CN1284876A - 用于控制血液葡萄糖的不溶性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及不溶性组合物,它含有一种选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素前体的蛋白;含有一种选自以下的衍生的蛋白:衍生的胰岛素、衍生的胰岛素类似物和衍生的胰岛素前体;一种络合物;一种六聚体稳定化合物;和一种二价金属阳离子。所述不溶性组合物制剂适用于经胃肠外和非胃肠外传递治疗高血糖和糖尿病。微晶型的所述不溶性沉淀物在药学上类似于中性鱼精蛋白Hagedorn(NPH)胰岛素晶体型。令人惊奇的是,发现这类不溶性组合物的悬浮剂具有独特而可控的溶解特性,与胰岛素NPH制剂相比,该溶解特性赋予萄萄糖动力学的药学优势。

Description

用于控制血液葡萄糖的不溶性组合物
                      发明背景
1．发明领域。本发明属于人类医学领域。更具体地讲，本发明属于糖尿病和高血糖疾病的药物治疗领域。
2．相关技术的描述。长期以来，胰岛素治疗的目标为模拟正常个体内内源胰岛素分泌模式。生理上对胰岛素的日需要量波动，并可以分为两个时期：(a)吸收期，需要胰岛素脉冲，以处理进食相关的血液葡萄糖骤增，和(b)吸收后期，需要持续传递胰岛素，以调节肝葡萄糖输出，以维持最佳禁食血液葡萄糖。
因此，对于糖尿病病人的有效治疗一般涉及联合使用两种类型的外源胰岛素制剂：一种通过大剂量注射提供的速效进食时胰岛素和一种长效的所谓基础胰岛素，通过每日注射一次或两次给予，以控制进食之间的血液葡萄糖水平。理想的基础胰岛素将提供延长的和“平坦的”时间作用，即它将控制血液葡萄糖水平至少12小时，最好控制24小时或更长时间，而没有显著的低血糖风险。此外，理想的基础胰岛素应该可与可溶性进食时胰岛素混合，并且应该于给药部位不引起刺激或反应。最后，基础胰岛素制剂应该在给药之前能够由患者容易地和均一地再悬浮。
正如本领域技术人员众所周知的，通过将正常胰岛素作为皮下注射用微晶悬浮剂配制，已经获得了长效胰岛素制剂。市售基础胰岛素制剂的实例包括NPH(中性鱼精蛋白Hagedorn)胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素(PZI)和特慢胰岛素(ultralente)(UL)。
在二十世纪三十年代，Scott等[J．Pharmacol.Exp.Ther．58：78及其后的内容(1936)]和Hagedorn等[J.Am.Med.Assoc.106：177-180(1936)]研制出含有过剩鱼精蛋白的现今市售NPH胰岛素的早期形式。于1946年，Krayenbuhl等研制出具有低精蛋白锌胰岛素比例的NPH胰岛素，该比例为胰岛素和鱼精蛋白以及锌的比例。[Rep．StenoMem.Hosp.Nord.Insulinlab.1：60及其后的内容(1946)]。这些研究人员发现，当在锌和酚类化合物存在下，胰岛素和鱼精蛋白在中性pH下混合为所谓的低精蛋白锌胰岛素比例时，形成无定形沉淀，而当所述无定形沉淀静置时转化为具有锥状末端的椭圆形四方晶体。这些晶体被描述为棒状。观察到胰岛素和硫酸鱼精蛋白的低精蛋白锌胰岛素比例约为每mg胰岛素0.09mg硫酸鱼精蛋白。锌的需要量至少约为每mg胰岛素3.5μg，而酚类化合物的浓度高于约0.1％。
胰岛素NPH是最为广泛使用的胰岛素制剂，占世界范围使用的胰岛素的50-70％。它是胰岛素、锌、鱼精蛋白和一种或多种酚类防腐剂的微晶复合物的悬浮剂。NPH胰岛素制剂是市售的，掺入人胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素或它们的混合物。此外，单体胰岛素类似物LysB298、ProB29-人胰岛素类似物的NPH样制剂是本领域已知的[本文缩写为“NPL”：De Felippis，M.R.，于1995年10月24日授予的美国专利第5，641，031号；De Felippis，M.R.，于1997年7月22日授予的美国专利第5，650，486号；和De Felippis，M.R.，于1998年5月5日授予的美国专利第5，747，642号]。人们普遍认为，与普通胰岛素相比，胰岛素NPH提供延长的血液葡萄糖控制，因为在胰岛素可以吸收之前，胰岛素必须首先从胰岛素HPN微晶中溶解出来。至于普通胰岛素，在吸收之前不需要溶解。对于胰岛素NPH，溶解是决定药效学和药代动力学的速率控制步骤。
NPH胰岛素微晶具有典型大小的有特色的棒状形态，长约5微米，厚1微米，宽1微米。NPH胰岛素微晶延长的作用时间由其从皮下注射部位缓慢吸收所致。
采用目前可得的NPH胰岛素制剂的疗法，不能提供维持进食之间较长时期最佳禁食血液葡萄糖必需的理想的“平坦”药代动力学。因此，用NPH胰岛素的治疗可能导致血液中不良的高水平的胰岛素，这可能引起危及生命的低血糖。
除不能提供理想的平坦药代动力学分布图之外，NPH胰岛素的作用时间也不理想。特别是，NPH疗法的主要问题是“黎明现象”，这是由于当患者睡觉时丧失有效的过夜葡萄糖控制而引起的高血糖。糖血控制的这些缺点导致严重的长期糖尿病医学并发症，并对患者产生相当的不便和基本生活条件不利。
鱼精蛋白锌胰岛素(PZI)的组成与NPH相似，但含有的鱼精蛋白和锌的水平高于NPH。PZI制剂可以作为中效无定形沉淀或长效晶状物质制备。然而，PZI不是理想的基础胰岛素药物，因为它不能与可溶性进食时胰岛素混合，并且高锌和鱼精蛋白可能在给药部位引起刺激或反应。
人特慢胰岛素是微晶胰岛素制剂，其锌水平高于NPH，并且或者鱼精蛋白或者酚类防腐剂不掺入微晶中。人特慢制剂提供不适当平坦的中等时间作用，并且它们与胰岛素不形成稳定的混合物。此外，它们难以再悬浮。
已经尝试解决已知胰岛素悬浮剂的已知的不足之处。已经研究了脂肪酸酰化胰岛素对血液葡萄糖的基础控制[Havelund，S.等，WIPO出版物WO95/07931，1995年3月23日]。由于这些分子的脂肪酰基部分结合至血清白蛋白，导致其时间作用延长。这些分子的脂肪酰基链长度是如此之长以致利用了脂肪酸结合血清白蛋白的能力。脂肪酸酰化胰岛素中所用的脂肪酸链通常长约10个碳原子以上，14个和16个碳原子的链长度最适于结合血清白蛋白和延长时间作用。
与不溶性的NPH胰岛素不同，上述脂肪酸酰化胰岛素于胰岛素通常的治疗浓度下是可溶性的。然而，这些制剂的时间作用可能不够长，或不足够平坦，以致于不能提供理想的基础控制，它们的效力低于胰岛素，因此需要给予较大量的药物[Radziuk，J.等，Diabetologia 41：116-120，489-490(1998)]。
Whittingham，J.L.等[Biochemistry 36：2826-2831(1997)]将B29-Nε-十四烷酰基-des(B30)-人胰岛素类似物作为与锌和苯酚的六聚物络合物结晶，用于X射线结晶学的结构研究。发现所述六聚物为R6构象，并具有某些不同于人胰岛素六聚物的特性。Whittingham等没有公开形成的该晶体的任何药学或药理学特性，也没有提出这种晶体可能具有治疗糖尿病或高血糖的任何有利的特性。根据Whittingham等所述，不可能预测是否能够与衍生的胰岛素和胰岛素类似物形成含鱼精蛋白的NPH型晶体，或预测这种晶体可能的药代动力学或药效学反应。
因此，仍需要鉴定比NPH胰岛素具有更平坦更长时间作用的胰岛素制剂，其中它们可与可溶性进食时胰岛素混合，可以容易地再悬浮，并且没有于给药部位的刺激或反应的风险。我相当意外地发现，包含衍生化蛋白、非衍生化蛋白、锌、鱼精蛋白和酚类防腐剂的不溶性组合物提供这些特性。除上述特性外，所述不溶性组合物还提供对葡萄糖动力学反应分布图时间和形状的灵活控制。它们被认为以控释组合物起作用，其中释放速率受衍生化蛋白的比例和性质控制。因此，本发明的一个方面是包含非衍生化蛋白、衍生化蛋白、络合化合物、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子的不溶性组合物。本文将讨论涉及这种组合物制备、配制和使用的本发明的其它方面。
我不知有衍生化胰岛素和非衍生化胰岛素的混合物的实例，尽管那些术语在本说明书内容中将被理解。已知由胰岛素原和胰岛素组成的晶体[Steiner，D.F.，Nature 243∶528-530(1973)；Low，B.W.等，Nature 248：339-340(1974)]和由胰岛素或等电点与胰岛素大约相同的胰岛素类似物和具有额外碱性氨基酸的胰岛素类似物组成的晶体[D_rschug，M.等，于1991年7月2日授予的美国专利第5，028，587号]。
Steiner在0.095M柠檬酸钠pH6.0、0.03M NaCl、0.012M ZnCl2和16％丙酮中产生了由摩尔比分别约为1∶11、1∶5、1∶2和1∶1的胰岛素原和胰岛素(即每6摩尔总胰岛素和胰岛素原0.5、1、2和3摩尔胰岛素原)组成的晶体。胰岛素原的比例大大影响结晶速率。所述晶体在相同条件下与纯胰岛素晶体有很大不同，被鉴定为具有圆形边界的菱形晶体。在制剂中和制剂之间有很大的可变性。结晶胰岛素原和胰岛素具有的用途是它促进从胰腺提取物中分离少量的胰岛素原和相关结构。作者预测，结晶可以发生在前体肽和产物肽之间，其中包括密切相关的蛋白。
Low，B.W.等制造了由等摩尔比例的牛或猪胰岛素和其相应的胰岛素原组成的非常大的晶体，其中胰岛素原和胰岛素在结晶之前形成均一的六聚物。X射线晶体学和定量电泳分析支持以下结论：晶体中的晶胞由12个胰岛素六聚物和12个胰岛素原六聚物组成。特别指出已知没有研究提出胰岛素和胰岛素原在溶液中形成混合二聚物和六聚物。
D_rschug，M.等公开了由胰岛素、des(PheBl)胰岛素、des(ThrB30)人胰岛素或des(AlaB30)牛胰岛素和至少一种于B链C末端具有一个碱性修饰的胰岛素(“修饰的胰岛素”)组成的晶体。这种修饰的胰岛素公开于例如欧洲专利申请第132，769号。其将珠蛋白和硫酸鱼精蛋白陈述为可以用于晶体制剂中的辅助化合物。没有使用鱼精蛋白的实例，也没有提出任何本发明人认识到的加入这类化合物的效应。此外，D_rschug，M.等所用的修饰的胰岛素不同于本发明中所用的衍生物。
如上所述，我已经意外地观察到，当选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原的蛋白通过衍生化一种或多种其反应性侧基使其在水性溶剂中可溶性降低或亲脂性更强时，选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原的衍生化蛋白和非衍生化蛋白可以掺入到不溶性沉淀和具有鱼精蛋白的NPH样晶体中。当这类蛋白共同沉淀或结晶形成不溶性组合物时，与由非衍生化蛋白构成的物理上相似的不溶性组合物溶解的速率相比，所述蛋白从不溶性组合物中溶解的速率大大降低。
我还发现，由衍生化蛋白、蛋白、络合化合物、二价金属阳离子和六聚物稳定化合物构成的无定形沉淀和微晶提供的时间作用比仅由非衍生化蛋白构成的物理上相似的微晶更平坦，并且时间更长。另外，我惊奇地发现，较平坦和较长时间作用的益处甚至可以得自由一种所述蛋白和一种衍生化蛋白构成的无定形沉淀。
                      发明概述
因此，在最广义的方面，本发明提供不溶性组合物，它包含：一种衍生化蛋白，选自胰岛素衍生物、胰岛素类似物衍生物和胰岛素原衍生物；一种蛋白，选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原；一种络合化合物；一种六聚物稳定化合物和一种二价金属阳离子。所述衍生化蛋白在水性溶剂中的溶解性或者低于非衍生化蛋白、其亲脂性高于非衍生化胰岛素，或者产生与锌和鱼精蛋白的络合物，其溶解性低于相应的与非衍生化蛋白的络合物。本发明的不溶性组合物可以为无定形沉淀形式，或更优选为微晶形式。所述微晶在形态上可以为棒状或不规则形态。这些不溶性组合物可用于治疗糖尿病和高血糖，提供的优点是比NPH胰岛素更平坦、更长的时间作用。所述不溶性组合物在制剂中可与可溶性蛋白或与可溶性衍生化蛋白或这两者混合。此外，通过改变蛋白和衍生化蛋白之间的比率，可以在从近似等于NPH胰岛素的时间作用至比NPH胰岛素的时间作用大得多的非常大的时间作用范围内，精细地控制时间作用的延长程度。
更具体地讲，本发明提供可用于治疗糖尿病和高血糖的蛋白和脂肪酸酰化蛋白的不溶性组合物。这些组合物包含：脂肪酸酰化蛋白，选自脂肪酸酰化胰岛素、脂肪酸酰化胰岛素类似物和脂肪酸酰化胰岛素原；蛋白，选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原；鱼精蛋白；酚类防腐剂和锌。本发明与先前的脂肪酸酰化胰岛素技术的不同之处在于，本发明的时间作用的延长不必依赖于白蛋白结合，尽管白蛋白结合可以进一步延长某些本发明组合物的时间作用。
本发明提供一种微晶，它包含：一种蛋白，选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原；一种衍生化蛋白，选自衍生化胰岛素、衍生化胰岛素类似物和衍生化胰岛素原；一种络合化合物；一种二价金属阳离子；和一种六聚物稳定化合物。本发明的微晶可用于治疗糖尿病和用于控制有需要的患者的血液葡萄糖。
本发明提供一种无定形沉淀，它包含：一种蛋白，选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原；一种衍生化蛋白，选自衍生化胰岛素、衍生化胰岛素类似物和衍生化胰岛素原；一种络合化合物；一种二价金属阳离子；和一种六聚物稳定化合物。本发明的无定形沉淀可用于治疗糖尿病和用于控制有需要的患者的血液葡萄糖。它们也可以用作形成本发明微晶的中间体。
本发明提供水性悬浮制剂，它包含不溶性组合物和一种水性溶剂。一种这样的水性悬浮制剂包含本发明微晶组合物和一种水性溶剂。另一种这样的水性悬浮制剂包含本发明的无定形沉淀和一种水性溶剂。本发明悬浮制剂的可溶性水相可以任选地包含诸如人胰岛素的蛋白或诸如单体胰岛素类似物的人胰岛素可溶性类似物，控制紧接进食后的血液葡萄糖，还可以另外或者替换地包含一种衍生化蛋白。与人胰岛素NPH相比，本发明的制剂具有优越的药效学，并且在从仅略长于人胰岛素NPH的时间作用至比人胰岛素NPH长得多的时间作用的宽范围内，可以有目的地选择其时间作用。
本发明也提供制备本发明的杂化六聚物、混合六聚物、无定形沉淀和共晶体(co-crystal)的方法。
本发明提供治疗糖尿病或高血糖的方法，包括给予有需要的患者本发明的不溶性组合物，其给药量足以调节该患者的血液葡萄糖水平。
本发明包括杂化六聚物组合物，它包含：一种蛋白，选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原；一种衍生化蛋白，选自衍生化胰岛素、衍生化胰岛素类似物和衍生化胰岛素原；和锌。本发明的杂化六聚物可用于治疗糖尿病和用于控制有需要的患者的血液葡萄糖。它也可用作形成本发明不溶性组合物的中间体，所述组合物本身可用于治疗糖尿病和用于控制有需要的患者的血液葡萄糖。认为当首先在非常适合溶解为低于六聚物状态的聚集状态的条件下将一种蛋白和一种衍生化蛋白混合在一起，其次将条件改变为非常适合六聚物聚集状态时，形成杂化六聚物。
本发明包括混合六聚物组合物，它包含：一种选自胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素原的蛋白的锌六聚物；和一种选自衍生化胰岛素、衍生化胰岛素类似物和衍生化胰岛素原的衍生化蛋白的锌六聚物。本发明的混合六聚物可用于治疗糖尿病和用于控制有需要的患者的血液葡萄糖。它也可用作形成本发明不溶性组合物的中间体，所述组合物本身可用于治疗糖尿病和用于控制有需要的患者的血液葡萄糖。认为当首先在适合六聚物聚集状态的条件下将一种蛋白和一种衍生化蛋白分别溶解，然后在继续非常适合六聚物聚集状态的条件下将它们混合在一起时，形成混合六聚物。
本发明包括应用本发明不溶性组合物制备用于治疗糖尿病和高血糖的药物。
                      附图简述
图1描述了与人胰岛素鱼精蛋白晶体制剂的溶解(…)相比，在4小时期间人胰岛素与B29-Nε-辛酰基-人胰岛素之比为3∶1
Figure 9881374300181
1∶1
Figure 9881374300182
和1∶3
Figure 9881374300183
的本发明共晶体的溶解。
图2描述了得自图1所述相同实验的溶解数据，但延长时间轴以显示多至约13.5小时的1∶3共晶体的数据。将人胰岛素与B29-Nε-辛酰基-人胰岛素之比为3∶1
Figure 9881374300184
1∶1
Figure 9881374300185
和1∶3
Figure 9881374300186
的本发明共晶体的溶解与人胰岛素鱼精蛋白晶体制剂的溶解(…)相比。图3描述了与仅由B29-Nε-辛酰基-人胰岛素构成的微晶
Figure 9881374300187
或人胰岛素-鱼精蛋白晶体制剂(…)相比，人胰岛素与B29-Nε-辛酰基-人胰岛素之比为1∶1(—)和1∶3(—)的本发明共晶体的溶解。
图4描述了与人胰岛素-鱼精蛋白晶体制剂(…)、人特慢胰岛素制剂(—)和牛特慢胰岛素(—)制剂相比，人胰岛素与B29-Nε-辛酰基-人胰岛素之比为1∶3
Figure 9881374300191
的本发明共晶体的溶解。
                   本发明的描述
术语“混合六聚物”是指蛋白六聚物和衍生化蛋白六聚物的混合物，其中所述蛋白六聚物由锌和选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原的蛋白构成，而所述衍生化蛋白六聚物由锌和选自衍生化胰岛素、衍生化胰岛素类似物和衍生化胰岛素原的衍生化蛋白构成。锌实际掺入六聚物的水平为每个六聚物约2至约4个锌原子。
术语“杂化六聚物”是指由6个单体和锌构成的六聚物，其中至少一个单体选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原，并且至少一个单体选自衍生化胰岛素、衍生化胰岛素类似物和衍生化胰岛素原。锌实际掺入六聚物的水平为每个六聚物约2至约4个锌原子。
本文所用的术语“共晶体”是指本发明的微晶。
术语“不溶性组合物”是指或者微晶状态或者无定形沉淀状态的物质。通过目视检查和显微镜检查可以确定微晶或无定形沉淀的存在。溶解性取决于溶剂，而特定的组合物可能不溶于一种溶剂，但溶于另一种溶剂。
术语“微晶”是指主要由晶态物质组成的固体，其中各个晶体主要为单一的晶体组合物，并且具有显微大小，通常最长的大小范围为1微米至100微米。术语“微晶的”是指为微晶的状态。
术语“棒状”是指也被描述为锥状尖端的四方棒状物的有特色的微晶形态。通过显微镜检查容易确定本发明微晶的形态学。
术语“不规则形态”是指一种微晶特征，其形态通过显微镜检查不易分为任何一种熟知的晶体类型，不是单一的晶体形态类型，或因为晶体的大小对于某些分类而言太小而不能容易地确定。
术语“无定形沉淀”是指不是晶态形式的不溶性物质。普通技术人员可以区别晶体与无定形沉淀。本发明的无定形沉淀在其正常状态下具有有利的药理学特性，也是形成本发明微晶的中间体。
术语“蛋白”具有其通常的含义，亦即氨基酸的聚合物。本文所用的术语“蛋白”也具有较窄的含义，亦即选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原的蛋白。术语“非衍生化蛋白”也是指选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原的蛋白。
用于权利要求书和正文其它地方的术语“总蛋白”是指混合量的蛋白(胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素原)和衍生化蛋白(衍生化胰岛素、衍生化胰岛素类似物或衍生化胰岛素原)。尽管在该术语的最广义的意义上，鱼精蛋白和其它已知的络合化合物也是蛋白，但术语“总蛋白”不包括它们。
术语“衍生化蛋白”是指选自以下的蛋白：衍生化胰岛素、衍生化胰岛素类似物和衍生化胰岛素原，它通过官能团衍生化，使得所述衍生化蛋白在水性溶剂中的溶解性低于非衍生化蛋白，亲脂性高于非衍生化胰岛素，或产生具有锌和鱼精蛋白的络合物，其溶解性低于相应的与非衍生化蛋白的络合物的。蛋白和衍生化蛋白的溶解性和亲脂性的测定是技术人员熟知的。在具有锌和鱼精蛋白的络合物中的衍生化蛋白和蛋白的溶解性可以通过熟知的方法[Graham和Pomeroy，J．Pharm.Pharmacol.36：427-430(1983)，如DeFelippis，M.R.和Frank，B.改进，EP735，048]或本文所用的方法测定。
这种衍生化蛋白的许多实例是本领域已知的，包括胰岛素和胰岛素类似物的苯甲酰基、对甲苯基-氨磺酰羰基和吲哚基衍生物[1995年3月23日公开的Havelund，S.等的WO95/07931]；胰岛素的烷氧羰基衍生物[1972年8月15日授予的Geiger，R.等的美国专利第3，684，791号；1975年9月23日授予的Brandenberg，D.等的U.S.3，907，763]；胰岛素的芳氧羰基衍生物[1975年9月23日授予Brandenberg，D.等的U.S.3，907，763]；烷基氨基甲酰基衍生物[1975年2月4日授予Smyth，D.G.的美国专利第3，864，325号；1976年4月13日授予Lindsay，D.G.等的美国专利第3，950，517号]；胰岛素的氨基甲酰基、O-乙酰基衍生物[1975年2月4日授予Smyth，D.G.的美国专利第3，864，325号]；交联烷基二羧基衍生物[1975年9月23日授予的Brandenberg，D.等的美国专利第3，907，763号]；N-氨基甲酰基、O-乙酰化胰岛素衍生物[1975年2月25日授予Smyth，D.G.的美国专利第3，86 8，356号]；各种O-烷基酯[1982年8月10日授予Markussen，J.的美国专利第4，343，898号；1983年8月23日授予Morihara，K.等的美国专利第4，400，465号；1983年8月30日授予Morihara，K.等的美国专利第4，401，757号；1984年12月18日授予Markussen，J.的美国专利第4，489，159号；1986年7月22日授予Obermeier，R.等的美国专利第4，601，852号；和1986年7月22日授予Andresen，F.H.等的美国专利第4，601，979号]；胰岛素的烷基酰胺衍生物[1995年7月4日授予Balschmidt，P.等的美国专利第5，430，016号]；胰岛素的各种其它衍生物[1975年3月4日授予Lindsay，D.G.的美国专利第3，869，437号]；和本文描述的脂肪酸酰化蛋白。
本文所用的术语“酰化蛋白”是指选自用有机酸部分酰化的胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原的衍生化蛋白，所述有机酸部分通过有机酸化合物的酸基团和该蛋白氨基之间形成的酰胺键结合至该蛋白。一般而言，所述氨基可以是该蛋白N末端氨基酸的α-氨基，或可以是该蛋白Lys残基的ε-氨基。酰化蛋白可以于胰岛素和大多数胰岛素类似物中存在的三个氨基中的一个或多个氨基酰化。单酰化蛋白于单个氨基酰化。二酰化蛋白于两个氨基酰化。三酰化蛋白于三个氨基酰化。所述有机酸化合物可以是例如脂肪酸、芳香酸或具有将与蛋白的氨基形成酰胺键的羧酸基团的任何其它有机化合物，与非衍生化蛋白相比，所述羧酸基团会降低所述衍生化蛋白的水溶性，提高亲脂性，或降低所述衍生化蛋白的锌/鱼精蛋白络合物的溶解性。
术语“脂肪酸酰化蛋白”是指选自用脂肪酸酰化的胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原的酰化蛋白，所述脂肪酸通过该脂肪酸的酸基和该蛋白的氨基之间形成的酰胺键结合至该蛋白。一般而言，所述氨基可以是该蛋白N末端氨基酸的α-氨基，或可以是该蛋白Lys残基的ε-氨基。脂肪酸酰化蛋白可以于胰岛素和大多数胰岛素类似物中存在的三个氨基中的一个或多个氨基酰化。单酰化蛋白于单个氨基酰化。二酰化蛋白于两个氨基酰化。三酰化蛋白于三个氨基酰化。脂肪酸酰化胰岛素公开于日本专利申请1-254，699。也参见Hashimoto，M.等，Pharmaceutical Research，6：171-176(1989)和Lindsay，D.G.等，Biochemical J.121：737-745(1971)。在以下文献中可找到脂肪酸酰化胰岛素和脂肪酸酰化胰岛素类似物及其合成方法的其它公开内容：1994年11月17日申请的Baker，J.C.等的U.S.08/342，931，1997年12月2日授予为美国专利第5，693，609号；1995年3月23日公开的Havelund，S.等的WO95/07931，对应于1998年5月12日的美国专利第5，750，497号；和1996年9月26日公开的Jonassen，I.等的WO96/29342。这些公开内容特此通过引用结合到本文中，以描述脂肪酸酰化胰岛素和脂肪酸酰化胰岛素类似物，以及以使得能够制备脂肪酸酰化胰岛素和脂肪酸酰化胰岛素类似物。
术语“脂肪酸酰化蛋白”包括药学上可接受的脂肪酸酰化蛋白复合物和其盐。术语“脂肪酸酰化蛋白”也包括酰化蛋白制剂，其中酰化蛋白分子群体在酰化位点方面是均一的。例如，对于本发明的目的，Nε-单酰化蛋白、B1-Nα-单酰化蛋白、A1-Nα-单酰化蛋白、A1，B1-Nα-二酰化蛋白、Nε，A1-Nα，二酰化蛋白、Nε，B1-Nα，二酰化蛋白和Nε，A1，B1-Nα，三酰化蛋白均包括在术语“脂肪酸酰化蛋白”中。该术语也指其中酰化蛋白分子群体具有不均一酰化的制剂。在后一种情况下，术语“脂肪酸酰化蛋白”包括单酰化和二酰化蛋白的混合物、单酰化和三酰化蛋白的混合物、二酰化和三酰化蛋白的混合物以及单酰化、二酰化和三酰化蛋白的混合物。
本文所用的术语“胰岛素”是指人胰岛素，其氨基酸序列和特定结构是众所周知的。人胰岛素由一条21个氨基酸的A链和一条30个氨基酸的B链组成，这两条链通过二硫键交联。正确交联的胰岛素含有三个二硫桥：一个位于A链7位和B链7位之间，第二个位于A链20位和B链19位之间，第三个位于A链6位和11位之间。
术语“胰岛素类似物”是指这样的蛋白，它具有一条A链和一条B链，其A链和B链的氨基酸序列分别与人胰岛素的A链和B链的氨基酸序列大致相同，但由于具有不破坏所述胰岛素类似物的胰岛素活性的一个或多个氨基酸缺失、一个或多个氨基酸取代和/或一个或多个氨基酸添加而不同于人胰岛素的A链和B链。
“动物胰岛素”是人胰岛素的类似物，因此是本文定义的胰岛素类似物。四种这样的动物胰岛素为兔、猪、牛和绵羊胰岛素。为了方便读者，以下列出了使这些动物胰岛素区别于人胰岛素的氨基酸取代。
                      氨基酸位置
           A8     A9     A10     B30
人胰岛素   Thr    Ser    Ile     Thr
兔胰岛素   Thr    Ser    Ile     Ser
猪胰岛素   Thr    Ser    Ile     Ala
牛胰岛素   Ala    Ser    Val     Ala
绵羊胰岛素 Ala    Gly    Val     Ala
另一种类型的胰岛素类似物“单体胰岛素类似物”是本领域熟知的。单体胰岛素类似物在结构上非常类似于人胰岛素，其活性类似于或等于人胰岛素，但具有一个或多个氨基酸缺失、取代或添加，这往往中断了参与二聚化和六聚化的接触，导致它们结合为更高的聚集状态的可能性降低。单体胰岛素类似物是人胰岛素的速效类似物，公开于例如1996年5月7日的Chance，R.E.等的美国专利第5，514，646号；Brems，D.N.等Protein Engineering，5：527-533(1992)；1987年3月18日公开的Brange，J.J.V.等，EPO公开说明书第214，826号；1997年4月8日的Brange，J.J.V.等的美国专利第5，618，913号；和Brange，J.等，Currnet Opinion in Structural Biology 1：934-940(1991)。单体胰岛素类似物的实例被描述为这样的人胰岛素，其中B28位的Pro被Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代，并且其中B29位的Lys为Lys，或被Pro取代，也描述为AlaB26-人胰岛素、des(B28-B30)-人胰岛素和des(B27)-人胰岛素。使用作本发明晶体中的衍生物，或在悬浮制剂的溶液相中非衍生化使用的所述单体胰岛素类似物在与人胰岛素相同的位置正确地交联。
用于本发明的另一组胰岛素类似物是等电点为约7.0至约8.0的那些胰岛素类似物。这些类似物称为“pI变化的胰岛素类似物”。这类胰岛素类似物的实例包括ArgB31，ArgB32-人胰岛素、GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素、ArgA0，ArgB31，ArgB32-人胰岛素和ArgA0，GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素。
另一组胰岛素类似物包括具有不显著破坏所述分子活性的一个或多个氨基酸缺失的胰岛素类似物。该组胰岛素类似物本文命名为“缺失类似物”。例如，于B1-B3位缺失一个或多个氨基酸的胰岛素类似物是有活性的。同样，于B28-B30位缺失一个或多个氨基酸的胰岛素类似物也是有活性的。“缺失类似物”的实例包括des(B30)-人胰岛素、desPhe(B1)-人胰岛素、des(B27)-人胰岛素、des(B28-B30)-人胰岛素和des(B1-B3)-人胰岛素。使用作本发明晶体中的衍生物、或在悬浮制剂的溶液相中非衍生化使用的缺失类似物在与人胰岛素相同的位置正确地交联。
已知酰胺化氨基酸、特别是胰岛素中的天门冬酰胺残基是化学不稳定的[1991年4月16日授予Jrogensen，K.H.等的美国专利第5，008，241号；1997年8月12日授予Dorschug，M.的美国专利第5，656，722号]。特别是，众所周知它们在某些条件下倾向于去酰胺和各种重排反应。因此，为了化学稳定性的缘故，胰岛素类似物可任选地为用其它氨基酸取代一个或多个酰胺化残基的胰岛素或胰岛素类似物。例如，Asn或Gln可以用非酰胺化氨基酸取代。Asn或Gln优选的氨基酸取代为Gly、Ser、Thr、Asp或Glu。优选取代一个或多个Asn残基。特别是，AsnAl8、AsnA21或AsnB3或那些残基的任何组合可以被例如Gly、Asp或Glu取代。此外，GlnA15或GlnB4或这两者可以被或者Asp或Glu取代。优选的取代是于B21的Asp和于B3的Asp。也优选不改变蛋白分子电荷的取代，因此也优选用中性氨基酸取代Asn或Gln。
术语“胰岛素原”是指胰岛素前体的单链肽分子。胰岛素原可以通过化学反应，或最好通过酶催化反应，转化为胰岛素或转化为胰岛素类似物。在胰岛素原中，正确的二硫键按本文所述形成。胰岛素原包括胰岛素或胰岛素类似物和一个连接键或连接肽。连接肽具有1至约35个氨基酸。所述连接键或连接肽分别通过一个α-酰胺键或通过两个α-酰胺键连接至A链的末端氨基酸和B链的末端氨基酸。最好是，连接肽中的氨基酸均不是半胱氨酸。连接肽的C末端氨基酸最好是Lys或Arg。胰岛素原可以具有式X-B-C-A-Y，或者可以具有式X-A-C-B-Y，其中X为氢或为其C末端氨基酸或者具有Lys或者具有Arg的1至约100个氨基酸的肽；Y为羟基，或者为其N末端氨基酸或者具有Lys或者具有Arg的1至约100个氨基酸的肽；A为胰岛素的A链或胰岛素类似物的A链；C为1至约35个非半胱氨酸的氨基酸的肽，其中所述C末端氨基酸为Lys或Arg；而B为胰岛素或胰岛素类似物的B链。
“药学上可接受的盐”是指蛋白中任何一个或多个带电基团和任何一个或多个药学上可接受的无毒阳离子或阴离子之间形成的盐。有机和无机盐包括例如由酸，诸如盐酸、硫酸、磺酸、酒石酸、延胡索酸、氢溴酸、乙醇酸、柠檬酸、马来酸、磷酸、琥珀酸、乙酸、硝酸、苯甲酸、抗坏血酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、丙酸、碳酸等制备的盐；或例如铵、钠、钾、钙或镁盐。
动词“酰化”是指在脂肪酸和蛋白的氨基之间形成酰胺键。当一种蛋白的一个或多个氨基以酰胺键与脂肪酸的酸基结合时，该蛋白被“酰化”
术语“脂肪酸”是指具有1-18个碳原子、饱和或不饱和的直链或支链脂肪酸。
术语“C1-C18脂肪酸”是指具有1-18个碳原子、饱和的直链或支链脂肪酸。
术语“二价金属阳离子”是指参加与多个蛋白分子形成络合物的离子。过渡金属、碱金属和碱土金属是已知与胰岛素形成络合物的金属的实例。最好是过渡金属。特别优选锌。药学上可接受的与胰岛素蛋白络合的其它过渡金属包括铜、钴和铁。
术语“complex”在本发明中具有两种含义。第一，该术语是指在形成络合物的所述蛋白的一个或多个原子与一个或多个二价金属阳离子之间形成的络合物。所述蛋白中的所述原子用作供电子配体。所述蛋白通常与二价过渡金属阳离子形成六聚物络合物。本发明中“complex”的第二种含义是络合化合物和六聚物之间的结合物。“络合化合物”是通常具有多个正电荷的有机分子，它结合至不溶性组合物中的六聚物，或与所述六聚物络合，由此稳定它们以抵抗溶解。本发明中合适络合化合物的实例包括鱼精蛋白、双(2-甲基-4-胺基-6-醌基)黑素、各种珠蛋白[Brange，J.，Galenics ofInsulin，Springer-Verlag，Berlin Heidelberg(1987)]和已知与胰岛素络合的各种聚阳离子聚合物化合物。
术语“鱼精蛋白”是指得自鱼精的强碱性蛋白混合物。鱼精蛋白中蛋白的平均分子量约4，200[Hoffmann，J.A.等，Protein Expressionand Purification，1：127-133(1990)]。“鱼精蛋白”可以指所述蛋白的相对无盐的制剂，通常称为“鱼精蛋白碱”。鱼精蛋白也指包含所述蛋白盐的制剂。市售制剂的盐含量变化很大。
鱼精蛋白对于胰岛素领域的技术人员是熟知的，目前被加入到NPH胰岛素制品中。鱼精蛋白的纯组分以及鱼精蛋白混合物在本发明中是有效的。然而，市售的鱼精蛋白制剂通常在存在的蛋白方面不是均质的。尽管如此，这些在本发明中也是有效的。由鱼精蛋白碱组成的鱼精蛋白在本发明中是有效的，由鱼精蛋白盐组成的以及为鱼精蛋白碱和鱼精蛋白盐的混合物的鱼精蛋白制剂也是有效的。硫酸鱼精蛋白是常用的鱼精蛋白盐。关于鱼精蛋白的所有质量比均参照鱼精蛋白游离碱给出。普通技术人员可以确定其它鱼精蛋白制剂质量比，它应当符合有关鱼精蛋白的特定质量比。
术语“悬浮液”是指液相和由大于胶体大小的不溶性或微溶性颗粒组成的固相的混合物。NPH微晶和水性溶剂的混合物形成悬浮液。无定形沉淀和水性溶剂的混合物也形成悬浮液。术语“悬浮制剂”是指药用组合物，其中活性药物存在于固相中，例如微晶固体、无定形沉淀或这两者中，所述活性药物很好地分散于水性溶剂中。很好分散的固体使得它可以通过温和搅拌混合物的作用，以相当均一的方式悬浮于整个水性溶剂中，由此提供相当均一的可以从中提取剂量体积的悬浮液。市售胰岛素悬浮制剂的实例包括例如NPH、PZI和特慢胰岛素。微晶悬浮制剂中的小比例固体物质可以是无定形的。无定形物质的比例优选低于微晶悬浮液中固体物质的10％，最优选低于1％。同样，无定形沉淀悬浮液中的小比例的固体物质可以是微晶的。
“NPH胰岛素”是指“中性鱼精蛋白Hagedorn”胰岛素制剂。同义词包括人胰岛素NPH和胰岛素NPH以及许多其它胰岛素制剂。Humulin_N是一种市售的NPH胰岛素制剂。相关的术语为“NPL”，是指NPH样LysB28，ProB29-人胰岛素类似物制剂。这些术语的含义和制备这些胰岛素制剂的方法是胰岛素制剂领域普通技术人员熟悉的。
术语“水性溶剂”是指含有水的液体溶剂。水性溶剂体系可以仅由水组成，可以包含水和一种或多种可混溶溶剂，并且可以含有溶质。更常用的可混溶溶剂为短链有机醇，诸如甲醇、乙醇、丙醇；短链酮，诸如丙酮；和多元醇，诸如甘油。
“等渗剂”是这样一种化合物，它是生理上耐受的，并赋予制剂合适张力以防止水净流穿过细胞膜，所述细胞膜与所给予制剂接触。甘油通常用作等渗剂。其它等渗剂包括例如氯化钠的盐和例如葡萄糖和乳糖的单糖。
本发明的不溶性组合物含有六聚物稳定化合物。术语“六聚物稳定化合物”是指稳定六聚体聚集状态的蛋白或衍生化蛋白的非蛋白性小分子量化合物。酚类化合物特别是酚类防腐剂是已知最好的用于胰岛素和胰岛素衍生物的稳定化合物。六聚物稳定化合物通过特定的分子间接触结合所述六聚物，而稳定所述六聚物。这种六聚物稳定剂的实例包括：各种酚类化合物、酚类防腐剂、间苯二酚、4’-羟基N-乙酰苯胺、4-羟基苯甲酰胺和2，7-二羟基萘。本发明不溶性组合物的多用途制剂除含有六聚物稳定化合物外，还将含有防腐剂。用于本发明制剂的防腐剂可以是酚类防腐剂，可以与所述六聚物稳定化合物相同或不同。
术语“防腐剂”是指加入药用制剂中用作抗微生物剂的化合物。胃肠外制剂必须符合作为市售适用的多用途制品的防腐剂效力准则。本领域已知的在胃肠外制剂中作为有效和可接受的防腐剂中，有氯苄烷胺、苄乙氧胺、chlorohexidine、苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸和它们的各种混合物。参见例如Wallh_usser，K.-H.，Develop.Biol.Standard，24：9-28(1974)(S.Krager，Basel)。
术语“酚类防腐剂”包括化合物苯酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和它们的混合物。某些酚类防腐剂诸如苯酚和间甲酚已知结合至胰岛素样分子，并由此诱导提高或者物理或者化学或这两者的稳定性的构象改变[Birnbaum，D.T.等，Pharmaceutical.Res.14：25-36(1997)；Rahuel-Clermont，S.等，Biochemistry 36：5837-5845(1997)]。
术语“缓冲剂”或“药学上可接受的缓冲剂”是指已知安全用于胰岛素制剂中并具有将制剂的pH控制在制剂所需pH的效应的化合物。本发明制剂的pH为约6.0至约8.0。本发明制剂的pH最好为约6.8至约7.8。用于将pH控制在中等酸性pH至中等碱性pH的药学上可接受的缓冲剂，包括诸如以下的化合物：磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、精氨酸、TRIS和组氨酸。“TRIS”是指2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇和其任何药学上可接受的盐。游离碱和盐酸盐形式是两种常见形式的TRIS。TRIS在本领域中也称为三羟甲基氨基甲烷、氨基丁三醇和三(羟甲基)氨基甲烷。药学上可接受的并适于将pH控制在所需水平的其它缓冲剂是普通化学技术人员已知的。
术语“给予”是指将本发明制剂引入有需要的患者机体内，以治疗疾病或病症。
术语“治疗”是指处理或护理患有糖尿病或高血糖或其它病症的患者，所述其它病症是指为了对抗或减轻所述病症的症状和并发症而需要给予胰岛素的病症。治疗包括给予本发明制剂，以防止所述症状或并发症发作、减轻症状或并发症、或消除所述疾病、病症或失调。
如上所述，本发明提供其特性在某些方面类似于NPH胰岛素、而在其它方面优于NPH胰岛素的不溶性组合物。它们在其物理特性方面类似于NPH胰岛素，如下文所述。配有油浸物镜和正交起偏振镜的光学显微镜用来检查按照制备本发明的包含B29-Nε-辛酰基-人胰岛素、胰岛素、锌、鱼精蛋白和苯酚的微晶。于1000x放大倍数下的检查表明，这些微晶是单个的棒状，表现出均一的晶体形态。这些微晶的大小一般在约2微米长至8微米长的范围内。用这种显微镜的直接比较表明，这些微晶的形态看来与工业生产的猪NPH微晶相似，后者已经在别处被描述为棒状。这些微晶的大小也与工业生产的NPH微晶相似，后者的平均长度一般约5微米。工业生产的NPH微晶平均长度的规格为1微米至40微米。
然而，本发明的微晶在其溶解特性以及时间作用方面意外地和不可预测地不同于NPH胰岛素晶体。特别是，本发明的微晶在模拟生理条件的条件下比NPH胰岛素晶体溶解慢得多，提供的血液葡萄糖控制分布曲线比NPH胰岛素更长、更平坦。这一点由以下实验证明。
发现某些可溶形式的衍生化蛋白的时间作用与普通人胰岛素没有显著差异。使用三组动物。第一组中的每只动物接受一定剂量(0.75nmol/kg)的Humulin_R(可溶性人胰岛素)，第二组中的每只动物接受一定剂量(0.75nmol/kg)的可溶性B29-Nε-辛酰基-人胰岛素(“C8-hI”)，而第三组中的每只动物接受一定剂量(0.75nmol／kg)的可溶性B29-Nε-癸酰基-人胰岛素(“C10-hI”)。实验基本上按照实施例5所述进行，每组5只狗。皮下给予所述蛋白。测定血液葡萄糖浓度，并示于下表中。表1.在同时给予促生长素抑制素产生一短暂糖尿病状态的正常狗中给予Humulin_R、可溶性B29-Nε-辛酰基-人胰岛素(“C8-hI”)或可溶性B29-Nε-癸酰基-人胰岛素(“C10-hI”)前后血液葡萄糖的浓度。数值为平均值±标准误差。
    血液葡萄糖浓度(mg/dL)
    时间(h)     Humulin_R    溶性C8-hI     可溶性C10-hI
    -0.5     110±2     115±4     108±2
    0     101±2     101±7     96±4
    0.5     83±5     80±5     85±6
    1     54±6     52+4     70±5
    1.5     49±4     51±2     57±4
    2     48±4     51±2     52±3
    2.5     55±4     60±3     56±4
    3     59±2     65±4     58±4
    3.5     65±2     73±5     63±4
   4      71±2      85±6      68±4
   5      87±2     110±8      79±3
   6     104±3     124±4      91±7
   7     119±8     145±14      106±8
   8     144±5     153±16     119±11
这些数据清楚表明，皮下给予一短暂糖尿病状态的正常狗的可溶性B29-Nε-辛酰基-人胰岛素和可溶性B29-Nε-癸酰基-人胰岛素，提供的葡萄糖降低大致与用可溶性人胰岛素获得的葡萄糖降低相当。最值得注意的是，可溶性B29-Nε-辛酰基-人胰岛素显示出比人胰岛素更快地开始，时间作用更短。
在第二个实验中，发现按照本发明制备的胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素共晶体的溶解速率比工业生产的NPH猪胰岛素的溶解速率明显更长。根据以上数据，这一点是最出乎意外的。可以采用熟知的方法[Graham和Pomeroy，J.Pharm.Pharmacol.36：427-430(1983)，如De Felippis，M.R.和Frank，B.等的修改方法，EP735，048]或本文所用的方法测定溶解速率。
通过于22℃的温度下，将5微升U100 NPH-猪胰岛素置于1cm光程长的正方形石英比色杯中的3ml Dulbecco磷酸缓冲盐水(无钙或镁)中，测定猪胰岛素NPH微晶的溶解速率。用比色杯磁力搅棒以恒定速率搅拌该溶液。以1分钟的间隔读取320nm下的吸光度测量值。320nm下的吸光度对应于由水性悬浮液中存在的不溶性颗粒散射的光。因此，当微晶溶解时，吸光度接近0。约20分钟后，猪胰岛素NPH微晶完全溶解。
采用以上所用的方法，也发现不含共结晶酰化人胰岛素的人胰岛素鱼精蛋白锌晶体的溶解速率约为20分钟。基本上用以下制备#1的方法制备这些NPH人胰岛素晶体，只是不用酰化蛋白，而使用7份人胰岛素。该实验得到的数据在图1用虚线表示。
按照以下制备2、4和5所述方法制备包含人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素的本发明共晶体。在这些制剂中，使用的人胰岛素和酰化胰岛素的结晶前质量比分别为3∶1、1∶1和1∶3。
按照上述方法测量这些共晶体的溶解速率。概括地讲，将12微升体积的每种鱼精蛋白-锌-B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素-人胰岛素共晶体悬浮液(含不多于50U/ml)，置于1cm光程长的正方形石英比色杯中的3ml Dulbecco磷酸缓冲盐水(无钙或镁)中。在22℃的相同温度下，以相同的恒定速率搅拌该溶液。该实验得到的数据示于图1中，表明3∶1的共晶体需要100分钟以上溶解，1∶1的共晶体需要150分钟以上溶解，而1∶3的共晶体甚至在400分钟后仍不完全溶解。
在溶解期间吸光度达到从起始吸光度值至最终吸光度值一半所需的时间定义为t1/2值。这些制剂的t1/2值示于以下表2中。表2.Iletin NPH、人胰岛素NPH和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素与人胰岛素共晶体的溶解t1/2值
    身份  B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素％  人胰岛素％  猪胰岛素％     t1/2值
 Iletin NPH        0       0     100       6
   人NPH        0     100       0       7
 3∶1共晶体       25      75       0      38
 1∶1共晶体       50      50       0     117
 1∶3共晶体       75      25       0   ＞400
这些实验确立，在于某些方面模拟组织液的Dulbecco磷酸缓冲盐水(无钙和镁)中，3∶1、1∶1和1∶3共晶体的溶解速率显著低于猪NPH微晶的溶解速率。这些实验也确立，鱼精蛋白-锌-人胰岛素微晶的溶解速率非常类似于猪NPH胰岛素(Iletin NPH)的溶解速率。这些结果还确立，鱼精蛋白-锌-B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素-人胰岛素共晶体的溶解速率取决于共晶体中存在的人胰岛素与B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素之比，具体地说，鱼精蛋白-锌-B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素-人胰岛素共晶体的溶解速率随人胰岛素比例的降低而降低。
使用基于HPLC测定溶解的蛋白和衍生化蛋白的另一种溶解方法，比较上述1∶3微晶与人胰岛素NPH、人特慢胰岛素和牛特慢胰岛素的市售制剂的溶解速率，并且也研究改变蛋白与衍生化蛋白的比率对溶解速率的影响。
在保持25℃的水夹套溶解装置中，将一定体积(0.5ml)的U100制剂悬浮于200ml调至pH7.4的Dulbecco磷酸缓冲盐水中。溶解缓冲液也含有1mg/ml人血清白蛋白以防止溶解的胰岛素的吸附损失。以180rpm的恒定速率搅拌溶解介质。以规则的间隔取出3.5ml该溶液并通过0.22μm低蛋白结合滤器过滤。弃去前0.5ml滤液，将接下来的1.5ml滤液用4ml 5N HCl酸化并经HPLC分析。HPLC峰面积确定溶解的胰岛素浓度，并以未过滤样品中胰岛素的总面积为100％，以随时间而变的溶解的百分率表示结果。如果未过滤样品中胰岛素的总面积随时间略微减小，则用一线性修正数值作为100％，来计算在各个时间点溶解的百分率。这些研究的结果示于图3和图4。
图3的数据表明，掺入微晶中的衍生化蛋白的部分越大，则溶解速率越慢。图4数据表明，人胰岛素和B29-辛酰基人胰岛素的1∶3微晶比人胰岛素NPH和人特慢胰岛素溶解明显更慢。最明显的是，所述1∶3微晶的溶解速率非常类似于牛特慢胰岛素的溶解速率。长期以来牛特慢胰岛素被认为是几近理想的长效胰岛素制剂，因为其生物活性延长时间非常长，也因为给予其后药效反应平坦。因此，预期这些微晶在非常长的时期内提供基础葡萄糖输出控制的能力方面可能接近或超过牛特慢胰岛素。
因为NPH制剂的时间作用分布图与微晶在皮下组织液中溶解的速率密切相关，所以从这些实验中总结出：本发明的微晶组合物当皮下给予糖尿病患者时，具有的延长的作用时间比现有的市售NPH胰岛素制剂更长。重要的是，这些结果也确立了，本发明通过操作蛋白与衍生化蛋白之比，使得可能控制、甚至优化患者中的作用时间。
当对照历史背景来看时，通过简单地改变蛋白与衍生化蛋白之比而操作作用时间的这种能力是最显著的。从历史上讲，控制基础葡萄糖输出的胰岛素制剂研制的主要障碍，是其时间作用不可改变地与该蛋白的固有分子特性例如白蛋白结合亲和性、等电点或溶解性相联系。结果是，每种分子或每种制剂可能仅有单一的时间作用，而改进药代动力学的仅有的求助方法是进一步修饰该分子。
长期以来追求的目标是研制其中通过操作制剂基质可以精细而方便地控制药代动力学的控释传递系统。在过去15年中该领域中的许多科学研究和工业研究已经涉及胰岛素，然而，因为胰岛素极其窄的治疗指数、其长期使用的需求以及对复杂和昂贵的方法和制剂有偏见的经济上的考虑，已经证明控释的目标特别难以捉摸。
本发明的主要优点是，这是一种比其它已提出的控释技术更方便地控制胰岛素释放药代动力学的控释系统。亦即包含蛋白胰岛素与衍生化蛋白的不溶性组合物提供一种方便的装置，以调节溶解速率并因此使得可以控释。尽管不打算受到限制，但相信本发明的不溶性组合物的药理学效力基于从所述组合物缓慢释放恒定比例的蛋白和衍生化蛋白。在不限制本发明的情况下，我们还认为，本发明显著的潜在特征是所述不溶性组合物完全均质或几乎完全均一。对于微晶，相信悬浮液中每一单个的微晶由几近相同比例的蛋白和衍生化蛋白组成。这个比率与结晶前混合在溶液中的蛋白和衍生化蛋白的比率紧密相连。关于溶解的微晶，也相信在溶解的整个过程中释放恒定和预定比例的蛋白和衍生化蛋白。这种行为的重要性是非常大的，因为它导致恒定、但速率降低地从注射部位将这两种活性分子释放到血流中。为了达到这一目的，必须特别关注制备所述组合物的方法。
蛋白与衍生化蛋白一起结晶并由此获得均一的共晶体是可能的，这一发现根据影响蛋白结晶的以下参数的复杂性而言是意外的：除体积效应、溶解性和空间体积外，还有特异性和非特异性分子间相互作用，诸如氢键、静电相互作用、疏水性相互作用、范德华力。尽管对于小分子结晶的基本了解相对增加，但对于复杂的大分子，这仍主要是定性科学，并且目前的实践由经验性地应用各式各样的结晶配方所组成。
疏水作用已被提出为蛋白结合的主要驱动力[Chothia，C.等，Nature 256：705-708(1975)]。此外，已经注意到表面疏水性和蛋白-蛋白接触之间的强相关性[Young，L.等，Protein Science 3：717-729(1994)]。此外，根据蛋白结晶的复杂性，衍生化胰岛素可以与未衍生化蛋白以与普通胰岛素同晶或几乎同晶的形式共结晶，这一发现是令人惊讶的。
为了修饰治疗行为，将两种相关治疗蛋白共结晶是一新概念。在很大程度上这是因为，由于获得单一的、大的、均一的适于X射线衍射结构分析的晶体的目标，推动了绝大多数蛋白结晶的工作。尽管蛋白共晶体是已知的，但这些共晶体系统特征为主体(host)-底物复合物，例如蛋白及其受体、蛋白-DNA复合物和蛋白受体-药物复合物。这些主体-底物复合物共晶体根本不同于本发明共晶体，因为在所述蛋白和衍生化蛋白之间没有形成复合物。
通过在溶解研究期间采用已知量的人胰岛素(蛋白)和B29-辛酰基-人胰岛素(衍生化蛋白)制备的两种微晶制剂，(利用HPLC)测定了蛋白和衍生化蛋白的浓度，证明了本发明不溶性组合物的蛋白和衍生化蛋白比例的可预测性以及不溶性组合物的均一性。在第一种制剂中，加入的蛋白与加入的衍生化蛋白的质量比为1∶3。在第二种制剂中，该比例为55∶45。对于1∶3的微晶，在以上溶解实验所述的条件下于溶解期间的10小时内进行了14次测量，B29-辛酰基-人胰岛素占总蛋白的约73-76％。在所述数据中没有观察到任何倾向。对于55∶45的微晶，在以上溶解实验所述的条件下于溶解期间的约3.75小时内进行了9次测量，B29-辛酰基-人胰岛素占总蛋白的约43-47％。在所述数据中也没有观察到任何倾向。
本发明的不溶性组合物可以是具有棒状形态或不规则形态的晶体，或它们可以是无定形沉淀。优选的不溶性组合物包含酰化胰岛素或酰化胰岛素类似物、锌离子(以每摩尔总蛋白约0.3至约0.7摩尔存在)、酚类防腐剂和鱼精蛋白，酚类防腐剂选自苯酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和它们的混合物，其相对于总蛋白的存在比例足以稳定T3R3或R6六聚物构象，鱼精蛋白的存在量为每摩尔总蛋白约0.15至约0.7摩尔。
用于制备用以形成本发明不溶性组合物的衍生化胰岛素类似物的一组优选的胰岛素类似物，包括动物胰岛素、缺失类似物和pI变化的类似物。更优选的一组包括动物胰岛素和缺失类似物。再更优选缺失类似物。
用于本发明微晶的另一组优选的胰岛素类似物包括单体胰岛素类似物。特别优选这样的单体胰岛素类似物，其中B28位的氨基酸残基为Asp、Lys、Leu、Val或Ala，B29位的氨基酸残基为Lys或Pro，B10位的氨基酸残基为His或Asp，B1位的氨基酸残基为Phe、Asp或单独缺失，或缺失并且缺失B2位的氨基酸残基，B30位的氨基酸残基为Thr、Ala、Ser或缺失，而B9位的氨基酸残基为Ser或Asp；前提是B28或B29位的任一个为Lys。
用于本发明的另一组优选的胰岛素类似物包括那些胰岛素类似物，其中该胰岛素类似物的等电点为约7.0至约8.0。这些类似物被称为“pI变化的胰岛素类似物”。pI变化的胰岛素类似物包括例如ArgB31，ArgB32-人胰岛素、GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素、ArgA0，ArgB31，ArgB32-人胰岛素和ArgA0，GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素。
另一组优选的胰岛素类似物包括LysB28，ProB29-人胰岛素(B28为Lys；B29为Pro)；AspB28-人胰岛素(B28为Asp)、AspBl-人胰岛素、ArgB31，ArgB32-人胰岛素、ArgA0-人胰岛素、AspBl，GluB13-人胰岛素、AlaB26-人胰岛素、GlyA21-人胰岛素、des(ThrB30)-人胰岛素和GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素。
特别优选的胰岛素类似物包括LysB28，ProB29-人胰岛素、des(ThrB30)-人胰岛素、AspB28-人胰岛素和AlaB26-人胰岛素。另一特别优选的胰岛素类似物为GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素[1997年8月12日授予D_rschug，M.的美国专利第5，656，722号]。最优选的胰岛素类似物为LysB28，ProB29-人胰岛素。
优选的衍生化蛋白是酰化蛋白，用于本发明微晶和制剂的优选的酰化蛋白是脂肪酸酰化胰岛素和脂肪酸酰化胰岛素类似物。高度优选脂肪酸酰化人胰岛素。同等高度优选脂肪酸酰化胰岛素类似物。
用于将胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素原(统称蛋白)衍生化的特定一组可以是当结合于所述蛋白时不显著降低所述蛋白生物活性、无毒的任何化学部分，最重要的是所述化学部分降低所述衍生化蛋白的水溶性、提高其亲脂性，或降低锌/鱼精蛋白络合物的溶解性。
一组优选的酰化部分包括直链饱和脂肪酸。该组包括甲酸(C1)、乙酸(C2)、丙酸(C3)、正丁酸(C4)、正戊酸(C5)、正己酸(C6)、正庚酸(C7)、正辛酸(C8)、正壬酸(C9)、正癸酸(C10)、正十一酸(C11)、正十二酸(C12)、正十三酸(C13)、正十四酸(C14)、正十五酸(C15)、正十六酸(C16)、正十七酸(C17)和正十八酸(C18)。形容词形式为甲酰基(C1)、乙酰基(C2)、丙酰基(C3)、丁酰基(C4)、戊酰基(C5)、己酰基(C6)、庚酰基(C7)、辛酰基(C8)、壬酰基(C9)、癸酰基(C10)、十一烷酰基(C11)、十二烷酰基(C12)、十三烷酰基(C13)、十四烷酰基(C14)或肉豆蔻酰基、十五烷酰基(C15)、十六烷酰基(C16)或棕榈酰基、十七烷酰基(C17)和十八烷酰基(C18)或硬脂酰基。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的一组优选脂肪酸，包括具有偶数碳原子的脂肪酸，即C2、C4、C6、C8、C10、C12、C14、C16和C18饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括具有奇数碳原子的脂肪酸，即C1、C3、C5、C7、C9、C11、C13、C15和C17饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括具有5个以上碳原子的脂肪酸，即C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括碳原子数少于9的脂肪酸，即C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C8饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括具有6-8个碳原子的脂肪酸，即C6、C7和C8饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括具有4-6个碳原子的脂肪酸，即C4、C5和C6饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括具有2-4个碳原子的脂肪酸，即C2、C3和C4饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括碳原子数少于6的脂肪酸，即C1、C2、C3、C4和C5饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括碳原子数少于4的脂肪酸，即C1、C2和C3饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括碳原子数多于9的脂肪酸，即C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括具有偶数碳原子数、且碳原子数多于9的脂肪酸，即C10、C12、C14、C16和C18饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括具有12、14或16个碳原子的脂肪酸，即C12、C14和C16饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括具有14或16个碳原子的脂肪酸，即C14和C16饱和脂肪酸。特别优选具有14个碳的脂肪酸。也特别优选具有16个碳的脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括具有4-10个碳原子的饱和脂肪酸，即C4、C5、C6、C7、C8、C9和C10饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸，包括具有4-10偶数碳原子数的饱和脂肪酸，即C4、C6、C8和C10饱和脂肪酸。
用于形成本发明微晶所用的脂肪酸酰化蛋白的另一组优选脂肪酸包括具有6、8或10个碳原子的脂肪酸。特别优选具有6个碳的脂肪酸。也特别优选具有8个碳的脂肪酸。特别优选具有10个碳的脂肪酸。
技术人员会认识到，通过混合上述优选组的脂肪酸，可得到较窄的优选组。
另一组优选的酰化部分包括具支链的饱和脂肪酸。支链脂肪酸具有至少两个支链。支链脂肪酸的“支链”长度可以用以所述酸碳开始的所述支链中的碳原子数描述。例如，支链脂肪酸3-乙基-5-甲基己酸具有长度为5、6和6个碳的三个支链。在这种情况下，“最长的”支链为6个碳。作为另一实例，2，3，4，5-四乙基辛酸具有长4、5、6、7和8个碳的5个支链。“最长的”支链为8个碳。一组优选的支链脂肪酸为最长支链中具有3-10个碳原子的支链脂肪酸。
我们将会提到这种支链饱和脂肪酸的典型数目，以确保读者理解可以用作本发明蛋白酰化部分的这类脂肪酸的范围：2-甲基-丙酸、2-甲基-丁酸、3-甲基-丁酸、2，2-二甲基-丙酸、2-甲基-戊酸、3-甲基-戊酸、4-甲基-戊酸、2，2-二甲基-丁酸、2，3-二甲基-丁酸、3，3-二甲基-丁酸、2-乙基-丁酸、2-甲基-己酸、5-甲基-己酸、2，2-二甲基-戊酸、2，4-二甲基-戊酸、2-乙基-3-甲基-丁酸、2-乙基-戊酸、3-乙基-戊酸、2，2-二甲基-3-甲基-丁酸、2-甲基-庚酸、3-甲基-庚酸、4-甲基-庚酸、5-甲基-庚酸、6-甲基-庚酸、2，2-二甲基-己酸、2，3-二甲基-己酸、2，4-二甲基-己酸、2，5-二甲基-己酸、3，3-二甲基-己酸、3，4-二甲基-己酸、3，5-二甲基-己酸、4，4-二甲基-己酸、2-乙基-己酸、3-乙基-己酸、4-乙基-己酸、2-丙基-戊酸、2-乙基-己酸、3-乙基-己酸、4-乙基-己酸、2-(1-丙基)戊酸、2-(2-丙基)戊酸、2，2-二乙基-丁酸、2，3，4-三甲基-戊酸、2-甲基-辛酸、4-甲基-辛酸、7-甲基-辛酸、2，2-二甲基-庚酸、2，6-二甲基-庚酸、2-乙基-2-甲基-己酸、3-乙基-5-甲基-己酸、3-(1-丙基)-己酸、2-(2-丁基)-戊酸、2-(2-(2-甲基丙基))戊酸、2-甲基-壬酸、8-甲基-壬酸、6-乙基-辛酸、4-(1-丙基)-庚酸、5-(2-丙基)-庚酸、3-甲基-十一酸、2-戊基-庚酸、2，3，4，5，6-五甲基-庚酸、2，6-二乙基-辛酸、2-己基-辛酸、2，3，4，5，6，7-六甲基-辛酸、3，3-二乙基-4，4-二乙基-己酸、2-庚基-壬酸、2，3，4，5-四乙基-辛酸、2-辛基-癸酸和2-(1-丙基)-3-(1-丙基)-4，5-二乙基-6-甲基-庚酸。
再一组优选的酰化部分包括具有5-24个碳原子的环烷酸，其中一个或多个所述环烷基部分具有5-7个碳原子。将提及这种环烷酸的典型数目以确保读者理解可以用作本发明蛋白酰化部分的这类酸的范围：环戊基-甲酸、环己基-甲酸、1-环戊基乙酸、2-环己基-乙酸、1，2-二环戊基-乙酸等等。
一组优选的用于本发明不溶性组合物的衍生化蛋白包括单酰化蛋白。最优选于ε-氨基单酰化。对于胰岛素，优选于LysB29的单酰化。同样，对于某些胰岛素类似物，诸如LysB28，ProB29-人胰岛素类似物，最优选于LysB28的ε-氨基单酰化。也优选于B链的α-氨基(B1)单酰化。也优选于A链的α-氨基(A1)单酰化。
另一组优选的用于本发明不溶性组合物的酰化蛋白包括二酰化蛋白。可以例如于Lys的ε-氨基和B链的α-氨基二酰化，或可以于Lys的ε-氨基和A链的α-氨基二酰化，或可以于A链的α-氨基和B链的α-氨基二酰化。
另一组优选的用于本发明不溶性组合物的酰化蛋白包括三酰化蛋白。三酰化蛋白是那些于Lys的ε-氨基、B链的α-氨基和A链的α-氨基酰化的三酰化蛋白。
也优选使用为单酰化和二酰化蛋白混合物的酰化蛋白。
同样优选使用为单酰化和三酰化蛋白混合物的酰化蛋白。
另一组优选的酰化蛋白包括二酰化和三酰化蛋白的混合物。
也优选使用为单酰化、二酰化和三酰化蛋白混合物的酰化蛋白。
将提及用于本发明微晶中的某些脂肪酸酰化蛋白，以确保读者理解本发明的范围。该表是说明性的，不提及特定脂肪酸酰化蛋白的事实不意味着含其的微晶不在本发明的范围内。1．B29-Nε-甲酰基-人胰岛素。2．B1-Nα-甲酰基-人胰岛素。3．A1-Nα-甲酰基-人胰岛素。4．B29-Nε-甲酰基-，B1-Nα-甲酰基-人胰岛素。5．B29-Nε-甲酰基-，A1-Nα-甲酰基-人胰岛素。6．A1-Nα-甲酰基-，B1-Nα-甲酰基-人胰岛素。7．B29-Nε-甲酰基-，A1-Nα-甲酰基-，B1-Nα-甲酰基-人胰岛素。8．B29-Nε-乙酰基-人胰岛素。9．B1-Nα-乙酰基-人胰岛素。10．A1-Nα-乙酰基-人胰岛素。11．B29-Nε-乙酰基-，B1-Nα-乙酰基-人胰岛素。12．B29-Nε-乙酰基-，A1-Nα-乙酰基-人胰岛素。13．A1-Nα-乙酰基-，B1-Nα-乙酰基-人胰岛素。14．B29-Nε-乙酰基-，A1-Nα-乙酰基-，B1-Nα-乙酰基-人胰岛素。15．B29-Nε-丙酰基-人胰岛素。16．B1-Nα-丙酰基-人胰岛素。17．A1-Nα-丙酰基-人胰岛素。18．B29-Nε-丙酰基-，B1-Nα-丙酰基-人胰岛素。19．B29-Nε-丙酰基-，A1-Nα-丙酰基-人胰岛素。20．A1-Nα-丙酰基-，B1-Nα-丙酰基-人胰岛素。21．B29-Nε-丙酰基-，A1-Nα-丙酰基-，B1-Nα-丙酰基-人胰岛素。22．B29-Nε-丁酰基-人胰岛素。23．B1-Nα-丁酰基-人胰岛素。24．A1-Nα-丁酰基-人胰岛素。25．B29-Nε-丁酰基-，B1-Nα-丁酰基-人胰岛素。26．B29-Nε-丁酰基-，A1-Nα-丁酰基-人胰岛素。27．A1-Nα-丁酰基-，B1-Nα-丁酰基-人胰岛素。28．B29-Nε-丁酰基-，A1-Nα-丁酰基-，B1-Nα-丁酰基-人胰岛素。29．B29-Nε-戊酰基-人胰岛素。30．B1-Nα-戊酰基-人胰岛素。31．A1-Nα-戊酰基-人胰岛素。32．B29-Nε-戊酰基-，B1-Nα-戊酰基-人胰岛素。33．B29-Nε-戊酰基-，A1-Nα-戊酰基-人胰岛素。34．A1-Nα-戊酰基-，B1-Nα-戊酰基-人胰岛素。35．B29-Nε-戊酰基-，A1-Nα-戊酰基、B1-Nα-戊酰基-人胰岛素。36．B29-Nε-己酰基-人胰岛素。37．B1-Nα-己酰基-人胰岛素。38．A1-Nα-己酰基-人胰岛素。39．B29-Nε-己酰基-，B1-Nα-己酰基-人胰岛素。40．B29-Nε-己酰基-，A1-Nα-己酰基-人胰岛素。41．A1-Nα-己酰基-，B1-Nα-己酰基-人胰岛素。42．B29-Nε-己酰基-，A1-Nα-己酰基-，B1-Nα-己酰基-人胰岛素。43．B29-Nε-庚酰基-人胰岛素。44．B1-Nα-庚酰基-人胰岛素。45．A1-Nα-庚酰基-人胰岛素。46．B29-Nε-庚酰基-，B1-Nα-庚酰基-人胰岛素。47．B29-Nε-庚酰基-，A1-Nα-庚酰基-人胰岛素。48．A1-Nα-庚酰基-，B1-Nα-庚酰基-人胰岛素。49．B29-Nε-庚酰基-，A1-Nα-庚酰基-，B1-Nα-庚酰基-人胰岛素。50．B29-Nε-辛酰基-人胰岛素。51．B1-Nα-辛酰基-人胰岛素。52．A1-Nα-辛酰基-人胰岛素。53．B29-Nε-辛酰基-，B1-Nα-辛酰基-人胰岛素。54．B29-Nε-辛酰基-，A1-Nα-辛酰基-人胰岛素。55．A1-Nα-辛酰基-，B1-Nα-辛酰基-人胰岛素。56．B29-Nε-辛酰基-，A1-Nα-辛酰基-，B1-Nα-辛酰基-人胰岛素。57．B29-Nε-壬酰基-人胰岛素。58．B1-Nα-壬酰基-人胰岛素。59．A1-Nα-壬酰基-人胰岛素。60．B29-Nε-壬酰基-，B1-Nα-壬酰基-人胰岛素。61．B29-Nε-壬酰基-，A1-Nα-壬酰基-人胰岛素。62．A1-Nα-壬酰基-，B1-Nα-壬酰基-人胰岛素。63．B29-Nε-壬酰基-，A1-Nα-壬酰基-，B1-Nα-壬酰基-人胰岛素。64．B29-Nε-癸酰基-人胰岛素。65．B1-Nα-癸酰基-人胰岛素。66．A1-Nα-癸酰基-人胰岛素。67．B29-Nε-癸酰基-，B1-Nα-癸酰基-人胰岛素。68．B29-Nε-癸酰基-，A1-Nα-癸酰基-人胰岛素。69．A1-Nα-癸酰基-，B1-Nα-癸酰基-人胰岛素。70．B29-Nε-癸酰基-，A1-Nα-癸酰基，B1-Nα-癸酰基-人胰岛素。71．B29-Nε-十一烷酰基-人胰岛素。72．B1-Nα-十一烷酰基-人胰岛素。73．A1-Nα-十一烷酰基-人胰岛素。74．B29-Nε-十二烷酰基-人胰岛素。75．B1-Nα-十二烷酰基-人胰岛素。76．A1-Nα-十二烷酰基-人胰岛素。77．B29-Nε-十三烷酰基-人胰岛素。78．B1-Nα-十三烷酰基-人胰岛素。79．A1-Nα-十三烷酰基-人胰岛素。80．B29-Nε-十四烷酰基-人胰岛素。81．B1-Nα-十四烷酰基-人胰岛素。82．A1-Nα-十四烷酰基-人胰岛素。83．B29-Nε-十五烷酰基-人胰岛素。84．B1-Nα-十五烷酰基-人胰岛素。85．A1-Nα-十五烷酰基-人胰岛素。86．B29-Nε-十六烷酰基-人胰岛素。87．B1-Nα-十六烷酰基-人胰岛素。88．A1-Nα-十六烷酰基-人胰岛素。89．B29-Nε-十七烷酰基-人胰岛素。90．B1-Nα-十七烷酰基-人胰岛素。91．A1-Nα-十七烷酰基-人胰岛素。92．B29-Nε-十八烷酰基-人胰岛素。93．B1-Nα-十八烷酰基-人胰岛素。94．A1-Nα-十八烷酰基-人胰岛素。95．B28-Nε-甲酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。96．B1-Nα-甲酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。97．A1-Nα-甲酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。98．B28-Nε-甲酰基-，B1-Nα-甲酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。99．B28-Nε-甲酰基-，A1-Nα-甲酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。100．A1-Nα-甲酰基-，B1-Nα-甲酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。101．B28-Nε-甲酰基-，A1-Nα-甲酰基-，B1-Nα-甲酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。102．B28-Nε-乙酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。103．B1-Nα-乙酰基LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。104．A1-Nα-乙酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。105．B28-Nε-乙酰基-，B1-Nα-乙酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。106．B28-Nε-乙酰基-，A1-Nα-乙酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。107．A1-Nα-乙酰基-，B1-Nα-乙酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。108．B28-Nε-乙酰基-，A1-Nα-乙酰基-，B1-Nα-乙酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。109．B28-Nε-丙酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。110．B1-Nα-丙酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。111．A1-Nα-丙酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。112．B28-Nε-丙酰基-，B1-Nα-丙酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。113．B28-Nε-丙酰基-，A1-Nα-丙酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。114．A1-Nα-丙酰基-，B1-Nα-丙酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。115．B28-Nε-丙酰基-，A1-Nα-丙酰基-，B1-Nα-丙酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。116．B28-Nε-丁酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。117．B1-Nα-丁酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。118．A1-Nα-丁酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。119．B28-Nε-丁酰基-，B1-Nα-丁酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。120．B28-Nε-丁酰基-，A1-Nα-丁酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。121．A1-Nα-丁酰基-，B1-Nα-丁酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。122．B28-Nε-丁酰基-，A1-Nα-丁酰基-，B1-Nα-丁酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。123．B28-Nε-戊酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。124．B1-Nα-戊酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。125．A1-Nα-戊酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。126．B28-Nε-戊酰基-，B1-Nα-戊酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。127．B28-Nε-戊酰基-，A1-Nα-戊酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。128．A1-Nα-戊酰基-，B1-Nα-戊酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。129．B28-Nε-戊酰基-，A1-Nα-戊酰基-，B1-Nα-戊酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。130．B28-Nε-己酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。131．B1-Nα-己酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。132．A1-Nα-己酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。133．B28-Nε-己酰基-，B1-Nα-己酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。134．B28-Nε-己酰基-，A1-Nα-己酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。135．A1-Nα-己酰基-，B1-Nα-己酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。136．B28-Nε-己酰基-，A1-Nα-己酰基-，B1-Nα-己酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。137．B28-Nε-庚酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。138．B1-Nα-庚酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。139．A1-Nα-庚酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。140．B28-Nε-庚酰基-，B1-Nα-庚酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。141．B28-Nε-庚酰基-，A1-Nα-庚酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。142．A1-Nα-庚酰基-，B1-Nα-庚酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。143．B28-Nε-庚酰基-，A1-Nα-庚酰基-，B1-Nα-庚酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。144．B28-Nε-辛酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。145．B1-Nα-辛酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。146．A1-Nα-辛酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。147．B28-Nε-辛酰基-，B1-Nα-辛酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。148．B28-Nε-辛酰基-，A1-Nα-辛酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。149．A1-Nα-辛酰基-，B1-Nα-辛酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。150．B28-Nε-辛酰基-，A1-Nα-辛酰基-，B1-Nα-辛酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。151．B28-Nε-壬酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。152．B1-Nα-壬酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。153．A1-Nα-壬酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。154．B28-Nε-壬酰基-，B1-Nα-壬酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。155．B28-Nε-壬酰基-，A1-Nα-壬酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。156．A1-Nα-壬酰基-，B1-Nα-壬酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。157．B28-Nε-壬酰基-，A1-Nα-壬酰基-，B1-Nα-壬酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。158．B28-Nε-癸酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。159．B1-Nα-癸酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。160．A1-Nα-癸酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。161．B28-Nε-癸酰基-，B1-Nα-癸酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。162．B28-Nε-癸酰基-，A1-Nα-癸酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。163．A1-Nα-癸酰基-，B1-Nα-癸酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。164．B28-Nε-癸酰基-，A1-Nα-癸酰基-，B1-Nα-癸酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。165．B28-Nε-十一烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。166．B1-Nα-十一烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。167．A1-Nα-十一烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。168．B28-Nε-十二烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。169．B1-Nα-十二烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。170．A1-Nα-十二烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。171．B28-Nε-十三烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。172．B1-Nα-十三烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。173．A1-Nα-十三烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。174．B28-Nε-十四烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。175．B1-Nα-十四烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。176．A1-Nα-十四烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。177．B28-Nε-十五烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。178．B1-Nα-十五烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。179．A1-Nα-十五烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。180．B28-Nε-十六烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。181．B1-Nα-十六烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。182．A1-Nα-十六烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。183．B28-Nε-十七烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。184．B1-Nα-十七烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。185．A1-Nα-十七烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。186．B28-Nε-十八烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。187．B1-Nα-十八烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。188．A1-Nα-十八烷酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。189．B29-Nε-戊酰基-GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素。190．B1-Nα-己酰基-GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素。191．A1-Nα-庚酰基-GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素。192．B29-Nε-辛酰基-，B1-Nα-辛酰基-GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素。193．B29-Nε-丙酰基-，A1-Nα-丙酰基-GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素。194．A1-Nα-乙酰基-，B1-Nα-乙酰基-GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素。195．B29-Nε-甲酰基-，A1-Nα-甲酰基-，B1-Nα-甲酰基-GlyA21，ArgB31，ArgBB32-人胰岛素。196．B29-Nε-甲酰基-des(TyrB26)-人胰岛素。197．B1-Nα-乙酰基-AspB28-人胰岛素。198．B29-Nε-丙酰基-，A1-Nα-丙酰基-，B1-Nα-丙酰基-AspB1，AspB3，AspB21-人胰岛素。199．A1-Nα-丁酰基-AspB10-人胰岛素。200．B29-Nε-戊酰基-GlyA21-人胰岛素。201．B1-Nα-己酰基-GlyA21-人胰岛素。202．A1-Nα-庚酰基-GlyA21-人胰岛素。203．B29-Nε-辛酰基-，B1-Nα-辛酰基-GlyA21-人胰岛素。204．B29-Nε-丙酰基-，A1-Nα-丙酰基-GlyA21-人胰岛素。205．A1-Nα-乙酰基-，B1-Nα-乙酰基-GlyA21-人胰岛素。206．B29-Nε-甲酰基-，A1-Nα-甲酰基-，B1-Nα-甲酰基-GlyA21-人胰岛素。207．B29-Nε-丁酰基-des(ThrB30)-人胰岛素。208．B1-Nα-丁酰基-des(ThrB30)-人胰岛素。209．A1-Nα-丁酰基-des(ThrB30)-人胰岛素。210．B29-Nε-丁酰基-，B1-Nα-丁酰基-des(ThrB30)-人胰岛素。211．B29-Nε-丁酰基、A1-Nα-丁酰基-des(ThrB30)-人胰岛素。212．A1-Nα-丁酰基-，B1-Nα-丁酰基-des(ThrB30)-人胰岛素。213.B29-Nε-丁酰基-，A1-Nα-丁酰基-，B1-Nα-丁酰基-des(ThrB30)-人胰岛素。
优选含水作为主要溶剂的水性组合物。高度优选其中水为溶剂的水性悬浮液。
本发明的组合物用来治疗患有糖尿病或高血糖的患者。本发明的制剂通常提供浓度为约1mg／ml至约10mg／ml的衍生化蛋白。本发明的胰岛素制品制剂通常根据胰岛素活性单位浓度(单位/ml)来特征鉴定，诸如U40、U50、U100等等，这分别大致相对于约1.4、1.75和3.5mg/ml制剂。给药剂量、途径和每天给药次数将由医师考虑诸如以下因素来确定：治疗对象、患者疾病的性质和原因、患者的性别和体重、运动水平、饮食习惯、给药方法和有经验医师已知的其它因素。在广泛的范围内，日剂量范围为约1nmol/kg体重至约6nmol/kg体重(6nmol被认为等于约1单位胰岛素活性)。目前胰岛素疗法通常的剂量为约2至约3nmol/kg。
治疗糖尿病的普通有经验的医师能够选择治疗上最有利的方法，给予本发明的制剂。最好是胃肠外给药途径。通常的胃肠外给予胰岛素悬浮制剂的途径是皮下和肌内途径。本发明的组合物和制剂也可经鼻、颊、肺或眼途径给予。
优选浓度为12mg/ml-25mg/ml的甘油作为等渗剂。对于等渗性，再更高度优选使用浓度为约15mg/ml至约17mg/ml的甘油。
在本发明的制剂中最好使用间甲酚和苯酚或它们的混合物作为防腐剂。
通过多种已知的肽合成技术中的任何一种，可以制备用来制备衍生化蛋白的胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素原，所述肽合成技术包括标准(溶液)方法、固相法、半合成法和新近的重组DNA法。例如，参见1996年5月7日授予Chance，R.E．等的美国专利第5，514，646号；1996年2月7日的EPO公告第383，472号；Brange，J.J.V.等，1987年3月18日EPO公告第214，826号；和1994年4月19日授予Belagaje，R.M.等的美国专利第5，304，473号，这些文献公开了各种胰岛素原和胰岛素类似物的制备。这些参考文献特此通过引用结合到本文中。
一般采用本领域已知的方法制备衍生化蛋白。以上列出的描述衍生化蛋白的出版物有合适的制备衍生化蛋白的方法。那些出版物中关于制备衍生化蛋白的方法通过引用结合到本文中。为了制备酰化蛋白，使所述蛋白与诸如活化脂肪酸的活化有机酸反应。活化脂肪酸为常用的酰化剂的衍生物，包括脂肪酸的活化酯、脂肪酰基卤、脂肪酸的活化酰胺，诸如活化azolide衍生物[Hansen，L.B.，WIPO公告第98/02460号，1998年1月22日]和脂肪酸酐。脂肪酸的活化酯、尤其是N-羟基琥珀酰亚胺酯的使用是特别有利的用脂肪酸酰化游离氨基酸的方法。Lapidot等描述了N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备及其在N-月桂酰基-甘氨酸、N-月桂酰基-L-丝氨酸和N-月桂酰基-L-谷氨酸制备中的用途。术语“活化脂肪酸酯”是指已经用本领域已知的一般技术活化的脂肪酸[Riordan，J.F.和Vallee，B.L.，Methods inEnzymology，XXV：494-499(1972)；Lapidot，Y.等，J.Lipid Res.8：142-145(1967)]。羟基苯并三唑(HOBT)、N-羟基琥珀酰亚胺和它们的衍生物特别熟知用来形成用于肽合成的活化酸。
为了选择性地酰化ε-氨基，在偶联期间可以用各种保护基封闭α-氨基。合适保护基的选择是本领域技术人员已知的，包括对甲氧基苯甲酸基羰基(pmZ)。最好是，在一步合成中酰化ε-氨基，而不用氨基保护基。Baker，J.C.等的美国专利第5，646，242号，1997年7月8日(特此通过引用结合到本文中)公开并要求保护了一种于Lys的Nε-氨基选择性酰化的方法。Baker，J.C.等的美国专利第5，700，904号，1997年12月23日(特此通过引用结合到本文中)公开并要求保护了一种制备酰化蛋白干粉的方法。
锌在本发明中的主要作用是促进形成所述蛋白和衍生化蛋白的锌(Ⅱ)六聚物，或者分别形成混合的六聚物，或一起形成杂化六聚物。锌促进胰岛素六聚物的形成和胰岛素类似物六聚物的形成。锌同样促进衍生化胰岛素和衍生化胰岛素类似物的六聚物的形成。通过在Zn(Ⅱ)离子的存在下使包含蛋白或衍生化蛋白或这两者的溶液的pH为中性区，或通过在将所述pH调至中性区后加入Zn(Ⅱ)，便利地实现六聚物的形成。
为了有效地产生本发明的微晶或无定形沉淀，本发明微晶和无定形沉淀中锌与总蛋白之摩尔比的下限为约0.33，即有效六聚化需要每个六聚物约2个锌原子。当不存在与胰岛素竞争结合锌的化合物时，微晶和无定形沉淀组合物会与存在的约2个至约4-6个锌原子相匹配地组合。如果存在与所述蛋白竞争锌结合的化合物，诸如含有柠檬酸盐或磷酸盐的化合物，则在此期间甚至可以使用更多的锌。为了更强地驱动六聚化，可能需要超出有效六聚化所需最小量的过量的锌。而且，在本发明制剂中可以存在超出最小量的过量的锌，可能需要所述过量的锌提高化学和物理稳定性，改进悬浮性能，并且可能进一步延长时间作用。因此，在本发明的不溶性组合物、方法和制剂中允许相当宽范围的锌∶蛋白之比。
按照本发明，所述制剂中锌的存在量为每摩尔总蛋白约0.3摩尔至约7摩尔，更优选每摩尔总蛋白约0.3摩尔至约1.0摩尔。再更高度优选的锌与衍生化蛋白之比为每摩尔总蛋白约0.3至约0.7摩尔锌原子。最高度优选的锌与总蛋白之比为每摩尔总蛋白约0.30至约0.55摩尔锌原子。对于与PZI制剂相似的较高的锌制剂，所述锌比例为每摩尔总蛋白约5至约7摩尔锌。
提供用于本发明的锌的锌化合物可以是任何药学上可接受的锌化合物。将锌加入胰岛素制剂中是本领域已知的，药学上可接受的锌源也是已知的。为本发明供应锌的优选的锌化合物包括氯化锌、乙酸锌、柠檬酸锌、氧化锌和硝酸锌。
本发明微晶和沉淀需要络合化合物。所述络合化合物的存在量必须足以引起所述六聚物的大致沉淀和结晶。通过简单的滴定实验，可以容易地确定特定络合化合物的特定制剂的这种量。理想的是，调节所述络合化合物的浓度，使得可忽略在完成沉淀或结晶后可溶相中残余的络合化合物。这需要根据实验确定的“低精蛋白锌”比率，混合所述络合化合物。预期该比率非常类似于NPH和NPL的比率。然而，它可以略有不同，因为衍生化可能影响蛋白-鱼精蛋白相互作用的性质。
当鱼精蛋白是络合化合物时，它在微晶中的存在量为每3.5mg总蛋白约0.15mg至约0.5mg。鱼精蛋白与总蛋白之比最好为约0.25至约0.40(mg/mg)。该比率更优选为约0.25至约0.38(mg/mg)。鱼精蛋白的存在量最好为每mg总蛋白0.05mg至约0.2mg，更优选为每mg总蛋白约0.05至约0.15mg鱼精蛋白。硫酸鱼精蛋白是用于本发明的优选的鱼精蛋白盐形式。当使用硫酸鱼精蛋白或鱼精蛋白的其它盐形式时，其使用的质量可能必须参考可以用于相同应用的鱼精蛋白游离碱的质量，用等于所述盐形式和鱼精蛋白的分子量之比的因子进行修正。
为了进一步延长本发明组合物的时间作用，或改进其悬浮性能，在结晶后可以加入额外的鱼精蛋白和锌。因此，本发明也包括鱼精蛋白高于低精蛋白锌比率的制剂。对于这些制剂，所述鱼精蛋白比率为每mg总蛋白0.25mg至约0.5mg鱼精蛋白。
本发明微晶和沉淀的一种所需组分为六聚物稳定化合物。在文献中已经表征了三种六聚物构象的结构，命名为T6、T3R3和R6。在诸如各种酚类化合物的六聚物稳定化合物存在下，使R6构象稳定。因此，在诸如苯酚或间甲酚等的六聚物稳定化合物存在下产生的微晶和沉淀中，六聚物非常可能为R6构象或为T3R3构象。范围广泛的六聚物稳定化合物是合适的。它们必须以相对于总蛋白的足够的比率存在，以稳定R6六聚物构象。为了达到这一点，有效的六聚物稳定化需要每摩尔六聚物至少2或至少3摩尔六聚物稳定化合物。最好是在本发明微晶和沉淀中存在每摩尔六聚物至少3摩尔六聚物稳定化合物。在制备微晶和沉淀的溶液中存在较高比率的六聚物稳定化合物，至少高达高25-50倍，将不会对六聚物稳定化有负面作用。
在本发明的制剂中，可以存在防腐剂，尤其是如果所述制剂在多个时间进行取样时。如上所述，范围广泛的合适防腐剂是已知的。所述防腐剂在溶液中的存在量最好适合提供足以满足药典要求的抗微生物效应。
优选的防腐剂是以上列举的酚类防腐剂。所述酚类防腐剂的优选浓度为每毫升水性悬浮制剂约2mg至约5mg。因为考虑到各种酚类防腐剂的混合物，所以这些浓度是指酚类防腐剂的总质量。合适的酚类防腐剂包括例如苯酚、间甲酚和对羟基苯甲酸甲酯。优选的酚类化合物为苯酚和间甲酚。也设想了诸如苯酚和间甲酚的酚类化合物的混合物，并且是高度优选的。酚类化合物混合物的实例是0.6mg/ml苯酚和1.6mg/ml间甲酚，以及0.7mg/ml苯酚和1.8mg/ml间甲酚。
本发明的微晶最好是包括蛋白、衍生化蛋白、二价阳离子并且包括络合化合物和六聚物稳定化合物的也称为“棒状”的椭圆形单晶。本发明微晶的平均长度的范围优选为1微米至40微米，更优选为3微米至15微米。
优选的组合物包含每35mg总蛋白约3mg至约6mg硫酸鱼精蛋白、和每35mg总蛋白约0.1至约0.4mg锌。另一种优选的组合物包含每35mg总蛋白约10mg至约17mg硫酸鱼精蛋白、和每35mg总蛋白约2.0至约2.5mg锌。另一种优选的组合物每ml包含硫酸鱼精蛋白0.34-0.38mg；锌，0.01-0.04mg；和总蛋白3.2-3.8mg。
本发明共晶体和无定形沉淀需要非衍生化蛋白和衍生化蛋白这两者。这些蛋白的质量之比决定了所述制剂时间的延长程度。所述蛋白与所述衍生化蛋白的优选摩尔数之比为约1∶100至约100∶1。所述蛋白与所述衍生化蛋白的进一步优选的摩尔数之比为约1∶1至约100∶1。所述蛋白与所述衍生化蛋白的另一优选的摩尔数之比为约1∶1至约20∶1。所述蛋白与所述衍生化蛋白的再一优选的摩尔数之比为约2∶1至约20∶1、约2∶1至10∶1、约2∶1至5∶1、约3∶1至5∶1、约1∶1至1∶20、约1∶1至1∶10、约1∶2至约1∶20、约1∶2至1∶10、约1∶2至1∶5、约1∶3至1∶5、约10∶1至约1∶10、约9∶1至约1∶9、约5∶1至约1∶5以及约3∶1至约1∶3。
本发明提供制备所述组合物的方法。此外，也设想了使用本发明的不溶性组合物制备用于控制血液葡萄糖以及用于治疗糖尿病或高血糖的药物。可以制备本发明的无定形沉淀和微晶用于药物中，或可以通过许多不同方法将本发明的无定形沉淀和微晶用于其它用途。
总之，合适的方法将一般按照以下其中一种顺序：溶解(如果用干物质开始)、六聚化、均化、络合、沉淀、结晶和可任选的配制；或溶解(如果用干物质开始)、均化、六聚化、络合、沉淀、结晶和任选的配制。
溶解是指将衍生化蛋白和蛋白充分溶解，以使其形成六聚物。六聚化是指其中蛋白和衍生化蛋白分子与锌(Ⅱ)原子结合形成六聚物的过程。络合是指在所述六聚物和鱼精蛋白之间形成不溶性络合物。沉淀通常由于形成不溶性络合物所致。结晶涉及沉淀的六聚物/鱼精蛋白络合物转化为晶体，通常为棒状晶体。
通过将所述衍生化蛋白和蛋白溶于水性溶剂中，进行溶解。所述水性溶剂可以是例如酸性溶液、中性溶液或碱性溶液。所述水性溶剂可以部分包含可混溶有机溶剂，诸如乙醇、乙腈、二甲基亚砜等。酸性溶液可以是例如HCl溶液，最好为约0.01N HCl至约1.0NHCl。也可以使用药学上可接受的的其它酸。碱性溶液可以是例如NaOH溶液，最好为约0.01N NaOH至约1.0N NaOH溶液或更高当量的溶液。也可以使用药学上可接受的其它碱。为了蛋白质的稳定性，酸或碱的浓度最好尽可能低，而同时仍有效地将所述蛋白和衍生化蛋白充分溶解。
可以于中性pH下将大多数蛋白(胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原)和许多衍生化蛋白溶解至合适浓度。于中性pH下溶解衍生化蛋白的溶液可以含有缓冲剂，可任选地含有诸如盐、酚类化合物、锌或等渗剂的一种或多种额外的溶质。
当六聚化发生在均化之前时，首先形成两种群体的均一的六聚物，然后将所述群体混合，由此形成混合六聚物。当首先发生均化时，六聚化产生杂化六聚物。如上所述，为制备含有杂化六聚物的不溶性络合物，在与二价金属阳离子一起六聚化之前，在适于解离为单体或二聚物聚集状态的条件下均化蛋白和衍生化蛋白。为了达到必需的解离，可以将所述蛋白和衍生化蛋白在强酸或强碱条件下混合。解离的程度以及因此均化由选择用于该步骤的溶液条件影响。胰岛素和相关蛋白容易在一系列，产生二聚物、六聚物和其它缔合形式的反应中自缔合。平衡下这些缔合形式的分布取决于许多参数，包括pH。通常认为这些缔合反应主要涉及单体-二聚物-六聚物装配。因此，根据所选择的溶液条件，均化应该完成单体、二聚物或它们的混合物的混合。例如在1N HCl中的均化与在0.1N HCl中的均化相比，可能含有较高部分的单体混合，而在0.1N HCl中的均化可能含有较多的二聚物混合。对于包含杂化六聚物的组合物的制备，只要在所用的均化条件下，仅存在非常少部分的或可忽略部分的所述蛋白或衍生化蛋白的均一六聚物，那么所述均化过程将是有效的。包含混合六聚物的组合物主要掺入两种类型的六聚物，即所述蛋白六聚物和所述衍生化蛋白六聚物。在这种情况下，均化步骤发生在六聚化步骤之后，在与所述络合化合物络合之前达到所述六聚物的均化。因此，均化步骤在稳定锌(Ⅱ)-胰岛素六聚物的溶液条件下进行。文献中稳定胰岛素六聚物的溶液条件是众所周知的。
六聚化所需的溶液条件是允许在溶液中形成所述杂化六聚物或混合六聚物的条件。这些条件与使胰岛素或胰岛素类似物六聚化的条件相同或非常相似。通常，六聚化需要锌和中性至微碱性pH，从约pH6.8至约pH8.4。六聚物稳定化合物的存在通过促进所述衍生化蛋白、在某些情况下为所述蛋白的R6或T3R3构象，有利地影响六聚化。对于某些单体胰岛素类似物，需要一种六聚物稳定化合物来形成六聚物。
对于包含杂化六聚物的组合物，预期有7种六聚物种类：P6、P5D1、P4D2、P3D3、P2D4、P1D5和D6，其中P代表所述蛋白单体，而D代表所述衍生化蛋白单体。预期六聚物的统计学分布符合泊松(Poisson)分布，并且将受蛋白和衍生化蛋白的相对比例以及在六聚化之前解离程度的影响。例如，预期四种主要的杂化六聚物种类来自主要由二聚物构成的均化溶液：P6、P4D2、P2D4和D6。对于包含混合六聚物的组合物，预期仅以两种六聚物种类为主：P6和D6。
络合步骤必须涉及将络合化合物与六聚物在每种物质初始可溶的溶液条件下混合。通过将六聚物或鱼精蛋白的分别的溶液混合，或通过首先于酸性或碱性pH下形成蛋白、衍生化蛋白和鱼精蛋白的溶液，然后将pH变为中性区，可以完成这一点。
在结晶期间，所述溶液条件必须稳定结晶种类，并促进沉淀向溶质向晶体的转化。因此，所述溶液条件将决定结晶的速率和结果。结晶可能涉及与非晶态沉淀、溶解的六聚物-鱼精蛋白络合物和晶体有关的络合物平衡。为了获得微晶，选择的用于结晶的条件必须朝着形成晶体的方向推动平衡。此外，根据假定的平衡，预期衍生化蛋白的溶解性显著影响结晶速率和大小，因为较低的溶解性将可能减慢从沉淀向溶液向结晶的净转化。此外，普遍认为，减慢结晶速率通常产生较大的晶体。因此，结晶速率和晶体大小被认为取决于衍生化蛋白衍生部分的大小和性质。
影响结晶速率和本发明晶体大小的结晶参数是：酰基的大小和性质；温度；与所述蛋白和所述衍生化蛋白竞争锌的化合物(诸如柠檬酸盐、硫酸盐等)的存在和浓度；酚类化合物的性质和浓度；锌的浓度；可混溶有机溶剂的存在和浓度；允许结晶的时间；pH和离子强度；缓冲剂身份和浓度；沉淀物的浓度；种子物质的存在；容器的形状和材料；搅拌速率；和总蛋白浓度。温度和竞争化合物的浓度被认为是特别重要。
诸如柠檬酸盐的竞争化合物可能影响晶体形成的速率，并间接影响晶体的大小和质量。这些化合物可以通过与溶液中的锌形成配位配合物、由此与所述六聚物表面上相对弱的锌结合位点竞争锌，而发挥其作用。这些弱的表面结合位点的占用可能阻碍结晶。另外，许多衍生化蛋白在每摩尔衍生化蛋白存在的锌几乎等于0.333的情况下是部分不溶性的，而竞争化合物的存在恢复溶解性，并允许结晶。对于蛋白和衍生化蛋白的任何组合而言，竞争化合物的最适浓度可以采用常规技术来确定。当然，上限为所述竞争化合物沉淀锌的浓度，或诸如当竞争化合物在给药部位引起疼痛和刺激时，为药学上不可接受的残留竞争化合物浓度。
制备本发明沉淀和晶体的方法的一个实例如下。将测定量的所述衍生化蛋白和测定量的所述蛋白溶于或混合形成在含六聚物稳定化合物(诸如酚类化合物)的水性溶剂的溶液中。向该溶液加入一种可溶性锌盐(例如Zn(Ⅱ)Cl2)的溶液，以提供每摩尔衍生化胰岛素约0.3摩尔锌至约0.7摩尔锌，或高至每摩尔总蛋白(蛋白+衍生化蛋白)1.0摩尔锌。将无水乙醇或另一种可混溶有机溶剂可任选地加入该溶液中，其加入量使得溶液含约5％至约10％(体积)有机溶剂。然后将该溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。通过将测定量的鱼精蛋白溶于水性溶剂中，制备鱼精蛋白溶液。使该溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。将蛋白和衍生化蛋白溶液与鱼精蛋白溶液混合，随后立即形成沉淀。于室温下(通常约20-25℃)缓慢搅拌所得的悬浮液，随后在约4小时至约10天的时间内形成微晶。
然后，可以从母液分离微晶，将其引入不同的溶剂中，用于贮存和给予患者。合适的水性溶剂的实例如下：注射用水，含有25mMTRIS、5mg/ml苯酚和16mg/ml甘油；注射用水，含有2mg/ml磷酸氢二钠、1.6mg/ml间甲酚、0.65mg/ml苯酚和16mg/ml甘油；和注射用水，含25mM TRIS、5mg/ml苯酚、0.1M柠檬酸三钠和16mg/ml甘油。
在制备本发明不溶性组合物的另一方法中，例如，将测定质量的干衍生化蛋白和测定质量的干蛋白一起溶于酸性水性溶剂诸如0.1N-1.0N HCl中。搅拌该溶液以确保衍生化蛋白和蛋白充分混合。预先限定该混合物中衍生化蛋白粉和蛋白粉的比率，以达到在所产生的不溶性组合物中相似的衍生化蛋白与蛋白之比。将分别制备的包含酚类防腐剂和任选的药学上可接受的缓冲剂的水溶液与所述蛋白的酸性溶液混合。然后将所得溶液的pH调至约6.8至约8.4，最好为约6.8至约8.0，或最好为pH约7.2至约7.8，最优选为约7.4至约7.8。向该溶液中加入一种可溶性锌盐例如Zn(Ⅱ)Cl2溶液，以提供每摩尔总胰岛素约0.3摩尔锌至每摩尔总胰岛素约4摩尔锌。将该溶液调至如上给定的pH，最好为约7.4-7.6，然后可以通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。通过将测定质量的鱼精蛋白溶于所述水性溶剂中制备鱼精蛋白溶液。可以使所述鱼精蛋白溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。将蛋白和衍生化蛋白的溶液与鱼精蛋白溶液混合，随后立即形成沉淀。于室温下(通常约20-25℃)缓慢搅拌所得的悬浮液，随后在约4小时至约10天的时间内形成微晶。
在制备本发明不溶性组合物的另一方法中，首先将测定量的衍生化蛋白溶于含有酚类防腐剂的水性溶剂中。向该溶液中加入一种可溶性锌盐例如Zn(Ⅱ)Cl2溶液，以提供每摩尔衍生化蛋白约0.3摩尔锌至每摩尔衍生化蛋白约4摩尔锌。然后将该溶液的pH调至约6.8至约8.4，最好为约6.8至约8.0，或最好为pH约7.2至约7.8，最优选为约7.4至约7.8。单独制备第二种溶液，其中将测定量的选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原的蛋白溶于含酚类防腐剂的水性溶剂中。向该溶液中加入一种可溶性锌盐例如Zn(Ⅱ)Cl2溶液，以提供每摩尔蛋白约0.3摩尔锌至每摩尔蛋白约4摩尔锌。将所得溶液的pH调至约6.8至约8.4，最好为约6.8至约8.0，或最好为pH约7.2至约7.8，最优选为约7.4至约7.8，或7.4至约7.6。将所述衍生化蛋白溶液部分和所述蛋白溶液部分混合，预先限定其混合比率以达到所述不溶性组合物中的相似的衍生化蛋白与蛋白之比。搅拌该溶液以确保衍生化蛋白和蛋白充分混合。然后将该溶液的pH调至约7.6，然后可以通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。通过将测定量的鱼精蛋白溶于水性溶剂中单独制备鱼精蛋白溶液。可以使所述鱼精蛋白溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。将蛋白和衍生化蛋白的溶液与鱼精蛋白溶液混合，随后立即形成沉淀。于室温下(通常约20-25℃)缓慢搅拌所得的悬浮液，随后在约4小时至约10天的时间内形成微晶。
尽管没有描述所有的非常多类型的以任何方式产生本发明不溶性组合物的方法，但以下是本发明的其它方法：
将蛋白、衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于pH不允许形成六聚物的水性溶剂中，将pH调至约6.8至约7.8，并加入络合化合物；
将蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于pH允许形成六聚物的水性溶剂中，单独地将衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于pH允许形成六聚物的水性溶剂中，将这两种溶液充分混合，然后加入络合化合物；
将蛋白、六聚物稳定化合物、二价金属阳离子和络合化合物溶于水性溶剂中，其中所得溶液的pH为不发生沉淀的pH，单独地将衍生化蛋白、六聚物稳定化合物、二价金属阳离子和络合化合物溶于水性溶剂中，其中所得溶液的pH为不发生沉淀的pH，将这两种溶液充分混合，并将该溶液的pH调至发生沉淀的pH值；
将蛋白、衍生化蛋白、六聚物稳定化合物、二价金属阳离子和络合化合物溶于水性溶剂中，其中所得溶液的pH为不发生沉淀的pH，并将该溶液的pH调至发生沉淀的pH值；
将蛋白、衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，其中所得溶液的pH为当加入络合剂时不发生沉淀的pH，加入络合化合物，并将步骤b)的溶液的pH调至发生沉淀的pH值；
将蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，其中所得溶液的pH为加入络合化合物时不发生沉淀的pH，单独地将衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，其中所得溶液的pH为加入络合化合物时不发生沉淀的pH，将这两种溶液充分混合，将络合化合物加入该溶液中，并将pH调至发生沉淀的pH值；
将蛋白、蛋白衍生物、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，其中所得溶液的pH为加入络合化合物时不发生沉淀的pH，将pH调至加入络合化合物时发生沉淀的pH，并将络合化合物加入该溶液中；
将蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，其中所得溶液的pH为加入络合化合物时不发生沉淀的pH，单独地将衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，其中所得溶液的pH为加入络合化合物时不发生沉淀的pH，将这两种溶液充分混合，将步骤c)的溶液的pH调至加入络合化合物时发生沉淀的pH值，并将络合化合物加入该溶液中；
在一个优选实施方案中，以避免需要从母液分离所述微晶的方式制备所述微晶。因此最好是母液本身适合于给予所述患者，或可以通过用合适的稀释剂稀释将母液制备成适合于给予的形式。应该理解，术语稀释剂是指包含溶解各种药学上可接受的赋形剂的水性溶剂的溶液，包括但不限于缓冲剂、等渗剂、锌、防腐剂、鱼精蛋白等。
除所述蛋白，所述衍生化蛋白、二价阳离子、络合化合物和六聚物稳定化合物外，按照本发明的适用于胃肠外给药的药用组合物可以使用另外的赋形剂和溶媒，诸如水可混溶有机溶剂，诸如甘油、芝麻油、水性丙二醇等。这类试剂当存在时，根据最后的制剂，通常的用量为低于约2.0％(重量)。关于采用胃肠外制品的常规赋形剂或溶媒的多种技术的进一步信息，请参见Remington’s PharmaceuticalSciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，PA，USA(1985)，通过引用结合到本文中。
在本发明的广泛实践中，也设想制剂可以含有微晶和蛋白(选自胰岛素、衍生化胰岛素、胰岛素类似物和衍生化胰岛素类似物)可溶性部分的混合物。这类药用组合物的实例包括无菌、等渗的胰岛素、胰岛素类似物、衍生化胰岛素或衍生化胰岛素类似物的、用药学上可接受的缓冲剂缓冲且无热原的盐水溶液。可溶相优选胰岛素或速效胰岛素类似物，诸如LysB28，ProB29-人胰岛素或AspB28-人胰岛素。这种混合物设计用来提供葡萄糖水平进食时控制(由可溶性胰岛素提供)和葡萄糖水平基础控制(由不溶性胰岛素提供)的组合。不溶相中总蛋白(蛋白+衍生化蛋白)与可溶相中总蛋白之比的范围为约9∶1至约1∶9。该比率的优选范围为约9∶1至约1∶1，更优选为约7∶3。其它比率为1∶1和3∶7。
以下制备和实施例说明并解释本发明。本发明的范围不限于这些制备和实施例。关于固体的“份数”是指重量份。关于液体的“份数”是指体积份。用于表示浓度时，百分比是指每体积的质量(x100)。所有温度均为摄氏度(℃)。“TRIS”是指2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇。通过用水将1.00ml 10，000ppm锌原子吸收标准溶液[RiccaChemical Company，锌的稀硝酸溶液]稀释至终体积10.00ml，制备1000份/106(ppm)锌溶液。
在下述的许多制备中，估计沉淀和晶体的得率。估计的得率依赖于所述沉淀或晶体中总蛋白量的测定、以及溶液中最初的总蛋白量的估计。为了测定总蛋白的量，通过反相梯度HPLC如下所述，分析再溶解的沉淀或晶体的样品以及沉淀或晶体上的上清液的样品。
简而言之，所述分析系统依赖于23℃下的C8反相柱。流速为1.0ml/min，使用214nm下的UV检测。溶剂A为0.1％(体积∶体积)三氟乙酸的10∶90(体积∶体积)乙腈∶水溶液。溶剂B为0.1％(体积∶体积)三氟乙酸的90∶10(体积∶体积)乙腈∶水溶液。展开程序为(分钟，％B)：(0.1，0)；(45.1，75)；(50．1，100)；(55，100)；(57，0)；(72，0)。所有变化均为线性变化。技术人员可以设计其它分析系统，以达到同一目标。
为了准备HPLC分析，通过用或者0.01N HCl或0.03N HCl稀释，溶解等份的充分混合的悬浮液。这些溶液的HPLC分析结果使得可以计算总蛋白。将等份的悬浮液在Eppendorf 5415C微量离心机中以14，000rpm离心约5分钟。倾出的上清液用或者0.01N或0.1NHCl稀释，并经HPLC分析。通过在Dulbecco磷酸缓冲盐水(无钙或镁)中再悬浮并且经离心再沉淀，洗涤所述沉淀。弃去缓冲液，将固体再溶于0.01N HCl中。经HPLC分析再溶解的沉淀。
HPLC用来证实酸化悬浮液、再溶解沉淀和上清液中预期蛋白的存在，也用来测定蛋白浓度。将再溶解沉淀的层析中峰的保留时间与观察到的鱼精蛋白的保留时间进行比较，并用所述活性化合物制备所述制剂。保留时间之间的一致性总是很好的，表明鱼精蛋白、蛋白和衍生化蛋白实际上掺入微晶中。通过将合适的峰面积与标准面积相比，确定蛋白和衍生化蛋白的浓度。将0.22mg/ml衍生化胰岛素溶液用作标准。将含鱼精蛋白的标准进行层析，但仅用来测定保留时间。未对鱼精蛋白浓度进行定量。
在下述的许多制备中，标准分光计测定用来测定于室温下晶体多快溶于Dulbecco磷酸缓冲盐水(pH7.4)中。要注意，下面紧接描述的步骤与制备说明中的适当之处明显不一致。适用于在紫外范围内测量并配有1cm比色杯和比色杯磁力搅棒的分光计用于所有的溶解测定。将含有小搅棒和3.00ml磷酸缓冲盐水(PBS)的比色杯置于分光计的测量池间格中。将仪器设定至320nm，并对同一缓冲液调零。然后，将通常总浓度约等于U50制剂或约1.6-1.8mg/ml的4.0微升充分悬浮的制剂加至比色杯。等待1.0分钟以进行混合后，记录320nm的光密度。由于涉及该过程的蛋白于320nm无光吸收，因此光密度的降低是由于当晶体溶解时散射的光减少。通常记录光密度降至其初始值一半的时间(t1/2)。作为对照，将2.0微升U100Humulin_N(即人胰岛素NPH，也称为人NPH胰岛素)加至3.00ml PBS缓冲液中，如上监测320nm的光密度。Humulin_N制剂的溶解半时间(t1/2)约为6分钟。
                      制备1
人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的9∶1共晶体
将B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素干粉(0.7质量份)和人胰岛素干粉(6.3质量份)溶于1000体积份水性溶剂中，所述溶剂由50mMTRIS、0.1M柠檬酸三钠和10mg/ml苯酚组成，pH7.6。向该溶液中加入75份15.3mM氯化锌溶液。用1N HCl和/或1N NaOH将pH调至7.6。将该溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。通过将7质量份硫酸鱼精蛋白溶于10，000体积份水中，然后通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤，制备鱼精蛋白溶液。将等体积的含胰岛素和酰化胰岛素的溶液和硫酸鱼精蛋白溶液混合。最初形成无定形沉淀。让该悬浮液于室温(通常为约22℃)下静置约24小时。无定形沉淀转化为共结晶微晶固体。
                    制备2
人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的3∶1共晶体
按照制备1的方法，只是使用1.75质量份B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素干粉和5.25质量份人胰岛素干粉。将等体积的含胰岛素和酰化胰岛素的溶液和硫酸鱼精蛋白溶液混合后，形成无定形沉淀。让该悬浮液于室温(通常为约22℃)下静置约24小时。无定形沉淀转化为共结晶微晶固体。
                     制备3
人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的3∶1共晶体制剂
从上清液中分离出用制备1的方法制备的共结晶微晶，通过常规的固体/液体分离法诸如过滤、离心或倾析将其回收。然后将回收的共结晶微晶悬浮于由25mM TRIS、5mg/ml苯酚和16mg/ml甘油组成的pH7.8的溶液中，使得胰岛素活性的终浓度为约100U/ml。
                     制备4
人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的1∶1共晶体
按照制备1的方法，只是使用3.5质量份B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素干粉和3.5质量份人胰岛素干粉。将等体积的含胰岛素和酰化胰岛素的溶液和硫酸鱼精蛋白溶液混合后，形成无定形沉淀。让该悬浮液于室温(通常为约22℃)下静置约24小时。无定形沉淀转化为共结晶微晶固体。
                    制备5
人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的1∶3共晶体
按照制备1的方法，只是使用5.25质量份B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素干粉和1.75质量份人胰岛素干粉。将等体积的含胰岛素和酰化胰岛素的溶液和硫酸鱼精蛋白溶液混合后，形成无定形沉淀。让该悬浮液于室温(通常为约22℃)下静置约24小时。无定形沉淀转化为共结晶微晶固体。
                    制备6
人胰岛素和B29-Nε-己酰基-人胰岛素的3∶1共晶体
按照制备1的方法，只是使用1.75质量份B29-Nε-己酰基-LysB29人胰岛素干粉和5.25质量份人胰岛素干粉。将等体积的含胰岛素和酰化胰岛素的溶液和硫酸鱼精蛋白溶液混合后，形成无定形沉淀。让该悬浮液于室温(通常为约22℃)下静置约24小时。无定形沉淀转化为共结晶微晶固体。
                    制备7
人胰岛素和B29-Nε-丁酰基-人胰岛素的3∶1共晶体
按照制备l的方法，只是使用1.75质量份B29-Nε-丁酰基-LysB29人胰岛素干粉和5.25质量份人胰岛素干粉。将等体积的含胰岛素和酰化胰岛素的溶液和硫酸鱼精蛋白溶液混合后，形成无定形沉淀。让该悬浮液于室温(通常为约22℃)下静置约24小时。无定形沉淀转化为共结晶微晶固体。
                      制备8
鱼精蛋白-锌-B29-Nε-辛酰基-人胰岛素-人胰岛素的共结晶微晶
将B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素(20.1mg)溶于1ml包含0.1NHCl的溶剂中。将人胰岛素(19.3mg)溶于1ml包含0.1N HCl的溶剂中。通过混合以以下所示比率的体积的每种溶液，制备包含不同B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素与胰岛素之比的5种溶液。表3.用于制备沉淀和微晶的人胰岛素溶液的体积和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素溶液的体积
       体积(μl)               人胰岛素与酰化人胰岛素之比
   1∶0     3∶1     1；1     1∶3     0∶1
 人胰岛素溶液    400     300     200     100       0
 B29-Nε-辛酰基-人胰岛素溶液      0     100     200     300     400
向这5种溶液中的每种溶液中，加入由50mM TRIS缓冲液、0.1M柠檬酸三钠和10mg/ml苯酚组成的pH7.6溶剂。向这5种溶液中的每种溶液中加入0.15ml 15.3mM氯化锌溶液。用1N NaOH将所得的5种溶液中的每种溶液的pH调至7.6。使所得的5种溶液中的每种溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。将3.50mg硫酸鱼精蛋白溶于10ml水中，然后通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤，制备另一种溶液。分别将1.9ml体积的这5种溶液中的每种溶液和1.9ml的所述硫酸鱼精蛋白溶液混合，在所述5种溶液中的每种溶液中导致立即出现无定形沉淀。让这5种溶液于室温(通常为约22℃)下静置24小时。该步骤导致在所述5种溶液中的每种溶液中形成白色至灰白色微晶固体。
                    制备9
人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的9∶1共晶体
将B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素干粉(0.7质量份)溶于100体积份水性溶剂中，所述溶剂由50mM TRIS、0.1M柠檬酸三钠和10mg/ml苯酚组成，pH7.6。向该溶液中加入7.5份15.3mM氯化锌溶液。制备第二种溶液，其中将人胰岛素干粉(6.3质量份)溶于900体积份水性溶剂中，所述溶剂由50mM TRIS、0.1M柠檬酸三钠和10mg/ml苯酚组成，pH7.6。向该溶液中加入67.5份15.3mM氯化锌溶液。将酰化胰岛素溶液和胰岛素溶液混合在一起，将其搅拌以确保混合这两种溶液。将该溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。通过将7质量份硫酸鱼精蛋白溶于10，000体积份水中，然后通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤，制备鱼精蛋白溶液。将等体积的酰化胰岛素溶液和硫酸鱼精蛋白溶液混合。形成无定形沉淀。让该悬浮液于室温(通常为约22℃)下静置约24小时。无定形沉淀转化为共结晶微晶固体。
                    制备10
人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的3∶1共晶体
将B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素干粉(1.75质量份)溶于250体积份水性溶剂中，所述溶剂由50mM TRIS、0.1M柠檬酸三钠和10mg/ml苯酚组成，pH7.6。向该溶液中加入18.75份15.3mM氯化锌溶液。制备第二种溶液，其中将人胰岛素干粉(5.25质量份)溶于750体积份水性溶剂中，所述溶剂由50mM TRIS、0.1M柠檬酸三钠和10mg/ml苯酚组成，pH7.6。向该溶液中加入56.25份15.3mM氯化锌溶液。将酰化胰岛素溶液和胰岛素溶液混合在一起，将其搅拌以确保混合这两种溶液。将该溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。通过将7质量份硫酸鱼精蛋白溶于10，000体积份水中，然后通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤，制备鱼精蛋白溶液。将等体积的酰化胰岛素溶液和硫酸鱼精蛋白溶液混合。形成无定形沉淀。让该悬浮液于室温(通常为约22℃)下静置约24小时。无定形沉淀转化为共结晶微晶固体。
                    制备11
人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的1∶1共晶体
将B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素干粉(3.5质量份)溶于500体积份水性溶剂中，所述溶剂由50mM TRIS、0.1M柠檬酸三钠和10mg/ml苯酚组成，pH7.6。向该溶液中加入1.75份15.3mM氯化锌溶液。制备第二种溶液，其中将人胰岛素干粉(3.5质量份)溶于500体积份水性溶剂中，所述溶剂由50mM TRIS、0.1M柠檬酸三钠和10mg/ml苯酚组成，pH7.6。向该溶液中加入37.5份15.3mM氯化锌溶液。将酰化胰岛素溶液和胰岛素溶液混合在一起，将其搅拌以确保混合这两种溶液。将该溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。通过将7质量份硫酸鱼精蛋白溶于10，000体积份水中，然后通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤，制备鱼精蛋白溶液。将等体积的酰化胰岛素溶液和硫酸鱼精蛋白溶液混合。形成无定形沉淀。让该悬浮液于室温(通常为约22℃)下静置约24小时。无定形沉淀转化为共结晶微晶固体。
                    制备12
人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的1∶3共晶体
将B29-Nε-辛酰基-LysB29人胰岛素干粉(5.25质量份)溶于750体积份水性溶剂中，所述溶剂由50mM TRIS、0.1M柠檬酸三钠和10mg/ml苯酚组成，pH7.6。向该溶液中加入56.25份15.3mM氯化锌溶液。制备第二种溶液，其中将人胰岛素干粉(1.75质量份)溶于250体积份水性溶剂中，所述溶剂由50mM TRIS、0.1M柠檬酸三钠和10mg/ml苯酚组成，pH7.6。向该溶液中加入18.75份15.3mM氯化锌溶液。将酰化胰岛素溶液和胰岛素溶液混合在一起，将其搅拌以确保混合这两种溶液。将该溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。通过将7质量份硫酸鱼精蛋白溶于10，000体积份水中，然后通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤，制备鱼精蛋白溶液。将等体积的酰化胰岛素溶液和硫酸鱼精蛋白溶液混合。形成无定形沉淀。让该悬浮液于室温(通常为约22℃)下静置约24小时。无定形沉淀转化为共结晶微晶固体。
                    制备13
人胰岛素和B29-Nε-己酰基-人胰岛素的共晶体
将12.3mg B29-Nε-己酰基-人胰岛素溶于0.3ml 0.1N HCl中，制备B29-Nε-己酰基-人胰岛素的酸性溶液。将4.6mg人胰岛素(锌晶体)溶于0.1ml 0.1N HCl中制备人胰岛素的酸性溶液。将这两种溶液混合，得到0.4ml的总体积。将这种所得溶液搅拌约5分钟。向这种所得溶液中于搅拌下加入0.150ml 1000 ppm锌(Ⅱ)溶液。制备包含32mg/ml甘油、50mM tris缓冲液、10mg/ml苯酚、100mM柠檬酸三钠的pH7.6的结晶稀释剂。向胰岛素溶液中加入1.6ml所述结晶稀释剂。用1N NaOH和1N HCl将该溶液的pH调至7.59。使该溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。将7.47mg硫酸鱼精蛋白溶于10ml水中，制备鱼精蛋白溶液。将2ml鱼精蛋白溶液加入2ml胰岛素溶液中。让所得的溶液于25℃的控制温度下原状静置18小时。
显微镜检查(于18小时)表明已经发生结晶，并且所述制剂产生均一的、棒状单晶，其平均长度约为3微米。
让上述18小时后产生的4毫升(4ml)晶体制剂静置过夜，晶体完全沉降。然后除去上清液，用4ml包含16mg/ml甘油、20mM tris缓冲液、1.6mg/ml间甲酚、0.65mg/ml苯酚、40mM柠檬酸三钠的pH7.6稀释剂取代。然后重悬浮所述晶体，并让其再次沉降。进行该步骤3次，只是在第三次时，仅用3ml稀释剂取代上清液。
通过将0.005ml均一悬浮的制剂置于22℃下1cm光程长的正方形石英比色杯中的3ml Dulbecco磷酸缓冲盐水(无钙或镁)中，测定晶体的溶解速率。用比色杯磁力搅棒以恒定的速率搅拌该溶液。以1分钟的间隔读取320nm下的吸光度测量值。于320nm的吸光度对应于由水性悬浮液中存在的不溶性颗粒散射的光。因此，当微晶溶解时，吸光度接近零。0.005ml该制剂溶解所需的时间大于150分钟。0.005ml U100市售Humulin N样品经受相同条件时溶解所需的时间约为10分钟。
经HPLC分析该制剂中总蛋白的量，以对总效力进行定量。总效力是指人胰岛素和B29-Nε-己酰基-人胰岛素的总浓度。将1等份(0.050ml)完全悬浮的制剂溶于0.950ml 0.01N HCl中，如下所述经HPLC分析。经该分析测定的总效力为4.54mg/ml。
对于HPLC分析，使用以下条件：C8-反相柱；恒定23℃；1.0ml/min，于214nm测定；溶剂A=10％乙腈(体积/体积)的0.1％三氟乙酸水溶液；溶剂B=90％乙腈(体积/体积)的0.1％三氟乙酸水溶液；线性梯度(0.1min，0％B；45.1min，75％B；50.1min，100％B；55min，100％B；57min，0％B；72min，0％B)。通过将标准(bulk)胰岛素和标准酰基胰岛素溶于0.01N HCl中制备标准品。通过UV分光光度法测量每种标准品的浓度。假定1.0mg/ml人胰岛素溶液在1cm比色杯中于最大波长(约276nm)的吸光度为1.05光密度单位。这相当于6098的摩尔消光系数。假定酰化胰岛素的摩尔消光系数与人胰岛素的摩尔消光系数相同。然后将通过UV校正的溶液稀释得到0.220、0.147、0.073和0.022mg/ml的标准品。将标准品在HPLC上层析，获得面积对浓度的标准曲线。
分析上清液，以测定该制剂中存在的可溶性人胰岛素和B29-Nε-己酰基-人胰岛素的总浓度。向0.040ml上清液中加入0.160ml 0.01NHCl。如上所述经HPLC分析酸化的上清液。上清液中可溶性人胰岛素和B29-Nε-己酰基-人胰岛素的浓度测定为0.07mg／ml。
通过用台式离心机沉降一等份(0.100ml)该制剂，倾去上清液，将晶体再悬浮于0.400ml Dulbecco磷酸缓冲盐水中，再离心，去除上清液，最后将晶体溶于1.50ml 0.01N HCl中，测定晶体中B29-Nε-癸酰基-人胰岛素与人胰岛素之比。进行上述的HPLC分析。该分析的结果为84.2％B29-Nε-癸酰基-人胰岛素和15.8％人胰岛素。
                      制备14
包含人胰岛素和B29-Nε-癸酰基-人胰岛素的共晶体悬浮制剂
将10.4mg B29-Nε-癸酰基-人胰岛素溶于0.25ml 0.1N HCl中，制备B29-Nε-癸酰基-人胰岛素的酸性溶液。将30.3mg人胰岛素(锌晶体)溶于0.75ml 0.1N HCl中制备人胰岛素的酸性溶液。将这两种溶液混合，得到1ml的总体积。将这种所得溶液搅拌约5分钟。向这种所得溶液中于搅拌下加入0.305ml 1000 ppm锌(Ⅱ)溶液。向这种所得溶液中加入4ml结晶稀释剂(40mg/ml甘油、50mM tris缓冲液、4mg/ml间甲酚、1.625mg/ml苯酚、100mM柠檬酸三钠，pH7.4)。将该溶液的pH调至7.58。使该溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。将5ml鱼精蛋白溶液(将37.6mg硫酸鱼精蛋白溶于50ml水中)加入5ml过滤的溶液中。让所得的溶液于25℃的控制温度下原状静置63小时。
显微镜检查(于63小时)表明已经发生结晶，并且所述制剂产生均一的棒状单晶，其平均长度约为8微米。
通过将0.006ml均一悬浮的晶体制剂置于22℃下1cm光程长的正方形石英比色杯中的3ml Dulbecco磷酸缓冲盐水(无钙或镁)中，测定晶体的溶解速率。0.006ml该晶体制剂溶解所需的时间大于300分钟。0.005ml U100市售Humulin N样品在相同条件下溶解所需的时间约为10分钟。
为了准备HPLC分析，让该制剂原状静置使晶体沉降。然后取出8毫升(8ml)上清液，用8ml稀释剂[16mg/ml甘油、20mM tris缓冲液、1.6mg/ml间甲酚、0.65mg/ml苯酚、40mM柠檬酸三钠，pH7.6]取代。然后再悬浮共晶体。以同样方式进行3次该步骤，只是在第三次时，用7ml稀释剂取代8ml上清液。
基本上按制备13所述，经HPLC分析晶体制剂的效力和上清液中的效力。由该分析测定的总效力为3.87mg/ml。上清液中可溶性人胰岛素和B29-Nε-癸酰基-人胰岛素的浓度测定为0.06mg/ml。用制备13的方法测定的晶体相中的人胰岛素和B29-Nε-癸酰基-人胰岛素的比例为74.3％人胰岛素和25.7％B29-Nε-癸酰基-人胰岛素。
用粒度测定仪(Multisizer IIE型，Coulter Corp.，Miami，FL 33116-9015)，对该制剂样品进行粒度测定。为了进行该测定，将0.25 ml晶体制剂加入100ml包含14mM磷酸氢二钠，16mM甘油、1.6mg/ml间甲酚、0.65mg/ml苯酚的pH7.4的稀释剂中。该仪器筛管孔径(aperture tube orifice size)为50微米。收集50秒的粒度数据。该测定表明，晶体的平均颗粒直径约6微米，具有大致正常的分布，包括的粒度范围为约2微米至约9微米。该结果与用类似方法[DeFelippis，M.R.等，J.Pharmaceut.Sci.87：170-176(1998)]中测定的市售NPH的粒度分布相似。
                        制备15
包含人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的共晶体悬浮制剂
将30.3mg B29-Nε-辛酰基-人胰岛素溶于0.75ml 0.1N HCl中，制备B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的酸性溶液。将59.7mg人胰岛素(锌晶体)溶于1.5ml 0.1N HCl中制备人胰岛素的酸性溶液。将一等份(0.25ml)的人胰岛素溶液与0.75ml B29-Nε-辛酰基-人胰岛素溶液混合，得到1ml的总体积，将该溶液搅拌约5分钟。向该溶液中于搅拌下加入0.365ml 1000 ppm锌(Ⅱ)溶液。向该胰岛素加锌的溶液中加入4ml结晶稀释剂(40mg/ml甘油、35mM磷酸氢二钠缓冲液、4mg/ml间甲酚、1.625mg/ml苯酚、15mM柠檬酸三钠，pH7.4)。将这种所得溶液的pH调至7.60。使该溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。将5毫升(5ml)鱼精蛋白溶液(将37.9mg硫酸鱼精蛋白溶于50ml水中)加入5ml过滤胰岛素加锌的溶液中。让所得的溶液于25℃的控制温度下原状静置48小时。
显微镜检查(于48小时)表明已经发生结晶，并且所述制剂产生均一的棒状单晶，其平均长度约为5微米。
为了准备HPLC分析和溶解测试，让该制剂原状静置使晶体沉降。然后取出8毫升(8ml)上清液，用8ml稀释剂[16mg/ml甘油、14mM磷酸氢二钠缓冲液、1.6mg/ml间甲酚、0.65mg/ml苯酚、6mM柠檬酸三钠，pH7.6]取代。然后再悬浮晶体。以同样方式进行3次该步骤，只是在第三次时，用7ml稀释剂取代8ml上清液。
基本上按以上制备13所述测定溶解速率。0.005ml该制剂溶解所需的大致时间大于300分钟。0.005ml U100市售Humulin N样品在相同条件下溶解所需的时间约为10分钟。
经HPLC测定总效力和上清液中的效力。总效力为3.44mg/ml。该晶体制剂中可溶性人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的浓度测定为0.01mg/ml。用制备13的方法测定的晶体相中的人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的比例为25.5％人胰岛素和74.5％B29-Nε-辛酰基-人胰岛素。
按制备14中所述测定的晶体的平均颗粒直径约6微米，具有大致正常的分布，包括的粒度范围为约2微米至约12微米。该结果与DeFelippis，M.R.等(见上文)中报道的市售NPH的粒度分布相似。
                    制备16
        与胰岛素制剂比较的三种共晶体制剂
将24.18mg B29-Nε-辛酰基-人胰岛素溶于0.6ml 0.1N HCl中，制备B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的酸性溶液。将41.1mg人胰岛素(锌晶体)溶于1ml 0.1N HCl中制备人胰岛素的酸性溶液。通过如以下表4中所示，将不同体积的B29-Nε-辛酰基-人胰岛素溶液和人胰岛素溶液混合，制备四种0.4ml溶液。
表4.微晶制剂的制备
                  制剂
    D     C     B     A
 B29-Nε-辛酰基-人胰岛素溶液的公称质量百分率    75    50    25    0
 B29-Nε-辛酰基-人胰岛素溶液的加入体积(μl)    300    200    100    0
 人胰岛素溶液的加入体积(μl)    100    200    300    400
向0.4ml四种溶液中的每种溶液中加入0.15ml 1000ppm锌(Ⅱ)溶液。向0.55ml四种溶液中的每种溶液中加入1.6ml结晶稀释剂(50mMtris缓冲液、10mg/ml苯酚、100mM柠檬酸三钠，pH7.6)。用1NNaOH和0.1N HCl将四种溶液中的每种溶液的pH调至7.6。使每种溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。将2毫升(2ml)四种蛋白溶液中的每种溶液与2ml鱼精蛋白溶液(将7.34mg硫酸鱼精蛋白溶于10ml水中)混合。在每种情况下，均立即形成沉淀。让这四种4ml悬浮液于室温下(约22℃)原状静置16小时。
显微镜检查(于16小时)表明四种制剂中的每种都已经产生均一的棒状单晶，其平均长度约为10微米。
将每种4ml制剂转移至试管中，并在台式离心机中以3000rpm离心20分钟，以完全沉淀晶体。对于每种制剂，取出3ml上清液，用3ml稀释剂[25mM tris缓冲液、5mg/ml苯酚、16mg/ml甘油，pH7.4]取代。然后再悬浮晶体。以同样方式进行3次该步骤，只是在第三次时，对每种制剂均用2.5ml稀释剂取代3ml上清液。
基本上如上所述，经HPLC分析四种制剂中的每种制剂，以定量测定各个晶体制剂和组合物的总效力。总效力是指人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的总浓度。通过分析一等份均一悬浮的制剂，测定总效力和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的百分率。分析上清液以测定每种制剂中存在的可溶性人胰岛素和可溶性B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的总浓度。以下显示这些分析的结果。按制备13所述测定溶解时间。表5.微晶制剂的特征。
                       制剂
    D     C     B     A    NPH
 晶体中的B29-Nε-辛酰基-人胰岛素(％)   77.7  51.4  23.7     0   -
 晶体中的人胰岛素(％)   22.3  48.6   76.3   100   -
 总效力(mg/ml)   3.21  3.48   3.38   3.43   -
 上清液的效力(mg/ml)  ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01   -
 溶解时间(min)    300   120   50     20     10
                    制备17
               不溶性组合物的制备
以下概述用来制备本发明沉淀和微晶的另一方法。所述概述与以下表6中的数据一起阅读。
将测定质量的如本文所述制备的衍生化蛋白溶于0.6ml 0.1NHCl中。将测定质量的蛋白溶于0.2ml 0.1N HCl中(人胰岛素或LysB28，ProB29-人胰岛素类似物的锌晶体)。通过搅拌5-10分钟将这两种溶液充分混合在一起。将一定体积(0.32ml)的含1000ppm Zn(Ⅱ)的水溶液和一定体积(3.2ml)的稀释溶液(约50mM Tris试剂、约10mg/ml苯酚、约16mg/ml甘油和约29.5mg/ml柠檬酸三钠)加入所述两种蛋白的混合物中。用1N HCl或1N NaOH将所得溶液的pH调至约7.6(7.55-7.64)。将已调节pH的溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。向4ml滤液中加入4ml鱼精蛋白的水溶液(约37.3mg硫酸鱼精蛋白/100ml，范围为37.18-37.48)。加入鱼精蛋白溶液后立即形成沉淀。让制剂于25℃原状静置。如前所述进行溶解实验。在相同条件下胰岛素NPH在约6分钟内溶解。表6.不溶性组合物的制备。
     蛋白                 LysB(28)，ProB(29)-人胰岛素类似物
  蛋白质量(mg)    4.28   4.02     3.84     3.96     4.15
   衍生化蛋白                           B29-酰化人胰岛素
    衍生基团    丁酰基    戊酰基     己酰基     壬酰基     癸酰基
衍生化蛋白质量(mg)    11.90     12.1     12.08     12.13     12.20
    晶体形状     棒状    棒状     棒状     棒状     棒状
    得率(％)     ＞80     ＞90     ＞90     ＞90     ＞90
不溶相中的衍生化蛋白(％)     77.5     75.1     77     76.5     76.6
溶解时间(min)     23-24     31     54     67     37-38
    蛋白                                人胰岛素
  蛋白质量(mg)    12.09    12.18  12.12  12.21  12.27
   衍生化蛋白 B28-酰化-Lys(B28)，Pro(B29)-人胰岛素类似物        A1，B28-酰化-Lys(B28)，Pro(B29)-人胰岛素
    衍生基团    丁酰基    己酰基     辛酰基   二丁酰基    二已酰基
衍生化蛋白质量(mg)     4.39     4.21     4.28     4.11     4.23
    晶体形状     棒状     棒状     棒状     棒状     棒状
    得率(％)     ＞80     ＞90     ＞90     ＞90     ＞90
不溶相中的衍生化蛋白(％)     27.6     25     27     26.8     24.1
溶解时间(min)     16-17     10-11     27-28     10-11     20-21
    蛋白                      人胰岛素
蛋白质量(mg)   4.26  4.26   4.13   4.23   12.09
  衍生化蛋白                  B29-酰化人胰岛素
   衍生基团  丁酰基  戊酰基  己酰基  壬酰基  十四烷酰基
衍生化蛋白质量(mg)     12.39     12.39     12.03     12.06     4.16
    晶体形状     棒状     棒状     棒状      棒状     棒状
    得率(％)     ＞90     72     ＞90     ＞90     ＞90
  不溶相中的衍生化蛋白(％)     76.3     76.5     75     72.5     25.07
   溶解时间(min)     45-46     62-63     77-78     77-78     61
    蛋白       人胰岛素
  蛋白质量(mg)     12.19
    衍生化蛋白     B29-酰化人胰岛素
    衍生基团        十六烷酰基
衍生化蛋白质量(mg)        3.99
    晶体形状        棒状
    得率(％)        ＞90
不溶相中的衍生化蛋白(％)        24.7
溶解时间(min)        71-72
以下概述用来制备本发明沉淀和微晶的另一方法。所述概述与以下表7中的数据一起阅读。
将测定质量的如本文所述制备的衍生化蛋白溶于3.2ml稀释溶液(约50mM Tris试剂、约10mg/ml苯酚、约16mg/ml甘油和约29.5mg/ml柠檬酸三钠)中。将测定质量的蛋白溶于0.6ml 0.1N HCl中(人胰岛素或LysB28，ProB29-人胰岛素类似物的锌晶体)。通过搅拌5-10分钟将这两种溶液充分混合在一起。用1N HCl或1N NaOH将所得溶液的pH调至约7.6(7.55-7.64)。将已调节pH的溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。向一定体积的滤液中加入等体积的鱼精蛋白的水溶液(约37.3mg硫酸鱼精蛋白/100ml，范围为37.18-37.48)。加入鱼精蛋白溶液后立即形成沉淀。让制剂于25℃原状静置。如前所述进行溶解实验。在相同条件下，胰岛素NPH在约6分钟内溶解。
表7.不溶性组合物的制备
        蛋白                         人胰岛素
蛋白质量(mg)   12.19   11.87    12.15   12.28    12.22
    衍生化蛋白     A1，B29-二酰基-人胰岛素 A1，B29-二酰基-LysB28.ProB29人胰岛素 B29-酰基-AspB28人胰岛素类似物
    衍生基团  二辛酰基  二壬酰基   二癸酰基  二辛酰基    辛酰基
衍生化蛋白质量(mg)     4.29     4.07     4.06     4.29     3.98
    晶体形状     棒状     棒状     棒状     棒状     棒状
    得率(％)     ＞90     ＞90     ＞90     ＞9     ＞90
不溶相中的衍生化蛋白(％)     25.2     24.6     26.6     27.4     24.4
溶解时间(min)     73-74     25     31-32     47-48     43-44
以下概述用来制备本发明沉淀和微晶的另一方法。所述概述与以下表8中的数据一起阅读。
将测定质量的如本文所述制备的衍生化蛋白溶于测定体积的0.1N HCl中。将测定质量的蛋白溶于测定体积的0.1N HCl中(人胰岛素或LysB28，ProB29-人胰岛素类似物的锌晶体)。通过搅拌5-10分钟将每种测定体积的这两种溶液充分混合在一起。将测定体积的含1000ppm Zn(Ⅱ)的水溶液和测定体积的稀释溶液(约50mM Tris试剂、约10mg/ml苯酚、约32mg/ml甘油和约30mg/ml柠檬酸三钠，pH8.47)加入所述两种蛋白的混合物中。用1N HCl或1N NaOH将所得溶液的pH调至约7.6(7.58-7.63)。将已调节pH的溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤。向2ml滤液中加入2ml鱼精蛋白的水溶液(约37.5mg硫酸鱼精蛋白/100ml)。加入鱼精蛋白溶液后立即形成沉淀。让制剂于25℃原状静置。如前所述进行溶解实验。在相同条件下胰岛素NPH在约6分钟内溶解。
表8.不溶性组合物的制备
      蛋白                           人胰岛素
  蛋白质量(mg)     11.3     11.3     33.6     33.6     16.5
    0.1N HCl的体积     0.57     0.57     1.68     1.68     0.83
    衍生化蛋白     B29-酰化人胰岛素
    衍生基团   2-甲基-己酰基   2-乙基-己酰基   4-甲基-辛酰基    3-甲基-癸酰基     十二烷酰基
 衍生化蛋白质量(mg)     6.07     6.3     6.12     2.12     6.3
    0.1N HCl的体积     0.3     0.3     0.3     0.1
   ml蛋白溶液与ml衍生化蛋白溶液混合     0.10+0.30     0.10+0.30     0.10+0.30     0.30+0.10     0.10+0.30
   ml 1000ppm锌     0.152     0.152     0.112     0.096     0.152
    ml加入的稀释剂     1.6     1.6     1.6     1.6     1.6
    晶体形状     棒状     棒状     棒状     棒状     小-不规则
    得率(％)     ＞90     ＞90     ＞80
  不溶相中的衍生化蛋白(％)     74.1     75.5     81.9
溶解时间(min)     116     236     40
    蛋    白                             人胰岛素
  蛋白质量(mg)     22.3     22.3     22.3     22.3
    0.1N HCl的体积     1.12     1.12     1.12     1.12
    衍生化蛋白   B29-酰化兔胰岛素   B29-酰化猪胰岛素   B29-酰化绵羊胰岛素   B29-酰化牛胰岛素
    衍生基团    辛酰基     辛酰基     己酰基     己酰基
  衍生化蛋白质量(mg)     6.21     6.07     6.07     6.21
    0.1N HCl的体积     0.3     0.3     0.3     0.3
  ml蛋白溶液与ml衍生化蛋白溶液混合   0.1+0.3   0.1+0.3   0.1+0.3   0.1+0.3
  ml 1000ppm锌     0.152     0.152     0.152     0.152
    ml加入的稀释剂     1.6     1.6     1.6     1.6
    晶体形状     棒状     棒状  小-不规则     棒状
    得率(％)     ＞90     ＞90     ＞90     ＞90
 不溶相中的衍生化蛋白(％)     74.6     74.7     75.4     75.9
  溶解时间(min)     111     ＞300     227     ＞300
      蛋  白                         人胰岛素
   蛋白质量(mg)     33.6     2.4     22.6
    0.1 N HCl的体积     1.68     0.1     1.12
    衍生化蛋白     B29-酰化-Gly(A21)，Arg(b31)，Arg(B32)-人类似物 B29-酰化人胰岛素    B29-酰化-derThr(B30)-人胰岛素类似物
    衍生基团     癸酰基  1，4-二氯苯基-硫代-乙酰基     辛酰基
  衍生化蛋白质量(mg)     2.23     5.1     6.06
    0.1N HCl的体积     0.1     0.3     0.3
   ml蛋白溶液与ml衍生化蛋白溶液混合     0.3+0.1     0.1+0.3     0.1+0.3
 ml 1000 ppm锌     0.096     0.152     0.152
    ml加入的稀释剂     1.6*     1.6     1.6
    晶体形状     棒状 小的不规则晶体     棒状
    得率(％)     ＞90     ＞90     ＞90
不溶相中的衍生化蛋白(％)     20.4     71.8     74.2
溶解时间(min)     63     66     ＞300
*在加入稀释剂之前加入2.096ml 37.5mg/100ml硫酸鱼精蛋白溶液。在加入稀释剂后调节pH。
                    制备18
              无定形悬浮液的制备
将测定质量(13.84mg蛋白)的固体B28-十四烷酰基-Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素类似物溶于0.375ml 0.1N HCl中。将测定质量的锌人胰岛素(7.40mg蛋白)溶于207ml 0．1N HCl中。将一等份(125μl)的胰岛素溶液(含4.47mg人胰岛素)加入B28-十四烷酰基-Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素类似物溶液中。加入一定体积(180μl)的1000ppm锌和2.0ml的稀释剂(1.6mg/ml苯酚、4mg/ml间甲酚、40mg/ml甘油、5mg/ml无水磷酸氢二钠、7.5mg/ml柠檬酸三钠二水合物，pH7.6)。用100微升1N NaOH将pH从5.6升至8.0，并用20微升1N HCl或1N NaOH将pH调回7.59。B28-十四烷酰基-Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素类似物的浓度为4.94mg/ml，而人胰岛素的浓度为1.60mg/ml。将该溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤并冷冻过夜。第二天早上，该溶液未出现沉淀。向2.5ml该溶液中加入2.88ml鱼精蛋白溶液(溶于水中的0.75mg/ml的固体硫酸鱼精蛋白)。当加入鱼精蛋白时形成无定形沉淀。
加入鱼精蛋白后，再次测定可溶相中B28-十四烷酰基-Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素类似物和人胰岛素的浓度。在加入鱼精蛋白后立即制备用于HPLC分析的样品。从峰的保留时间来看，HPLC分析表明，悬浮液中的不溶性物质含有鱼精蛋白、B28-十四烷酰基-Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素类似物和人胰岛素。可溶相中的B28-十四烷酰基-Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素类似物的浓度为2.30mg/ml，而人胰岛素的浓度为0.74mg/ml。
测定悬浮液、上清液和沉淀的酸化样品中的B28-十四烷酰基-Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素类似物和人胰岛素的浓度，并在以下列表显示。它们和预期值相当一致。未定量测定鱼精蛋白的浓度。
表9.不溶性组合物的制备
浓度(mg/ml) 质量百分率(％)
样品 B28-十四烷酰基-Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素类似物 人胰岛素
悬浮液 2.52 0.79 76.2
上清液 0.006 0.057 8.9
沉淀 2.29 0.60 79.2
                       制备19
                  无定形悬浮液的制备
以下概述用于制备本发明沉淀的另一方法。该方法用来制备胰岛素与以下三种衍生化蛋白中的每种的无定形沉淀制剂：B29-Nε-辛酰基-人胰岛素、B29-Nε-壬酰基-人胰岛素和B28-Nε-辛酰基-Lys(B28)，Pro(B29)人胰岛素类似物。
将测定质量的固体衍生化蛋白溶于3ml 0.1N HCl中，产生含约16mg/ml衍生化蛋白的溶液。将测定质量的锌人胰岛素晶体(73mg，其中67.17mg为蛋白)溶于4.198ml 0.1N HCl中，产生含约16mg/ml胰岛素的溶液。将3毫升衍生化蛋白溶液和1毫升胰岛素溶液合并并充分混合。加入测定体积的1000ppm锌溶液(1.137ml)和测定体积的稀释剂(16ml，每ml含1.625mg苯酚、4mg间甲酚、40mg甘油、5mg无水磷酸氢二钠、7.5mg柠檬酸三钠二水合物，pH7.6)。用5N NaOH和5N HCl溶液将pH调至约7.6(7.58-7.61)。在PH调节过程中加入的体积为0.11至0.12ml。将该溶液通过0.22微米低蛋白结合滤器过滤并冷冻过夜。第二天早上，该溶液未出现沉淀。该溶液包含蛋白和衍生化蛋白(约1∶3的质量比)，总蛋白浓度等于约85单位/ml。恰好在大鼠中测试之前，将等体积的该溶液和硫酸鱼精蛋白溶液(0.352gm/ml)合并并充分混合。立即形成无定形沉淀。将含所述无定形沉淀的悬浮制剂样品立即注射入实验动物中。与鱼精蛋白混合后，总蛋白的浓度为约42.4单位/ml。
                   制备20
   Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)-人胰岛素类似物
Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-人胰岛素得自大肠杆菌发酵，其中Gly(A21)-人胰岛素原前体分子在内含体中超量表达。将1份(94.7g)内含体于室温下溶于500ml含0.1M TRIS、0.27M亚硫酸钠和0.1M连四硫酸钠pH10.5的6M盐酸胍中。用12N HCl将pH快速降至8.8。在开放的容器中剧烈搅拌45分钟后，用磷酸将pH降至2.1，将样品于4℃离心过夜。倾出上清液并于4℃贮存用于另外的加工。用200ml额外的pH10.5溶液(参见上述)再提取沉淀，然后于4℃离心3小时。将该上清液和先前获得的上清液分别用100mM磷酸钠pH4稀释4倍，沉淀所述产物和其它酸性组分。将沉淀物沉降后，倾出大部分上清液并将其弃去。将所得的悬浮液离心，然后倾出并弃去额外的上清液，留下粗制Gly(A21)-人胰岛素原S-磺酸盐前体湿沉淀。将沉淀溶于1.5升7M去离子尿素中，用5N NaOH将pH调至8，于4℃搅拌数小时。然后，加入盐(NaCl)以达到1M浓度，将样品上样至XAD-7柱(14cm×20cm，Toso-Haas，Montgomeryville，PA)，该柱先前用50％乙腈/50％50mM碳酸氢铵、10％乙腈/90％50mM碳酸氢铵冲洗，最后用7M去离子尿素/1M NaCl/20mM TRIS pH8.0冲洗。一旦上样，则向该柱灌输4.5升7M去离子尿素/1M NaCl/20mM TRISpH8溶液，然后灌输2.8升50mM碳酸氢铵/1M NaCl和6.5升50mM碳酸氢铵。该柱用线性梯度的乙腈的50mM碳酸氢铵溶液洗脱，同时经UV于280nm监测洗脱液。收集目的峰，即部分纯化的Gly(A21)-人胰岛素原S-磺酸盐前体，将其冻干，并如下经过折叠/二硫键步骤。将一定量(5.4g)的所述前体于4℃溶于3升20mM甘氨酸pH10.5中。然后，在搅拌下加入15ml240mM盐酸半胱氨酸，同时将pH维持在10.5，将温度维持在4℃。将反应溶液于4℃温和搅拌27小时，然后通过用磷酸将pH降至3.1进行猝灭。加入乙腈(155ml)，然后将该溶液上样至5×25cm C4反相柱，该柱先前灌输60％乙腈／40％水/0.1％TFA，并在10％乙腈/90％水/0.1％TFA中平衡。一旦上样，向该柱灌输1升17.5％乙腈/82.5％水/0.1％TFA，然后用乙腈在0.1％TFA中的线性梯度洗脱，同时于280nm监测。将选定的流分合并并冻干，回收714mg。为了将胰岛素原前体转化为所需的胰岛素类似物，将697mg Gly(A21)人胰岛素原前体溶于70ml 50mM碳酸氢铵中，然后冷却至4℃，pH8.3。将一定体积(0.14ml)的1mg/ml猪胰蛋白酶(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)的0.01N HCl溶液，加至样品溶液中，将其于4℃温和搅拌约24小时。将另外0.14ml所述胰蛋白酶溶液加至反应溶液，然后再搅拌21小时45分钟。通过用0.7ml冰醋酸和0.3ml磷酸将pH降至3.2，猝灭该反应。得自胰蛋白酶切割反应的猝灭的Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-人胰岛素样品溶液用30％乙腈/70％50 mM乙酸pH 3.1稀释4倍，并上样至1×30cm SHyperD F(Biosepra，Marlborough，MA)阳离子交换柱，该柱先前灌输30％乙腈/70％50 mM乙酸/500mM NaCl pH3.3，并在30％乙腈/70％50mM乙酸中平衡。一旦上样，向该柱灌输约50ml30％乙腈/70％50mM乙酸，然后用NaCl在30％乙腈/50mM乙酸中的线性梯度洗脱，同时于276nm监测洗脱液。合并含Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-人胰岛素的选定流分，用纯化水稀释3倍，并上样至2.2×25cmC4反相柱(Vydac，Hesperia，CA)，该柱先前灌输60％乙腈/40％水/0.1％TFA，然后灌输10％乙腈/90％水/0．1％TFA。一旦上样，向该柱灌输约200ml 10％乙腈/90％水/0.1TFA，然后用乙腈在0.1％TFA中的线性梯度洗脱。合并并冻干选定的流分，回收101mg。分析型HPLC显示主峰纯度高于95％。纯化蛋白的电喷射质谱(ESMS)分析得到的分子量为6062.9(理论值6063.0)。
                     制备21
               des(B30)-人胰岛素
通过受控胰蛋白酶水解，由人胰岛素原制备des(B30)-人胰岛素。将一定质量(2g)的在重组大肠杆菌中生物合成的并用常规方法[Frank，B.H.等PEPTIDES：Synthesis-structure-Function.Proceedings ofthe Seventh American Peptide Symposium，Rich D.H.和Gross，E.(编辑)，Pierce Chemical Company，Rockford，第729-738页，1981；也参见1984年2月7日授予Frank，B.H.的美国专利第4，430，266号，每个都通过引用结合到本文中]纯化的人胰岛素原，溶于400ml 0.1M pH7.5HEPES缓冲液中。加入8ml 1M CaCl2(水中)并用5N NaOH将pH调至7.5后，将2ml 10mg/ml猪胰蛋白酶(Sigma)的0.01N HCl溶液转移至样品溶液中，同时温和搅拌。将反应溶液于室温下搅拌2小时42分钟，此时将其转移至37℃环境中，同时有时搅拌。于37℃l小时45分钟后，通过用磷酸将pH调至3.0猝灭酶促反应，并于4℃贮存。随后，使溶液达到室温，并用50ml乙腈稀释，然后用纯化水稀释至终体积500ml，然后上样至2.5×58 cm CG-161(Toso-Hass)柱，该柱先前灌输1c.v.(柱体积)40％乙腈/60％ 0.1M硫酸铵pH2.5和2c.v.10％乙腈/90％ 0.1M硫酸铵pH2.5。一旦上样，向该柱灌输1c.v10％乙腈/90％ 0.1M硫酸铵pH2.5。用乙腈在0.1M硫酸铵pH2.5中的线性梯度洗脱该柱，同时于276nm监测洗脱液。通过合并选定的流分，收集目的峰，即部分纯化的des(B30)-人胰岛素。用纯化水pH3.5，将该合并的部分纯化des(B30)-人胰岛素样品稀释至1.28升，上样至1×29cm S HyperD F(Biosepra)阳离子交换柱，该柱预先灌输1 c.v.30％乙腈/70％ 0.1％TFA/0.5M NaCl pH1.9和2c.v.30％乙腈/70％ 0.1％TFA pH2.3。一旦上样，向该柱灌输1c.v.30％乙腈/70％0.1％TFA pH2.3，然后用NaCl在30％乙腈/70％0.1％TFA pH1.9-2.3中的线性梯度洗脱，同时于276nm监测洗脱液。将选定的含纯化des(B30)-人胰岛素的流分合并，用纯化水稀释2.5倍，并上样至35-c.c C8SepPak(Waters，Milford，MA)，该柱预先用2c.v.乙腈、2c.v.60％乙腈/40％0.1％TFA和2c.v.10％乙腈/90％ 0.1％TFA清洗并灌注(prime)。一旦上样，SepPak用3c.v.10％乙腈/90％0.1％TFA冲洗，然后用2c.v.60％乙腈/40％ 0.1％TFA洗脱。冻干的流出液得到500mg。分析型HPLC测定显示主峰纯度高于95％。纯化蛋白的电喷射质谱(EMSM)分析得到的分子量为5706.5(理论值5707)。
                       制备22
                      兔胰岛素
如Chance，R.E.等所述[Proinsulin，Insulin，C-Peptide，Baba，S.等(编辑)，Excerpta Medica，Amsterdam-Oxford，第99-105页(1979)]制备兔胰岛素。
                       制备23
               Asp(B28)-人胰岛素类似物
基本上按照Chance，R.E.等的实施例31和32所述[1997年12月23日授予的美国专利第5，700，662号，特别通过引用结合到本文中]的技术，制备和纯化Asp(B28)-人胰岛素。用胰蛋白酶辅助的半合成，使des(B23-30)-人胰岛素[Bromer，W.W.和Chance，R.E.，Biochim Biophys，Acta，133：219-223(1967)，特此通过引用结合到本文中]和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys(Tfa)-Thr缩合，经凝胶过滤和反相HPLC纯化，用15％氢氧化铵(v/v)于室温下处理4小时，以去除Lys(B29)的三氟乙酸(Tfa)保护基团，经反相HPLC纯化并冻干。
                        制备24
                   衍生化蛋白的合成
以下是用来制备本发明沉淀和晶体的某些衍生化蛋白的合成概述。所述概述与以下表10的数据一起阅读。
将测定质量的纯化胰岛素或胰岛素类似物于搅拌下溶于测定体积的二甲基亚砜(DMSO)中。然后，加入测定体积的盐酸四甲基胍(TMG)，将溶液充分混合。在另外的容器中，将测量质量的N-酰基-琥珀酰亚胺(NAS)溶于测定体积的DMSO中。将测定体积的第二种溶液加入第一种溶液中。反应于室温下进行，通过用HPLC分析反应混合物的样品，监测反应的进程。通过加入测定体积的乙醇胺猝灭反应，然后酸化至pH2-3。
然后，用单独的反相层析，或用阳离子交换层析然后反相层析的组合，纯化反应混合物。用具有214nm或280nm的UV检测、分部收集器、2.2×25cm或5×30cm C18柱的FPLC_系统(Pharmacia)，于室温下进行反相纯化，流速为2.5或5ml/min。液相为溶液A[0.1％三氟乙酸(TFA)的10∶90乙腈∶水(v/v)溶液]和溶液B[0.1％三氟乙酸(TFA)的70∶30乙腈∶水(v/v)溶液]的混合物，适用于洗脱和分离目的种类。通常，该柱在100％溶液A中平衡并上样。然后，用至一定比例溶液B的线性梯度，来充分地分离反应产物。合并含产物的流分。纯化方法的设计在本领域技术范围内。
以下表10提供按照以上概述、用于合成衍生化蛋白的实验数据，所述衍生化蛋白用来制备本发明的各种实施方案。如上所述或按照常规方法制备起始蛋白。常规纯化用来提供高度纯化的用于下述合成的起始蛋白。胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原的合成在本领域技术范围内，可以采用重组表达、半合成或固相合成然后进行链组合来完成。通过常规纯化技术，将合成蛋白纯化至适用于制备用于本发明的衍生物的纯度。
纯化衍生物的分子量通过电喷射质量分析(EMSM)经质谱证实。酰化位点的分配或者基于层析分析(“HPLC”)，或者基于N末端分析(“N末端”)，或基于这两者。表10.各种衍生化蛋白合成的总结。
    起始蛋白   人胰岛素   人胰岛素   人胰岛素
    蛋白质量(mg)     141.3     1，080     120
    DMSO(ml)     42     30     36
    TMG(μl)     30.5     233     25.9
    NAS酰基链   正己酰基   正辛酰基   正十二酰基
    NAS质量(mg)     7.76     85.7     9.22
    DMSO体积(ml)     1.0     1.0     0.701
加入的NAS溶液的体积(ml)     0.494     0.785     0.701
    反应时间(min)     40     105     40
    乙醇胺体积(μl)     20     100     120
    总得率(％)     40     33     36
    分子量(理论值)     5906.0     5933.9     5990.0
    分子量(ESMS)     5906.8     5933.9     5990.0
    HPLC纯度(％)     96     94     98
    酰化位点(HPLC)     Nε     Nε     Nε
    酰化位点(N-末端)     Nε     Nε     Nε
       起始蛋白   人胰岛素   人胰岛素   人胰岛素
    蛋白质量(mg)     194     2040     2050
    DMSO(ml)     60     62     58
    TMG(μl)     41.9     441     443
    NAS酰基链 正十四酰基 正丁酰基   正己酰基
    NAS质量(mg)     23.4     269.3     209
    DMSO体积(ml)     1.0     1.0     2.0
加入的NAS溶液的体积(ml)     0.756     0.29     1.44
    反应时间(min)     20     30     30
    乙醇胺体积(μl)     5     100     100
    总得率(％)     45     27*     22
    分子量(理论值)     6018.1     5877.8     5905.9
    分子量(ESMS)     6018.2     5877.8     5906.0
    HPLC纯度(％)     98     94     93
    酰化位点(HPLC)     Nε     Nε     Nε
    酰化位点(N-末端)     Nε     -     -
*纯化包括首先反相HPLC，然后阳离子交换HPLC，然后反相HPLC
以下是另外的衍生化蛋白的合成概述。所述概述与以下表11的数据一起阅读，以提供全面的合成流程。
向测定质量的纯化胰岛素或胰岛素类似物中加入测定体积的50mM硼酸pH2.57，将其溶解。然后于搅拌下，缓慢加入与硼酸溶液等体积的测定体积的乙腈。“溶剂”体积为硼酸体积和乙腈体积之和。用NaOH将溶液的pH调至10.2-10.5。在另外的容器中，将测定质量的N-酰基-琥珀酰亚胺(“NAS”)溶于测定体积的DMSO中。将测定体积的第二种溶液加入第一种溶液中。反应于室温下进行，根据需要将pH维持在10.2以上，通过用HPLC分析反应混合物的样品，监测反应的进程。通过酸化至pH2-3猝灭反应。然后，如上所述用反相层析系统纯化反应混合物。
表11提供按照以上概述、用于合成衍生化蛋白的实验数据，所述衍生化蛋白用来制备本发明的各种实施方案。通过电喷射质量分析(ESMS)经质谱证实所纯化衍生物的分子量。酰化位点的分配或者基于层析分析(“HPLC”)，或者基于N末端分析(“N末端”)，或基于这两者。表11.各种衍生化蛋白合成的总结。
       起始蛋白   人胰岛素   人胰岛素   人胰岛素
    蛋白质量(mg)     2.170     2.420     2.250
    溶剂(ml)     200     240     200
    NAS酰基链   正丁酰基 正戊酰基   正辛酰基
    N-酰基-琥珀酰亚胺的质量(mg)     108.7     1155     173
    DMSO体积(ml)     1.0     5     1.0
 加入的NAS溶液的体积(ml)     0.955     0.719     0.81
    反应时间(min)     40     40     40
    总得率(％)     25     12     37
    分子量(理论值)     5877.8     5891.8     5933.9
    分子量(ESMS)     5877.7     5891.9     5933.8
    HPLC纯度(％)     96     95     96
    酰化位点(HPLC)     Nε     Nε     Nε
    起始蛋白   人胰岛素   人胰岛素   人胰岛素
    蛋白质量(mg)     1.960     2，750     1.040
    溶剂(ml)     200     200     200
    NAS酰基链   正壬酰基   正十二酰基   正十四酰基
    N-酰基-琥珀酰     145.8     19.9     102.3
    亚胺的质量(mg)
    DMSO体积(ml)     1.0     1.0     1.0
加入的NAS溶液的体积(ml)     0.887     0.771     0.885
    反应时间(min)     40     30     35
    总得率(％)     35     14     39
    分子量(理论值)     5947.9     5990.0     6018.1
    分子量(ESMS)     5948.1     5989.9     6018.1
    HPLC纯度(％)     94     93     94
    酰化位点(HPLC)     Nε     Nε     Nε
    起始蛋白  绵羊胰岛素   牛胰岛素   猪胰岛素
    蛋白质量(mg)     312     275     200
    溶剂(ml)     100     100     100
    NAS酰基链   正己酰基   正己酰基   正辛酰基
    N-酰基-琥珀酰亚胺的质量(mg)     27.2     19.9     16.4
    DMSO体积(ml)     1.0     1.0     1.0
    加入的NAS溶液的体积(ml)     0.644     0.771     0.764
    反应时间(min)     45     30     82
    总得率(％)     31     50     41
    分子量(理论值)     5801.7     5831.8     5903.9
    分子量(ms)     5801.8     5831.7     5903.9
    HPLC纯度(％)     96     96     96
    酰化位点(HPLC)     Nε     Nε     Nε
    起始蛋白   兔胰岛素  des(B30)-人胰岛素 AspB28-人胰岛素
    蛋白质量(mg)     211.4       205.3     132.3
    溶剂(ml)     100       20     20
    NAS酰基链   正辛酰基     正辛酰基    正辛酰基
    N-酰基-琥珀酰亚胺的质量(mg)     16.8       21.5     11.5
    DMSO体积(ml)     1.0       0.5     1.0
    加入的NAS溶液的体积(ml)     0.786       0.303     0.715
    反应时间(min)     57       40     85
    总得率(％)     39       47     32
    分子量(理论值)     5919.9       5833.6     5951.9
    分子量(ms)     5920.0       5832.7     5952.2
    HPLC纯度(％)     95       96     94
       起始蛋白   GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素类似物     人胰岛素  des(B27)-人胰岛素类似物
    蛋白质量(mg)     86.2     134.8     44.8
    溶剂(ml)     10     20     7
    NAS酰基链     正辛酰基   2-甲基-己酰基     正辛酰基
    N-酰基-琥珀酰亚胺的质量(mg)     22.4     749     3.6
    DMSO体积(ml)     0.5     4.93*     1.0
    加入的NAS溶液的体积(ml)     0.115     0.052     0.993
    反应时间(min)     40     45     40
    总得率(％)     45     45     53
    分子量(理论值)     6189.2     5919.9     5832.8
    分子量(ms)     6189.2     5919.9     5832.9
    HPLC纯度(％)     97     96     93
    酰化位点(HPLC)     Nε     Nε     Nε
*溶于乙腈，而不是溶于DMSO。
       起始蛋白     人胰岛素      人胰岛素    人胰岛素
    蛋白质量(mg)     160     147.7     2.080
    溶剂(ml)     20     20     200
    NAS酰基链   4-甲基-辛酰基   3-甲基-癸酰基   正辛酰基
    N-酰基-琥珀酰亚胺的质量(mg)     715     22.5     146.7
    DMSO体积(ml)     4.97*     1.0*     1.0*
加入的NAS溶液的体积(ml)     0.0734     0.609     0.884
    反应时间(min)     60     45     40
    总得率(％)     54     38     5.3**
    分子量(理论值)     5947.9     5976.0     6060.1
    分子量(ms)***     5947.8     5976.2     6060.5
    HPLC纯度(％)     96     96     92
    酰化位点(HPLC)     Nε     Nε  A1-Nα，Nε
*溶于乙腈中，而不是溶于DMSO中。**A1-Nα，B29-Nε-二酰基-人胰岛素衍生物的得率***通过基质辅助激光解吸离子化(MALDI)质谱测定，来代替电喷射质谱。
     起始蛋白  des(B30)-人胰 人胰岛素 人胰岛素
 岛素类似物
      蛋白质量(mg)     205.3   1，960    2.110
       溶剂(ml)       20     200     200
       NAS酰基链   正辛酰基   正壬酰基   正癸酰基
     N-酰基-琥珀酰亚胺的质量(mg)     21.5    145.8    150.5
      DMSO体积(ml)     1.0     1.0     1.0
 加入的NAS溶液的体积(ml)    0.089    0.0887    0.975
     反应时间(min)      40      40      60
     总得率(％)    11.0     11.5     11.1
     分子量(理论值)    5959.5     6088.2    6116.2
     分子量(ms)    5959.3     6088.3    6116.4
     HPLC纯度(％)      96       92      92
     酰化位点(HPLC) A1-Nα，Nε  A1-Nα，Nε  A1-Nα，Nε
以下是产生其它衍生化蛋白的合成流程的总体概述。在一种具体情况下，所述概述与以下表12的数据一起阅读，以提供用于特定衍生化蛋白的全面的合成流程。向测定质量的纯化胰岛素或胰岛素类似物中加入测定体积的DMSO，将其溶解。用10个相当量的四甲基胍调节溶液的pH。在另外的容器中，将测量质量的N-酰基-琥珀酰亚胺(“NAS”)溶于测定体积的DMSO中。将测定体积的第二种溶液加入第一种溶液中，得到1.9倍摩尔过量的N-酰基-琥珀酰亚胺。反应于室温下进行，通过用HPLC分析反应混合物的样品，监测反应的进程。用20毫升乙醇胺猝灭反应，在冰/水浴中冷却并用0.1N HCl稀释2.1倍。然后用以下方案在反相层析柱上对反应混合物脱盐：1)用100％乙腈湿润该柱，然后用3-4倍柱体积的0.1％TFA/70％乙腈(缓冲液B)洗涤；最后用4-5倍柱体积的0.1％TFA/10％乙腈(缓冲液A)洗涤；2)将稀释的反应混合物上柱，该柱再次用5-6倍柱体积的缓冲液A洗涤；和3)使5-6倍柱体积的缓冲液B通过该柱，洗脱出衍生化蛋白。将洗脱期间收集的流体冷冻，然后冻干。然后用如上所述的反相层析系统再纯化冻干的粗制产物(86.1mg)。
表12提供按照以上概述、用于合成衍生化蛋白的实验数据，所述衍生化蛋白用来制备本发明的各种实施方案。通过电喷射质量分析(ESMS)经质谱法证实所纯化衍生物的分子量。酰化位点的分配或者基于层析分析(“HPLC”)。
表12.各种衍生化蛋白合成的概述
      起始蛋白           人胰岛素
    蛋白质量(mg)             179
    (溶解人胰岛素的DMSOml)              20
      NAS酰基链   1，4-二氯苯基硫基-乙酰基
    N-酰基-琥珀酰亚胺的质量(mg)          30
    DMSO体积(ml)           1.0
加入的NAS溶液的体积(ml)           0.412
    反应时间(min)          50
    总得率(％)          32.2*
    分子量(理论值)        6026.78
    分子量(ESMS)        6026.9
    HPLC纯度(％)          96
    酰化位点(HPLC)          Nε
*根据脱盐的冻干粗制产物的重量计算得率。
                      实验1
              共晶体在狗中的时间作用
在接受恒定输注促生长素抑制素以产生短暂糖尿病状态的正常狗中，测定本发明的三种共晶体组合物的时间作用。基本上按照以上制备16中关于制剂D所述，制备包含人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的第一种共晶体制剂，将其以3nmol/kg的剂量皮下给予(“8753”)。基本上按照以上制备16中关于制剂D所述，制备包含人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的第二种共晶体制剂，将其以2.5nmol/kg的剂量皮下给予(“8752.5”)。最后，按照以上制备14中所述，制备包含人胰岛素和B29-Nε-癸酰基-人胰岛素的第三种共晶体制剂，将其以2.5nmol/kg的剂量皮下给予(“10252.5”)。将该数据与在同一模型中在给予Humulin N(2.0nmol/kg “NPH”)、牛/猪特慢胰岛素(3nmol/kg，“BP-UL”)和盐水后观察到的数据进行比较。
在过夜禁食的长期插管的重10-17kg的清醒雄性和雌性小猎犬(Marshall Farms，NorrhRose，NY)中进行实验。在该项研究之前至少10天，用异氟烷(Anaquest，Madison，WI)麻醉动物，并将连接至血管入口端(vascular aceess port)(V-A-PTM，Access Technologies，NorfolkMedical，Skokie，IL)的硅氧烷导管插入股动脉和股静脉。导管充满甘油/肝素溶液(3∶1，v/v；肝素终浓度为250KIU/ml；甘油得自SigmaChemical Co.，St.Louis，MO，而肝素得自Elkins-Sinn，Inc.，Cherry Hill，NJ)，以防止导管阻塞，然后封闭伤口。手术前给予(20mg/kg，IV和20mg/kg，I.M.)头孢唑啉(Eli Lilly & Co.，IndianapoIis，IN)，手术后给予头孢氨苄(250mg，每日口服1次，给予7天)以防止感染。手术后给予Torbugesic(1.5mg/kg，I.M.)以控制疼痛。
正好在研究当天之前取血，确定动物的健康情况。只使用血细胞比容高于38％和白细胞计数低于16，000/mm3的动物(血液学分析仪：Cell-Dyn 900，Sequoia-Tumer，Mountain View，CA)。
该实验当天早晨，进入所述端口(Access Technologies，NorfolkMedicai，Skokie，IL)；抽吸导管的内容物；用盐水冲洗导管(BaxterHealthcare Corp.，Deerfield，IL)；将狗置于笼中；延长管线(extensionline)(由一条不锈钢系链保护，并连接至一个旋转系统[InstechLaboratories，Plymouth Meeting，PA])连接至端口入口管线(port accessline)。
在取动脉血液样品用于测定禁食胰岛素、葡萄糖和胰高血糖素浓度之前(时间=-30分钟)，让狗适应笼中环境至少10分钟。此时，开始给予连续的IV输注环状促生长素抑制素(0.65μg/kg/min；BACHEM California，Torrance，CA)，并持续接下来的30.5小时。开始输注后30分钟(时间=0分钟)，取动脉血液样品，在颈背侧面皮下注射大剂量的测试物质或溶媒。此后每3小时取动脉血液样品，用于测定血浆葡萄糖和胰岛素浓度，每6小时取动脉血液样品，用于测定血浆胰高血糖素浓度。整个研究持续30小时。
将动脉血液样品收集到含EDTA二钠(Terumo Medicai Corp.，Elkton，MD)的真空血液收集管中，立即置于冰上。将一部分血样品(1.5ml)转移至含40μl抑酶酞(10，000KIU/ml；Trasylol，Miles，Inc.，Diagnostics Division，Kankakee，IL)制剂的聚丙烯试管中，以测定血浆胰高血糖素浓度。将样品离心，并将所得的血浆转移至聚丙烯试管中，并在研究期间贮存于冰上。
在研究当天，用葡萄糖氧化酶法，在市售葡萄糖分析仪中测定血浆葡萄糖浓度。用于其它测定的样品贮存于-80℃，直至用于分析时。用双抗体放射免疫测定法测定胰岛素浓度。用放射免疫测定试剂盒(LINCO Research，Inc.，St.Charles，MO)测定胰高血糖素浓度。
实验结束时，用新鲜盐水冲洗导管，用头孢唑啉(20mg/kg)处理，并充入甘油/肝素混合物；口服抗生素(头孢氨苄；250mg)。可能时为了使所用动物数最小化并使数据库配对，对动物研究多次。以1周的最小间隔，在再研究的动物中进行实验。
关于人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的1∶3共晶体的时间作用，在较高剂量(8753)下，其时间作用比NPH人胰岛素的时间作用长9小时(24小时对15小时)，在较低剂量(8752.5)下比NPH人胰岛素的作用时间长6小时(21小时对15小时)。通过统计学比较平均葡萄糖水平与对照组(盐水)的平均葡萄糖水平，测定时间作用。人胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的1∶3共晶体制剂的葡萄糖分布图比NPH-人胰岛素的分布图更象预期的基础胰岛素的分布图。所述1∶3共晶体的活性也比牛/猪特慢胰岛素的活性更高，具有更想要的葡萄糖分布图。与对照(盐水)相比由所述共晶体制剂引起的血液葡萄糖的降低，其持续时间比由这种牛/猪特慢胰岛素引起的血液葡萄糖降低的持续时间更为长久。
人胰岛素和B29-Nε-癸酰基-人胰岛素的1∶3共晶体(10252.5)的时间作用比NPH人胰岛素长9小时(24小时对15小时)。这种差异在统计学上是显著的(p＜0.05)。在相同动物中，人胰岛素和B29-Nε-癸酰基-人胰岛素的3∶1共晶体制剂(2.5nmol/kg，SC)的时间作用比或者Humulin U或牛U制剂长6小时(24小时对18小时)。这种差异在统计学上也是显著的(p＜0.05)。所述共晶体制剂的葡萄糖分布图比NPH-人胰岛素的分布图更象预期的基础胰岛素的分布图。此外，当给予所述3∶1共晶体时，在狗中的时间作用的变异性最小。
总之，这些数据表明，本发明的共晶体在狗中有效地在延长的时间内控制葡萄糖水平。它们也支持这样一种结论：本发明的共晶体在2型糖尿病患者的过夜葡萄糖控制方面、或作为1型或2型糖尿病患者的基础/大剂量胰岛素疗法的基本武器将是有效的。它们也提示，这些制剂可以产生可变性小于市售胰岛素制剂的反应。
                       实验2
               共晶体在猪中的时间作用
在正常的重17-25kg有感知的雌猪中进行研究。经外科手术预先植入动脉(颈动脉或股动脉)导管用于取样，以及植入颈静脉管线用于给予促生长素抑制素。在实验之前，让插管的猪禁食22-24小时。在耳后柔软的皮肤中皮下给予胰岛素注射，剂量为3.0nmol/kg(0.5单位/kg)。同时给予0.3μg/kg/min的促生长素抑制素(溶于含1％人血清白蛋白的0.9％NaCl中，Miles Canada，Etobicoke，ON)，以抑制内源胰岛素的分泌。通过以可变的速率输注20％葡萄糖维持接近血糖量正常，并且频繁监测葡萄糖浓度。用葡萄糖氧化酶法，用市售的葡萄糖分析仪对研究当天的新鲜血浆样品测定血浆葡萄糖水平。
在血糖正常控制(clamp)研究中，在研究开始时(时间0)，皮下给予5头猪包含1∶3胰岛素∶B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的本发明微晶制剂，剂量为0.5U/kg(相当于约3nmol/kg)。连续测定维持血糖正常所需的葡萄糖输注速率(设定点=约90mg/ml)。对照组接受皮下给予的相同剂量的Humulin N(U100)(n=6)。在整个实验期间维持同时输注促生长素抑制素(0.3μg/kg/min)。对于本发明的微晶，在前2个小时内葡萄糖输注速率稳定上升，达到约7mg/ml/min的最大值。此后，直至约17.5小时，葡萄糖输注速率相当稳定的降至约0.5mg/kg/min。在17.5小时和24小时时的研究结束之间的大多数时间，葡萄糖输注速率维持在约0.5至约2mg/kg/min。
相比之下，在对照组中平均葡萄糖输注速率(Humulin NPH)稳步上升，在给药后约3小时时达到约14mg/kg/min的最大值。此后，到约4.5小时为止，输注速率降至约7mg/kg／min，到给药后13小时时降至约5mg/kg/min。对于对照组没有取进一步的数据。这些结果与包含摩尔比为1∶3的胰岛素和B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的微晶制剂的葡萄糖动力学分布图比胰岛素NPH更为平坦这一结论是一致的。
                        实验3
               共晶体在大鼠中的时间作用
在BBDP/Wor大鼠中测试包含1∶3胰岛素∶B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的本发明微晶制剂，所述大鼠为遗传上特征鉴定的动物模型，由与Biomedical Research Models，Inc.(Rutland，MA)有联系的Massachusetts Medical Center大学(Worchester，MA)保有并提供。DPBB/Wor大鼠系有糖尿病倾向，表现出依赖于胰岛素(自身免疫)的糖尿病。所有制剂均以0.9U/100g体重的剂量皮下给予。
将BBDP/Wor雄性大鼠[4-5月龄，维持长效胰岛素(PZI]随机分配为5个实验组-A、B、C、D和E。组A(n=22)用U40人特慢胰岛素(Humulin UL)处理3天；组B(n=18)用Iletin Ultralente的U40制剂(65％牛胰岛素，35％猪胰岛素)处理3天；组C(n=10)用如上制备的包含1∶3胰岛素∶B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的微晶制剂处理3天；组D(n=21)用包含100％B29-Nε-辛酰基-人胰岛素微晶制剂处理；而组E接受U40牛-猪PZI胰岛素(PZI)。在测定血液葡萄糖之前2天和测定血液葡萄糖的当天，给予每只大鼠日剂量的其组制剂。
在给予测试制剂之前半小时获取血液。于11∶30A.M.给动物注射所述制剂样品。通过在尾部刻痕(未麻醉)取血。在冰上短暂贮存样品，然后离心，并用Beckman Ⅱ葡萄糖分析仪测定葡萄糖。恰好在给予测试制剂之前以及给予测试制剂之后2、4、6、8、12、16、20和24小时时获取血液样品。考虑到由低于200mg/dL的血液葡萄糖水平指示的合适的控制，所述制剂提供约9.5小时(Humulin UL)、约12小时(Iletin U)、约15.5小时(本发明)、约20.5小时(100％B29-Nε-辛酰基-人胰岛素)和约21.5小时(PZI)的控制。因此，本发明的微晶制剂控制血液葡萄糖的时间比Humulin UL和Iietin U获得的时间长，而比用或者100％B29-Nε-辛酰基-人胰岛素微晶制剂或者PZI制剂获得的时间短。
                        实验4
            无定形沉淀在大鼠中的时间作用
在BBDP/Wor大鼠中测试如制备19中所述制备的包含1∶3胰岛素∶B29-Nε-辛酰基-人胰岛素、1∶3胰岛素∶B29-Nε-辛酰基-Lys(B28)，Pro(B29)-人胰岛素和1∶3胰岛素∶B29-Nε-壬酰基-人胰岛素的无定形沉淀制剂。所有制剂均以0.9U/100g体重的剂量皮下给予。
将BBDP/Wor雄性大鼠[4-5月龄，维持长效胰岛素(PZI)]随机分配为5个实验组-A、B、C、D和E。组A(n=7)用U40NPH(HumulinN)制剂处理。组B(n=8)用1∶3胰岛素∶B29-Nε-辛酰基-人胰岛素的U42.4制剂处理。组C(n=8)用1∶3胰岛素∶B28-Nε-辛酰基-Lys(B28)，Pro(B29)-人胰岛素的U42.6制剂处理。组D(n=8)用1∶3胰岛素∶B29-Nε-壬酰基-人胰岛素的U42.7制剂处理。组E用U40牛-猪PZI胰岛素(PZI)处理。
在给予测试制剂之前半小时获取血液。于11∶30A.M.给动物皮下注射所述测试制剂(0.9U/100g体重)。通过在尾部刻痕(未麻醉)取血。在冰上短暂贮存样品，然后离心，并用市售葡萄糖分析仪测定葡萄糖。恰好在给予测试制剂之前以及给予测试制剂之后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24小时时获取血液样品。考虑到由低于200mg/dL的血液葡萄糖水平指示的合适的控制，所述制剂提供约7.5小时(1∶3胰岛素∶B28-Nε-辛酰基-Lys(B28)，Pro(B29)-人胰岛素)、约9小时(NPH)、约15.5小时(1∶3胰岛素∶B29-Nε-辛酰基-人胰岛素)、约16小时(1∶3胰岛素∶B29-Nε-壬酰基-人胰岛素)和约22.5小时(PZI)的控制。
在以上说明书中已经描述了本发明的原理、优选实施方案和操作模式。然而，在此计划保护的本发明不应被解释为限于所公开的具体形式，因为这些形式被认为是说明性的，而不是限制性的。本领域技术人员可以在不违背本发明精神的情况下，进行改变和变化。

Claims (83)

1．不溶性组合物，包含：
a)选自以下的蛋白：胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原；
b)选自以下的衍生化蛋白：衍生化胰岛素、衍生化胰岛素类似
物和衍生化胰岛素原；
c)络合化合物；
d)六聚物稳定化合物；和
e)二价阳离子。
2．权利要求1的组合物，所述组合物为无定形沉淀。
3．权利要求1的组合物，所述组合物为微晶。
4．权利要求3的组合物，其中所述微晶具有棒状形态。
5．权利要求3的组合物，其中所述微晶具有不规则形态。
6．权利要求1的组合物，其中所述衍生化蛋白选自：脂肪酸酰化胰岛素、脂肪酸酰化胰岛素类似物和脂肪酸酰化胰岛素原。
7．权利要求6的组合物，其中所述络合化合物为鱼精蛋白，所述六聚物稳定化合物为酚类防腐剂，而所述二价金属阳离子为锌。
8．权利要求1的组合物，其中所述衍生化蛋白选自脂肪酸酰化胰岛素和脂肪酸酰化胰岛素类似物。
9．权利要求8的组合物，其中所述络合化合物为鱼精蛋白，所述六聚物稳定化合物为酚类防腐剂，而所述二价金属阳离子为锌。
10．权利要求1的组合物，其中所述衍生化蛋白选自：酰化胰岛素、酰化胰岛素类似物和酰化胰岛素原。
11．权利要求1的组合物，其中所述衍生化蛋白选自：酰化胰岛素和酰化胰岛素类似物。
12．权利要求11的组合物，其中所述衍生化蛋白于其Lys-Nε氨基单酰化。
13．权利要求12的组合物，其中所述络合化合物为鱼精蛋白，其存在量为每3.5mg总蛋白约0.15mg至约0.5mg。
14．权利要求13的组合物，其中所述二价阳离子为锌，其存在量为每摩尔总蛋白约0.3摩尔至约0.7摩尔。
15．权利要求14的组合物，其中所述六聚物稳定化合物为酚类防腐剂，选自：苯酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和它们的混合物，其存在的比例至少为3摩尔酚类防腐剂对6摩尔总蛋白。
16．权利要求15的组合物，其中所述蛋白选自胰岛素和胰岛素类似物。
17．权利要求16的组合物，其中所述蛋白为胰岛素。
18．权利要求17的组合物，其中所述衍生化蛋白为于LysB29-Nε氨基单酰化的胰岛素。
19．权利要求18的组合物，其中所述衍生化蛋白为用直链饱和脂肪酸酰化的胰岛素。
20．权利要求19的组合物，其中所述直链饱和脂肪酸选自：正己酸、正庚酸、正辛酸、正壬酸和正癸酸。
21．权利要求20的组合物，其中所述蛋白和所述衍生化蛋白之间的摩尔比为约1∶9至约9∶1。
22．权利要求21的组合物，其中所述直链饱和脂肪酸选自：正己酸、正辛酸和正癸酸。
23．权利要求22的组合物，其中所述直链饱和脂肪酸选自正辛酸和正癸酸。
24．权利要求23的组合物，其中所述直链饱和脂肪酸为正辛酸。
25．权利要求24的组合物，其中所述蛋白和所述衍生化蛋白之间的摩尔比为约1∶3至约3∶1。
26．权利要求22的组合物，其中所述蛋白和所述衍生化蛋白之间的摩尔比为约1∶9至约1∶1。
27．权利要求16的组合物，其中所述蛋白为胰岛素类似物。
28．权利要求27的组合物，其中所述蛋白为LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。
29．权利要求27的组合物，其中所述蛋白为AspB28-人胰岛素类似物。
30．权利要求1的组合物，其中所述蛋白为胰岛素或胰岛素类似物，而所述衍生化蛋白为选自酰化胰岛素和酰化胰岛素类似物的酰化蛋白。
31．权利要求1的组合物，其中所述衍生化蛋白为用直链饱和脂肪酸于LysB29-Nε氨基单酰化的胰岛素。
32．权利要求31的组合物，其中所述直链饱和脂肪酸选自：正己酸、正庚酸、正辛酸、正壬酸和正癸酸。
33．权利要求32的组合物，其中所述衍生化蛋白选自：B29-Nε-己酰基-人胰岛素、B29-Nε-辛酰基-人胰岛素和B29-Nε-癸酰基-人胰岛素。
34．权利要求31的组合物，其中所述直链饱和脂肪酸选自：正十二碳酸、正十四碳酸和正十六碳酸。
35．权利要求1的组合物，其中所述衍生化蛋白于Lys-Nε氨基二酰化并且也于一个N末端Nα氨基酰化，且其中所述脂肪酸选自：正己酸、正庚酸、正辛酸、正壬酸和正癸酸。
36．权利要求1的组合物，其中所述衍生化蛋白用支链饱和脂肪酸酰化。
37．权利要求36的组合物，其中所述衍生化蛋白用最长支链中具有3-10个碳原子的支链饱和脂肪酸酰化。
38．权利要求1的组合物，其中所述衍生化蛋白为于Lys-Nε氨基用直链饱和脂肪酸单酰化的胰岛素类似物。
39．权利要求38的组合物，其中所述脂肪酸选自：正己酸、正庚酸、正辛酸、正壬酸和正癸酸。
40．权利要求38的组合物，其中所述衍生化蛋白为于Nε氨基用选自以下的脂肪酸单酰化的胰岛素类似物，脂肪酸为：正十二烷酸、正十四烷酸、和正十六烷酸。
41．权利要求38的组合物，其中所述衍生化蛋白选自：脂肪酸酰化动物胰岛素、脂肪酸酰化单体胰岛素、脂肪酸酰化缺失类似物和脂肪酸酰化pI变化的胰岛素类似物。
42．权利要求41的组合物，其中所述衍生化蛋白为脂肪酸酰化des(B30)-人胰岛素类似物、脂肪酸酰化LysB28，ProB29-人胰岛素类似物或脂肪酸酰化AspB28-人胰岛素类似物。
43．权利要求42的组合物，其中所述衍生化蛋白为脂肪酸酰化des(B30)-人胰岛素类似物。
44．权利要求43的组合物，其中所述衍生化蛋白为B29-Nε-肉豆蔻酰基-des(B30)-人胰岛素类似物。
45．权利要求42的组合物，其中所述衍生化蛋白为脂肪酸酰化LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。
46．权利要求45的组合物，其中所述衍生化蛋白为B28-Nε-肉豆蔻酰基-LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。
47．权利要求42的组合物，其中所述衍生化蛋白为脂肪酸酰化的AspB28-人胰岛素类似物。
48．权利要求1的组合物，其中所述蛋白和所述衍生化蛋白之间的摩尔比为约1∶9至约9∶1。
49．权利要求48的组合物，其中所述比率为约1∶3至约3∶1。
50．权利要求48的组合物，其中所述比率为约1∶9至约1∶1。
51．权利要求1的组合物，其中所述蛋白为胰岛素。
52．权利要求1的组合物，其中所述蛋白为胰岛素类似物。
53．权利要求52的组合物，其中所述蛋白为单体胰岛素类似物。
54．包括不溶相和溶液相的悬浮制剂，其中所述不溶相包含权利要求1的不溶性组合物，而溶液相包含水性溶剂。
55．权利要求54的悬浮制剂，其中所述溶液相还包含浓度约0.5mg/ml溶液至约6mg/ml溶液的酚类防腐剂、药学上可接受的缓冲剂和等渗剂。
56．权利要求54的悬浮制剂，其中所述溶液相还包含胰岛素、胰岛素类似物、衍生化胰岛素或衍生化胰岛素类似物。
57．权利要求56的悬浮制剂，其中所述溶液相包含胰岛素。
58．权利要求56的悬浮制剂，其中所述溶液相包含衍生化胰岛素。
59．权利要求56的悬浮制剂，其中所述溶液相包含胰岛素类似物。
60．权利要求56的悬浮制剂，其中所述胰岛素类似物为单体胰岛素类似物。
61．权利要求56的悬浮制剂，其中所述胰岛素类似物为LysB28，ProB29-人胰岛素类似物。
62．权利要求56的悬浮制剂，其中所述胰岛素类似物为AspB28-人胰岛素类似物。
63．权利要求54的悬浮制剂，其中所述溶液相还包含选自胰岛素和胰岛素类似物的蛋白以及选自衍生化胰岛素和衍生化胰岛素类似物的衍生化蛋白。
64．权利要求63的悬浮制剂，其中所述溶液相中的蛋白与所述不溶相中的蛋白相同，且其中所述溶液相中的衍生化蛋白与所述不溶相中的的衍生化蛋白相同。
65．权利要求54的悬浮制剂，其中所述不溶相基本上由无定形沉淀组成。
66．权利要求54的悬浮制剂，其中所述不溶相基本上由微晶组成。
67．权利要求54的悬浮制剂，其中所述不溶相包含无定形沉淀和微晶的混合物。
68．权利要求54的悬浮制剂，其中所述溶液相还包含锌和鱼精蛋白，其中所述悬浮制剂中锌与总蛋白之比为每摩尔总蛋白约5至约7摩尔锌原子，而所述悬浮制剂中鱼精蛋白与总蛋白之比为每mg总蛋白约0.25mg至约0.5mg。
69．治疗糖尿病的方法，包括将权利要求1的组合物给予需要其的患者，其给予量足以调节所述患者的血液葡萄糖水平。
70．治疗高血糖的方法，包括将权利要求54的组合物给予需要其的患者，其给予量足以调节所述患者的血液葡萄糖水平。
71．包含6个单体和锌的杂化六聚物组合物，其中至少一个单体选自：胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原，而至少一个单体选自：衍生化胰岛素、衍生化胰岛素类似物和衍生化胰岛素原。
72．包含锌蛋白六聚物和锌衍生化蛋白六聚物的混合六聚物组合物，其中所述锌蛋白六聚物包含锌和选自胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原的一种蛋白，且其中所述锌衍生化蛋白六聚物包含锌和选自衍生化胰岛素、衍生化胰岛素类似物和衍生化胰岛素原的一种衍生化蛋白。
73．制备权利要求1的不溶性组合物的方法，包括：
a)将蛋白、衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子
溶于水性溶剂中，所述水性溶剂的pH允许形成六聚物，和
b)加入络合化合物。
74．制备权利要求1的不溶性组合物的方法，包括：
a)将蛋白、衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子
溶于水性溶剂中，所述水性溶剂的pH不允许形成六聚物，和
b)将pH调至约6.8至约7.8；和
c)加入络合化合物。
75．制备权利要求1的不溶性组合物的方法，包括：
a)将蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，所述水性溶剂的pH允许形成六聚物；
b)单独地将衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，所述水性溶剂的pH允许形成六聚物；
c)将步骤a)和步骤b)的溶液充分混合在一起；和
d)将络合化合物加入到步骤c)产生的溶液中。
76．制备权利要求1的不溶性组合物的方法，包括：
a)将蛋白、六聚物稳定化合物、二价金属阳离子和络合化合物溶于水性溶剂中，其中在所得溶液的pH下不发生沉淀；
b)单独地将衍生化蛋白、六聚物稳定化合物、二价金属阳离子和络合化合物溶于水性溶剂中，其中在所得溶液的pH下不发生沉淀；
c)将步骤a)和步骤b)的溶液充分混合在一起；和
d)将步骤c)的溶液的pH调至发生沉淀的pH值。
77．制备权利要求1的不溶性组合物的方法，包括：
a)将蛋白、衍生化蛋白、六聚物稳定化合物、二价金属阳离子和络合化合物溶于水性溶剂中，其中在所得溶液的pH下不发生沉淀；
b)将步骤a)的溶液的pH调至发生沉淀的pH值。
78．制备权利要求1的不溶性组合物的方法，包括：
a)将蛋白、衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，其中当加入络合剂时在所得溶液的pH下不发生沉淀；
b)加入络合化合物；和
c)将步骤b)的溶液的pH调至发生沉淀的pH值。
79．制备权利要求1的不溶性组合物的方法，包括：
a)将蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，其中当加入络合化合物时在所得溶液的pH下不发生沉淀；
b)单独地将衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，其中当加入络合化合物时在所得溶液的pH下不发生沉淀；
c)将步骤a)和步骤b)的溶液充分混合在一起；
d)将络合化合物加入步骤c)的溶液中；和
e)将步骤d)的溶液的pH调至发生沉淀的pH值。
80．制备权利要求1的不溶性组合物的方法，包括：
a)将蛋白、衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，其中当加入络合化合物时在所得溶液的pH下不发生沉淀；
b)将步骤a)的溶液的pH调至加入络合化合物时发生沉淀的pH值；和
c)将络合化合物加入步骤b)的溶液中。
81．制备权利要求1的不溶性组合物的方法，包括：
a)将蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，其中当加入络合化合物时在所得溶液的pH下不发生沉淀；
b)单独地将衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，其中当加入络合化合物时在所得溶液的pH下不发生沉淀；
c)将步骤a)和步骤b)的溶液充分混合在一起；
d)将步骤c)的溶液的pH调至加入络合化合物时发生沉淀的pH值；和
e)将络合化合物加入步骤d)的溶液中。
82．制备杂化六聚物的方法，包括将蛋白、衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，所述水性溶剂的pH允许形成六聚物。
83．制备杂化六聚物的方法，包括：
a)将蛋白、衍生化蛋白、六聚物稳定化合物和二价金属阳离子溶于水性溶剂中，所述水性溶剂的pH不允许形成六聚物，和
b)将pH调至约6.8至约7.8。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102219851A (zh) * 2011-05-09 2011-10-19 甘李药业有限公司 甘精胰岛素结晶的制备方法
CN114096330A (zh) * 2020-06-02 2022-02-25 维白奥锤有限公司 金属相变化合物及其制备方法
WO2022073275A1 (zh) * 2020-10-10 2022-04-14 南京汉欣医药科技有限公司 一种门冬胰岛素30混悬液的制备方法

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA989644B (en) * 1997-10-24 2000-04-25 Lilly Co Eli Insoluble insulen compositions.
CO4970787A1 (es) * 1997-12-23 2000-11-07 Lilly Co Eli Composiciones insolubles de insulina y derivados de insulina que controlan la glucosa sanguinea
AU2001220765A1 (en) 2000-01-24 2001-07-31 Medtronic Minimed, Inc. Mixed buffer system for stabilizing polypeptide formulations
US6737401B2 (en) 2001-06-28 2004-05-18 Metronic Minimed, Inc. Methods of evaluating protein formulation stability and surfactant-stabilized insulin formulations derived therefrom
MXPA04001560A (es) 2001-08-28 2004-05-17 Lilly Co Eli Premezclas de glp-1 e insulina basal.
WO2003035099A1 (en) 2001-10-19 2003-05-01 Eli Lilly And Company Biphasic mixtures of glp-1 and insulin
WO2003053460A1 (en) * 2001-12-19 2003-07-03 Eli Lilly And Company Crystalline compositions for controlling blood glucose
AU2002359730A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-30 Smithkline Beecham Corporation Compositions and methods for altering glucose production
ATE496064T1 (de) 2002-05-07 2011-02-15 Novo Nordisk As Lösliche formulierungen, die monomeres insulin und acyliertes insulin enthalten
BR0317888A (pt) 2002-12-31 2005-12-06 Altus Pharmaceuticals Inc Cristais do hormÈnio do crescimento humano e processos para preparação dos mesmos
WO2004080481A1 (en) * 2003-03-13 2004-09-23 Novo Nordisk A/S Novel nph insulin preparations
EP1620465A2 (en) * 2003-04-29 2006-02-01 Eli Lilly And Company Insulin analogs having protracted time action
US20050054818A1 (en) * 2003-07-02 2005-03-10 Brader Mark Laurence Crystalline compositions for controlling blood glucose
BRPI0413276B8 (pt) * 2003-08-05 2021-05-25 Novo Nordisk As derivado de insulina, complexo de zinco do mesmo, e, composição farmacêutica
EP2626368B1 (en) * 2004-07-19 2016-12-21 Biocon Limited Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof
AU2014200247B2 (en) * 2004-07-19 2015-05-14 Biocon Limited Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof
PL373543A1 (pl) * 2005-03-10 2006-09-18 Instytut Biotechnologii i Antybiotyków Kompozycja farmaceutyczna zawierająca biosyntetyczny analog insuliny ludzkiej, oraz jej zastosowanie w terapii cukrzycy
EP1916997B1 (en) * 2005-08-05 2018-04-18 Amgen Inc. Stable aqueous protein pharmaceutical formulations and their preparation
WO2007026474A1 (ja) * 2005-08-29 2007-03-08 Ajinomoto Co., Inc. 栄養組成物
ES2371361T3 (es) * 2005-12-28 2011-12-30 Novo Nordisk A/S Composiciones que comprenden una insulina acilada y zinc y método de producción de dichas composiciones.
WO2007081824A2 (en) * 2006-01-06 2007-07-19 Case Western Reserve University Fibrillation resistant proteins
WO2007121318A2 (en) * 2006-04-12 2007-10-25 Emisphere Technologies, Inc. Formulations for delivering insulin
EP2049149B1 (en) 2006-07-31 2015-04-15 Novo Nordisk A/S Pegylated extended insulins
CN101541830A (zh) 2006-09-22 2009-09-23 诺沃-诺迪斯克有限公司 蛋白酶抗性的胰岛素类似物
WO2008043033A2 (en) 2006-10-04 2008-04-10 Case Western Reserve University Fibrillation-resistant insulin and insulin analogues
WO2008132224A2 (en) 2007-04-30 2008-11-06 Novo Nordisk A/S Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein
EP2167032B1 (en) * 2007-06-13 2019-08-07 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulation comprising an insulin derivative
AU2008313248B2 (en) * 2007-10-16 2012-04-26 Biocon Limited An orally administerable solid pharmaceutical composition and a process thereof
PT2597103T (pt) 2007-11-16 2017-02-08 Novo Nordisk As Composições farmacêuticas contendo insulina e um péptido insulinotrófico
WO2009112583A2 (en) 2008-03-14 2009-09-17 Novo Nordisk A/S Protease-stabilized insulin analogues
EP2910571B1 (en) 2008-03-18 2016-10-05 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
WO2009125423A2 (en) * 2008-04-07 2009-10-15 National Institute Of Immunology Compositions useful for the treatment of diabetes and other chronic disorder
US8993516B2 (en) * 2008-04-14 2015-03-31 Case Western Reserve University Meal-time insulin analogues of enhanced stability
WO2009132129A2 (en) * 2008-04-22 2009-10-29 Case Western Reserve University Isoform-specific insulin analogues
KR20120129875A (ko) 2008-07-31 2012-11-28 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 염소화 아미노산을 갖는 인슐린 유사체
US9200053B2 (en) 2008-07-31 2015-12-01 Case Western Reserve University Insulin analogues containing penta-fluoro-Phenylalanine at position B24
US20110171312A1 (en) * 2008-09-19 2011-07-14 Nektar Therapeutics Modified therapeutic peptides, methods of their preparation and use
BRPI0919946A2 (pt) * 2008-10-30 2016-02-16 Novo Nordisk As tratamento de diabetes melito usando injeções de insulina com frequência de injeção menor que diariamente
US8399407B2 (en) * 2009-09-17 2013-03-19 Case Western Reserve University Non-standard insulin analogues
CA2782056C (en) 2009-11-25 2021-03-09 Arisgen Sa Mucosal delivery of peptides
RU2012123642A (ru) 2009-12-11 2014-01-20 Кейз Вестерн Ризев Юнивесити Аналоги инсулина, содержащие хлорированные аминокислоты
RU2013123515A (ru) 2010-10-27 2014-12-10 Ново Нордиск А/С Лечение сахарного диабета с помощью инъекций инсулина, вводимых с различными интервалами
WO2012171994A1 (en) * 2011-06-15 2012-12-20 Novo Nordisk A/S Multi substituted insulins
CN104364260B (zh) 2012-04-11 2017-02-22 诺和诺德股份有限公司 胰岛素制剂
GB2513805B (en) * 2012-04-18 2020-04-01 Waters Technologies Corp Methods for quantifying polypeptides using mass spectrometry
AU2013255880B2 (en) * 2012-05-01 2017-07-20 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition
US9897565B1 (en) 2012-09-11 2018-02-20 Aseko, Inc. System and method for optimizing insulin dosages for diabetic subjects
US9171343B1 (en) 2012-09-11 2015-10-27 Aseko, Inc. Means and method for improved glycemic control for diabetic patients
EP2931301B2 (en) 2012-12-17 2021-09-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for purifying insulin and analogues thereof
WO2014096985A2 (en) * 2012-12-19 2014-06-26 Wockhardt Limited A stable aqueous composition comprising human insulin or an analogue or derivative thereof
CA2937532A1 (en) * 2013-01-22 2014-07-31 Case Western Reserve University N-terminal truncated insulin analogues
CN103145829B (zh) * 2013-03-29 2015-06-03 江苏诺泰制药有限公司 一种地特胰岛素的纯化方法
US10137172B2 (en) 2013-04-30 2018-11-27 Novo Nordisk A/S Administration regime
ES2676065T3 (es) 2013-10-07 2018-07-16 Novo Nordisk A/S Nuevo derivado de un análogo de la insulina
US9486580B2 (en) 2014-01-31 2016-11-08 Aseko, Inc. Insulin management
US9233204B2 (en) 2014-01-31 2016-01-12 Aseko, Inc. Insulin management
AR099569A1 (es) 2014-02-28 2016-08-03 Novo Nordisk As Derivados de insulina y los usos médicos de estos
KR102569743B1 (ko) 2014-10-06 2023-08-23 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 이상 단일 사슬 인슐린 유사체
WO2016069475A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Aseko, Inc. Subcutaneous outpatient management
US11081226B2 (en) 2014-10-27 2021-08-03 Aseko, Inc. Method and controller for administering recommended insulin dosages to a patient
US9886556B2 (en) 2015-08-20 2018-02-06 Aseko, Inc. Diabetes management therapy advisor
MA49116A (fr) 2016-12-16 2020-03-25 Novo Nordisk As Compositions pharmaceutiques contenant de l'insuline
US10335464B1 (en) 2018-06-26 2019-07-02 Novo Nordisk A/S Device for titrating basal insulin

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2538018A (en) 1944-04-04 1951-01-16 Nordisk Insulinlab Crystalline product of insulin and alkaline protein and process of making it
US2801953A (en) 1952-02-28 1957-08-06 Hoechst Ag Process of preparing crystallized insulin preparations
US2849370A (en) 1953-06-04 1958-08-26 Novo Terapeutisk Labortorium A Injectable insulin preparations with protracted effect and process of producing same
US3102077A (en) 1953-08-19 1963-08-27 Christensen Henry Marinus Preparation of insulin containing 2.75 to 8 percent zinc content
US3060093A (en) 1957-07-18 1962-10-23 Nordisk Insulinlab Slowly acting insulin preparation in crystalline form and method of preparation
US3012077A (en) * 1960-03-11 1961-12-05 Union Carbide Corp Process for the production of organo sulfur compounds
DE1793517C3 (de) 1968-09-28 1974-12-05 Farbwerke Hoechst Ag, Vormals Meister Lucius & Bruening, 6000 Frankfurt N(Al),N(B29>Bis-(tert.-butyloxycarbonyl)-insulin und Verfahren zu seiner Herstellung
US3950517A (en) 1970-05-08 1976-04-13 National Research Development Corporation Insulin derivatives
US3869437A (en) 1970-05-08 1975-03-04 Nat Res Dev Mono-, di, and N{HD A1{B , N{HU B1{B , N{HU B29{B -tri-acylated insulin
GB1381274A (en) 1971-01-28 1975-01-22 Nat Res Dev Insulin derivatives
US3868358A (en) 1971-04-30 1975-02-25 Lilly Co Eli Protamine-insulin product
US3864325A (en) 1971-11-18 1975-02-04 Nat Res Dev (N{HU Al{b , N{HU Bl{b , N{HU B29{B , carbamoyl)-(O{HU A14{B , O{HU B16{B , O{HU B26{B aryl) insulin derivatives
US3907763A (en) 1972-03-01 1975-09-23 Bayer Ag Insulin derivatives crosslinked by a dicarboxylic acid moiety
US4183849A (en) 1975-01-15 1980-01-15 Nordisk Insulinlaboratorium Therapeutic insulin preparation and a process for the production of a stable insulin preparation with protracted effect
JPS55138391A (en) 1979-04-13 1980-10-29 Shionogi & Co Ltd New synthetic method of peptide derivative
JPS55138393A (en) 1979-04-13 1980-10-29 Shionogi & Co Ltd Semisynthesis of insulin
US4343898A (en) 1980-02-11 1982-08-10 Novo Industri A/S Process for preparing esters of human insulin
DE3101382A1 (de) 1981-01-17 1982-09-02 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten"
DK353781A (da) 1981-08-10 1983-02-11 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af insulinderivater
US4601979A (en) 1981-09-15 1986-07-22 Nordisk Insulinlaboratorium Process for preparing human insulin or B-30 esters thereof
DE3326473A1 (de) 1983-07-22 1985-01-31 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Pharmazeutisches mittel zur behandlung des diabetes mellitus
DE3327709A1 (de) 1983-07-29 1985-02-07 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Insulin-derivat-kristallsuspensionen, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung
PH25772A (en) 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
DE3717370A1 (de) 1987-05-22 1988-12-01 Hoechst Ag Mischkristalle aus insulin und insulinderivaten, verfahren zur herstellung dieser mischkristalle, diese mischkristalle enthaltende pharmazeutische mittel und ihre verwendung zur behandlung von diabetes mellitus
JPH01254699A (ja) 1988-04-05 1989-10-11 Kodama Kk インスリン誘導体及びその用途
EP0425482B1 (en) 1988-07-20 1993-08-18 Novo Nordisk A/S Human insulin analogs and preparations containing them
JPH04502465A (ja) 1988-12-23 1992-05-07 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ ヒトインシュリン類似物質
US5514646A (en) 1989-02-09 1996-05-07 Chance; Ronald E. Insulin analogs modified at position 29 of the B chain
NZ232375A (en) 1989-02-09 1992-04-28 Lilly Co Eli Insulin analogues modified at b29
DK134189D0 (da) 1989-03-20 1989-03-20 Nordisk Gentofte Insulinforbindelser
AT400337B (de) * 1990-05-02 1995-12-27 Plasser Bahnbaumasch Franz Gleisstopfmaschine mit in gleisquerrichtung verstellbaren stopfeinheiten
DK72793D0 (da) 1993-06-21 1993-06-21 Novo Nordisk As Nyt produkt
DK0705275T3 (da) 1993-06-21 1999-09-20 Novo Nordisk As AspB28-insulin-krystaller
US5534488A (en) * 1993-08-13 1996-07-09 Eli Lilly And Company Insulin formulation
BR9407508A (pt) 1993-09-17 1997-01-07 Novo Nordisk As Derivado de insulina composição farmaceutica e processo para o tratamento de diabete em um paciente com necessidade deste tratamento
US5474978A (en) 1994-06-16 1995-12-12 Eli Lilly And Company Insulin analog formulations
US5461031A (en) 1994-06-16 1995-10-24 Eli Lilly And Company Monomeric insulin analog formulations
US5597893A (en) 1994-10-31 1997-01-28 Eli Lilly And Company Preparation of stable insulin analog crystals
AU720966B2 (en) 1995-03-17 2000-06-22 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
US5700904A (en) 1995-06-07 1997-12-23 Eli Lilly And Company Preparation of an acylated protein powder
US5877153A (en) 1996-06-11 1999-03-02 Commonwealth Biotechnologies Inc. Heparin-binding peptides
US5948751A (en) 1996-06-20 1999-09-07 Novo Nordisk A/S X14-mannitol
DE69737995T2 (de) 1996-06-20 2008-04-24 Novo Nordisk A/S INSULINPREPARATION MIT MAnnitol
ES2242270T3 (es) 1997-02-07 2005-11-01 Novo Nordisk A/S Cristalizacion de proteinas.
US5898028A (en) 1997-03-20 1999-04-27 Novo Nordisk A/S Method for producing powder formulation comprising an insulin
CN1276731A (zh) 1997-10-24 2000-12-13 伊莱利利公司 不溶性胰岛素组合物
ZA989744B (en) 1997-10-31 2000-04-26 Lilly Co Eli Method for administering acylated insulin.
CO4970787A1 (es) * 1997-12-23 2000-11-07 Lilly Co Eli Composiciones insolubles de insulina y derivados de insulina que controlan la glucosa sanguinea

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102219851A (zh) * 2011-05-09 2011-10-19 甘李药业有限公司 甘精胰岛素结晶的制备方法
CN114096330A (zh) * 2020-06-02 2022-02-25 维白奥锤有限公司 金属相变化合物及其制备方法
WO2022073275A1 (zh) * 2020-10-10 2022-04-14 南京汉欣医药科技有限公司 一种门冬胰岛素30混悬液的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
BR9814471A (pt) 2000-10-10
EP0925792A2 (en) 1999-06-30
NO20003269L (no) 2000-08-23
ID25476A (id) 2000-10-05
EA200000708A1 (ru) 2000-12-25
ATE264690T1 (de) 2004-05-15
CA2315300A1 (en) 1999-07-01
TR200001935T2 (tr) 2000-12-21
HUP0100243A3 (en) 2001-09-28
NZ505091A (en) 2002-11-26
DZ2691A1 (fr) 2003-03-29
HRP20000427A2 (en) 2001-06-30
IL136724A0 (en) 2001-06-14
AR019807A1 (es) 2002-03-20
EA003394B1 (ru) 2003-04-24
EP0925792A3 (en) 2001-09-12
KR20010024799A (ko) 2001-03-26
EP0925792B1 (en) 2004-04-21
JP2001526225A (ja) 2001-12-18
PL341300A1 (en) 2001-04-09
US20030144181A1 (en) 2003-07-31
NO20003269D0 (no) 2000-06-22
PE20000106A1 (es) 2000-02-09
AU2008899A (en) 1999-07-12
DE69823319D1 (de) 2004-05-27
CO4970787A1 (es) 2000-11-07
US6531448B1 (en) 2003-03-11
WO1999032116A1 (en) 1999-07-01
HUP0100243A2 (hu) 2001-08-28

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