стабильности белка.

Пример 1. Разработка состава анти-РС8К1 тАЬ-316Р.

Проводили скрининг различных буферов, органических вспомогательных растворителей и термических стабилизаторов для выявления вспомогательных веществ, которые повышают стабильность антитела РС8К9. Анализировали также буферные условия, чтобы определить оптимальный рН для максимальной стабильности антитела. Результаты этих исследований использовали для разработки стабильного жидкого состава, а также стабильного лиофилизованного состава, пригодного для клинического использования как при внутривенном (в/в), так и подкожном (п/к) введении. В случае лиофилизованного лекарства был разработан один состав для двойного применения, который можно разводить стерильной водой для инъекций (ВДИ) до концентрации либо 50 мг/мл для в/в или 100 мг/мл для п/к введения. После разведения до 50 мг/мл лекарство можно дополнительно разбавлять в пакете для в/в вливания, содержащем 0,9% хлорида натрия для в/в инъекций. Для жидкого состава концентрация тАЬ-316Р готовили 175±27 и 150±23 мг/мл. В одном осуществлении 175±27 мг/мл тАЬ-316Р готовили в 10± 1,5 мМ гистидине (рН 6,0±0,3), 0,01±0,0015% полисорбате 20, 5±0,75% сахарозе. В одном осуществлении 150±23 мг/мл тАЬ-316Р готовили в 10±1,5 мМ гистидине (рН 6,0±0,3), 0,2±0,03 или 0,01±0,0015% полисорбате 20, 10±1,5% сахарозе.

Пример 2. Буфер и рН анти-РС8К1 тАЬ-316Р.

Для жидких растворов изучали воздействие рН и типа буфера на стабильность антител РС8К9. 2 мг/мл анти-РС8К9 тАЬ-316Р инкубировали при 45°С в одном из следующих 10 мМ буферов: ацетатный (рН 5,0-5,5), цитратный (рН 5,5-6,0), сукцинатный (рН 6,0), гистидиновый (рН 6,0), фосфатный (рН 6,0-7,5) или Τπδ (рН 8,0) для оценки воздействия буфера и рН на термическую стабильность белка (табл. 1). Для этого эксперимента каждый из жидких составов объемом 0,35 мл помещали во флакон емкостью 2 мл из боросиликатного стекла типа 1 с пробкой из бутилкаучука с покрытием РЬИКОТЕС® 4432/50. Общее выделенное количество тАЬ-316Р определяли с использованием обращеннофазовой хроматографии. Процент нативной формы тАЬ-316Р по сравнению с агрегированной определяли с помощью эксклюзионной хроматографии. Процент кислых и основных форм тАЬ-316Р определяли с помощью катионообменной хроматографии. Максимальную стабильность белка отслеживали поданным эксклюзионной хроматографии (ЭХ) и катионообменной хроматографии (КОХ) для состава анти-РС8К9 тАЬ-316Р в 10 мМ гистидиновом буфере при рН 6,0.

Оптимальный рН для тАЬ-316Р затем определяли инкубированием 10 мг/мл тАЬ-316Р при 45°С в гистидиновом буфере в интервале рН от 5,5 до 6,5. Максимальную стабильность белка отслеживали по ЭХ и КОХ для составов тАЬ-316Р в гистидиновом буфере при рН 6,0 (табл. 2). Результаты проведенных анализов показали, что основные пути распада белка связаны с образованием агрегатов, продуктов разложения и различных зарядовых форм. На основании полученных результатов для подготовки жидких и лиофилизованных составов тАЬ-316Р выбрали 10 мМ гистидиновый буфер при рН 6,0.

Результаты исследований вариантов состава показывают, что в основных условиях (рН>6,5) антиРС8К9 тАЬ-316Р в растворе может подвергаться деамидированию. Напротив, при рН<5,5 наблюдалась повышенная скорость образования вариантов молекулярного веса тАЬ-316Р. На основании этих данных рН буфера, используемого для состава тАЬ-316Р, поддерживается в интервале рН между 5,7 и 6,3. Для ускоренных исследований стабильности тАЬ-316Р в этом интервале рН получены аналогичные результаты.

- 16 028227

Пример 3. Выбор средств защиты от стресса при встряхивании.

Раздельно изучали различные вспомогательные растворители по их способности сводить к минимуму образование частиц в смесях, содержащих тАЬ-316Р из-за стресса при встряхивании. Анализ мутности лекарственного препарата при встряхивании показал увеличение оптической плотности (0Ό) при 405 нм после 120 мин встряхивания раствора, содержащего тАЬ-316Р (0,35 мл 25 мг/мл раствора тАЬ-316Р, 10 мМ гистидина, рН 6,0±0,2 во флаконе из боросиликатного стекла типа 1 емкостью 2 мл с пробкой из бутилкаучука с покрытием РЬиК0ТЕС® 4432/50) (табл. 3). Состав со всеми изученными вспомогательными растворителями препятствовал повышению мутности из-за встряхивания. При этом 20% РЕ0 300, 10% РЕ0 300 и 20% пропиленгликоля значительно снижали термическую стабильность тАЬ-316Р по данным ЭХ (табл. 4; та же концентрация тАЬ-316Р, буфер и емкость, что и в приведенном выше исследовании встряхивания). Составы с полисорбатом 20, полисорбатом 80, Р1игошс Р68 и РЕ0 3350 по результатам ЭХ и КОХ не оказывали заметного эффекта на термическую стабильность тАЬ-316Р, что делает указанные вспомогательные растворители пригодными для использования в составах анти-РС8К9 тАЬ-316Р. Полисорбат 20 выбирали в качестве органического вспомогательного растворителя для подготовки лиофилизованных и жидких составов тАЬ-316Р, поскольку при этом удавалось обеспечить высокие характеристики стабильности при встряхивании и исследовании термической стабильности тАЬ-316Р.

Пример 4. Выбор средств защиты от термического стресса.

Раздельно анализировали различные вспомогательные вещества, которые выбирали из перечня, включающего сахара, аминокислоты и неорганические соли, для оптимального увеличения термической стабильности тАЬ-316Р. Итоговая информация по некоторым термическим стабилизаторам, которые включали в исследование, приводится в табл. 5. Для этих экспериментов вспомогательные термические стабилизаторы добавляли в раствор 20 мг/мл тАЬ-316Р в 10 мМ гистидине (0,35 мл во флаконе из боросиликатного стекла типа 1 емкостью 2 мл с пробкой из бутилкаучука с покрытием РЬиК0ТЕС® 4432/50). По результатам ЭХ анализа составы, содержащие сахарозу, сорбитол, маннитол и трегалозу демонстрировали наименьшую степень распада тАЬ-316Р. При этом в составах с сорбитолом наблюдалось неожиданное увеличение мутности по сравнению с составами, содержащими сахарозу, трегалозу и маннитол (табл. 5). Несмотря на то что для сахарозы, трегалозы и маннитола не наблюдалось никакого воздействия на образование различных зарядовых форм анти-РС8К9 тАЬ-316Р, оказалось, что маннитол дестабилизирует белок в ходе нескольких циклов замораживания-оттаивания. Таким образом, стабильность тАЬ-316Р в составах с сахарозой и трегалозой была приблизительно одинаковой.

Пример 5. Лиофилизованный состав.

Был разработан лиофилизованный состав для повышения стабильности анти-РС8К9 тАЬ-316Р, в частности, по отношению к различным зарядовым формам и для увеличения максимальных доставляемых концентраций тАЬ-316Р. Различные лиопротекторы добавляли к 0,7 мл 50 мг/мл раствора тАЬ-316Р, 10 мМ гистидина во флаконе из боросиликатного стекла типа 1 емкостью 2 мл с пробкой из бутилкаучука с покрытием РЬиК0ТЕС® 4432/50, лиофилизировали и анализировали их способность стабилизировать лиофилизованный тАЬ-316Р при инкубации при 50°С. Перед анализом лиофилизованный остаток разводили до 100 мг/мл тАЬ-316Р. Два лиофилизованных состава с наибольшей стабильностью по данным ЭХ и КОХ содержали 1) 6% сахарозы или 2) 2% сахарозы и 2% аргинина. Для приготовления лекарственного препарата тАЬ-316Р выбрали 6% сахарозы. Таким образом, лиофилизованный лекарственный препарат на основе анти-РС8К9 тАЬ-316Р получали лиофилизацией оптимизированного забуференного водного раствора препарата содержащего 10 мМ гистидина, рН 6,0±0,1, 0,1% (вес./об.) полисорбата 20, 6% (вес./об.) сахарозы и 50 мг/мл анти-РС8К9 тАЬ-316Р. Результаты анализа стабильности такого лиофилизованного препарата при хранении и стрессе приводятся в табл. 7.

Цикл лиофилизации анти-РС8К9 тАЬ-316Р формировали на основе измеряемой Тд' состава (температура низкотемпературного стеклования), которую определяли с помощью модулированной дифференциальной сканирующей калориметрии при пониженной температуре окружающей среды (мДСК). При первоначальной сушке температура продукта не должна подниматься выше Тд', которая по результатам измерений составляет -27,9°С.

Для получения лиофилизованного препарата тАЬ-316Р во флаконы из стекла типа 1 помещали 5,3 мл 50 мг/мл тАЬ-316Р, 10 мМ гистидина (рН 6,0), 0,1% полисорбата 20, 6% сахарозы и проводили лиофилизацию в следующей последовательности:

- 17 028227

1. Температура препарата в процессе загрузки:

2. Начальное выдерживание:

3. Скорость (время) замораживания:

4. Выдерживание:

5. Установка вакуума:

6. Скорость (время) нагревания для первичной сушки:

7. Температура препарата при первичной сушке:

8. Продолжительность первичной сушки:

9. Скорость (время) нагревания для вторичной сушки:

10. Температура препарата при вторичной сушке:

11. Продолжительность вторичной сушки:

12. Скорость (время) охлаждения:

13. Выдерживание:

14. Заполнение газообразным азотом

5-25°С минут при 5°С

0,5°С/мин (100 минут)

120 минут при -45°С

100 мТорр

0.5°С/мин (40 минут)

-25°С часов

0.2°С/мин (300 минут)

35°С часов

0.5°С/мин (20 минут) минут при 25°С*

15. Укупорка под вакуумом: 80% атмосферного давления (608 000 мТорр)

Если после вторичной сушки и до момента укупорки требуется продолжительное хранение, температура в лиофилизаторк устанавливается на уровне 2-8°С. Лиофилизованный лекарственный препарат, который был получен в ходе описанных выше завершающих циклов, имел хороший внешний вид, низкое содержание влаги (0,3%), время растворения меньше 4 мин без признаков мутности разведенного раствора.

Внешний вид лиофилизованного остатка не менялся, если лекарственный препарат шАЬ-316Р (шАЬ-316Р ЭР) выдерживали 2 месяца при 50°С или хранили 3 месяца при 5°С. Не отмечалось воздействия на рН, внешний вид или мутность разведенного лекарственного препарата тАЬ-316Р и не отмечалось особых различий в количествах выделенного тАЬ-316Р. Через 2 месяца после инкубации при 50°С лиофилизованный лекарственный препарат тАЬ-316Р был на 1,1% более разложившимся по данным ЭХ ВЭЖХ и на 8,3% более разложившимся по данным КОХ ВЭЖХ. Не отмечалось заметного разложения лиофилизованного лекарственного препарата тАЬ-316Р при хранении в течение 3 месяцев при 5°С. Для всех подвергшихся стрессовому воздействию образцов не отмечалось заметного снижения биологической активности по результатам биопроб анти-РС8К9.

Пример 6. Жидкие и восстановленные препараты тАЬ-316Р.

Существует два метода восстановления лиофилизованного лекарственного препарата тАЬ-316Р в зависимости от способа введения. Для в/в введения лекарственный препарат тАЬ-316Р разводят 5,0 мл стерильной ВДИ с образованием 5,3 мл раствора, содержащего 50 мг/мл тАЬ-316Р, 10 мМ гистидина, рН 6,0, 0,1% (вес./об.) полисорбата 20 и 6% (вес./об.) сахарозы. Для п/к введения лекарственный препарат тАЬ-316Р разводят 2,3 мл стерильной ВДИ с образованием 2,7 мл раствора, содержащего 100 мг/мл ΚΕΟΝ727, 20 мМ гистидина, рН 6,0, 0,2% (вес./об.) полисорбата 20 и 12% (вес./об.) сахарозы. Доступный для отбора объем составляет 4,8 мл для в/в и 2,0 мл для п/к введения; остаток разведенного раствора 0,7 мл оставляют во флаконе для п/к.

В альтернативном варианте жидкий препарат тАЬ-316Р готовят в виде жидкого препарата без промежуточного этапа лиофилизации. Жидкие препараты тАЬ-316Р имеют концентрацию 150 мг/мл (± 15%) или 175 мг/мл (± 15%) анти-РС8К9 тАЬ-316Р в 10±1,5 мМ гистидине (рН 6,0±0,3), полисорбате 20 при 0,01±0,0015 или 0,2±0,03%, сахарозы при 5±0,75 или 10±1,5%, а также в случае состава 175 мг/мл - аргинин при 50±7,5 мМ.

Анти-РС8К9 тАЬ-316Р оказался стабильным при стерильном фильтровании. Для приготовления клинических препаратов использовали фильтрационную установку МПНроге МШЫРАК, а для исследований применяли фильтр аналогичного состава (МПНроге МП ,1 ,НХ ОЕКАРОКП). По сравнению охранением в стеклянном флаконе стабильность состава лекарственного препарата тАЬ-316Р (тАЬ-316Р ΡΏδ) менялась незначительно при хранении в полипропиленовой пробирке, полистирольной пробирке, поликарбонатной пробирке или в стеклянном флаконе со стальным шариковым клапаном (табл. 8).

- 18 028227

Пример 7. Жидкие препараты в предварительно заполненных шприцах.

Исследования по разработке состава проводили с целью приготовления высококонцентрированных жидких составов тАЬ-316Р, которые могут использоваться в предварительно заполненных шприцах (РР8) для п/к введения. Результаты, полученные на стадии разработки лиофилизованного препарата КЕСИ727, продемонстрировали, что оптимальным буфером, рН, вспомогательным растворителем и термическим стабилизатором являлись гистидин, рН 6,0, полисорбат 20 и сахароза соответственно (см. выше). Эти же вспомогательные вещества использовались для разработки составов лекарственных препаратов в концентрации 150 и 175 мг/мл тАЬ-316Р. Для снижения вязкости состава к лекарственному препарату в концентрации 175 мг/мл тАЬ-316Р добавляли аргинин. Стабильность при стрессовом воздействии лекарственного препарата 150 и 175 мг/мл тАЬ-316Р изучали в длинных стеклянных шприцах Νυονα ΟΜ^Ι емкостью 1 мл с предварительным заполнением (РР8) и сравнивали со стабильностью лекарственного препарата 150 и 175 мг/мл в контрольных стеклянных флаконах. После инкубирования лекарственного препарата 150 или 175 мг/мл тАЬ-316Р при 45°С не наблюдалось различий в физической или химической деградации между ΟΜ^Ι РР8 и контрольным стеклянным флаконом. Полученные данные показывают, что составы лекарственных препаратов 150 и 175 мг/мл анти-РС8К9 тАЬ-316Р достаточно стабильны для использования в РР8.

Пример 8. Стабильность составов лекарственных препаратов тАЬ-316Р.

Исследования стабильности проводили для выяснения стабильности при хранении и воздействии стрессовых условий составов 150 и 175 мг/мл тАЬ-316Р. Для оценки физической стабильности тАЬ-316Р использовали анализ мутности и ОФ ВЭЖХ. Физическая стабильность определяется как восстановление растворимых форм анти-РС8К9 тАЬ-316Р в растворе. Потеря белка может быть связана с осаждением белка или поверхностной адсорбцией. Наличие частиц в растворе можно регистрировать визуально или по измерениям оптической плотности (ΟΌ) на 405 нм (измерения мутности). В последнем анализе увеличение ΟΌ указывает на повышение мутности из-за образования твердых частиц. Присутствие твердых частиц, регистрируемое по измерениям ΟΌ, свидетельствует о том, что образец не в состоянии оставаться стабильным. Восстановление тАЬ-316Р регистрируется с помощью ОФ ВЭЖХ. При анализе ОФ ВЭЖХ антитело анти-РС8К9 тАЬ-316Р элюируется из обращенно-фазовой колонки одним пиком. Концентрация каждого испытываемого образца определялась по площади элюируемого пика антитела тАЬ-316Р по сравнению с данными калибровочной кривой, построенной с использованием стандартов тАЬ-316Р с фиксированной нагрузкой белка.

Химическая стабильность определяется по сохранению химической структуры антитела антиРС8К9 (тАЬ-316Р) в образце. Химическая нестабильность в значительной мере может быть отнесена к образованию ковалентно модифицированных форм белка (например, ковалентных агрегатов, продуктов распада или различных заряженных форм), а также нековалентно модифицированных форм белка (например, нековалентных агрегатов). К настоящему времени единственными зарегистрированными продуктами распада тАЬ-316Р были соединения, которые отличаются либо по молекулярному весу, либо по заряду. Продукты распада с более высоким и более низким молекулярным весом можно отделить от нативного тАЬ-316Р с помощью ЭХ ВЭЖХ. Процент нативного тАЬ-316Р в эксклюзионном хроматографическом методе определяется отношением площади нативного пика к суммарной площади всех пиков антитела тАЬ-316Р.

Различные заряженные формы тАЬ-316Р отделяют от нативного тАЬ-316Р с помощью катионообменной хроматографии. Пики, которые элюируются с колонки КОХ ВЭЖХ с временами удерживания до главного пика, маркируются как кислые пики, а те, которые элюируются с колонки КОХ ВЭЖХ со временами удерживания после главного пика, маркируются как основные пики. Процент распавшегося тАЬ-316Р в катионнообменном хроматографическом методе определяется изменением относительного процента площадей главного, кислого и основного пиков по сравнению с суммарной площадью всех пиков тАЬ-316Р.

Оценка тАЬ-316Р в условиях ускоренного исследования стабильности проводилась в рамках воздействия на антитело различных факторов стресса. В таких тестах используются экстремальные условия обращения, в которых состав лекарственного препарата может оказаться в процессе производства лекарства. Состав лекарственного препарата тАЬ-316Р помещали в поликарбонатные флаконы емкостью 5 мл для встряхивания, циклов замораживания/оттаивания и моделирования условий хранения в замороженном состоянии. Для исследования стрессовой стабильности при высоких температурах составы лекарственных препаратов тАЬ-316Р помещали в стеклянные флаконы.

Пример 9. Исследования стабильности составов лекарственных препаратов (ΡΌ8) при хранении.

Состав лекарственного препарата 150 мг/мл тАЬ-316Р (ΡΌ8; 0,5 мл в 5 мл поликарбонатном флаконе; 150 мг/мл антитела тАЬ-316Р, 10 мМ гистидин (рН 6,0), 0,2% полисорбат 20 и 10% сахарозы) оказался физически и химически стабильным при хранении при <-20°С в течение 12 месяцев. По данным эксклюзионной и ионообменной хроматографии не обнаруживалось заметных потерь тАЬ-316Р и заметной химической деградации антитела. Более 97% восстановленного тАЬ-316Р было в нативной структуре, как показали результаты эксклюзионной хроматографии, и более 56% восстановленного тАЬ-316Р

- 19 028227 было в главной заряженной форме, как показали результаты катионообменной хроматографии. Результаты приводятся в табл. 9.

Состав лекарственного препарата 175 мг/мл тЛЬ-316Р (ΡΌδ; 0,75 мл в 5 мл поликарбонатном флаконе; 175 мг/мл антитела тАЬ-316Р, 10 мМ гистидин (рН 6,0), 0,01% полисорбат 20 и 5% сахарозы) оказался физически и химически стабильным при хранении при <-20°С в течение 3 месяцев. По данным эксклюзионной и ионообменной хроматографии не обнаруживалось заметных потерь тАЬ-316Р и заметной химической деградации антитела. Более 96% восстановленного тАЬ-316Р было в нативной структуре, как показали результаты эксклюзионной хроматографии, и более 56% восстановленного тАЬ-316Р было в главной заряженной форме, как показали результаты катионообменной хроматографии. Результаты приводятся в табл. 10.

Пример 10. Исследования стабильности составов лекарственных препаратов при стрессовом воздействии.

Исследования стабильности при стрессовом воздействии проводили для состава лекарственного препарата 150 мг/мл тАЬ-316Р (ΡΌδ) (0,35-0,5 мл 150 мг/мл тАЬ-316Р, 10 мМ гистидина (рН 6,0), 0,2% полисорбата 20, 10% сахарозы) и состава лекарственного препарата 175 мг/мл тАЬ-316Р (0,5-1,7 мл 175 мг/мл тАЬ-316Р, 10 мМ гистидина (рН 6,0), 0,01% полисорбата 20, 5% сахарозы, 50 мМ аргинина). Исследования при высокой температуре проводили во флаконах из боросиликатного стекла типа 1 емкостью 2 мл с бутилкаучуковой пробкой с покрытием РЬиКОТЕС® 4432/50; остальные исследования проводили в поликарбонатных флаконах емкостью 5 мл. Составы лекарственных препаратов 150 и 175 мг/мл анти-РСδΚ9 тАЬ-316Р оказались физически и химически стабильными при встряхивании в течение 2 ч. Раствор оставался визуально прозрачным, не отмечались потери белка и не образовывались соединения с другим молекулярным весом или различные заряженные формы (табл. 11 и 12). тАЬ-316Р также оказалось физически и химически стабильным после восьми циклов замораживания до -80°С и оттаивания до комнатной температуры. После восьми циклов замораживания/оттаивания раствор белка оставался на вид прозрачным, и потери белка не регистрировались. Анализ с помощью ЭХ или КОХ не выявил образования соединений с другим молекулярным весом (растворимые агрегаты или продукты распада) или различных заряженных форм, соответственно.

Несмотря на то что составы лекарственных препаратов 150 и 175 мг/мл анти-РСδΚ9 тАЬ-316Р были физически стабильными при инкубировании при 37 или 45°С в течение 28 дней, тем не менее наблюдалась определенная доля химического распада (табл. 11 и 12). Результаты испытаний в условиях стрессового воздействия показали, что основные пути распада связаны с образованием агрегатов, продуктов разложения и различных зарядовых форм. Как и ожидалось, скорость распада антитела анти-РСδΚ9 тАЬ-316Р была медленнее при 37°С, чем при 45°С. Не отмечалось заметных изменений физической или химической стабильности составов лекарственных препаратов 150 или 175 мг/мл тАЬ-316Р при инкубировании в течение 28 дней при температуре 25°С.

Пример 11. Стабильность при хранении лекарственного препарата (ИР).

В лекарственном препарате 150 мг/мл тАЬ-316Р содержится 10 мМ гистидина, рН 6,0, 0,01% полисорбата 20, 10% сахарозы и 150 мг/мл антитела анти-РСδΚ9 тАЬ-316Р. В лекарственном препарате 175 мг/мл тАЬ-316Р содержится 10 мМ гистидина, рН 6,0, 0,01% полисорбата 20, 5% сахарозы, 50 мМ аргинина и 175 мг/мл антитела анти-РСδΚ9 тАЬ-316Р. Не отмечалось никаких изменений в физической и химической стабильности лекарственного препарата 150 или 175 мг/мл тАЬ-316Р (ИР) при хранении при 5°С в течение 6 месяцев в предварительно заполненном шприце (ΓΡδ; длинный стеклянный шприц ОМР1 емкостью 1 мл с тонкостенной иглой размера 27 и резиновым защитным колпачком иглы ΡΜ27 с резиновым поршнем с покрытием РЬиКОТЕС® 4023/50) (табл. 13 и 14). Растворы сохраняли визуальную прозрачность, не наблюдались потери белка, и после воздействия перечисленных факторов стресса на отмечалось никаких изменений рН. Кроме того, не регистрировалось существенных изменений в соединениях с различным молекулярным весом или различных зарядовых формах по данным ЭХ и КОХ, соответственно.

Пример 12. Стабильность лекарственного препарата (ИР) при стрессовом воздействии.

Стабильность лекарственных препаратов 150 мг/мл тАЬ-316Р и 175 мг/мл тАЬ-316Р анализировали при инкубировании предварительно заполненных шприцов при 25°С и 45°С. Каждый из соответствующих лекарственных препаратов был физически стабильным при инкубировании в течение 28 дней при 45°С или в течение 6 месяцев при 25°С (табл. 13 и 14). Растворы сохраняли визуальную прозрачность, не наблюдались потери белка, и после воздействия перечисленных факторов стресса не отмечалось никаких изменений рН. При этом агрегаты и различные заряженные формы регистрировались при инкубировании белка при 45 и 25°С. Такие стрессовые испытания показывают, что эти пути разложения лекарственного препарата являются основными. Для лекарственного препарата 150 мг/мл доля агрегатов тАЬ-316Р после инкубирования в течение 28 дней при 45°С увеличилась на 1,9%, а доля кислых форм возросла на 19,1%. Снижение уровня химического распада отмечалось при инкубировании белка при 25°С. Отмечалось увеличение относительного количества агрегатов на 0,8%, а кислых форм - на 10,3% через 6 месяцев инкубирования при 25°С. Для лекарственного препарата 175 мг/мл доля агрегатов тАЬ- 20 028227

316Р после инкубирования в течение 28 дней при 45°С увеличилась на 1,8%, а доля кислых форм возросла на 17,0%. Снижение уровня химического распада отмечалось при инкубировании белка при 25°С. Отмечалось увеличение относительного количества агрегатов на 0,7%, а кислых форм - на 9,4% через 6 месяцев инкубирования при 25°С. Для обоих лекарственных препаратов 150 мг/мл и 175 мг/мл доля агрегатов не отмечалось значительных изменений стабильности тАЬ-316Р после инкубирования в течение 1 месяца при 25°С.

Пример 13. Объемы заполнения.

Вводимый объем предварительно заполненного шприца (РР8), содержащего 150 мг/мл лекарственного препарата ΚΕΟΝ727 составляет 1,0 мл. Вводимый объем РР§, содержащего 175 мг/мл лекарственного препарата ΚΕΟΝ727 составляет 1,14 мл. Ни в один из РР8 не включались излишки, поскольку мертвый объем шприца пренебрежимо мал (от 0,005 до 0,01 мл).

Пример 14. Стабильность тАЬ-316Р при хранении в различных материалах.

Анти-РС8К9 тАЬ-316Р оказался стабильным при стерильном фильтровании. Для исследования и для приготовления клинических препаратов использовали фильтрационную установку М1РЫРОКЕ МШЫРАК. По сравнению охранением в стеклянных флаконах стабильность составов 150 мг/мл и 175 мг/мл лекарственного препарата тАЬ-316Р менялась незначительно при хранении в полипропиленовой пробирке, полистирольной пробирке, поликарбонатной пробирке или в стеклянном флаконе с кольцом из нержавеющей стали (табл. 15 и 16). Несмотря на наблюдаемый распад при инкубировании состава лекарственного препарата при 40°С в течение 14 дней, не наблюдалось существенных различий по степени разложения тАЬ-316Р между контролем, стеклянным флаконом и воздействием пластиковых контейнеров и нержавеющей стали.

Пример 15. Анализ антитела анти-РС8К9 тАЬ-316Р.

По крайней мере две партии тАЬ-316Р (партия 1 и партия 2) анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии и лазерного светового рассеяния с кратными углами (ЭХ ЛСРКУ) - аналитического метода, который позволяет оценить молярную массу белка или гликопротеина. Партии 1 и 2 имели соответствующие молярные массы 154,5 и 154,6 кДа. В других партиях молярные массы находились в диапазоне от 154,4 до 154,8 кДа (среднее примерно 155 кДа) для главного пика, который элюировался с носителя ЭХ. На такой главный пик приходилось примерно 96,7-99,2% суммарной площади пика белка, и это соответствует интактному мономеру тАЬ-316Р (т.е. нативному в соответствии с терминологией настоящего документа).

тАЬ-316Р анализировали капиллярным изоэлектрическим фокусированием (КИЭФ), чтобы определить изоэлектрические точки главных составляющих изоформ. р1 и средняя площадь пика (% от суммарной площади пиков) для образцов тАЬ-316Р по данным КИЭФ приведены в табл. 17. В каждой партии присутствовал главный пик (пик 5) с расчетным р1 примерно 8,5, который присутствовал в концентрациях 66,4 и 68,0% в партиях 1 и 2 соответственно. Преобладающая форма (пик 5) с наибольшей вероятностью представляет собой интактное, полностью гликозилированное антитело без С-терминального лизина (т.е. главную заряженную форму в соответствии с терминологией настоящего документа).

Масс-спектрометрический (МС) анализ восстановленных триптических пептидных карт тАЬ-316Р для партии 1 и партии 2 позволил подтвердить наличие единственного сайта гликозилирования, Ави298, в домене Рс обеих партий. Основные ковалентно связанные гликановые формы этого сайта гликозилирования приводятся в табл. 18. В целом, было установлено, что обе партии содержат сложные 2-антенарные гликаны, большинство которых фукозилированы при Ави298. При этом относительное количество фукозилированного агалактозила (О0), содержащего сахарные цепочки, в партии 2 было несколько больше по сравнению с количеством такой гликоформы в партии 1. Напротив, относительные количества фукозилированного дигалактозила (О2) и фукозилированного моногалактозила (О1), содержащие сахарные цепочки в партии 2 меньше по сравнению с относительными количествами таких сахарных цепочечных структур в партии 1. Анализ результатов ЖХ/МС двух образцов лекарственных препаратов (пик 16) также позволил выявить 2,9 и 8,4% пептида тяжелой цепи без сайта гликана при Ави298 в партии 1 и партии 2 соответственно.

Анализировались профили гликана, полученные с помощью ВЭЖХ после высвобождения олигосахаридов из каждой из двух партий тАЬ-316Р. В каждой хроматограмме производные олигосахаридов подразделялись на две главные группы: нефукозилированные 2-антенарные формы и фукозилированные 2-антенарные формы. В каждой группе (фукозилированные и нефукозилированные) олигосахариды дополнительно разбивали на дигалактозильные (О2), моногалактозильные (О1) и агалактозильные (О0) формы. Структурные отнесения в олигосахаридах были получены с помощью времяпролетной массспектрометрии с матричной лазерной десорбцией/ионизацией. Интегрирование каждого пика в двух хроматограммах показало, что уровень фукозилирования в двух партиях тАЬ-316Р был в целом достаточно высоким, при этом в партиях 1 и 2 отмечалось 80,0 и 86,9% фукозилирования.

Несмотря на близкий совокупный процент фукозилирования двух партий, отмечались количественные различия в относительном содержании каждой из гликановых форм, присутствующих в двух партиях (табл. 19). В партии 1 для фукозилированных гликановых структур О0, О1 и О2 регистрировали процент площадей пиков 34,4, 39,6 и 11,7% соответственно. Напротив, процент площадей пиков в партии 2

- 21 028227 составлял 45,8, 33,3 и 7,1% для фукозилированных гликоформных структур ОС, 04 и 02 соответственно, указывая на различия в степени галактозилирования между двумя партиями. Пик гликана с высоким содержанием маннозы (гликан тап5) (пик 2) регистрировался с относительным содержанием 1,8-2,9% по сравнению с общим количеством сахарной цепочки, регистрируемой в обеих партиях (табл. 19). Всего девять неидентифицированных пиков с процентным соотношением площадей пиков от 0,5 до 1,5% также регистрировалось в обеих партиях, проанализированных таким методом, и они составляют <3% суммарной площади гликановых пиков, выявленных в каждой партии. Анализ эквимолярной смеси двух партий не выявил новых пиков, и процентная доля площадей для всех пиков в смеси хорошо коррелировала с ожидаемыми значениями по результатам раздельного анализа каждой партии (табл. 19).

Таблица 1

Влияние буфера и рН на стабильность тЛЬ-316Р при 45°С в течение 28 дней

рН/буфер	Мутность1	Всего (мг/мл)	% нативног о	% агр.	% главная	% кислая	% основная
без инкубации2	0,00	1,8	98,1	0,3	57,0	33,0	10,0
рН 8,0, Тпз	0,00	1,7	88,9	0,8	15,2	82,4	2,4
рН 8,0, фосфат	0,01	2,0	89,4	1,3	н.д.	н.Д.	н.Д.
рН 7,5, фосфат	0,01	1,9	91,7	0,9	н.д.	н.Д.	н.Д.
рН 7,0, фосфат	0,01	2,1	92,4	0,7	16,7	78,8	4,5
рН 6,5, фосфат	0,00	2,0	93,2	0,6	25,0	68,3	6,6
рН 6,0, фосфат	0,00	1,8	93,9	0,3	29,8	62,3	8,0
рН 6,0, гистидин	0,00	1,9	94,5	0,0	36,9	54,0	9,1
рН 6,0, сукцинат	0,00	1,9	93,1	0,4	31,9	59,8	8,3
рН 6,0, цитрат	0,00	1,9	95,1	0,4	32,1	58,1	9,9
рН 5,5, цитрат	0,00	2,1	94,6	0,4	28,0	62,0	9,9
рН 5,5, ацетат	0,00	2,0	92,4	0,2	34,5	56,9	8,5
рН 5,0, ацетат	0,00	1,8	93,0	0,2	31,1	57,5	11,4

¹Мутность = изменение ОЭ на 405 нм по сравнению с исходным веществом. ²Средние значения неинкубированных образцов для всех 12 составов.

Таблица 2

Влияние рН на 10 мг/мл тЛЬ-316Р, 10 мМ гистидин при 45°С в течение 28 дней

рН/буфер	Мутность1	Всего (мг/мл)	% нативного	% агр.	% главная	% кислая	% основная
без инкубации 2	0,00	9,5	98,1	0,2	57,8	31,1	11,1
рН 5,5	0,01	9,5	94,3	0,5	34,7	52,2	13,1
рН 6,0	0,01	9,7	94,7	0,9	37,5	51,8	10,6
рН 6,5	0,01	10,1	93,4	1,8	35,7	55,2	9,1

¹Мутность = изменение ОЭ на 405 нм по сравнению с исходным веществом. ²Средние значения неинкубированных образцов для всех 3 составов.

- 22 028227

Влияние вспомогательных растворителей на 25 мг/мл тАЬ-316Р при встряхивании в течение 120 мин

Таблица 3

Органический вспомогательн ый растворитель	Мутность1	Всего (мг/мл)	% нативног 0	% агр.	% главная	% кислая	% основная
Без встряхивания2	0,00	25,6	97,3	0,5	50,6	39,2	10,3
Без вспомогательн ого растворителя	0,10	25,6	97,3	0,5	51,1	39,0	9,9
0,2% полисорбата 20	0,01	24,7	97,2	0,5	51,1	38,9	10,1
0,2% полисорбата 80	0,01	24,7	97,3	0,5	50,9	38,9	10,2
0,2% ΡΙικοηίο Р68	0,01	25,2	96,9	0,5	50,5	39,2	10,3
ΟΟΔ ϋΕΓϊ ООСП ν /и ι ι_χ-ί исюи	0,01	25,3	97,1	0,5	50,7	39,0	10,2
1,5% РЕС 3350	0,01	24,9	97,1	0,5	50,8	39,1	10,1
20% РЕС 300	0,00	26,7	97,0	0,6	48,8	40,5	10,7
10% РЕС 300	0,01	25,7	97,2	0,5	49,9	39,8	10,3
20% пропиленглико ля	0,01	25,8	96,9	0,5	51,1	38,6	10,3

¹Мутность = изменение 0Э на 405 нм по сравнению с исходным веществом. ²Средние значения образцов без встряхивания для всех 9 составов.

Влияние вспомогательных растворителей на 25 мг/мл тАЬ-316Р, инкубированного при 45°С в течение 28 дней

Таблица 4

Органический вспомогатель ный растворитель	Мутное ть1	РН	Всего (мг/мл)	% нативно го	% агр.	% главная	% кислая	% основна я
без инкубации2	0,00	6,1	25,6	97,3	0,5	50,6	39,2	10,3
Без вспомогатель ного растворителя	0,02	6,2	24,9	94,5	0,7	34,8	54,7	10,5
0,2% полисорбата 20	0,03	6,2	24,3	94,6	0,5	35,2	54,3	10,5
0,2% полисорбата 80	0,02	6,2	24,3	94,8	0,6	35,1	54,5	10,4
0,2% ΡΙιίΓοηϊο Р68	0,03	6,1	24,6	94,7	0,6	33,8	55,6	10,6
3% РЕС 3350	0,03	6,2	24,8	95,0	0,7	35,9	53,5	10,6
Ί СО/. 1,и/О I- 1_ЧР 3350	0,02	6,2	24,4	94,8	0,6	36,0	53,5	10,5
20% РЕС 300	0,12	4,8	25,4	88,8	4,2	н.д.	н.Д.	н.Д.
10% РЕС 300	0,09	5,4	25,0	93,7	0,9	24,1	67,0	8,9
20% пропиленглик оля	0,03	6,1	24,6	89,9	5,6	34,6	54,2	11,2

¹Мутность = изменение 0Э на 405 нм по сравнению с исходным веществом. ²Средние значения образцов без встряхивания для всех 9 составов.

- 23 028227

Влияние стабилизатора на 20 мг/мл тАЬ-316Р, 10 мМ гистидин при 45°С в течение 28 дней

Таблица 5

Вспомогател ьное вещество	Визуа льно	Мутное ть1	РН	Всего (мг/мл)	% нативн ого	% агр.	% главна я	% кисла я	% основ ная
без инкубации2	Годен	0,00	6,0	20,2	97,7	0,5	51,1	39,3	9,6
Без стабилизатор а	Годен	0,02	6,1	19,8	93,6	2,0	33,5	56,5	10,1
150мМЫаС1	Не год ен	0,03	6,0	20,0	91,0	4,6	35,3	51,0	13,6
20% сахарозы	Г одбн	η пи	о п и,и	пп о и	ПИИ 574-,4-	и п 1	оп и о ι	С“7 П и / ,и	и η п 1 и,57
20% сорбитола	Годен	0,16	5,8	21,8	94,3	1,0	23,5	67,4	9,1
10% маннитола	Годен	0,02	6,0	21,2	94,8	0,9	34,4	54,5	11,1
20% трегалозы	Годен	0,05	6,0	22,7	94,7	0,5	33,2	56,6	10,2
5% глицерина	Годен	0,10	5,9	20,8	90,2	5,4	н.Д.	н.Д.	н.Д.
3% аргинина	Годен	0,02	6,1	21,1	92,9	3,0	37,5	49,2	13,3
3% глицина	Годен	0,03	6,1	19,8	93,7	1,7	31,0	58,0	10,9

¹Мутность = изменение 0Э на 405 нм по сравнению с исходным веществом. ²Средние значения неинкубированных образцов для всех 9 составов.

Влияние лиопротекторов на лиофилизованный тАЬ-316Р, инкубированный при 50°С в течение 28 дней

Таблица 6

Вспомогательное вещество	Визуа льно	Мутное ть1	РН	Всего (мг/мл)	% натив ного	% агр.	% главн ая	% кисла я	% основ ная
без инкубации	Годен	0,00	6,0	100	97,1	1,2	51,0	38,3	10,7
Без лиопротектора	Не год ен	0,09	6,1	100	70,0	28,5	24,2	35,1	40,7
2% сахарозы	Годен	0,02	6,1	104	90,7	7,4	37,4	39,1	23,6
6% сахарозы	Годен	0,00	6,1	105	96,1	1,8	46,8	39,2	14,1
2% сахар., 2% С1у	Годен	0,02	6,0	114	94,5	3,4	40,9	42,4	16,8
2% сахар., 2% Агд	Годен	0,00	5,9	109	95,9	2,0	47,2	38,4	14,4

¹Мутность = изменение 0Э на 405 нм по сравнению с исходным веществом.

²Лиофилизованный лекарственный препарат, разведенный до 100 мг/мл КЕС^27 до анализа. ³Средние значения для исходного материала 4 составов.

Стабильность лиофилизованного лекарственного препарата, разведенного до 100 мг/мл

Таблица 7

Температура хранения	Без хранения	5°С 4 мес.	25°С 3 мес.	40°С 3 мес.	50°С 2 мес.
Мутность1	0,00	0,01	0,01	0,02	0,02
РН	6,2	6,3	6,2	6,2	6,2
% суммарного выделения	100	104	100	98	105
% нативного	96,0	96,5	96,2	95,7	94,9
% агрегата	1,7	1,4	1,7	2,4	2,9
% главная	50,6	51,5	49,2	46,2	43,5
% кислая	38,0	37,9	38,2	39,5	40,1
% основная	11,4	10,5	12,7	14,3	16,2
Биопроба (% этал. станд.)2	146	НП	НП	НП	152

¹Мутность = изменение 0Э на 405 нм по сравнению с исходным веществом. ²Критерии приемлемости: 50-200% от эталонного стандарта.

- 24 028227

Совместимость 50 мг/мл тАЬ-316Р после 14 дней при 40°С и влажности 75%

Таблица 8

Хранение	Без хранения	Стекло	Поли- пропилен	Поли- стирол	Поли- карбонат	Нержаве ющая сталь
Мутность1	0,00	0,00	0,01	0,00	0,01	0,01
% суммы	100	98	99	104	103	98
% нативного	97,0	96,3	96,3	96,2	96,2	96,1
% агрегата	2,0	1,9	1,9	2,0	2,0	2,0
% главная	50,8	45,7	44,9	45,2	45,6	45,5
% кислая	38,1	42,8	43,6	43,0	42,5	43,2
% основная	11,2	11,5	11,6	11,9	11,8	11,2

Мутность = изменение 0Э на 405 нм по сравнению с исходным веществом.

Стабильность 150 мг/мл анти-РС8К9 тАЬ-316Р в течение 12 месяцев при -80°С

Таблица 9

Температура хранения	Контрол ь	-80°С	-30°С	-20°С
Мутность (Οϋ 405 нм)	0,00	0,00	0,01	0,01
% общего выделения тАЬ-316Р	100	104	108	111
% выделения нативного	97,5	97,3	97,2	97,2
% выделения агрегатов	1,7	1,8	1,8	1,9
% выделения главной	56,2	56,5	56,4	56,3
% выделения кислой	26,5	25,7	25,7	25,4
% выделения основной	17,4	17,9	17,9	18,2

Таблица 10

Стабильность 175 мг/мл анти-РС8К9 тАЬ-316Р в течение 3 месяцев при -80°С

Температура хранения	Контрол ь	-80°С	-30°С	-20°С
Мутность (СЮ 405 нм)1	0,00	0,01	0,01	0,01
% общего выделения ΠΕΟΝ727 (ОФ ВЭЖХ)	100	100	104	101
% выделения нативного ΚΕΟΝ727 (ЭХ ВЭЖХ)	96,2	96,5	96,4	96,3
% выделения агрегированного ΒΕΟΝ727 (ЭХ ВЭЖХ)	2,7	2,5	2,6	2,7
% выделения главной ΚΕΟΝ727 (КОХ ВЭЖХ)	58,5	56,2	56,6	56,7
% выделения кислой ΚΕΟΝ727 (КОХ ВЭЖХ)	29,4	29,4	29,4	29,4
% выделения основной ΡΕΟΝ727 (КОХ ВЭЖХ)	12,2	14,5	14,0	13,9

¹Мутность= изменение 0Э на 405 нм по сравнению с исходным веществом.

- 25 028227

Таблица 11

Стабильность 150 мг/мл тАЬ-316Р ΡΌ8¹ при стрессовом воздействии » Без _о 45°С 37°С 25°С Замор.

^г стресса^{2 г} инкубирование инкубирование инкубирование/оттаив.

Время	0	60	120	14 дн	28 дн	14 дн	28 дн	14 дн	28 дн	8
воздействия	мин	мин	мин	циклов
Внешний
Годен	Годен	Годен	Годен	Годен	Годен	Годен	Годен	Годен	Годен
вид Мутность3	0,00	0,00	0,00	0,02	0,03	0,00	0,01	0,00	0,00	0,00
РН	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0
% суммарного выделения %	100	101	102	98	98	99	98	100	99	101
выделения нативного	97,4	97,5	97,2	94,2	92,4	95,7	95,1	96,7	96,2	97,1
% выделения агрегатов %	1,6	1,7	2,1	3,4	4,1	2,4	2,6	2,0	2,2	1,7
выделения главной	53,6	53,7	54,7	38,7	29,0	46,3	39,5	51,5	49,1	53,9
% выделения кислой %	27,2	26,1	25,9	39,5	48,6	31,9	36,9	27,8	28,9	26,5
выделения основной	19,3	20,2	19,5	21,8	22,5	21,8	23,7	20,7	22,0	19,6
Биопроба (% отн. акт.)4	84	НП	84	НП	85	НП	82	НП	98	81

¹10 мМ гистидин, рН 6,0, 0,2% полисорбат 20, 10% сахарозы, 150 мг/мл анти-РС8К9 тАЬ316Р.

²Значения без стресса представляют собой среднее обоих исследований стабильности.

³Мутность определяется как относительное изменение 0Э на 405 нм по сравнению с исходным веществом.

⁴Процент относительной активности; критерии приемлемости: 50-200% от эталонного стандарта.

- 26 028227

Таблица 12

Стабильность 175 мг/мл тАЪ-316Р ΡΏ3¹ при стрессовом воздействии

Стресс-тест Время воздействия	Без стресса2 0 мин	Встряхивание	45°С инкубирование	37°С инкубирование	25°С инкубирование	Замор./ оттаив. 8 циклов
60 мин	120 мин	14 дн	28 дн	14 дн	28 дн	14 дн	31 дн
Внешний вид	Годен	Годен	Годен	Годен	Годен	Годен	Годен	нд	Годен	Годен
Мутность3	0,00	0,00	0,01	0,01	0,03	0,00	0,01	н.Д.	0,00	0,01
РН	6,0	6,0	6,0	6,1	6,1	6,0	6,0	н.Д.	6,0	6,0
% суммарного выделения	100	96	98	101	98	100	96	н.Д.	99	98
% выделения нативного %	96,5	96,3	96,4	94,5	91,7	95,7	94,7	Н.Д.	96,2	96,1
выделения агрегатов %	2,5	2,5	2,5	3,6	5,2	2,8	3,0	Н.Д.	2,6	2,3
выделения главной %	59,5	58,3	59,0	47,1	38,4	56,3	46,9	Н.Д.	58,2	59,3
выделения кислой %	30,1	29,3	29,4	39,5	47,6	32,3	39,8	Н.Д.	30,9	29,5
выделения основной	10,3	12,4	11,6	13,4	14,1	11,4	13,4	Н.Д.	11,0	11,1
Биопроба (% отн. акт.)4	0,00	0,00	0,01	0,01	0,03	0,00	0,01	Н.Д.	0,00	0,01

^х10 мМ гистидин, рН 6,0, 0,01% полисорбат 20, 5% сахарозы, 50 мМ аргинина, 175 мг/мл антиРСЗК9 тАЪ-316Р.

²Значения без стресса представляют собой среднее обоих исследований стабильности. ³Мутность = изменение 0Ώ на 405 нм по сравнению с исходным веществом.

⁴Процент относительной активности; критерии приемлемости: 50-200% от эталонного стандарта.

- 27 028227

Таблица 13

Стабильность 150 мг/мл тАЪ-316Р 1)Р в РР8

Хранение	0	5°С 6 мес.	25°С 6 мес.	45°С 28 дней
Внешний вид	Годен	Годен	Годен	Годен
Мутность1	0,00	0,00	0,00	0,02
рн	6,1	6,1	6,1	6,1
% суммарного выделения	100	102	102	97
% выделения нативного	96,6	96,1	94,2	92,4
% выделения агрегатов	2,4	2,6	3,2	4,3
% выделения главной	58,4	58,5	45,7	35,8
% выделения кислой	31,8	31,3	42,1	50,9
% выделения основной	9,8	10,2	12,2	13,4

¹Мутность = изменение ОЭ на 405 нм по сравнению с исходным веществом.

Таблица 14

Стабильность 175 мг/мл тАЪ-316Р 1)Р в РР8

Хранение	0	5°С 6 мес.	25°С 6 мес.	45°С 28 дней
Внешний вид	Годен	Годен	Годен	Годен
Мутность1	0,00	0,00	0,02	0,04
рн	6,1	6,1	6,1	6,1
% суммарного выделения	100	103	101	100
% выделения нативного	96,7	96,3	94,6	91,6
% выделения агрегатов	2,3	2,4	3,0	5,4
% выделения главной	59,1	59,7	47,1	37,7
% выделения кислой	31,2	30,6	40,6	48,2
% выделения основной	9,7	9,7	12,3	14,2

¹Мутность = изменение ОЭ на 405 нм по сравнению с исходным веществом.

Таблица 15

Совместимость 150 мг/мл тАЪ-316Р^х после 14 дней при 40°С

Хранение

Без хранения Стекло Стекло

Поли- Поли- Поликарбонат пропилен стирол

Нержаве ющая сталь

Мутность 2	0,00	0,00	0,00	0,01	0,01	0,01
' рн	6,0	6,1	6,0	6,0	6,0	6,0
% суммарного	100	97	104	99	105	104
выделения
7о выделения	97,4	95,9	95,8	95,7	95,7	95,5
нативного
% суммарного	1,7	2,5	2,6	2,7	2,6	2,7
выделения
% Мат Кесоуегес!	53,3	45,8	45,8	44,7	45,6	45,1
% Ас1сЛс Кесоуегес!	26,9	33,0	32,9	33,8	33,0	33,5
% Вазю Кесоуегес!	19,8	21,3	21,6	21,6	21,5	21,4

¹10 мМ гистидин, рН 6,0, 0,2% полисорбат 20, 10% сахароза, 150 мг/мл анти- тАЪ. ²Мутность = изменение ОЭ на 405 нм по сравнению с исходным веществом.

- 28 028227

Таблица 16

Совместимость 175 мг/мл тАЬ-316?1 после 14 дней при 40°С
Хранение	Без хранения Стекло	Стекло	Поли- карбонат	Поли- пропилен	Поли- стирол	Нержаве ющая сталь
Мутность2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,01
РН	6,1	6,1	6,1	6,0	6,1	6,1
% суммарного выделения	100	98	104	100	105	98
% выделения нативного	96,6	95,3	95,2	95,1	95,2	94,9
% выделения агрегатов	2,4	3,0	3,1	3,2	3,1	3,3
% выделения главной	57,7	51,3	51,0	50,6	51,0	50,4
% выделения кислой	30,0	34,5	34,5	35,0	34,5	35,2
% выделения основной	12,3	14,2	14,5	14,4	14,4	14,4

¹10 мМ гистидин, рН 6,0, 0,01% полисорбат 20, 5% сахарозы, 50 мМ аргинина и 175 мг/мл тАЬ. ²Мутность = изменение ОЭ на 405 нм по сравнению с исходным веществом.

Таблица 17

Гетерогенность заряда тАЬ-316Р по данным КИЭФ

	Партия 1	Партия 2	Партия 1:Партия 2 (смесь 1:1)
№ пика	р!	Площадь пика, %	р!	Площадь пика, %	р!	Площадь пика, %
1	7,99 (0,01)	0,8 (0,1)	7,99 (0,01)	0,8 (0,0)	7,98 (0,01)	0,7 (0,1)
2	8,15 (0,00)	2,6 (0,1)	8,15 (0,01)	2,6 (0,1)	8,14 (0,01)	2,6 (0,1)
3	8,29 (0,00)	6,9 (0,1)	8,29 (0,00)	7,0 (0,0)	8,28 (0,01)	6,9 (0,1)
4	8,42 (0,00)	18,4 (0,2)	8,42 (0,00)	18,6 (0,2)	8,42 (0,01)	18,5 (0,1)
5	8,54 (0,01)	66,4 (0,3)	8,55 (0,01)	68,0 (0,3)	8,54 (0,00)	67,3 (0,1)
6	8,65 (0,00)	4,0 (0,1)	8,65 (0,00)	2,8 (0,1)	8,64 (0,01)	3,4 (0,0)
7	8,82 (0,00)	0,9 (0,1)	8,81 (0,00)	0,3 (0,1)	8,81 (0,01)	0,6 (0,1)

- 29 028227

Гликозилированные пептиды тАЬ-316Р

Таблица 18

№ пика	Тяжелая цепь Фрагмен т	Полученная масса (Да)	Комментарии
Партия 1	Партия 2
15а	294-302	2957,15	2957,19	(Рис)1(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)2(Са1)2
294-302	2795,11	2795,11	(Рис)1(С1сЫАс)2(Мап)3(С1сЫАс)2(Са1)1
294-302	2404,94	2404,94	(С1сЫАс)2(Мап)5
294-302	2592,02	2591,96	(Рис)1(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)1(Са1)1
294-302	2267,94	2267,92	(Рис)1(С1сЫАс)2(Мап)2(С1сЫАс)1
294-302	2121,82	2121,80	(С1сЫАс)2(Мап)2(С1сЫАс)1
15Ь	. 294-302	2283,91	2283,91	(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)1
294-302	2429,98	2429,98	(Рис)1(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)1
294-302	2486,99	2486,97	(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)2
294-302	2633,05	2633,06	(Рис)1(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)2
16	294-302	1188,52	1188,53	поп-д1усову1а1ес1 Ν8Τ зНе
17а	290-302	3439,44	3439,44	(Рис)1(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)2(Са1)2
290-302	3278,40	3277,35	(Рис)1(С1сЦАс)2(Мап)з(С1сЦАс)2(Са1)1
290-302	2887,20	2887,26	(С1сЫАс)2(Мап)5
17Ь	290-302	2766,24	2766,21	(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)1
290-302	2969,34	2969,25	(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)2
290-302	2912,28	2912,25	(Рис)1(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)1
290-302	3115,32	3115,35	(Рис)1(С1сЫАс)2(Мап)з(С1сЫАс)2

- 30 028227

Таблица 19

Интегрированные площади пиков гликанов, по данным капиллярного электрофореза

	Площадь пика партии а %	Площадь пика партии 2, %	Площадь пика смесь партий 1:1, %	Идентификация гликана1	Структура гликана2
1	8,6 (0,2)	6,8 (0,1)	7,6 (0,2)	СО-Рис	-О.
2	1,8 (0,0)	2,9 (0,1)	2,3 (0,1)	Мап5
3	0,7 (0,0)	0,5 (0,0)	0,6 (0,0)	Обнаружен небольшой пик
4	Ниже ПО	Ниже ПО	Ниже ПО	Обнаружен небольшой пик
5	Ниже ПО	Ниже ПО	Ниже ПО	Обнаружен небольшой пик
6	34,4 (0,1)	45,8 (0,2)	40,4 (0,2)	СО	%-4
7	1,5 (0,0)	0,7 (0,0)	1,1 (0,0)	Обнаружен небольшой пик
8	Ниже ПО	0,9 (0,0)	0,6 (0,0)	Обнаружен небольшой пик
9	Ниже ПО	0,7 (0,0)	0,6 (0,0)	Обнаружен небольшой пик
10	29,5 (0,1)	24,7 (0,0)	27,0 (0,1)	С 1(1-6)
11	10,1 (0,1)	8,6 (0,0)	9,3 (0,1)	С1(1-3) и/или ό^,-ι ис	,.1/Н в -
12	Ниже ПО	Ниже ПО	Ниже ПО	Обнаружен небольшой пик
13	Ниже ПО	Ниже ПО	Ниже ПО	Обнаружен небольшой пик
14	11,7 (0,0)	7,1 (0,1)	9,4 (0,2)	С2	^>4

'С#-1ис и О# обозначают нефукозилированные и фукозилированные гликаны соответственно. Символ # означает 0, 1 или 2.

²Обозначение гликана: ▼ - фукоза, - Ν-ацетилглюкозамин, · - манноза, ♦ - галактоза.

ПО = Предел определения.

- 31 028227

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Кедепегоп РЬагтасеиб1са1з, 1пс.

<120> Стабилизированные составы, содержащие антитела анти-РСБК9 <130> 7050А <160> 9 <170> Рабепб1п версия 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 1

О1и 1

Уа1

О1п

Ьеи

Уа1

О1и

Бег 5

О1у

О1у

О1у

Ьеи

Уа1

О1п 1С

Рго 1

О1у

О1у

15

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз 20

А1а

А1а

Бег

О1у

РЬе

ТЬг

РЬе 25

Азп

Азп

Туг

А1а

Меб

Азп 35

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у 40

Ьуз

О1у

Ьеи

Азр

Тгр

Уа1 45

Бег

ТЬг 50

11е )

Бег

О1у

Бег

О1у

О1у 55

ТЬг

ТЬг

Азп

Туг

А1а

Азр 60

Бег 1

Уа1

Ьуз 65

О1у

Агд

РЬе

11е

11е

Бег 70

Агд

Азр

Бег

Бег

Ьуз

НЧз 75

ТЬг

Ьеи

Туг

80

Ьеи

О1п

Меб

Азп

Бег

Ьеи

Агд 85

А1а

О1и

Азр

ТЬг

А1а 90

Уа1

Туг

Туг

Суз

95

А1а

Ьуз

Азр

Бег

Азп

Тгр 100

О1у

Азп

РЬе

Азр

Ьеи

Тгр 105

О1у

Агд

О1у

ТЬг

110

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

115 <210> 2 <211> 8 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая

- 32 028227 <400> 2

О1у РЪе ТЪг РЪе Азп Азп Туг А1а 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 3

11е Зег О1у Зег О1у О1у ТЪг ТЪг 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 4

А1а Ьуз Азр Зег Азп Тгр О1у Азп РЪе Азр Ьеи 1 5 10 <210> 5 <211> 113 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 5

Азр 1

11е

Уа1

МеЪ

ТЪг

О1п 5

Зег

Рго

Азр

Зег

Ьеи

А1а

Уа1 10

Зег

Ьеи

О1у

15

О1и

Агд

А1а

ТЪг

11е

Азп 20

Суз

Ьуз

Зег

Зег

О1п

Зег 25

Уа1

Ьеи

Туг

Агд

Зег

Азп

Азп 35

Агд

Азп

РЪе

Ьеи

О1у

Тгр

Туг 40

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п 45

Рго

Рго

Азп

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Тгр

А1а

Зег

ТЪг

Агд

О1и

Зег

О1у

Уа1

- 33 028227

55 60

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

О1у

Зег

О1у

Зег

О1у

ТЬг

Азр

РЬе ТЬг

Ьеи

ТЬг

65

70

75

80

11е

Зег

Зег

Ьеи

О1п

А1а

О1и

Азр

Уа1

А1а

Уа1

Туг

Туг Суз

О1п

О1п

85

90

95

Туг

Туг

ТЬг

ТЬг

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьуз Ьеи

О1и

11е

100

105

110

Ьуз <210> 6 <211> 12 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 6

О1п Зег Уа1 Ьеи Туг Агд Зег Азп Азп Агд Азп РЬе

5 10 <210> 7 <211> 3 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 7

Тгр А1а Зег <210> 8 <211> 9 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 8

О1п О1п Туг Туг ТЬг

ТЬг Рго Туг ТЬг 5

- 34 028227 <210> 9 <211> 692 <212> РКТ <213> Ното заргепз

<400> 9
МеЁ О1у ТЬг Уа1 Зег Зег Агд Агд Зег Тгр Тгр Рго Ьеи Рго Ьеи Рго
15 10 15
Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи О1у Рго А1а О1у А1а Агд А1а О1п О1и
20 25 30
Азр О1и Азр О1у Азр Туг О1и О1и Ьеи Уа1 Ьеи А1а Ьеи Агд Зег О1и
35 40 45
О1и Азр О1у Ьеи А1а Азр А1а Рго О1и Н1з О1у А1а ТЬг А1а ТЬг РЬе
50 55 60
Н1з Агд Суз А1а Ьуз Азр Рго Тгр Агд Ьеи Рго О1у ТЬг Туг Уа1 Уа1
65 70 75 80
Уа1 Ьеи Ьуз О1и О1и ТЬг Н1з Агд Зег О1п Зег О1и Агд ТЬг А1а Агд
85 90 95
Агд Ьеи О1п А1а О1п А1а А1а Агд Агд О1у Туг Ьеи ТЬг Ьуз 11е Ьеи
100 105 110
Н1з Уа1 РЬе Н1з Н1з Ьеи Ьеи Рго О1у РЬе Ьеи Уа1 Ьуз МеЁ Зег О1у
115 120 125
Азр Ьеи Ьеи О1и Ьеи А1а Ьеи Ьуз Ьеи Рго Н1з Уа1 Азр Туг 11е О1и
130 135 140
О1и Азр Зег Зег Уа1 РЬе А1а О1п Зег 11е Рго Тгр Азп Ьеи О1и Агд
145 150 155 160
11е ТЬг Рго А1а Агд Туг Агд А1а Азр О1и Туг О1п Рго Рго Ьуз О1у
165 170 175
О1у Зег Ьеи Уа1 О1и Уа1 Туг Ьеи Ьеи Азр ТЬг Зег 11е О1п Зег Азр
180 185 190
Н1з Агд О1и 11е О1и О1у Агд Уа1 МеЁ Уа1 ТЬг Азр РЬе О1и Зег Уа1
195 200 205
Рго О1и О1и Азр О1у ТЬг Агд РЬе Н1з Агд О1п А1а Зег Ьуз Суз Азр
210 215 220
Зег Н1з О1у ТЬг Н1з Ьеи А1а О1у Уа1 Уа1 Зег О1у Агд Азр А1а О1у
225 230 235 240
Уа1 А1а Ьуз О1у А1а О1у Ьеи Агд Зег Ьеи Агд Уа1 Ьеи Азп Суз О1п
245 250 255
О1у Ьуз О1у ТЬг Уа1 Зег О1у ТЬг Ьеи 11е О1у Ьеи О1и РЬе 11е Агд
260 265 270
Ьуз Зег О1п Ьеи Уа1 О1п Рго Уа1 О1у Рго Ьеи Уа1 Уа1 Ьеи Ьеи Рго
275 280 285

- 35 028227

Ьеи А1а О1у О1у	Туг	Зег Агд Уа1	РЬе Азп А1а А1а 295	Суз	О1п	Агд	Ьеи 300
	290
А1а	Агд А1а О1у	Уа1	Уа1 Ьеи Уа1	ТЬг А1а А1а О1у	Азп	РЬе	Агд	Азр
305			310			315		320
Азр	А1а Суз Ьеи	Туг	Зег Рго А1а	Зег А1а Рго О1и	Уа1	11е	ТЬг	Уа1
			325		330		335
О1у	А1а ТЬг Азп	А1а	О1п Азр О1п	Рго Уа1 ТЬг Ьеи	О1у	ТЬг	Ьеи	О1у
		340	345			350
ТЬг	Азп РЬе О1у	Агд	Суз Уа1 Азр	Ьеи РЬе А1а Рго	О1у	О1и	Азр	11е
	355			360			365
11е	О1у А1а Зег	Зег	Азр Суз Зег	ТЬг Суз РЬе Уа1	Зег	Агд	Зег	О1у
	370			375			380
ТЬг	Зег О1п А1а	А1а	А1а Н1з Уа1	А1а О1у 11е А1а	А1а	МеЬ	МеЬ	Ьеи
385			390		395		400
Зег	А1а О1и Рго	О1и	Ьеи ТЬг Ьеи	А1а О1и Ьеи Агд	С1п	Агд	Ьеи	11е
		405	410				415
Ηΐ3	РЬе Зег А1а	Ьуз	Азр Уа1 11е	Азп О1и А1а Тгр	РЬе	Рго	О1и	Азр
	420		425				430
О1п	Агд Уа1 Ьеи	ТЬг	Рго Азп Ьеи	Уа1 А1а А1а Ьеи	Рго	Рго	Зег	ТЬг
	435			440				445
Ηΐ3	Агд А1а О1у	Тгр	О1п Ьеи РЬе	Суз Агд ТЬг Уа1	Тгр	Зег	А1а	Н1з
	450		455			460
Зег	О1у Рго ТЬг	Агд	МеЬ А1а ТЬг	А1а Уа1 А1а Агд	Суз	А1а	С1п	Азр
465			470	475			480
О1и	О1и Ьеи Ьеи	Зег	Суз Зег Зег	РЬе Зег Агд Зег	О1у	Ьуз	Агд	Агд
		485	490				495
О1у	О1и Агд 11е	О1и	А1а О1п О1у	О1у Ьуз Агд Уа1	Суз	Агд	А1а	Н1з
	500		505				510
Азп	А1а РЬе О1у	С1у	О1и О1у Уа1	Туг А1а 11е А1а	Агд	Суз	Суз	Ьеи
	515			520				525
Ьеи	Рго О1п Уа1	Азп	Суз Зег Уа1	Н1з ТЬг А1а Рго	Рго	А1а	О1у	А1а
	530			535			540
Зег	МеЬ О1у ТЬг	Агд	Уа1 Н1з Суз	Н1з О1п О1п О1у	Н1з	Уа1	Ьеи	ТЬг
545			550			555		560
О1у	Суз Зег Зег	Н1з	Тгр О1и Уа1	О1и Азр Ьеи О1у	ТЬг	Н1з	Ьуз	Рго
			565	570			575
Рго	Уа1 Ьеи Агд	Рго	Агд О1у О1п	Рго Азп О1п Суз	Уа1	О1у	Н1з	Агд
		580	585			590
О1и	А1а Зег 11е	Н1з	А1а Зег Суз	Суз Н1з А1а Рго	О1у	Ьеи	О1и	Суз
	595			600				605
Ьуз	Уа1 Ьуз О1и	Н1з	О1у 11е Рго	А1а Рго С1п О1и	О1п	Уа1	11е	Уа1
	610			615				620

- 36 028227

А1а 625	Суз	О1и	Азр	О1у	Тгр	ТЬг ^еи 630	ТЬг
ТЬг	Зег	Ηΐ3	Уа1	^еи 645	О1у 1	А1а	Туг	А1а
Агд	Зег	Агд	Азр 660	Уа1	Зег	ТЬг	ТЬг	О1у
А1а	А1а	Уа1	А1а 675	11е	Суз	Суз	Агд	Зег 680
О1п О1и 690	^еи	О1п

О1у	Суз	Зег	Рго	^еи 635	Рго	С1у	640
Уа1	Азр 650	Азп	ТЬг	Суз	Уа1	Уа1	655
Зег	ТЬг Зег 665	^уз	О1и	А1а	Уа1	670
Агд	Нгз	^еи	Уа1	С1п	А1а	Зег

685

Claims (12)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Жидкий фармацевтический состав, включающий:

   (a) от 50±7,5 до 250±37,5 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связывают человеческую пропротеиновую конвертазу субтилизин/кексин типа 9 (РСЗК9), где антитело содержит определяющую комплементарность область тяжелой цепи (НСГОК1) с ЗЕО ГО N0: 2, НСГОК2 с ЗЕО ГО N0: 3, НСГОК3 с ЗЕО ГО N0: 4, определяющую комплементарность область легкой цепи (ЬСПК1) с ЗЕО ГО N0: 6, 1.С1Ж2 с ЗЕО ГО N0: 7 и 1.С1Ж с ЗЕО ГО N0: 8;

   (b) от 5±0,75 до 50±7,5 мМ гистидина (рН 6,0±0,3);

   (c) 0,01±0,0015% (вес./об.) полисорбата 20;

   (б) 10±1,5 % (вес./об.) сахарозы.
2. 2. Жидкий фармацевтический состав по п.1, где концентрация гистидина выбрана из группы, состоящей из:

   (ί) от 5±0,75 до 15±2,25 мМ;

   (ίί) от 6±0,9 до 14±2,1 мМ;

   (ίίί) от 7±1,05 до 13±1,95 мМ;

   (ίν) от 8± 1,2 до 12± 1,8 мМ;

   (ν) от 9±1,35 до 11±1,65 мМ;

   (νί) 10±1,5 мМ.
3. 3. Жидкий фармацевтический состав по п.1 или 2, где антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи (НСУВ), содержащий ЗЕО ГО N0: 1, и вариабельный домен легкой цепи (ЬСУЭ), содержащий ЗЕО ГО N0: 5.
4. 4. Жидкий фармацевтический состав по п.1, где состав содержит 175 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
5. 5. Жидкий фармацевтический состав по п.1, где состав содержит 150 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
6. 6. Жидкий фармацевтический состав по п.1, где состав содержит 100 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
7. 7. Жидкий фармацевтический состав по п.1, где состав содержит 75 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
8. 8. Жидкий фармацевтический состав по п.1, где состав содержит 50 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
9. 9. Жидкий фармацевтический состав, содержащий:

   (a) 75 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связывают человеческую пропротеиновую конвертазу субтилизин/кексин типа 9 (РСЗК9), где антитело содержит определяющую комплементарность область тяжелой цепи (НСГОК1) с ЗЕО ГО N0: 2, НСГОК2 с ЗЕО ГО N0: 3, НС.ВК3 с ЗЕО ГО N0: 4, определяющую комплементарность область легкой цепи (ЬСГОГО) с ЗЕО ГО N0: 6, БСВК2 с ЗЕО ГО N0: 7 и 1,С1Ж с ЗЕО ГО N0: 8;

   (b) гистидин (рН 6,0±0,3) в концентрации 8± 1,2 мМ;

   (c) 0,01±0,0015% (вес./об.) полисорбата 20;

   (б) 10±1,5 % (вес./об.) сахарозы.
10. 10. Жидкий фармацевтический состав по п.9, где антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи (НСУЭ), содержащий ЗЕО ГО N0: 1, и вариабельный домен легкой цепи (ЬСУЭ), содержащий ЗЕО ГО N0: 5.
11. 11. Жидкий фармацевтический состав, содержащий:

    (a) 150 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связывают человеческую пропротеиновую конвертазу субтилизин/кексин типа 9 (РСЗК9), где антитело содержит определяющую комплементарность область тяжелой цепи (НСГОК1) с ЗЕО ГО N0: 2, НСГОК2 с ЗЕО ГО N0: 3, НС.ВК3 с ЗЕО ГО N0: 4, определяющую комплементарность область легкой цепи (ЬСГОГО) с ЗЕО ГО N0: 6, БСВК2 с ЗЕО ГО N0: 7 и 1,С1Ж с ЗЕО ГО N0: 8;

    (b) гистидин (рН 6,0±0,3) в концентрации 6±0,9 мМ;

    (c) 0,01±0,0015% (вес./об.) полисорбата 20;

    (б) 10±1,5 % (вес./об.) сахарозы.
12. 12. Жидкий фармацевтический состав по п.11, где антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи (НСУЭ), содержащий ЗЕО ГО N0: 1, и вариабельный домен легкой цепи (ЬСУЭ), содержащий ЗЕО ГО N0: 5.