EA003394B1 - Нерастворимые инсулинсодержащие композиции, способы их получения, суспензионный препарат, способ лечения диабета и гипергликемии - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к нерастворимым композициям, содержащим белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины; производный белок, выбираемый из группы, включающей производный инсулин, аналог производного инсулина и производный проинсулин; комплексообразующее соединение; стабилизатор гексамеры и катион двухвалентного металла. Нерастворимые композиции пригодны как для парентерального, так и непарентерального способа введения при лечении гипергликемии и диабета. Микрокристаллические формы нерастворимого осадка фармацевтически аналогичны кристаллической форме инсулина с нейтральным протамином Хейгдорна (NPH). Установлено, что суспензионные препараты на основе таких нерастворимых композиций обладают уникальными свойствами регулируемого растворения, обеспечивающими терапевтически благоприятную глюкодинамику по сравнению с препаратами инсулина NPH.

Description

Предпосылки изобретения Область техники

Это изобретение относится к области медицины. В частности, это изобретение относится к фармакотерапии таких болезней, как диабет и гипергликемия.

Описание предшествующего уровня техники

На протяжении длительного времени целью инсулинотерапии является имитация схемы секреции эндогенного инсулина у здорового человека. Дневная физиологическая потребность в инсулине колеблется и может быть разделена на две фазы: (а) фаза всасывания, требующая поступления инсулина для удаления избытка глюкозы в крови во время приема пищи, и (Ь) фаза после всасывания, требующая пролонгированного поступления инсулина для регулирования уровня глюкозы, секретируемой печенью, с целью сохранения оптимальной концентрации глюкозы в крови в период между приемами пищи.

Из вышеизложенного следует, что эффективное лечение людей, страдающих диабетом, обычно включает комбинированное применение препаратов экзогенного инсулина двух типов: инсулин быстрого действия, вводимый во время приема пищи в виде инъекции ударной дозы вещества, и так называемый основной инсулин пролонгированного действия, вводимый в виде инъекции 1 или 2 раза в день для регулирования содержания глюкозы в крови между приемами пищи. Идеальный основной инсулин обеспечивает продолжительное и ровное действие в течение длительного времени, то есть он регулирует содержание глюкозы в крови в течение, по крайней мере, 12 ч и предпочтительно в течение 24 ч или более без существенного риска возникновения гипогликемии. Кроме того, идеальный основной инсулин должен смешиваться с растворимым инсулином, вводимым во время приема пищи, и не должен вызывать раздражения или реакции в месте введения. И, наконец, основной инсулин должен иметь такую структуру, чтобы его можно было легко и однородно суспендировать перед введением.

Как должно быть понятно специалистам в этой области, препараты инсулина пролонгированного действия получают из обычного инсулина в виде микрокристаллических суспензий для подкожных инъекций. Примерами коммерческих препаратов основного инсулина являются инсулин ΝΡΗ (с нейтральным протамином Хейгдорна), комплекс инсулина с протамином и цинком (ΡΖΙ) и ультралент (ИЬ).

Первоначальные варианты современного коммерческого инсулина ΝΡΗ, содержащего избыток протамина, были созданы в 1930-х годах Скоттом и др. [8сой, е! а1., 1. Рйагтасой Ехр. Тйег. 58:78, е! кед. (1936)] и Надеботи, е! а1. [1. Ат. Меб. Аккос. 106:177-180 (1936)]. В 1946г. КгауепЬий1, е! а1. [Кер. 8!еио Мет. Нокр. №гб. 1ики1ш1аЬ. 1:60, е! кед. (1946)] получили инсулин

ΝΡΗ, который, помимо усваиваемых количеств инсулина и протамина, содержал цинк. Эти исследователи обнаружили, что при смешивании инсулина и протамина в так называемых усваиваемых пропорциях при нейтральном показателе рН в присутствии цинка и фенольного соединения образуется аморфный осадок, который после выстаивания превращается в продолговатые, тетрагональные кристаллы с концами пирамидальной формы. Эти кристаллы охарактеризованы как палочкообразные кристаллы. Установлено, что усваиваемое соотношение инсулина и протамина составляет около 0,09 мг сульфата протамина на мг инсулина. Цинк необходим в количестве, по крайней мере, около

3,5 мкг на мг инсулина, и концентрация фенольного соединения превышает примерно 0,1%.

Инсулин ΝΡΗ является наиболее широко применяемым инсулиновым препаратом, и на его долю приходится от 50 до 70% мирового потребления инсулина. Этот препарат представляет собой суспензию микрикристаллического комплекса инсулина, цинка, протамина и одного или нескольких фенольных консервантов. Выпускаемые промышленностью препараты инсулина ΝΡΗ содержат инсулин человека, свиньи, крупного рогатого скота или их смеси. Кроме того, в этой области известны ΝΡΗ-подобные препараты на основе аналога мономерного инсулина и аналога ЬукВ28, РгоВ29-инсулина человека [определяемые здесь как ΝΡΕ: Эе ЕеИррйк, М.К., патент США № 5461031, выданный 24 октября 1995 г.; Эе ЕейррЦ, М.К., патент США № 5650486, выданный 22 июля 1997 г.; и Эе Еейррщ, М.К., патент США № 5747642, выданный 5 мая 1998 г.]. Общепризнанным фактом является то, что инсулин ΝΡΗ обеспечивает более длительное регулирование концентрации глюкозы в крови по сравнению с обычным инсулином, так как этот инсулин должен сначала раствориться из микрокристаллов инсулина ΝΡΗ, прежде чем он поступит в кровь. Обычный инсулин не должен растворяться перед поступлением в кровь. Скорость растворения инсулина ΝΡΗ является измеряемым показателем при определении его фармакодинамики и фармакокинетики.

Микрокристаллы инсулина ΝΡΗ имеют выраженную палочкообразную морфологию и типичные размеры, в частности длину около 5 мкм, толщину 1 мкм и ширину 1 мкм. Пролонгированное действие микрокристаллов инсулина ΝΡΗ является следствием их медленного всасывания в месте подкожной инъекции.

Лечение производимыми в настоящее время препаратами инсулина ΝΡΗ не обеспечивает идеально ровной фармакокинетики, необходимой для сохранения оптимальной концентрации глюкозы в крови между приемами пищи в течение продолжительного времени. Поэтому лечение инсулином ΝΡΗ может привести к не3 желательно высоким уровням инсулина в крови, которые могут стать причиной возникновения опасной для жизни гипогликемии.

Помимо того, что инсулин ΝΡΗ не обеспечивает идеально ровного фармакокинетического профиля, продолжительность действия инсулина ΝΡΗ также не является идеальной. В частности, основную проблему при лечении ΝΡΗ вызывает феномен пробуждения, который представляет собой гипергликемию, возникающую из-за недостаточно эффективного регулирования концентрации глюкозы во время сна субъекта. Эти недостатки, связанные с регулированием сахара, являются причиной серьезных долговременных осложнений диабета, вызывают существенные неудобства и снижают качество жизни нуждающегося субъекта.

Состав препарата на основе протамина, цинка и инсулина (ΡΖΙ) подобен ΝΡΗ, но этот инсулин содержит большие количества протамина и цинка, чем ΝΡΗ. Препараты ΡΖΙ могут быть получены в виде аморфных осадков промежуточного действия или кристаллического вещества пролонгированного действия. Однако ΡΖΙ не является идеальным фармацевтическим препаратом основного инсулина, так как он не смешивается с растворимым инсулином во время приема пищи, и высокое содержание цинка и протамина может вызывать раздражение или реакцию в месте введения.

Инсулин человека ультралент представляет собой микрокристаллический препарат инсулина с более высоким содержанием цинка, чем у ΝΡΗ, микрокристаллы которого не содержат протамин или фенольный консервант. Препараты инсулина человека ультралент характеризуются средней продолжительностью действия, которое не является достаточно ровным, и не образуют устойчивых смесей с инсулином. Кроме того, они плохо повторно суспендируются.

Были предприняты попытки устранить недостатки известных суспензий инсулина. С этой целью была исследована способность инсулинов, ацилированных жирной кислотой, регулировать содержание глюкозы в крови [Ηаνе1иηά, 8., е! а1., публикация ΧνίΡΟ XVО 95/07931 от 23 марта 1995 г.]. Пролонгированное действие этих препаратов обусловлено тем, что ацильная часть жирной кислоты этих молекул связывается с сывороточным альбумином. Длина ацильной цепи жирной кислоты этих молекул обеспечивает связывание жирной кислоты с сывороточным альбумином. Цепи жирных кислот, используемых в инсулинах, ацилированных жирными кислотами, обычно содержат больше десяти атомов углерода, причем цепи длиной четырнадцать и шестнадцать атомов углерода являются оптимальными для связывания с сывороточным альбумином и увеличения срока действия препарата.

В отличие от инсулина ΝΡΗ, который является нерастворимым, вышеуказанные инсули ны, ацилированные жирными кислотами, растворимы при обычных терапевтических концентрациях инсулина. Однако действие этих препаратов является недостаточно продолжительным или недостаточно ровным для идеального регулирования содержания основного инсулина, и они являются менее эффективными, чем инсулин, что требует введения больших количеств лекарственного средства |Ка6/шк. 1., е! а1., И1аЬеЮ1оща 41:116-120, 489-490 (1998)].

νΗίΐΐίη^Ηαω, 1.Б., е! а1. [ВюсБетщйу, 36:2826-2831 (1997)] кристаллизовали аналог В29-№-тетрадеканоил-дес(В30)-инсулина человека в виде гексамерного комплекса с цинком и фенолом для выполнения структурного исследования при помощи рентгеновской кристаллографии. Установлено, что этот гексамер имеет конформацию К.6 и обладает определенными свойствами, отличающими его от гексамеров инсулина человека. ΧνΐιίΙΙίηβΙιηιη е! а1. не дали описания фармацевтических или фармакологических свойств полученных кристаллов и не указали, обладают ли такие кристаллы какимилибо полезными свойствами для лечения диабета или гипергликемии. В описании, представленном ΧνΐιίΙΙίηβΙιηιη и др., нет четкого определения того, можно ли получить содержащие протамин кристаллы типа ΝΡΗ из производных инсулинов и аналогов инсулина и каковы фармакокинетические или фармакодинамические характеристики таких кристаллов.

Таким образом, по-прежнему необходимы препараты инсулина, которые обладают более ровным и продолжительным действием, чем инсулин ΝΡΗ, смешиваются с растворимыми инсулинами, вводимыми во время приема пищи, могут быть легко ресуспендированы и не вызывают раздражения или реакции в месте введения. Заявитель установил, что эти свойства присущи нерастворимым композициям, содержащим производный белок, непроизводный белок, цинк, протамин и фенольный консервант. Кроме того, такие нерастворимые композиции позволяют гибко регулировать продолжительность и форму профиля глюкодинамической реакции. Эти композиции считаются композициями с регулируемым высвобождением, в которых скорость высвобождения регулируется пропорцией и характером производного белка. Таким образом, одной целью настоящего изобретения является нерастворимая композиция, содержащая непроизводный белок, производный белок, комплексообразующее соединение, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла. Далее будут описаны другие цели этого изобретения, относящиеся к получению и применению таких композиций.

Заявителю не известны примеры смесей производных и непроизводных инсулинов в том значении, которое станет очевидным из настоящего описания изобретения. Известны кристаллы, состоящие из проинсулина и инсулина [8!ешет, Ό.Ρ.,

Νιΐιιιν 243:528-530 (1973); кои, В.V., е! а1., Ыа1иге 248:339-340 (1974)], и кристаллы, состоящие из инсулина или аналога инсулина, имеющего примерно такую же изоэлектрическую точку, что и инсулин, и аналога инсулина, имеющего дополнительные основные аминокислоты [Погасйид, М., е! а1., патент США № 5028587, выданный 2 июля 1991 г.].

§!ешет получил кристаллы, содержащие проинсулин и инсулин в молярных отношениях, соответственно равных примерно 1:11, 1:5, 1:2 и 1:1 (то есть 0,5, 1, 2 и 3 моля проинсулина на 6 молей общего инсулина и проинсулина), в растворе 0,095 М цитрата натрия, рН 6,0, 0,03 М №1Ск 0,012 М ΖπΟ₂ и 16% ацетона. Пропорция проинсулина сильно влияет на скорость кристаллизации. Эти кристаллы существенно отличаются от кристаллов чистого инсулина, полученных в тех же условиях, и могут быть охарактеризованы как ромбоэдральные кристаллы с закругленными ребрами. Существует большое разнообразие кристаллов как в одном препарате, так и в разных препаратах. Полезность кристаллизации проинсулина и инсулина заключается в том, что это облегчает выделение небольших количеств проинсулина и родственных структур из панкреатических экстрактов. Автор указывает, что кристаллизация может происходить между пептидами-предшественниками и зрелыми пептидами, а также между другими родственными белками.

Ьои В.XV. е! а1. получили очень большие кристаллы, содержащие эквимолярные количества инсулина коровы или свиньи и соответствующих проинсулинов, в которых проинсулин и инсулин образовывали гомогенные гексамеры до кристаллизации. Анализ, выполненный при помощи рентгеновской кристаллографии и количественного электрофореза, подтвердил вывод о том, что элементарная ячейка в этих кристаллах образована двенадцатью гексамерами инсулина и двенадцатью гексамерами проинсулина. Было особо отмечено, что неизвестно о выполнении исследований, которые подтвердили бы, что инсулин и проинсулин образуют в растворе смешанные димеры и гексамеры.

ЭогесЫщ М. е! а1. описаны кристаллы, состоящие из инсулина, дес(Р1еВ1)инсулина, дес(Т1гВ30)инсулина человека или дес(А1аВ30) инсулина крупного рогатого скота и, по крайней мере, одного инсулина, имеющего основную модификацию у С-конца цепи В (модифицированный инсулин). Такие модифицированные инсулины описаны, например, в заявке на европейский патент № 132769. В этой заявке отмечено, что глобин и сульфат протамина являются дополнительными соединениями, которые можно использовать в кристаллических препаратах. В указанной заявке отсутствуют примеры использования протамина и не указано, каким образом изобретатели оценивают результат добавления таких соединений. Кроме того, модифи цированные инсулины, использованные Эог5с1шд е! а1., отличаются от производных, используемых в настоящем изобретении.

Как указывалось выше, заявитель обнаружил, что если белок, выбранный из инсулина, аналога инсулина и проинсулина, сделать менее растворимым в водном растворителе и более липофильным путем получения его производного в результате замещения одной или нескольких реакционноспособных боковых групп, то производный белок и непроизводный белок, выбираемый из инсулина, аналога инсулина и проинсулина, можно ввести в нерастворимые осадки и ΝΡΗ-подобные кристаллы вместе с протамином. Когда такие белки вместе осаждают или кристаллизуют с получением нерастворимых композиций, значительно уменьшается скорость растворения белков из такой нерастворимой композиции по сравнению с физически сходными нерастворимыми композициями, содержащими непроизводный белок.

Заявитель далее обнаружил, что как аморфные осадки, так и микрокристаллы, содержащие производный белок, непроизводный белок, комплексообразующее соединение, катион двухвалентного металла и стабилизатор гексамера, обеспечивают более ровное и длительное действие, чем физически схожие микрокристаллы, содержащие только непроизводный белок. Кроме того, заявитель установил, что более ровное и продолжительное действие может быть достигнуто даже при использовании аморфных осадков, содержащих один из белков и производный белок.

Краткое изложение существа изобретения

Целью настоящего изобретения в наиболее широком понимании являются нерастворимые композиции, содержащие производный белок, выбираемый из группы, включающей производные инсулина, производные аналога инсулина и производные проинсулина; белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины; комплексообразующее соединение; стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла. Производный белок или должен быть менее растворим в водном растворителе, чем непроизводный белок, более липофильным, чем непроизводный инсулин, или должен образовывать комплекс с цинком и протамином, который менее растворим, чем соответствующий комплекс с непроизводным белком. Нерастворимые композиции по настоящему изобретению могут иметь форму аморфных осадков или более предпочтительно форму микрокристаллов. Микрокристаллы могут иметь палочкообразную или неупорядоченную морфологию.

Эти нерастворимые композиции позволяют эффективно лечить диабет и гипергликемию и характеризуются более ровным и продолжительным действием, чем инсулин ΝΡΗ. Нерастворимые композиции смешивают в препарате с растворимым белком или растворимым производным белком либо с обоими вместе. Кроме того, изменяя соотношение между белком и производным белком, можно очень точно регулировать продолжительность действия в очень широких пределах, от почти такого же времени действия как у инсулина ΝΡΗ до гораздо более продолжительного действия, чем у инсулина ΝΡΗ.

В частности, настоящее изобретение относится к нерастворимым композициям, содержащим белки и белки, ацилированные жирной кислотой, которые позволяют эффективно лечить диабет и гипергликемию. Эти композиции содержат ацилированный жирной кислотой белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, ацилированный жирной кислотой, аналог инсулина, ацилированного жирной кислотой, и проинсулин, ацилированный жирной кислотой; белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулин; протамин; фенольный консервант и цинк. Настоящее изобретение отличается от ранее известного способа получения инсулина, ацилированного жирной кислотой, тем, что продолжительность действия композиции по настоящему изобретению необязательно обусловлена связыванием альбумина, хотя связывание альбумина может еще больше увеличивать продолжительность действия некоторых композиций по настоящему изобретению.

Это изобретение относится к микрокристаллам, содержащим белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналог инсулина и проинсулин; производный белок, выбираемый из группы, включающей производный инсулин, аналог производного инсулина и производный проинсулин; комплексообразующее соединение; катион двухвалентного металла и стабилизатор гексамера. Микрокристаллы по настоящему изобретению позволяют эффективно лечить диабет и регулировать содержание глюкозы в крови у нуждающихся субъектов.

Это изобретение относится к аморфному осадку, содержащему белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналог инсулина и проинсулин; производный белок, выбираемый из группы, включающей производный инсулин, аналог производного инсулина и производный проинсулин; комплексообразующее соединение; катион двухвалентного металла и стабилизатор гексамера. Аморфные осадки по настоящему изобретению позволяют эффективно лечить диабет и регулировать содержание глюкозы в крови у нуждающихся субъектов. Они являются также полезными промежуточными веществами для получения микрокристаллов по настоящему изобретению.

Это изобретение относится к препаратам в виде водной суспензии, содержащим нерастворимую композицию и водный растворитель. Один такой препарат в виде водной суспензии содержит микрокристаллическую композицию по настоящему изобретению и водный растворитель. Другой препарат в виде водной суспензии содержит аморфный осадок по настоящему изобретению и водный растворитель. Растворимая водная фаза препаратов по настоящему изобретению может необязательно содержать белок, такой как инсулин человека, или растворимый аналог инсулина человека, такой как аналог мономерного инсулина, который регулирует содержание глюкозы в крови сразу же после приема пищи и может дополнительно или альтернативно содержать производный белок. Препараты по настоящему изобретению обладают лучшей фармакодинамикой по сравнению с инсулином ΝΡΗ человека, и продолжительность их действия можно целенаправленно выбирать в широких пределах: от немного более продолжительного действия по сравнению с инсулином ΝΡΗ человека до значительно более продолжительного по сравнению с инсулином ΝΡΗ человека.

Это изобретение относится к способам получения гибридных гексамеров, смешанных гексамеров, аморфных осадков и сокристаллов по настоящему изобретению.

Это изобретение относится к способу лечения диабета или гипергликемии, который заключается в том, что нуждающемуся субъекту вводят нерастворимую композицию по настоящему изобретению в количестве, достаточном для регулирования уровней глюкозы в крови у этого субъекта.

Это изобретение относится к композициям на основе гибридных гексамеров, которые содержат белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналог инсулина и проинсулин; производный белок, выбираемый из группы, включающей производный инсулин, аналоги производного инсулина, производные проинсулины и цинк. Гибридные гексамеры по настоящему изобретению позволяют эффективно лечить диабет и регулировать содержание глюкозы в крови у нуждающегося субъекта. Они являются также полезными промежуточными веществами для получения нерастворимых композиций по настоящему изобретению, которые сами по себе полезны для лечения диабета и регулирования содержания глюкозы в крови у нуждающегося субъекта. Считается, что гибридные гексамеры образуются, во-первых, при смешивании белка и производного белка в условиях, которые в наибольшей степени способствуют растворению в более низких состояниях агрегации по сравнению с гексамерным состоянием, и, во-вторых, при изменении условий на такие, которые в наибольшей степени стимулирует гексамерное состояние агрегации.

Это изобретение относится к композициям на основе смешанных гексамеров, которые содержат цинковые гексамеры белка, выбираемого из группы, включающей инсулин, аналог ин9 сулина или проинсулин, и цинковые гексамеры производного белка, выбираемые из группы, включающей производный инсулин, аналог производного инсулина или производный проинсулин. Смешанные гексамеры по настоящему изобретению позволяют эффективно лечить диабет и регулировать содержание глюкозы в крови у нуждающегося субъекта. Они являются также полезными промежуточными веществами для получения нерастворимых композиций по настоящему изобретению, которые сами по себе полезны для лечения диабета и регулирования содержания глюкозы в крови нуждающегося субъекта. Считается, что смешанные гексамеры образуются, прежде всего, при раздельном растворении белка и производного белка в условиях, благоприятных для гексамерного состояния агрегации, и при последующем смешивании в условиях, которые в наибольшей степени стимулируют гексамерное состояние агрегации.

Это изобретение относится к применению нерастворимой композиции по настоящему изобретению для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения диабета или гипергликемии.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 приведены данные растворения в течение 5 ч сокристаллов по настоящему изобретению, в которых отношения инсулина человека к В29-№-октаноилинсулину человека составляют 3:1 (—), 1:1 (—) и 1:3 () по сравнению с растворением кристаллов протамина и инсулина человека ().

На фиг. 2 приведены данные растворения, полученные при осуществлении экспериментов, изображенных на фиг. 1, но временная ось на этой фигуре продлена, чтобы можно было показать данные для сокристаллов с отношением 1:3 в течение примерно 13,5 ч. Растворение сокристаллов по настоящему изобретению, в которых отношения инсулина человека к Β29-Νεоктаноилинсулину человека составляют 3:1 (—), 1:1 (—) и 1:3 (), сравнивается с растворением кристаллов протамина и инсулина человека ().

На фиг. 3 приведены данные растворения сокристаллов по настоящему изобретению, в которых отношения инсулина человека к В29Νε-октаноилинсулину человека составляют 1:1 (—) и 1:3 (—) по сравнению с растворением микрокристаллов, содержащих только Β29-Νεоктаноилинсулин человека () или кристаллы протамина и инсулина человека ().

На фиг. 4 приведены данные растворения сокристаллов по настоящему изобретению, в которых отношение инсулина человека к В29Νε-октаноилинсулину человека составляют 1:3 () по сравнению с растворением кристаллов протамина и инсулина человека (), инсулина человека ультралент (—) и инсулина крупного рогатого скота ультралент (—).

Подробное описание изобретения

Термин смешанные гексамеры означает смесь гексамеров белка и гексамеров производного белка, в которой гексамеры белка состоят из цинка и белка, выбираемого из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины, и гексамеры производного белка состоят из цинка и производного белка, выбираемого из группы, включающей производный инсулин, аналоги производного инсулина и производные проинсулины. Содержание цинка в гексамере составляет от около 2 до около 4 атомов цинка на один гексамер.

Термин гибридный гексамер означает гексамер, состоящий из шести мономеров и цинка, в котором, по крайней мере, один мономер выбирают из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины, и, по крайней мере, один мономер выбирают из группы, включающей производный инсулин, аналоги производного инсулина и производные проинсулины. Содержание цинка в гексамере обычно составляет от около 2 до около 4 атомов цинка на один гексамер.

В используемом здесь значении термин сокристалл означает микрокристалл по настоящему изобретению.

Термин нерастворимая композиция означает вещество в микрокристаллическом состоянии или в состоянии аморфного осадка. Наличие микрокристаллов или аморфного осадка можно определить визуально и путем микроскопического исследования. Растворимость зависит от растворителя, и определенная композиция может быть нерастворимой в одном растворителе и растворимой в другом.

Термин микрокристалл означает твердое вещество, находящееся, как правило, в кристаллическом состоянии, в котором отдельные кристаллы имеют, в основном, одну кристаллографическую композицию и микроскопический размер, причем наибольший размер обычно составляет от 1 до 100 мкм. Термин микрокристаллический означает состояние, в котором вещество является микрокристаллом.

Термин палочкообразный означает выраженную микрокристаллическую морфологию, которая описывается также как тетрагональные палочки с пирамидальным концом. Морфологию микрокристаллов по настоящему изобретению можно легко определить путем микроскопического исследования.

Термин неупорядоченная морфология характеризует микрокристаллы, морфология которых, выявленная при помощи микроскопического исследования, не может быть классифицирована в соответствии с одним из хорошо известных типов кристаллов, не относится к одному типу морфологии кристалла или не может быть сразу же определена из-за того, что размер кристаллов является слишком мелким для конкретной классификации.

Термин аморфный осадок означает нерастворимое вещество, не находящееся в кристаллическом состоянии. Специалист в этой области может легко отличить кристаллы от аморфного осадка. Аморфные осадки по настоящему изобретению сами по себе обладают предпочтительными фармакологическими свойствами и являются также промежуточными веществами для получения микрокристаллов по настоящему изобретению.

Термин белок может иметь общепринятое значение, то есть полимер аминокислот. В этом описании изобретения термин белок имеет также более узкое значение, то есть белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины. Термин непроизводный белок означает также белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины.

В значении, используемом в формуле изобретения и в описании изобретения, термин общий белок означает общее количество белка (инсулин, аналог инсулина или проинсулин) и производного белка (производный инсулин, аналог производного инсулина или производный проинсулин). Хотя протамин и другие известные комплексообразующие соединения также являются белками в наиболее широком значении этого термина, они не входят в определение термина общий белок.

Термин производный белок означает белок, выбираемый из группы, включающей производный инсулин, аналоги производного инсулина и производный проинсулин, который является за счет функциональной группы таким, что производный белок становится или менее растворимым в водном растворителе, чем непроизводный белок, более липофильным, чем непроизводный инсулин, или образует комплекс с цинком и протамином, который является менее растворимым, чем соответствующий комплекс с непроизводным белком. Способы определения растворимости или липофильности белков и производных белков хорошо известны специалистам в этой области. Растворимость производных белков и белков в комплексах с цинком и протамином можно легко определить хорошо известными способами [бгайаш апй Ротегоу, 1. Рйагт. Р11агтаео1. 36:427-430 (1983), модифицированными ОеРе11рр1к, М.Р. апй Ргапк, В., европейский патент № 735048] или способом, описанным в этом описании изобретения.

Многие примеры таких производных белков известны в этой области, включая бензоильные производные, карбонильные производные п-толилсульфонамида и индолильные производные инсулина и аналогов инсулина [Науе1ипй, 8., е! а1., заявка ХУО 95/07931, опубликованная 23 марта 1995г.]; алкилоксикарбонильные производные инсулина |Се1§ег. Р.. е! а1., патент США № 3684791, выданный 15 августа 1972г.; ВгапйепЬегд, Ό., е! а1., патент США № 3907763, выданный 23 сентября 1975г.]; арилоксикарбонильные производные инсулина [ВгапйепЬегд, Ό., е! а1., патент США № 3907763, выданный 23 сентября 1975г.]; алкилкарбамильные производные [8ту1й, Ό.Ο., патент США № 3864325, выданный 4 февраля 1975г.; Ьшйкау, Ό.Ο., е! а1., патент США № 3950517, выданный 13 апреля 1976 г.]; карбамильные, О-ацетильные производные инсулина [8ту!й, Ό.Ο., патент США № 3864325, выданный 4 февраля 1975 г.]; алкилдикарбоксильные производные с поперечными связями [ВгапйепЬегд, Ό., е! а1., патент США № 3907763, выданный 23 сентября 1975 г.]; Ν-карбамильные, О-ацетилированные производные инсулина [8ту1й, Ό.Ο., патент США № 3868356, выданный 25 февраля 1975г.]; разные О-алкильные сложные эфиры [Магкиккеп, 1., патент США № 4343898, выданный 10 августа 1982 г.; Мопйага, К., е! а1., патент США № 4400465, выданный 23 августа 1983г.; МогШага, К., е! а1., патент США № 4401757, выданный 30 августа 1983 г.; Магкиккеп, 1., патент США № 4489159, выданный 18 декабря 1984 г.; ОЬегте1ег, Р., е! а1., патент США № 4601852, выданный 22 июля 1986г.; и Апйгекеп, Р.Н, е! а1., патент США № 4601979, выданный 22 июля 1986г.]; алкиламидные производные инсулина [Ва1кейт1й!, Р., е! а1., патент США № 5430016, выданный 4 июля 1995 г.]; различные другие производные инсулина [Ьшйкау, Ό.Ο., патент США № 3869437, выданный 4 марта 1975 г.]; и белки, ацилированные жирной кислотой, рассматриваемые в этом описании изобретения.

Термин ацилированный белок в используемом здесь значении означает производный белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулин, которые ацилированы органической кислотой, связанной с белком амидной связью, образованной между кислотной группой органической кислоты и аминогруппой белка. Аминогруппа может быть α-аминогруппой Ν-концевой аминокислоты белка или ε-аминогруппой остатка Ьук белка. Ацилированный белок может быть ацилирован в одной или нескольких аминогруппах из трех, присутствующих в инсулине и в большинстве аналогов инсулина. Моноацилированные белки ацилированы в одной аминогруппе. Диацилированные белки ацилированы в двух аминогруппах. Триацилированные белки ацилированы в трех аминогруппах. Органическая кислота может быть, например, жирной кислотой, ароматической кислотой или любым другим органическим соединением, имеющим группу карбоновой кислоты, которая может образовывать амидную связь с аминогруппой белка и которая уменьшает растворимость в воде, повышает липофильность или уменьшает растворимость комплексов цинка/протамина производного белка по сравнению с непроизводным белком.

Термин белок, ацилированный жирной кислотой означает ацилированный белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины, которые ацилированы жирной кислотой, связанной с белком амидной связью, образованной между кислотной группой жирной кислоты и аминогруппой белка. Аминогруппа может быть α-аминогруппой Ν-концевой аминокислоты белка или εаминогруппой остатка Ьуз белка. Белок, ацилированный жирной кислотой, может быть ацилирован в одной или нескольких аминогруппах из трех, присутствующих в инсулине и в большинстве аналогов инсулина. Моноацилированные белки ацилированы в одной аминогруппе. Диацилированные белки ацилированы в двух аминогруппах. Триацилированные белки ацилированы в трех аминогруппах. Инсулин, ацилированный жирной кислотой, описан в заявке на патент Японии 1-254699. См. также НазЫто!о, М., е! а1., РйаттасеиИса1 Кезеатсй, 6:171-176 (1989), апб Ьшбзау, Ό.Ο., е! а1., Вюсйет1са1 1. 121:737-745 (1971). Дальнейшее описание инсулинов, ацилированных жирной кислотой, аналогов инсулина, ацилированных жирной кислотой, и способов их синтеза можно найти в заявке на патент США 08/342931, поданной Вакег, 1.С., е! а1. 17 ноября 1994 г., на основании которой выдан патент США № 5693609 от 2 декабря 1997 г.; в заявке на патент УО 95/07931 Науе1ип6, 8., е! а1., опубликованной 23 марта 1995 г., и соответствующем патенте США № 5750497, выданном 12 мая 1998 г.; в заявке УО 96/29342 1опаззеп, I., е! а1., опубликованной 26 сентября 1996 г. Все эти работы включены в это описание изобретения в качестве ссылки для описания инсулинов, ацилированных жирной кислотой, и аналогов инсулинов, ацилированных жирной кислотой, и для ознакомления со способами их получения.

Термин белок, ацилированный жирной кислотой включает фармацевтически приемлемые соли и комплексы белков, ацилированных жирной кислотой. Термин белок, ацилированный жирной кислотой включает также препараты ацилированных белков, в которых совокупность молекул ацилированного белка является однородной в отношении сайта или сайтов ацилирования. Например, Νε-моноацилированный белок, В1-Ла-моноацилированный белок, А1-Ла-моноацилированный белок, А1,В1Να-диацилированный блок, Νε, А1-№/.-диацилированный белок, №,В1-На-диацилированный белок и Νε, А1,В1-Ла-триацилированный белок, которые полностью входят в объем определения термина белок, ацилированный жирной кислотой в соответствии с целями настоящего изобретения. Этот термин относится также к препаратам, в которых вся совокупность молекул ацилированного белка характеризуется однородным ацилированием. В последнем случае термин белок, ацилированный жирной кислотой означает смеси моноацилированных и диацилированных белков, смеси моноацилированных и триацилированных белков, смеси диацилированных и триацилированных белков и смеси моноацилированных, диацилированных и триацилированных белков.

Термин инсулин в используемом здесь значении означает инсулин человека, аминокислотная последовательность и особенности структуры которого хорошо известны. Инсулин человека имеет А-цепь, состоящую из 21 аминокислоты, и В-цепь, состоящую из 30 аминокислот, которые поперечно связаны дисульфидными связями. Правильно поперечно связанный инсулин содержит три дисульфидных мостика: один между положением 7 А-цепи и положением 7 В-цепи, второй между положением 20 Ацепи и положением 19 В-цепи и третий между положениями 6 и 11 А-цепи.

Термин аналог инсулина означает белки, имеющие А-цепь и В-цепь, которые содержат практически такие же аминокислотные последовательности, что и соответственно А-цепь и В-цепь инсулина человека, но отличаются от Ацепи и В-цепи инсулина человека тем, что у них удалены, заменены и/или добавлены одна или несколько аминокислот, которые не нарушают инсулиновую активность аналога инсулина.

Инсулины животных являются аналогами инсулина человека и поэтому относятся к аналогам инсулина в соответствии с приведенным здесь определением. Четырьмя такими инсулинами животных являются инсулин кролика, свиньи, коровы и овцы. Замещения аминокислот, которые отличают инсулины этих животных от инсулина человека, приведены ниже для сведения.

	Положение аминокислот
	А8	А9	А10	В30
Инсулин человека	Тйт	8ег	11е	Тйт
Инсулин кролика	Тйт	8ег	11е	8ег
Инсулин свиньи	Тйт	8ег	11е	А1а
Инсулин коровы	А1а	8ег	Уа1	А1а
Инсулин овцы	А1а	С1у	Уа1	А1а

Другой тип аналога инсулина, аналог мономерного инсулина, хорошо известен в этой области. Аналоги мономерного инсулина в структурном отношении очень схожи с инсулином человека и обладают активностью, которая схожа или эквивалентна инсулину человека, но у них удалены, заменены или добавлены одна и несколько аминокислот, нарушающие связи, относящиеся к димеризации и гексамеризации, что ведет к уменьшению связывания с достижением более высоких агрегатных состояний. Аналоги мономерного инсулина являются аналогами инсулина человека быстрого действия и описаны, например, С На псе, Р.Е.. е! а1., патент США № 5514646, 7 мая 1996 г.; Вгетз, Ό.Ν., е!

а1., Рго!е1п Епдтеегшд, 5:527-533 (1992); Вгапде, ПУ., е! а1., публикация ЕРО № 214826 от 18 марта 1987 г.; Вгапде, ПУ., е! а1., патент США № 5618913, 8 апреля 1997 г.; и Вгапде, 1., е! а1., Сиггеп! Оршюп ш 81гис!ига1 Вю1оду 1:934-940 (1991). В качестве примера аналогов мономерного инсулина приведен инсулин человека, в котором Рго в положении В28 замещен Акр, Ьук, Ьеи, Уа1 или А1а и Ьук в положении В29 является Ьук или замещен Рго, а также А1аВ26инсулин человека, 6ек(В28-В39)инсулин человека и 6ек(В27)инсулин человека. Аналоги мономерного инсулина, используемого в качестве производных соединений в кристаллах по настоящему изобретению или непроизводных соединений в фазе раствора суспензионных препаратов, поперечно связаны в тех же положениях, что и инсулин человека.

Другую группу аналогов инсулина, пригодных для использования при осуществлении настоящего изобретения, составляют аналоги инсулина, у которых изоэлектрическая точка находится в пределах от около 7,0 до около 8,0. Эти аналоги определяются как аналоги инсулина со сдвигом р1. Примерами таких аналогов инсулина являются АгдВ31,АгдВ32-инсулин человека, С1уА21, АгдВ31, АгдВ32-инсулин человека, АгдА0, АгдВ31, АгдВ32-инсулин человека и АгдАО, С1уА21, АгдВ31, АгдВ32инсулин человека.

Еще одну группу аналогов инсулина составляют аналоги инсулина с делениями одной или нескольких аминокислот, существенно не нарушающими активность молекулы. Эта группа аналогов инсулина определяется здесь как делеционные аналоги. Например, необходимой активностью обладают аналоги инсулина с делецией одной или нескольких аминокислот в положениях В1-В3. Аналогичным образом обладают активностью аналоги инсулина с делецией одной или нескольких аминокислот в положениях В28-В30. В качестве примеров делеционных аналогов можно указать дес(В30)инсулин человека, дес-Рйе(В1)инсулин человека, дес(В27)инсулин человека, дес(В28-В30)инсулин человека и дес(В1-В3)инсулин человека. Делеционные аналоги, используемые в качестве производных соединений в кристаллах по настоящему изобретению или непроизводных соединений в фазе раствора суспензионного препарата, имеют необходимые поперечные связи в тех же положениях, что и инсулин человека.

Известно, что амидированные аминокислоты, и в частности остатки аспарагина в инсулине, являются химически неустойчивыми Цогдепкеп, К.Н., е! а1., патент США № 5008241, выданный 16 апреля 1991 г.; Эогесйид. М., патент США № 5656722, выданный 12 августа 1997 г.]. В частности, они подвержены деамидированию и разным реакциях перегруппировки, которые хорошо известны. Поэтому аналог инсулина необязательно может быть инсулином или аналогом инсулина, у которого один или несколько амидированных остатков замещены другими аминокислотами для обеспечения химической стойкости. Например, Акп или С1п может быть заменен неамидированной аминокислотой. Предпочтительными замещениями аминокислот для Акп или С1п являются С1у, 8ег, Т11Г, Акр или С1и. Желательно заменить один или несколько остатков Акп. В частности, АкпА18, АкпА21, АкпВ3 или любая комбинация этих остатков может быть заменена, например, остатками С1у, Акр или С1и. Кроме того, С1пА15 или С1пВ4 либо оба вместе могут быть заменены Акр или С1и.

Предпочтительными замещениями являются Акр в положении В21 и Акр в положении В3. Помимо этого, предпочтительны замещения, которые не изменяют заряд молекулы белка, так что замена Акп или С1п нейтральными аминокислотами также является предпочтительной.

Термин проинсулин означает одноцепочечную молекулу пептида, которая является предшественником инсулина. Проинсулин можно превратить в инсулин или аналог инсулина при помощи химических реакций или предпочтительно реакций, катализируемых ферментом. Как указано в этом описании изобретения, в проинсулине образуются необходимые дисульфидные связи. Проинсулин включает инсулин или аналог инсулина и связь или связующий пептид. Связующий пептид имеет от 1 до около 35 аминокислот. Связь или связующий пептид присоединены к концевой аминокислоте А-цепи и к концевой аминокислоте В-цепи при помощи соответственно α-амидной связи или двух αамидных связей. Ни одна из аминокислот в связующем пептиде предпочтительно не является цистеином. С-концевая аминокислота связующего пептида предпочтительно является Ьук или Агд. Проинсулин может иметь формулу XВ-С-А-Υ или формулу Х-А-С-В-Υ, в которой Х обозначает водород или пептид, имеющий от 1 до около 100 аминокислот, который содержит Ьук или Агд в С-концевой аминокислоте, Υ обозначает гидрокси или пептид, имеющий от 1 до около 100 аминокислот, который содержит Ьук или Агд в Ν-концевой аминокислоте, А обозначает А-цепь инсулина и А-цепь аналога инсулина, С обозначает пептид, имеющий от 1 до около 35 аминокислот, ни одна из которых не является цистеином, в котором С-концевая аминокислота является Ьук или Агд, и В обозначает Вцепь инсулина или В-цепь аналога инсулина.

Фармацевтически приемлемая соль означает соль, образованную между одной или несколькими заряженными группами в белке и одним или несколькими фармацевтически приемлемыми нетоксичными катионами или анионами. Органическими и неорганическими солями являются, например, соли, полученные из таких кислот, как хлористо-водородная, серная, сульфоновая, винная, фумаровая, бромистоводородная, гликолевая, лимонная, малеиновая, фосфорная, янтарная, уксусная, азотная, бензойная, аскорбиновая, п-толуолсульфоновая, бензолсульфоновая, нафталинсульфоновая, пропионовая, угольная и тому подобные кислоты, или, например, соли аммония, натрия, калия, кальция или магния.

Глагол ацилировать означает образование амидной связи между жирной кислотой и аминогруппой белка. Белок ацилирован в том случае, когда одна или несколько его аминогрупп связаны амидной связью с кислотной группой жирной кислоты.

Термин жирная кислота означает насыщенную или ненасыщенную жирную кислоту с прямой или разветвленной цепью, имеющую от одного до восемнадцати атомов углерода.

Термин С1-С18 жирная кислота означает насыщенную жирную кислоту с прямой или разветвленной цепью, имеющую от одного до восемнадцати атомов углерода.

Термин катион двухвалентного металла означает ион или ионы, участвующие в образовании комплекса с несколькими молекулами белка. В качестве примеров металлов, образующих комплексы с инсулином, можно привести переходные металлы, щелочные металлы и щелочно-земельные металлы. Переходные металлы являются предпочтительными. Цинк является особенно предпочтительным. Другими переходными металлами, которые могут был фармацевтически приемлемыми для образования комплекса с белками инсулина, являются медь, кобальт и железо.

Термин комплекс имеет два значения в настоящем описании изобретения. Первым значением этого термина является комплекс, образуемый между одним или несколькими атомами комплексообразующих белков и одним или несколькими катионами двухвалентного металла. Атомы белков служат в качестве электронодонорных лигандов. Белки обычно образуют гексамерный комплекс с катионами двухвалентных переходных металлов. Вторым значением термина комплекс в настоящем описании изобретения является ассоциация между комплексообразующим соединением и гексамерами. Комплексообразующее соединение является органической молекулой, которая обычно имеет множество положительных зарядов, которые связываются или образуют комплекс с гексамерами в нерастворимой композиции, стабилизируя их против растворения. Примерами комплексообразующих соединений, пригодных для осуществления настоящего изобретения, являются протамин, сурфен, различные глобиновые белки [Вгапде, 1., 6а1ешс§ ой Ιηδυϊίη. 8ргшдегУсг1ад. Вегбп Не1бе1Ьегд (1987)] и разные поликатионные полимеры, образующие комплекс с инсулином.

Термин протамин означает смесь сильно основных белков, полученных из спермы рыбы. Средняя молекулярная масса белков в протамине равна примерно 4200 [Нойтапп, ТА., е1 а1., Рго1ет Ехргекыоп апб Рцпйсабоп, 1:127-133 (1990)]. Протамин может означать относительно бессолевой препарат белков, часто именуемый основанием протамина. Протамин также означает препараты, содержащие соли белков. В коммерческих препаратах содержание соли изменяется в широких пределах.

Протамины хорошо известны специалистам в области получения инсулина, и в настоящее время их вводят в препараты инсулина ΝΡΗ. В настоящем изобретении использована чистая фракция протамина, а также смеси протаминов. Однако коммерческие препараты протамина обычно не бывают однородными в отношении присутствующих белков. Тем не менее, они пригодны для осуществления настоящего изобретения. Протамин в форме основания протамина пригоден для осуществления настоящего изобретения точно так же, как препараты протамина, включающие соли протамина, и препараты, представляющие собой смеси основания и солей протамина. Часто используемой солью протамина является сульфат протамина. Все массовые отношения для протамина указаны с учетом свободного основания протамина. Специалист в этой области может определить целый ряд других препаратов протамина, имеющих требуемое массовое отношение для протамина.

Термин суспензия означает смесь жидкой и твердой фаз, которая состоит из нерастворимых или умеренно растворимых частиц, размер которых больше коллоидных частиц. Смеси микрокристаллов ΝΡΗ и водного растворителя образуют суспензии. Смеси аморфного осадка и водного растворителя также образуют суспензию. Термин суспензионный препарат означает фармацевтическую композицию, в которой активное вещество присутствует в твердой фазе, например такой, как микрокристаллическое твердое вещество, аморфный осадок или оба вместе, и тонко диспергировано в водном растворителе. Тонко диспергированное твердое вещество имеет такую структуру, которая позволяет его суспендировать в достаточно однородном состоянии в водном растворителе при слабом перемешивании смеси, в результате чего получают однородную суспензию, из которой можно экстрагировать дозу требуемого объема. Примерами промышленно выпускаемых суспензионных препаратов инсулина являются, например, ΝΡΗ, ΡΖΙ и ультралент. Небольшая пропорция твердого вещества в микрокристаллической суспензии может находиться в аморфном состоянии. Пропорция аморфного вещества предпочтительно составляет менее 10% и наиболее предпочтительно менее 1% твердого вещества в микрокристаллической суспензии.

Аналогичным образом небольшая пропорция твердого вещества в суспензии аморфного осадка может иметь микрокристаллическую структуру.

Термин инсулин ΝΡΗ означает препарат инсулина с нейтральным протамином Хейгдорна. Синонимами этого термина наряду с другими определениями являются инсулин ΝΡΗ человека и инсулин ΝΡΗ. Промышленно выпускаемым препаратом инсулина ΝΡΗ является гумулин® Ν. Родственным термином является ΝΡΤ, который служит для определения ΝΡΗподобного препарата аналога ЬукВ28,РгоВ29инсулина человека. Значения этих терминов и способы получения этих препаратов должны быть известны специалистам в области получения инсулина.

Термин водный растворитель означает жидкий растворитель, содержащий воду. Водный растворитель может состоять только из воды, может включать воду и один или несколько смешивающихся растворителей и может содержать растворенные вещества. Наиболее широко используемыми смешивающимися растворителями являются органические спирты с короткой цепью, такие как метанол, этанол, пропанол; кетоны с короткой цепью, такие как ацетон; и многоатомные спирты, такие как глицерин.

Термин изотонический агент означает соединение, которое является физиологически толерантным и сообщает необходимую тоничность композиции, предотвращающую движение воды через клеточные мембраны, контактирующие с введенным препаратом. В качестве изотонического агента обычно используют глицерол, известный также как глицерин. Другими изотоническими агентами являются соли, например хлорид натрия, и моносахариды, например декстроза и лактоза.

Нерастворимые композиции по настоящему изобретению содержат стабилизатор гексамера. Термин стабилизатор гексамера означает небелковое низкомолекулярное соединение, которое стабилизирует белок или производный белок в гексамерном агрегатном состоянии. Наиболее известными стабилизаторами для инсулина и производных инсулина являются фенольные соединения, в частности фенольные консерванты. Стабилизаторы гексамера оказывают стабилизирующее действие в результате связывания с гексамером через специфические межмолекулярные связи. Примерами стабилизаторов гексамера являются разные фенольные соединения, фенольные консерванты, резорцинол, 4'-гидроксиацетанилид, 4-гидроксибензамид и 2,7-дигидроксинафталин. Многоцелевые препараты, содержащие нерастворимые композиции по настоящему изобретению, помимо стабилизатора гексамера, включают консервант. Консервант, используемый в препаратах по настоящему изобретению, может быть фенольным консервантом, при этом он может быть аналогичен стабилизатору гексамера или отличаться от него.

Термин консервант означает соединение, добавляемое к фармацевтическому препарату в качестве антимикробного средства. Препараты для парентерального введения должны удовлетворять требованиям, предъявляемым к эффективности консерванта, в соответствии с которыми он должен быть коммерчески жизнеспособным многоцелевым продуктом. Среди консервантов, которые считаются в этой области эффективными и приемлемыми для использования в препаратах для парентерального введения, можно указать хлорид бензалкония, бензетоний, хлоргексидин, фенол, м-крезол, бензиловый спирт, метилпарабен, хлорбутанол, о-крезол, пкрезол, хлоркрезол, нитрат фенилртути, тимерозал, бензойную кислоту и их разные смеси. См., например, АаНЬаиккег, К.-Η., Бсус1ор. ΒίοΙ. 81ап6аг6, 24:9-28 (1974) (8. Кгадег, Ваке1).

Термин фенольный консервант означает такие соединения, как фенол, м-крезол, окрезол, п-крезол, хлоркрезол, метилпарабен и их смеси. Известно, что некоторые фенольные консерванты, такие как фенол и м-крезол, связываются с инсулиноподобными молекулами и, таким образом, вызывают конформационные изменения, усиливающие физическую или химическую стойкость либо оба эти показателя вместе [В1гпЬаит, Б.Т.. е1 а1., ΡЬа^тасеиΐ^са1. Рек. 14:25-36 (1997); РаЬие1-С1егтоп1, 8., е! а1., ΒίοсйетШгу, 36:5837-5845 (1997)].

Термин буфер или фармацевтически приемлемый буфер означает соединение, которое является безопасным для использования в инсулиновых препаратах и позволяет регулировать рН препарата до достижения требуемого значения. Показатель рН препаратов по настоящему изобретению находится в пределах от около 6,0 до около 8,0. Препараты по настоящему изобретению предпочтительно имеют значение рН от около 6,8 до около 7,8. Фармацевтически приемлемыми буферами, позволяющими регулировать рН от умеренно кислого значения рН до умеренно основного значения рН, являются такие соединения, как фосфат, ацетат, цитрат, аргинин, ТР18 и гистидин. ТР18 означает 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол и его любую фармацевтически приемлемую соль. ТР18 обычно используют в форме свободного основания и гидрохлорида. ТР18 известен в этой области также как триметилоламинометан, трометамин и трис(гидроксиметил)аминометан. Специалистам в этой области должны быть известны другие буферы, которые являются фармацевтически приемлемыми и позволяют регулировать рН в требуемых пределах.

Термин вводить означает введение препарата по настоящему изобретению в тело нуждающегося субъекта для лечения болезни или нарушения.

Термин лечение означает оказание помощи и уход за больным, страдающим диабетом или гипергликемией, а также другим заболеванием, для лечения которого показано введение инсулина с целью устранения или облегчения симптомов и осложнений этих болезней. Лечение включает введение препарата по настоящему изобретению для предотвращения возникновения симптомов или осложнений, облегчения симптомов или осложнений или излечивания болезни, поражения или нарушения.

Как указывалось выше, настоящее изобретение относится к нерастворимым композициям, обладающим свойствами, подобными в некоторых отношениях инсулину ΝΡΗ и превосходящими инсулин ΝΡΗ в других отношениях. Они имеют такие же описываемые ниже физические свойства, что и инсулин ΝΡΗ. Микрокристаллы, содержащие В29-№-октаноилинсулин человека, инсулин, цинк, протамин и фенол, которые были получены по настоящему изобретению, исследовали при помощи светового микроскопа, оснащенного объективом с масляной иммерсией и перекрестным поляризатором. Исследование при 1000-кратном увеличении показало, что эти микрокристаллы являются палочкообразными одиночными кристаллами и имеют однородную кристаллическую структуру. Длина этих микрокристаллов обычно составляет от около 2 до 8 мкм. Прямое сравнение, выполненное при помощи этого микроскопа, показало, что морфология указанных микрокристаллов, по-видимому, подобна морфологии производимых промышленностью микрокристаллов ΝΡΗ свиньи, которые в научной литературе описаны как палочкообразные микрокристаллы. Размер этих микрокристаллов также подобен производимым промышленностью микрокристаллам ΝΡΗ, средняя длина которых обычно равна примерно 5 мкм. Средняя длина промышленно производимых микрокристаллов ΝΡΗ составляет от 1 до 40 мкм.

Однако микрокристаллы по настоящему изобретению совершенно неожиданно отличаются от кристаллов инсулина ΝΡΗ растворимостью и продолжительностью действия. В частности, микрокристаллы по настоящему изобретению растворяются гораздо медленнее в имитированных физиологических условиях, чем кристаллы инсулина ΝΡΗ, и характеризуются более продолжительным и ровным профилем регулирования содержания глюкозы в крови по сравнению с инсулином ΝΡΗ. Это продемонстрировано нижеследующими экспериментами.

Установлено, что продолжительность действия некоторых производных белков в растворимой форме существленно не отличается от обычного инсулина человека. В экспериментах использовали три группы животных. Всем животным в первой группе вводили дозу (0,75 нмоль/кг) гумулина® В (Иитийи® В) (растворимый инсулин человека), всем животным во вто рой группе вводили дозу (0,75 нмоль/кг) растворимого В29-№-октаноилинсулина человека (С8-Ы) и всем животным в третьей группе вводили дозу (0,75 нмоль/кг) растворимого В29Νε-деканоилинсулина человека (С10-Ы) . Эти эксперименты выполняли, в основном, так же, как это описано в примере 5, причем в каждой группе было по пять собак. Белки вводили подкожно. Полученные концентрации глюкозы в крови приведены в нижеследующей таблице.

Таблица 1. Концентрации глюкозы в крови до и после введения гумулина В, растворимого В29-№-октаноилинсулина человека (С8-Ы) или растворимого В29-№-деканоилинсулина человека (С10-Ы) здоровым собакам, которым одновременно вводили соматостатин, чтобы вызвать временное диабетическое состояние. Приведенные величины представляют собой среднее значение ± стандартную ошибку.

Время, ч	Концентрация глюкозы в крови, мг/дл
Гумулин® В	Растворимый С8-Й1	Растворимый С10-Й1
-0,5	110±2	115±4	108±2
0	101±2	101±7	96±4
0,5	83±5	80±5	85±6
1	54±6	52±4	70±5
1,5	49±4	51±2	57±4
2	48±4	51±2	52±3
2,5	55±4	60±3	56±4
3	59±2	65±4	58±4
3,5	65±2	73±5	63±4
4	71±2	85±6	68±4
5	87±2	110±8	79±3
6	104±3	124±4	91±7
7	119±8	145±14	106±8
8	144±5	153±16	119±11

Эти данные ясно показывают, что растворимый В29-№-октаноилинсулин человека и В29-№-деканоилинсулин человека, вводимые подкожно здоровым собакам, у которых было вызвано временное диабетическое состояние, обеспечивают резкое снижение содержания глюкозы по сравнению с результатами, полученными при использовании растворимого инсулина человека. Наиболее интересным является то, что растворимый В29-№-октаноилинсулин человека действует гораздо быстрее и менее продолжительно, чем инсулин человека.

Во втором эксперименте было установлено, что скорость растворения сокристаллов инсулина и В29-№-октаноилинсулина человека, полученных по настоящему изобретению, является значительно более длительной, чем у промышленно производимого инсулина ΝΡΗ свиньи. Этот результат явился особенно неожиданным в свете приведенных выше данных. Скорость растворения можно измерить хорошо известными способами [Отайат апй Ротегоу, 1. Рйатт. Рйагтасо1. 36:427-430 (1983), модифицированными Эе Гейррщ М.В. апй Ргапк, В., европейский патент № 735048] или способом, приведенным в этом описании изобретения.

Скорость растворения микрокристаллов инсулина ΝΡΗ свиньи измеряют, помещая 5 мкл И100 инсулина ΝΡΗ свиньи в 100 мл физиологического раствора с фосфатным буфером Дульбекко (без кальция или магния), находящегося в квадратной кварцевой кювете с длиной пути 1 см при температуре 22°С. Этот раствор перемешивают с постоянной скоростью при помощи магнитной мешалки кюветы. Измерения оптической плотности производят при 320 нм через промежутки времени, равные 1 мин. Оптическая плотность при 320 нм соответствует свету, рассеиваемому нерастворимыми частицами, присутствующими в водной суспензии. Затем по мере растворения микрокристаллов оптическая плотность приближается к нулю. Микрокристаллы инсулина ΝΡΗ свиньи полностью растворяются примерно через 20 мин.

При помощи вышеописанного способа установлено, что скорость растворения кристаллов, состоящих из протамина, цинка и инсулина человека и не содержащих сокристаллизованного ацилированного инсулина человека, также равна примерно 20 мин. Эти кристаллы инсулина ΝΡΗ человека получены в соответствии с описываемым ниже способом получения № 1, за исключением того, что при его осуществлении вместо ацилированного белка использовано 7 частей инсулина человека. Данные, полученные в результате выполнения этого эксперимента, показаны на фиг. 1 пунктирной линией.

Сокристаллы по настоящему изобретению, состоящие из инсулина человека и В29-№октаноил-ЬукВ29-инсулина человека, получены в соответствии с описанными ниже способами получения № 2, 4 и 5. При осуществлении этих способов инсулин человека и ацилированный инсулин используют в массовых отношениях перед кристаллизацией, равных соответственно 3:1, 1:1 и 1:3.

Скорость растворения этих сокристаллов измеряли вышеописанным способом. Для этого 12 мкл суспензии сокристаллов, состоящих из протамина, цинка, В29-№-октаноил-ЬукВ29инсулина человека и инсулина человека, (содержащей не более чем 50 и/мл) вводят в 3 мл физиологического раствора с фосфатным буфером Дульбекко (без кальция или магния), находящегося в квадратной кварцевой кювете с длиной пути 1 см. Этот раствор перемешивают с вышеуказанной постоянной скоростью и при температуре 22°С. Данные, полученные в результате осуществления этого эксперимента, представлены на фиг. 1; эти данные показывают, что сокристаллы с отношением 3:1 растворяются в течение более 100 мин, сокристаллы с отношением 1:1 растворяются в течение более 150 мин и сокристаллы с отношением 1:3 не растворяются полностью даже через 400 мин.

Время, необходимое для изменения оптической плотности наполовину от исходного до конечного значения оптической плотности, определяется как !1/2. Значения !1/2 для этих препаратов приведены ниже в табл. 2.

Таблица 2. Значения !1/2 для растворения инсулина ΝΡΗ свиньи, инсулина ΝΡΗ человека и сокристаллов В29октаноилинсулина человека и инсулина человека

Определение	В29- Октаноилинсулин человека, %	Инсулин человека	Инсулин свиньи, %	Значение !1/2, мин
ΝΡΗ свиньи	0	0	100	6
ΝΡΗ человека	0	100	0	7
Сокристаллы 3:1	25	75	0	38
Сокристаллы 1:1	50	50	0	117
Сокристаллы 1:3	75	25	0	>400

Эти эксперименты показывают, что в физиологическом растворе с фосфатным буфером Дульбекко (без кальция и магния), который в некоторых отношениях имитирует тканевую жидкость, скорость растворения сокристаллов с отношениями компонентов 3:1, 1:1 и 1:3 значительно ниже аналогичного показателя для микрокристаллов ΝΡΗ свиньи. Эти эксперименты также показывают, что скорость растворения микрокристаллов, состоящих из протамина, цинка и инсулина человека, весьма схожа с аналогичным показателем для инсулина ΝΡΗ свиньи (илетин ΝΡΗ). Эти результаты далее показывают, что скорость растворения сокристаллов, состоящих из протамина, цинка, В29-№октаноил-ЬукО29-инсулина человека и обычного инсулина человека, зависит от отношения инсулина человека к В29-№-октаноил-ЬукВ29инсулину человека, присутствующему в сокристаллах, в частности скорость растворения сокристаллов, состоящих из протамина, цинка, В29-№-октаноил-ЬукВ29-инсулина человека и инсулина человека, снижается при уменьшении пропорции инсулина человека.

Другой способ измерения растворенного белка и производного белка использовали для сравнения скорости растворения вышеописанных микрокристаллов с отношением компонентов 1:3 с коммерческими препаратами инсулина ΝΡΗ человека, инсулина человека ультралент и инсулина крупного рогатого скота ультралент, а также для исследования влияния на скорость растворения изменения отношения белка к производному белку.

Препарат И100 (0,5 мл) суспендируют в 200 мл физиологического раствора с фосфатным буфером Дульбекко, имеющего рН 7,4, в аппарате для растворения с водяной рубашкой при 25°С. Буфер для растворения содержит также 1 мг/мл сывороточного альбумина человека, с тем чтобы предотвратить адсорбционные потери растворенных инсулинов. Среду растворения перемешивают при постоянной скорости, равной 180 об./мин. Через одинаковые промежутки времени отбирают 3,5 мл этого раствора и фильтруют его через фильтр 0,22 мкм с низким связыванием белка. Первые 0,5 мл фильтрата выбрасывают и следующие 1,5 мл фильтрата подкисляют 4 мл 5 н. раствора НС1 и анализируют при помощи ВЭЖХ. Концентрации растворенных инсулинов определяют на основании площадей пиков ВЭЖХ и выражают в процентах растворения в зависимости от времени, при этом 100% соответствуют общей площади инсулинов в нефильтрованных образцах. Если общая площадь нефильтрованных образцов незначительно уменьшается в зависимости от времени, то для вычисления процентного значения растворенного вещества в каждый период времени за 100% принимают значение с линейной поправкой. Результаты этих исследований представлены на фиг. 3 и 4.

Данные, приведенные на фиг. 3, показывают, что, чем больше доля производного белка в микрокристалле, тем медленнее скорость растворения. Данные, приведенные на фиг. 4, показывают, что микрокристалл с соотношением инсулина человека и В29-октаноилинсулина человека 1:3 растворяется значительно медленнее по сравнению с инсулином ΝΡΗ человека и инсулином человека ультралент. Важное значение имеет то, что микрокристаллы с отношением 1:3 имеют скорость растворения, схожую с аналогичным показателем инсулина крупного рогатого скота ультралент. Инсулин крупного рогатого скота ультралент в течение длительного времени считался почти идеальным инсулиновым препаратом пролонгированного действия благодаря длительному сохранению биологической активности и ровной фармакодинамической реакции после его введения. Таким образом, можно предположить, что эти микрокристаллы могут обладать такой же или более высокой активностью, чем инсулин крупного рогатого скота ультралент, при регулировании выделения основной глюкозы в течение продолжительных периодов времени.

Так как профиль продолжительности действия препаратов ΝΡΗ тесно связан со скоростью растворения микрокристаллов в подкожной тканевой жидкости, на основании этих экспериментов можно сделать вывод о том, что микрокристаллические композиции по настоящему изобретению обладают более продолжительным действием при подкожном введении субъектам, страдающим диабетом, чем существующие коммерческие препараты инсулина ΝΡΗ. Важно отметить, что эти результаты также показывают, что настоящее изобретение позволяет регулировать и даже оптимизировать продолжительность действия препарата у субъектов, изменяя отношение белка к производному белку.

Возможность изменять продолжительность действия путем изменения соотношений белка и производного белка имеет особо важное значение, если рассматривать эту проблему в историческом аспекте. Основным препятствием к созданию инсулиновых препаратов для регулиро вания секреции основной глюкозы было то, что продолжительность их действия неразрывно связана с молекулярными свойствами белка, такими как сродство к связыванию альбумина, изоэлектрическая точка или растворимость. Следствием этого явилось то, что только одна продолжительность действия была возможна для каждой молекулы или препарата, и единственным способом улучшения фармакокинетики была дальнейшая модификация молекулы.

Долговременной целью является создание систем доставки лекарственного средства с регулируемым высвобождением, в которых фармакокинетика может быть точно и удобно отрегулирована путем изменения матрицы препарата. На протяжении последних 15 лет многие научные и промышленные исследования в этой области были посвящены инсулину, однако, достижение регулируемого высвобождения оказалось нереальным из-за чрезвычайно узкого терапевтического индекса инсулина, необходимости его постоянного применения, а также экономических соображений, которые не позволяли создавать сложные и дорогостоящие способы и препараты.

Основным преимуществом настоящего изобретения является то, что оно позволяет создать систему с регулируемым высвобождением, в которой фармакокинетику высвобождения инсулина можно регулировать гораздо проще, чем в других предлагаемых методах регулируемого высвобождения. То есть нерастворимая композиция, содержащая белок инсулина и производный белок, предоставляет удобный способ регулировать скорость растворения и, как следствие этого, делает возможным регулируемое высвобождение инсулина. Не ограничиваясь какими-либо рамками, можно предположить, что в основе фармакологической эффективности нерастворимых композиций по настоящему изобретению лежит медленное высвобождение из композиции необходимого количества обычного белка и производного белка. Далее можно предположить, не ограничивая объем изобретения, что важной отличительной особенностью этого изобретения является полная или почти полная однородность нерастворимой композиции. Что касается микрокристаллов, то можно отметить, что все отдельные микрокристаллы в суспензии имеют практически одинаковое соотношение белка и производного белка. Это соотношение очень близко отражает отношение белка к производному белку, соединенных в растворе перед кристаллизацией. Кроме того, считается, что по мере растворения микрокристаллов высвобождается требуемое и заранее определенное количество белка и производного белка на протяжении всего времени растворения. Это явление имеет важное значение, так как оно ведет к постоянной, но более низкой скорости поступления в кровоток двух активных молекул с места инъекции. Для достижения этой цели особое внимание должно быть уделено способу получения композиций.

Настоящее открытие, состоящее в том, что можно кристаллизовать белок с производным белком и, таким образом, получить однородные сокристаллы, имеет важное значение с учетом сложности параметров, влияющих на кристаллизацию белка: специфические и неспецифические межмолекулярные взаимодействия, такие как связывание водорода, электростатические взаимодействия, гидрофобные взаимодействия, силы межмолекулярного взаимодействия, взаимоисключающие влияния объемов, растворимость и пространственный объем. Хотя научное понимание кристаллизации маленьких молекул является достаточно глубоким, в отношении макромолекул комплексов эта наука все еще носит, в основном, качественный характер, и современная практика строится на эмпирическом применении многочисленных способов кристаллизации.

Гидрофобный эффект предложен в качестве основной движущей силы для связывания белков |С1ю11иа, С. е! а1., №11иге 256:705-708 (1975)]. Кроме того, отмечена сильная корреляция между поверхностной гидрофобностью и белок-белковыми связями [Уоиид, Ь., е! а1., Рго!ет 8с1еисе 3:717-729 (1994)]. И все же с учетом сложности кристаллизации белков открытие того, что производные инсулины можно сокристаллизовывать с непроизводным белком в изоморфной или почти изоморфной форме в отношении нормального инсулина, является совершенно удивительным.

Сокристаллизация двух родственных терапевтических белков с целью модификации терапевтического поведения является новой концепцией. В значительной степени это происходит потому, что большая часть работы по кристаллизации белков направлена на создание больших, однородных монокристаллов, пригодных для исследования при помощи рентгеноструктурного анализа. Хотя сокристаллы белка известны в этой области, такие системы сокристаллов определяются как комплексы хозяин-субстрат, например белок и его рецептор, комплексы белка и ДНК и комплексы рецептора белка и лекарственного средства. Сокристаллы комплекса хозяин-субстрат существенно отличаются от сокристаллов по настоящему изобретению, так как здесь отсутствует комплекс, образованный между белком и производным белком.

Возможность прогнозирования пропорций белка и производного белка и однородности нерастворимых композиций по настоящему изобретению была продемонстрирована путем измерения (ВЭЖХ) концентраций белка и производного белка во время исследований по растворению двух препаратов микрокристаллов, которые были получены с использованием известных количеств инсулина человека (белка) и

В29-октаноилинсулина человека (производный белок). В первом препарате массовое отношение белка, добавляемого к производному белку, равно 1:3. Во втором препарате эта пропорция равна 55:45. В микрокристаллах с отношением 1:3 В29-октаноилинсулин человека составляет от около 73 до 76% общего белка для 14 измерений, выполняемых в течение 10 ч в условиях растворения, описанных выше для испытания на растворение. В этом случае также не наблюдалось отклонения данных.

В микрокристаллах с отношением 55:45 В29-октаноилинсулин человека составлял от около 43 до 47% общего белка для 9 измерений, выполняемых в течение примерно 3,75 ч в условиях растворения, описанных выше для испытания на растворение. Здесь также не наблюдалось отклонения данных.

Нерастворимые композиции по настоящему изобретению могут быть кристаллами с палочкообразной или неупорядоченной морфологией либо они могут быть аморфными осадками. Предпочтительные нерастворимые композиции содержат ацилированный инсулин или аналог ацилированного инсулина, ионы цинка, присутствующие в количестве от около 0,3 до около 0,7 моля на моль общего белка, фенольный консервант, выбираемый из группы, включающей фенол, м-крезол, о-крезол, п-крезол, хлоркрезол, метилпарабен или их смеси, количество которого относительно общего белка должно быть достаточным для стабилизации конформации гексамера Т2К3 или К6, и протамин, присутствующий в количестве от около 0,15 до около 0,7 моля на моль общего белка.

Предпочтительную группу аналогов инсулина, предназначенных для получения аналогов производного инсулина, используемых для создания нерастворимых композиций по настоящему изобретению, составляют инсулины животных, делеционные аналоги и аналоги со сдвигом р1. В более предпочтительную группу входят инсулины животных и делеционные аналоги. Делеционные аналоги являются еще более предпочтительными.

Другую предпочтительную группу аналогов инсулина, предназначенных для использования в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют аналоги мономерного инсулина. Особенно предпочтительными являются аналоги мономерного инсулина, в которых аминокислотный остаток в положении В28 является Акр, Ьук, Ьеи, Уа1 или А1а, аминокислотный остаток в положении В29 является Ьук или Рго, аминокислотный остаток в положении В10 является Ηίκ или Акр, аминокислотный остаток в положении В1 является Р1е, Акр либо он удален один или вместе с остатком в положении В2, аминокислотный остаток в положении В30 является ТЬг, А1а, 8ег или удален, и аминокислотный остаток в положении В 9 является 8ег или Азр; при условии, что остаток в положении В28 или В29 является Ьуз.

Другую предпочтительную группу аналогов инсулина, предназначенных для использования в настоящем изобретении, составляют аналоги, в которых изоэлектрическая точка аналога инсулина находится в пределах от около 7,0 до около 8,0. Эти аналоги определяются как «аналоги инсулина со сдвигом р1». Примерами аналогов инсулина со сдвигом р1 являются, например, АгдВ31, АгдВ32-инсулин человека, 61уА21, АгдВ31АгдВ32-инсулин человека, АгдА0, АгдВ31, АгдВ32-инсулин человека и АгдА0, 61уА21, АгдВ31, АгдВ32-инсулин человека.

Другую предпочтительную группу аналогов инсулина составляют ЬузВ28,РгоВ29инсулин человека (В28 означает Ьуз; В29 означает Рго); АзрВ28-инсулин человека (В28 означает Азр), АзрВ1 -инсулин человека, АгдВ31, АгдВ32-инсулин человека, АгдА0-инсулин человека, АзрВ1, С1иВ13-инсулин человека, А1аВ26-инсулин человека, С1уА21 -инсулин человека, дес(ТБгВ30)инсулин человека и С1уА21, АгдВ31,АгдВ32-инсулин человека.

Особенно предпочтительными аналогами инсулина являются ЬузВ28, РгоВ29-инсулин человека, дес(ТБгВ30)инсулин человека, АзрВ28-инсулин человека и А1аВ26-инсулин человека. Еще одним особенно предпочтительным аналогом инсулина является С1уА21, АгдВ31, АгдВ32-инсулин человека [ПогзсБид, М., патент США № 5656722, 12 августа 1997г.]. Наиболее предпочтительным аналогом инсулина является Ьу5В28, РгоВ29-инсулин человека.

Предпочтительными производными белками являются ацилированные белки, и предпочтительными ацилированными белками для получения микрокристаллов и препаратов по настоящему изобретению являются инсулин, ацилированный жирной кислотой, и аналоги инсулина, ацилированного жирной кислотой. Ацилированный жирной кислотой инсулин человека является особенно предпочтительным. Аналоги инсулина, ацилированного жирной кислотой, предпочтительны в равной степени.

Конкретная группа, используемая для получения производного инсулина, аналога инсулина и проинсулина (общее название белок), может быть любой химической частью молекулы, которая существенно не уменьшает биологическую активность белка, не является токсичной при связывании с белком и, что наиболее важно, уменьшает растворимость в воде, повышает липофильность или уменьшает растворимость комплексов цинка/протамина производного белка.

Одну предпочтительную группу ацилирующих частей составляют жирные кислоты, которые имеют прямую цепь и являются насыщенными. В эту группу входят метановая кислота (С1), этановая кислота (С2), пропановая кислота (С3), н-бутановая кислота (С4), н-пентановая кислота (С5), н-гексановая кислота (С6), н-гептановая кислота (С7), н-октановая кислота (С8), н-нонановая кислота (С9), н-декановая кислота (С10), н-ундекановая кислота (С11), н-додекановая кислота (С12), н-тридекановая кислота (С 13), н-тетрадекановая кислота (С 14), н-пентадекановая кислота (С 15), н-гексадекановая кислота (С16), н-гептадекановая кислота (С17) и н-октадекановая кислота (С18). Производными формами являются формил (С1), ацетил (С2), пропионил (С3), бутирил (С4), пентаноил (С5), гексаноил (С6), гептаноил (С7), октаноил (С8), нонаноил (С9), деканоил (С10), ундеканоил (С11), додеканоил (С12), тридеканоил (С13), тетрадеканоил (С14) или миристоил, пентадеканоил (С15), гексадеканоил (С16) или пальмитиновая кислота, гептадеканоил (С 17) и октадеканоил (С18) или стеариновая кислота.

Предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие четное число атомов углерода, то есть С2, С4, С6, С8, С10, С12, С14, С16 и С18 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие нечетное число атомов углерода, то есть С1, С3, С5, С7, С9, С11, С13, С15 и С17 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие более 5 атомов углерода, то есть С6, С7, С8, С9, С10, С11, С12, С13, С14, С15, С16, С17 и С18 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие менее 9 атомов углерода, то есть С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7 и С8 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие от 6 до 8 атомов углерода, то есть С6, С7 и С8 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие от 4 до 6 атомов углерода, то есть С4, С5 и С6 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие от 2 до 4 атомов углерода, то есть С2, С3 и С4 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие менее 6 атомов углерода, то есть С1, С2, С3, С4 и С5 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие менее 4 атомов углерода, то есть С1, С2 и С3 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие более 9 атомов углерода, то есть С10, С11, С12, С13, С14, С15, С16, С17 и С18 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие четное число и более 9 атомов углерода, то есть С10, С12, С14, С16 и С18 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие 12, 14 или 16 атомов углерода, то есть С12, С14 и С16 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие 14 или 16 атомов углерода, то есть С14 и С16 насыщенные жирные кислоты. Жирные кислоты с 14 атомами углерода являются особенно предпочтительными. Жирные кислоты с 16 атомами углерода также предпочтительны.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие от 4 до 10 атомов углерода, то есть С4, С5, С6, С7, С8, С9 и С10 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие четное число и от 4 до 10 атомов углерода, то есть С4, С6, С8 и С10 насыщенные жирные кислоты.

Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие 6, 8 или 10 атомов углерода. Жирные кислоты с 6 атомами углерода являются предпочтительными. Жирные кислоты с 8 атомами углерода являются особенно предпочтительными. Жирные кислоты с 10 атомами углерода также являются особенно предпочтительными.

Специалисту в этой области должно быть понятно, что более узкие предпочтительные группы можно получить, объединяя вышеописанные предпочтительные группы жирных кислот.

Другую предпочтительную группу ацилирующих частей молекулы составляют насыщенные жирные кислоты с разветвленной цепью. Жирная кислота с разветвленной цепью имеет, по крайней мере, две цепи. Длина цепи жирной кислоты с разветвленной цепью может быть определена по числу атомов углерода в цепи, начинающемся с атома углерода кислоты. Например, жирная кислота с разветвленной цепью, а именно 3-этил-5-метилгексановая кислота имеет три цепи длиной 5, 6 и 6 атомов углерода. В этом случае наибольшая цепь равна 6 атомам углерода. В качестве другого примера можно привести 2,3,4,5-тетраэтилоктановую кислоту, которая имеет пять цепей длиной 4, 5, 6, 7 и 8 атомов углерода. Наибольшая цепь равна 8 атомам углерода. Предпочтительную группу жирных кислот с разветвленной цепью составляют кислоты, имеющие от 3 до 10 атомов углерода в наибольшей цепи.

Ниже приведены типичные примеры насыщенных жирных кислот с разветвленной цепью, дающие представление о диапазоне жирных кислот, которые можно использовать в качестве ацилирующих частей белков при осуществлении настоящего изобретения: 2-метилпропионовая кислота, 2-метилмасляная кислота, 3метилмасляная кислота, 2,2-диметилпропионовая кислота, 2-метилпентановая кислота, 3-метилпентановая кислота, 4-метилпентановая кислота, 2,2-диметилмасляная кислота, 2,3-диметилмасляная кислота, 3,3-диметилмасляная кислота, 2-этилмасляная кислота, 2-метилгексановая кислота, 5-метилгексановая кислота, 2,2диметилпентановая кислота, 2,4-диметилпентановая кислота, 2-этил-3-метилмасляная кислота,

2-этилпентановая кислота, 3-этилпентановая кислота, 2,2-диметил-3-метилмасляная кислота, 2метилгептановая кислота, 3-метилгептановая кислота, 4-метилгептановая кислота, 5-метилгептановая кислота, 6-метилгептановая кислота,

2.2- диметилгексановая кислота, 2,3-диметилгек- сановая кислота, 2,4-диметилгексановая кислота, 2,5-диметилгексановая кислота, 3,3-диметилгексановая кислота, 3,4-диметилгексановая кислота, 3,5-диметилгексановая кислота, 4,4-диметилгексановая кислота, 2-этилгексановая кислота, 3-этилгексановая кислота, 4-этилгексановая кислота, 2-пропилпентановая кислота, 2этилгексановая кислота, 3-этилгексановая кислота, 4-этилгексановая кислота, 2-(1-пропил)пентановая кислота, 2-(2-пропил)пентановая кислота, 2,2-диэтилмасляная кислота, 2,3,4-триметилпентановая кислота, 2-метилоктановая кислота, 4-метилоктановая кислота, 7-метилоктановая кислота, 2,2-диметилгептановая кислота,

2.6- диметилгептановая кислота, 2-этил-2-метил- гексановая кислота, 3-этил-5-метилгексановая кислота, 3-(1-пропил)гексановая кислота, 2-(2бутил)пентановая кислота, 2-(2-(2-метилпропил))пентановая кислота, 2-метилнонановая кислота, 8-метилнонановая кислота, 6-этилоктановая кислота, 4-(1-пропил)гептановая кислота, 5(2-пропил)гептановая кислота, 3-метилундекановая кислота, 2-пентилгептановая кислота,

2.3.4.5.6- пентаметилгептановая кислота, 2,6-диэтилоктановая кислота, 2-гексилоктановая кислота, 2,3,4,5,6,7-гексаметилоктановая кислота,

3.3- диэтил-4,4-диэтилгексановая кислота, 2гептилнонановая кислота, 2,3,4,5-тетра-этилоктановая кислота, 2-октилдекановая кислота и 2(1-пропил)-3-(1-пропил)-4,5-диэтил-6-метилгептановая кислота.

Другую предпочтительную группу ацилирующих частей составляют циклические алкильные кислоты, имеющие от 5 до 24 атомов углерода, в которых одна или несколько циклических алкильных частей имеют 5-7 атомов углерода. Ниже приведены типичные примеры таких циклических алкильных кислот, дающие представление о диапазоне кислот, которые можно использовать в качестве ацилирующих частей белков при осуществлении настоящего изобретения: циклопентилмуравьиная кислота, циклогексилмуравьиная кислота, 1-циклопентилуксусная кислота, 2-циклогексилуксусная кислота, 1,2-дициклопентилуксусная кислота и тому подобные.

Предпочтительную группу производных белков, предназначенных для использования в нерастворимых композициях по настоящему изобретению, составляют моноацилированные белки. Наиболее предпочтительным является моноацилирование в положении ε-аминогруппы. Для инсулина предпочтительным является моноацилирование в положении ЬукВ29. Подобным образом, для определенных аналогов инсулина, таких как аналог ЬукВ28,РгоВ29 инсулина человека, наиболее предпочтительным является моноацилирование в положении ε-аминогруппы ЬукВ28. Моноацилирование в положении α-аминогруппы В-цепи (В1) также является предпочтительным. Не менее предпочтительным является моноацилирование в положении α-аминогруппы А-цепи (А1).

Другую предпочтительную группу ацилированных белков, предназначенных для использования в нерастворимых композициях по настоящему изобретению, составляют диацилированные белки. Диацилирование может быть произведено, например, в положении ε-аминогруппы Ьук и в положении α-аминогруппы Вцепи, в положении ε-аминогруппы Ьук и в положении α-аминогруппы А-цепи или в положении α-аминогруппы А-цепи и в положении αаминогруппы В-цепи.

Другую предпочтительную группу ацилированных белков, предназначенных для использования в нерастворимых композициях по настоящему изобретению, составляют триацилированные белки. Триацилированными белками являются белки, ацилированные в положении εаминогруппы Ьук, в положении α-аминогруппы В-цепи и в положении α-аминогруппы А-цепи.

Кроме того, можно использовать ацилированные белки, представляющие собой смесь моноацилированных и диацилированных белков.

Аналогичным образом можно использовать ацилированные белки, представляющие собой смесь моноацилированных и триацилированных белков.

Другую предпочтительную группу ацилированных белков составляет смесь диацилированных и триацилированных белков.

Кроме того, можно использовать ацилированные белки, представляющие собой смесь моноацилированных, диацилированных и триацилированных белков.

Ниже приведены некоторые ацилированные жирной кислотой белки, используемые в микрокристаллах по настоящему изобретению, которые дают представление об объеме настоящего изобретения. Этот список является иллюстративным, и тот факт, что в нем не указан какой-либо конкретный белок, ацилированный жирной кислотой, не означает, что содержащий его микрокристалл не входит в объем настоящего изобретения.

В29-№-формилинсулин человека;

В1-Nα-формилинсулин человека; Α1-Nα-формилинсулин человека;

В29-№-формил-, В1-№-формилинсулин человека;

В29-№-формил-, А1-№-формилинсулин человека;

А1-№-формил-. В1-Να-формилинсулин человека;

В29-№-формил, А1-Να-формил, Β1-Ναформилинсулин человека:

В29-№-ацетилинсулин человека;

ΒΙ-Να-ацетилинсулин человека;

ΑΙ-Να-ацетилинсулин человека;

В29-№-ацетил-, ΒΙ-Να-ацетилинсулин человека;

В29-№-ацетил-, ΑΙ-Να-ацетилинсулин человека;

ΑΙ-Να-ацетил-, ΒΙ-Να-ацетилинсулин человека;

Β29-Nε-ацетил-, А1-Να-ацетил-, Β1-Ναацетилинсулин человека;

В29-№-пропионилинсулин человека; ΒΙ-Να-пропионилинсулин человека; ΑΙ-Να-пропионилинсулин человека;

Β29-Nε-пропионил-, Β Ι-Να-пропионилинсулин человека;

Β29-Nε-пропионил-, ΑΙ-Να-пропионилинсулин человека;

ΑΙ-Να-пропионил-, ΒΙ-Να-пропионилинсулин человека;

В29-№-пропионил-, ΑΙ-Να-пропионил-,

ΒΙ-Να-пропионилинсулин человека;

В29-№-бутирилинсулин человека;

ΒΙ-Να-бутирилинсулин человека;

ΑΙ-Να-бутирилинсулин человека;

Β29-Nε-бутирил-, Β1 -Να-бутирилинсулин человека;

Β29-Nε-бутирил-, А1-Ыое-бутирилинсулин человека;

ΑΒΝα-бутирил-, Β1 -Να-бутирилинсулин человека;

Β29-Nε-бутирил-, ΑΒΝα-бутирил-, Β1-Ναбутирилинсулин человека;

В29-№-пентаноилинсулин человека;

Β1-Nα-пентаноилинсулин человека;

Α1-Nα-пентаноилинсулин человека;

В29-№-пентаноил-, Β 1-Nα-пентаноилинсулин человека;

Β29-Nε-пентаноил-, Α1-Nα-пентаноилинсулин человека;

Α1-Nα-пентаноил-, Β1 -Να-пентаноилинсулин человека;

В29-№-пентаноил-, Α1-Nα-пентаноил-,

Β1-Nα-пентаноилинсулин человека;

Β29-Nε-гексаноилинсулин человека;

Β1-Nα-гексаноилинсулин человека;

Α1-Nα-гексаноилинсулин человека;

Β29-Nε-гексаноил-, Β 1-Nα-гексаноилинсулин человека;

Β29-Nε-гексаноил-, Α1-Nα-гексаноилинсулин человека;

Α1-Nα-гексаноил-, Β1 -Να-гексаноилинсулин человека;

Β29-Nε-гексаноил-, Α1-Nα-гексаноил-, Β1Να-гексаноилинсулин человека;

В29-№-гептаноилинсулин человека;

Β1-Nα-гептаноилинсулин человека;

Α1-Nα-гептаноилинсулин человека;

В29-№-гептаноил-, Β 1-Nα-гептаноилинсулин человека;

В29-№-гептаноил-, Α1-Nα-гептаноилинсулин человека;

Α1-Nα-гептаноил-, Β 1-Nα-гептаноилинсулин человека;

Β29-Nε-гептаноил-, Α1-Nα-гептаноил-, Β1Να-гептаноилинсулин человека;

В29-№-октаноилинсулин человека;

Β1-Nα-октаноилинсулин человека;

Α1-Nα-октаноилинсулин человека;

Β29-Nε-октаноил-, Β 1-Nα-октаноилинсулин человека;

В29-№-октаноил-, Α1-Nα-октаноилинсулин человека;

Α1-Nα-октаноил-, Β 1-Nα-октаноилинсулин человека;

В29-№-октаноил-, Α1-Nα-октаноил-, Β1Να-октаноилинсулин человека;

В29-№-нонаноилинсулин человека;

Β1-Nα-нонаноилинсулин человека;

Α1-Nα-нонаноилинсулин человека;

В29-№-нонаноил-, Β 1-Nα-нонаноилинсулин человека;

Β29-Nε-нонаноил-, Α1-Nα-нонаноилинсулин человека;

А1 -Να-нонаноил-, Β1 -Να-нонаноилинсулин человека;

Β29-Nε-нонаноил-, А1-Να-нонаноил-, Β1Να-нонаноилинсулин человека;

В29-№-деканоилинсулин человека;

Β1-Nα-деканоилинсулин человека;

Α1-Nα-деканоилинсулин человека;

В29-№-деканоил-, Β1 -Να-деканоилинсулин человека;

Β29-Nε-деканоил-, Α1-Nα-деканоилинсулин человека;

Α1-Nα-деканоил-, Β1 -Να-деканоилинсулин человека;

Β29-Nε-деканоил-, Α1-Nα-деканоил-, Β1Να-деканоилинсулин человека;

Β29-Nε-ундеканоилинсулин человека;

Β1-Nα-ундеканоилинсулин человека;

Α1-Nα-ундеканоилинсулин человека; В29-№-додеканоилинсулин человека;

Β1-Nα-додеканоилинсулин человека;

Α1-Nα-додеканоилинсулин человека; В29-№-тридеканоилинеулин человека ; Β1-Nα-тридеканоилинсулин человека; Α1-Nα-тридеканоилинсулин человека; В29-№-тетрадеканоилинсулин человека;

Β1-Nα-тетрадеканоилинсулин человека;

Α1-Nα-тетрадеканоилинсулин человека;

В29-№-пентадеканоилинсулин человека ;

Β1-Nα-пентадеканоилинсулин человека;

Α1-Nα-пентадеканоилинсулин человека;

В29-№-гексадеканоилинсулин человека;

Β1-Nα-гексадеканоилинсулин человека;

ΑΙ-Να-гексадеканоилинсулин человека; В29-№-гептадеканоилинсулин человека ; ΒΙ-Να-гептадеканоилинсулин человека; ΑΙ-Να-гептадеканоилинсулин человека; В29-№-октадеканоилинсулин человека; ΒΙ-Να-октадеканоилинсулин человека ; ΑΙ-Να-октадеканоилинсулин человека; аналог В28-№-формил-Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог Β 1-Ыа-формил-Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог А1-На-формил-Бу5В28.РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-формил-, ΒΙ-Να-формилЬу§В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-формил-, А1-Ыа-формилЬу§В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог ΑΙ-Να-формил-, В Ι-Να-формилЬу§В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-формил-, ΑΙ-Να-формил-, В 1-Ыа-формил-Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-ацетил-Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В 1-Nα-ацетил-^у8Β28,Р^оΒ29-инсулина человека;

аналог А1-Nα-ацетил-^у8Β28,Р^оΒ29-инсулина человека;

аналог В28-№-ацетил-, Β1-Nα-ацетилЬу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-ацетил-, А1-Nα-ацетилЬу5В28, РгоВ29-инсулина человека;

аналог ΑΙ-Να-ацетил-, Β1-Nα-ацетилЬу5В28, РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-ацетил-, ΑΙ-Να-ацетил-, В1^/.-3^^14^3^28. Рго29-инсулина человека;

аналог В28-№-пропионил-Ьу8В28,РгоВ29инсулина человека;

аналог Β1-Nα-пропионил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог А1-Nα-пропионил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог В28-№-пропионил-, В1-Ы/-пропионил-Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-пропионил-, Α1-Ναпропионил-Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог Α1-Nα-пропионил-, Β1-Ναпропионил-Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-пропионил-, Α1-Nα-пропионил-, Β 1-Nα-пропионил-^у8Β28,Р^оΒ29-инсулина человека;

аналог В28-№-бутирил-Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В1-ΝВ28, РгоВ29-инсулина человека;

аналог Α1-Nα-бутирил-Β28,Р^оΒ29-инсулина человека;

аналог В28-№-бутирил-, Β1-Nα-бутирилЬу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-бутирил-, А1-Nα-бутирилЬу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог Α1-Nα-бутирил-, В 1-^-671^^Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-бугирил-, Α1-Nα-бутирил-, Β1-Nα-бутирил-^у8Β28,Р^оΒ29-инсулина человека;

аналог В28-№-пентаноил-Ьу5В28,РгоВ29инсулина человека;

аналог Β1-Nα-пентаноил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог А1-Nα-пентаноил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог В28-№-пентаноил-, В 1-^-^4^ ноил-Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-пентаноил-, А1-Nα-пентаноил-Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог ΑΙ-Να-пентаноил-, В 1-^-^4^ ноил-Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-пентаноил-, Α1-Nα-пентаноил-, Β 1-Nα-пентаноил-^у8Β28,Р^оΒ29-инсулина человека;

аналог В28-№-гексаноил-Ьу5В28,РгоВ29инсулина человека;

аналог В 1-Nα-гексаноил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог А1-Nα-гексаноил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог В28-№-гексаноил-, Β1-Nα-гексаноил-ЬукВ 28,РгоВ 29-инсулина человека;

аналог В28-№-гексаноил-, Α1-Nα-гексаноил-^у8Β28,Р^оΒ 29-инсулина человека;

аналог Α1-Nα-гексаноил-, Β1-Nα-гексаноил-ЬукВ 28,РгоВ 29-инсулина человека;

аналог В28-№-гексаноил-, ΑΙ-Να-гексаноил-, Β 1-Nα-гексаноил-^у8Β28,Ρ^оΒ29-инсулина человека;

аналог Β28-Nε-гептаноил-^у8Β28,Ρ^оΒ29инсулина человека;

аналог В 1-Nα-гептаноил-^у8Β28,Ρ^оΒ29-инсулина человека;

аналог А1-Nα-гептаноил-^у8Β28,Ρ^оΒ29-инсулина человека;

аналог В28-№-гептаноил-, Β1-Nα-гептаноил-ЬукВ 28,РгоВ 29-инсулина человека;

аналог В28-№-гептаноил-, Α1-Nα-гептаноил-^у8Β28,Р^оΒ 29-инсулина человека;

аналог Α1-Nα-гептаноил-, Β1-Nα-гептаноил-ЬукВ 28,РгоВ 29-инсулина человека;

аналог В28-№-гептаноил-, Α1-Nα-гептаноил-, Β1 -Nα-гептаноил-^у8Β28,Ρ^оΒ29-инсулина человека;

аналог Β28-Nε-октаноил-^у8Β28,Ρ^оΒ29-инсулина человека;

аналог В 1-Nα-октаноил-^у8Β28,Ρ^оΒ29-инсулина человека;

аналог А1-Nα-октаноил-^у8Β28,Р^оΒ29-инсулина человека;

аналог В28-№-октаноил-, Β1-Nα-октаноил-ЬукВ 28,РгоВ 29-инсулина человека;

аналог В28-№-октаноил-, ΑΙ-Να-октаноил-Ьу8В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог ΑΙ-Να-октаноил-, ΒΙ-Να-октаноилЬу§В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-октаноил-, ΑΙ-Να-октаноил-, В1 -Nα-октаноил-^у8Β28,Р^оΒ29-инсулина человека;

аналог В28-№-нонаноил-Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В 1-№/.-нонаноил-Ру5В28.РгоВ29инсулина человека;

аналог Α1-Nα-нонаноил-^у8Β28,Р^оΒ29-инсулина человека;

аналог В28-№-нонаноил-, В1-№/.-нонаноил-Ьу§В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-нонаноил-, ΑΙ-Να-нонаноил-Ьу§В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог ΑΙ-Να-нонаноил-, ΒΙ-Να-нонаноил-Ьу§В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-нонаноил-, ΑΙ-Να-нонаноил-, В1 -Να-нонаноил-Ьу5В28. Р гоВ 29-инсулина человека;

аналог В28-№-деканоил-Ьу5В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В 1-Nα-деканоил-^у8Β28,Р^оΒ29-инсулина человека;

аналог А 1-№/.-деканоил-Ру5В28. РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-деканоил-, В Ι-Να-деканоил-Ьу§В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-деканоил-, ΑΙ-Να-деканоил-Ьу§В28, РгоВ29-инсулина человека;

аналог ΑΙ-Να-деканоил-, В Ι-Να-деканоилЬу§В28,РгоВ29-инсулина человека;

аналог В28-№-деканоил-, ΑΙ-Να-деканоил-, В1 -Nα-деканоил-^у8Β28,Р^оΒ29-инсулина человека;

аналог В28-№-ундеканоил-Ьу5В28,РгоВ29инсулина человека;

аналог Β1-Nα-ундеканоил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог Α1-Nα-ундеканоил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог В28-№-додеканоил-Ьу5В28,РгоВ29инсулина человека;

аналог Β1-Nα-додеканоил-^у8Β29,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог Α1-Nα-додеканоил-^у8Β29,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог В28-№-1ридеканоил-Ьу5В29,РгоВ29инсулина человека;

аналог В 1-Nα-тридеканоил-^у8Β29,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог А 1-Nα-тридеканоил-^у8Β29, РгоВ29инсулина человека;

аналог В28-№-тетрадеканоил-Ьу8В29,РгоВ29инсулина человека;

аналог В 1-Nα-тетрадеканоил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог Α1-Nα-тетрадеканоил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог В28-№-иентадеканоил-Ьу5В28,РгоВ29инсулина человека;

аналог В1 -Nα-иентадеканоил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог Α1-Nα-иентадеканоил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог В28-№-гексадеканоил-Ьу5В28,РгоВ29инсулина человека;

аналог В1 -Nα-гексадеканоил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог Α1-Nα-гексадеканоил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог В28-№-гептадеканоил-Ьу5В28,РгоВ29инсулина человека;

аналог В1 -Nα-геитадеканоил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог Α1-Nα-гептадеканоил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог В28-№-октадеканоил-Ьу5В28,РгоВ29инсулина человека;

аналог В 1-Nα-октадеканоил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

аналог Α1-Nα-октадеканоил-^у8Β28,Р^оΒ29инсулина человека;

Β29-Nε-иентаноил-61уΑ21, АгдВ31, АгдВ32инсулин человека;

Β1-Nα-гексаноил-61уΑ21,Α^дΒ31,Α^дΒ32инсулин человека;

Α1-Nα-геитаноил-61уΑ21,Α^дΒ31,Α^дΒ32инсулин человека;

В29-№-октаноил-, В1 -№/.-октаноил-61у А21, АгдВ31,АгдВ32-инсулин человека;

В29-№-ироиионил-, Α1-Nα-ироиионил61)021^1^31^1^3241^4114 человека;

Α1-Nα-ацетил-, В 1-№/.-ацетил-61уА21.

АгдВ31,АгдВ32-инсулин человека;

В29-№-формил-, Α1-Nα-формил-, ВТ-Ναформил-61уА21,АгдВ31,АгдВ32-инсулин человека;

В29-№-формил-дес(ТугВ26)инсулин человека;

В 1-^-ацетил-А5рВ28-инсулин человека;

Β29-Nε-ироиионил-, Α1-Nα-ироиионил-, В1М/.-пропионил-АщВ 1, А§рВ3, А§рВ21-инсулин человека;

Α1-Nα-бутирил-Α8рΒ 10-инсулин человека; В29-№-пентаноил-61уА21-инсулин человека;

В 1-№/.-гексаноил-61уА21-инсулин человека;

А 1-№/.-гептаноил-61уА21-инсулин человека;

В29-№-октаноил-, В1 -Nα-октаноил-61уΑ21 инсулин человека;

В29-№-пропионил-, Α1-Nα-ироиионил61уΑ21-инсулин человека;

Α1-Nα-ацетил-, В 1-№/.-ацетил-61уА21-инсулин человека;

В1 -Να-бутирилА1-Ν а-бутирилВ1 -Να-бутирилВ29-№-формил-, А1-Να-формил-, Β1-Ναформил-С1уА21-инсулин человека;

В29-№-бутирил-дес(ТйгВ30)инсулин человека;

В1-№/.-бутирил-дес(Т11гВ30)инсулин человека;

А1-№/.-бутирил-дес(Т11гВ30)инсулин человека;

В29-№-бутирил-, дес(ТйгВ30)инсулин человека;

В29-№-бутирил-, дес(ТйгВ30)инсулин человека;

Α1-Ν α-бутирил-, дес(ТйгВ30)инсулин человека;

В29-№-бутирил-, А1-№/.-бутирил-. В1-№/.бутирил-дес(ТйгВ30)инсулин человека.

Предпочтительными являются водные композиции, содержащие воду в качестве главного растворителя. Особенно предпочтительными являются водные суспензии, в которых растворителем является вода.

Композиции по настоящему изобретению предназначены для лечения пациентов, страдающих диабетом или гипергликемией. Препараты по настоящему изобретению обычно содержат производный белок в концентрациях от около 1 до около 10 мг/мл. Препараты по настоящему изобретению, содержащие продукты инсулина, обычно оценивают по числу единиц активности инсулина (ед/мл), например И40, И50, И100 и так далее, что соответствует примерно 1,4, 1,75 и 3,5 мг/мл препарата. Дозу, способ введения и число введений в день определяет лечащий врач с учетом таких факторов, как лечебные цели, характер и причина заболевания, пол и масса тела пациента, уровень физической подготовки, пищевые привычки, способ введения, и других факторов, хорошо известных квалифицированному врачу. Дневная доза в широких пределах составляет от около 1 до около 6 нмоль/кг массы тела (считается, что 6 нмоль эквивалентны примерно 1 единице активности инсулина). В современной инсулинотерапии обычно применяется доза от около 2 до около 3 нмоль/кг.

Врач, обладающий необходимой квалификацией в области лечения диабета, может выбрать терапевтически наиболее приемлемый способ введения препаратов по настоящему изобретению. Парентеральные способы введения являются предпочтительными. Типичными способами парентерального введения суспензионных препаратов инсулина являются подкожные и внутримышечные инъекции. Композиции и препараты по настоящему изобретению можно также вводить назальным, трансбуккальным, легочным или глазным способами.

В качестве изотонического агента предпочтителен глицерин в концентрации от 12 до 25 мг/мл. Для регулирования изотоничности еще предпочтительнее использовать глицерин в концентрации от около 15 до около 17 мг/мл.

М-крезол и фенол или их смеси являются предпочтительными консервантами в препаратах по настоящему изобретению.

Инсулин, аналоги инсулина или проинсулины, используемые для получения производных белков, можно получить любым известным методом синтеза пептида, включая классические методы (растворение, твердофазные методы, полусинтетические методы и недавно получившие признание методы рекомбинантных ДНК.) См., например. Сйапсе, В.Е., е! а1., патент США № 5514646, 7 мая 1996 г.; публикация ЕРО № 383472, 7 февраля 1996 г.; Вгапде, 1.1. V., е! а1., публикация ЕРО № 214826, 18 марта 1987 г.; и Ве1ада)е, Ρ.Μ., е! а1., патент США № 5304473, 19 апреля 1994 г., в которых описаны способы получения разных проинсулинов и аналогов инсулина. Эти работы включены в это описание изобретения в качестве ссылки.

Производные белки обычно получают методами, известными в этой области. В вышеуказанных публикациях, посвященных производным белкам, описаны приемлемые методы получения производных белков. Эти публикации включены в это описание изобретения в качестве ссылки на методы получения производных белков. Чтобы получить ацилированный белок, исходный белок подвергают взаимодействию с активированной органической кислотой, такой как активированная жирная кислота. Активированные жирные кислоты являются производными обычно используемых ацилирующих агентов и включают активированные сложные эфиры жирных кислот, галогенангидриды жирных кислот, активированные амиды жирных кислот, например производные активированного азолида [Напкеп, Б.В., публикация νίΡΟ № 98/02460, 22 января 1998 г.] и ангидриды жирных кислот. Использование активированных сложных эфиров, в частности Ν-гидроксисукцинимидоэфиров жирных кислот, является особенно предпочтительным способом ацилирования свободной аминокислоты жирной кислотой. Бар1бо!, е! а1., описывают способ получения Ν-гидроксисукцинимидоэфиров и их применение для получения Ν-лауроилглицина, Ν-лауроил-Бсерина и Ν-лауроил-Ь-глутаминовой кислоты. Термин активированный сложный эфир жирной кислоты означает жирную кислоту, которая была активирована обычными методами, известными в этой области [Кюгбап, ЕЕ. апб Vа11ее, В.Б., Ме1йобк ш Епхуто1оду, ΧΧν:494499 (1972); Бар1бо!, Υ., е! а1., 1. Б1р1б Век. 8:142145 (1967)]. Гидроксибензотриазид (НОВТ), Νгидроксисукцинимид и их производные широко используются для получения активированных кислот, применяемых для синтеза пептидов.

Для избирательного ацилирования ε-аминогруппы можно использовать разные защит43 ные группы, блокирующие α-аминогруппы во время осуществления реакции сочетания. У специалиста в этой области не вызовет затруднений выбор приемлемой защитной группы, в частности, такой группой может быть пметоксибензоксикарбонил (ртΖ). ε-Аминогруппу предпочтительно ацилируют в соответствии с одностадийным синтезом без использования защитных групп для аминогруппы. Способ избирательного ацилирования в положении Νεаминогруппы остатка Ьук описан в заявке на патент Вакег, ТС., е! а1., патент США № 5646242, выданный 8 июля 1997 г., который полностью включен в это описание изобретения в качестве ссылки. Способ получения сухого порошка ацилированного белка рассмотрен в заявке на патент Вакег, ТС. е! а1., патент США № 5700904, выданный 23 декабря 1997 г., который полностью включен в это описание изобретения в качестве ссылки.

Цинк, используемый в препаратах по настоящему изобретению, прежде всего, служит для облегчения процесса получения гексамеров Ζι·ι(ΙΙ) белка и производного белка, отдельно в виде смешанных гексамеров или вместе в виде гибридных гексамеров. Цинк облегчает получение гексамеров инсулина и аналогов инсулина. Цинк стимулирует образование гексамеров производного инсулина и аналогов инсулина. Чтобы получить гексамер, показатель рН раствора, содержащего белок или производный белок либо оба белка вместе, доводят до нейтрального значения в присутствии ионов Ζ^ΙΙ) или добавляют Ζ^ΊΙ) после того, как показатель рН будет доведен до нейтрального значения.

Для достижения эффективного выхода микрокристаллов или аморфного осадка молярное отношение цинка к общему белку в микрокристалле и аморфном осадке по настоящему изобретению доводят до нижнего предела, равного примерно 0,33, то есть вводят примерно два атома цинка на гексамер, необходимые для эффективной гексамеризации. Композиция, состоящая из микрокристаллов и аморфного осадка, предпочтительно имеет от около 2 до около 4-6 атомов цинка при отсутствии соединения, конкурирующего с инсулином за связывание цинка. В присутствии соединения, конкурирующего с белком за связывание цинка, такого как цитрат или фосфат, можно использовать даже большее количество цинка. Для усиления гексамеризации может потребоваться избыток цинка, превышающий минимальное количество, необходимое для эффективной гексамеризации. Кроме того, избыток цинка, превышающий минимальное количество, может присутствовать в препарате по настоящему изобретению для улучшения химической и физической стойкости, для улучшения суспендируемости и, возможно, для дальнейшего увеличения времени действия. Поэтому существует достаточно ши рокий диапазон отношений цинк: белок, используемых в нерастворимых композициях, способах и препаратах по настоящему изобретению.

В соответствии с настоящим изобретением цинк присутствует в препарате в количестве от около 0,3 до около 7 молей на моль общего белка и более предпочтительно от 0,3 до около 1,0 моля общего белка. Отношение цинка к производному белку предпочтительнее всего составляет от около 0,3 до около 0,7 моля атомов цинка на моль общего белка. Еще более предпочтительным является отношение цинка к общему белку от около 0,30 до около 0,55 моля атомов цинка на моль общего белка. В случае более сильных препаратов на основе цинка, которые подобны препаратам ΡΖΙ, отношение цинка составляет от около 5 до около 7 молей цинка на моль общего белка.

Соединение цинка, дающее цинк для настоящего изобретения, может быть любым фармацевтически приемлемым соединением цинка. В этой области хорошо известны способы введения цинка в инсулиновые препараты и фармацевтически приемлемые источники цинка. Предпочтительными соединениями цинка, дающими цинк для осуществления настоящего изобретения, являются хлорид цинка, ацетат цинка, цитрат цинка, оксид цинка и нитрат цинка.

Для получения микрокристаллов и осадков по настоящему изобретению необходимо комплексообразующее соединение. Комплексообразующее соединение должно присутствовать в достаточных количествах, чтобы вызвать значительное осаждение и кристаллизацию гексамеров. Такие количества можно определить для конкретного препарата с определенным комплексообразующим соединением при помощи простых экспериментов по титрованию. Концентрацию комплексообразующих соединений нужно довести до требуемого значения, чтобы в фазе раствора после окончания осаждения и кристаллизации оставалось незначительное количество комплексообразующего соединения. Для этого комплексообразующее соединение нужно вводить на основании отношения усвоения, установленного экспериментальным путем. Считается, что это отношение аналогично отношениям ΝΡΗ и ΝΡΗ Однако оно может незначительно отличаться, так как получение производного соединения может повлиять на характер взаимосвязи между белком и протамином.

Когда комплексообразующим соединением является протамин, он присутствует в микрокристаллах в количестве от около 0,15 до около 0,5 мг на 3,5 мг общего белка. Отношение протамина к общему белку предпочтительно составляет от около 0,25 до около 0,40 (мг/мг). Это отношение более предпочтительно составляет от около 0,25 до около 0,38 (мг/мг). Протамин предпочтительно используют в количестве от 0,05 до около 0,2 мг/мг общего белка и более предпочтительно в количестве от около 0,05 до около 0,15 мг протамина на миллиграмм общего белка. Сульфат протамина является предпочтительной солью протамина, предназначенной для использования в настоящем изобретении. Масса сульфата протамина или другой соли протамина должна быть отрегулирована в соответствии с массой свободного основания протамина, которое может быть использовано для той же цели, с учетом коэффициента, равного отношению молекулярных масс соли и протамина.

Чтобы еще больше увеличить время действия композиций по настоящему изобретению или улучшить их суспендируемость, после кристаллизации в них можно добавить дополнительный протамин и цинк. Таким образом, в объем настоящего изобретения входят препараты, содержащие протамин в более высоком количестве, чем отношение усвоения. Содержание протамина в этих препаратах составляет от 0,25 до около 0,5 мг протамина на мг общего белка.

Необходимым компонентом микрокристаллов и осадков по настоящему изобретению является стабилизатор гексамера. В научной литературе описаны структуры трех гексамерных конформаций, которые обозначены Т6, Т3Р3 и Р6. В присутствии стабилизатора гексамера, например разных фенольных соединений, происходит стабилизация конформаций Р6. Поэтому весьма вероятно, что гексамеры имеют конформацию Р6 или Т3Р3, полученную в кристаллах или осадках в присутствии стабилизатора гексамера, такого как фенол или м-крезол. При осуществлении этого изобретения можно использовать целый ряд стабилизаторов гексамера. Они должны присутствовать в достаточных пропорциях относительно общего белка, чтобы стабилизировать конформацию гексамера Р6. Для эффективной стабилизации гексамера необходимо использовать, по крайней мере, 2 или 3 моля стабилизатора гексамера на гексамер. Желательно, чтобы в микрокристаллах и осадках по настоящему изобретению присутствовало, по крайней мере, 3 моля стабилизатора гексамера на гексамер. Присутствие в растворе, из которого получают микрокристаллы и осадки, стабилизатора гексамера в более высоких концентрациях, например в 25-50 раз больше, не оказывает вредного влияния на стабилизацию гексамера.

В препаратах по настоящему изобретению может присутствовать консервант, особенно в тех случаях, когда препарат предназначен для многократного использования. Как указывалось выше, известен целый ряд приемлемых консервантов. Консервант предпочтительно присутствует в растворе в количестве, приемлемом для обеспечения антимикробного действия в соответствии с требованиями фармакопеи.

Предпочтительными консервантами являются вышеуказанные фенольные консерванты.

Предпочтительные концентрации для фенольного консерванта составляют от около 2 до около 5 мг на миллилитр препарата в виде водной суспензии. Эти концентрации относятся к общей массе фенольных консервантов, так как предполагается, что могут быть использованы смеси отдельных фенольных консервантов. Приемлемыми фенольными консервантами являются, например, фенол, м-крезол и метилпарабен. Предпочтительными фенольными соединениями являются фенол и м-крезол. Смеси фенольных соединений, таких как фенол и м-крезол, также являются весьма предпочтительными. Типичные смеси фенольных соединений включают 0,6 мг/мл фенола и 1,6 мг/мл м-крезола и 0,7 мг/мл фенола и 1,8 мг/мл м-крезола.

Микрокристаллы по настоящему изобретению предпочтительно имеют продолговатую форму и известны как палочкообразные одиночные кристаллы, содержащие белок, производный белок, катион двухвалентного металла, комплексообразующее соединение и стабилизатор гексамера. Средняя длина микрокристаллов по настоящему изобретению предпочтительно равна 1-40 мкм и более предпочтительно 3-15 мкм.

Предпочтительная композиция содержит от около 3 до около 6 мг сульфата протамина на 35 мг общего белка и от около 0,1 до около 0,4 мг цинка на 35 мг общего белка. Другая предпочтительная композиция содержит от около 10 до около 17 мг сульфата протамина на 35 мг общего белка и от около 2,0 до около 2,5 мг цинка на 35 мг общего белка. Другая предпочтительная композиция содержит в 1 мл раствора 0,34-0,38 мг сульфата протамина, 0,01-0,04 мг цинка и 3,2-3,8 мг общего белка.

В сокристаллах и аморфных осадках по настоящему изобретению должен присутствовать как непроизводный белок, так и производный белок. Соотношение между массами этих белков определяет время действия препаратов. Предпочтительное отношение количества молей белка к количеству молей производного белка составляет от около 1:100 до около 100:1. Другое предпочтительное отношение количества молей белка к количеству молей производного белка составляет от около 1:1 до около 100:1. Еще одно предпочтительное отношение количества молей белка к количеству молей производного белка составляет от около 1:1 до около 20:1. Другие предпочтительные отношения количества молей белка к количеству молей производного белка составляют от около 2:1 до около 20:1; от около 2:1 до 10:1; от около 2:1 до 5:1; от около 3:1 до 5:1; от 1:1 до 1:20; от 1:1 до 1:10; от около 1:2 до около 1:20; от около 1:2 до 1:10; от около 1:2 до 1:5; от около 1:3 до 1:5; от около 10:1 до около 1:10; от около 9:1 до около 1:9; от около 5:1 до около 1:5 и от около 3:1 до около 1:3.

Настоящее изобретение относится к способам получения указанных композиций. Кроме того, в объем настоящего изобретения входит применение нерастворимых композиций для получения лекарственных средств, предназначенных для регулирования содержания глюкозы в крови и лечения диабета или гипергликемии. Аморфные осадки и микрокристаллы по настоящему изобретению, предназначенные для использования в лекарственных средствах или для других применений, можно получить разными способами.

Приемлемые способы обычно включают стадии в одной из нижеследующих последовательностей:

солюбилизация (если исходное вещество находится в сухом состоянии), гексамеризация, гомогенизация, комплексообразование, осаждение, кристаллизация и необязательно получение композиции; или солюбилизация (если исходное вещество находится в сухом состоянии), гомогенизация, гексамеризация, комплексообразование, осаждение, кристаллизация и необязательно получение композиции.

Солюбилизация означает растворение производного белка и белка в достаточной степени для образования гексамеров. Гексамеризация означает процесс связывания молекул белка и производного белка с цинком(11) для образования гексамеров. Комплексообразование означает образование нерастворимых комплексов между гексамерами и протамином. Осаждение обычно происходит в результате образования нерастворимых комплексов. Кристаллизация означает превращения осажденных комплексов гексамера/протамина в кристаллы, обычно в палочкообразные кристаллы.

Солюбилизацию осуществляют, растворяя производный белок и белок в водном растворителе. Водный растворитель может быть, например, кислым, нейтральным или основным раствором. Водный растворитель может частично включать смешиваемый органический растворитель, такой как этанол, ацетонитрил, диметилсульфоксид и тому подобные. Кислые растворы могут быть, например, растворами НС1, содержащими предпочтительно от около 0,01н. НС1 до около 1,0н. НС1. Можно использовать другие фармацевтически приемлемые кислоты. Основные растворы могут быть, например, растворами ΝηΟΗ, содержащими предпочтительно от около 0,01н. ΝηΟΗ до около 1,0н. ΝηΟΗ или больше. Можно использовать другие фармацевтически приемлемые основания. Для сохранения стабильности белка концентрация кислоты или основания должна быть как можно меньше, но при этом она должна быть достаточной для эффективного растворения белка и производного белка.

Большинство белков (инсулин, аналоги инсулина и проинсулины) и многие производ ные белки можно растворить до приемлемых концентраций при нейтральном значении рН. Растворы, предназначенные для растворения производных белков при нейтральном значении рН, могут содержать буфер и необязательно одно или несколько дополнительных растворенных веществ, таких как соли, фенольные соединения, цинк и изотонические агенты.

Если гексамеризацию осуществляют до гомогенизации, сначала образуются две совокупности однородных гексамеров, после чего эти совокупности смешивают с получением смешанных гексамеров. Если сначала производят гомогенизацию, то в результате последующей гексамеризации получают гибридные гексамеры. Как указывалось выше, чтобы получить нерастворимые композиции, состоящие из гибрадных гексамеров, белок и производный белок гомогенизируют в условиях, способствующих диссоциации на мономерное или димерное агрегатные состояния, до гексамеризации с катионом двухвалентного металла. Для достижения необходимой диссоциации белок и производный белок можно смешивать в сильно кислотных или сильно основных условиях. На степень диссоциации и последующей гомогенизации влияют условия растворения, выбранные на этой стадии. Инсулин и родственные белки легко самоассоциируются в результате осуществления последовательности реакций с образованием димеров, гексамеров и других ассоциированных форм. Равновесное распределение этих ассоциированных форм зависит от многих параметров, включая показатель рН. Обычно считается, что эти реакции ассоциации позволяют получить, главным образом, совокупность мономеров, димеров и гексамеров. Поэтому в зависимости от выбранных условий растворения во время гомогенизации должно производиться смешивание мономеров, димеров или их смесей. Гомогенизация в 1н. растворе Ηί.Ί, например, ведет к смешиванию большего количества мономеров, чем гомогенизация в 0,1н. растворе НС1, что увеличивает вероятность смешивания большего количества димеров. При получении композиций, содержащих гибридные гексамеры, процесс гомогенизации будет эффективным только тогда, когда в применяемых условиях гомогенизации имеется очень небольшая или пренебрежимая фракция однородных гексамеров белка или производного белка.

Композиции, содержащие смешанные гексамеры, включают, главным образом, два типа гексамеров, а именно гексамеры белка и гексамеры производного белка. В этом случае стадию гомогенизации осуществляют после стадии гексамеризации и производят гомогенизацию гексамеров до комплексообразования с использованием комплексообразующего соединения. Стадию гомогенизации осуществляют в условиях растворения, которые стабилизируют гексамер Ζη(II)инсулина. Условия растворения, ста билизирующие гексамеры инсулина, хорошо известны в научной литературе.

Для гексамеризации необходимы такие условия растворения, которые позволяют получить в растворе гибридные или смешанные гексамеры. Эти условия идентичны или подобны условиям, в которых производят гексамеризацию инсулина или аналогов инсулина. Обычно для гексамеризации необходим цинк и нейтральный или слегка основный показатель рН, который находится в пределах от около 6,8 до около 8,4. Присутствие стабилизатора гексамера благоприятно влияет на гексамеризацию, стимулируя образование конформаций К6 или Т3К3 производного белка и в некоторых случаях также белка. При использовании некоторых аналогов мономерного инсулина для образования гексамеров необходим стабилизатор гексамера.

В случае композиций, содержащих гибридные гексамеры, можно получить семь гексамерных видов: Р₆, Ρ₅Όι, Р₄Э₂, Р₃О₃. Ρ₂Ό₄, Р1Э₅ и Ό₆, где Р обозначает мономер белка и Ό обозначает мономер производного белка. Предполагается, что статистическое распределение гексамеров соответствует распределению Пуассона, причем на этот показатель влияет относительная пропорция белка и производного белка и степень диссоциации до гексамеризации. Например, из гомогенизированного раствора, состоящего, в основном, из димеров, можно получить четыре основных гибридных гексамера: Ρ6, Р₄Э₂, Р₂Э₄ и Ό₆. В случае композиций, содержащих смешанные гексамеры, можно получить только два гексамерных вида: Р₆ и Ό₆.

Стадия комплексообразования включает смешивание комплексообразующего соединения с гексамером в условиях растворения, при которых каждое вещество первоначально растворяется. Этот процесс осуществляют, смешивая отдельные растворы гексамеров и протамина или получая сначала раствор белка, производного белка и протамина при кислотном или основном показателе рН с последующим сдвигом рН к нейтральному значению.

Во время кристаллизации условия растворения должны стабилизировать кристаллизующиеся виды и способствовать превращению осадка в растворенное вещество и затем в кристаллы. Таким образом, условия растворения должны определять скорость и выход кристаллизации. Кристаллизация, по-видимому, вызывает уравновешивание комплекса, включая некристаллический осадок, растворенные комплексы гексамера с протамином и кристаллы. Чтобы получить микрокристаллы, условия, выбранные для кристаллизации, должны вызывать смещение равновесное состояние в сторону образования кристаллов. Кроме того, с учетом гипотетического равновесия ожидается, что растворимость производного белка сильно влияет на скорость кристаллизации и размер кристаллов, так как более низкая растворимость, по-видимому, замедляет превращение осадка в раствор и затем в кристаллы. Из этого следует, что замедление скорости кристаллизации часто ведет к образованию более крупных кристаллов. Таким образом, считается, что скорость кристаллизации и размер кристаллов зависят от размера и характера части производного белка, образующей производное соединение.

Параметрами кристаллизации, влияющими на скорость кристаллизации и размер кристаллов по настоящему изобретению, являются размер и характер ацильной группы; температура; наличие и концентрация соединений, конкурирующих с белком и производным белком за связывание с цинком, таких как цитрат, фосфат и тому подобные; характер и концентрация одного или нескольких фенольных соединений; концентрация цинка; присутствие и концентрация смешивающегося органического растворителя; время, необходимое для кристаллизации; значение рН и ионная сила; характер и концентрация буфера; концентрация осадителей; присутствие затравочных веществ: форма и материал емкости; скорость перемешивания и концентрация общего белка. Считается, что особое значение имеют температура и концентрация конкурирующих соединений.

Конкурирующие соединения, такие как цитрат, могут влиять на скорость образования кристаллов и косвенно на размер и качество кристаллов. Эти соединения могут действовать путем образования координационных комплексов с цинком в растворе, конкурируя таким образом с относительно слабыми сайтами связывания цинка на поверхности гексамера. Занятость этих слабых поверхностных сайтов связывания, вероятно, препятствует кристаллизации. Кроме того, многие производные белки частично нерастворимы в присутствии цинка в количестве более 0,333 на моль производного белка и присутствие конкурирующих соединений восстанавливает растворимость и способствует кристаллизации. Оптимальную концентрацию конкурирующего соединения можно определить обычными методами, предназначенными для любой комбинации белка и производного белка. Верхним пределом, несомненно, является концентрация, при которой цинк осаждается конкурирующим соединением, или концентрация, при которой остаточное конкурирующее соединение является фармацевтически неприемлемым, например когда оно вызывает боль или раздражение в месте введения.

Ниже приведен пример способа получения осадков и кристаллов по настоящему изобретению. Измеренные количества производного белка и белка растворяют или смешивают с получением раствора в водном растворителе, содержащем стабилизатор гексамера, такой как фенольное соединение. К этому раствору добавляют раствор цинка в виде одной из его раство римых солей, например Ζη(ΙΙ)Ο₂, до концентрации от около 0,3 моля цинка на моль производного инсулина до около 0,7 моля или 1,0 моля цинка на моль общего белка (белок 4- производный белок). К этому раствору необязательно добавляют абсолютный этанол или другой смешивающийся органический растворитель в количестве, необходимом для получения раствора, содержащего от примерно 5 до примерно 10 об.% органического растворителя. Этот раствор затем фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Получают раствор протамина, растворяя измеренное количество протамина в водном растворителе. Этот раствор фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Раствор белка и производного белка смешивают с раствором протамина, в результате чего сначала образуется осадок. Полученную суспензию медленно перемешивают при комнатной температуре (обычно около 20-25°С), в результате чего в течение периода времени от около 4 ч до около 10 дней образуются микрокристаллы.

Микрокристаллы затем отделяют от маточного раствора и вводят в другой растворитель для хранения и введения пациенту. Примерами соответствующих водных растворителей являются вода для инъекций, содержащая 25 мМ ΤΚΙ8, 5 мг/мл фенола и 16 мг/мл глицерина; вода для инъекций, содержащая 2 мг/мл двухосновного фосфата натрия, 1,6 мг/мл м-крезола, 0,65 мг/мл фенола и 16 мг/мл глицерина; и вода для инъекций, содержащая 25 мМ ΤΚΙ8, 5 мг/мл фенола, 0,1 М тринатрийцитрата и 16 мг/мл глицерина.

В соответствии с другим способом получения нерастворимых композиций по настоящему изобретению измеренную массу сухого производного белка и измеренную массу сухого белка растворяют вместе в кислотном водном растворителе, таком как 0,1-1,0н. раствор НС1. Этот раствор перемешивают до полного смешивания производного белка и белка. Отношение порошка производного белка к порошку белка в этой смеси определяют с таким расчетом, чтобы получить такое же отношение производного белка к белку в нерастворимой композиции. Отдельно полученный водный раствор, содержащий фенольный консервант и необязательно фармацевтически приемлемый буфер, смешивают с кислым раствором белков. Показатель рН полученного раствора доводят до величины от около 6,8 до около 8,4, предпочтительно от около

6,8 до около 8,0 или предпочтительно до рН от около 7,2 до около 7,8 и наиболее предпочтительно от около 7,4 до около 7,8. К этому раствору добавляют раствор цинка в виде одной из его растворимых солей, например Ζη(ΙΙ)Ο₂, до концентрации от около 0,3 моля цинка на моль общего инсулина до около 4 молей цинка на моль общего инсулина. Этот раствор доводят до указанного выше значения рН, предпочтительно до около 7,4-7,6, и фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Получают раствор протамина, растворяя измеренную массу протамина в водном растворителе. Раствор протамина можно профильтровать через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Раствор белка и производного белка смешивают с раствором протамина, в результате чего сначала образуется осадок. Полученную суспензию медленно перемешивают при комнатной температуре (обычно около 20-25°С), в результате чего в течение периода времени от около 4 ч до около 10 дней образуются микрокристаллы.

В соответствии с еще одним способом получения нерастворимых композиций по настоящему изобретению измеренное количество производного белка сначала растворяют в водном растворителе, содержащем фенольный консервант. К этому раствору добавляют раствор цинка в виде одной из его растворимых солей, например Ζη(ΙΙ)Ο₂, до концентрации от около 0,3 моля цинка на моль производного белка. Показатель рН полученного раствора доводят до величины от около 6,8 до около 8,4, предпочтительно от около 6,8 до около 8,0, более предпочтительно от около 7,2 до около 7,8 и особенно предпочтительно от около 7,4 до около 7,8. Отдельно получают второй раствор, в котором измеренное количество белка, выбираемого из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулин, растворяют в водной растворителе, содержащем фенольный консервант. К этому раствору добавляют раствор цинка в виде одной из его растворимых солей, например Ζη(ΙΙ)Ο₂, до концентрации от около 0,3 моля цинка на моль белка до около 4 молей цинка на моль белка. Показатель рН полученного раствора доводят до величины от около 6,8 до около 8,4, предпочтительно от около 6,8 до около 8,0, более предпочтительно до рН от около 7,2 до около 7,8 и особенно предпочтительно от около 7,4 до около 7,8 или 7,4-7,6. Порции раствора производного белка и раствора белка перемешивают в заранее определенном отношении, чтобы получить такое же отношение производного белка к белку в нерастворимой композиции. Этот раствор перемешивают до полного смешивания производного белка и белка. Показатель рН этого раствора доводят до около 7,6, после чего раствор может быть профильтрован через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Отдельно получают раствор протамина, растворяя измеренное количество протамина в водном растворителе. Раствор протамина можно профильтровать через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Раствор белка и производного белка смешивают с раствором протамина, в результате чего сначала образуется осадок. Полученную суспензию медленно перемешивают при комнатной температуре (обычно около 20-25°С), в результате чего в течение периода времени от около 4 ч до около 10 дней образуются микрокристаллы.

Хотя в этом описании изобретения не рассмотрены все многочисленные способы, позволяющие получить нерастворимые композиции по настоящему изобретению, тем не менее, далее представлено еще несколько способов по настоящему изобретению, которые заключаются в том, что белок, производный белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем рН, способствующим образованию гексамеров, и добавляют комплексообразующее соединение;

белок, производный белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем рН, препятствующим образованию гексамеров, доводят рН до значения между около 6,8 и около 7,8 и добавляют комплексообразующее соединение;

белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем рН, способствующим образованию гексамеров, отдельно растворяют производный белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла в водном растворителе с показателем рН, способствующим образованию гексамеров, тщательно смешивают эти два раствора и добавляют комплексообразующее соединение;

белок, стабилизатор гексамера, катион двухвалентного металла и комплексообразующее соединение растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения, отдельно растворяют производный белок, стабилизатор гексамера, катион двухвалентного металла и комплексообразующее соединение в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения, тщательно смешивают эти два раствора и доводят рН раствора до значения, при котором происходит осаждение;

белок, производный белок, стабилизатор гексамера, катион двухвалентного металла и комплексообразующее соединение растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения, и доводят рН раствора до значения, при котором происходит осаждение;

белок, производный белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего вещества, добавляют комплексообразующее соединение и доводят показатель рН раствора, полученного на стадии Ь), до значения, при котором происходит осаждение;

белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения, отдельно растворяют производный белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения, тщательно перемешивают эти два раствора, добавляют к раствору комплексообразующее соединение и доводят показатель рН до значения, при котором происходит осаждение;

белок, производный белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждение при добавлении комплексообразующего соединения, доводят показатель рН раствора до значения, при котором происходит осаждение при добавлении комплексообразующего соединения, и добавляют к раствору комплексообразующее соединение;

белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения, отдельно растворяют производный белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения, тщательно смешивают эти два раствора, доводят рН раствора, полученного на стадии с), до значения, при котором происходит осаждение при добавлении комплексообразующего соединения, и добавляют к раствору комплексообразующее соединение.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения микрокристаллы получают так, чтобы устранить необходимость отделения микрокристаллов от маточного раствора. Таким образом, желательно, чтобы маточный раствор сам по себе был пригоден для введения пациенту или чтобы маточный раствор можно было сделать пригодным для введения путем разведения его приемлемым разбавителем. Термин разбавитель означает раствор, содержащий водный растворитель, в котором растворены разные фармацевтически приемлемые наполнители, которые включают, но не ограничиваются ими, буфер, изотонический агент, цинк, консервант, протамин и тому подобные.

Помимо белка, производного белка, катиона двухвалентного металла, комплексообразующего соединения и стабилизатора гексамера, фармацевтические композиции, предназначенные для парентерального введения в соответствии с настоящим изобретением, могут содержать дополнительные наполнители и носители, в частности смешивающиеся с водой органические растворители, такие как глицерин, кунжутное масло, водный раствор пропиленгликоля и тому подобные. Такие вещества обычно используют в количестве менее 2 вес.% в расчете на конечный вес препарата. Для более подробного ознакомления с разными методами использования известных наполнителей или носителей в продуктах, предназначенных для парентерального введения, см. справочник РеттдЮп'к Рйагтасеийса1 8с1епсек, 17!й Еййюп, Маск РиЬНкЫпд Сотрапу, Еак!оп, РА, И8А (1985), который включен в это описание изобретения в качестве ссылки.

Препарат, полученный в соответствии с широкой практикой осуществления настоящего изобретения, может также содержать смесь микрокристаллов и растворимой фракции белка, выбираемого из инсулина, производного инсулина, аналогов инсулина и аналогов производного инсулина. Примерами таких фармацевтических композиций являются стерильные, изотонические водные физиологические растворы инсулина, аналога инсулина, производного инсулина или аналога производного инсулина, содержащие физиологически приемлемый буфер и не содержащие пирогена. Для растворимой фазы предпочтителен инсулин или быстродействующий аналог инсулина, такой как ЬукВ28,РгоВ29-инсулин человека или АкрВ28инсулин человека. Такие смеси позволяют регулировать концентрацию глюкозы во время приема пищи, что обеспечивается растворимым инсулином, и концентрацию глюкозы в промежутках между приемами пищи, что обеспечивается нерастворимым инсулином. Отношение общего белка (белок плюс производный белок) в нерастворимой фазе к общему белку в растворимой фазе находится в пределах от около 9:1 до около 1:9. Это отношение предпочтительно находится в пределах от около 9:1 до около 1:1 и более предпочтительно около 7:3. Другие отношения равны 1:1 и 3:7.

Это изобретение проиллюстрировано и объяснено с использованием следующих способов получения и примеров. Объем изобретения не ограничивается этими способами получения и примерами. Ссылка на части для твердых веществ означает весовые части. Ссылка на части для жидкостей означает объемные части. Проценты, используемые для выражения концентрации, означают массу, деленую на объем (х100). Все температуры выражены в градусах по шкале Цельсия (°С). ТР18 означает 2амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол. Раствор, содержащий 1000 частей на миллион цинка, получают, разбавляя 1,00 мл стандартного раствора с атомным поглощением 10000 частей на миллион цинка [К1сса Сйет1са1 Сотрапу, цинк в разбавленной азотной кислоте] водой до конечного объема 10,00 мл.

Во многих нижеописанных способах получения указан выход осадков и кристаллов. Значение выхода определено на основании количе ства общего белка в осадке или кристаллах и на оценке количества того же вещества, первоначально находившегося в растворе. Чтобы определить количество общего белка, образцы повторно растворенного осадка или кристаллов и супернатанта над осадком или кристаллами анализировали градиентной ВЭЖХ с обращенной фазой, как это описано ниже.

В аналитической системе использована колонка С8 с обращенной фазой при 23°С. Скорость потока равна 1,0 мл/мин, и ультрафиолетовое детектирование произведено при 214 нм. Растворитель А содержит 0,1% (в объемном отношении) трифторуксусной кислоты в ацетонитрил:вода с отношением 10:90 (в объемном отношении). Растворитель В содержит 0,1% (в объемном отношении) трифторуксусной кислоты в ацетонитрил:вода с отношением 90:10 (в объемном отношении). Использована программа проявления (минуты, %В): (0,1, 0); (45,1, 75); (50,1, 100); (55, 100); (57, 0); (72, 0). Все изменения являются линейными. Специалист в этой области может использовать другие аналитические системы для достижения той же цели.

Чтобы получить образцы для анализа ВЭЖХ, аликвоты хорошо смешанных суспензий растворяли, разбавляя их 0,01 или 0,03н. раствором НС1. Результаты анализа ВЭЖХ этих растворов позволяют высчитать общий белок. Аликвоты этих суспензий центрифугировали в течение примерно 5 мин в микроцентрифуре ЕррепйогГ 5415С со скоростью 14000 об./мин. Слитый супернатант разводили 0,01 или 0,1н. раствором НС1 и анализировали ВЭЖХ. Осадок промывали, для чего его повторно суспендировали в физиологическом растворе с фосфатным буфером Дульбекко (без кальция или магния) и повторно осаждали центрифугированием. Буфер сливали и твердое вещество повторно растворяли в 0,01н. растворе НС1. Повторно растворенный осадок анализировали ВЭЖХ.

ВЭЖХ использовали для подтверждения наличия требуемых белков в подкисленной суспензии, повторно растворенном осадке и супернатанте, а также для определения концентраций белков. Время удерживания пиков в хроматограммах повторно растворенных осадков сравнивали с временем удерживания для протамина и активных соединений, используемых для получения указанных препаратов. Соответствие между значениями времени удерживания было всегда хорошим, свидетельствуя о том, что микрокристаллы действительно содержат протамин, белок и производные белки. Концентрации белка и производного белка определяли путем сравнения площадей соответствующих пиков с площадями эталона. В качестве эталона использовали 0,22 мг/мл раствора производного инсулина. Эталон, содержащий протамин, исследовали только с целью определения времени удерживания. Количественное определение концентрации протамина не производили.

Во многих нижеописанных способах получения использовали стандартный спектрофотометрический анализ для определения скорости растворения кристаллов в физиологическом растворе с фосфатным буфером Дульбекко (рН 7,4) при комнатной температуре. Там, где это необходимо, в способах получения указаны существенные отклонения от нижеописанной процедуры. Для всех анализов растворения использовали спектрофотометр, пригодный для измерения в ультрафиолетовом диапазоне и оснащенный 1 см кюветой и магнитной мешалкой для кюветы. Кювету с маленькой мешалкой, содержащую 3,00 мл физиологического раствора с фосфатным буфером (РВ8), помещали в ячейку спектрофотометра. Прибор был установлен на 320 нм и на нуль в отношении того же буфера. Затем в кювету добавляли 4,0 мкл хорошо суспендированного препарата, общая концентрация которого обычно была эквивалентна препарату И50 или составляла от около 1,6 до

1,8 мг/мл. Препарат перемешивали в течение 1,0 мин и определяли оптическую плотность при 320 нм. Поскольку белки, используемые в этом исследовании, не поглощают свет при 320 нм, уменьшение оптической плотности связано с уменьшением рассеяния света по мере растворения кристаллов. Обычно регистрировали время (!1/2), необходимое для уменьшения оптической плотности на половину первоначальной величины. Для выполнения контрольного эксперимента 2,0 мкл гумулина® N И100 (то есть инсулин ΝΓΗ человека) добавляли к 3,00 мл буфера РВ8 и измеряли оптическую плотность при 320 нм, как описано выше. Полупериод растворения (!ι_/2) для гумулина® N равен примерно 6 мин.

Способ получения 1. Сокристаллы инсулина человека и В29-№-октаноилинсулина человека с отношением 9:1.

Сухой порошок В29-№-октаноил-ЬукВ29инсулина человека (0,7 мас.ч.) и сухой порошок инсулина человека (6,3 мас.ч.) растворяют в 1000 об. ч. водного растворителя, содержащего 50 мМ ТК18, 0,1 М тринатрийцитрата и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К этому раствору добавляют 75 частей 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Показатель рН доводят до 7,6, добавляя 1н. раствор НС1 и/или 1н. раствор ΝηΟΗ. Этот раствор фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Получают второй раствор, растворяя 7 мас.ч. сульфата протамина в 10000 об.ч. воды и фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Смешивают равные объемы раствора, содержащего инсулин и ацилированный инсулин, и раствора сульфата протамина. Сначала образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22°С).

Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества.

Способ получения 2. Сокристаллы инсулина человека и В29-№-октаноилинсулина человека с отношением 3:1.

Выполняют процедуру, описанную в способе получения 1, за исключением того, что используют 1,75 мас.ч. сухого порошка В29-№октаноил-ЬукВ29-инсулина человека и 5,25 мас. ч. сухого порошка инсулина человека. Смешивают равные объемы раствора, содержащего инсулин и ацилированный инсулин, и раствора сульфата протамина, в результате чего образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22°С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества.

Способ получения 3. Композиция, содержащая сокристаллы инсулина человека и В29Νε-октаноилинсулина человека с отношением 3:1.

Сокристаллы микрокристаллического твердого вещества, полученные в соответствии со способом получения 1, отделяют от супернатанта и получают обычными способами разделения твердого вещества и жидкости, такими как фильтрование, центрифугирование или декантация. Полученные сокристаллы микрокристаллического твердого вещества суспендируют в растворе, содержащем 25 мМ ТШ8, 5 мг/мл фенола и 16 мг/мл глицерина, рН 7,8, до достижения конечной концентрации, при которой активность инсулина составляет примерно 100 ед./мл.

Способ получения 4. Сокристаллы инсулина человека и В29-№-октаноилинсулина человека с отношением 1:1.

Выполняют процедуру, описанную в способе получения 1, за исключением того, что используют 3,5 мас.ч. сухого порошка В29-№октаноил-ЬукВ29-инсулина человека и 3,5 мас.ч. сухого порошка инсулина человека. Смешивают равные объемы раствора, содержащего инсулин и ацилированный инсулин, и раствора сульфата протамина, в результате чего образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22°С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества.

Способ получения 5. Сокристаллы инсулина человека и В29-№-октаноилинсулина человека с отношением 1:3.

Выполняют процедуру, описанную в способе получения 1, за исключением того, что используют 5,25 мас.ч. сухого порошка В29-№октаноил-ЬукВ29-инсулина человека и 1,75 мас. ч. сухого порошка инсулина человека.

Смешивают равные объемы раствора, содержа59 щего инсулин и ацилированный инсулин, и раствора сульфата протамина, в результате чего образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22°С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества.

Способ получения 6.

Сокристаллы инсулина человека и В29-№гексаноилинсулина человека с отношением 3:1.

Выполняют процедуру, описанную в способе получения 1, за исключением того, что используют 1,75 мас.ч. сухого порошка В29-№гексаноил-ЬукВ29-инсулина человека и 5,25 мас.ч. сухого порошка инсулина человека. Смешивают равные объемы раствора, содержащего инсулин и ацилированный инсулин, и раствора сульфата протамина, в результате чего образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22°С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества.

Способ получения 7. Сокристаллы инсулина человека и В29-№-бутирилинсулина человека с отношением 3:1.

Выполняют процедуру, описанную в способе получения 1, за исключением того, что используют 1,75 мас.ч. сухого порошка В29-№бутирил-ЬукВ29-инсулина человека и 5,25 мас.ч. сухого порошка инсулина человека. Смешивают равные объемы раствора, содержащего инсулин и ацилированный инсулин, и раствора сульфата протамина, в результате чего образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22°С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества.

Способ получения 8. Сокристаллы микрокристаллического вещества, состоящие из протамина, цинка, В29-№-октаноилинсулина человека и инсулина человека.

В29-№-октаноил-ЬукВ29-инсулин человека (20,1 мг) растворяют в 1 мл растворителя, содержащего 0,1н. раствор НС1. Инсулин человека (19,3 мг) растворяют в 1 мл растворителя, содержащего 0,1н. раствор НС1. Получают пять растворов, содержащих В29-№-октаноилЬукВ29-инсулин человека и инсулин человека в разных отношениях, для чего эти растворы смешивают в нижеуказанных объемах.

Таблица 3. Объемы растворов инсулина человека и В29-№октаноилинсулина человека, используемые для получения осадков и микрокристаллов

Объем, мкл	Отношение инсулина человека к ацилированному инсулину человека
1:0	3:1	1:1	1:3	0:1
Раствор инсулина человека	400	300	200	100	0
Раствор В29-№-октаноинсулина человека	0	100	200	300	400

К каждому из этих пяти растворов добавляют 1,6 мл растворителя, содержащего 50 мМ буфера ΤΚ18, 0,1 М тринатрийцитрата и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К каждому из пяти растворов добавляют 0,15 мл 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Показатель рН всех пяти растворов доводят до 7,6, добавляя 1н. раствор ΝαΟΗ. Все пять растворов фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Получают дополнительный раствор, растворяя 3,50 мг сульфата протамина в 10 мл воды, и фильтруют его через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. По 1,9 мл каждого из пяти растворов соответственно смешивают с

1,9 мл раствора сульфата протамина, в результате чего сразу же образуется аморфный осадок. Эти пять растворов оставляют выстаиваться в течение 24 ч при комнатной температуре (примерно 22°С). Затем в каждом из пяти растворов образуется белое и не совсем белое микрокристаллическое вещество.

Способ получения 9. Сокристаллы инсулина человека и В29-№-октаноилинсулина человека с отношением 9:1.

Сухой порошок В29-№-октаноил-ЬукВ29инсулина человека (0,7 мас.ч.) растворяют в 100 об.ч. водного растворителя, содержащего 50 мМ ΤΚ18, 0,1М тринатрийцитрата и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К этому раствору добавляют 7,5 части 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Получают второй раствор, в котором сухой порошок инсулина человека (6,3 мас.ч.) растворен в 900 об.ч. водного растворителя, содержащего 50 мМ ΤΚ18, 0,1М тринатрийцитрата и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К этому раствору добавляют 67,5 части 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Раствор ацилированного инсулина объединяют с раствором инсулина и перемешивают до однородного смешивания двух растворов. Полученный раствор фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Получают раствор протамина, растворяя 7 мас.ч. сульфата протамина в 10000 об. ч. воды, и фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Смешивают равные объемы раствора ацилированного инсулина и раствора сульфата протамина. Образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22°С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества.

Способ получения 10. Сокристаллы инсулина человека и В29-№-октаноилинсулина человека с отношением 3:1.

Сухой порошок В29-№-октаноил-Ьу§В29инсулина человека (1,75 масс.ч.) растворяют в 250 об.ч. водного растворителя, содержащего 50 мМ ТВ 18. 0,1М тринатрийцитрата и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К этому раствору добавляют 18,75 части 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Получают второй раствор, в котором сухой порошок инсулина человека (5,25 мас.ч.) растворен в 750 об.ч. водного растворителя, содержащего 50 мМ ТВ18, 0,1 М тринатрийцитрата и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К этому раствору добавляют 56,25 части 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Раствор ацилированного инсулина объединяют с раствором инсулина и перемешивают до однородного смешивания двух растворов. Полученный раствор фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Получают раствор протамина, растворяя 7 мас.ч. сульфата протамина в 10000 об.ч. воды, и фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Смешивают равные объемы раствора ацилированного инсулина и раствора сульфата протамина. Образуется аморфный осадок. Полученную суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22°С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества.

Способ получения 11. Сокристаллы инсулина человека и В29-№-октаноилинсулина человека с отношением 1:1.

Сухой порошок В29-№-октаноил-Ьу§В29инсулина человека (3,5 мас.ч.) растворяют в 500 об.ч. водного растворителя, содержащего 50 мМ ТВ18, 0,1М тринатрийцитрат и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К этому раствору добавляют 1,75 части 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Получают второй раствор, в котором сухой порошок инсулина человека (3,5 мас.ч.) растворен в 500 об.ч. водного растворителя, содержащего 50 мМ ТВ18, 0,1М тринатрийцитрата и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К этому раствору добавляют 37,5 части 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Раствор ацилированного инсулина объединяют с раствором инсулина и перемешивают до однородного смешивания двух растворов. Полученный раствор фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Получают раствор протамина, растворяя 7 мас.ч. сульфата протамина в 10000 об.ч. воды, и фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Смешивают равные объемы раствора ацилированного инсулина и раствора сульфата протамина. Образуется аморфный осадок. Полученную суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22°С).

Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества

Способ получения 12. Сокристаллы инсулина человека и В29-№-октаноилинсулина человека с отношением 1:3.

Сухой порошок В29-№-октаноил-Ьу§В29инсулина человека (5,25 мас.ч.) растворяют в 750 об.ч. водного растворителя, содержащего 50 мМ ТВ 18, 0,1М тринатрийцитрата и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К этому раствору добавляют 56,22 части 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Получают второй раствор, в котором сухой порошок инсулина человека (1,75 мас.ч.) растворен в 250 об.ч. водного растворителя, содержащего 50 мМ ТВ18, 0,1 М тринатрийцитрата и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К этому раствору добавляют 18,75 части 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Раствор ацилированного инсулина объединяют с раствором инсулина и перемешивают до однородного смешивания двух растворов. Полученный раствор фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Получают раствор протамина, растворяя 7 мас.ч. сульфата протамина в 10000 об.ч. воды, и фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Смешивают равные объемы раствора ацилированного инсулина и раствора сульфата протамина. Образуется аморфный осадок. Полученную суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22°С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества.

Способ получения 13. Сокристаллы инсулина человека и В29-№-гексаноилинсулина человека.

Получают кислый раствор В29-№-гексаноилинсулина человека, растворяя 12,3 мг В29Νε-гексаноилинсулина человека в 0,3 мл 0,1н. раствора НС1. Получают кислый раствор инсулина человека, растворяя 4,6 мг инсулина человека (кристаллы цинка) в 0,1 мл 0,1н. раствора НС1. Оба раствора смешивают с получением общего объема, равного 0,4 мл. Полученный раствор перемешивают в течение примерно 5 мин. К полученному раствору добавляют, перемешивая, 0,150 мл раствора 1000 частей на миллион цинка(11). Получают вызывающий кристаллизацию разбавитель, содержащий 32 мг/мл глицерина, 50 мМ трис-буфера, 10 мг/мл фенола, 100 мМ тринатрийцитрата при рН 7,6. К раствору инсулина добавляют 1,6 мл вызывающего кристаллизацию разбавителя. Показатель рН раствора доводят до 7,59, добавляя 1н. раствор ΝηΘΗ и 1н. раствор НС1. Полученный раствор фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Получают раствор протамина, растворяя 7,47 мг сульфата протамина в 10 мл воды. Два миллилитра (2 мл) раствора протамина добавляют к 2 мл раствора инсулина. Полученный раствор оставляют выстаи ваться в покое в течение 18 ч при контролируемой температуре, равной 25°С.

Микроскопическое исследование (через 18 ч) показывает, что кристаллизация произошла и что получены однородные, одиночные, палочкообразные кристаллы со средней длиной около 3 мкм.

мл кристаллического вещества, полученного через 18 ч, оставляют выстаиваться в покое в течение ночи, в результате чего происходит полное осаждение кристаллов. Супернатант удаляют и заменяют 4 мл разбавителя, содержащего 16 мг/мл глицерина, 20 мМ трисбуфера, 1,6 мг/мл м-крезола, 0,65 мг/мл фенола, 40 мМ тринатрийцитрата, рН 7,6. Затем кристаллы повторно суспендируют и снова оставляют осаждаться. Эту процедуру выполняют трижды, за исключением того, что в третий раз супернатант заменяют только 3 мл разбавителя.

Измеряют скорость растворения кристаллов, помещая 0,005 мл однородно суспендированной композиции в 3 мл физиологического раствора с фосфатным буфером Дульбекко (без кальция или магния) в квадратную кварцевую кювету с длиной пути 1 см при температуре 22°С. Этот раствор перемешивают с постоянной скоростью при помощи магнитной мешалки кюветы. Измерения оптической плотности при 320 нм производят с интервалами в 1 мин. Оптическая плотность при 320 нм соответствует свету, рассеиваемому нерастворимыми частицами, присутствующими в водной суспензии. По мере растворения микрокристаллов оптическая плотность приближается к нулю. Время, необходимое для растворения 0,005 мл этого вещества, превышает 150 мин. Время, необходимое для растворения 0,005 мл образца коммерческого гумулина Ν и 100 в тех же условиях, составляет примерно 10 мин.

Общий белок в этой композиции анализируют ВЭЖХ с целью количественного определения общей эффективности. Общая эффективность относится к общей концентрации инсулина человека и В29-№-гексаноилинсулина человека. Аликвоту (0,050 мл) полностью повторно суспендированной композиции растворяют в 0,950 мл 0,01н. раствора НС1 и анализируют ВЭЖХ, как это описано ниже. Общая эффективность, измеренная при помощи этого анализа, равна 4,54 мг/мл.

Анализ ВЭЖХ выполняют в следующих условиях: колонка с обращенной фазой С8; постоянная температура 23°С; скорость потока 1,0 мл/мин; определение при 214 нм; растворитель А=10% ацетонитрила (в объемном отношении) в 0,1% водном растворе трифторуксусной кислоты; растворитель В=90% ацетонитрила (в объемном отношении) в 0,1% водном растворе трифторуксусной кислоты; линейные градиенты (0,1 мин, 0% В; 45,1 мин, 75% В; 50,1 мин, 100% В; 55 мин, 100% В; 57 мин, 0% В; 72 мин, 0% В). Эталоны получают, растворяя весь инсулин и весь ацилированный инсулин в 0,01н. растворе НС1. Концентрацию каждого эталона определяют ультрафиолетовой спектроскопией. Предполагается, что раствор 1,0 мг/мл инсулина человека в 1 см кювете имеет оптическую плотность, равную 1,05 единицы при максимальной длине волны (примерно 276 нм). Это соответствует молярному коэффициенту погашения, равному 6098. Считается, что ацилированные инсулины имеют такой же молярный коэффициент погашения, что и инсулин человека. Растворы, калиброванные ультрафиолетовым светом, разбавляют, чтобы получить эталоны при 0,220, 0,147, 0,073 и 0,022 мг/мл. Эти эталоны анализируют ВЭЖХ и получают стандартную кривую зависимости площади от концентрации.

Супернатант анализируют, чтобы определить общую концентрацию растворимого инсулина человека и В29-№-гексаноилинсулина человека в этой композиции. К 0,040 мл супернатанта добавляют 0,160 мл 0,01н. раствора НС1. Подкисленный супернатант анализируют ВЭЖХ, как это описано выше. Установлено, что концентрация растворимого инсулина человека и В29-№-гексаноилинсулина человека в супернатанте равна 0,07 мг/мл.

Определяют соотношение между В29-№гексаноилинсулином человека и инсулином человека в кристаллах, для чего осаждают аликвоту (0,100 мл) композиции при помощи настольной центрифуги, сливают супернатант, повторно суспендируют кристаллы в 0,400 мл физиологического раствора с фосфатным буфером Дульбекко, вновь центрифугируют, удаляют супернатант и растворяют кристаллы в 1,50 мл 0,01н. раствора НС1. Выполняют вышеописанный анализ ВЭЖХ. Результаты этого анализа показывают наличие 84,2% В29-№-гексаноилинсулина человека и 15,8% инсулина человека.

Способ получения 14. Суспензионная композиция, содержащая сокристаллы инсулина человека и В29-№-деканоилинсулина человека.

Получают кислый раствор В29-№-деканоилинсулина человека, растворяя 10,4 мг В29-№деканоилинсулина человека в 0,25 мл 0,1н. раствора НС1. Получают кислый раствор инсулина человека, растворяя 30,3 мг инсулина человека (кристаллы цинка) в 0,75 мл 0,1н. раствора НС1. Оба раствора смешивают с получением общего объема, равного 1 мл. Полученный раствор перемешивают в течение примерно 5 мин. К этому раствору добавляют, перемешивая, 0,305 мл растворе 1000 частей на миллион цинка(11). К полученному раствору добавляют 4 мл вызывающего кристаллизацию разбавителя (40 мг/мл глицерина, 50 мМ трис-буфера, 4 мг/мл мкрезола, 1,625 мг/мл фенола, 100 мл тринатрийцитрата, рН 7,4). Показатель рН полученного раствора доводят до 7,58. Этот раствор фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. 5 мл раствора протамина (37,6 мг сульфата протамина в 50 мл воды) добавляют к 5 мл фильтрованного раствора. Полученный раствор оставляют выстаиваться в покое в течение 63 ч при контролируемой температуре, равной 25°С.

Микроскопическое исследование (через 63 ч) показывает, что кристаллизация произошла и получены однородные, одиночные, палочкообразные кристаллы со средней длиной около 8 мкм.

Измеряют скорость растворения кристаллов, помещая 0,006 мл однородно суспендированной кристаллической композиции в 3 мл физиологического раствора с фосфатным буфером Дульбекко (без кальция или магния) в квадратную кварцевую кювету с длиной пути 1 см при температуре 22°С. Время, необходимое для растворения 0,006 мл кристаллической композиции, превышает 300 мин. Время, необходимое для растворения 0,005 мл образца коммерческого гумулина Ν и 100 в тех же условиях, составляет около 10 мин.

Перед выполнением анализа ВЭЖХ кристаллы осаждают, оставляя композицию выстаиваться в покое. Удаляют 8 мл супернатанта и заменяют его 8 мл разбавителя [16 мг/мл глицерина, 20 мМ трис-буфера, 1,6 мг/мл мкрезола, 0,65 мг/мл фенола, 40 мМ тринатрийцитрата, рН 7,6]. Сокристаллы повторно суспендируют. Эту процедуру выполняют трижды, за исключением того, что в третий раз 8 мл супернатанта заменяют 7 мл разбавителя.

Эффективность кристаллической композиции и эффективность в супернатанте анализируют ВЭЖХ, как это описано и способе получения 13. Общая эффективность, определенная при помощи этого анализа, равна 3,87 мг/мл. Концентрация растворимого инсулина человека и В29-№-деканоилинсулина человека в супернатанте равна 0,06 мг/мл. Пропорции инсулина человека и В29-№деканоилинсулина человека в кристаллической фазе, измеренные в соответствии со способом получения 13, составляют 74,3% инсулина человека и 25,7% В29-№-деканоилинсулина человека.

Размер частиц определяют, используя образец композиции, при помощи прибора для измерения размера частиц (МиШжег, модель 11Е, Сои1!ег Согр., М1ат1, РЬ, 33116-9015). Для выполнения этого измерения 0,25 мл кристаллической композиции добавляют к 10 мл разбавителя, содержащего 14 мМ двухосновного фосфата натрия, 16 мМ глицерина, 1,6 мг/мл м-крезола, 0,65 мг/мл фенола, рН 7,4. Размер отверстия диафрагмы объектива прибора равен 50 мкм. Данные о размере частиц получают в течение 50 с. Это измерение показывает, что средний диаметр кристаллов равен примерно 6 мкм при нормальном распределении в диапазоне размеров частиц от около 2 до около 9 мкм. Этот результат подобен распределению частиц по размерам коммерческого препарата ΝΡΗ, установленному при по мощи аналогичного метода |Эе РейррЦ, М. К., е! а1., 1. ΡΕιηικκΥ'ΐιΙ. 8сь, 87:170-176(1998)].

Способ получения 15. Суспензионная композиция, содержащая сокристаллы инсулина человека и В29-№-октаноилинсулина человека.

Получают кислый раствор В29-№-октаноилинсулина человека, растворяя 30,3 мг В29-№октаноилинсулина человека в 0,75 мл 0,1н. раствора НС1. Получают кислый раствор инсулина человека растворяя 59,7мг инсулина человека (кристаллы цинка) в 1,5 мл 0,1н. раствора НС1. Аликвоту (0,25 мл) раствора инсулина человека смешивают с 0,75 мл раствора В29-№-октаноилинсулина человека с получением общего объема, равного 1 мл, и перемешивают в течение примерно 5 мин. К полученному раствору добавляют, перемешивая, 0,365 мл раствора 1000 частей на миллион цинка(11). К раствору инсулина с цинком добавляют 4 мл вызывающего кристаллизацию разбавителя (40 мг/мл глицерина, 35 мМ двухосновного фосфата натрия, 4 мг/мл м-крезола, 1,625 мг/мл фенола, 15 мМ тринатрий-цитрата, рН 7,4). Показатель рН полученного раствора доводят до 7,60. Этот раствор фильтруют через фильтр со слабым связыванием белка 0,22 мкм. 5 мл раствора протамина (37,9 мг сульфата проталина в 50 мл воды) добавляют к 5 мл фильтрованного раствора инсулина с цинком. Полученный раствор оставляют выстаиваться в покое в течение 48 ч при контролируемой температуре 25°С.

Микроскопическое исследование (через 48 ч) показывает, что кристаллизация произошла и получены однородные, палочкообразные монокристаллы со средней длиной около 5 мкм.

Перед выполнением анализа ВЭЖХ и испытания на растворение полученные кристаллы осаждают, оставляя композицию выстаиваться в покое. 8 мл супернатанта удаляют и заменяют 8 мл разбавителя [16 мг/мл глицерина, 14 мМ двухосновного фосфата натрия, 1,6 мг/мл мкрезола, 0,65 мг/мл фенола, 6 мМ тринатрийцитрата, рН 7,6]. Затем кристаллы повторно суспендируют. Эту процедуру выполняют трижды за исключением того, что в третий раз 8 мл супернатанта заменяют на 7 мл разбавителя.

Скорость растворения определяют так же, как это описано в рассмотренном выше способе получения 13. Примерное время, необходимое для растворения 0,005 мл этой композиции, составляет более 300 мин. Время, необходимое для растворения 0,005 мл образца коммерческого гумулина Ν и 100 в аналогичных условиях, равно примерно 10 мин.

Общую эффективность и эффективность в супернатанте определяют при помощи ВЭЖХ, как это описано в способе получения 13. Общая эффективность равна 3,44 мг/мл. Как установлено, концентрация растворимого инсулина человека и В29-№-октаноилинсулина человека в кристаллической композиции равна 0,01 мг/мл. Пропорции инсулина человека и В29-№-окта ноилинсулина человека в кристаллической фазе определяют в соответствии с процедурой, описанной в способе получения 13, при этом обнаружено 25,5% инсулина человека и 74,5% В29Νε-октаноилинсулина человека.

Средний диаметр кристаллов, измеренный в соответствии со способом получения 14, равен примерно 6 мкм, при наличии практически нормального распределения в диапазоне размеров частиц от около 2 до около 12 мкм. Этот результат аналогичен распределению частиц по размерам коммерческого ΝΡΗ, о чем сообщают в своей работе Эе Гейрр1з, М.К., е! а1., см. выше.

Способ получения 16. Сравнение сокристаллов трех композиций с композицией на основе инсулина.

Получают кислый раствор В29-№-октаноилинсулина человека, растворяя 24,18 мг В29Νε-октаноилинсулина человека в 0,6 мл 0,1н. раствора НС1. Получают кислый раствор инсулина человека, растворяя 41,1 мг инсулина человека (в виде кристаллов цинка) в 1 мл 0,1н. раствора НС1. Получают четыре раствора по 0,4 мл каждый, смешивая растворы В29-№-октаноилинсулина человека и инсулина человека в разных объемах, как это показано в нижеследующей табл. 4.

Таблица 4. Получение микрокристаллических композиций

	Композиция
э	С	В	А
Номинальные мас.% В29-№октаноилинсулина человека	75	50	25	0
Объем добавляемого раствора В29Νε-октаноилинсулина человека, мкл	300	200	100	0
Объем добавляемого раствора инсулина человека, мкл	100	200	300	400

К каждому из четырех 0,4 мл растворов добавляют 0,15 мл раствора 1000 частей на миллион цинка(11). К каждому из четырех 0,55 мл растворов добавляют 1,6 мл вызывающего кристаллизацию разбавителя (50 мМ трисбуфера, 10 мг/мл фенола, 100 мМ тринатрийцитрата, рН 7,6). Все четыре раствора доводят до рН 7,6, добавляя небольшие количества 1н. раствора №1ОН и 0,1н. раствора НС1. Все растворы фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. 2 мл каждого из четырех растворов белка смешивают с 2 мл раствора протамина (7,34 мг сульфата протамина в 10 мл воды). Во всех случаях сразу же образуется осадок. Все четыре 4 мл суспензии оставляют выстаиваться в покое при комнатной температуре (примерно 22°С) в течение 16 ч.

Микроскопическое исследование (через 16 ч) показывает, что во всех четырех препаратах получены однородные, одиночные, палочкообразные кристаллы со средней длиной около 10 мкм.

Все 4 мл композиции переносят в пробирки и центрифугируют в настольной центрифуге со скоростью 3000 об./мин в течение 20 мин до полного осаждения кристаллов. Из каждой композиции удаляют 3 мл супернатанта и заменяют его 3 мл разбавителя (25 мМ трис-буфера, 5 мг/мл фенола, 16 мг/мл глицерина, рН 7,4). Затем кристаллы повторно суспендируют. Эту процедуру выполняют трижды за исключением того, что в третий раз 3 мл супернатанта заменяют 2,5 мл разбавителя во всех композициях.

Все четыре композиции анализируют ВЭЖХ с целью количественного определения общей эффективности композиций и составов соответствующих кристаллов, как это описано выше. Общая эффективность относится к общей концентрации инсулина человека и В29-№октаноилинсулина человека. Общую эффективность и процентное содержание В29-№-октаноилинсулина человека определяют, анализируя аликвоту однородно суспендированной композиции. Супернатант анализируют для определения общей концентрации растворимого инсулина человека и растворимого В29-№-октаноилинсулина человека в каждой композиции. Результаты этих анализов приведены ниже. Время растворения определяют так, как это описано выше в способе получения 13.

Таблица 5. Характеристики микрокристаллических композиций

	Композиции
э	С	В	А	ΝΡΗ
В29-№-октаноилинсулин человека в кристаллах, %	77,7	51,4	23,7	0	-
Инсулин человека в кристаллах, %	22,3	48,6	76,3	100	-
Общая эффективность, мг/мл	3,21	3,48	3,38	3,43	-
Эффективность супернатанта, мг/мл	<0,01	<9,01	<0,01	<0,01	-
Время растворения, мин	300	120	50	20	10

Способ получения 17. Получение нерастворимых композиций.

Ниже описан еще один способ, предназначенный для получения осадков и микрокристаллов по настоящему изобретению. Это описание следует рассматривать вместе с данными, приведенными в нижеследующей табл. 6.

Измеренную массу производного белка, полученного в соответствии с вышеописанным способом, растворяют в 0,6 мл 0,1н. раствора НС1. Измеренную массу белка растворяют в 0,2 мл 0,1н. раствора НС1 (цинковые кристаллы инсулина человека или аналог ЬузВ28,Рго29инсулина человека). Оба раствора объединяют, перемешивая в течение 5-10 мин. К смеси двух белков добавляют требуемый объем (0,32 мл) водного раствора, содержащего 1000 частей на миллион Ζπ(ΙΙ), и требуемый объем (3,2 мл) раствора разбавителя (около 50 мМ трис-реагента, около 10 мг/мл фенола, около 16 мг/мл глицерина и около 29,5 мг/мл тринатрийцитрата). Показатель рН полученного раствора доводят до около 7,6 (7,55-7,64), добавляя 1н. раствор НС1 или 1н. раствор №1ОН. Раствор с отрегулированным показателем рН фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием бел69 ка. К 4 мл фильтрата добавляют 4 мл раствора протамина в воде (около 37,3 мг сульфата протамина на 100 мл в диапазоне 37,18-37,48). Сразу же после добавления раствора протамина образуется осадок. Препарат оставляют выстаиваться в покое при 25°С. Испытания на растворение выполняют так, как это описано выше. Инсулин ΝΡΗ растворяют в аналогичных условиях в течение примерно 6 мин.

Таблица 6. Получение нерастворимых композиций

Белок	Аналог Ьу8(В28),Рго(В29)ннсулнна человека
Масса белка, мг	4,28	4,02	3,84	3,96	4,15
Производный белок	В29-ацнлнрованный инсулин человека
Группа, образующая производное	Бута- ноил	Пентаноил	Гекса- ноил	Нонаноил	Деканоил
Масса производ ного белка, мг	11,90	12,1	12,08	12,13	12,20
Форма кристалла	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный
Выход, %	>80	>90	>90	>90	>90
Производный белок в ^растворимой фазе, %	77,5	75,1	77	76,5	76,6
Время растворения, мин	23-24	31	54	67	37-38

Белок	Инсулин человека
Масса белка, мг	12,09	12,18	12,12	12,21	12,27
Производный белок	Аналог В28-ацилированного ^у8(В28),Ρ^о(В29)ннсулнна человека	А1, В28-диацилированный Ьу8(В28),Рто(В29) инсулин человека
Группа, образующая производное	Бута- ноил	Гекса- ноил	Октаноил	Дибута- ноил	Дигексаноил
Масса производ ного белка, мг	4,39	4,21	4,28	4,11	4,23
Форма кристалла	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный
Выход, %	>80	>90	>90	>90	>90
Производный белок в ^растворимой фазе, %	27,6	25	27	26,8	24,1
Время растворения, мин	16-17	10-11	27-28	10-11	20-21

Белок	Инс	улин человека
Масса белка, мг	4,26	4,26	4,13	4,23	12,09
Производный белок	В29-ацнлнрованный инсулин человека
Группа, образующая производное	Бута- ноил	Пентаноил	Гекса- ноил	Нонаноил	Тетрадеканоил
Масса производ ного белка, мг	12,39	12,39	12,03	12,06	4,16
Форма кристалла	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный
Выход, %	>90	>72	>90	>90	>90
Производный белок в ^растворимой фазе, %	76,3	76,5	75	72,5	25,07
Время растворения, мин	45-46	62-63	77-78	77-78	61

Форма кристалла	Палочкообразный
Выход, %	>90
Производный белок в нерастворимой фазе, %	24,7
Время растворения, мин	71-72

Ниже дано описание еще одного способа, предназначенного для получения осадков и микрокристаллов по настоящему изобретению. Это описание следует рассматривать вместе с данными, приведенными в нижеследующей табл. 7.

Измеренную массу производного белка, полученного в соответствий с вышеописанным способом, растворяют в 3,2 мл раствора разбавителя (около 50 мМ трис-реагента, около 10 мг/мл фенола, около 16 мг/мл глицерина и около 29,5 мг/мл тринатрийцитрата). Измеренную массу белка растворяют в 0,6 мл 0,1н. раствора НС1 (цинковые кристаллы инсулина человека или аналога ЬукВ28,Рго29-инсулина человека). Оба раствора тщательно смешивают, перемешивая в течение 5-10 мин. Показатель рН полученного раствора доводят примерно до 7,6 (7,55-7,64), добавляя 1н. раствор НС1 или 1н. раствор №ОИ. Раствор с отрегулированным показателем рН фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. К требуемому объему фильтрата добавляют равный объем раствора протамина в воде (около 37,3 мг сульфата протамина на 100 мл в диапазоне 37,18-37,48). Сразу же после добавления раствора протамина образуется осадок. Препарат оставляют выстаиваться в покое при 25°С. Испытания на растворение выполняют в соответствии с вышеописанным способом. В аналогичных условиях инсулин ΝΡΗ растворяется в течение примерно 6 мин.

Таблица 7. Получение нерастворимых композиций

Белок	Инсулин человека
Масса белка, мг	12,19	11,87	12,15	12,28	12,22
Производный белок	А1, В29-днацнлннсулнн человека	А1, В28диацилированный ЬукВ28, РгоВ29инсулин человека	Аналог В29ацил- А8рВ28инсулина человека
Группа, образующая производное	Диоктаноил	Динонаноил	Дидеканоил	Диоктаноил	Октаноил
Масса производного белка, мг	4,29	4,07	4,06	4,29	3,98
Форма кристалла	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный
Выход, %	>80	>90	>90	>90	>90
Производный белок в ^растворимой фазе, %	25,2	24,6	26,6	27,4	24,4
Время растворения, мин	73-74	25	31-32	47-48	43-44

Белок	Инсулин человека
Масса белка, мг	12,19
Производный белок	В29-ацнлнрованный инсулин человека
Группа, образующая производное	Гексадеканоил
Масса производного белка, мг	3,99

Ниже дано описание еще одного способа, предназначенного для получения осадков и микрокристаллов по настоящему изобретению.

Это описание следует рассматривать вместе с данными, приведенными в нижеследующей табл. 8.

Измеренную массу производного белка, полученного в соответствии с вышеописанным способом, растворяют в измеренном объеме 0,1н. раствора НС1. Измеренную массу белка растворяют в измеренном объеме 0,1н. раствора НС1 (цинковые кристаллы инсулина человека или аналога ЕукВ28.Рго29 инсулина человека). Измеренные объемы обоих растворов тщательно смешивают, перемешивая в течение 5-10 мин. Измеренные объемы водного раствора, содержащего 1000 частей на миллион Ζη(ΙΙ), и раствора разбавителя (около 50 мМ трис-реагента, около 10 мг/мл фенола, около 32 мг/мл глицерина и около 30 мг/мл дигидрата тринатрийцитрата, рН 8,47) добавляют к смеси двух белков. Показатель рН полученного раствора доводят примерно до 7,6 (7,58-7,63), добавляя 1н. раствор НС1 или 1н. раствор ΝαΟΗ. Раствор с отрегулированным показателем рН фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. К 2 мл фильтрата добавляют 2 мл раствора протамина в воде (около 37,5 мг сульфата протамина на 100 мл). Сразу же после добавления раствора протамина образуется осадок. Препарат оставляют выстаиваться в покое при 25°С. Испытания на растворение выполняют в соответствии с вышеописанным способом. В аналогичных условиях инсулин ΝΡΗ растворяется в течение примерно 6 мин.

Таблица 8. Получение нерастворимых композиций

Белок	Инсулин человека
Масса белка, мг	11,3	11,3	33,6	33,6	16,5
Объем 0,1 н раствора НС1	0,57	0,57	1,68	1,68	0,83
Производный белок	В29-ацилированный инсулин человека
Группа, образующая производное	2-Метил гексаноил	2-Этилгексаноил	4-Метилоктаноил	3-Метилдеканоил	Додека- ноил
Масса производ ного белка, мг	6,07	6,3	6,12	2,12	6,3
Объем 0,1 н раствора НС1	0,3	0,3	0,3	0,1	0,3
Кол-во раствора (мл) белка, смешиваемого с кол-вом раствора (мл) производного белка	0,10+ 0,30	0,10+ 0,30	0,10+ 0,30	0,30+ 0,10	0,10+ 0,30
Раствор 1000 частей на 1000000 цинка, мл	0,152	0,152	0,112	0,096	0,152
Объем разбавителя, мг	1,6	1,6	1,6	1,6	1,6
Форма кристалла	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный	Палочкообразный
Выход, %	>90	>90			>80
Производный белок в ^растворимой фазе, %	74,1	75,5			81,9
Время растворения, мин	116	236			40

белок	рованный инсулин кролика	рованный инсулин свиньи	рованный инсулин овцы	рованный инсулин человека
Группа, образующая производное	Октаноил	Октаноил	Гексаноил	Гексаноил
Масса производного белка, мг	6,21	6,07	6,07	6,21
Объем 0,1 н раства НС1	0,3	0,3	0,3	0,1
Кол-во раствора (мл) белка, смешиваемого с кол-вом раствора (мл) производного белка	0,1+0,3	0,1+0,3	0,1+0,3	0,3+0,1
Раствор 1000частей на 1000000 цинка, мл	0,152	0,152	0,152	0,152
Объем разбавителя, мг	1,6	1,6	1,6	1,6
Форма кристалла	Палочкообразный	Палочкообразный	Мелкий неупорядоченный	Палочкообразный
Выход, %	>90	>90	>90	>90
Производный белок в ^растворимой фазе, %	74,6	74,6	75,4	75,9
Время растворения, мин	111	>300	227	>300

Белок	Инсулин человека
Масса белка, мг	33,6	2,4	22,6
Объем 0,1 н раствора НС1	1,68	0,1	1,12
Производный белок	Аналог В29ацилированного О&(А21)А1Э(В31) Агд(В32)инсулина человека	В29-ацилированный инсулин человека	Аналог В29ацилированного дес-Тйг(В30)инсулина человека
Группа, образующая производное	Деканоил	1,4-Дихлорфенилтиоацетил	Октаноил
Масса производного белка, мг	2,23	5,1	6,06
Объем 0,1 н раства НС1	0,1	0,3	0,3
Кол-во раствора (мл) белка, смешиваемого с кол-вом раствора (мл) производного белка	0,3+0,1	0,1+0,3	0,1+0,3
Раствор 1000частей на 1000000 цинка, мл	0,096	0,152	0,152
Объем разбавителя, мг	1,6*	1,6	1,6
Форма кристалла	Палочкообразный	Мелкие неупорядочен. кристаллы	Палочкообразный
Выход, %	>90	>90	>90
Производный белок в ^растворимой фазе, %	20,4	71,8	74,2
Время растворения, мин	63	66	>300

* Перед добавлением разбавителя 2,096 мл 37,5 мг/100 мл раствора сульфата протамина. Показатель рН регулируют после добавления разбавителя.

Белок	Инсулин человека
Масса белка, мг	22,3	22,3	22,3	22,3
Объем 0,1 н раствора НС1	1,12	1,12	1,12	1,12
Производный	В29-ацили-	В29-ацили-	В29-ацили-	В29-ацили-

Способ получения 18. Получение аморфной суспензии.

Измеренную массу (13,84 мг белка) твердого аналога В28-тетрадеканоил Γνκ(Β28),ΡΐΌ(Β29)73 инсулина человека растворяют в 0,375 мл 0,1н. раствора НС1. Измеренную массу инсулина человека (7,40 мг белка) с цинком растворяют в 207 мкл 0,1н. раствора НС1. Аликвоту (125 мкл) раствора инсулина (содержащего 4,47 мг инсулина человека) добавляют к раствору аналога В28тетрадеканоил-Ьук(В28),Рго(В29)инсулина человека. Затем добавляют требуемый объем (180 мкл) раствора 1000 частей на 1000000 цинка и 2,0 мл разбавителя (1,6 мг/мл фенола, 4 мг/мл мкрезола, 40 мг/мл глицерина, 5 мг/мл безводного двухосновного фосфата натрия, 7,5 мг/мл дигидрата тринатрийфосфата, рН 7,6). Показатель рН увеличивают с 5,6 до 8,0, добавляя 100 мкл 1н. раствора №ΘΗ, и затем уменьшают до 7,59, добавляя 20 мкл 1н. раствора НС1 и 1н. раствора ΝηΘΗ. Концентрация аналога В28-тетрадеканоил-Ьук(В28),Рго(В29)инсулина человека равна 4,94 мг/мл, и концентрация инсулина человека равна 1,60 мг/мл. Раствор фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка и помещают на ночь в холодильник. На следующее утро осадок в растворе отсутствует. К 2,50 мл раствора добавляют 2,88 мл раствора протамина (0,75 мг/мл твердого сульфата протамина, растворенного в воде). После добавления протамина образуется аморфный осадок.

Закончив добавление протамина, снова определяют концентрацию аналога В28-тетрадеканоил-Ьук(В28),Рго(В29)инсулина человека и инсулина человека в жидкой фазе. Образцы для анализа ВЭЖХ готовят сразу же после добавления протамина. На основании времени удерживания пиков анализа ВЭЖХ можно установить, что нерастворимое вещество в суспензии состоит из протамина, аналога В28-тетрадеканоилЬук(В28),Рго(В29)инсулина человека и инсулина человека. Концентрация аналога В28-тетрадеканоил-Ьук(В28),Рго(В29) инсулина человека в жидкой фазе равна 2,30 мг/мл, и концентрация инсулина человека равна 0,74 мг/мл.

Полученные концентрации аналога В28тетрадеканоил-Ьук(В28),Рго(В29)инсулина человека и инсулина человека в подкисленных образцах суспензии, супернатанте и осадке приведены в нижеследующей таблице. Все эти данные обоснованно согласуются с предполагаемыми результатами. Количественное определение концентрации протамина не производилось.

Таблица 9. Получение нерастворимых композиций

	Концентрация, мг/мл	Масса в %
Образец	Аналог В28-тетрадеканоил-Ьук(В28),Рго(В29)инсулина человека	Инсулин человека
Суспензия	2,52	0,79	76,2
Супернатант	0,006	0,057	8,9
Осадок	2,29	0,60	79,2

Способ получения 19. Получение аморфных суспензий.

Ниже дано описание еще одного способа получения осадков по настоящему изобретению. Этот способ предназначен для получения аморфных осадков инсулина с использованием трех производных белков: В29-№-октаноилинсулина человека; В29-№-нонаноилинсулина человека и аналога В28-№-октаноил-ЬукВ29, РгоВ29-инсулина человека.

Измеренную массу твердого производного белка растворяют в 3 мл 0,1н. раствора НС1 с получением раствора, содержащего примерно 16 мг/мл производного белка. Измеренную массу цинковых кристаллов инсулина человека (73 мг, из которых 67,17 мг составляет белок) растворяют в 4,198 мл 0,1н. раствора НС1 с получением раствора, содержащего примерно 16 мг/мл инсулина. 3 мл раствора производного белка и 1 мл раствора инсулина объединяют и тщательно смешивают. Добавляют измеренные объемы раствора 1000 частей на 1000000 цинка (1,137 мл) и разбавителя (16 мл, содержащего в 1 мл 1,625 мг фенола, 4 мг м-крезола, 40 мг глицерина, 5 мг безводного двухосновного фосфата натрия, 7,5 мг дигидрата тринатрийцитрата, рН 7,6). Показатель рН доводят примерно до 7,6 (7,58-7,61), добавляя 5н. раствор ΝηΘΗ и 5н. раствор НС1. Объем, добавляемый во время регулирования рН, составляет от 0,11 до 0,12 мл. Раствор фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка и помещают на ночь в холодильник. На следующее утро в растворе отсутствует осадок. Раствор состоит из белка и производного белка (массовое отношение примерно равно 1:3), и общая концентрация белка эквивалентна примерно 85 ед./мл. Перед испытанием на крысах равные объемы этого раствора и раствора сульфата протамина (0,352 мг/мл) объединяют и тщательно смешивают. Сразу же образуется аморфный осадок. Образец суспензии, содержащей аморфный осадок, сразу же инъецируют испытуемым животным. После смешивания с протамином концентрация общего белка составляет примерно 42,4 ед./мл.

Способ получения 20.

Аналог 61у(А21),Агд(В31),Агд(В32)инсулина человека.

61у(А21)Агд(В31)Агд(В32)инсулин человека получают из Е.соН ферментацией, в которой молекулу предшественника С1у(А21)проинсулина человека сверхпродуцируют во внутриклеточных тельцах. Порцию (94,7 г) внутриклеточных телец солюбилизируют при комнатной температуре в 500 мл 6М раствора гидрохлорида гуанидина, содержащего 0,1М ТШ8, 0,27М сульфита натрия и 0,1М тетратионата натрия, рН 10,5. Показатель рН быстро понижают до 8,8, добавляя 12н. раствор НС1. Смесь интенсивно перемешивают в открытой емкости в течение 45 мин, показатель рН понижают до 2,1, добавляя фосфорную кислоту, и образец центрифугируют в течение ночи при 4°С. Супернатант сливают и хранят при 4°С до выполнения дополнительной обработки. Осадок повторно экстрагируют 200 мл дополнительного раствора с рН 10,5 (см. выше) и центрифугируют в течение 3 ч при 4°С. Этот и ранее полученный супернатант разводят в 4 раза 100 мМ фосфата натрия, рН 4, в результате чего происходит осаждение продукта и других кислых компонентов. После полного осаждения осадка большую часть супернатанта сливают и выбрасывают. Полученную суспензию центрифугируют, после чего сливают и выбрасывают дополнительный супернатант, что позволяет получить мокрый осадок сырого предшественника 8сульфоната С1у(А21)проинсулина человека. Осадок солюбилизируют в 1,5 л 7М раствора деионизированной мочевины, доводят показатель рН до 8, добавляя 5н. раствор №ΟΗ, и перемешивают в течение нескольких часов при 4°С. Добавляют соль (№1С1) до достижения 1М концентрации и образец вводят в колонку ХАО-7 (14 см х 20 см, Тозо-Иааз, Моп!дотетууШе, РА), которую предварительно промывают 50% ацетонитрила/50% 50 мМ бикарбоната аммония, 10% ацетонитрила/90% 50 мМ бикарбоната аммония и, наконец, раствором 7М деионизированной мочевины/1М №10/20 мМ ТК18, рН 8. Колонку с введенным в нее образцом прокачивают 4,5 л раствора 7М деионизированной мочевины/1М N<10/20 мМ ТК18, рН 8, и затем 2,8 л раствора 50 мМ бикарбоната аммония/1М №1С1 и 6,5 л 50 мМ бикарбоната аммония. Колонку элюируют линейным градиентом ацетонитрила в 50 мМ бикарбоната аммония, контролируя элюент ультрафиолетовой спектроскопией при 280 нм. Очищенный предшественник 8-сульфоната О1у(А21)проинсулина человека, пик которого представляет особый интерес, собирают, лиофилизуют и подвергают нижеследующей процедуре укладки/дисульфидного связывания. Полученный предшественник (5,4 г) растворяют в 3 л 20 мМ глицина, рН 10,5, 4°С. Затем добавляют, перемешивая, 15 мл 240 мМ НС1 цистеина, сохраняя рН равным 10,5, при температуре 4°С. Реакционный раствор осторожно перемешивают при 4°С в течение 27 ч и останавливают реакцию, понижая рН до 3,1 фосфорной кислотой. Добавляют ацетонитрил (155 мл) и вводят раствор в колонку с обращенной фазой С4 5х25 см, которую предварительно прокачивают 60% ацетонитрила/40% воды/0,1% ТФУ и уравновешивают в 10% ацетонитрила/90% воды/0,1% ТФУ. Колонку с введенным в нее образцом прокачивают 1 л 17,5% ацетонитрила/82,5% воды/0,1% ТФУ и элюируют линейным градиентом ацетонитрила в 0,1% ТФУ, контролируя процесс при 280 нм. Выбранные фракции собирают и лиофилизуют, что дает 714 мг. Чтобы превратить предшественник проинсулина в требуемый аналог инсулина, 697 мг предшественника О1у(А21)проинсулина человека растворяют в 70 мл 50 мМ бикарбоната аммония и охлаждают до 4°С, рН 8,3. К раствору образца, который осторожно перемешивают при 4°С в течение 24 ч, добавляют 0,14 мл 1 мг/мл раствора трипсина свиньи (81дта СБетюа1 Сотрапу, 8!. Ьошз, Мо) в 0,01н. растворе НС1. К реакционному раствору добавляют еще 0,14 мл раствора трипсина и перемешивают в течение 21 ч 45 мин. Реакцию останавливают, для чего рН понижают до 3,2, добавляя 0,7 мл ледяной уксусной кислоты и 0,3 мл фосфорной кислоты. Раствор образца О1у(А21)Атд(В31)Агд(В32)инсулина человека, полученный в результате осуществления реакции триптического гидролиза, разводят в 4 раза 30% ацетонитрила/70% 50 мМ уксусной кислоты, рН 3,1, и вводят в катионообменную колонку 1х30 см 8 ЧуреЮ Р (Вюзерта, МайЬогоидЬ, МА), которую предварительно прокачивают 30% ацетонитрила/70% 50 мМ уксусной кислоты/500 мМ №С1, рН 3,3, и уравновешивают в 30% ацетонитрила/70% 50 мМ уксусной кислоты. Колонку с введенным в нее образцом прокачивают примерно 50 мл 30% ацетонитрила/70% 50 мМ уксусной кислоты и элюируют линейным градиентом №1С1 в 30% ацетонитрила/50 мМ уксусной кислоты, контролируя элюент при 276 нм. Выбранные фракции, содержащие О1у(А21)Атд(В31)Атд(В32)инсулин человека, собирают, разводят в 3 раза очищенной водой и вводят в колонку с обращенной фазой С4 2,2х25 см (Уубас, ^зрена, СА), которую предварительно прокачивают 60% ацетонитрила/40% воды/ 0,1% ТФУ и затем 10% ацетонитрила/90% воды/0,1% ТФУ. Колонку с введенным в нее образцом прокачивают примерно 200 мл 10% ацетонитрила/90% воды/0,1% ТФУ и элюируют линейным градиентом ацетонитрила в 0,1% ТФУ. Выбранные фракции собирают и лиофилизуют с получением 101 мг вещества. Результаты аналитической ВЭЖХ показывают, что чистота образца выше 95% главного пика. Масс-спектроскопия с электрораспылением (Е8М8) очищенного белка позволяет получить молекулярную массу, равную 6062,9 (теоретическое значение 6063,0).

Способ получения 21. Дес(В30)инсулин человека.

Дес(В30)инсулин человека получают из проинсулина человека регулируемым триптическим гидролизом. Проинсулин человека (2 г), биологически синтезированный в рекомбинантной Е.соН и очищенный известными методами [Ргапк, В.Н., е! а1., ίη РЕРТГОЕ8: 8уп111ез1з81гис1иге-Еипс1юп. РгосееФпдз о£ 1Не 8емеп111 Атепсап РерПНе 8утрозшт, КтсБ, Ό.Η. апб Огозз, Е. (Ебз.), Р1егсе СБетка1 Сотрапу, КоскРогб, рр. 729-738, 1981; а также Ргапк, В.Н., патент США № 4430266, выданный 7 февраля 1984г., которые включены в это описание изобретения в качестве ссылки], растворяют в 400 мл 0,1М буфера ЧЕРЕ8, рН 7,5. К полученному раствору добавляют 8 мл 1М раствора СаС1₂ (в воде) и доводят рН до 7,5, добавляя 5н. раствор ΝηΟΗ, после чего в раствор образца, слегка пе ремешивая, вводят 2 мл 10 мг/мл раствора трипсина свиньи (81дта) в 0,01н. растворе НС1. Реакционный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч 42 мин и переносят в среду с температурой 37°С, продолжая периодически перемешивать. Раствор выдерживают в течение 1 ч 45 мин при 37°С и останавливают ферментативную реакцию, для чего рН понижают до 3,0, добавляя фосфорную кислоту, и хранят раствор при 4°С. Затем раствор нагревают до комнатной температуры, разводят 50 мл ацетонитрила и 500 мл очищенной воды до конечного объема, вводят в колонку СО-161 2,5х58 см (Токо-Наак), которую предварительно прокачивают 1 объемом (объем колонки) 40% ацетонитрила/60% 0,1М сульфата аммония, рН 2,5, и 2 объемами 10% ацетонитрила/90% 0,1М сульфата аммония, рН 2,5. Колонку с введенным в нее образцом прокачивают 1 объемом 10% ацетонитрила/90% 0,1М сульфата аммония, рН 2,5. Колонку элюируют линейным градиентом ацетонитрила в 0,1М растворе сульфата аммония, рН 2,5, контролируя элюент при 276 нм. Частично очищенный дес(В30)инсулин человека, пик которого представляет особый интерес, получают, собирая выбранные фракции. Собранные фракции образца частичного очищенного дес(В30)-инсулина человека разводят до 1,28 л очищенной водой, рН 3,5, и вводят в катионообменную колонку 8 НуреЮ Р 1х29 см (Вюкерга), которую предварительно прокачивают 1 объемом 30% ацетонитрила/70% 0,1% ТФУ/0,5М №С1, рН 1,9, и 2 объемами 30% ацетонитрила/70% 0,1% ТФУ, рН 2,3. Колонку с введенным в нее образцом прокачивают 1 объемом 30% ацетонитрила/70% 0,1% ТФУ, рН 2,3, и элюируют линейным градиентом ΝηΟΊ в 30% ацетонитрила/70% 0,1% ТФУ, рН 1,9-2,3, контролируя элюент при 276 нм. Выбранные фракции, содержащие очищенный дес(В30)инсулин человека, разводят в

2.5 раза очищенной водой и вводят в колонку С8 8ерРак (35 куб.см.) (\Уа1егк, МПГогй, МА), которую предварительно очищают и заполняют 2 объемами ацетонитрила, 2 объемами 60% ацетонитрила/40% 0,1% ТФУ и 2 объемами 10% ацетонитрила/90% 0,1% ТФУ. Колонку 8ерРак с введенным в нее образцом промывают 3 объемами 10% ацетонитрила/90% 0,1% ТФУ и элюируют 2 объемами 60% ацетонитрила/40% 0,1% ТФУ. Лиофилизованный элюент дает 500 мг вещества. Результаты аналитической ВЭЖХ показывают, что чистота образца выше 95% главного пика. Масс-спектроскопия с электрораспылением (Е8М8) очищенного белка позволяет получить молекулярную массу, равную

5706.5 (теоретическое значение 5707).

Способ получения 22. Инсулин кролика.

Инсулин кролика получают по методу, описанному Сйапсе, К.Е., е! а1., [Рготкийп, 1пки1т, С-Рерййе, ВаЬа, 8., е! а1., (Ейк.), Ехсегр!а Мей1са, Атк!егйат-ОхГогй, рр. 99-105 (1979)].

Способ получения 23. Аналог Акр(В28)инсулина человека.

Акр(В28)инсулин человека получают и очищают в соответствии со способами по примерам 31 и 32, описанными в патенте Сйапсе, Р.Е., е! а1. (патент США № 5700662, выданный 23 декабря 1997г.), который включен в это описание изобретения в качестве ссылки. Дес(В2330)инсулин человека [Вготег, ν.ν. апй Сйапсе, К.Е., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 133:219-223 (1967), включенный в это описание изобретения в качестве ссылки] и синтетический октапептид С1уРйе-Рйе-Туг-Тйг-Акр-Еук(ТГа)-Тйг конденсируют полусинтезом с использованием трипсина, очищают гель-фильтрацией и ВЭЖХ с обращенной фазой, обрабатывают 15% гидроксидом аммония (в объемном отношении) в течение 4 ч при комнатной температуре, чтобы удалить трифторацетатную (ТГа) блокирующую группу из Ьук(В29), очищают ВЭЖХ с обращенной фазой и лиофилизуют.

Способ получения 24. Синтез производных белков.

Ниже дано описание синтеза некоторых производных белков, используемых для получения осадков и микрокристаллов по настоящему изобретению. Это описание следует рассматривать вместе с данными, приведенными в нижеследующей табл. 10.

Измеренную массу очищенного инсулина или аналога инсулина растворяют, перемешивая, в измеренном объеме диметилсульфоксида (ДМСО). Затем добавляют измеренный объем гидрохлорида тетраметилгуанидина (ТМС) и полученный раствор тщательно перемешивают. В отдельной емкости измеренную массу Νацилсукцинимида ^А8) растворяют в измеренном объеме ДМСО. К первому раствору добавляют измеренный объем второго раствора. Реакцию осуществляют при комнатной температуре и ход реакции контролируют, анализируя образцы реакционной смеси при помощи ВЭЖХ. Реакцию останавливают, добавляя измеренный объем этаноламина, и подкисляют до рН 2-3.

Реакционную смесь очищают хроматографией с обращенной фазой или катионообменной хроматографией с последующим выполнением хроматографии с обращенной фазой. Очистку хроматографией с обращенной фазой осуществляют при комнатной температуре, используя систему РРЬС® (фармакопея), которая включает ультрафиолетовое детектирование при 214 или 280 нм, сбор фракций из колонки С18 2,2х25 см или 5х30 см со скоростью потока 2,5 или 5 мл/мин. Жидкие фазы представляют собой смеси раствора А [0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ) в смеси ацетонитрила и воды с отношением 10:90 (в объемном отношении)] и раствора В [0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ) в смеси ацетонитрила и воды с отношением 70:30 (в объемном отношении)], которые позволяют элюировать и отделять представляющие интерес виды. Колонку уравновешивают и вводят в нее 100% раствора А. Затем ис пользуют линейный градиент раствора В для правильного разделения продуктов реакции. Собирают фракции, содержащие продукт. Их очистку производят методами, известными в этой области.

В нижеследующей табл. 10 приведены относящиеся к описанию экспериментальные данные, которые необходимы для синтеза производных белков, используемых в разных вариантах осуществления настоящего изобретения. Исходные белки получают так, как описано выше, или в соответствии с известными методами. Хорошо очищенные исходные белки для описанного ниже синтеза получают известными методами очистки. Синтез инсулина, аналогов инсулина и проинсулина хорошо известен в этой области и может быть осуществлен методом рекомбинантной экспрессии, полусинтеза или твердофазного синтеза с последующим соединением цепи. Очистку синтезированных белков до чистоты, достаточной для получения производных, используемых по настоящему изобретению, производят обычными методами.

Молекулярную массу очищенных производных определяют масс-спектроскопией с электрораспылением (Е8М8). Наличие сайта ацилирования определяют хроматографическим анализом (ВЭЖХ), или анализом Ν-конца (Νконец), либо тем и другим способами вместе.

Таблица 10. Краткий обзор синтеза разных производных белков

Исходный белок	Инсулин человека	Инсулин человека	Инсулин человека
Масса белка, мг	141,3	1,080	120
ДМСО, мл	42	30	36
ТМО, мкл	30,5	233	25,9
Ацильная цель NА8	н-Гексаноил	н-Октаноил	нДодеканоил
Масса NА8, мг	7,76	85,7	9,22
Объем ДМСО, мл	1,0	1,0	0,701
Объем добавляемого раствора NА8, мл	0,494	0,785	0,701
Время реакции, мин	40	105	40
Объем этаноламина, мкл	20	100	120
Общий выход, %	40	33	36
Молекулярная масса (теоретическое значение)	5906,0	5933,9	5990,0
Молекулярная масса (Е8М8)	5906,8	5933,9	5990,0
Чистота по результатам ВЭЖХ, %	96	94	98
Сайт ацилирования (ВЭЖХ)	Νε	Νε	Νε
Сайт ацилирования (Ν-конец)	Νε	Νε	Νε

Исходный белок	Инсулин человека	Инсулин человека	Инсулин человека
Масса белка, мг	194	2040	2050
ДМСО, мл	60	62	58
ТМО, мкл	41,9	441	443
Ацильная цель NА8	н-Тетрадеканоил	н-Бутирил	н-Гексаноил
Масса NА8, мг	23,4	269,3	209
Объем ДМСО, мл	1,0	1,0	2,0
Объем добавляемого раствора NА8, мл	0,756	0,29	1,44
Время реакции, мин	20	30	30
Объем этаноламина, мкл	5	100	100
Общий выход, %	45	27*	22
Молекулярная масса (теоретическое значение)	6018,1	5877,8	5905,9

Молекулярная масса (Е8М8)	6018,2	5877,8	5906,0
Чистота по результатам ВЭЖХ, %	98	94	93
Сайт ацилирования (ВЭЖХ)	Νε	Νε	Νε
Сайт ацилирования (Ν-конец)	Νε	-	-

* Очистку производят сначала ВЭЖХ с обращенной фазой, затем катионообменной ВЭЖХ и наконец ВЭЖХ с обращенной фазой.

Ниже дано описание синтеза дополнительных производных белков. Это описание следует рассматривать вместе с данными, приведенными в нижеследующей табл. 11, чтобы получить полное представление о схемах синтеза.

Измеренную массу очищенного инсулина или аналога инсулина растворяют, добавляя к ней измеренный объем 50 мМ борной кислоты, рН 2,57. Затем медленно добавляют, перемешивая, измеренный объем ацетонитрила, равный объему раствора борной кислоты. Объем растворителя представляет собой сумму объемов борной кислоты и ацетонитрила. Показатель рН раствора доводят до 10,2-10,5, добавляя ΝηΟΗ. Измененную массу Ν-ацилсукцинимида (ΝΆ8) растворяют в отдельной емкости в измеренном объеме ДМСО. К первому раствору добавляют измеренный объем второго раствора. Реакцию осуществляют при комнатной температуре, при необходимости поддерживая значение рН выше 10,2, и ход реакции контролируют, анализируя образцы реакционной смеси при помощи ВЭЖХ. Реакцию останавливают, подкисляя ее до рН 2-3. Затем реакционную смесь очищают хроматографией с обращенной фазой, как это описано выше.

В табл. 11 приведены относящиеся к описанию экспериментальные данные, которые необходимы для синтеза производных белков, используемых в разных вариантах осуществления настоящего изобретения. Молекулярную массу очищенных производных определяют масс-спектроскопией с электрораспылением (Е8М8). Наличие сайта ацилирования определяют хроматографическим анализом (ВЭЖХ), или анализом Ν-конца (Ν-конец), либо тем и другим способами вместе.

Таблица 11. Краткий обзор синтеза разных производных белков

Исходный белок	Инсулин человека	Инсулин человека	Инсулин человека
Масса белка, мг	2170	2420	2250
Растворитель, мл	200	240	200
Ацильная цель NА8	н-Бутирил	н-Пентаноил	н-Октаноил
Масса Ν-ацилсукцинимида, мг	108,7	1155	173
Объем ДМСО, мл	1,0	5	1,0
Объем добавляемого раствора NА8, мл	0,955	0,719	0,81
Время реакции, мин	40	40	40
Общий выход, %	25	12	37
Молекулярная масса (теоретическое значение)	5877,8	5891,8	5933,9
Молекулярная масса (Е8М8)	5877,7	5891,9	5933,8
Чистота по результатам ВЭЖХ, %	96	95	96
Сайт ацилирования (ВЭЖХ)	Νε	Νε	Νε

Исходный белок	Инсулин человека	Инсулин человека	Инсулин человека
Масса белка, мг	1960	2750	1040
Растворитель, мл	200	200	200
Ацильная цель ΝΑ8	н-Нонаноил	н-Додеканоил	н-Тетрадеканоил
Масса Ν-ацилсукцинимида, мг	145,8	19,9	102,3
Объем ДМСО, мл	1,0	1,0	1,0
Объем добавляемого раствора ΝΑ8, мл	0,887	0,771	0,885
Время реакции, мин	40	30	35
Общий выход, %	35	14	39
Молекулярная масса (теоретическое значение)	5947,9	5990,0	6018,1
Молекулярная масса (Е8М8)	5948,1	5989,9	6018,1
Чистота по результатам ВЭЖХ (%)	94	93	94
Сайт ацилирования (ВЭЖХ)	Νε	Νε	Νε

Исходный белок	Инсулин овцы	Инсулин коровы	Инсулин свиньи
Масса белка, мг	312	275	200
Растворитель, мл	100	100	100
Ацильная цепь ΝΑ8	н-Гексаноил	н-Гексаноил	н-Октаноил
Масса Ν-ацилсукцинимида, мг	27,2	19,9	16,4
Объем ДМСО, мл	1,0	1,0	1,0
Объем добавляемого раствора ΝΑ8, мл	0,644	0,771	0,764
Время реакции, мин	45	30	82
Общий выход, %	31	50	41
Молекулярная масса (теоретическое значение)	5801,7	5831,8	5903,9
Молекулярная масса (М8)	5801,8	5831,7	5903,9
Чистота по результатам ВЭЖХ, %	96	96	96
Сайт ацилирования (ВЭЖХ)	Νε	Νε	Νε

Исходный белок	Инсулин кролика	Инсулин человека	Инсулин человека
Масса белка, мг	211,4	205,3	132,3
Растворитель, мл	100	20	20
Ацильная цель ΝΑ8	н-Октаноил	н-Октаноил	н-Октаноил
Масса Ν-ацилсукцинимида, мг	16,8	21,5	11,5
Объем ДМСО, мл	1,0	0,5	1,0
Объем добавляемого раствора ΝΑ8, мл	0,786	0,303	0,715
Время реакции, мин	57	40	85
Общий выход, %	39	47	32
Молекулярная масса (теоретическое значение)	5919,9	5833,6	5951,9
Молекулярная масса (Е8М8)	5920,0	5832,7	5952,2
Чистота по результатам ВЭЖХ, %	95	96	94
Сайт ацилирования (ВЭЖХ)	Νε	Νε	Νε

Исходный белок	Аналог О1уА21, А1§В31,А1дВ32инсулина человека	Инсулин человека	Аналог дес(В27)инсулина человека
Масса белка, мг	86,2	134,8	44,8
Растворитель, мл	10	20	7
Ацильная цепь ΝΑ8	н-Октаноил	2-Метил- гексаноил	н-Октаноил
Масса Ν-ацилсукцинимида, мг	22,4	749	3,6
Объем ДМСО, мл	0,5	4,93*	1,0
Объем добавляемого раствора ΝΑ8, мл	0,115	0,052	0,993
Время реакции, мин	40	45	40
Общий выход, %	45	45	53
Молекулярная масса (теоретическое значение)	6189,2	5919,9	5832,8
Молекулярная масса (М8)	6189,2	5919,9	5832,9

Чистота по результатам ВЭЖХ (%)	97	96	93
Сайт ацилирования (ВЭЖХ)	Νε	Νε	Νε

* Растворен в ацетонитриле вместо ДМСО.

Исходный белок	Инсулин человека	Инсулин человека	Инсулин человека
Масса белка, мг	160	147,7	2080
Растворитель, мл	20	20	200
Ацильная цепь ΝΑ8	4-Метил- октаноил	3-Метилдеканоил	н-Октаноил
Масса Ν-ацилсукцинимида, мг	715	22,5	146,7
Объем ДМСО, мл	4,97*	1,0*	1,0*
Объем добавляемого раствора ΝΑ8, мл	0,0734	0,609	0,884
Время реакции, мин	60	45	40
Общий выход, %	54	38	5,3**
Молекулярная масса (теоретическое значение)	5947,9	5976,0	6060,1
Молекулярная масса (М8)* * *	5947,8	5976,2	6060,5
Чистота по результатам ВЭЖХ, %	96	96	92
Сайт ацилирования (ВЭЖХ)	Νε	Νε	Α1-Να, Νε

* Растворен в ацетонитриле вместо ДМСО.

** Выход производного АХ-α, В29-№-диацил-инсулина человека.

*** Определение произведено масс-спектро-скопией с лазерной десорбционной ионизацией при помощи матрицы (МАЬЭ1) вместо масс-спектроскопии с распылением.

Исходный белок	Аналог дес(В30)инсулина человека	Инсулин человека	Инсулин человека
Масса белка, мг	205,3	1960	2110
Растворитель, мл	20	200	200
Ацильная цепь ΝΑ8	н-Октаноил	н-Нонаноил	н-Деканоил
Масса Ν-ацилсукцинимида, мг	21,5	145,8	150,5
Объем ДМСО, мл	0,5	1,0	1,0
Объем добавляемого раствора ΝΑ8, мл	0,089	0,0887	0,975
Время реакции, мин	40	40	60
Общий выход, %	11,0	11,5	11,1
Молекулярная масса (теоретическое значение)	5959,5	6088,2	6116,2
Молекулярная масса (М8)	5959,3	6088,3	6116,4
Чистота по результатам ВЭЖХ, %	96	92	92
Сайт ацилирования (ВЭЖХ)	Α1-Να, Νε	Α1-Να, Νε	Α1-Να, Νε

Ниже дано общее описание схемы синтеза, предназначенной для получения дополнительных производственных белков. В каждом конкретном случае это описание следует рассматривать вместе с данными, приведенными в нижеследующей табл. 12, чтобы получить представление о полной схеме синтеза определенного производственного белка. Измеренную массу очищенного инсулина или аналога инсулина растворяют, добавляя к ней измеренный объем ДМСО. Показатель рН раствора регулируют 10 эквивалентами тетраметилгуанидина. Измеренную массу Ν-ацилсукцинимида («ΝΑ8») растворяют в измеренном объеме ДМСО в отдельной емкости. Измеренный объем второго раствора добавляют к первому раствору до достижения 1,9-кратного избытка Ν-ацилсукцинимида. Эту реакцию осуществляют при комнатной температуре и ход реакции контролируют, ана83 лизируя образцы реакционной смеси при помощи ВЭЖХ. Реакционную смесь гасят 20 мкл этаноламина, охлаждают на бане со смесью воды со льдом и разводят в 2,1 раза 0,1н. раствором НС1. Затем реакционную смесь обессоливают на колонке для хроматографии с обращенной фазой в следующих условиях: 1) колонку смачивают 100% ацетонитрилом, промывают тремя-четырьмя объемами 0,1% ТФУ/70% ацетонитрила (буфер В); и наконец промывают четырьмя-пятью объемами 0,1% ТФУ/10% ацетонитрила (буфер А); 2) разведенные реакционные смеси вводят в колонку, после чего колонку снова промывают пятью-шестью объемами буфера А; и 3) производный белок элюируют, пропуская через колонку пять-шесть объемов буфера В. Жидкость, собранную во время элюирования, замораживают и лиофилизуют. Лиофилизованный сырой продукт (86,1 мг) повторно очищают хроматографией с обращенной фазой, как это описано выше.

В табл. 12 приведены относящиеся к описанию экспериментальные данные, которые предназначены для синтеза производных белков, используемых в разных вариантах осуществления настоящего изобретения. Молекулярную массу очищенных производных определяют масс-спектроскопией с электрораспылением (Е8М8). Наличие сайта ацилирования определяют хроматографическим анализом (ВЭЖХ).

Таблица 12. Краткий обзор синтеза разных производных белков

Исходный белок	Инсулин человека
Масса белка, мг	179
Кол-во ДМСО, используемого для растворения инсулина человека, мл	20
Ацильная цель NА8	1,4-Дихлорфенилтио- ацетил
Масса Ν-ацилсукцинимида, мг	30
Объем ДМСО, мл	1,0
Объем добавляемого раствора NА8, мл	0,412
Время реакции, мин	50
Общий выход, %	32,2*
Молекулярная масса (теоретическое значение)	6026,78
Молекулярная масса (Е8М8)	6026,9
Чистота по результатам ВЭЖХ, %	96
Сайт ацилирования (ВЭЖХ)	Νε

* Выход высчитан в расчете на массу обессоленного и лиофилизованного сырого продукта.

Эксперимент 1. Время действия сокристаллов у собак.

Время действия трех композиций на основе сокристаллов по настоящему изобретению определяли у здоровых собак, которым производили непрерывное вливание соматостатина, чтобы вызвать у них временный диабет. Первый препарат на основе сокристаллов, содержащий инсулин человека и В29-№-октаноилинсулин человека, получали так, как это описано для препарата Ό в приведенном выше способе получения 16, и вводили подкожно в дозе 3 нмоль/кг (8753). Второй препарат на основе сокристал лов, содержащий инсулин человека и В29-№октаноилинсулин человека, получали так, как это описано для препарата Ό в приведенном выше способе получения 16, и вводили подкожно в дозе 2,5 нмоль/кг (8752,5). И наконец, третий препарат на основе сокристаллов, содержащих инсулин человека и В29-№-деканоилинсулин человека, получали так, как это описано в приведенном выше способе получения 14, и вводили подкожно в дозе 2,5 вмоль/кг (10252,5). Данные сравнивали с результатами, полученными у той же модели после введения гумулина Ν (2,0 нмоль/кг ΝΡΗ), инсулина коровы/свиньи ультралент (3 нмоль/кг, ΈΡ-υΓΙ') и физиологического раствора.

Эти эксперименты проводили с использованием находившихся в сознании самцов и самок породы коротконогих гончих весом 10-17 кг (Магкйай Еагтк, ΝοΠίι Роке, ΝΥ), которым были введены постоянные катетеры и которых не кормили в течение ночи. По крайней мере, за 10 дней до начала исследования животных анестезировали изофлураном (Апациек!, Майкоп, XVI), после чего в бедренную артерию и вену вводили силиконовые катетеры, прикрепленные к портам доступа к сосудам (У-А-Ρ™, Ассекк Тес11по1ощек, №гГо1к Мейса1, 8кок1е, 1Ь). Катетеры заполняли раствором глицерина/гепарина (3:1, в объемном отношении; конечная концентрации гепарина равна 250 Κΐυ/мл; глицерин фирмы 8щта Сйет1са1 Со., 8ΐ. Ьошк, МО, и гепарин фирмы Е1к1пк-8шп, 1пс., Сйепу Ηί11, ΝΓ), чтобы предотвратить окклюзию катетера, после чего раны закрывали. Во избежание инфекции животным до операции вводили кефзол (Ей ЬШу & Со., 1пйапаройк, ΙΝ) (20 мг/кг, внутривенно, и 20 мг/кг, внутримышечно) и после операции кефлекс (250 мг, перорально 1 раз в день в течение 7 дней). Для снятия боли после операции животным вводили торбугезик (1,5 мг/кг, внутримышечно).

У животных брали пробу крови непосредственно перед днем начала исследования, чтобы определить состояние их здоровья. В исследовании участвовали только животные с гематокритным числом более 38% и количеством лейкоцитов менее 16000/мм³ (гематологический анализатор (гематологии Се11-Эуп 900, 8ес.|ио1а Тигпег, МоиШат У|е\\·, СА)).

В утро эксперимента скрывали порты (Ассекк Тес11по1ощек, №гГо1к Мейса1, 8кок1е, 1Ь); отсасывали содержимое катетеров; катетеры промывали физиологическим раствором (Вах!ег ^айксаю Согр., БеегТюИ, 1Ь); собак помещали в клетки и к каналам доступа к портам присоединяли удлинители (защищенные креплением из нержавеющей стали и присоединенные к шарнирной системе |1пк1ес11 ЬаЬога1ог1ек, Ρ^тои111 Меейпд, ΡА]).

Собак оставляли примерно на 10 мин, чтобы они могли привыкнуть в условиям содержания в клетках, после чего у них брали пробу артериальной крови для определения концентрации инсулина, глюкозы и глюкагона после голодания (время=-30 мин). В это время начинали внутривенное вливание циклического соматостатина (0,65 мкг/кг/мин; ВАСНЕМ Са11Гогша, Тоггапсе, СА) и продолжали его в течение последующих 30,5 ч. Через 30 мин после начала вливания (время=0 мин) брали пробу артериальной крови и в заднюю часть шеи подкожно инъецировали испытуемое вещество или носитель. Пробы артериальной крови брали через каждые 3 ч для определения концентраций глюкозы и инсулина в плазме и через каждые 6 ч для определения концентраций глюкагона в плазме. Все исследование продолжалось 30 ч.

Пробы артериальной крови собирали в герметично закрытые пробирки для сбора крови, содержащие динатрий-ЕЭТА (Тегито Мей1са1 Согр., Е1к1оп, ΜΌ) и сразу же помещали на лед. Порцию пробы крови (1,5 мл) переносили в полипропиленовую пробирку, содержащую 40 мкл апротинина (10000 Κΐυ/мл; Тга§у1о1, Мйек, 1пс., О|адпо511С5 ОМмоп, Капкакее, 1Ь), для определения концентрации глюказона в плазме. Пробы центрифугировали, полученную плазму помещали в полипропиленовые пробирки и хранили на льду в течение всего исследования.

Концентрации глюкозы в плазме определяли в день исследования, анализируя глюкозооксидазу в коммерческом анализаторе глюкозы. Пробы для других анализов хранили при -80°С до времени выполнения анализа. Концентрации инсулина определяли при помощи радиоиммуноанализа методом двойных антител. Концентрации глюкагона определяли с использованием набора для радиоиммуноанализа (ЬШСО Везеагсй, 1пс., 81. Сйаг1е§, МО).

В конце эксперимента катетеры промывали свежим физиологическим раствором, обрабатывали кефзолом (20 мг/кг) и заполняли смесью глицерина/гепарина; перорально вводили антибиотик (КеГ1ех; 250 мг). Чтобы сократить до минимума количество используемых животных и получить парные базы данных, животных исследовали несколько раз. Эксперименты на животных, подвергнутых повторному исследованию, проводили минимум через 1 неделю.

Время действия сокристаллов инсулина человека и В29-№-октаноилинсулина человека с отношением 1:3 было продолжительнее на 9 ч, чем у инсулина человека ΝΡΗ (24 ч по сравнению с 15 ч) при введении большей дозы (8753), и продолжительнее на 6 ч, чем у инсулина человека (21 ч по сравнению с 15 ч) при введении более низкой дозы (8752,5). Время действия определяли статистическим путем, сравнивая средние концентрации глюкозы с аналогичным показателем в контрольной группе (физиологический раствор). Профили глюкозы для препаратов, содержащих сокристаллы инсулина человека и В29-№-октаноилинсулина с отношением 1:3, были в большей степени подобны ожидае мому профилю основного инсулина, чем профиль инсулина человека ΝΡΗ. Сокристаллы с отношением 1:3 обладали большей активностью и имели более приемлемый профиль глюкозы по сравнению с инсулином коровы/свиньи ультралент. Пониженная концентрация глюкозы в крови по сравнению с контрольной группой (физиологический раствор), вызываемая препаратами на основе сокристаллов, сохранялась гораздо дольше по сравнению с аналогичным показателем, полученным при использовании инсулина коровы/свиньи ультралент.

Время действия препаратов на основе сокристаллов инсулина человека и В29-№деканоилинсулина человека (10252,5) с отношением 3:1 было продолжительнее на 9 ч, чем у инсулина человека ΝΡΗ (24 ч по сравнению с 15 ч). Это различие является статистически значимым (р<0,05). У тех же животных время действия препарата на основе сокристаллов инсулина человека и В29-№-деканоилинсулина человека (2,5 нмоль/кг, подкожное введение) было продолжительнее на 6 ч, чем у препаратов гумулина υ или инсулина коровы υ (24 ч по сравнению с 18 ч). Эти различия также являются статистически значимыми (р<0,05). Профиль глюкозы для препаратов на основе сокристаллов был в большей степени подобен ожидаемому профилю основного инсулина, чем профиль инсулина человека ΝΡΗ. Кроме того, различия времени действия у собак были наименьшими при введении сокристаллов с отношением 3:1.

В заключение следует отметить, что полученные данные свидетельствуют о том, что сокристаллы по настоящему изобретению позволяют эффективно регулировать уровни глюкозы у собак в течение длительных периодов времени. Эти данные подтверждают вывод о том, что сокристаллы по настоящему изобретению эффективно регулируют содержание глюкозы у пациентов, страдающих диабетом типа 2, в течение ночи или могут быть использованы для инсулинотерапии пролонгированного/кратковременного действия для пациентов, страдающих диабетом типа 1 или типа 2. Полученные данные позволяют предположить, что эти препараты вызывают менее изменчивые реакции, чем выпускаемые промышленностью инсулиновые препараты.

Эксперимент 2. Время действия сокристаллов у поросят.

Исследования выполняли с использованием здоровых, находящихся в сознании самок поросят весом 17-25 кг. Поросятам хирургическим путем предварительно имплантировали один катетер в артерию (сонную или бедренную артерию) для отбора проб и другой катетер в яремную вену для введения соматостатина. До начала экспериментов поросят, которым были введены катетеры, не кормили в течение 22-24

ч. Подкожные инъекции инсулина делали в мягкую кожу за ухом в дозе 3,0 нмоль/кг (0,5 ед/кг).

Чтобы подавить секрецию эндогенного инсулина, поросятам одновременно вводили соматостатин в дозе 0,3 мкг/кг/мин (раствор в 0,9% №С1, содержащем 1% сывороточного альбумина человека (Мбек Сапаба, ЕюЫсоке. ΟΝ)). Состояние, близкое к нормогликемии, сохраняли путем вливания 20% декстрозы с разной скоростью, производя частые проверки концентраций глюкозы. Уровни глюкозы в плазме определяли в свежих пробах плазмы в день исследования по методу глюкозооксидазы с использованием коммерческого анализатора глюкозы.

При выполнении исследования с эугликемическим зажимом в начале исследования (время 0) пяти поросятам подкожно вводили препарат, содержащий микрокристаллы инсулина и В29-№-октаноилинсулина человека в отношении 1:3, в дозе 0,5 ед/кг (эквивалентно примерно 3 нмоль/кг). Постоянно определяли скорость вливания глюкозы, необходимую для сохранения эугликемии (заданное значение=примерно 90 мг/дл). Контрольной группе подкожно вводили гумулин Ν (И100) в такой же дозе (п=6). На протяжении всего эксперимента производили одновременное вливание соматостатина (0,3 мкг/кг/мин). При использовании микрокристаллов по настоящему изобретению скорость вливания глюкозы постоянно увеличивали в течение первых 2 ч до достижения максимального значения, равного примерно 7 мг/кг/мин. Затем в течение примерно 17,5 ч скорость вливания глюкозы постоянно снижали примерно до 0,5 мг/кг/мин. Большую часть времени между 17,5 ч и концом исследования в 24 ч скорость вливания глюкозы была равна от около 0,5 до около 2 мг/кг/мин.

В отличие от этого, среднюю скорость вливания глюкозы в контрольной группе (гумулин ΝΡΗ) постоянно увеличивали до достижения максимального значения, равного примерно 14 мг/кг/мин, примерно через 3 ч после введения. Затем скорость вливания уменьшали примерно до 7 мг/кг/мин в течение примерно 4,5 ч и доводили до около 5 мг/кг/мин через 13 ч после введения. Для контрольной группы не были получены другие данные. Эти результаты совместимы с выводом о том, что микрокристаллический препарат, содержащий инсулин и В29-№октаноилинсулин человека в молярном отношении 1:3, имеет более ровный глюкодинамический профиль, чем инсулин ΝΡΗ.

Эксперимент 3. Время действия сокристаллов у крыс.

Препарат, содержащий микрокристаллы инсулина и В29-Ые-октаноилинсулина человека с отношением 1:3, испытывали с использованием крыс ΒΒΌΡ/^ог, представляющих собой генетически исследованную животную модель, которые были выведены и предоставлены Медицинским центром Массачусетского университета (\Уогс11ек1ег, МА) совместно с компанией Β^отеб^са1 Векеагсй Мобе1к, 1пс. (Вибапб, МА).

Линия крыс ΌΡΒΒ/^ог склонна к возникновению диабета и страдает инсулинзависимым (аутоиммунным) диабетом. Все препараты вводили подкожно в дозе 0,9 ед/100 г массы тела.

Самцов крыс ΒΒΌΡ/^ог в возрасте 4-5 недель, которым вводили инсулин пролонгированного действия (ΡΖΙ), произвольно делили на пять экспериментальных групп, А, В, С, Ό и Е. Группе А (п=22) в течение 3 дней вводили инсулин человека ультралент И40 (гумулин ИЬ); группе В (п=18) в течение 3 дней вводили инсулин (илетин) ультралент И40 (65% инсулина коровы, 35% инсулина свиньи); группе С (п=10) в течение 3 дней вводили препарат, состоящий из микрокристаллов инсулина и В29-№октаноилинсулина человека с отношением 1:3, полученный в соответствии с вышеописанным способом; группе Ό (п=21) вводили препарат, состоящий из микрокристаллов 100% В29-№октаноилинсулина человека; и группе Е вводили инсулин коровы и свиньи И40 (ΡΖΙ). Всем крысам делали ежедневные инъекции препарата, предназначенного для данной группы, в течение 2 дней до определения содержания глюкозы в крови и в день определения содержания глюкозы в крови.

Кровь брали за полчаса до введения испытуемых препаратов. Образцы препаратов инъецировали в 11:30 утра. Пробы крови получали, делая надрез на хвосте (без анестезии). Пробы крови в течение короткого времени хранили на льду, центрифугировали и определяли в них содержание глюкозы при помощи анализатора глюкозы Βесктаη II. Пробы крови брали непосредственно перед введением испытуемых композиций и через 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 и 24 ч после введения. С учетом того, что при правильном регулировании концентрации глюкозы в крови содержание глюкозы составляет менее 200 мг/дл, установлено, что указанные препараты регулируют содержание глюкозы в крови в течение около 9,5 ч (гумулин ИЬ), около 12 ч (илетин И), около 15,5 ч (настоящее изобретение), около 20,5 ч (100% Β29-Nε-октаноилинсулин человека) и около 21,5 ч (ΡΖΙ). Таким образом, микрокристаллический препарат по настоящему изобретению регулирует содержание глюкозы в крови в течение более продолжительного времени, чем гумулин ИЬ и илетин и, и в течение меньшего времени, чем микрокристаллический препарат на основе 100% В29-№октаноилинсулина человека или препарат ΡΖΙ.

Эксперимент 4. Время действия аморфных осадков у крыс.

Препараты аморфных осадков, содержащих инсулин и Β29-Nε-октаноилинсулин человека в отношении 1:3, инсулин и Β28-Nε-октаноил-^уκ(В28),Ρ^о(Β29)инсулин человека в отношении 1:3, инсулин и В29-№-нонаноилинсулин человека в отношении 1:3, полученные в соответствии со способом получения 19, испы89 тывали с использованием крыс ВВИР^ог. Все препараты вводили подкожно в дозе 0,9 ед/100 г массы тела.

Самцов крыс ВВИРЖог в возрасте 4-5 месяцев, которым вводили инсулин пролонгированного действия (ΡΖΙ), произвольно делили на пять экспериментальных групп, А, В, С, И и Е. Группе А (п=7) вводили препарат ΝΡΗ И40 (гумулин Ν). Группе В (п=8) вводили препарат И42,4, содержащий инсулин и В29-№октаноилинсулин человека в отношении 1:3. Группе С (п=8) вводили препарат И42,6, содержащий инсулин и В28-№-октаноил-Ьук(В28), Рго(В29)инсулин человека в отношении 1:3. Группе Ό (п=8) вводили препарат И42,7, содержащий инсулин и В29-№-нонаноилинсулин человека в отношении 1:3. Группе Е вводили инсулин ΡΖΙ коровы/свиньи И40 (ΡΖΙ).

Пробы крови брали за полчаса до введения испытуемых композиций. Животным делали подкожные инъекции (0,9 ед./100 мг массы тела) в 11:30 утра. Пробы крови брали, делая надрез на хвосте (без анестезии). Пробы в течение короткого времени хранили на льду, центрифугировали и определяли содержание глюкозы при помощи коммерческого анализатора глюкозы. Пробы крови получали непосредственно перед введением испытуемых композиций и через 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 и 24 ч после введения. С учетом того, что при правильном регулировании концентрации глюкозы в крови содержание глюкозы составляет менее 200 мг/дл, установлено, что указанные препараты регулируют содержание глюкозы в крови в течение около 7,5 ч (инсулин и В28-№-октаноил-Ьук(В28), Рго(В29)инсулин человека с отношением 1:3), около 9 ч (ΝΡΗ), около 15,5 ч (инсулин и В29Νε-октаноилинсулин человека с отношением 1:3), около 16 ч (инсулин и В29-№-нонаноилинсулин человека с отношением 1:3) и около 22,5 ч (ΡΖΙ).

В приведенном выше описании изобретения рассмотрены принципы, предпочтительные варианты осуществления и способы осуществления настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничивается описанными здесь конкретными формами, которые носят иллюстративный характер. В настоящее изобретение могут быть внесены изменения и модификации, не выходящие за пределы объема этого изобретения.

Claims (77)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Нерастворимая композиция, содержащая

   a) белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналог инсулина и проинсулин;

   b) производный белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, ацилированный жирной кислотой, аналоги инсулина, ацилиро ванного жирной кислотой, и проинсулин, ацилированный жирной кислотой;

   с) комплексообразующее соединение;

   б) стабилизатор гексамера; и

   е) катион двухвалентного металла.
2. 2. Композиция по п.1, которая является аморфным осадком.
3. 3. Композиция по п.1, которая является микрокристаллом.
4. 4. Композиция по п.3, в которой микрокристалл имеет палочкообразную морфологию.
5. 5. Композиция по п.3, в которой микрокристалл имеет неупорядоченную морфологию.
6. 6. Композиция по п.1, в которой комплексообразующее соединение является протамином, стабилизатор гексамера является фенольным консервантом и катион двухвалентного металла является цинком.
7. 7. Композиция по п.1, в которой производный белок моноацилирован в положении ЬукΝε-аминогруппы.
8. 8. Композиция по п.7, в которой комплексообразующее соединение является протамином и присутствует в количестве от около 0,15 до около 0,5 мг на 3,5 мг общего белка.
9. 9. Композиция по п.8, в которой катион двухвалентного металла является цинком и присутствует в количестве от около 0,3 до около 0,7 моля на моль общего белка.
10. 10. Композиция по п.9, в которой стабилизатор гексамера является фенольным консервантом, выбираемым из группы, включающей фенол, м-крезол, о-крезол, п-крезол, хлоркрезол, метилпарабен и их смеси, и присутствует в отношении, равном, по крайней мере, 3 молям фенольного консерванта на 6 молей общего белка.
11. 11. Композиция по п.10, в которой белок выбирают из группы, включающей инсулин и аналоги инсулина.
12. 12. Композиция по п.11, в которой белок является инсулином.
13. 13. Композиция по п.12, в которой производный белок является инсулином, моноацилированным в положении ЬукВ29-№-аминогруппы.
14. 14. Композиция по п.13, в которой производный белок является инсулином, ацилированным насыщенной жирной кислотой с прямой цепью.
15. 15. Композиция по п.14, в которой насыщенную жирную кислоту с прямой цепью выбирают из группы, включающей н-гексановую кислоту, н-гептановую кислоту, н-октановую кислоту, н-нонановую кислоту и н-декановую кислоту.
16. 16. Композиция по п.15, в которой молярное отношение белка к производному белку составляет от около 1:9 до около 9:1.
17. 17. Композиция по п.16, в которой насыщенную жирную кислоту с прямой цепью выбирают из группы, включающей н-гексановую кислоту, н-октановую кислоту и н-декановую кислоту.
18. 18. Композиция по п.17, в которой насыщенную жирную кислоту с прямой цепью выбирают из группы, включающей н-октановую кислоту и н-декановую кислоту.
19. 19. Композиция по п.18, в которой насыщенная жирная кислота с прямой цепью является н-октановой кислотой.
20. 20. Композиция по п.19, в которой молярное отношение белка к производному белку составляет от около 1:3 до около 3:1.
21. 21. Композиция по п.17, в которой молярное отношение белка к производному белку составляет от около 1:9 до около 1:1.
22. 22. Композиция по п.11, в которой белок является аналогом инсулина.
23. 23. Композиция по п.22, в которой белок является аналогом ЬузВ28,РгоВ29-инсулина человека.
24. 24. Композиция по п.22, в которой белок является аналогом АзрВ28-инсулина человека.
25. 25. Композиция по п.1, в которой производный белок является инсулином, моноацилированным в положении ЬузВ29-№-аминогруппы насыщенной жирной кислотой с прямой цепью.
26. 26. Композиция по п.25, в которой насыщенную жирную кислоту с прямой цепью выбирают из группы, включающей н-гексановую кислоту, н-гептановую кислоту, н-октановую кислоту, н-нонановую кислоту и н-декановую кислоту.
27. 27. Композиция по п.26, в которой производный белок выбирают из группы, включающей В29-№-гексаноилинсулин человека, В29Νε-октаноилинсулин человека и В29-№деканоилинсулин человека.
28. 28. Композиция по п.25, в которой насыщенную жирную кислоту с прямой цепью выбирают из группы, включающей н-додекановую кислоту, н-тетрадекановую кислоту и н-гексадекановую кислоту.
29. 29. Композиция по п.1, в которой производный белок диацилирован в положении ЬузΝε-аминогруппы и ацилирован в положении одной Ν-концевой Να-аминогруппы и в которой жирную кислоту выбирают из группы, включающей н-гексановую кислоту, н-гептановую кислоту, н-октановую кислоту, н-нонановую кислоту и н-декановую кислоту.
30. 30. Композиция по п.1, в которой производный белок ацилирован насыщенной жирной кислотой с разветвленной цепью.
31. 31. Композиция по п.30, в которой производный белок ацилирован насыщенной жирной кислотой с разветвленной цепью, имеющей от трех до десяти атомов углерода в наибольшей цепи.
32. 32. Композиция по п.1, в которой производный белок является аналогом инсулина, мо ноацилированным в положении Ьуз-№-аминогруппы насыщенной жирной кислотой с прямой цепью.
33. 33. Композиция по п.32, в которой жирную кислоту выбирают из группы, включающей нгексановую кислоту, н-гептановую кислоту, ноктановую кислоту, н-нонановую кислоту и ндекановую кислоту.
34. 34. Композиция по п.32, в которой производный белок является аналогом инсулина, моноацилированным в положении Νε-аминогруппы жирной кислотой, выбираемой из группы, включающей н-додекановую кислоту, н-тетрадекановую кислоту и н-гексадекановую кислоту.
35. 35. Композиция по п.32, в которой производный белок выбирают из группы, включающей инсулины животных, ацилированные жирной кислотой, аналоги мономерного инсулина, ацилированного жирной кислотой, делеционные аналоги, ацилированные жирной кислотой, и аналоги инсулина со сдвигом р1, ацилированного жирной кислотой.
36. 36. Композиция по п.35, в которой производный белок является аналогом дес(В30)инсулина человека, ацилированного жирной кислотой, аналогом ЬузВ28,РгоВ29-инсулина человека, ацилированного жирной кислотой, или аналогом АзрВ28-инсулина человека, ацилированного жирной кислотой.
37. 37. Композиция по п.36, в которой производный белок является аналогом дес(В30)инсулина человека, ацилированного жирной кислотой.
38. 38. Композиция по п.37, в которой производный белок является аналогом В29-№-миристоил-дес(В30)инсулина человека.
39. 39. Композиция по п.36, в которой производный белок является аналогом ЬузВ28, РгоВ29-инсулина человека, ацилированного жирной кислотой.
40. 40. Композиция по п.39, в которой производный белок является аналогом В28-№миристоил-ЬузВ28,РгоВ29-инсулина человека.
41. 41. Композиция по п.36, в которой производный белок является аналогом АзрВ28инсулина человека, ацилированного жирной кислотой .
42. 42. Композиция по п.1, в которой молярное отношение белка к производному белку составляет от около 1:9 до около 9:1.
43. 43. Композиция по п.42, в которой молярное отношение составляет от около 1:3 до около 3:1.
44. 44. Композиция по п.42, в которой молярное отношение составляет от около 1:9 до около 1:1.
45. 45. Композиция по п.1, в которой белок является инсулином.
46. 46. Композиция по п.1, в которой белок является аналогом инсулина.
47. 47. Композиция по п.46, в которой белок является аналогом мономерного инсулина.
48. 48. Суспензионный препарат, содержащий нерастворимую фазу и фазу раствора, в котором нерастворимая фаза включает нерастворимую композицию по п.1 и фаза раствора включает водный растворитель.
49. 49. Суспензионный препарат по п.48, в котором фаза раствора дополнительно включает фенольный консервант в концентрации от около 0,5 до около 6 мг на мл раствора, фармацевтически приемлемый буфер и изотонический агент.
50. 50. Суспензионный препарат по п.48, в котором фаза раствора дополнительно включает инсулин, аналог инсулина, производный инсулин или аналог производного инсулина.
51. 51. Суспензионный препарат по п.50, в котором фаза раствора включает инсулин.
52. 52. Суспензионный препарат по п.50, в котором фаза раствора включает производный инсулин.
53. 53. Суспензионный препарат по п.50, в котором фаза раствора включает аналог инсулина.
54. 54. Суспензионный препарат по п.50, в котором аналог инсулина является аналогом мономерного инсулина.
55. 55. Суспензионный препарат по п.50, в котором аналог инсулина является аналогом ЬукВ28,РгоВ29-инсулина человека.
56. 56. Суспензионный препарат по п.50, в котором аналог инсулина является аналогом АкрВ28-инсулина человека.
57. 57. Суспензионный препарат по п.48, в котором фаза раствора включает белок, выбираемый из инсулина и аналогов инсулина, и производный белок, выбираемый из инсулина, ацилированного жирной кислотой, и аналогов инсулина, ацилированного жирной кислотой.
58. 58. Суспензионный препарат по п.57, в котором белок в фазе раствора аналогичен белку в нерастворимой фазе и в котором производный белок в фазе раствора аналогичен производному белку в нерастворимой фазе.
59. 59. Суспензионный препарат по п.48, в котором нерастворимая фаза состоит, в основном, из аморфного осадка.
60. 60. Суспензионный препарат по п.48, в котором нерастворимая фаза состоит, в основном, из микрокристаллов.
61. 61. Суспензионный препарат по п.48, в котором нерастворимая фаза состоит из смеси аморфного осадка и микрокристаллов.
62. 62. Суспензионный препарат по п.48, в котором фаза раствора дополнительно включает цинк и протамин, отношение цинка к общему белку составляет от около 5 до около 7 молей атомов цинка на моль общего белка и отношение протамина к общему белку составляет от около 0,25 до около 0,5 мг на мг общего белка.
63. 63. Способ лечения диабета, который заключается в том, что нуждающемуся субъекту вводят композицию по п.1 в количестве, доста точном для регулирования содержания глюкозы в крови указанного субъекта.
64. 64. Способ лечения гипергликемии, который заключается в том, что нуждающемуся субъекту вводят препарат по п.48 в количестве, достаточном для регулирования содержания глюкозы в крови указанного субъекта.
65. 65. Композиция на основе гибридных гексамеров, содержащая шесть мономеров и цинк, в которой, по крайней мере, один мономер выбирают из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины, и, по крайней мере, один мономер выбирают из группы, включающей инсулин, ацилированный жирной кислотой, аналоги инсулина, ацилированного жирной кислотой, и проинсулины, ацилированные жирной кислотой.
66. 66. Композиция на основе смешанных гексамеров, содержащая гексамеры цинка и белка, гексамеры цинка и производного белка, в которой гексамеры цинка и белка состоят из цинка и белка, выбираемого из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины, и гексамеры цинка и производного белка состоят из цинка и производного белка, выбираемого из группы, включающей инсулин, ацилированный жирной кислотой, аналоги инсулина, ацилированного жирной кислотой, и проинсулины, ацилированные жирной кислотой.
67. 67. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что

    a) белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем рН, способствующим образованию гексамеров, и

    b) добавляют комплексообразующее соединение.
68. 68. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что

    a) белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем рН, препятствующим образованию гексамеров, и

    b) доводят показатель рН до величины от около 6,8 до около 7,8; и

    c) добавляют комплексообразующее соединение.
69. 69. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что

    a) белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем рН, способствующим образованию гексамеров;

    b) белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют отдельно в водном растворителе с показателем рН, способствующим образованию гексамеров;

    c) растворы, полученные на стадиях а) и Ь), тщательно смешивают; и

    б) к раствору, полученному на стадии с), добавляют комплексообразующее соединение.
70. 70. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что

    a) белок, стабилизатор гексамера, катион двухвалентного металла и комплексообразующее соединение растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения;

    b) белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера, катион двухвалентного металла и комплексообразующее соединение растворяют отдельно в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения;

    c) растворы, полученные на стадиях а) и Ь), тщательно смешивают; и

    б) показатель рН раствора, полученного на стадии с), доводят до значения, при котором происходит осаждение.
71. 71. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что

    a) белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера, катион двухвалентного металла и комплексообразующее соединение растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения; и

    b) показатель рН раствора, полученного на стадии а), доводят до значения, при котором происходит осаждение.
72. 72. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что

    a) белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения;

    b) добавляют комплексообразующее соединение; и

    c) показатель рН раствора, полученного на стадии Ь), доводят до значения, при котором происходит осаждение.
73. 73. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что

    a) белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения;

    b) белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют отдельно в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения;

    c) растворы, полученные на стадиях а) и Ь), тщательно смешивают;

    б) к раствору, полученному на стадии с), добавляют комплексообразующее соединение; и

    е) показатель рН раствора, полученного на стадии б), доводят до значения, при котором происходит осаждение.
74. 74. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что

    a) белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения;

    b) показатель рН раствора, полученного на стадии а), доводят до значения, при котором происходит осаждение при добавлении комплексообразующего соединения; и

    c) к раствору, полученному на стадии Ь), добавляют комплексообразующее соединение.
75. 75. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что

    a) белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения;

    b) белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют отдельно в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения;

    c) растворы, полученные на стадиях а) и Ь), тщательно смешивают;

    б) показатель рН раствора, полученного на стадии с), доводят до значения, при котором происходит осаждение при добавлении комплексообразующего соединения; и

    е) к раствору, полученному на стадии б), добавляют комплексообразующее соединение.
76. 76. Способ получения гибридных гексамеров, который заключается в том, что белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем рН, способствующим образованию гексамеров.
77. 77. Способ получения гибридных гексамеров, который заключается в том, что

    a) белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем рН, препятствующим образованию гексамеров; и

    b) показатель рН доводят до значения от около 6,8 до около 7,8.