一种地特胰岛素的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种地特胰岛素的纯化方法,属于生物化学、药物化学领域。
背景技术
糖尿病是全球范围内威胁人类健康的一大疾病。在中国,随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加快,糖尿病的患病率呈快速上升趋势,在2010年中国糖尿病患者总数已突破9000万人。糖尿病的急慢性并发症,尤其是慢性并发症累计多个器官,致残、致死率高,严重影响患者的身心健康,并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。
所有Ⅰ型糖尿病患者都须接受胰岛素治疗,大多数Ⅱ型糖尿病患者随着病程进展,最终也须使用胰岛素控制血糖。现有证据表明,糖尿病患者一旦具有开始胰岛素治疗的指征,就应尽早启动胰岛素治疗,这样可以使血糖得到更持续、稳定、良好的控制,在很大程度上减少并发症的发生。
然而,频繁地注射胰岛素,给糖尿病患者带来诸多不便和痛苦,临床上需要注射间隔时间更长的长效胰岛素。近年来,随着胰岛素技术的不断发展,人们开发出了具有不同作用时间的新一代胰岛素及胰岛素类似物。其中长效胰岛素类似物正在越来越多地被医生和患者所接受和使用。理想的胰岛素替代治疗应尽可能模拟健康人群生理状态下的胰岛素分泌模式,长效胰岛素的理想效果是通过尽可能少的胰岛素注射次数,在糖尿病患者体内重建胰岛素基础分泌,而地特胰岛素正是这样一种模拟生理模式的基础胰岛素类似物。
地特胰岛素是诺沃挪第克公司利用基因工程重组人胰岛素研制的一种新型长效可溶(避免了非溶性胰岛素的常见副作用)胰岛素类似物。它的结构式如下:
即在去掉了B30位氨基酸残基的人胰岛素类似物的B29位Lys的ε-氨基连接了一个十四烷基脂肪酸(肉豆蔻酸)侧链,其中去B30重组人胰岛素和十四烷基脂肪酸(肉豆蔻酸)侧链以酰胺键的形式相连。
在现有技术中,地特胰岛素及其它脂肪酸链修饰的胰岛素类似物的制备纯化基本上都是采用了反相高效液相色谱的方式。伊莱利利公司(中国专利CN95196266.3)公开了一种采用C4反相高效色谱柱的纯化方式;康久化学生物技术公司(中国专利,CN200480021270.5)公开了一种采用phenomenex luna phenyl-hexyl反相色谱柱的纯化方式;从已有的文献资料可以看到通过反相高效液相色谱的纯化能够得到产品,但是这种纯化方式对于设备的要求较高,需要整套能够耐受高压的色谱系统,而且制备过程中会使用大量的乙腈等有机试剂,成本较高而且不环保;样品在反相制备柱上的吸附较强,导致回收率不高,且容易对反相制备柱造成不可逆的损坏。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本更低、回收率更高、操作更方便的地特胰岛素的纯化方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种地特胰岛素的纯化方法,其特点是:所述的原料是由去B30的重组人胰岛素和十四烷基脂肪酸-N-琥珀酰亚胺酯一步反应制得的地特胰岛素溶液;纯化采用离子交换层析方法进行,其步骤如下:
(1)采用氯化钠浓度低于50mM、pH值为2-4的酸性缓冲液平衡阳离子交换柱4.5-5.5CV,并用前述酸性缓冲液或用同体系的稀酸将地特胰岛素溶液调节至pH值<5,得样品溶液;
(2)将样品溶液上到阳离子交换柱上,此时十四烷基脂肪酸-N-琥珀酰亚胺酯不挂柱,会流穿出来,然后用平衡缓冲液冲洗阳离子交换柱2.5-3.5CV;
(3) 采用氯化钠浓度为0.5-1.0M 、pH值为2-4的酸性缓冲液线性梯度洗脱的方式将吸附在柱子上的各种物质依次洗脱下来,收集主峰即得目的产物地特胰岛素。
本发明所述的地特胰岛素的纯化方法中,进一步优选的技术方案或者技术特征是:
1.所述的酸性缓冲溶液的pH值优选为3-3.5。
2.所述的酸性缓冲溶液优选为醋酸钠缓冲液或柠檬酸钠缓冲液。
3.步骤(1)所述酸性缓冲溶液优选为氯化钠浓度是10-50mM的醋酸钠缓冲液或柠檬酸钠缓冲液。最优选的缓冲溶液是的10mM pH3.0的柠檬酸钠缓冲液。
4.离子交换层析使用的离子交换树脂优选自SP Sepharose F.F.、SP Sepharose H.P.、S Sepharose F. F.、Capto S、Source 15S、Source 30S或Capto SP ImpRes。
本发明地特胰岛素的纯化方法,是利用在地特胰岛素的合成粗品中,去B30重组人胰岛素和脂肪酸修饰剂反应生成的各种修饰产物以及原料在特定的溶液体系下带电荷数目等性质的差异来进行纯化的。
合成去B30胰岛素脂肪酰化修饰物的方法在本领域内是已知的,例如可以参见中国专利CN95196266.3中公开的方法。
本发明采用的地特胰岛素粗品是由去B30重组人胰岛素和十四烷基脂肪酸-N-琥珀酰亚胺酯在碱性条件溶液中一步反应得到的。反应后的目的产物(即地特胰岛素)为十四烷基脂肪酸-N-琥珀酰亚胺酯与去B30重组人胰岛素的B29-Lys的ε-氨基反应并以酰胺键相连形成的产物,其他的修饰产物(如多个脂肪酸链修饰产物)和未完全反应的原料(十四烷基脂肪酸-N-琥珀酰亚胺酯和去B30重组人胰岛素)等为杂质。
结合离子交换层析的原理分析,我们发现可以利用上述各种物质的裸露氨基的数目不同来进行分离纯化。地特胰岛素的粗品溶液中的以上各种物质由于本身结构或者被修饰氨基数目的差异而显现出在酸性pH的溶液体系下的带正电荷情况的明显差异,更近一步导致它们和阳离子交换树脂的吸附力有着明显的不同。原料之一的十四烷基脂肪酰-N-琥珀酰亚胺酯不带电荷;多修饰产物的多个氨基都连接有脂肪链且修饰剂的电荷屏蔽较强,带正电荷较少;而目的产物只有一个氨基连接了一个脂肪链,带正电荷较多;去B30重组人胰岛素的裸露氨基是最多的,因此它带的正电荷最多。
从上述纯化过程中可以看出,采用离子交换层析的方法纯化地特胰岛素,相对于之前大多数工艺的制备方法具有操作方便,上样量大等优势;本发明方法中样品和填料的非特异性吸附较少,样品的回收率和纯度高;本发明所用的纯化方法中的色谱填料和纯化系统都是低压规格的,不需要使用昂贵的精细填料和高压系统,而且流动相大多数为低浓度的盐类溶液和纯化水,相对于之前其他工艺常用的反相色谱等方法用到大量的色谱纯有机试剂而言,既大量节省成本,又经济环保。
附图说明
图1为地特胰岛素的粗品分析图谱;
图2为地特胰岛素的阳离子交换层析图谱;
图3为地特胰岛素的纯品分析图谱。
具体实施方式
以下结合具体的实施方法详细描述本发明的构思,所有的实施例描述无论多么的详细和具体,都不意味着对本发明的范围的限制,本发明保护的范围由权利要求的法律结构唯一确定。所有的实验操作,除非特别说明均按照本领域技术人员常用的方法进行。
实施例1, 一种地特胰岛素的纯化方法,所述的原料是由去B30的重组人胰岛素和十四烷基脂肪酸-N-琥珀酰亚胺酯一步反应制得的地特胰岛素溶液;纯化采用离子交换层析方法进行,其步骤如下:
(1)采用氯化钠浓度低于50mM、pH值为2的酸性缓冲液平衡阳离子交换柱4.5CV;并用前述酸性缓冲液或用同体系的稀酸将地特胰岛素溶液调节至pH值<5,得样品溶液;
(2)将样品溶液上到阳离子交换柱上,此时十四烷基脂肪酸-N-琥珀酰亚胺酯不挂柱,会流穿出来,然后用平衡缓冲液冲洗阳离子交换柱2.5CV;
(3) 采用氯化钠浓度为0.5M 、pH值为2的酸性缓冲液线性梯度洗脱的方式将吸附在柱子上的各种物质依次洗脱下来,收集主峰即得目的产物地特胰岛素。
实施例2, 一种地特胰岛素的纯化方法,所述的原料是由去B30的重组人胰岛素和十四烷基脂肪酸-N-琥珀酰亚胺酯一步反应制得的地特胰岛素溶液;纯化采用离子交换层析方法进行,其步骤如下:
(1)采用氯化钠浓度低于50mM、pH值为4的酸性缓冲液平衡阳离子交换柱5.5CV;并用前述酸性缓冲液或用同体系的稀酸将地特胰岛素溶液调节至pH值<5,得样品溶液;
(2)将样品溶液上到阳离子交换柱上,此时十四烷基脂肪酸-N-琥珀酰亚胺酯不挂柱,会流穿出来,然后用平衡缓冲液冲洗阳离子交换柱3.5CV;
(3) 采用氯化钠浓度为1.0M 、pH值为4的酸性缓冲液线性梯度洗脱的方式将吸附在柱子上的各种物质依次洗脱下来,收集主峰即得目的产物地特胰岛素。
实施例3, 一种地特胰岛素的纯化方法,所述的原料是由去B30的重组人胰岛素和十四烷基脂肪酸-N-琥珀酰亚胺酯一步反应制得的地特胰岛素溶液;纯化采用离子交换层析方法进行,其步骤如下:
(1)采用氯化钠浓度为10mM、pH值为3的酸性缓冲液平衡阳离子交换柱5CV;并用前述酸性缓冲液或用同体系的稀酸将地特胰岛素溶液调节至pH值<5,得样品溶液;
(2)将样品溶液上到阳离子交换柱上,此时十四烷基脂肪酸-N-琥珀酰亚胺酯不挂柱,会流穿出来,然后用平衡缓冲液冲洗阳离子交换柱3CV;
(3) 采用氯化钠浓度为0.8M 、pH值为3的酸性缓冲液线性梯度洗脱的方式将吸附在柱子上的各种物质依次洗脱下来,收集主峰即得目的产物地特胰岛素。
实施例4, 一种地特胰岛素的纯化方法,所述的酸性缓冲溶液的pH值为3.5;所述的酸性缓冲溶液为醋酸钠缓冲液或柠檬酸钠缓冲液。其余均与实施例3相同。
实施例5,实施例1-4所述的地特胰岛素的纯化方法中,离子交换层析使用的离子交换树脂选自SP Sepharose F.F.、SP Sepharose H.P.、S Sepharose F. F.、Capto S、Source 15S、Source 30S或Capto SP ImpRes。
实施例6,地特胰岛素的纯化实验一:
地特胰岛素样品反应液(粗品纯度78%,见图1)为200ml,待反应结束后,采用稀醋酸将反应液pH调节至4.0;并配制1000ml的20mM pH4.0 NaAc缓冲液(Buffer A),500ml的20mM pH 4.0 NaAc+1M NaCl缓冲液(Buffer B);制备柱采用柱床体积为20ml的SP Sepharose H.P.(GE Healthcare)阳离子交换柱,基本纯化过程如下:
1.Buffer A: 20mM NaAc pH4.0平衡柱子5CV;
2.样品的粗品溶液上柱;
3.Buffer A: 20mM NaAc pH4.0冲洗柱子3CV;
4.Buffer B和Buffer A以线性梯度方式洗脱;
洗脱时收集主峰(纯化图谱见图2),即为地特胰岛素纯品,纯度为97.5%(见图3),收率约为93%。
实施例7,地特胰岛素的纯化实验二:
地特胰岛素样品反应液为150ml(粗品纯度76%),待反应结束后,采用稀柠檬酸溶液将反应液pH调节至3.5;并配制1000ml的10mM pH3.5 柠檬酸钠缓冲液(Buffer C),500ml的10mM pH3.5 柠檬酸钠+1M NaCl缓冲液(Buffer D);制备柱采用柱床体积为18ml的SP Sepharose F.F.(GE Healthcare)阳离子交换柱,基本纯化过程如下:
1.Buffer C: 10mM pH3.5 柠檬酸钠缓冲液平衡柱子5CV;
2.样品溶液上柱;
3.Buffer C:10mM pH3.5 柠檬酸钠缓冲液冲洗柱子3CV;
4.Buffer D和Buffer C以线性梯度方式洗脱。
洗脱时收集主峰,即为地特胰岛素纯品(纯度97.2%),收率约为92%。
实施例8,地特胰岛素的纯化实验三:
地特胰岛素样品反应液为160ml(粗品纯度71%),待反应结束后,采用稀柠檬酸溶液将反应液pH调节至3.5;并配制1000ml的10mM pH3.5 柠檬酸钠缓冲液(Buffer C),500ml的10mM pH3.5 柠檬酸钠+1M NaCl缓冲液(Buffer D);制备柱采用柱床体积为20ml的Capto SP ImpRes(GE Healthcare)阳离子交换柱,基本纯化过程如下:
1.Buffer C: 10mM pH3.5 柠檬酸钠缓冲液平衡柱子5CV;
2.样品溶液上柱;
3.Buffer C:10mM pH3.5 柠檬酸钠缓冲液冲洗柱子3CV;
4.Buffer D和Buffer C以线性梯度方式洗脱;
洗脱时收集主峰,即为地特胰岛素纯品(纯度98.5%),收率约为91%。
实施例9,地特胰岛素的纯化实验四:
地特胰岛素样品反应液为180ml(粗品纯度70%),待反应结束后,采用稀柠檬酸溶液将反应液pH调节至3.5;并配制1000ml的10mM pH3.5 柠檬酸钠缓冲液(Buffer C),500ml的10mM pH3.5 柠檬酸钠+1M NaCl缓冲液(Buffer D);制备柱采用柱床体积为16ml的SP Sepharose H.P.(GE Healthcare)阳离子交换柱,基本纯化过程如下:
1.Buffer C: 10mM pH3.5 柠檬酸钠缓冲液平衡柱子5CV;
2.样品溶液上柱;
3.Buffer C:10mM pH3.5 柠檬酸钠缓冲液冲洗柱子3CV;
4.Buffer D和Buffer C以线性梯度方式洗脱;
洗脱时收集主峰,即为地特胰岛素纯品(纯度98.1%),收率约为95%。
实施例10,地特胰岛素的纯化实验五:
地特胰岛素样品反应液为120ml(粗品纯度73%),待反应结束后,采用稀柠檬酸溶液将反应液pH调节至3.0;并配制1000ml的20mM pH3.0柠檬酸钠缓冲液(Buffer E),500ml的10mM pH3.0 柠檬酸钠+1M NaCl缓冲液(Buffer F);制备柱采用柱床体积为15ml的Source 30S(GE Healthcare)阳离子交换柱,基本纯化过程如下:
1.Buffer E: 20mM pH3.0柠檬酸钠缓冲液平衡柱子5CV;
2.样品溶液上柱;
3.Buffer E: 20mM pH3.0柠檬酸钠缓冲液冲洗柱子3CV;
4.Buffer F和Buffer E以线性梯度方式洗脱;
洗脱时收集主峰,即为地特胰岛素纯品(纯度98.7%),收率约为90%。
实施例11,地特胰岛素的纯化实验六:
地特胰岛素样品反应液为100ml(粗品纯度75%),待反应结束后,采用稀醋酸将反应液pH调节至4.0;并配制1000ml的20mM pH4.0 NaAc缓冲液(Buffer A),500ml的20mM pH 4.0 NaAc+1M NaCl缓冲液(Buffer B);制备柱采用柱床体积为15ml的Capto S(GE Healthcare)阳离子交换柱,基本纯化过程如下:
1.Buffer A: 20mM NaAc pH4.0平衡柱子5CV;
2.样品溶液上柱;
3.Buffer A: 20mM NaAc pH4.0冲洗柱子3CV;
4.Buffer B和Buffer A以线性梯度方式洗脱;
洗脱时收集主峰,即为地特胰岛素纯品(纯度97.1%),收率约为93%。