HRP20000427A2 - Insoluble compositions for controlling blood glucose - Google Patents

Description

Pozadina izuma

1. Područje izuma. Ovaj izum spada u područje humane medicine. Preciznije, ovaj izum spada u područje farmaceutskog liječenja dijabetesa i hiperglikemije.

2. Opis srodne problematike. Već duže vrijeme cilj inzulinske terapije bio je pronaći način koji bi oponašao endogeno ispuštanje inzulina kao kod zdravih ljudi. Dnevne fiziološke potrebe za inzulinom fluktuiraju, te se stoga mogu podijeliti u dvije faze: (a) faza apsorpcije u kojoj se količina inzulina podešava s obzirom na promjenu koncentracije glukoze u krvi koja je posljedica uzimanja hrane, te (b) faza nakon apsorpcije koja zahtijeva neprekidno dopremanje inzulina kako bi se regulirala proizvodnja glukoze u jetri što omogućava održavanje optimalnog nivoa glukoze u krvi za vrijeme gladovanja.

Kod dijabetičara učinkovita terapija općenito uključuje kombiniranu uporabu dvije vrste pripravaka koji sadrže egzogene inzuline: terapija brzodjelujućeg inzulin koji se daje za vrijeme obroka u obliku injekcija, te terapija koja sadržava tzv. bazalni inzulin s produženim djelovanjem, koji se daje u obliku injekcija jedan do dva puta na dan, u svrhu kontroliranja razinu glukoze u krvi između obroka. Idealni bazalni inzulin omogućit će produljeno i “ujednačeno” djelovanje što znači da će kontrolirati razinu glukoze u periodu od barem 12 sati, odnosno još bolje u periodu od 24 sata ili više, pri čemu ne postoji značajniji rizik od hipoglikemije. Nadalje, idealni bazalni inzulin trebao bi se miješati s topljivim inzulinom koji se daje za vrijeme obroka, te ne bi trebao prouzročiti iritaciju ili reakciju na mjestu primjene terapije. Konačno, pacijent bi trebao biti u stanju ujednačeno resuspendirati bazalni inzulin na licu mjesta prije same primjene.

Pripravci koji sadržavaju inzulin s produženim djelovanjem dobiveni su preradom običnog inzulina u mikrokristaliničnu suspenziju namijenjenu za subkutanu primjenu. Primjeri komercijalnih pripravaka koji sadržavaju bazalni inzulin su NPH (Neutral Protamine Hagedorn) inzulini, protamin-cink inzulini (PZI) i ultralente (UL).

Rane verzije današnjeg komercijalnog NPH inzulina, koje su sadržavale višak protamina, razvijene su tijekom tridesetih godina dvadesetog stoljeća (Scott i suradnici, J. Pharmacol. Exp. Ther. 58 : 78, et seq. (1936)). 1946. godine Krayenbuhl i suradnici razvili su NPH inzulin s izofanim omjerom inzulina i protamina (Rep. Steno. Mem. Hosp. Nord. Insulinlab. 1 : 60, et seq. (1946). Spomenuti istraživači pronašli su da ako se inzulin i protamin kombiniraju u tzv. izofanom omjeru kod neutralnog pH, uz prisustvo cinka i fenolnog spoja, nastaje amorfni talog iz kojeg stajanjem nastaju ovalni, tetragonalni kristali s piramidalnim krajevima. Ti kristali spadaju u skupinu prutićastih kristala. Izofani odnos protamin-sulfata i inzulina iznosi 0,09 µg protamin-sulfata po miligramu inzulina. Minimalna potrebna količina cinka iznosi 3,5 µg po miligramu inzulina. Fenolni spoj mora biti prisutan u koncentraciji višoj od 0,1 %.

NPH inzulin je najčešće korišteni inzulinski pripravak. Na njega otpada 50 do 70 % svjetske potrošnje. NPH inzulin je suspenzija mikrokristaliničnog kompleksa inzulina, cinka, protamina, te jednog ili više fenolnih konzervansa. Pripravci NPH inzulina koji su komercijalno dostupni sadržavaju humani inzulin, goveđi inzulin svinjski inzulin, te njihove smjese.

Također su poznati pripravci koji nalikuju NPH pripravcima, a sadržavaju monomerni analog inzulina, te LysB298, ProB29 analog humanog inzulina (čija je kratica NPL; M. R. De Felippis U.S. Patent br. 5, 461, 031, objavljen 24. listopada 1995.; M. R. De Felippis U.S. Patent br. 5, 650, 486, objavljen 22. srpnja 1997.; M. R. De Felippis U.S. Patent br. 5, 747, 642, objavljen 5. svibnja 1998.). Opće prihvaćena činjenica je da NPH inzulin omogućava dulju kontrolu glukoze u krvi u usporedbi s običnim inzulinom jer prije nego što dođe do apsorpcije inzulina, mora doći do njegovog otpuštanja iz mikrokristala NPH inzulina. Kod običnih inzulina nije potrebno nikakvo otpuštanje prije apsorpcije. Kod NPH inzulina otpuštanje je stupanj koji kontrolira brzinu reakcije pri mjerenju farmakodinamike i farmakokinetike.

Mikrokristali NPH inzulina imaju specifičnu prutićastu morfologiju čije su tipične dimenzije: duljina 5 mikrona : visina 1 mikron : širina 1 mikron. Produljeno djelovanje mikrokristala NPH inzulina uvjetovano je njihovom slabom apsorpcijom na mjestima subkutane primjene.

Terapija koja koristi trenutno dostupne pripravke koji sadržavaju NPH inzulin ne uspijeva osigurati idealno ujednačenu farmakokinetiku potrebnu za održavanje razine glukoze u krvi za vrijeme gladovanja u dužem vremenskom periodu između obroka. Kao posljedica navedenog, liječenje NPH inzulinom može dovesti do neželjeno visoke količine inzulina u krvi što može prouzrokovati takav oblik hipoglikemije koji je opasna po život.

Osim što ne uspijeva osigurati idealno ujednačeni farmakokinetički profil, ni sama duljina djelovanja nije idealna. Najveći problem vezan uz NPH terapiju je tzv. “fenomen slabosti” kojeg uzrokuje hiperglikemija nastala zbog neučinkovite kontrole glukoze tijekom noći za vrijeme sna. Navedeni nedostaci u kontroli glukoze u krvi doprinose ozbiljnim dugotrajnim medicinskim komplikacijama kao što su dijabetes, te uzrokuju znatne poteškoće u životu pacijenta.

Protamin-cink-inzulin (PZI) ima slični sastav kao NPH, ali sadržava veće količine protamina i cinka u odnosu na NPH. PZI pripravci mogu biti pripravljeni kao amorfni talozi srednje dugog djelovanja ili kao kristalinične tvari dugog djelovanja. PZI nije idealni bazalni inszulinski farmaceutski pripravak jer se ne može pomiješati s topljivim inzulinom koji se daje za vrijeme obroka, a visoka koncentracija cinka i protamina može prouzrokovati iritaciju ili reakciju na mjestu primjene.

Humani ultralente inzulin je mikrokristalinični pripravak s višom koncentracijom cinka od one kod NPH, a u strukturi mikrokristala nisu ugrađeni niti fenolni konzervansi niti protamin. Humani ultralente pripravci omogućuju umjerenu duljinu djelovanja koje nije dovoljno ujednačeno, a njihove smjese s inzulinom nisu stabilne. Osim toga, njih je vrlo teško resuspendirati.

Do sada je bilo pokušaja koji su nastojali usmjeriti pažnju na uočene nedostatke poznatih inzulinskih suspenzija. Provedena su ispitivanja inzulina koji su acilirani masnim kiselinama kako bi se utvrdila bazalna kontrola glukoze u krvi (S. Havelund i suradnici, WIPO publikacija WO95/07931, 23. ožujak 1995.). Njihova produljeno vrijeme djelovanja prouzrokovano je vezanjem masne acilne skupine na albumin u serumu. Duljine masnih acilnih lanaca tih molekula su takve da omogućavaju uspješno vezanje masnih kiselina na albumin u serumu. Lanci masnih kiselina koji se primjenjuju za pripravu inzulina aciliranih masnom kiselinom imaju u pravilu više od 10 C atoma, a lanci s 14 ili 16 C atoma optimalni su za vezanje na albumin u serumu, te za produljeno vrijeme djelovanja.

Suprotno u odnosu na NPH inzulin koji je netopljiv, prije spomenuti inzulini acilirani masnom kiselinom topljivi su pri uobičajenim terapijskim koncentracijama inzulina. Kod tih pripravaka vrijeme djelovanja ne mora biti uvijek zadovoljavajuće dugo, odnosno dovoljno jednoliko kako bi se omogućila optimalna bazalna kontrola, a pri tome su i slabije djelotvorni od inzulina pa je stoga pri njihovoj primjeni potrebna veća količina djelatne tvari (J. Radziuk. i suradnici, Diabetologia 41 : 116 - 120, 489 - 490 (1998)).

J. L. Whittingham i suradnici (Biochemistry 36 : 2826 - 2831 (1997)) uspjeli su dobiti kristale B29-Nε-tetradekanoil-des-(B30) analog humanog inzulina u obliku heksamernog kompleksa s cinkom i fenolom kojeg su uporabili za rentgensku strukturnu analizu. Pronađeno je da heksamer odgovara R6 konformaciji, kao i da ima odgovarajuća svojstva drukčija od heksamera humanog inzulina. Whittingham i suradnici nisu razjasnili nikakva farmaceutska odnosno farmakološka svojstva nastalog kristala, te također nisu mogli utvrditi da li takav kristal ima nekakvo povoljnije svojstvo koje bi se moglo iskoristiti za liječenje dijabetesa i hiperglikemije. Iz rada kojeg su napisali Whittingham i suradnici nije moguće predvidjeti da li bi kristali NPH tipa koji sadržavaju protamin mogli nastati s derivatiziranim inzulinima i analozima inzulina, te kakva bi bila farmakokinetička odnosno farmakodinamička primjena tih kristala.

Stoga postoji potreba za pronalaženjem inzulinskih pripravaka s ujednačenim i produljenim vremenom djelovanja u odnosu na NPH inzulin, koji se mogu miješati s topljivim inzulinima koji se daju za vrijeme obroka, koji se mogu jednostavno resuspendirati, te koji ne uzrokuju iritaciju ili reakciju na mjestu primjene. Sasvim neočekivano otkrio sam da ta svojstva uzrokuju netopljivi sastojci koji uključuju derivatizirani proteini, nederivatizirani protein, cink, protamin i fenolni konzervans. Vezano na gore spomenuta svojstva, netopljivi sastojci omogućavaju fleksibilnost kontrole u odnosu na trajanje i profil glukodinamičke reakcije.

Pretpostavljalo se da djeluju kao pripravci s kontroliranim otpuštanjem, pri čemu se otpuštanje kontrolira pomoću veličine i svojstava proteina. Prema tome, predmet ovog izuma je netopljivi spoj koji uključuje nederivatizirani protein, derivatizirani protein, kompleksirajuću tvar, tvar koja dovodi do stabilizacije heksamera, te dvovalentni kation. Naknadno će biti prodiskutirani ostali aspekti ovog izuma koji se odnose na pripravu, formulaciju te uporabu.

Nisu mi poznati nikakvi primjeri smjesa derivatiziranih i nederivatiziranih inzulina pod uvjetima koje podrazumijeva ovo otkriće. Poznati su kristali koji u svojoj strukturi uključuju proinzulin i inzulin (D. F. Steiner, Nature 243 : 528 - 530 (1973); B. W. Low i suradnici, Nature 248 : 339 -340 (1974)), te kristali koji uključuju inzulin ili analog inzulina s aproksimativno jednakom izoelektričnom točkom kao i inzulin i analog inzulina koji dodatno imaju bazične amino-kiseline. (M. Doersch i suradnici, U. S. Patent br. 5, 028, 587, objavljen 2. srpnja 1991.).

Steiner je dobio kristale koji su uključivali proinzulin i inzulin u molarnom omjeru 1 : 11, 1 : 5, 1 : 2 i 1 : 1 (na primjer 0,5, 1, 2 i 3 mola proinzulina na 6 molova ukupnog inzulina i proinzulina), u 0,095 M otopini natrij-citrata, pH 6,0, 0,03 M otopini natrij-klorida; 0,012 M otopini ZnCl2, te 16 % acetona. Količina proinzulina znatno utječe na stupanj kristalizacije. Kristali se znatno razlikuju od kristala dobivenih od čistog inzulina pod istim uvjetima, a okarakterizirani su kao romboedrijski kristali sa zaobljenim rubovima. Pripravci su se međusobno i unutar sebe znatno razlikovali. Prednost koja se pripisuje kristalizaciji proinzulina i inzulina je ta što se olakšava izolacija male količine proinzulina i srodnih struktura dobivenih iz ekstrakata gušterače. Autor rada nagađao je da bi moglo doći do kristalizacije između prekursora i dobivenih peptida te između ostalih srodnih proteina.

B. W. Low i suradnici pripravili su vrlo velike kristale koji su uključivali ekvimolarne omjere goveđeg odnosno svinjskog inzulina i njihovih proinzulina, pri čemu su prije procesa kristalizacije proinzulin i inzulin formirali homogeni heksamer. Rendgenskom strukturnom analizom i kvantitativnom elektroforezom pokazalo se da jediničnu ćeliju čine 12 inzulinskih heksamera te 12 proinzulinskih heksamera. Posebno je naglašeno da ne postoje nikakva istraživanja koja bi upućivala na to da inzulin i proinzulin čine smjesu dimera i heksamera u otopini.

M. Doerschung i suradnici otkrili su kristale koji uključuju inzulin, des(PhB1) inzulin, des(ThrB30) humani inzulin ili des(AlaB30) goveđi inzulin, te barem jedan inzulin koji ima bazičnu modifikaciju na C- terminalnom kraju B lanca (modificirani inzulin). Ti modificirani inzulini opisani su u Europskoj patentnoj prijavi br. 132, 769. Globin ili protamin-sulfat smatraju se pomoćnim spojevima koji se mogu koristiti za pripravljanje kristala. U radu nisu navedeni primjeri uporabe protamina, a također ne postoje nikakve naznake da su autori smatrali da bi moglo doći do značajnog učinka nakon dodavanja takvih sastojaka. Nadalje, modificirani inzulini korišteni u radu Doerschunga i suradnika različiti su od derivata koji su se koristili u ovom izumu.

Kao što je spomenuto gore, sasvim neočekivano primijetio sam da kada se postigne da protein odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina i proinzulina bude manje topljiv u vodenom mediju odnosno jače lipofilan uslijed derivatizacije jedne ili više vlastitih reaktivnih rubnih skupina, derivatiziranih proteina i nederivatiziranih proteina odabranog iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina i proinzulina tada može biti ugrađen u netopljive taloge i u kristale protamina koji liče NPH kristalima. Kada se takvi proteini zajedno istalože ili kristaliziraju te tvore netopljive spojeve, brzina otpuštanja proteina u spojevima koji su netopljivi znatno je smanjena u usporedbi s brzinom kojem se otpuštaju fizički slične netopljive tvari koje u svojoj strukturi uključuju nederivatizirani protein.

Nadalje, otkrio sam i amorfni talog i mikrokristali koji u svojoj strukturi uključuju derivatizirani protein, protein, kompleksirajuću tvar, dvovalentni metalni kation, te spoj koji stabilizira heksamer, omogućavaju ujednačenije i dulje vrijeme djelovanja u odnosu na fizički slične mikrokristale koji uključuju samo nederivatizirani protein. Dodatno, sasvim iznenađujuće otkrio sam prednosti koje proizlaze iz ujednačenijeg i duljeg vremena djelovanja čak i amorfnih taloga koji uključuju jedan od proteina i derivatiziranih proteina.

Bit izuma

U svom najširem aspektu, ovaj izum opisuje netopljive spojeve koji uključuju derivatizirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od derivata inzulina, derivata analoga inzulina i derivata proinzulina, proteina odabranog iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, proinzulina, kompleksirajuće tvari, spoja koji stabilizira heksamer, te dvovalentnog kationa. Derivatizirani protein je ili manje topljiv u vodenom mediju u odnosu na nederivatizirani protein, odnosno lipofilniji je od nederivatiziranog proteina, ili stvara kompleks s cinkom i protaminom koji je slabije topljiv u odnosu na odgovarajući kompleks s nederivatiziranim proteinom. Netopljivi spojevi ovog izuma nalaze se u obliku amorfnog taloga, odnosno češće u obliku mikrokristala. Po svojoj morfologiji mikrokristali su ili u obliku prutića ili su pak nepravilnih oblika. Ti netopljivi spojevi korisni su u procesu liječenja dijabetesa i hiperglikemije, a prednost im je ujednačenije i dulje vrijeme djelovanja u odnosu na NPH inzulin. U farmaceutskim pripravcima netopljivi spojevi miješaju se s topljivim proteinima ili s topljivim derivatiziranim proteinima, ili s jednim i drugim zajedno. Nadalje, ako se mijenja odnos proteina i derivatiziranog proteina, kontrolira se produljenje vremena djelovanja u vrlo velikom području, a proteže se od onog koji je gotovo jednako kao kod NPH inzulina pa do mnogo duljeg nego kod NPH inzulina.

Preciznije, ovaj izum opisuje netopljive proteinske spojeve te spojeve proteina aciliranih masnom kiselinom koji se koriste u liječenju dijabetesa i hiperglikemije. Ti spojevi se sastoje od proteina aciliranih masnom kiselinom koji su odabrani iz skupine koja se sastoji od inzulina aciliranog masnom kiselinom, analoga inzulina aciliranog masnom kiselinom, te proinzulina aciliranog masnom kiselinom, proteina odabranih iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, proinzulina, protamina, fenolnog konzervansa, te cinka. Ovaj izum razlikuje se od prijašnje tehnologije dobivanja inzulina aciliranog masnom kiselinom po tome što se produljenje vremena djelovanja ovog izuma ne oslanja nužno na vezanje albumina, iako vezanje albumina može produljiti vrijeme djelovanja pojedinih spojeva ovog izuma.

Izum opisuje mikrokristal koji uključuje protein odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, proinzulina, derivatiziranog proteina, odabranog iz skupine koja se sastoji od derivatiziranog inzulina, analoga derivatiziranog inzulina, derivatiziranog proinzulina, kompleksirajuće tvari, dvovalentnog kationa, te spoj koji stabilizira heksamer. Mikrokristali navedeni u ovom izumu koriste se u postupku liječenja dijabetesa, te u slučaju potrebe, za kontrolu glukoze u krvi pacijenata.

Izum opisuje amorfni talog koji uključuje protein odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, proinzulina; derivatizirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od derivatiziranog inzulina, analoga derivatiziranog inzulina, derivatiziranog proinzulina, kompleksirajuću tvar, dvovalentni kation, te spoj koji stabilizira heksamer. Amorfni talozi navedeni u ovom izumu koriste se u postupku liječenja dijabetesa, te ako je potrebna kontrola glukoze u krvi pacijenata. Također se mogu uporabiti kao međuprodukti u pripravi mikrokristala opisanih u ovom izumu.

Izum opisuje vodene suspenzije koje uključuju netopljive tvari i vodeni medij. Jedna takva vodena suspenzija uključuje mikrokristalinični spoj opisan u ovom izumu, te vodeni medij. Druga takva vodena suspenzija uključuje amorfni talog opisan u ovom izumu , te vodeni medij. Topljiva, vodena faza navedene suspenzije može dodatno sadržavati protein, kao što je na primjer humani inzulin ili pak topljivi analog humanog inzulina, kao što je na primjer monomerni analog inzulina, koji trenutno kontrolira razinu glukoze u krvi nakon obroka, a dodatno ili alternativno može sadržavati derivatizirani protein. Pripravci ovog izuma pokazuju bolja farmakodinamička svojstva u odnosu na NPH humani inzulin. Duljina njihovog djelovanja može biti vrlo različita, počevši od samo malo produženih vrijednosti u usporedbi s NPH humanim inzulinom, pa do izrazito produženih u usporedbi s NPH humanim inzulinom.

Izum također opisuje postupke priprave hibridnih heksamera, smjese heksamera, amorfnih taloga, te kokristale.

Izum opisuje postupak liječenja dijabetesa ili hiperglikemije koji po potrebi uključuje davanje dovoljne količine netopljive tvari (opisane u ovom izumu) pomoću koje se regulira razina glukoze u krvi pacijenta.

Izum opisuje pripravke na temelju hibridnog heksamera koji uključuju protein odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, proinzulina; derivatizirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od derivatiziranog inzulina, analoga derivatiziranog inzulina, derivatiziranog proinzulina i cinka. Hibridni heksamer ovog izuma koriste se u postupku liječenja dijabetesa, te po potrebi, za kontrolu glukoze u krvi pacijenata. Također se mogu uporabiti kao međuprodukti u pripravi netopljivih tvari opisanih u ovom izumu, koji se isto tako koriste se u postupku liječenja dijabetesa, te po potrebi, za kontrolu glukoze u krvi pacijenata. Vjeruje se da heksamerni hibridi nastaju kada se pomiješaju protein i derivatizirani protein pod uvjetima koji značajno favoriziraju prelazak u niža agregacijska stanja u odnosu na heksamerno stanje, te u slučaju kad su uvjeti takvi da značajno favoriziraju heksamerno agregacijsko stanje.

Izum opisuje pripravke dobivene miješanjem heksamera koji uključuju heksamere cink i proteina odabranog iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, te proinzulina, te heksamere cinka i derivatiziranog proteina odabranog iz skupine koja se sastoji od derivatiziranog inzulina, analoga derivatiziranog inzulina, te derivatiziranog proinzulina. Smjesa heksamera opisana u ovom izumu koriste se u postupku liječenja dijabetesa, te po potrebi, za kontrolu glukoze u krvi pacijenata. Također se mogu uporabiti kao međuprodukti u pripravi netopljivih tvari opisanih u ovom izumu, koji se isto tako koriste se u postupku liječenja dijabetesa, te po potrebi, za kontrolu glukoze u krvi pacijenata. Vjeruje se da smjesa heksamera nastaje kada se otope protein i derivatizirani protein pod uvjetima koji značajno favoriziraju heksamerno agregacijsko stanje, te zatim pomiješaju pod uvjetima koji također značajno favoriziraju heksamerno agregacijsko stanje.

Izum opisuje uporabu netopljivog pripravka ovog izuma u izradi pripravaka za liječenje dijabetesa i hiperglikemije.

Kratki opis crteža

Na slici 1 prikazano je otpuštanje kokristala, opisanog u ovom izumu, tijekom pet sati, kod kojeg je odnos humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina 3 : 1 ( - - - ), 1 : 1, (____), i 1 : 3 ([image] ), u usporedbi s otpuštanjem pripravka na temelju kristala humanog inzulina i protamina (.....).

Na slici 2 prikazani su podaci vezani uz otpuštanje dobivene u istom pokusu kao i za Sliku 1, ali s promijenjenom vremenskom osi koja je produžena kako bi mogla prikazati rezultate za 1 : 3 kokristal tijekom trinaest i pol sati. Otpuštanje kokristala, opisanog u ovom izumu kod kojeg je odnos humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina 3 : 1 ( - - - ), 1 : 1, (___), i 1 : 3 ([image] ), u usporedbi s otpuštanjem pripravka na temelju kristala humanog inzulina i protamina (.....).

Na slici 3 prikazani su podaci vezani uz otpuštanje kokristala, opisanog u ovom izumu, kod kojeg je odnos humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina 1 : 1, (____), i 1 : 3 ([image] ), u usporedbi s otpuštanjem mikrokristala koji uključuju samo B29-Nε-oktanoil humani inzulin (....), odnosno pripravak koji sadržava kristale humanog inzulina i protamina.

Na slici 4 prikazani su podaci vezani uz otpuštanje kokristala, opisanog u ovom izumu, kod kojeg je odnos humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina 1 : 3 ([image] ), u usporedbi s pripravkom koji sadržava kristale humanog inzulina i protamina (....), odnosno ultralente humani inzulin (___) i goveđi ultralente inzulin (___).

Opis izuma

Pojam “smjesa heksamera” odnosi se na smjesu proteinskih heksamera i derivatiziranih proteinskih heksamera, pri čemu proteinski heksameri uključuju u svoju strukturu cink i derivatizirani protein odabran iz skupine koja sadržava derivatizirani inzulin, analog derivatiziranog inzulina, te derivatizirani proinzulin. Broj atoma cinka koji je uključen u heksamer kreće se od 2 do 4 po heksameru.

Pojam “hibridni heksamer” odnosi se na heksamer koji u svojoj strukturi uključuje 6 monomera i cink, pri čemu je barem jedan monomer odabran iz skupine koja sadržava derivatizirani inzulin, analog derivatiziranog inzulina, te derivatizirani proinzulin. Broj atoma cinka koji je uključen u heksamer kreće se od 2 do 4 po heksameru.

Pojam “kokristal” označava mikrokristal ovog izuma.

Pojam “netopljivi spojevi” odnosi se na tvar u mikrokristaliničnom obliku odnosno u obliku amorfnog taloga. Prisustvo mikrokristala ili amorfnog taloga određuje se vizualno ili pomoću mikroskopa. Topljivost ovisi o otapalu, te stoga određene tvar mogu biti netopljive u jednom otapalu, ali su topljive u nekom drugom otapalu.

Pojam “mikrokristal” označava krutinu koja se primarno sastoji od tvari u obliku kristala, pri čemu pojedinačni kristali u najvećem broju spadaju u jednu kristalografsku skupinu, te su mikroskopske veličine od 1 do 100 mikrona. Pojam “mikrokristaliničan” odnosi se na stanje u kojem se javlja mikrokristal.

Pojam “prutićasti” označava posebnu mikrokristalnu morfologiju koja se također može opisati kao piramidalno- tetragonski prutići. Morfologija mikrokristala opisanih u izumu određuje se mikroskopom na vrlo jednostavan način.

Pojam “nepravilna morfologija” karakterizira mikrokristale čija se morfologija nakon provedenog mikroskopskog ispitivanja ne može svrstati ni u jednu od poznatih kristalografskih skupina ili se ne može odrediti jer je veličina kristala premala za određenu klasifikaciju.

Pojam “ amorfni talog” odnosi se na netopljivu tvar koja se ne nalazi u obliku kristala. Prosječno obučena osoba može razlikovati amorfni talog od kristala. Amorfni talozi ovog izuma pokazuju bitno bolja farmakološka svojstva, a predstavljaju međuprodukte u pripravi mikrokristala opisanih u ovom izumu.

Pojam “protein” može imati svoje uobičajeno značenje što znači da je to polimer amino-kiselina. Pojam “protein” koji se koristi u ovom tekst ima nešto uže značenje i odnosi se na protein odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, te proinzulina. Pojam “nederivatizirani protein“također se odnosi na protein odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, te proinzulina.

Kao što je navedeno u Zahtjevima, te nadalje u tekstu gdje god je to kontekst iziskivao, pojam “ukupni protein” odnosi se na kombiniranu količinu proteina (inzulina, analoga inzulina, te proinzulina) i derivatiziranog proteina (derivatiziranog inzulina, analoga derivatiziranog inzulina, te derivatiziranog proinzulina). Premda su protamin i ostale kompleksirajuće tvari također proteini u najširem smislu te riječi, pojam “ukupni protein” ne odnosi se na njih.

Pojam “derivatizirani protein” odnosi se na protein odabran iz skupine koja se sastoji od derivatiziranog inzulina, analoga derivatiziranog inzulina, te derivatiziranog proinzulina, pri čemu se derivatizacija funkcionalne skupine provodi tako da se dobije derivatizirani protein manje topljiv u vodenom mediju u odnosu na nederivatizirani inzulin, odnosno da je lipofilniji od nederivatiziranog inzulina, ili pak stvara kompleks s cinkom i protaminom koji je manje topljiv u odnosu na odgovarajući kompleks nederivatiziranog proteina. Dobro obučena osoba može vrlo lako provesti određivanje topljivosti odnosno lipofilnosti proteina i derivatiziranih proteina. Određivanje topljivosti derivatiziranih proteina i proteina koji kompleksiraju s cinkom i protaminom provodi se po dobro poznatim postupcima (Graham i Pomeroy, J. Pharm. Pharmacol. 36 : 427 - 430 (1983), odnosno modificirana verzija opisana u članku M. R. De Felippis i B. Frank, EP 735,048) ili po postupcima opisanim u izumu.

Poznati su mnogi primjeri takvih derivatiziranih proteina, kao što su derivati inzulina i analoga inzulina u obliku benzoila, p-tolil-sulfonamidkarbonila i indola (S. Havelund i suradnici, WO94-5/07931, objavljen 23. ožujka 1995. godine); alkiloksikarbonilni derivati inzulina (R. Geiger i suradnici, U.S. Patent br. 3, 684, 791, objavljen 15. kolovoza 1972. godine; D. Brandenberg i suradnici, U.S. Patent 3, 907, 763, objavljen 23. rujna 1975. godine); ariloksi karbonilni derivati inzulina (D. Brandenberg i suradnici, U.S. Patent 3, 907, 763, objavljen 23. rujna 1975. godine); alkil karbamilni derivati (D. G. Smyth, U.S. Patent br. 3, 864, 325, objavljen 4. ožujka 1975. godine; D. G. Lindsay i suradnici, U.S. Patent br. 3, 905, 517, objavljen 13. travnja 1976. godine); karbamil, O-acetil derivati inzulina (D. G. Smyth, U.S. Patent br. 3, 864, 325, objavljen 4. ožujka 1975. godine); ukršteni, alkildikarboksilni derivati (D. Brandenberg i suradnici, U.S. Patent 3, 907, 763, objavljen 23. rujna 1975. godine); N-karbamil, O-acetil derivati inzulina (D. G. Smyth, U.S. Patent br. 3, 868, 356, objavljen 25. veljače 1975. godine); različiti O-alkil esteri (J. Markusen, U.S. Patent br. 4, 343, 898, objavljen 10. kolovoza 1982. godine; K. Morihara i suradnici, U.S. Patent br. 4, 401, 757, objavljen 30. kolovoza 1983. godine; J. Markussen, U.S. Patent br. 4, 489 159, objavljen 18. prosinca 1984. godine; R. Obermeier i suradnici, U.S. Patent br. 4, 601, 852, objavljen 22. srpnja 1986. godine; F. H. Andersen i suradnici, U.S. Patent br. 4, 601, 979, objavljen 22 srpnja 1986. godine) alkilamidni derivati inzulina (P. Balschmidt i suradnici, U.S. Patent br. 5, 430, 016, objavljen 4. srpnja 1995. godine); različiti drugi derivati inzulina (D- G. Lindsay, U.S. Patent br. 3, 869, 437, objavljen 4. travnja 1975. godine); te proteini acilirani masnom kiselinom koji su tamo opisani.

Pojam “acilirani protein” koji se koristi u ovom tekstu odnosi se na derivatizirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, te proinzulina aciliranog organskom kiselinom koja se veže na proteini stvara amidnu vezu koja nastaje između organske kiseline spoja i amino skupine proteina. Općenito, amino skupina može biti α-amino skupina N-terminalne amino-kiseline proteina, ili pak može biti ε-amino skupina lizinskog ostatka proteina. Acilacija proteina može se provesti na jednoj ili više od ukupno tri amino skupine koje postoje u molekuli inzulina i molekulama većine analoga inzulina. Mono-acilirani proteini imaju samo jednu aciliranu amino skupinu. Di-acilirani proteini imaju acilirane dvije amino skupine. Tri-acilirani proteini imaju acilirane tri amino skupine. Organska kiselina može biti na primjer masna kiselina, aromatska kiselina ili bilo koji drugi organski spoj s karboksilnom skupinom koja se veže s amino skupinom proteina i tvori amidnu vezu, pri čemu se snižava topljivost u vodi povećava lipofilnost ili smanjuje topljivost cink/protamin kompleksa derivatiziranog proteina u odnosu na nederivatizirani protein.

Pojam “protein aciliran masnom kiselinom” odnosi se na acilirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, te proinzulina koji je aciliran masnom kiselinom (koja je povezana s proteinom amidnom vezom, a nastaje između karboksilne skupine masne kiseline i amino skupine proteina). Općenito, amino skupina može biti α-amino skupina N-terminalne amino-kiseline proteina, ili pak može biti ε-amino skupina lizinskog ostatka proteina. Acilacija proteina pomoću masne kiseline može se provesti na jednoj ili više od ukupno tri amino skupine koje postoje u molekuli inzulina i u većini molekula analoga inzulina. Mono-acilirani proteini imaju samo jednu aciliranu amino skupinu. Di-acilirani proteini imaju acilirane dvije amino skupine. Tri-acilirani proteini imaju acilirane tri amino skupine. Inzulin aciliran masnom kiselinom opisan je u Japanskoj patentnoj prijavi 1 - 254, 699. Vidi također članak M. Hashimoto i suradnici, Pharmaceutical Research, 6 : 171 - 176 (1989), te D. G. Lindsay i suradnici, Biochemical J. 121 : 737 -745 (1971). Daljnji podaci koji se odnose na inzuline acilirane masnom kiselinom te analoge inzulina acilirane masnom kiselinom, kao i njihove sinteze, mogu se pronaći u radovima koje su napisali J. C. Baker i suradnici, U.S.. 08/342, 931, ispunjen 17. studenog 1994. godine te objavljen kao U.S. Patent br. 5, 693, 609, 2. prosinca 1997. godine; S. Havelundi suradnici, WO95/07931, objavljen 23. travnja 1995. godine, te odgovarajući U.S. Patent br. 5, 750, 497, objavljen 12. svibnja 1998. godine; I. Jonassen i suradnici, WO96/29342, objavljen 26. rujna 1996. godine. Ove publikacije navode se u ovom tekstu u obliku literaturnih navoda koji opisuju inzuline acilirane masnom kiselinom i analoge inzulina aciliranih masnom kiselinom, te načine priprave istih.

Pojam “protein aciliran masnom kiselinom“ uključuje farmaceutski prihvatljive soli i komplekse proteina aciliranih masnom kiselinom. Pojam “protein aciliran masnom kiselinom“ također uključuje pripravke aciliranih proteina kod kojih je ukupna količina molekula aciliranih proteina homogena s obzirom na mjesto odnosno mjesta acilacije. Na primjer, Nε- mono-acilirani protein, B1-Nα-mono-acilirani protein A1- Nα-mono-acilirani protein, A1,B1- Nα-diacilirani protein, Nε, A1- Nα-diacilirani protein , Nε, B1- Nα-diacilirani protein , te Nε, A1, B1- Nα-triacilirani protein uključeni su u pojam “protein aciliran masnom kiselinom” u ovom izumu.

Pojam “inzulin” koji se koristi u ovom tekstu odnosi se na humani inzulin vrlo dobro poznate amino-kiselinske sekvencije te strukture. Humani inzulin uključuje 21 amino-kiselinski A-lanac, te 30 amino-kiselinskih B-lanaca koji su unakrsno premošteni disulfidnim mostovima: jedan se most nalazi na položaju 7 A-lanca i položaju 7 B-lanca, drugi se nalazi na položaju 20 A-lanca i položaju 19 B-lanca, a treći na položaju 6 A-lanca i položaju 11 A-lanca.

Pojam “analog inzulina” označava proteine čiji su A-lanac i B-lanac suštinski isti kao A-lanac i B-lanac humanog inzulina, no razlikuju se u odnosu na A-lanac i B-lanac humanog inzulina po tome što im manjka jedna ili više amino-kiselina ili su pak jedna odnosno više amino-kiselina zamijenjene, odnosno imaju jednu ili više amino-kiselina koje ne utječu negativno na aktivnost analoga inzulina.

“Životinjski inzulini” su analozi humanog inzulina, te su stoga analozi inzulina prema gore navedenoj definiciji. U tu se skupinu ubrajaju kunići, svinjski, goveđi i ovčji inzulin. U Tablici koja se nalazi ispod dan je prikaz onih amino-kiselina po kojima se životinjski inzulini razlikuju od humanog inzulina.

Položaj amino-kiseline

A8 A9 A10 B30

humani inzulin Thr Ser Ile Ser

inzulin kunića Thr Ser Ile Thr

svinjski inzulin Thr Ser Ile Ala

goveđi inzulin Ala Ser Val Ala

ovčji inzulin Ala Gly Val Ala

“Monomerni inzulin ” je dobro poznati slijedeći tip analoga inzulina. Monomerni analozi inzulina imaju vrlo sličnu strukturu kao humani inzulin, pri čemu im je aktivnost jednaka ili vrlo slična aktivnosti humanog inzulina, ali im neke amino-kiseline nedostaju, ili su zamijenjene, ili pak imaju koju dodatnu amino-kiselinu što rezultira razdvajanjem veza uključenih u dimerizaciju i heksamerizaciju. Ta činjenica dovodi do smanjenog stvaranja asocijata s višim agregacijskim stanjem. Monomerni analozi inzulina su brzo djelujući analozi humanog inzulina. Opisani su u R. E. Chance i suradnici, U.S. Patent br. 5, 514, 646, objavljen 7. svibnja 1996. godine; D. N. Brems i suradnici, Protein Engeneering, 5 : 527 -533 (1992); J. J. V. Brange i suradnici, EPO publikacija br. 214, 826, objavljena 18. travnja 1987. godine; J. J. V. Brange i suradnici, U.S. Patent br. 5, 618, 913, objavljen 8. travnja 1997. godine; J. Brange i suradnici, Current Opinion in Structural Biology 1 : 934 - 940 (1991). Opisan je jedan primjer monomernog analoga inzulina kao humani inzulin kod kojeg je Pro na položaju B28 supstituiran s Asp, Lys, Leu, Val ili Ala, te kod kojeg je na položaju B29 Lys ili je supstituiran s Pro, te također AlaB26 humanim inzulinom, des(B28-B30) humanim inzulinom, te des(B27) humanim inzulinom. Monomerni analozi inzulina koji se koriste kao derivati u kristalima opisanim u ovom izumu, odnosno koji se koriste u svom nederivatiziranom obliku u otopini ili u pripravcima u obliku suspenzije, unakrsno su premošteni točno na onim mjestima kao kod humanog inzulina.

Slijedeća skupina analoga inzulina koja se koristi u ovom izumu ima izoelektričnu točku u rasponu od 7,0 do 8,0. Takvi analozi odnose se na “pI-pomaknute analoge inzulina”. Takvi primjeri analoga inzulina su ArgB31, ArgB32- humani inzulin, GlyA21,ArgB31, ArgB32 humani inzulin, ArgA0, ArgB31, ArgB32 humani inzulin, te ArgA0, GlyA21, ArgB31, ArgB32 humani inzulin.

Slijedeća skupina analoga inzulina sastoji s od takvih inzulina kojima nedostaje jedna ili više amino-kiselina, a ta činjenica ne utječe značajno na aktivnost molekule. Ova skupina analoga navedena je ovdje kao “deletion” analozi. Na primjer, analozi inzulina kojima nedostaje jedna ili više amino-kiselina na položajima B1-B3 svejedno su aktivni. Slično tome, analozi inzulina kojima nedostaje jedna ili više amino-kiselina na položajima B28-B30 su također aktivni. Primjeri “deletion” analoga su des(B30) humani inzulin, desPhe(B1) humani inzulin, des(B27) humani inzulin, des(B28-30) humani inzulin, te des(B1-B3) humani inzulin. “Deletion” analozi koji se koriste kao derivati u kristalima opisanim u ovom izumu, odnosno koji se koriste u svom nederivatiziranom obliku u otopini ili u pripravcima u obliku suspenzije, unakrsno su premošteni točno na onim mjestima kao kod humanog inzulina.

Amidirane amino-kiseline, posebno ostaci asparagina u inzulinu, poznate su kao kemijski vrlo nestabilni spojevi (K. H. Jorgensen i suradnici, U.S. Patent br. 5, 008, 241, objavljen 16. aprila 1991. godine; M. Dorschung, U.S. Patent br. 5, 656, 241, objavljen 12. kolovoza 1997. godine). Opće je poznato da su one pri određenim uvjetima sklone deamidiranju i ostalim različitim reakcijama koje dovode do drukčijeg rasporeda. Stoga, analog inzulina može biti inzulin ili analog inzulina kojem su jedan ili više amidnih ostataka zamijenjeni drugim amino-kiselinama kako bi se poboljšala kemijska stabilnost. Npr. Asn ili Gln mogu se zamijeniti s neamidiranom amino-kiselinom. Pogodne zamjene za Asn ili Gln su Gly, Ser, Thr, Asp, ili Glu. Poželjno je da dođe do zamjene jednog ili više Asn ostataka. AsnA18, AsnA21, te AsnB3 odnosno bilo koja od kombinacija ovih ostataka može se zamijeniti s Gly, Asp, te Glu. Također, GlnA15, te GlnB4 ili oba mogu se zamijeniti s Asp odnosno Glu. Povoljnije zamjene su Asp na B21, te Asp na B3. Vrlo pogodne zamjene su i one zamjene kod kojih ne dolazi do promjene naboja na molekuli proteina. Stoga je vrlo povoljna zamjena Asn ili Gln neutralnim amino-kiselinama.

Pojam “proinzulin”označava peptid koji ima samo jedan lanac, a predstavlja prekursor inzulina. Proinzulin se može pretvoriti u inzulin ili u analog inzulina kemijskom reakcijom, odnosno pogodnije, reakcijom uz enzim kao katalizator. Kod proinzulina, odgovarajući disulfidni mostovi nastaju po opisanom postupku. Proinzulin uključuje inzulin odnosno analog inzulina te vezu odnosno vezujući peptid. Vezujući peptid ima od 1 do 35 amino-kiselina. Veza ili vezujući peptid ostvaruje se na terminalnoj amino-kiselini A-lanca te na terminalnoj amino-kiselini B-lanca, pomoću α-amidne veze ili pomoću dvije α-amidne veze. Po mogućnosti, ni jedna od amino-kiselina koje čine peptidnu vezu ne bi trebala biti cistein. Po mogućnosti, C-terminalna amino-kiselina veznog peptida trebala bi biti Lys ili Arg. Formula proinzulina može biti X-B-C-A-Y ili X-A-C-B-Y, pri čemu je X vodik ili peptid koji sadržava od 1 do 100 amino-kiselina, a na mjestu C-terminalne amino-kiseline nalaze se Lys ili Arg; Y je hidroksilna skupina ili peptid koji sadržava od 1 do 100 amino-kiselina, a na mjestu N-terminalne amino-kiseline nalaze se Lys ili Arg; A je inzulinski A-lanac odnosno A-lanac analoga inzulina; C je peptid od oko 35 amino-kiselina (pri čemu ni jedna nije cistein) kog kojeg se na mjestu C-terrminalne amino-kiseline nalazi Lys ili Arg; B je inzulinski B-lanac odnosno B-lanac analoga inzulina.

“Farmaceutski prihvatljive soli” su soli koje nastaju vezanjem jedne ili više nabijenih skupina proteina i jednog ili više netoksičnih, farmaceutski prihvatljivih kationa odnosno aniona. Organske i anorganske soli dobivaju se pripravom pomoću kloridne, sulfatne, sulfonske, tartarne, fumarne, bromidne, glikolne, limunske, maleinske, fosfatne, sukcinske, octene, nitratne, benzojeve, askorbinske, propionske, karbonatne kiseline ili sličnih kiselina, kao i amonija, natrija, kalija, kalcija ili magnezija.

Glagol “acilirati” označava nastajanje amidne veze između masne kiseline i amino skupine proteina. Protein je aciliran kada jedna ili više njegovih amino skupina tvori amidnu vezu s kiselinskom skupinom masne kiseline.

Pojam “masna kiselina” odnosi se na zasićene i nezasićene, ravne ili razgranate lance masnih kiselina koji sadržavaju od 1 do 18 C atoma.

Pojam “C1 - C18 masna kiselina” odnosi se na zasićene i nezasićene, ravne ili razgranate lance masnih kiselina koji sadržavaju od 1 do 18 C atoma.

Pojam “dvovalentni metalni kation” odnosi se na ion ili ione koji sudjeluju u nastajanju kompleksa s mnoštvom proteinskih molekula. Poznato je da prijelazni metali. alkalijski metali, te zemnoalkalijski metali stvaraju komplekse s inzulinom. Pogodniji su prijelazni metali. Posebno pogodan je cink. Ostali farmaceutski prihvatljivi zemno alkalijski metali koji kompleksiraju s inzulinom su bakar, kobalt i željezo.

Pojam “kompleks” ima u ovom izumu dva značenja. Prvo je značenje da se pojam odnosi na kompleks koji nastaje između dva ili više atoma proteina (koji kompleksiraju) te jednog ili više dvovalentnih metalnih kationa. Atomi proteina imaju ulogu elektron-donorskih liganada. Proteini stvaraju heksamerni kompleks s dvovalentnim kationom prijelaznog metala. Drugo značenje pojma “kompleks” u ovom izumu predstavlja asocijaciju između kompleksirajućeg spoja i heksamera. “Kompleksirajući spoj” je organska molekula koja ima mnoštvo pozitivnih naboja koja se veže na ili kompleksira s heksamerima u netopljivim spojevima, pri čemu ih stabilizira s obzirom na mogućnost otapanja. Primjeri kompleksirajućih spojeva koji su pogodni za primjenu u ovom izumu uključuju protamin, surfen te različite globinske proteine (J. Brange, Galenics of Inzulin, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg (1987.)), te različite polimerne spojeve za koje se zna da kmpleksiraju s inzulinom.

Pojam “protamin” odnosi se na smjesu izrazito bazičnih proteina koji se dobivaju iz sperme ribe. Prosječna molekulska masa proteina protaminu iznosi oko 4200 (J. A. Hoffman i suradnici, Protein Expression and Purification, 1 : 127 - 133 (1990). “Protamin” se može odnositi na pripravke proteina u kojima gotovo nema spojeva u obliku soli, koji se vrlo često nazivaju “protaminske baze”.Protamin se također odnosi na pripravke koji sadržavaju proteine u obliku soli. Komercijalni pripravci značajno se razlikuju prema količine soli koju sadržavaju.

Protaminni su dobro poznati stručnjacima koji se bave inzulinskom problematikom, a trenutno se ugrađuju u NPH inzulinske pripravke. U ovom izumu koristi se čisti protamin, kao i smjese protamina. Komercijalni protaminski pripravci najčešće nisu homogeni s obzirom na zastupljene proteine. Oni se ipak koriste u ovom izumu. Pripravak koji uključuje protaminsku bazu primjenjuje se u ovom izumu, isto kao i protaminski pripravci koji sadržavaju soli protamina, te oni koji su ustvari smjese protaminske baze i protaminskih soli. Vrlo često korištena protaminska sol je protamin-sulfat. Masa koje se odnosi na protamin iskazuju se u odnosu na protaminsku bazu. Prosječno obučena osoba može odrediti količinu protaminskih pripravka s poznatim omjerom mase u odnosu na protamin.

Pojam “ suspenzija” odnosi se na smjesu tekuće faze i krute faze koja se sastoji od netopljivih ili teško topljivih čestica čija je veličina veća od one kod koloidnih čestica. Smjese NPH kristala i vodenog medija stvara suspenziju. Smjese amorfnog taloga i vodenog medija također stvaraju suspenziju. Pojam “pripravci u obliku suspenzije” podrazumijevaju farmaceutske pripravke kod kojih je djelatna tvar prisutna u krutom stanju, npr. mikrokristalinična krutina, amorfni talog, odnosno oboje, te je fino raspršena u vodenom mediju. Fino raspršena krutina ima takvo svojstvo da se može vrlo jednoliko suspendirati u vodenom mediju uz blago mućkanje smjese što osigurava dobivanje ujednačene suspenzije iz koje se može ekstrahirati potrebni volumen za jednu dozu. Primjeri komercijalno dostupnih inzulinskih suspenzija uključuju NPH, PZI i ultralente. Dozvoljeno je da mala količina krute tvari u mikrokristaliničnoj suspenziji bude amorfnog oblika. Pogodno je ako je udio amorfne tvari manji od 10 %, no najpogodnije je ako je taj iznos manji od 1 % u odnosu na ukupnu krutu fazu u mikrokristaliničnoj suspenziji. Isto tako, dozvoljeno je da male količine krute tvari u suspenzijama amorfnih taloga čine mikrokristali.

“NPH inzulin” odnosi se na “Neutral Protamine Hagedorn” inzulinske pripravke. Dozvoljeni sinonimi su humani inzulin NPH i inzulin NPH. Humulin ® N je komercijalni pripravak NPH inzulina. Pripadajući naziv je “NPL” koji se odnosi na Pripravak nalik NPH pripravku, a koji je analog LysB28, ProB29 humanog inzulina. Značenje ovih naziva, te načini pripravljanja inzulina poznati su osobama koje se bave tom problematikom.

Pojam “vodeni medij” odnosi se na otapalo koje sadržava vodu. Vodeni medij može uključivati samo vodu, može uključivati vodu te jedan ili više otapala koja se miješaju s vodom odnosno može sadržavati otopljene tvar. Najčešće korištena otapala koja se miješaju s vodom su organski alkoholi kratkog lanca poput metanola, etanola, propanola; ketoni kratkog lanca poput acetona; te polialkoholi poput glicerola.

“Sredstvo za izotoniziaciju” je spoj koji se fiziološki lako podnosi te daje odgovarajuća svojstva pripravku kako bi se spriječilo potpuno istjecanje vode preko staničnih membrana koje dolaze u dodir s danim pripravkom. Glicerol (još poznat pod imenom gliceril) je najčešće sredstvo za izotonizaciju. Druga sredstva za izotonizaciju sadržavaju soli, npr. natrij-klorid, te monosaharide, npr. dekstrozu i laktozu.

Netopljivi pripravci ovog izuma sadržavaju tvar za stabilizaciju heksamera. Pojam “tvar za stabilizaciju heksamera” odnosi se na neproteinske molekule male molekulske mase koje stabiliziraju protein, odnosno derivatizirani protein u heksamernom agregacijskom stanju. Fenolni spojevi, a posebno fenolni konzervansi najbolje su poznate stabilizirajuće tvari za inzulin i inzulinske derivate. Tvari za stabilizaciju heksamera stabiliziraju heksamer stvarajući posebne inter-molekulske veze sa heksamerom. Primjeri tvari za stabilizaciju heksamera različiti su fenolni spojevi, fenolni konzervansi, rezorcinol, 4’-hidroksiacetanilid, 4-hidroksibenzamid, te 2,7-dihidroksinaftalen. Pripravci ovog izuma koji sadržavaju netopljive sastojke, a napravljeni su za višestruku primjenu, sadržavaju konzervans kao dodatak tvari za stabilizaciju heksamera. Konzervans koji se koristi u pripravcima ovog izuma može biti fenolni konzervans, a može se poklapati s tvari za stabilizaciju heksamera ili pak biti različit od nje.

Pojam “konzervans” odnosi se na spoj koji se dodaje farmaceutskom pripravku kako bi se spriječila mikrobiološka kontaminacija. Parenteralni pripravak mora biti u skladu sa smjernicama za djelotvornost konzervansa koji se koristi u komercijalnim proizvodima za višestruku namjenu. Konzervansi koji su djelotvorni te prihvatljivi za parenteralne pripravke su benzalkonij-klorid, benzetonij, kloroheksidin, fenol, m-krezol, benzilni alkohol, metilparaben, klorobutanol, o-krezol, p-krezol, klorokrezol, fenil-živa-nitrat timerosal, benzojeva kiselina, kao i različite smjese navedenih tvari. Vidi, npr. K. H. Wallhaeusser, Develop. Biol. Standard, 24 : 90-028 (1974) (S. Krager, Basel).

Pojam “fenolni konzervans”uključuje slijedeće spojeve: fenol, m- krezol, o-krezol, p-krezol, klorokrezol, metilparaben te njihove smjese. Poznato je da se određeni fenolni konzervansi poput fenola ili m-krezola vežu na molekule čija struktura liči na strukturu inzulina, te stoga uzrokuju konformacijske promjene koje pojačavaju fizikalnu, odnosno kemijsku stabilnost, odnosno oboje (D. T. Birnbaum i suradnici, Pharmaceutical. Res. 14 : 25 - 36 (1997); S. Rahuel-Clermont i suradnici, Biochemistry 36 : 5837 - 5845 (1997)):

Pojam “pufer” ili “farmaceutski prihvatljivi pufer” odnosi se na spoj za kojeg se zna da se može koristiti u postupku priprave inzulinskih pripravaka, a čija uloga je kontrola pH vrijednosti pripravka koja mora biti na onoj razini koju zahtijeva određeni pripravak. pH vrijednosti pripravaka ovog izuma kreću se u području od 6,0 do 8,0. Pogodnije je da se pH pripravaka ovog izuma kreće u rasponu od 6,8 do 7,8. Farmaceutski prihvatljivi puferi kojima se kontrolira pH u rasponu od umjereno kiselog pH do umjereno lužnatog pH uključuju spojeve kao što su fosfati, acetati, citrati, arginin, TRIS i histidin. “TRIS” se odnosi na 2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiol, te na njegove farmaceutski prihvatljive soli. Najčešći oblici u kojima se susreće TRIS su baza i kloridna sol. TRIS je također sinonim za trimetilol aminometan, trometamin, te tris(hidroksimetil)aminometan Ostali farmaceutski prihvatljivi puferi koji su pogodni za kontrolu pH poznati su kemičarima s prosječnim znanjem.

Pojam “primijeniti lijek” znači unijeti pripravak ovog izuma u tijelo pacijenta, ako za tim postoji potreba, a kako bi se liječila bolest ili određeno stanje.

Pojam “liječenje” odnosi se na kontrolu i brigu za pacijenta koji boluje od dijabetesa ili hiperglikemije, ili drugih stanja kod kojih se preporuča davanje inzulina kako bi se mogli ublažiti ili ukloniti simptomi koji su doveli do tog stanja. Liječenje uključuje davanje pripravka ovog izuma kako bi se spriječili simptomi ili komplikacije, ublažili simptomi ili komplikacije, ili kako bi se izliječila bolest odnosno uklonili poremećaji ili problematična stanja.

Kao što je prije spomenuto, ovaj izum opisuje netopljive pripravke čija su svojstva slična NPH inzulinu u određenim aspektima, te bolja u odnosu na svojstva NPH inzulina u nekim drugim aspektima. Slični su NPH inzulinu u pogledu fizikalnih svojstava (što je opisano kasnije). Kako bi se ispitali mikrokristali koji uključuju B29-Nε-oktanoil humani inzulin, inzulin, cink, protamin, fenol (pripravljeni u skladu s ovim izumom), korišten je svjetlosni mikroskop s objektivom koji se može uroniti u ulje te s ukrštenim polarizatorom. Ispitivanje uz povećanje od 1000 puta pokazalo je da su dobiveni monokristali u obliku prutića, jednake kristalne morfologije. Veličina (duljina) tih mikrokristala kretala se uglavnom u području od 2 do 8 mikrona. Direktnom usporedbom pod navedenim mikroskopom utvrđeno je da je morfologija ovih kristala slična morfologiji komercijalno pripravljenih svinjskih NPH mikrokristala, koji su također opisani kao kristali u obliku prutića. Veličina tih kristala također je bila slična veličini komercijalno pripravljenih NPH mikrokristala, Prosječna veličina iznosila je oko 5 mikrona. Specifikacija za komercijalnu proizvodnju za srednju duljinu NPH mikrokristala kreće se u rasponu od 1 do 40 mikrona.

S obzirom na svojstva vezana uz otpuštanje, te vrijeme djelovanja, mikrokristali ovog izuma su neočekivano i nepredvidljivo drukčiji u odnosu na NPH kristale. Preciznije, u uvjetima koji oponašaju fizikalne uvjete mikrokristali ovog izuma otapaju se znatno sporije u odnosu na kristale NPH inzulina, te osiguravaju dulju i ujednačeniju kontrolu glukoze u krvi u odnosu na NPH inzulin. To je dokazano slijedećim eksperimentima.

Za određene derivatizirane proteini u topljivom obliku pronađeno je da vrijeme djelovanja nije bitno različito u odnosu na humani inzulin. Koristile su se tri skupine životinja. Svaka životinja u prvoj skupini dobivala je dozu od 0,75 nmol/kg Humulina ® R (topljivi humani inzulin, svaka životinja u drugoj skupini dobivala je dozu od 0,75 nmol/kg topljivog B29-Nε-oktanoil humanog inzulina (C8-hI), a svaka životinja u trećoj skupini dobivala je dozu od 0,75 nmol/kg topljivog B29-Nε-heksanoil humanog inzulina (C10-hI). Pokus se provodio u skladu s Primjerom 5 na pet pasa po skupini. Proteini su se primjenjivali subkutano. Određene su koncentracije glukoze u krvi i prikazane u tablici koja slijedi.

Tablica 1. Koncentracije glukoze u krvi prije i nakon primjene Humulina ® R, topljivog B29-Nε-oktanoil humanog inzulina (C8-hI) ili topljivog B29-Nε-dekanoil humanog inzulina (C10-hI) kod zdravih pasa kojima je istovremeno dan somatostatin kako bi se prouzročilo privremeno stanje dijabetesa. Dane su srednje vrijednosti ± standardna pogreška.

[image]

Iz ovih podataka jasno je vidljivo da subkutanom primjenom topljivog B29-Nε-oktanoil humanog inzulina i topljivog B29-Nε-dekanoil humanog inzulina kod zdravih pasa, koje se nalaze u privremenom stanju dijabetesa, dolazi do smanjivanja glukoze koje se može ugrubo usporediti s učinkom topljivog humanog inzulina.

U drugom eksperimentu, primijećeno je da je brzina otpuštanja kokristala inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina (pripravljenog sukladno ovom izumu) primjetno veća u odnosu na komercijalno pripravljeni NPH svinjski inzulin. Taj podatak je bio najneočekivaniji s obzirom na gore dobivene podatke. Brzina otpuštanja može se mjeriti prema dobro poznatim postupcima (Graham i Pomeroy, J. Pharm. Pharmacol. 36 : 427 - 430 (1983), odnosno modificirano M. R. De Felippis i B. Frank, EP 735, 048), odnosno prema postupku korištenom u ovom izumu.

Brzina otpuštanja mikrokristala svinjskog NPH inzulina mjeren je na slijedeći način: u 3 ml Dulbecco-vog fosfatnog pufera (ne sadržava ni kalcij ni magnezij) koji se nalazi u četvrtastoj kvarcnoj kiveti (duljina 1 cm) dodano je 5 mikrolitara (100 i.j). svinjskog NPH inzulina, na temperaturi od 22 °C. Ova otopina kontinuirano se miješala na magnetskoj miješalici. Mjerila se vrijednost apsorbancije na 320 nm u vremenskom intervalu od jedne minute. Apsorbancija na 320 nm odgovara svjetlosti koje se raspršuje na netopljivim česticama prisutnim u vodenoj suspenziji. Postupno kako se mikrokristal otapa, vrijednost apsorbancije približava se 0. Nakon oko 20 minuta mikrokristali svinjskog NPH inzulina potpuno su se otopili.

Brzina otpuštanja kristala humanog inzulina na temelju protamin i cink koji nisu sadržavali kokristalizirani acetilirani humani inzulin također je iznosila oko 20 minuta, pod uvjetom da se koristi gore opisani postupak. Ti kristali NPH humanog inzulina pripremljeni su u skladu s postupkom opisanim u Pripravi #1 (u nastavku teksta), s iznimkom da se nije koristio acilirani protein, te da je uporabljeno 7 dijelova humanog inzulina. Podaci dobiveni u ovom pokusu prikazani su na Slici 1 kao iscrtkana linija.

Kokristali ovog izuma koji uključuju humani inzulin i B29-Nε-oktanoil-LysB29 humani inzulin pripremljeni su kao što je opisano u postupku Priprave #2, 4 i 5. Kod tih pripravaka maseni odnosi humanog inzulin i aciliranog inzulina iznosili su redom 3 : 1, 1 : 1, te 1 : 3.

Kako bi se mjerila brzina otpuštanja kokristala korišten je gore opisani postupak. U 3 ml Dulbecco-vog fosfatnog pufera (ne sadržava ni kalcij ni magnezij) koji se nalazi u četvrtastoj kvarcnoj kiveti (duljina 1 cm) dodano je 12 mikrolitara od svake komponente B29-Nε-oktanoil-LysB29 humani inzulin - humani inzulin kokristalinične suspenzije (koja ne sadržava više od 50 jedinica/ml. Ova otopina kontinuirano se miješala na magnetskoj miješalici na temperaturi od 22 °C. Podaci dobiveni u ovom pokusu prikazani su na Slici 1, a pokazuju da se 3: 1 kokristali otapaju duže od 100 minuta, 1 : 1 kokristali otapaju se 150 minuta, a 1 : 3 kokristali se nisu potpuno otopili niti nakon 400 minuta.

Vrijeme koje je bilo potrebno da se pri otapanju apsorbancija smanji na pola u odnosu na početnu vrijednost te konačnu vrijednost definira se kao t1/2. Dobivene t1/2 vrijednosti za ove pripravke prikazane su u Tablici 2.

Tablica 2. Vrijednosti otpuštanja t1/2 za Iletin NPH, humani inzulin NPH, te kokristale B29-oktanoil humanog inzulina i humani inzulin

[image]

Ovaj pokus pokazao je da je brzina otpuštanja 3 : 1, 1 : 1, 1 : 3 kokristala u Dulbecco-vom fosfatnom puferu koji ne sadržava ni kalcij ni magnezij (otopini koja oponaša želučani sok) znatno manja u odnosu na svinjske NPH mikrokristale. Ovaj pokus također je pokazao da je brzina otpuštanja mikrokristala protamin-cink humanog inzulina vrlo slična u odnosu na brzinu otpuštanja svinjskog NPH inzulina (iletin NPH). Ti rezultati nadalje ukazuju da brzina otpuštanja kokristala B29-Nε-oktanoil-LysB29 humani inzulin - humani inzulin ovisi o omjeru humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil-LysB29 humanog inzulina koji se nalaze u kokristalu. Brzina otpuštanja kokristala protamin-cink- B29-Nε-oktanoil-LysB29 humani inzulin - human inzulin smanjuje se kako se smanjuje udio humanog inzulina.

Drugi postupak mjerenja otpuštanja djelatne tvari, koji se osniva na određivanju otopljenog proteina i derivatiziranog proteina tehnikom tekućinske kromatografije visokog učinka, korišten je kako bi se usporedila brzina otpuštanja 1 : 3 mikrokristala (koji su prije opisani) s komercijalnim pripravcima humanog NPH inzulina, humanog inzulina ultralente, goveđeg inzulina ultralente, te kako bi se proučio utjecaj variranja omjera proteina i derivatiziranih proteina na brzinu otpuštanja.

0,5 ml pripravka koji sadržava 100 jedinica suspendirano je u 200 ml Dulbecco-vog fosfatnog pufera podešenog na pH 7,4 u “water-jacketed” aparaturi za otpuštanje djelatne tvari na temperaturi od 25 °C. Pufer također sadržava 1 mg/ml humanog albumina iz seruma kako bi se spriječili gubici otopljenog inzulina. Medij u kojem se odvija otpuštanje kontinuirano se miješa brzinom od 180 okretaja u minuti. U pravilnim razmacima vadi se 3,5 ml ove otopine te filtrira preko filtra koji slabo veže proteine, veličine pora od 0,22 µm. Odbacuje se prvih 0,5 ml filtrata, a slijedećih 1,5 ml filtrata zakiseli se s 4 ml 5 M HCl te dalje proslijedi na HPLC analizu. Koncentracije otopljenih inzulina određivale su se pomoću površina HPLC pikova, a rezultati su se izražavali kao postotak otopljenog inzulina u funkciji vremena, pri čemu je 100 % bila ukupna površina inzulina u neprofiltriranom uzorku. Ako se ukupna površina dobivena iz neprofiltriranog uzorka vrlo malo smanjivala u funkciji vremena, pri računanju postotka otopljenog inzulina uzimalo se da je linearni korekcijski faktor 100 % za svaku pojedinačnu točku koja je predstavljala vrijeme trajanja otpuštanja. Rezultati ovih ispitivanja prikazani su na Slikama 3 i 4.

Podaci sa Slike 3 ukazuju da postoji slijedeća relacija: što je veći udio derivatiziranog proteina ugrađenog u mikrokristal, to je manja brzina otpuštanja. Podaci sa Slike 4 pokazuju da se 1 : 3 mikrokristali humanog inzulina i B29-oktanoil humanog inzulina otapaju bitno slabije u usporedbi s humanim inzulinom NPH i humanim inzulinom ultralente. Najznakovitiji bio je podatak da je brzina otpuštanja 1 : 3 mikrokristala bila slična brzini kod goveđeg ultralente. Dugo vremena goveđi ultralente inzulin smatrao se gotovo idealnim pripravkom s dugim djelovanjem jer je imao izrazito dugu biološku aktivnost, te jer je nakon primjene njegov farmakodinamički odgovor bio vrlo ujednačen. Stoga je tada predviđeno da bi se ti kristali mogli približiti ili čak prestići goveđi ultralente s obzirom na svoju sposobnost kontroliranja proizvodnje bazalne glukoze u vrlo dugom vremenskom periodu.

S obzirom da je profil duljine djelovanja NPH pripravaka izrazito povezan sa stupnjem otpuštanja mikrokristala u subkutanoj tekućini, zaključeno je na temelju ovog eksperimenta da mikrokristalinične pripravke ovog izuma karakterizira znatno duže vrijeme djelovanja ako se primjenjuju subkutano na pacijentima koji boluju od dijabetesa, u odnosu na komercijalne NPH inzulinske pripravke. Također je vrlo važno to što ovi rezultati ukazuju da ovaj izum omogućava kontrolu, pa čak i optimalizaciju vremena djelovanja kod pacijenata jer je moguća manipulacija omjera proteina i derivatiziranog proteina.

Ova sposobnost manipulacije duljinom djelovanja, koja se postiže jednostavnom izmjenom omjera proteina i derivatiziranog proteina, naročita je značajna s povijesnog stajališta. Povijesno gledano, najveća zapreka u razvoju inzulinskih pripravaka koji su trebali kontrolirati proizvodnju bazalne glukoze bila je činjenica da je njihovo vrijeme djelovanja bilo u nefleksibilnoj vezi s bitnim molekulskim svojstvima proteina, npr. afinitetom vezanja na albumin, izoelektričnom točkom, te topljivošću. Posljedica toga bila je ta da je bilo moguće samo pojedinačno vrijeme djelovanja za svaku molekulu ili pripravak, a samo daljnjim modificiranjem molekule moglo se očekivati da će se poboljšati farmakokinetika.

Vrlo bitan cilj razvoja bio je razvoj postupka priprave takvih farmaceutskih pripravaka kod kojih je moguće jednostavno i precizno podešavanje farmakokinetike manipuliranjem matriksa pripravka. Provedena su mnoga akademska i industrijska istraživanja u tom smjeru u proteklih 15 godina, no pokazalo se da je postavljeni zadatak, koji je težio proizvodnji pripravaka s kontroliranim otpuštanjem, gotovo iluzoran zbog niza razloga kao što su vrlo uski terapijski indeks inzulina, zahtjev za njegovom uporabom u kroničnim slučajevima, financijska ograničenja koja su bila protiv sofisticiranih i skupih postupaka i pripravaka.

Najveća prednost ovog izuma je ta što je dobiven sustav s kontroliranim otpuštanjem u kojem se može lakše kontrolirati farmakokinetika otpuštanja inzulina u odnosu na druge predložene tehnologije za kontrolirano otpuštanje. Ta prednost proizlazi iz činjenice da je dobiven netopljivi pripravak koji uključuje inzulin, pri čemu derivatizirani protein omogućava pogodno podešavanje brzine otpuštanja te je stoga moguće kontrolirano otpuštanje. Smatra se (pri čemu se ne želi ograničiti izum) da se farmakološka učinkovitost netopljivih spojeva ovog izuma osniva na sporom otpuštanju pogodnog omjera proteina i derivatiziranog proteina. Nadalje se vjeruje da (pri čemu se ne želi ograničiti izum) je znakovito obilježje ovog izuma potpuna odnosno gotovo potpuna homogenost netopljive tvari.

Vjeruje s da svaki pojedinačni mikrokristal u suspenziji sadržava gotovo isti odnos proteina i derivatiziranog proteina. Ovaj odnos vrlo je blizak odnosu proteina i derivatiziranog proteina koji su pomiješani u otopini prije kristalizacije. Također se vjeruje da kako se otapa mikrokristal, dolazi do konzistentnog i predodređenog otpuštanja određene količine proteina i derivatiziranog proteina tijekom ukupnog trajanja procesa otpuštanja. Važnost ovog ponašanja je u tome što dolazi do kontinuirane ali smanjene brzine otpuštanja dvije aktivne molekule s mjesta na kojem je dana injekcija pa prema krvotoku. Da bi se postigao ovaj cilj, mora se obratiti posebna pozornost proizvodnji ovih pripravaka.

Otkriće da je moguća kristalizacija proteina s derivatiziranim proteinom, čime nastaje homogeni kokristal bilo je iznenađujuće s obzirom na kompleksnost svih parametara koji utječu na kristalizaciju proteina (specifične i nespecifične intermolekulske reakcije poput vodikovih veza, elektrostatske interakcije, hidrofobne interakcije, van der Waalsove sile, utjecaj volumena, topljivost, te sterički volumen). Premda su saznanja o kristalizaciji malih molekula relativno napredna, kod kompleksnih makromolekula još uvijek se radi o poprilično kvalitativnoj znanosti, te se sadašnja praksa sastoji od empirijske primjene mnoštva različitih postupaka kristalizacije.

Smatra se da hidrofobni učinak ima najveću zaslugu za stvaranje proteinskog asocijata (C. Chotia i suradnici, Nature 256 : 705-708 (1975)). Nadalje, primijećena je jaka korelacija između hidrofobnosti i protein-protein kontakta. (L. Young i suradnici, Protein Science 3 : 717 : 729 (1994)). S obzirom na kompleksnost pojma kristalizacije proteina, začuđuje otkriće da derivatizirani inzulin može kokristalizirati s nederivatiziranim proteinom na način da je izomorfan odnosno gotovo izomorfan običnom inzulinu.

Kokristalizacijom dva srodna terapeutska proteina modificira se terapeutsko ponašanje što predstavlja potpuno novi koncept. Ogromna većina aktivnosti vezana uz posao oko kristalizacije proteina svodi se na dobivanje monokristala, dovoljno velikog i homogenog kako bi se mogla provesti rendgenska strukturna analiza. Premda su poznati kokristali, takvi kokristalni sustavi predstavljaju komplekse tipa domaćin-gost (supstrat), na primjer protein i njegov receptor, kompleksi protein i DNA, te kompleksi receptora proteina i djelatne tvari. Ovi kompleksi tipa domaćin-gost suštinski se razlikuju od kokristala ovog izuma jer ne nastaje kompleks između proteina i derivatiziranog proteina.

Mjerenja koncentracije proteina i derivatiziranog proteina (pomoću tekućinske kromatografije visokog učinka) tijekom proučavanja otpuštanja, u kojima su se koristila dva mikrokristalinična pripravka pripravljena na taj način da su bile poznate količine humanog inzulina (proteina) i B29-oktanoil humanog inzulina (derivatiziranog proteina), pokazala su da je moguće predvidjeti omjer proteina i derivatiziranog proteina; kao i homogenost netopljivih sastojaka ovog izuma. Kod prvog pripravka, omjer masa uporabljenog proteina i uporabljenog derivatiziranog proteina iznosio je 1 : 3. Kod drugog pripravka taj je odnos iznosio 55 : 45. Kod 1 : 3 mikrokristala, B29-oktanoil humani inzulin činio je od 73 % do 76 % ukupne količine proteina koja se koristila za 14 mjerenja tijekom 10 sati koliko je trajao postupak otpuštanja (pod gore opisanim uvjetima). Obradom podataka nije uočena nikakva tendencija vezana uz podatke. Kod 55 : 45 mikrokristala, B29-oktanoil humani inzulin činio je od 43 % do 47 % ukupne količine proteina koja se koristila za 9 mjerenja tijekom 3,75 sati koliko je trajao postupak otpuštanja, pod gore opisanim uvjetima. Ponovno nije uočeno postojanje nikakve tendencije.

Netopljive tvari ovog izuma mogu biti kristali prutićaste morfologije ili pak nepravilne morfologije, odnosno to mogu biti amorfni talozi. Pogodnije netopljive tvari uključuju acilirani inzulin ili analog aciliranog inzulina, cinkove ione (koji su zastupljeni u količini od 0,3 do 0,7 mola po molu ukupnog proteina) fenolni konzervans kojeg čini skupina spojeva kao što su fenol, m-krezol, o-krezol, p-krezol, klorokrezol, metilparaben, te njihove smjese, a količina konzervansa određuje se s obzirom na ukupnu količinu proteina kako bi se stabilizirale T3R3 ili R6 heksamerne konformacije, te protamin koji je zastupljen u iznosu od 0,15 do 0,7 mola po molu ukupnog proteina.

Pogodnija skupina analoga inzulina koja služi za pripravu analoga derivatiziranog inzulina, a koristila se za pripravu netopljivih spojeva ovog izuma, sastoji se od životinjskog inzulina, analoga kojima nedostaje poneka amino-kiselina ("deletion" analog), te pI-pomaknutih analoga. Najpogodnija skupina sastoji se od životinjskog inzulina, te analoga kojima nedostaje poneka amino-kiselina ("deletion" analog).

Slijedeća skupina pogodnih analoga inzulina koja se koristila za pripravu mikrokristala opisanih u ovom izumu sastoji se od monomernih analoga inzulina. Posebno su pogodni oni monomerni analozi inzulina kod kojih je amino-kiselinski ostatak na položaju B28 Asp, Lys, Leu, Val ili Ala, amino-kiselinski ostatak na položaju B29 Lys, ili Pro, amino-kiselinski ostatak na položaju B10 His ili Asp, amino-kiselinski ostatak na položaju B1 Phe, Asp ili samo prazno mjesto odnosno prazno mjesto u kombinaciji s praznim mjestom ostatka na položaju B2, amino-kiselinski ostatak na položaju B30 Thr, Ala, Ser, ili prazno mjesto, te amino-kiselinski ostatak na položaju B9 Ser ili Asp, pri čemu na jednom od položaja B28 ili B29 treba biti Lys.

Slijedeća pogodna skupina analoga inzulina koja se koristi u ovom izumu sastoji se od onih analoga čija se izoelektrična točka nalazi u području od 7,0 do 8,0. Ti analozi se odnose na “pI-pomaknute” analoge inzulina. Primjeri takvih pI-pomaknutih analoga inzulina uključuju ArgB31, ArgB32 humani inzulin, GlyA21, ArgB31, ArgB32 humani inzulin, ArgA0, ArgB31, ArgB32 humani inzulin te Arg0, GlyA21ArgB31, ArgB32 humani inzulin.

Slijedeća pogodna skupina analoga inzulina sastoji se od LysB28, ProB29, humanog inzulina (B28 je Lys; B29 je Pro); AspB28 humanog inzulina (B28 je Asp), AspB1humanog inzulina ArgB31, ArgB32 humanog inzulina, ArgA0 humanog inzulina, AspB1, GluB13 humanog inzulina, AlaB26 humanog inzulina, GlyA21 humanog inzulina, des(ThrB30) humanog inzulina te GlyA21, ArgB31, ArgB32 humanog inzulina.

Posebno pogodni analozi inzulina su LysB28, ProB29 humani inzulin, des(ThrB30) humani inzulin, AspB28 humani inzulin te AlaB26 humani inzulin. Slijedeći posebno pogodni analog inzulina je GlyA21, ArgB31, ArgB32 humani inzulin (M. Doerschung, U.S. Patent br. 5, 656, 722, 12. kolovoza 1997. godine). Najpogodniji analog inzulina je LysB28, ProB29 humani inzulin.

Pogodni derivatizirani proteini su acilirani proteini. Pogodni acilirani proteini za mikrokristalinične pripravke ovog izuma su inzulin aciliran masnom kiselinom, te analozi inzulina aciliranog masnom kiselinom. Posebno pogodan je humani inzulin aciliran masnom kiselinom. Jednako pogodni su i analozi inzulina aciliranog masnom kiselinom.

Određena skupina koja se koristi za derivatiziranje inzulina, analoga inzulina odnosno proinzulina (skupno proteina) može biti bilo koja kemijska skupina koja ne snižava značajno biološku aktivnost proteina, koja nije toksična nakon što se veže na protein, te što je najvažnije, koja smanjuje topljivost u vodi, povećava lipofilnost, ili pak smanjuje topljivost cink/protamin kompleksa derivatiziranog proteina.

Skupina pogodnih aciliranih spojeva sastoji se od zasićenih masnih kiselina nerazgranatog lanca. U tu skupinu ubrajaju se metanska kiselina (C1), etanska kiselina (C2), propanska kiselina (C3), n-butanska kiselina (C4), n-pentanska kiselina (C5), n-heksanska kiselina (C6), n-heptanska kiselina (C7), n-oktanska kiselina (C8), n-nonanska kiselina (C9), n-undekanska kiselina (C10), n-dodekanska kiselina (C12), n-tridekanska kiselina (C13), n-tetradekanska kiselina (C14), n-pentadekanska kiselina (C15), n-heksadekanska kiselina (C17), te n-oktadekanska kiselina (C18). Dodatni oblici su formil (C1), acetil (C2), propanoil (C3), butanoil (C4), pentanoil (C5), heksanoil (C6), heptanoil (C7), oktanoil (C8), nonanoil (C9), dekanoil (C10); undekanoil (C11), dodekanoil (C12), tridekanoil (C13), tetradekanoil (C14), pentadekanoil ili miristoil (C15), heksadekanoil ili palmitil (C16), heptadekanoil (C17), oktadekanoil ili stearil (C18).

Skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima paran broj ugljikovih atoma, iz čeg slijedi da su to C2, C4, C6, C8, C10, C12, C14, C16, te C18 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima neparan broj ugljikovih atoma, iz čeg slijedi da su to C1, C3, C5, C7, C9, C11, C13, C15 te C17 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima broj ugljikovih atoma veći od 5, iz čeg slijedi da su to C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12,C13, C14, C15, C16, C17 te C18 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima broj ugljikovih atoma manji od 9, iz čeg slijedi da su to C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, te C8 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima od 6 do 8 ugljikovih atoma iz čeg slijedi da su to C6, C7, te C8 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima od 4 do 6 ugljikovih atoma iz čeg slijedi da su to C4, C5, te C6 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima od 2 do 4 ugljikovih atoma iz čeg slijedi da su to C2, C3, te C4 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima od manje od 6 ugljikovih atoma iz čeg slijedi da su to C1, C2, C3, C4, te C5 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima manje od 4 ugljikovih atoma iz čeg slijedi da su to C1, C2, te C3 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima više od 9 ugljikovih atoma iz čeg slijedi da su to C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, te C18 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima paran broj ugljikovih , te više od 9 ugljikovih atoma iz čeg slijedi da su to C10, C12, C14, C16, te C18 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima 12, 14, odnosno 16 ugljikovih atoma iz čeg slijedi da su to C12, C14, te C16 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima 14, odnosno 16 ugljikovih atoma iz čeg slijedi da su to C14, te C16 zasićene masne kiseline. Posebno su pogodne masne kiseline sa 16 C atoma.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima od 4 do 10 ugljikovih atoma iz čeg slijedi da su to C4, C5, C6, C7, C8, C9, te C10 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima paran broj ugljikovih, te ima od 4 do 10 ugljikovih atoma iz čeg slijedi da su to C4, C6, C8, te C10 zasićene masne kiseline.

Slijedeća skupina masnih kiselina koja je pogodna za pripravu proteina aciliranih masnom kiselinom (koji stvaraju mikrokristale opisane u ovom izumu) ima od 6 do 10 ugljikovih atoma iz čeg slijedi da su to C4, C6, C8, te C10 zasićene masne kiseline. Posebno su pogodne masne kiseline sa 6 C atoma. Također su posebno pogodne masne kiseline s 8 C atoma. Također su posebno pogodne masne kiseline s 10 C atoma.

Osoba koja se bavi ovim područjem razumjet će zašto je navedena tako uska podjela gore navedenih skupina.

Slijedeću skupina pogodnih aciliranih spojeva čine razgranate masne kiseline. Razgranate masne kiseline moraju imati barem dvije “grane”. Duljina “grane” razgranate masne kiseline opisuje se brojem C atoma u “grani” počevši s ugljikom iz karboksilne kiseline. Na primjer, 3-etil-5-metilheksanska kiselina ima tri “grane” čije duljine iznose 5, 6 te 6 C atoma. U ovom slučaju najdulja je ona grana koja ima 6 C atoma. Slijedeći primjer je 2,3,4,5- tetraetiloktanska kiselina koja ima 5 grana duljine 4, 5, 6, 7, te 8 C atoma. Najdulja grana ima 8 C atoma. Pogodne su one razgranate masne kiseline koje imaju od 3 do10 C atoma u najduljoj grani.

Spomenut ćemo određeni broj takvih razgranatih zasićenih masnih kiselina kako bi čitatelju pomogli da shvati o kakvom broju masnih kiselina se tu radi koje se mogu koristiti za aciliranje proteina ovog izuma: 2-metil-propanska kiselina, 2-metil-butanska kiselina, 3-metil-butanska kiselina, 2,2-dimetil-propanska kiselina, 2-metil-pentansaka kiselina, 3-metil-pentansaka kiselina, 4-metil-pentansaka kiselina, 2,2-dimetil-butanska kiselina, 2,3-dimetil-butanska kiselina, 3,3-dimetil-butanska kiselina, 2-etil-butanska kiselina, 2-metil-heksanska kiselina, 5-metil-heksanska kiselina, 2,2,-dimetil-pentanska kiselina, 2,4-dimetil-pentanska kiselina, 2-etil-3-metil-butanska kiselina, 2-etil-pentanska kiselina, 3-etil-pentanska kiselina, 2,2,-dimetil-trimetil-butanska kiselina, 2-metil-heptanska kiselina, 3-metil-heptanska kiselina, 4-metil-heptanska, 5-metil-heptanska kiselina, 6-metil-heptanska kiselina, 2,2-dimetil-heksanska kiselina, 2,3-dimetil-heksanska kiselina, 2,4-dimetil-heksanska kiselina, 2,5-dimetil-heksanska kiselina, 3,3-dimetil-heksanska kiselina, 3,4-dimetil-heksanska kiselina, 3,5-dimetil-heksanska kiselina, 4,4-dimetil-heksanska kiselina, 2-etil-heksanska kiselina, 3-etil-heksanska kiselina, 4-etil-heksanska kiselina, 2-propil-pentanska kiselina, 2-etil-heksanska kiselina, 3-etil-heksanska kiselina, 4-etil-heksanska kiselina, 2-(1-propil)pentanska kiselina, 2-(2-propil)pentanska kiselina, 2,2-dietil-butanska kiselina, 2,3,4-trimetil-pentanska kiselina, 2-metil-oktanska kiselina, 4-metil-oktanska kiselina, 7-metil-oktanska kiselina, 2,2-dimetil-heptanska kiselina, 2,6-dimetil-heptanska kiselina, 2-etil-2-metil-heksanska kiselina, 3-etil-5-metil-heksanska kiselina, 3-(1-propil)heksanska kiselina, 2-(2-butil)pentanska kiselina, 2-(2-(metilpropil))pentanska kiselina, 2-metil-nonanska kiselina, 8-metil-nonanska kiselina, 6-etil-oktanska kiselina, 4-(1-propil)heptanska kiselina, 5-(2-propil)heptanska kiselina, 3-metil-undekanska kiselina, 2-pentil-heptanska kiselina, 2,3,4,5,6-pentametil-heptanska kiselina, 2,6-dietil-oktanska kiselina, 2-heksil-oktanska kiselina, 2,3,4,5,6,7-heksametil-oktanska kiselina, 3,3-dietil-4,4-dietilheksanska kiselina, 2-heptil-nonanska kiselina, 2,3,4,5-tetraetiloktanska kiselina, 2-oktil-dekanska kiselina i 2-(1-propil)-3-(1-propil)-4,5-dietil-6-metil-heptanska kiselina.

Slijedeću pogodnu skupina čine acilirani spojevi cikličnih alkilnih kiselina koje imaju od 5 do 24 C atoma, pri čemu prsten sadržava od 5 do 7 atoma. Spomenut ćemo određeni broj takvih cikličkih zasićenih masnih kiselina kako bi čitatelju pomogli da shvati o kakvom broju masnih kiselina se tu radi, a koje se mogu koristiti za aciliranje proteina ovog izuma: cikolpentil-mravlja kiselina, cikloheksil-mravlja kiselina, 1-ciklopentil-octena kiselina, 2-cikloheksil-octena kiselina, 1,2-diciklopentil-octena kiselina i dr.

Pogodna skupina derivatiziranih proteina koja se koristi za pripravu netopljivih pripravka ovog izuma sastoji se od monoaciliranih proteina. Najpogodnija je monoacilacija ε-amino skupine. Kod inzulina, najpogodnije je mono-aciliranje na LysB29. Slično tome, za određene analoge inzulina poput LysB28, ProB29 humanog inzulina, najpogodnije je monoaciliranje ε-amino skupine na LysB28. Također je vrlo pogodno i aciliranje α-amino skupine B-lanca (B1). Također je vrlo pogodno i aciliranje α-amino skupine A-lanca (A1).

Slijedeća pogodna grupa acetiliranih proteina koja se koristi za pripravu netopljivih pripravka ovog izuma sastoji se od di-aciliranih proteina. Di-acilacija se može provesti na primjer na ε-amino skupini lizina i na α-amino skupini B-lanca, odnosno na ε-amino skupini lizina i na α-amino skupini A-lanca, odnosno na α-amino skupini A-lanca i na α-amino skupini B-lanca.

Slijedeća pogodna grupa acetiliranih proteina koja se koristi za pripravu netopljivih pripravka ovog izuma sastoji se od tri-aciliranih proteina. Tri-acilacija se može provesti na ε-amino skupini lizina, na α-amino skupini B-lanca, te na α-amino skupini A-lanca.

Također je pogodna uporaba aciliranih proteina koji predstavljaju smjese mono-aciliranih i di-aciliranih proteina.

Slično tome, pogodna je uporaba aciliranih proteina koji predstavljaju smjese mono-aciliranih i tri-aciliranih proteina.

Također je pogodna uporaba aciliranih proteina koji predstavljaju smjese mono-aciliranih,, di-aciliranih, te tri-aciliranih proteina.

Spomenut ćemo određeni broj proteina aciliranih masnom kiselinom koji se koriste u pripravi monokristala opisanih u ovom izumu, kako bi čitatelju pomogli da shvati područje interesa ovog izuma. Popis je ilustrativan, a činjenica da neki od proteina aciliranih masnom kiselinom nisu spomenuti u popisu ne znači da mikrokristal koji ih sadrži ne spada u područje interesa ovog izuma.

B29-Nε-formil humani inzulin.

B1-Nα-formil humani inzulin.

A1-Nα-formil humani inzulin.

B29-Nε-formil-, B1-Nα-formil humani inzulin.

B29-Nε-formil-, A1-Nα-formil humani inzulin.

A1-Nα-formil-, B1-Nα-formil humani inzulin.

B29-Nε-formil-, A1-Nα-formil-, B1-Nα-formil humani inzulin.

B29-Nε-acetil humani inzulin.

B1-Nα-acetil humani inzulin.

A1-Nα-acetil humani inzulin.

B29-Nε-acetil-, B1-Nα-acetil humani inzulin.

B29-Nε-acetil-, A1-Nα-acetil humani inzulin.

A1-Nα-acetil-, B1-Nα-acetil humani inzulin.

B29-Nε-acetil-, A1-Nα-acetil-, B1-Nα-formil humani inzulin.

B29-Nε-propanoil humani inzulin.

B1-Nα-propanoil humani inzulin.

A1-Nα-propanoil humani inzulin.

B29-Nε-propanoil-, B1-Nα-propanoil humani inzulin.

B29-Nε-propanoil-, A1-Nα-propanoil humani inzulin.

A1-Nα-propanoil-, B1-Nα-propanoil humani inzulin.

B29-Nε-propanoil-, A1-Nα-propanoil-, B1-Nα-propanoil humani inzulin.

B29-Nε-butanoil humani inzulin.

B1-Nα-butanoil humani inzulin.

A1-Nα-butanoil humani inzulin.

B29-Nε-butanoil-, B1-Nα-butanoil humani inzulin.

B29-Nε-butanoil-, A1-Nα-butanoil humani inzulin.

A1-Nα-butanoil-, B1-Nα-butanoil humani inzulin.

B29-Nε-butanoil-, A1-Nα-butanoil-, B1-Nα-butanoil humani inzulin.

B29-Nε-pentanoil humani inzulin.

B1-Nα-pentanoil humani inzulin.

A1-Nα-pentanoil humani inzulin.

B29-Nε-pentanoil-, B1-Nα-pentanoil humani inzulin.

B29-Nε-pentanoil-, A1-Nα-pentanoil humani inzulin.

A1-Nα-pentanoil-, B1-Nα-pentanoil humani inzulin.

B29-Nε-pentanoil-, A1-Nα-pentanoil-, B1-Nα-pentanoil humani inzulin.

B29-Nε-heksanoil humani inzulin.

B1-Nα-heksanoil humani inzulin.

A1-Nα-heksanoil humani inzulin.

B29-Nε-heksanoil-, B1-Nα-heksanoil humani inzulin.

B29-Nε-heksanoil-, A1-Nα-heksanoil humani inzulin.

A1-Nα-heksanoil-, B1-Nα-heksanoil humani inzulin.

B29-Nε-heksanoil-, A1-Nα-heksanoil-, B1-Nα-heksanoil humani inzulin.

B29-Nε-heptanoil humani inzulin.

B1-Nα-heptanoil humani inzulin.

A1-Nα-heptanoil humani inzulin.

B29-Nε-heptanoil-, B1-Nα-heptanoil humani inzulin.

B29-Nε-heptanoil-, A1-Nα-heptanoil humani inzulin.

A1-Nα-heptanoil-, B1-Nα-heptanoil humani inzulin.

B29-Nε-heptanoil-, A1-Nα-heptanoil-, B1-Nα-heptanoil humani inzulin.

B29-Nε-oktanoil humani inzulin.

B1-Nα-oktanoil humani inzulin.

A1-Nα-oktanoil humani inzulin.

B29-Nε-oktanoil-, B1-Nα-oktanoil humani inzulin.

B29-Nε-oktanoil-, A1-Nα-oktanoil humani inzulin.

A1-Nα-oktanoil-, B1-Nα-oktanoil humani inzulin.

B29-Nε-oktanoil-, A1-Nα-oktanoil-, B1-Nα-oktanoil humani inzulin.

B29-Nε-nonanoil humani inzulin.

B1-Nα-nonanoil humani inzulin.

A1-Nα-nonanoil humani inzulin.

B29-Nε-nonanoil-, B1-Nα-nonanoil humani inzulin.

B29-Nε-nonanoil-, A1-Nα-nonanoil humani inzulin.

A1-Nα-nonanoil-, B1-Nα-nonanoil humani inzulin.

B29-Nε-nonanoil-, A1-Nα-nonanoil-, B1-Nα-nonanoil humani inzulin.

B29-Nε-dekanoil humani inzulin.

B1-Nα-dekanoil humani inzulin.

A1-Nα-dekanoil humani inzulin.

B29-Nε-dekanoil-, B1-Nα-dekanoil humani inzulin.

B29-Nε-dekanoil-, A1-Nα-dekanoil humani inzulin.

A1-Nα-dekanoil-, B1-Nα-dekanoil humani inzulin.

B29-Nε-dekanoil-, A1-Nα-dekanoil-, B1-Nα-dekanoil humani inzulin.

B29-Nε-undekanoil humani inzulin.

B1-Nα-undekanoil humani inzulin.

A1-Nα-undekanoil humani inzulin.

B29-Nε-dodekanoil humani inzulin.

B1-Nα-dodekanoil humani inzulin.

A1-Nα-dodekanoil humani inzulin.

B29-Nε-tridekanoil humani inzulin.

B1-Nα-tridekanoil humani inzulin.

A1-Nα-tridekanoil humani inzulin.

B29-Nε-tetradekanoil humani inzulin.

B1-Nα-tetradekanoil humani inzulin.

A1-Nα-tetradekanoil humani inzulin.

B29-Nε-pentadekanoil humani inzulin.

B1-Nα-pentadekanoil humani inzulin.

A1-Nα-pentadekanoil humani inzulin.

B29-Nε-heksadekanoil humani inzulin.

B1-Nα-heksadekanoil humani inzulin.

A1-Nα-heksadekanoil humani inzulin.

B29-Nε-heptadekanoil humani inzulin.

B1-Nα-heptadekanoil humani inzulin.

A1-Nα-heptadekanoil humani inzulin.

B29-Nε-oktadekanoil humani inzulin.

B1-Nα-oktadekanoil humani inzulin.

A1-Nα-oktadekanoil humani inzulin.

B28-Nε-formil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-formil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-formil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-formil-, B1-Nα-formil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-formil-, A1-Nα-formil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-formil-, B1-Nα-formil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-formil-, A1-Nα-formil B1-Nα-formil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-acetil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-acetil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-acetil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-acetil-, B1-Nα-acetil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-acetil-, A1-Nα-acetil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-acetil-, B1-Nα-acetil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-acetil-, A1-Nα-acetil B1-Nα-acetil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-propanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-propanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-propanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-propanoil-, B1-Nα-propanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-propanoil-, A1-Nα-propanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-propanoil-, B1-Nα-propanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-propanoil-, A1-Nα-propanoil B1-Nα-propanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-butanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-butanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-butanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-butanoil-, B1-Nα-butanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-butanoil-, A1-Nα-butanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-butanoil-, B1-Nα-butanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-butanoil-, A1-Nα-butanoil B1-Nα-butanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-pentanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-pentanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-pentanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-pentanoil-, B1-Nα-pentanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-pentanoil-, A1-Nα-pentanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-pentanoil-, B1-Nα-pentanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-pentanoil-, A1-Nα-pentanoil B1-Nα-pentanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-heksanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-heksanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-heksanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-heksanoil-, B1-Nα-heksanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-heksanoil-, A1-Nα-heksanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-heksanoil-, B1-Nα-heksanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-heksanoil-, A1-Nα-heksanoil B1-Nα-heksanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-heptanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-heptanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-heptanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-heptanoil-, B1-Nα-heptanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-heptanoil-, A1-Nα-heptanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-heptanoil-, B1-Nα-heptanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-heptanoil-, A1-Nα-heptanoil B1-Nα-heptanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-oktanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-oktanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-oktanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-oktanoil-, B1-Nα-oktanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-oktanoil-, A1-Nα-oktanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-oktanoil-, B1-Nα-oktanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-oktanoil-, A1-Nα-oktanoil B1-Nα-oktanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-nonanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-nonanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-nonanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-nonanoil-, B1-Nα-nonanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-nonanoil-, A1-Nα-nonanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-nonanoil-, B1-Nα-nonanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-nonanoil-, A1-Nα-nonanoil B1-Nα-nonanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-dekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-dekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-dekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-dekanoil-, B1-Nα-dekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-dekanoil-, A1-Nα-dekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-dekanoil-, B1-Nα-dekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-dekanoil-, A1-Nα-dekanoil B1-Nα-dekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-undekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-undekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-undekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-dodekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-dodekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-dodekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-tridekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-tridekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-tridekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-tetradekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-tetradekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-tetradekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-pentadekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-pentadekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-pentadekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-heksadekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-heksadekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-heksadekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-heptadekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-heptadekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-heptadekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B28-Nε-oktadekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B1-Nα-oktadekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

A1-Nα-oktadekanoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

B29- Nε-pentanoil-GlyA21, ArgB31, Arg B32 humani inzulin.

B1-Nα-heksanoil-GlyA21, ArgB31, Arg B32 humani inzulin.

A1-Nα-oktanil-GlyA21, ArgB31, Arg B32 humani inzulin.

B29- Nε-oktanoil, -B1-Nα-oktanil-GlyA21, ArgB31, Arg B32 humani inzulin.

B29- Nε-propanoil-, A1-Nα-propanoil-GlyA21, ArgB31, Arg B32 humani inzulin.

A1- Nα-acetil-, B1-Nα-acetil-GlyA21, ArgB31, Arg B32 humani inzulin.

B29- Nε-formil-, A1-Nα-formil-, B1-Nα-formil-GlyA21, ArgB31, Arg B32 humani inzulin.

B29- Nε-formil-des(TyrB26) humani inzulin.

B1-Nα-acetil-AspB28 humani inzulin.

B29- Nε-propanoil-, A1-Nα-propanoil-, B1-Nα-propanoil-AspB1, AspB3, AspB21 humani inzulin.

A1-Nα-butanoil-AspB10 humani inzulin.

B29- Nε-pentanoil-GlyA21 humani inzulin.

B1-Nα-heksanoil-GlyA21 humani inzulin.

A1-Nα-heptanoil-GlyA21 humani inzulin.

B29- Nε-oktanoil-, B1-Nα-oktanoil- GlyA21 humani inzulin.

B29- Nε-propanoil-, A1-Nα-propanoil-GlyA21 humani inzulin.

A1-Nα-acetil, B1-Nα-acetil-GlyA21 humani inzulin.

B29- Nε-formil-, A1-Nα-formil-, B1-Nα-formil-GlyA21 humani inzulin.

B29- Nε-butanoil-des(ThrB30) humani inzulin.

B1-Nα-butanoil-des(ThrB30) humani inzulin.

A1-Nα- butanoil-des(ThrB30) humani inzulin.

B29- Nε-butanoil-, B1-Nα-butanoil-des(ThrB30) humani inzulin.

B29- Nε-butanoil-, A1-Nα-butanoil-des(ThrB30) humani inzulin.

A1-Nα-butanoil, B1-Nα-butanoil-des(ThrB30) humani inzulin.

B29- Nε-butanoil-, A1-Nα-butanoil, B1-Nα-butanoil-des(ThrB30) humani inzulin.

Pogodni su vodeni pripravci koji sadržavaju vodu kao glavno otapalo. Izrazito su pogodne vodene suspenzije u kojima je voda glavno otapalo.

Pripravci ovog izuma namijenjeni su liječenju pacijenata koji boluju od dijabetesa ili hiperglikemije. Pripravci ovog izuma obično sadržavaju derivatizirani protein u koncentraciji od 1 mg/ml do 10 mg/ml. Za pripravke ovog izuma obično se koriste jedinice aktivnosti (jedinica/ml), kao što su 40 jedinica, 50 jedinica, 100 jedinica itd., što odgovara ugrubo koncentraciji od 1,4, 1,75, te 3,5 mg/ml. Dozu, način primjene, te broj dnevnih doza određuje liječnik koji uzima u obzir slijedeće faktore kao što su svrha terapije, priroda i uzrok bolesti, spol i težina pacijenta, uvježbanost, prehrambene navike, način primjene lijeka, te ostali faktori koji su poznati stručnom liječniku. Dnevna se doza najčešće nalazi u području od 1 nmol/kg tjelesne težine do 6 nmol/kg tjelesne težine (6 nmol predstavlja ekvivalent 1 jedinici inzulinske aktivnosti). Doza koja sadržava oko 2 do 3 nmol/kg je najčešća u inzulinskoj terapiji koju propisuje ovaj izum.

Liječnik s prosječnim iskustvom u liječenju dijabetesa moći će izabrati najbolju terapiju koja će uključiti primjenu pripravaka opisanih u ovom izumu.

Tipični načini parenteralne primjene pripravaka u obliku suspenzije su subkutana i intramuskularna primjena. Pripravci ovog izuma mogu se također primjenjivati nazalno, bukalno, pulmonarno ili okularno.

Kao pogodno sredstvo za izotonizaciju koristi se glicerol koncentracije od 12 mg/ml do 25 mg/ml. Najpogodnija koncentracija glicerola koji se koristi za izotonizaciju kreće se u području od 15 mg/ml do 17 mg/ml.

M-krezol i fenol, odnosno njihove smjese vrlo su pogodni konzervansi koji se koriste u pripravcima ovog izuma.

Priprava inzulina, analoga inzulina ili proinzulina, koji se koriste u postupku derivatizacije proteina, može se odvijati korištenjem niza tehnika za sintezu peptida koje uključuju klasične postupke (otopina), postupke u kojima se koristi kruta faza, polusintetički postupci, te novije rekombinantne DNA postupke. Na primjer, vidi R. E. Chance i suradnici, U.S. Patent br. 5, 514, 646, 7. svibanj 1996. godine; J. J. V. Brange i suradnici, EPO publikacija br. 214, 826, 18. ožujak 1987. godine; te R. M. Belagaje u suradnici, U.S. Patent br. 5, 304, 473, 19. travanj 1994. godine, koji opisuju pripravu različitih inzulina i analoga inzulina. Ovi podaci navedeni su u tekstu isključivo u obliku literaturnih podataka.

Općenito, derivatizirani proteini pripremaju se prema postupcima koji su uobičajeni za ovu problematiku. Gore navedene publikacije navedene su s ciljem da se opišu derivatizirani proteini, te da prikažu sintezu derivatiziranih proteina na odgovarajući način. Ovi podaci navedeni su u tekstu isključivo u obliku literaturnih podataka. Kako bi se pripravio acilirani protein, protein mora reagirati s aktiviranom organskom kiselinom (kao što je aktivirana masna kiselina). Aktivirane masne kiseline predstavljaju uobičajeno korištene tvari koje se koriste za aciliranje. Ta skupina uključuje aktivirane estere masnih kiselina, halide masnih kiselina, aktivirane amide masnih kiselina poput derivata azolida (L. B. Hansen, WIPO publikacija br. 98/02460, 22. siječanj 1998. godine), te anhidride masnih kiselina. Posebno pogodna je uporaba aktiviranih estera, a posebno N-hidroksisukcinimidnog estera masnih kiselina, u svrhu aciliranja slobodne amino-kiseline masnom kiselinom. Lapidot i suradnici opisali su pripravu N-hidroksisukcinimidnog estera te njihovu uporabu u pripravi N-lauril-glicina, N-lauril-L-serina, te N-lauril-L-glutaminske kiseline. Pojam “aktivirani ester masne kiseline” označava masnu kiselinu aktiviranu nekom od općenitih tehnika koje se koriste u ovo problematici (J. F. Riordan i B. L. Valle, Methods in Enzymology, XXV : 494-499 (1972)); Y. Lapidot i suradnici. J. Lipid Res. 8 : 142 - 145 (1967)). Opće poznati spojevi koji se koriste za aktiviranje masne kiseline (koja se koristi u sintezi peptida) hidroksibenzotriazid (HOBT), N-hidroksisukcinimid i njihovi derivati.

Ako se želi selektivno acilirati ε-amino skupina, moraju se koristiti različite zaštitne skupine koje će blokirati α-amino skupinu tijekom vezanja. Odabir odgovarajućih zaštitnih skupina poznat je onima koji se bave ovom problematikom, a uključuje p-metoksibenzoksikarbonil (pmZ). Pogodno je ako se može izvesti aciliranje ε-amino skupina u jednom koraku u kojem nije potrebno koristiti zaštitu za amino skupinu. Postupak selektivnog aciliranja Nε-amino skupine lizina opisao je J. C. Baker sa suradnicima, U.S. patent br. 5, 646, 242, 8. srpanj 1997. godine, a čiji se opis isključivo koristi kao literaturni podatak. Postupak priprava suhog praška aciliranog proteina opisao je J. C. Baker sa suradnicima, U.S. patent br. 5, 700, 904, 23. prosinac 1997. godine, a čiji se opis isključivo koristi kao literaturni podatak.

Primarna uloga cinka u ovom izumu je da olakša stvaranje Zn(II) heksamera proteina i derivatiziranog proteina, bez obzira da li dolaze u pojedinačnom obliku kao smjesa heksamera ili skupa u obliku hibridnog heksamera. Cink olakšava stvaranje inzulinskog heksamera, te analoga inzulina. Slično tome, cink uzrokuje stvaranje heksamera derivatiziranog inzulina i analoga derivatiziranog inzulina. Stvaranje heksamera općenito se postiže na taj način da se podesi pH otopine koja uključuje protein, odnosno derivatizirani protein, odnosno oboje, tako da bude u neutralnom području uz prisustvo Zn(II) iona, ili dodavanjem Zn(II) nakon što se podesi pH tako da bude u neutralnom području.

Kako bi se postiglo učinkoviti iskorištenje mikrokristala ili amorfnog taloga, molarni odnos između cinka i ukupnog proteina u mikrokristalu odnosno amorfnom talogu ovog izuma mora biti na donjoj granici koja iznosi 0,33 što znači oko 2 cinkova atoma po heksameru potrebnih za heksamerizaciju. Mikrokristali i amorfni talog pogodno će se vezati s 2 do 4 odnosno 6 prisutnih cinkovih atoma, ako nije prisutan nikakav spoj koji se može natjecati s inzulinom u vezanju cinka. Može biti poželjno da se cink nalazi u suvišku u odnosu na minimalnu količinu koja je potrebna za učinkovitu heksamerizaciju jer upravo taj suvišak potiče bržu heksamerizaciju. Suvišak cinka u odnosu na minimalnu količinu koristi se i u pripravcima ovog izuma s namjerom da se poboljša kemijska i fizikalna stabilnost, kako bi se poboljšalo suspendiranje, te kako bi se eventualno produžilo djelovanje. Zbog navedenih razloga može se reći da postoji poprilično široki raspon omjera cinka i proteina koji se mogu koristiti u pripravi netopljivih spojeva, te u postupcima i pripravcima ovog izuma.

Sukladno ovom izumu, količina cinka u pripravku kreće se od 0,3 do 7 mola po molu ukupnog proteina, odnosno pogodnije od 0,3 do 1,0 mola po molu ukupnog proteina. Najpogodniji odnos cinka i derivatiziranog proteina nalazi se u području od 0,3 do 0,7 mola cinka po molu ukupnog proteina. Kod pripravaka koji sadržavaju više cinka, sličnih PZI pripravcima, omjer cinka i ukupnog proteina kreće se od 5 do 7 molova cinka po molu ukupnog proteina.

Spoj koji sadržava katione cinka, a koristi se u ovom izumu, može biti bilo koji farmaceutski prihvatljivi cinkov spoj. Postupak dodavanja cinka inzulinskim pripravcima opće je poznata činjenica u ovoj problematici, kao što su opće poznati i farmaceutski prihvatljivi izvori cinka. Pogodni spojevi iz kojih se dobiva cink, a koji se koriste u ovom izumu su cink-klorid, cink-acetat, cink-citrat, cink-oksid i cink-nitrat.

Mora se koristiti tvar koja uzrokuje nastajanje kompleksa mikrokristala i taloga ovog izuma. Kompleksirajuća tvar mora biti prisutna u dovoljnoj količini kako bi prouzrokovala znatno taloženje i kristalizaciju heksamera. Količina tvari potrebna za određenu pripravu i određenu kompleksirajuću tvar određuje se vrlo jednostavno - titrimetrijom. Idealno je da koncentracija kompleksirajuće tvari bude podešena tako da nakon završetka procesa kristalizacije ili taloženja u otopini ostane neznatna količina kompleksirajuće tvari. To iziskuje kombiniranje kompleksirajuće tvari koje se osniva na eksperimentalno utvrđenim “izofanim” omjerima. Očekuje se da omjer bude vrlo blizak onome kod NPH i NPL. No, može biti i malo različit jer derivatizacija može utjecati na prirodu interakcije proteina i protamina.

Ako se protamin koristi kao kompleksirajuća tvar, prisutan je u mikrokristalu u iznosu od 0,15 mg do 0,5 mg po 3,5 mg ukupnog proteina. Pogodnije je ako je omjer protamina i ukupnog proteina u području od 0,25 do 0,4 mg/mg. Najpogodnije je ako taj odnos iznosi od 0,25 do 0,38 mg/mg. Pogodno je ako je količina protamina u iznosu od 0,05 mg do 0,2 mg po mg ukupnog proteina, no još pogodnije je ako se taj iznos kreće u području od 0,05 do 0,15 miligrama po miligramu ukupnog protamina. Protamin-sulfat je pogodna sol protamina koja se koristi u ovom izumu. Ako se koristi protamin-sulfat, odnosno nekakva drukčija sol protamina, potrebno je uskladiti masu soli u odnosu na masu protamina u obliku baze koja se koristi u istu svrhu, preko faktora koji je jednak omjeru molekulskih masa protamina i soli.

Kako bi se produljilo vrijeme djelovanja pripravaka opisanih u ovom izumu, odnosno poboljšalo suspendiranje, mogu se dodati dodatne količine cinka i protamina nakon kristalizacije. Zbog toga se i ovom izumu susreću pripravci kod kojih je količina protamina viša u odnosu na izofani omjer. Kod tih pripravaka omjer protamina nalazi se u području od 0,25 do 0,50 mg protamina po mg ukupnog proteina.

Tvar za stabilizaciju kompleksa sastavni je dio mikrokristala i taloga ovog izuma. U literaturi su opisane tri konformacije heksamera, te su asignirane kao T6, T3R3 i R6. U prisustvu tvari za stabilizaciju heksamera (kao što su različiti fenolni spojevi) stabilizira se R6 konformacija. Stoga je vrlo vjerojatno da heksameri budu u R6 konformaciji, odnosno T3R3 konformaciji u kristalima i talozima nastalim u prisustvu tvari za stabiliziranje heksamera (kao što su između ostalih fenol, te m-krezol). Pogodan je cijeli niz tvari za stabiliziranje heksamera. Oni moraju biti prisutni u dovoljnoj količini s obzirom na ukupni protein kako bi stabilizirali R6 konformaciju heksamera. Kako bi se to postiglo, potrebno je barem 2 odnosno 3 mola tvari za stabiliziranje u odnosu na heksamer kako bi se ostvarila učinkovita stabilizacija heksamera. Preporuča se barem 3 mola tvari za stabiliziranje po heksameru u mikrokristalima odnosno talozima ovog izuma. U slučaju da se koriste veći omjeri tvari za stabiliziranje heksamera (veći barem 25 do 50 puta), u otopinama u kojima se pripravljaju mikrokristali ili talozi, oni neće nepovoljno utjecati na stabilizaciju heksamera.

U pripravcima ovog izuma može se koristiti konzervans, posebno ako se pripravak namjerava koristiti više puta. Kao što je gore spomenuto, poznata je velika skupina odgovarajućih konzervansa. Najpogodnije je ako se u pripravku nalazi ona količina konzervansa koja je potrebna da bi se spriječila mikrobiološka kontaminacija, a koja je u skladu s farmakopejskim zahtjevima.

Pogodni su fenolni konzervansi, koji su već pobrojani u tekstu. Pogodna količina fenolnog konzervansa nalazi se u području od 2 mg do 5 mg po mililitru pripravka u obliku vodene suspenzije. Ova koncentracija odnosi se na ukupnu količinu fenolnog konzervansa jer se zbrajaju mase pojedinačnih fenolnih konzervansa u smjesi. U skupinu odgovarajućih fenolnih konzervansa ubrajaju se fenol, m-krezol i metilparaben. Najpogodniji konzervansi su fenol i m-krezol. Također se primjenjuju smjese fenolnih spojeva, npr. smjesa fenola i m-krezola, pri čemu je važno naglasiti da su to izrazito pogodne smjese. Primjeri takvih smjesa su: 0,6 mg/ml fenola i 1,6 mg/ml m-krezola te 0,7 mg/ml fenola i 1,8 mg/ml m-krezola.

Pogodni mikrokristali ovog izuma su monokristali duguljastog oblika, također poznati kao prutićasti kristali, a sadržavaju protein, derivatizirani protein, dvovalentni kation, kompleksirajuću tvar te tvar za stabiliziranje heksamera. Duljina mikrokristala opisanih u ovom izumu kreće se u području od 1 do 40 mikrona, no pogodnije je da se kreće u području od 3 do 15 mikrona.

Pogodna formulacija sadržava od 3 do 6 mg protamin-sulfata na 35 mg ukupnog proteina, te od 0,1 do 0,4 mg cinka na 35 mg ukupnog proteina. Druga pogodna formulacija sadržava od 10 do 17 mg protamin-sulfata na 35 mg ukupnog proteina, te od 2,0 do 2,5 mg cinka na 35 mg ukupnog proteina. Slijedeća pogodna formulacija sadržava u 1 ml 0,034 - 0,38 mg protamina-sulfata; 0,01 - 0,04 mg cinka; te 3,2 - 3,8 mg ukupnog proteina.

Kokristali i amorfni talozi moraju sadržavati i nederivatizirani protein i derivatizirani protein. Omjer između masa tih proteina određuje stupanj produljenja djelovanja tih pripravaka. Pogodni omjer molova proteina i derivatiziranog proteina nalazi se u području od 1 : 100, odnosno 100 : 1. Slijedeći pogodni omjer molova proteina i derivatiziranog proteina iznosi 1 : 1, odnosno 100 : 1. Slijedeći pogodni omjer molova proteina i derivatiziranog proteina iznosi 1 : 1, odnosno 20 : 1. Odnosno ostali pogodni omjeri molova proteina i derivatiziranog proteina nalaze se u području od 2 : 1, odnosno 20 : 1; od 2 : 1, odnosno 10 : 1; od 2 : 1, odnosno 5 : 1; od 3 : 1, odnosno 5 : 1; od 1 : 1, odnosno 1: 20; od 1 : 1, odnosno 1 : 10; 1 : 2, odnosno 1: 20; od 1 : 2, odnosno 1 : 10; 1 : 2, odnosno 1: 5; od 1 : 3, odnosno 1 : 5; 10 : 1, odnosno 1: 10; od 9 : 1, odnosno 1 : 9; 5 : 1, odnosno 1: 5; od 3 : 1, odnosno 1 : 3.

Ovaj izum opisuje postupke priprave spojeva. Također su opisane netopljive tvari koje se koriste u pripravi lijekova za kontrolu glukoze u krvi, te za liječenje dijabetesa i hiperglikemije. Amorfni talozi u mikrokristali opisani u ovom izumu mogu se pripraviti na različite načine, a koriste se za pripravu lijekova te u ostale svrhe.

Odgovarajući postupci općenito uključuju slijedeće korake: solubilizacija (ako se kreće od suhe tvari), heksamerizacija, homogenizacija, kompleksiranje, taloženje, kristalizacija te po potrebi proizvodnja pripravka; ili solubilizacija (ako se kreće od suhe tvari), homogenizacija, heksamerizacija, kompleksiranje, taloženje, kristalizacija te po potrebi proizvodnja pripravka.

Solubilizacija podrazumijeva otapanje derivatiziranog proteina i proteina u onoj mjeri koja je potrebna da bi došlo do stvaranja heksamera. Heksamerizacija se odnosi na postupke u kojima se molekule proteina i derivatiziranog proteina vežu s dvovalentnim cinkom pri čemu nastaje heksamer. Kompleksiranje je pojam koji označava nastajanje netopljivog kompleksa između heksamera i proteina. Taloženje je posljedica nastajanja netopljivih tvari. Kristalizacija uključuje pretvorbu istaloženog kompleksa heksamera i protamina u kristal (uobičajeno prutićasti kristal).

Solubilizacija se odvija otapanjem derivatiziranog proteina i proteina u vodenom mediju. Vodeni medij može biti kiseo, neutralan ili lužnat. Vodena otopina može uključivati i organska otapala koja se miješaju s vodom kao što su etanol, acetonitril, dimetilsulfoksid i sl. Kisele otopine mogu biti npr. otopine HCl, pri čemu su pogodne one otopine koje se kreću u rasponu od 0,01 do 1, M HCl otopine. Također se mogu uporabiti i ostale farmaceutski prihvatljive kiseline. Lužnate otopine mogu biti npr. otopine NaOH, pri čemu su pogodne one otopine koje se kreću u rasponu od 0,01 do 1, M NaOH otopine. Također se mogu uporabiti i ostale farmaceutski prihvatljive lužine. Zbog stabilnosti proteina nastoji se koristiti što je moguće manja koncentracija kiseline odnosno lužine koja će biti dovoljna za otapanje i derivatizaciju proteina.

Većina proteina (inzulin, analozi inzulina, proinzulin) te mnogi derivatizirani proteini mogu se otopiti u odgovarajućoj koncentraciji pri neutralnom pH. Otopine koje se koriste za otapanje derivatiziranih proteina pri neutralnom pH mogu sadržavati pufer, te po potrebi jednu ili više dodatnih otopljenih tvari kao što su soli, fenolni spojevi, cink te tvari za izotonizaciju.

Ako dođe do heksamerizacije prije homogenizacije, stvaraju se prvo dvije skupine homogenih heksamera, nakon čega se te skupine pomiješaju, te nastaje smjesa heksamera. Ako dođe prvo do homogenizacije, u procesu heksamerizacije nastaju hibridni heksameri. Ka što je već prije spomenuto, kako bi se pripravile netopljive smjese koje uključuju hibridne heksamere, homogeniziraju se protein i derivatizirani protein pod uvjetima kod kojih je favorizirana disocijaciji na monomerno odnosno dimerno agregacijsko stanje prije heksamerizacije s dvovalentnim kationom metala. Kako bi se postigao odgovarajući stupanj disocijacije, protein i derivatizirani protein mogu se pomiješati u izrazito kiselom odnosno lužnatom mediju. Na stupanj disocijacije, a samim tim i homogenizaciju, utječu karakteristike otopine koja se koristi u ovom stupnju. Inzulini i srodni proteini tvore lako asocijate u nizu reakcija koje rezultiraju nastajanjem dimera, heksamera i ostalih asocijacijskih oblika. Raspodjela tih asocijata u stanju ravnoteže ovisi o nizu parametara, uključujući i pH. Smatra se da ove asocijacijske reakcije prvenstveno uključuju monomerno-dimerno-heksamerne ansamble. Ovisno o karakteristikama otopine, u postupku homogenizacije trebalo bi uspjeti miješanje monomera, dimera ili njihovih smjesa. Na primjer, homogenizacija u 1 M HCl otopini uključivat će veći udio monomera koji se miješa, u odnosu na 0,1 m HCl otopinu koja će vrlo vjerojatno uključivati veći udio dimera koji se miješa. Za pripravu smjesa koje uključuju hibridne heksamere, učinkovito će se provesti postupak homogenizacije samo ako postoji vrlo mali odnosno gotovo zanemarivi udio homogenih heksamera proteina ili derivatiziranog proteina (pod određenim homogenizacijskim uvjetima).

Smjese koje uključuju smjese heksamera sadržavaju u najvećem broju dvije vrste heksamera, to jest heksamere proteina, odnosno heksamere derivatiziranog proteina. U tom slučaju, stupanj homogenizacije odvija se nakon stupnja heksamerizacije, a homogenizacija se heksamera postiže prije kompleksiranja s tvari za kompleksiranje. Zbog toga se stupanj homogenizacije provodi u otopini čija je bitna karakteristika da stabilizira Zn(II)-heksamer inzulina. Karakteristike otopine koje stabiliziraju heksamere inzulina vrlo su dobro poznate u literaturi.

Karakteristike otopina u kojima se odvija postupak heksamerizacije moraju omogućiti stvaranje hibridnih heksamera ili smjese heksamera u otopini.

Te karakteristike su jednake ili vrlo slične onima kod kojih dolazi do heksamerizacije inzulina i njegovih analoga. Uobičajeno je da se koristi cink u postupku heksamerizacije, te da pH bude neutralan ili blago lužnat (pH 6,8 - 8,4). Prisustvo tvari za stabilizaciju heksamera izrazito pogodno utječe na heksamerizaciju potičući nastajanje R6 i T3R3 konformacija derivatiziranog protein, a u pojedinim slučajevima i samog proteina. Tvar za stabiliziranje heksamera potrebna je kod određenih monomernih analoga inzulina kako bi došlo do stvaranja heksamera.

Kod smjesa koje uključuju hibridne heksamere očekivalo se 7 heksamernih specija: P6, P5D1, P4D2, P3D3, P2D4, P1D5, te D6, gdje P predstavlja monomer proteina, a D predstavlja derivatizirani monomer proteina. Očekivalo se da će se statistička raspodjela heksamera odvijati po Poisson-ovoj razdiobi, te da će na nju utjecati relativni odnos proteina i derivatiziranog proteina, te stupanj disocijacije prije heksamerizacije. Na primjer, očekuje se nastajanje 4 glavne hibridne heksamere specije iz homogenizirane otopine koja predominantno sadržava dimere. Te speciju su P6, P4D2, P2D4, te D6. Ako se očekuje nastajanje samo 2 glavne hibridne heksamere specije iz homogenizirane otopine koja predominantno sadržava smjesu heksamera., onda su te specije P6, te D6.

Stupanj kompleksiranja mora uključivati kombinaciju spoja koji kompleksira i heksamera u takvoj otopini u kojoj su oba spoja početno topljiva. To se može postići kombiniranjem odvojenih otopina heksamera i protamina, ili ako se prvo napravi otopina proteina, te derivatiziranog proteina, te protamina pri kiselom ili lužnatom pH, te naknadnim pomicanjem pH k neutralnom području.

Za vrijeme kristalizacije, otopina mora imati takve karakteristike koje će dovesti do stabilizacije kristalizirajućih specija, te potaknuti pretvorbu taloga preko otopljene tvari u kristal. Može se zaključiti da će karakteristike otopine odrediti stupanj i količinu nastalog kristala. Kristalizacija uključuje ravnotežu nastajanja kompleksa koja uključuje nekristalinični talog, otopljeni kompleks heksamera i protamina te sam kristal. Promatrano s aspekta hipotetske ravnoteže, smatra se da bi topljivost derivatiziranog proteina trebala značajno utjecati na stupanj kristalizacije te na veličinu jer izgleda da lošija topljivost smanjuje pretvorbu taloga preko otopine u kristal. Stoga se smatra da stupanj kristalizacije i veličina ovise o veličini i svojstvima onog dijela molekule derivatiziranog proteina koji sudjeluje u postupku derivatizacije.

Parametri kristalizacije koji utječu na stupanj kristalizacije i veličinu kristala opisanih u ovom izumu su: veličina i svojstva acilne skupine, temperatura, prisustvo tvari koje zajedno s proteinom i derivatiziranim proteinom sudjeluju u procesu kompeticije za cink (kao što su citrati, fosfati i sl.), koncentracija i svojstva fenolnog spoja (spojeva), koncentracija cinka prisustvo te koncentracija otapala koja se miješaju s vodom, vrijeme kristalizacije, pH, ionska jakost, vrsta i koncentracija pufera, koncentracija taloga, prisustvo centara kristalizacije, oblik posude i vrsta materijala od koje je ona napravljena, brzina miješanja, te ukupna koncentracija proteina. Smatra se da su od posebne važnosti temperatura te tvari koje sudjeluju u kompeticiji.

Tvari koji sudjeluju u kompeticiji (npr. citrat) mogu utjecati na stupanj kristalizacije, te indirektno na veličinu i kakvoću kristala. Utjecaj tih tvari može se pokazati prilikom stvaranja koordinativnih kompleksa s cinkom u otopini, što ustvari predstavlja kompeticiju za cink koja se odvija s mjestima na površini heksamera koja relativno slabo vežu cink. Zauzimanje tih mjesta na površini najvjerojatnije onemogućava kristalizaciju. Dodatno, mnogi derivatizirani proteini djelomično su topljivi u prisustvu nešto malo više od 0,333 cinka po molu derivatiziranog proteina, a prisustvo tvari koje sudjeluju u kompeticiji smanjuje topljivost, te omogućava kristalizaciju. Za bilo koju kombinaciju proteina i derivatiziranog proteina može se pomoću rutinskih tehnika odrediti optimalna koncentracija tvari koja sudjeluje u kompeticiji. Gornja granica je ona koncentracija kod koje dolazi do taloženja cinka zbog tvari koja sudjeluje u kompeticiji, odnosno koncentracija kod koje bi ostatna tvar koja sudjeluje u kompeticiji bila farmaceutski neprihvatljiva, kao npr. ako bi uzrokovala bol ili iritaciju na mjestu primjene lijeka.

Slijedi primjer priprave taloga i kristala koji su opisani u ovom izume. Mjerena količina derivatiziranog proteina i mjerena količina proteina otope se u vodenom mediju, odnosno spoje se kako bi napravili otopinu u vodenom mediju koji sadržava tvar koja stabilizira heksamer (kao što je na primjer fenolni spoj). Toj otopini dodaje se otopina cinka koji se nalazi u obliku svoje topljive soli, npr. cink(II)-klorid. Koncentracija iona cinka u otopini kreće se u području od 0,3 do 0,7 mola po molu derivatiziranog inzulina, odnosno maksimalno 1,0 mola cinka po molu ukupnog proteina (protein + derivatizirani protein). Po potrebi, u otopinu se može dodati apsolutni etanol ili neko drugo otapalo koje se miješa s vodom, pri čemu se udio organskog otapala kreće od 5 do 10 %. Tada se otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Otopina protamina priredi se otapanjem mjerene količine protamina u vodenom mediju. Tada se otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Otopina koja sadržava protein i derivatizirani protein pomiješa se s otopinom koja sadržava protamin, pri čemu odmah dolazi do taloženja. Nastala se otopina polako miješa na sobnoj temperaturi (20 - 25 °C), pri čemu nastaju kristali u periodu od 4 sata do 10 dana.

Nastali kristali izdvoje se iz ishodne otopine te se premjeste u drugo otapalo koje služi za pohranu, te koje je pogodno za primjenu u medicinske svrhe. Slijede primjeri odgovarajućih vodenih medija: voda za injekcije koja sadržava 25 mM TRIS, 5 mg/ml fenola i 16 mg/ml glicerola; voda za injekcije koja sadržava 2 mg/ml dibazičnog natrij-fosfata, 1,6 mg/ml m-krezola, 0,65 mg/ml fenola i 16 mg/ml glicerola; voda za injekcije koja sadržava 25 mM TRIS, 5 mg/ml fenola, 0,1 M Na3P04 i 16 mg/ml glicerola.

U slijedećem postupku priprave netopljivih smjesa otope se mjerena količina suhog derivatiziranog proteina i mjerena količina suhog proteina u kiselom vodenom mediju (0,1 - 1,0 M HCl). Kako bi se osiguralo potpuno miješanje derivatiziranog proteina i proteina, otopina se mora dobro miješati. Omjer praha derivatiziranog proteina i praha proteina u ovoj smjesi je predodređen kako bi se dobio sličan omjer onom kod derivatiziranog proteina i proteina u netopljivim smjesama koje se moraju proizvesti. Posebno pripravljena vodena otopina koja uključuje fenolni konzervans, te po potrebi farmaceutski prihvatljivi pufer, pomiješa se zakiseljenom proteinskom otopinom. Tada se podesi pH otopine tako da se nalazi u području od 6,8 do 8,4, pogodnije od 6,8 do 8,0, odnosno još pogodnije od 7,2 do 7,8, odnosno najpogodnije od 7,4 do 7,8. Toj otopini doda se otopina koja sadržava cink u obliku neke njegove topljive soli, npr. cink(II)-klorid, čija je koncentracija podešena tako da osigurava od 0,3 do 0,4 mola cinka po molu ukupnog inzulina. Ovoj otopini podesi se pH kako je prethodno opisano (najpogodnije je da pH bude u području od 7,4 do 7,6), te se nakon toga filtrira kroz filter veličine pora od 0,22 mikrona koji slabo veže proteine. Otopina protamina priprema se otapanjem izmjerene količine protamina u vodenom mediju. Otopina protamina može se filtrirati kroz filter veličine pora od 0,22 mikrona koji slabo veže proteine. Pomiješaju se otopina koja sadržava protamin te otopina koja sadržava protein i derivatizirani protein, pri čemu trenutačno nastaje talog. Nastala otopina polako se miješa na sobnoj temperaturi (20 - 25 °C), pri čemu nastaju kristali u periodu od 4 sata do 10 dana.

U slijedećem postupku priprave netopljivih smjesa opisanih u ovom izumu, izmjerena količina proteina prvo se otopi u vodenom mediju koji sadržava fenolni konzervans. Toj otopini doda se otopina koja sadržava cink u obliku neke njegove topljive soli, npr. cink(II)-klorid, čija je koncentracija podešena tako da osigurava od 0,3 do 0,4 mola cinka po molu derivatiziranog proteina. Tada se podesi pH otopine tako da se nalazi u području od 6,8 do 8,4, pogodnije od 6,8 do 8,0, odnosno još pogodnije od 7,2 do 7,8, odnosno najpogodnije od 7,4 do 7,8. Odvojeno se pripravi slijedeća otopina koja sadržava izmjerenu količinu proteina koju čine inzulin, analog inzulina te proinzulin. Proteini su otopljeni u vodenom mediju koji sadržava fenolni konzervans. Toj otopini doda se otopina koja sadržava cink u obliku neke njegove topljive soli, npr. cink(II)-klorid, čija je koncentracija podešena tako da osigurava od 0,3 do 0,4 mola cinka po molu proteina. Tada se podesi pH otopine tako da se nalazi u području od 6,8 do 8,4, pogodnije od 6,8 do 8,0, odnosno još pogodnije od 7,2 do 7,8, odnosno najpogodnije od 7,4 do 7,8 te 7,4 -7,6. Pomiješaju se alikvoti otopine koja sadržava derivatizirani protein i alikvot otopine koja sadržava protein u omjeru koji je predodređen kako bi se postigao sličan omjer kao kod derivatiziranog proteina i proteina u netopljivim smjesama. Otopini se podesi pH na oko 7,6 te se filtrira kroz filter veličine pora od 0,22 mikrona koji slabo veže proteine. Otopina protamina priprema se otapanjem izmjerene količine protamina u vodenom mediju. Otopina protamina može se filtrirati kroz filter veličine pora od 0,22 mikrona koji slabo veže proteine. Pomiješaju se otopina koja sadržava protamin te otopina koja sadržava protein i derivatizirani protein, pri čemu trenutačno nastaje talog. Nastala otopina polako se miješa na sobnoj temperaturi (20 - 25 °C), pri čemu nastaju kristali u periodu od 4 sata do 10 dana.

S obzirom da se ne mogu opisati svi mnogobrojni načini priprave netopljivih smjesa ovog izuma, navedeni su slijedeći postupci ovog izuma:

• otapanje proteina, derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju kojem je podešen pH tako da ne dozvoljava stvaranje heksamera, te dodavanje kompleksirajuće tvari;

• otapanje proteina, derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju kojem je podešen pH tako da ne dozvoljava stvaranje heksamera, podešavanje pH u području od 6,8 do 7,8 te dodavanje kompleksirajuće tvari;

• otapanje proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju kojem je podešen pH tako da ne dozvoljava stvaranje heksamera, te odvojeno otapanje derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju kojoj je podešen pH tako da ne dozvoljava stvaranje heksamera, dobro miješanje te dvije otopine te dodavanje kompleksirajuće tvari;

• otapanje proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, dvovalentnog kationa metala, te kompleksirajuće tvari u vodenom mediju kojem je podešen pH tako da ne dozvoljava stvaranje taloga, odvojeno otapanje proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, dvovalentnog kationa metala, te kompleksirajuće tvari u vodenom mediju kojem je podešen pH tako da ne dozvoljava stvaranje taloga, dobro miješanje te dvije otopine, te podešavanje pH otopine na vrijednost kod koje dolazi do taloženja;

• otapanje proteina, derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, dvovalentnog kationa metala, te kompleksirajuće tvari u vodenom mediju kojem je podešen pH tako da ne dozvoljava stvaranje taloga, te podešavanje pH otopine na vrijednost kod koje dolazi do taloženja;

• otapanje proteina, derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, dvovalentnog kationa metala, te kompleksirajuće tvari u vodenom mediju kojem je podešen pH tako da ne dozvoljava stvaranje taloga u trenutku dodavanja kompleksirajuće tvari, dodavanje kompleksirajuće tvari, te podešavanje pH otopine nastale u stupnju b) na vrijednost kod koje dolazi do taloženja;

• otapanje proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, dvovalentnog kationa metala, te kompleksirajuće tvari u vodenom mediju kojem je podešen pH tako da ne dozvoljava stvaranje taloga u trenutku dodavanja kompleksirajuće tvari, odvojeno otapanje derivatiziranog proteina, derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, dvovalentnog kationa metala, te kompleksirajuće tvari u vodenom mediju kojem je podešen pH tako da ne dozvoljava stvaranje taloga u trenutku dodavanja kompleksirajuće tvari, dobro miješanje te dvije otopine, dodavanje kompleksirajuće tvari u otopinu, te podešavanje pH otopine na vrijednost kod koje dolazi do taloženja;

• otapanje proteina, derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, dvovalentnog kationa metala, te kompleksirajuće tvari u vodenom mediju kojem je podešen pH tako da ne dozvoljava stvaranje taloga u trenutku dodavanja kompleksirajuće tvari, te podešavanje pH otopine na vrijednost kod koje dolazi do taloženja kada se otopini doda kompleksirajuća tvar, te dodavanje kompleksirajuće tvari otopini;

• otapanje proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, dvovalentnog kationa metala, te kompleksirajuće tvari u vodenom mediju kojem je podešen pH tako da ne dozvoljava stvaranje taloga u trenutku dodavanja kompleksirajuće tvari, odvojeno otapanje derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, dvovalentnog kationa metala, te kompleksirajuće tvari u vodenom mediju kojem je podešen pH tako da ne dozvoljava stvaranje taloga u trenutku dodavanja kompleksirajuće tvari, dobro miješanje te dvije otopine, te podešavanje pH otopine dobivene u stupnju c) na vrijednost kod koje dolazi do taloženja kada se otopini doda kompleksirajuća tvar, te dodavanje kompleksirajuće tvari otopini.

Pogodniji je način priprave kod kojeg nije potrebno odvajanje nastalih kristala od ishodne otopine. Stoga je izrazito pogodno ako je ishodna otopina farmaceutski prihvatljiva za primjenu u medicinske svrhe (davanje pacijentima), odnosno da se ishodna otopina učini farmaceutski prihvatljivom dodavanjem odgovarajućeg otapala. Pojam otapalo podrazumijeva otopinu koja sadržava vodeni medij u kojem su otopljeni različiti farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti, uključujući bez ikakvih ograničenja pufer, tvar za izotonizaciju, cink, konzervans, protamin i sl. Uz protein, derivatizirani protein, tvar za stabiliziranje heksamera, dvovalentni kationa metala, kompleksirajuće tvari, farmaceutske smjese prilagođene za parenteralnu primjenu, a sukladno ovom izumu, mogu sadržavati dodatne pomoćne tvari i nosače kao što su organska otapala koja se miješaju s vodom (npr. glicerol), sezamovo ulje, vodeni propilen glikol i sl. Ako se koriste, takve tvari su zastupljene u iznosu manjem od oko 2,0 % mase konačnog pripravka. Za daljnje informacije vezane uz različite tehnike koje koriste uobičajene pomoćne tvari i nosače koji se koriste za pripravu parenteralnih proizvoda, molimo pogledati Remington’s Pharmaceutical Science, 17. izdanje. Mack Publishing Company, Easton. PA, USA (1985), koja se u ovom tekstu koristi kao literaturni podatak.

Šira primjena ovog izuma uključuje mogućnost da pripravak može sadržavati smjesu mikrokristala i topljivi udio proteina kojeg sačinjavaju inzulin, derivatizirani inzulin, analozi inzulina, te derivatizirani analozi inzulina. Primjeri ovakvih farmaceutskih smjesa uključuju sterilne, izotonične, vodene slane otopine inzulina, odnosno derivatiziranog inzulina, odnosno derivatiziranog analoga inzulina, kojima je pH podešen s farmaceutski prihvatljivim puferom, te koji su apirogeni. U otopini pogodni su inzulin te brzodjelujući analog inzulina kao što je LysB28, ProB29 humani inzulin odnosno AspB28 humani inzulin. Takve smjese napravljene su kao kombinacija pomoću koje je moguća kontrola nivoa glukoze u krvi za vrijeme obroka, koju osigurava topljivi inzulin, te bazalne kontrole glukoze u krvi, koju osigurava netopljivi inzulin. Omjer ukupnog proteina (protein + derivatizirani protein) u netopljivoj fazi i ukupni protein u topljivoj fazi nalazi se u području od oko 9 : 1 do oko 1 : 9. Pogodno područje ovog omjera kreće se od oko 9 : 1 do oko 1 : 1, odnosno još pogodnije od oko 7 : 3. Ostali omjeri su 1 : 1 te 3 : 7.

Slijedeći pripravci i primjeri objašnjavaju i opisuju izum. Područje ovog izuma nije ograničeno samo na ove primjere i ove pripravke. Pojam “udio” krutine odnosi se na udio u masi, a “udio” tekućine odnosi se na udio u volumenu Kada se koriste postoci za izražavanje koncentracije, odnose se na masu po volumenu (× 100). Sve temperature izražene su u stupnjevima Celsiusa (°C). “TRIS” se odnosi na 2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiol. Otopina cinka koja sadržava1000 ppm cinka pripravljena je razrjeđivanjem 1,00 ml standardne cinkove otopine za atomsku apsorpciju koncentracije 10 000 ppm (Ricca Chemical Company, cink u razrijeđenoj nitratnoj kiselini) s vodom do ukupnog volumena od 10 ml.

Procijenjeno je iskorištenje za mnoge pripravke koji su opisani u nastavku teksta. Procjena iskorištenja osnivalo se na određivanju količine ukupnog proteina u talogu odnosno kristalu, te na procjeni količine proteina u otopini. Kako bi se odredila ukupna količina proteina, određivali su se uzorci ponovno otopljenog taloga ili kristala, te supernatanta koristeći reverzno-faznu tekućinsku kromatografiju visokog učinka (HPLC) uz gradijent mobilne faze (kao što je opisano u daljnjem tekstu).

Analitički sustav sastoji se od C8 reverzno-fazne kolone, a kromatografija se odvija na 23 °C. Protok je 1,0 ml/min, dok je UV detektor podešen na 214 nm. Mobilnu fazu A čini 0,1%- tna (v/v) trifluoroctena kiselina u smjesi 10 : 90 (v/v) acetonitril : voda. Mobilnu fazu B čini 0,1%- tna (v/v) trifluoroctena kiselina u smjesi 90 : 10 (v/v) acetonitril : voda. gradijent program (minuta, % B) je: (0,1, 0); (45,1, 75); (50,1, 100); (55, 100); (57, 0); (72, 0). Sve su promjene linearne. Mogu se koristiti i drukčiji analitički sustavi kako bi se postigli isti ciljevi (pod nadzorom stručne osobe).

Kako bi se pripravio uzorak za HPLC analizu, alikvot dobro promiješane suspenzije otopljen je s razrijeđenom kloridnom kiselinom ( koncentracija ili 0,01 M ili 0,03 M). Rezultati HPLC analize ovih otopina dobiveni su na temelju računanja ukupnog proteina. Alikvoti suspenzije centrifugiraju se oko 5 minuta na mikrocentrifugi uz 14 000 okretaja u minuti (uzorci su bili u Eppendorf 5414C kivetama). Supernatant se dekantira te razrijedi ili s 0,01 ili 0,1 M HCl. Ponovno otopljeni talog analizira se pomoću HPLC.

HPLC se korist kako bi se potvrdilo prisustvo očekivanih proteina u zakiseljenoj suspenziji, ponovno otopljenom talogu, te supernatantu, kao i za određivanje koncentracije proteina. Retencijsko vrijeme pikova u kromatogramu ponovno otopljenog taloga uspoređeno je s retencijskim vremenom dobivenim za protamin i djelatnu tvar koja se koristi za proizvodnju pripravka. Podudarnost retencijskih vremena je uvijek bila dobra, pri čemu se vidjelo da su protamin, protein i derivatizirani proteini bili ugrađeni u mikrokristale. Koncentracije proteina i derivatiziranog proteina određene su usporedbom površina njihovih pikova s površinom pika standarda. Kao standard koristila se otopina derivatiziranog inzulina koncentracije 0,22 mg/ml. Koristio se i standard koji je sadržavao protamin, ali samo kako bi mu se odredilo retencijsko vrijeme. Koncentracija protamina nije bila kvantitativno određena.

Kod mnogih pripravaka, koji su opisani u daljnjem tekstu, sadržaj određen spektroskopski kako bi se odredilo kako brzo se tope kristali u Dulbecco-vom fosfatnom puferu (pH 7,4) pri sobnoj temperaturi. Ako su primijećena znatna odstupanja u opisu pripravaka u odnosu na postupak koji slijedi odmah u tekstu, posebno su navedena. Za sve sadržaje koji su se određivali nakon otpuštanja korišten je odgovarajući UV spektrofotometar, kvarcna kiveta od 1 cm, te odgovarajuća magnetska miješalica. Kiveta koja je sadržavala maleni magnetić za miješanje, te 3,00 ml fosfatnog pufera (PBS) postavi se u odjeljak za mjerenje. Instrument se podesi na 320 nm te se nulira u odnosu na pufer. Tada se u kivetu doda 4,0 mikrolitra dobro suspendiranog pripravka čija je uobičajena koncentracija 50 jedinica ili oko od 1,6 do 1,8 mg/ml. Nakon miješanja tijekom 1 minute, snimi se optička gustoća na 320 nm. S obzirom da proteini koji su obuhvaćeni ovim radom ne apsorbiraju svjetlost na 320 nm, smanjenje optičke gustoće događalo se zbog smanjenog raspršivanja svjetlosti jer se kristal topio. Vrijeme koje je potrebno kako bi se optička gustoća prepolovila u odnosu na početnu vrijednost označava se kao (t 1/2). Za provjeru, doda se 2,0 mikrolitra Humulina ® N 100 jedinica (humani inzulin NPH, koji je također poznat kao humani NPH inzulin) u 3,00 ml PBS pufera te se promatra optička gustoća na 320 nm kao što je navedeno gore u tekstu. Vrijeme poluotpuštanja za Humulina ® N iznos oko 6 minuta.

Priprava 1

9 : 1 kokristali humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina

Suhi prašak B29-Nε-oktanoil-LysB29 humanog inzulina (0,7 masenih dijelova) te suhi prašak humanog inzulina (6,3 masenih dijelova) otope se u 1000 dijelova po volumenu vodene otopine koja sadržava 50 mM TRIS, 0,1 M Na3P04, te 10 mg/ml fenola kod pH 7,6. Toj otopini doda se 75 dijelova 15,3 mM otopine cink-klorida. pH se podesi na 7,6 pomoću 1 M HCl odnosno 1 M NaOH. Ova otopina profiltrira se kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pripremi se druga otopina koja sadržava 7 masenih dijelova u masi protamin-sulfata u 10 000 volumnih dijelova u volumenu vode, nakon čega se profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pomiješaju se jednaki volumeni otopina koje sadržavaju inzulin, acilirani inzulin, te protamin-sulfat. Prvenstveno nastaje amorfni talog. Nakon što suspenzija stoji na sobnoj temperaturi (uobičajeno 22 °C), amorfni talog pretvara se u kokristaliničnu mikrokristaliničnu krutinu.

Priprava 2

3 : 1 kokristali humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina

Korišten je postupak Priprave 1, s iznimkom da je korišteno 1,75 dijelova u masi suhog praška B29-Nε-oktanoil-LysB29 humanog inzulina i 5,25 dijelova u masi suhog praška humanog inzulina. Pomiješaju se jednaki volumeni otopina koje sadržavaju inzulin, acilirani inzulin, te protamin-sulfat. Prvo nastaje amorfni talog. Nakon što suspenzija stoji na sobnoj temperaturi (uobičajeno 22 °C), amorfni talog pretvara se u kokristaliničnu mikrokristaliničnu krutinu.

Priprava 3

3 : 1 kokristali humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina

Mikrokristalinični kokristali pripravljeni prema Postupku 1 odvoje se od supernatanta te se pročišćavaju uobičajenim separacijskim tehnikama (krutina/tekućina) kao što su filtracija, centrifugiranje ili dekantiranje. Pročišćeni mikrokristali suspendiraju se u otopini koja sadržava 25 mm TRIS, 5 mg/ml fenola, 16 mg/ml glicerola, pri čemu je pH otopine 7,8. Konačna koncentracija inzulinske aktivnosti je 100 jedinica/ml.

Priprava 4

1 : 1 kokristali humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina

Korišten je postupak Priprave 1, s iznimkom da je korišteno 3,5 dijelova u masi suhog praška B29-Nε-oktanoil-LysB29 humanog inzulina i 3,5 dijelova u masi suhog praška humanog inzulina. Pomiješaju se jednaki volumeni otopina koje sadržavaju inzulin, acilirani inzulin, te protamin-sulfat. Prvo nastaje amorfni talog. Nakon što suspenzija stoji na sobnoj temperaturi (uobičajeno 22 °C), amorfni talog pretvara se u kokristaliničnu mikrokristaliničnu krutinu.

Priprava 5

1 : 3 kokristali humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina

Korišten je postupak Priprave 1, s iznimkom da je korišteno 5,25 dijelova u masi suhog praška B29-Nε-oktanoil-LysB29 humanog inzulina i 1,75 dijelova u masi suhog praška humanog inzulina. Pomiješaju se jednaki volumeni otopina koje sadržavaju inzulin, acilirani inzulin, te protamin-sulfat. Prvo nastaje amorfni talog. Nakon što suspenzija stoji na sobnoj temperaturi (uobičajeno 22 °C), amorfni talog pretvara se u kokristaliničnu mikrokristaliničnu krutinu.

Priprava 6

3 : 1 kokristali humanog inzulina i B29-Nε-heksanoil humanog inzulina

Korišten je postupak Priprave 1, s iznimkom da je korišteno 1,75 dijelova u masi suhog praška B29-Nε-heksanoil-LysB29 humanog inzulina i 5,25 dijelova u masi suhog praška humanog inzulina. Pomiješaju se jednaki volumeni otopina koje sadržavaju inzulin, acilirani inzulin, te protamin-sulfat. Prvo nastaje amorfni talog. Nakon što suspenzija stoji na sobnoj temperaturi (uobičajeno 22 °C), amorfni talog pretvara se u kokristaliničnu mikrokristaliničnu krutinu.

Priprava 7

3 : 1 kokristali humanog inzulina i B29-Nε-butanoil humanog inzulina

Korišten je postupak Priprave 1, s iznimkom da je korišteno 1,75 dijelova u masi suhog praška B29-Nε-oktanoil-LysB29 humanog inzulina i 5,25 dijelova u masi suhog praška humanog inzulina. Pomiješaju se jednaki volumeni otopina koje sadržavaju inzulin, acilirani inzulin, te protamin-sulfat. Prvo nastaje amorfni talog. Nakon što suspenzija stoji na sobnoj temperaturi (uobičajeno 22 °C), amorfni talog pretvara se u kokristaliničnu mikrokristaliničnu krutinu.

Priprava 8

mikrokristalinični kokristali protamin-cink-B29-Nε-oktanoil humanog inzulina i humanog inzulina

B29-Nε-oktanoil-LysB29 humani inzulin (20,1 mg) otopi se i 1 ml 0,1 M HCl. Humani inzulin (19,3 mg) otopi se i 1 ml 0,1 M HCl. Pripravi se 5 otopina koje imaju različit omjer B29-Nε-oktanoil-LysB29 humanog inzulina i humanog inzulina. Kombinacija uporabljenih volumena prikazana je u tablici koja slijedi.

Tablica 3. Volumeni otopina humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil-LysB29 humanog inzulina korištenih za pripravu taloga i mikrokristala.

[image]

Svakoj od tih 5 otopina doda se 50 mM TRIS, 0,1 M Na3P04, te 10 mg/ml fenola kod pH 7,6. Svakoj od tih 5 otopina doda se 0,15 ml 15,3 mM otopine cink-klorida. Svakoj nastaloj otopini podesi se pH na 7,6 pomoću 1 M NaOH. Svaka otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pripremi se dodatna otopina otapanjem 3,50 mg protamin-sulfata u 10 ml vode te profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pomiješa se 1,9 ml svake od navedenih 5 otopina s 1,9 ml otopine protamin-sulfat. U svakoj od 5 otopina nastaje amorfni talog. Nakon što tih 5 otopina stoji na sobnoj temperaturi (uobičajeno 22 °C), amorfni talog pretvara se u bjelkastu kokristaliničnu mikrokristaliničnu krutinu kod svih 5 otopina.

Priprava 9

9 : 1 kokristali humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina

Suhi prašak B29-Nε-oktanoil-LysB29 humanog inzulina (0,7 masenih dijelova) otopi se u 100 dijelova po volumenu vodene otopine koja sadržava 50 mM TRIS, 0,1 M Na3P04, te 10 mg/ml fenola kod pH 7,6. Toj otopini doda se 7,5 dijelova 15,3 mM otopine cink-klorida. Pripravi se druga otopina koja sadržava prašak humanog inzulina (6,3 masenih dijelova) otopljenog u 900 volumnih dijelova vodene otopine koja sadržava 50 mM TRIS, 0,1 M Na3P04, te 10 mg/ml fenola kod pH 7,6. Toj otopini doda se 67,5 dijelova 15,3 mM otopine cink-klorida. Pomiješaju se vrlo pozorno otopine aciliranog inzulina i inzulina kako bi se nastala otopina bila dobro homogenizirana. Ova se otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pripremi se druga otopina koja sadržava 7 masenih dijelova protamin-sulfata u 10 000 volumnih dijelova vode, nakon čega se profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pomiješaju se jednaki volumeni otopina koje sadržavaju inzulin, acilirani inzulin, te protamin-sulfat. Prvenstveno nastaje amorfni talog. Nakon što suspenzija stoji na sobnoj temperaturi (uobičajeno 22 °C), amorfni talog pretvara se u kokristaliničnu mikrokristaliničnu krutinu.

Priprava 10

3 : 1 kokristali humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina

Suhi prašak B29-Nε-oktanoil-LysB29 humanog inzulina (1,75 masenih dijelova) otopi se u 250 dijelova po volumenu vodene otopine koja sadržava 50 mM TRIS, 0,1 M Na3P04, te 10 mg/ml fenola kod pH 7,6. Toj otopini doda se 18,75 dijelova 15,3 mM otopine cink-klorida. Pripravi se druga otopina koja sadržava prašak humanog inzulina (5,25 masenih dijelova) otopi se u 750 volumnih dijelova vodene otopine koja sadržava 50 mM TRIS, 0,1 M Na3P04, te 10 mg/ml fenola kod pH 7,6. Toj otopini doda se 56,25 dijelova 15,3 mM otopine cink-klorida. Pomiješaju se vrlo pozorno otopine aciliranog inzulina i inzulina kako bi se nastala otopina dobro homogenizirala. Ova se otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pripremi se druga otopina koja sadržava 7 masenih dijelova protamin-sulfata u 10 000 volumnih dijelova vode, nakon čega se profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pomiješaju se jednaki volumeni otopina koje sadržavaju inzulin, acilirani inzulin, te protamin-sulfat. Prvenstveno nastaje amorfni talog. Nakon što suspenzija stoji na sobnoj temperaturi (uobičajeno 22 °C), amorfni talog pretvara se u kokristaliničnu mikrokristaliničnu krutinu.

Priprava 11

1 : 1 kokristali humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina

Suhi prašak B29-Nε-oktanoil-LysB29 humanog inzulina (3,5 masenih dijelova) otopi se u 500 dijelova po volumenu vodene otopine koja sadržava 50 mM TRIS, 0,1 M Na3P04, te 10 mg/ml fenola kod pH 7,6. Toj otopini doda se 1,75 dijelova 15,3 mM otopine cink-klorida. Pripravi se druga otopina koja sadržava prašak humanog inzulina (3,5 masenih dijelova) otope se u 500 dijelova po volumenu vodene otopine koja sadržava 50 mM TRIS, 0,1 M Na3P04, te 10 mg/ml fenola kod pH 7,6. Toj otopini doda se 37,5 dijelova 15,3 mM otopine cink-klorida. Pomiješaju se vrlo pozorno otopine aciliranog inzulina i inzulina kako bi se nastala otopina bila dobro homogenizirana. Ova se otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pripremi se druga otopina koja sadržava 7 masenih dijelova protamin-sulfata u 10 000 volumnih dijelova vode, nakon čega se profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pomiješaju se jednaki volumeni otopina koje sadržavaju inzulin, acilirani inzulin, te protamin-sulfat. Prvenstveno nastaje amorfni talog. Nakon što suspenzija stoji na sobnoj temperaturi (uobičajeno 22 °C), amorfni talog pretvara se u kokristaliničnu mikrokristaliničnu krutinu.

Priprava 12

1 : 3 kokristali humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina

Suhi prašak B29-Nε-oktanoil-LysB29 humanog inzulina (1,75 masenih dijelova) otopi se u 250 dijelova po volumenu vodene otopine koja sadržava 50 mM TRIS, 0,1 M Na3P04, te 10 mg/ml fenola kod pH 7,6. Toj otopini doda se 18,75 dijelova 15,3 mM otopine cink-klorida. Pripravi se druga otopina koja sadržava prašak humanog inzulina (5,25 masenih dijelova) otope se u 750 dijelova po volumenu vodene otopine koja sadržava 50 mM TRIS, 0,1 M Na3P04, te 10 mg/ml fenola kod pH 7,6. Toj otopini doda se 56,25 dijelova 15,3 mM otopine cink-klorida. Pomiješaju se vrlo pozorno otopine aciliranog inzulina i inzulina kako bi se nastala otopina bila dobro homogenizirana. Ova otopina se profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pripremi se druga otopina koja sadržava 7 masenih dijelova protamin-sulfata u 10 000 volumnih dijelova vode, nakon čega se profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pomiješaju se jednaki volumeni otopina koje sadržavaju inzulin, acilirani inzulin, te protamin-sulfat. Prvenstveno nastaje amorfni talog. Nakon što suspenzija stoji na sobnoj temperaturi (uobičajeno 22 °C), amorfni talog pretvara se u kokristaliničnu mikrokristaliničnu krutinu.

Priprava 13

1 : 3 kokristali humanog inzulina i B29-Nε-heksanoil humanog inzulina

Pripravi se kisela otopina B29-Nε-heksanoil humanog inzulina otapanjem 12,3 mg B29-Nε-heksanoil humanog inzulina u 0,3 ml 0,1 M HCl. Pripravi se kisela otopina humanog inzulina otapanjem 4,6 mg humanog inzulina (kristali cinka) u 0,1 ml 0,1 M HCl. Te dvije otopine se pomiješaju što rezultira ukupnim volumenom od 0,4 ml. Nastaloj otopini doda se uz miješanje 0,150 ml otopine cink(II)-klorida koncentracije 1000 ppm. Pripravi se otapalo za kristalizaciju koje sadržava 50 mM TRIS, 100 mM Na3P04, te 10 mg/ml fenola kod pH 7,6.Otopini inzulina doda se 1,6 ml kristalizacijskog otapala. pH se podesi na 7,6 pomoću 1 M HCl odnosno 1 M NaOH. Ova se otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pripremi se protaminska otopina koja sadržava 7,47 mg protamin-sulfata u 10 ml vode. 2 ml protaminske otopine doda se u 2 ml inzulinske otopine. Nastala otopina ostavi se stajati 18 sati na temperaturi od 25 °C.

Nakon 18 sati, mikroskopom se provjeri da li je došlo do kristalizacije, te da li su nastali jednoliki, prutićasti monokristali čija prosječna duljina iznosi 3 mikrona.

4 ml kristalnog pripravka koji je pripravljen nakon 18 sati (gore opisani postupak) ostavi se stajati preko noći, pri čemu dolazi do potpunog taloženja kristala. Ukloni se superntant, te zamijeni s 4 ml otapala koje sadržava 16 mg/ml glicerola, 20 mM TRIS pufera, 1,6 mg/ml m-krezola, 0,65 mg/ml fenola, te 40 mM Na-citrata pri pH 7,6. Kristali se ponovno resuspendiraju, te ponovno istalože. Ovaj postupak ponavlja se tri puta, pri čemu treba naglasiti da se treći put supernatant zamjenjuje sa samo 3 ml otapala.

Brzina otpuštanja kristala mjeri se na slijedeći način: u 3 ml Dulbecco-vog fosfatnog pufera (ne sadržava ni kalcij ni magnezij) koji se nalazi u četvrtastoj kvarcnoj kiveti (duljina 1 cm) dodano je 5 mikrolitara jednoliko suspendiranog pripravka, na temperaturi od 22 °C. Ova otopina kontinuirano se miješala na magnetskoj miješalici. Mjerila se vrijednost apsorbancije na 320 nm u vremenskom intervalu od jedne minute. Apsorbancija na 320 nm odgovara svjetlosti koje se raspršuje na netopljivim česticama prisutnim u vodenoj suspenziji. Postupno kako se mikrokristal otapa, vrijednost apsorbancije približava se 0. Potrebno je više od 150 minuta da se potpuno otopi 0,005 ml ovog pripravka. Vrijeme potrebno da se potpuno otopi 0,005 ml uzorka komercijalnog Humulina N 100 i.j pri istim uvjetima iznosi oko 10 minuta.

Ukupna količina proteina u pripravku analizira se tekućinskom kromatografijom visokog učinka kako bi se odredila ukupna biološka aktivnost. Alikvot od 0,05 ml potpuno suspendiranog pripravka otopi se u 0,950 ml 0,01 M HCl, te se proslijedi na HPLC analizu (kao što je opisano u nastavku teksta).

Analitički sustav sastoji se od C8 reverzno-fazne kolone, a kromatografija se odvija pri 23 °C. Protok je 1,0 ml/min, dok je UV detektor podešen na 214 nm. Mobilna faza A je 0,1%- tna (v/v) trifluoroctena kiselina u smjesi 10 : 90 (v/v) acetonitril : voda. Mobilna faza B je 0,1%- tna (v/v) trifluoroctena kiselina u smjesi 90 : 10 (v/v) acetonitril : voda. Linearni gradijent program (minuta, % B) je: (0,1, 0); (45,1, 75); (50,1, 100); (55, 100); (57, 0); (72, 0).

Standardne otopine pripremaju se od početnog inzulina i početnog aciliranog inzulina otopljenih u 0,01 M HCl. Koncentracija svakog pojedinačnog standarda određuje se UV spektrofotometrijom. Pretpostavlja se da otopina koja sadržava 1,0 mg/ ml humanog inzulina u kiveti (1 cm) ima vrijednost apsorbancije u iznosu od 1,05 jedinica optičke gustoće na maksimumu (oko 276 nm). To odgovara molarnom ekstincijskom koeficijentu u iznosu od 6098. Pretpostavlja se da acilirani inzulini imaju isti molarni ekstincijski koeficijent kao i humani inzulin. Otopine, koje su prethodno kalibrirane UV spektrofotometrom, razrijede se kako bi se dobile standardne otopine od 0,220, 0,147, 0,073, te 0,022 mg/ml. Standardne otopine analiziraju se pomoću HPLC što rezultira nastankom standardne krivulje (površina prema koncentraciji).

Analizira se supernatant kako bi se odredila ukupna koncentracija otopljenog humanog inzulina i B29-Nε-heksanoil humanog inzulina koji su prisutni u pripravku. U 0,040 ml supernatanta doda se 0,160 ml 0,01 M HCl. Zakiseljeni supernatant analizira se pomoću HPLC, kao što je već gore opisano u tekstu. Određena koncentracija otopljenog humanog inzulina i B29-Nε-heksanoil humanog inzulina iznosi 0,07 mg/ml.

Omjer humanog inzulina i B29-Nε-heksanoil humanog inzulina u kristalu određuje se taloženjem alikvota (0,100 ml) pripravka, pri čemu se pripravak prvo centrifugira, zatim se odlije supernatant, kristali se resuspendiraju u 0,400 ml Dulbecco-vog fosfatnog pufera, ponovno centrifugiraju, ukloni se supernatant, te se na kraju otope kristali u 1,50 ml 0,01 M otopini HCl. Koristi se gore opisani HPLC postupak. Dobiveni rezultat ove analize je 84,2 % B29-Nε-heksanoil humanog inzulina i 15,8 % humanog inzulina.

Priprava 14

Pripravak suspenzije kokristala humanog inzulina i B29-Nε-dekanoil humanog inzulina

Pripravi se kisela otopina B29-Nε-dekanoil humanog inzulina otapanjem 10,4 mg B29-Nε-dekanoil humanog inzulina u 0,25 ml 0,1 M HCl. Pripravi se kisela otopina humanog inzulina otapanjem 30,3 mg humanog inzulina (kristali cinka) u 0,1 ml 0,1 M HCl. Te dvije otopine se pomiješaju što rezultira ukupnim volumenom od 1 ml. Otopina se miješa oko 5 minuta. Nastaloj otopini doda se uz miješanje 0,305 ml otopine cink(II)-klorida koncentracije 1000 ppm. Pripravi se kristalizacijsko otapalo koje sadržava 40 mg/ml glicerola, 50 mM TRIS, 100 mM Na3-citrata, 4 mg/ml m-krezola, te 1,625 mg/ml fenola kod pH 7,6. Otopini inzulina doda se 4 ml kristalizacijskog otapala. pH se podesi na 7,58. Ova se otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pripremi se protaminska otopina koja sadržava 37,6 mg protamin-sulfata u 50 ml vode. 5 ml protaminske otopine doda se u 5 ml inzulinske otopine. Nastala otopina ostavi se stajati 63 sati na temperaturi od 25 °C.

Nakon 63 sati mikroskopom se provjeri da li je došlo do kristalizacije, te da li su nastali jednoliki, prutićasti monokristali čija prosječna duljina iznosi 8 mikrona.

Brzina otpuštanja kristala mjeri se na slijedeći način: u 3 ml Dulbecco-vog fosfatnog pufera (ne sadržava ni kalcij ni magnezij) koji se nalazi u četvrtastoj kvarcnoj kiveti (duljina 1 cm) dodano je 6 mikrolitara jednoliko suspendiranog pripravka, na temperaturi od 22 °C. Potrebno je više od 300 minuta da se potpuno otopi 0,006 ml ovog pripravka. Vrijeme potrebno da se potpuno otopi 0,005 ml uzorka komercijalnog Humulina N 100 i.j pri istim uvjetima iznosi oko 10 minuta.

Kako bi se pripravili kristali za HPLC analizu, kristalni se pripravak ostavi stajati preko noći. Ukloni se 8 ml superntanta, te zamijeni s 8 ml otapala koje sadržava 16 mg/ml glicerola, 20 mM TRIS pufera, 1,6 mg/ml m-krezola, 0,65 mg/ml fenola, te 40 mM Na-citrata pri pH 7,6. Kristali se ponovno resuspendiraju, te ponovno istalože. Ovaj postupak ponavlja se tri puta, pri čemu treba naglasiti da se treći put supernatant zamjenjuje sa 7 ml otapala.

Biološka aktivnost kristaliničnog pripravka, te supernatanta određuje se pomoću HPLC, kao što je opisano u Pripravi 13. Ukupna biološka aktivnost iznosi 3,87 mg/ml.

Određena koncentracija otopljenog humanog inzulina i B29-Nε-dekanoil humanog inzulina iznosi 0,06 mg/ml. Omjer humanog inzulina i B29-Nε- dekanoil humanog inzulina u kristalu određuje se prema postupku opisanom u Pripravi 13, a iznosi74,3 % B29-Nε- dekanoil humanog inzulina i 25,7 % humanog inzulina.

Određivanje veličine čestice provodi se na uzorku pripravka koristeći aparat za određivanje veličine čestica (Multisizer Model IIE, Coulter Corp., Miami, FL 33116 - 9015). Kako bi se provelo to određivanje, 0,25 ml kristaliničnog pripravka doda se u 100 ml otapala koje se sastoji od 14 mM dibazičnog natrij-fosfata, 16 mg/ml glicerola, 0,65 mg/ml fenola, pri pH 7,4. Veličina otvora cijevi ove aparature iznosi 50 mikrona. Vrijeme određivanja iznosi 50 sekundi. Ovim mjerenjem dobivena je prosječna veličina dijametra čestice kristala u iznosu od 6 mikrona, pri čemu normalna raspodjela obuhvaća veličine od 2 do 9 mikrona. Ovaj podatak sličan je podatku dobivenom određivanjem raspodjele veličine čestica komercijalnog NPH koristeći isti mjerni postupak (M. R. De Felippis i suradnici, J. Pharmaceut. Sci. 87 : 170 -176 (1998)).

Priprava 15

Pripravak suspenzije kokristala humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina

Pripravi se kisela otopina B29-Nε-oktanoil humanog inzulina otapanjem 30,3 mg B29-Nε-oktanoil humanog inzulina u 0,75 ml 0,1 M HCl. Pripravi se kisela otopina humanog inzulina otapanjem 59,7 mg humanog inzulina (kristali cinka) u 1,5 ml 0,1 M HCl. Pomiješa se alikvot od 0,25 ml humanog inzulina s alikvotom od 0,75 ml B29-Nε-oktanoil humanog inzulina što rezultira ukupnim volumenom od 1 ml. Otopina se miješa oko 5 minuta. Nastaloj otopini doda se uz miješanje 0,365 ml otopine cink(II)-klorida koncentracije 1000 ppm. Pripravi se kristalizacijsko otapalo koje sadržava 40 mg/ml glicerola, 35 mM dibazičnog natrij-fosfatnog pufera, 15 mM Na-citrata, 4 mg/ml m-krezola, te 1,625 mg/ml fenola kod pH 7,6. Otopini inzulina i cinka doda se 4 ml kristalizacijskog otapala. pH se podesi na 7,60. Ova se otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pripremi se protaminska otopina koja sadržava 37,9 mg protamin-sulfata u 50 ml vode. 5 ml protaminske otopine doda se u 5 ml inzulinske otopine. Nastala otopina ostavi se stajati 48 sati na temperaturi od 25 °C.

Nakon 48 sati mikroskopom se provjeri da li je došlo do kristalizacije, te da li su nastali jednoliki, prutićasti monokristali čija prosječna duljina iznosi 5 mikrona.

Kako bi se pripravili kristali za HPLC analizu, kristalni se pripravak ostavi stajati preko noći. Ukloni se 8 ml superntanta, te zamijeni s 8 ml otapala koje sadržava 16 mg/ml glicerola, 14 mM dibazičnog natrij-fosfatnog pufera, 1,6 mg/ml m-krezola, 0,65 mg/ml fenola, te 6 mM Na-citrata, pri pH 7,6. Kristali se ponovno resuspendiraju, te ponovno istalože. Ovaj postupak ponavlja se tri puta, pri čemu treba naglasiti da se treći put supernatant zamjenjuje sa 7 ml otapala.

Brzina otpuštanja kristala mjeri se kao što je opisano u Pripravi 13. Potrebno je više od 300 minuta da se potpuno otopi 0,005 ml ovog pripravka. Vrijeme potrebno da se potpuno otopi 0,005 ml uzorka komercijalnog Humulina N 100 i.j pri istim uvjetima iznosi oko 10 minuta.

Biološka aktivnost kristaliničnog pripravka, te supernatanta određuje se pomoću HPLC, kao što je opisano u Pripravi 13. Ukupna biološka aktivnost iznosi 3,44 mg/ml. Određena koncentracija otopljenog humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina iznosi 0,01 mg/ml. Omjer humanog inzulina i B29-Nε- oktanoil humanog inzulina u kristalu određuje se prema postupku opisanom u Pripravi 13, a iznosi 74,5 % B29-Nε- oktanoil humanog inzulina i 25,5 % humanog inzulina.

Određivanje veličine čestice provodi se kao što je opisano u Pripravi 13. Ovim mjerenjem dobivena je prosječna veličina dijametra čestice kristala u iznosu od 6 mikrona, pri čemu normalna raspodjela obuhvaća veličine od 2 do 12 mikrona. Ovaj podatak sličan je podatku dobivenom određivanjem raspodjele veličine čestica komercijalnog NPH kojeg je objavio M. R. DeFelippis i suradnici.

Priprava 16

Tri kokristalinična pripravak u usporedbi s inzulinskim pripravkom

Pripravi se kisela otopina B29-Nε-oktanoil humanog inzulina otapanjem 24,18 mg B29-Nε-oktanoil humanog inzulina u 0,6 ml 0,1 M HCl. Pripravi se kisela otopina humanog inzulina otapanjem 41,1 mg humanog inzulina (u obliku kristala s cinkom) u 1,0 ml 0,1 M HCl. Priprave se 4 otopine od 0,4 ml miješanjem različitih alikvot humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina, kao što je prikazano u Tablici 4.

Tablica 4. Priprava mikrokristaliničnih pripravaka

[image]

Svakoj otopini volumena 0,4 ml doda se uz miješanje 0,15 ml otopine cink(II)-klorida koncentracije 1000 ppm. Pripravi se kristalizacijsko otapalo koje sadržava 50 mM TRIS pufera, 10,0 mg/ml fenola, te 100 mM Na-citrata, kod pH 7,6. Svakoj otopini volumena 0,55 ml doda se 1,6 ml kristalizacijskog otapala. Svakoj otopini podesi se pH na 7,60 pomoću malih količina 1 M NaOH odnosno 1 M HCl. Ove se otopine profiltriraju kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Pripremi se protaminska otopina koja sadržava 7,34 mg protamin-sulfata u 10 ml vode. 2 ml protaminske otopine doda se u 2 ml inzulinske otopine. U svakom pojedinačnom slučaju dolazi do trenutačnog stvaranja taloga. Nastale suspenzije ostave se stajati 16 sati na temperaturi od 22 °C.

Nakon 16 sati mikroskopom se provjeri da li je došlo do kristalizacije, te da li su nastali jednoliki, prutićasti monokristali čija prosječna duljina iznosi 10 mikrona.

Svaki od ova 4 pripravka (volumena 4 ml) prebaci se u kivetu za centrifugiranje, te se centrifugira brzinom od 3000 okretaja u minuti tijekom 20 minuta kako bi se kristali potpuno istaložili. Svakom se pripravku ukloni 3 ml superntanta, te zamijeni s 3 ml otapala koje sadržava 25 mM TRIS pufer, 5 mg/ml fenola, 16 mg/ml glicerola, pri pH 7,4. Kristali se ponovno resuspendiraju, te ponovno istalože. Ovaj postupak ponavlja se tri puta, pri čemu treba naglasiti da se treći put supernatant zamjenjuje sa 2,5 ml otapala.

Svaki pripravak analizira se pomoću HPLC, kako bi se odredila biološka aktivnost kristaliničnih pripravaka te smjesa tih kristala. Ukupna biološka aktivnost odgovara ukupnoj koncentraciji humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina. Ukupna biološka aktivnost i postotak B29-Nε-oktanoil humanog inzulina određuje se analizom alikvota jednoliko suspendiranog pripravka. Analiza supernatanta provodi se kako bi se odredila ukupna koncentracija otopljenog humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina prisutnih u svakom pripravku. Rezultati dobiveni u tim analizama prikazani su u Tablici 5.Brzina otpuštanja kristala mjeri se kao što je opisano u Pripravi 13.

Tablica 5. Karakteristike mikrokristaliničnih pripravaka.

[image]

Priprava 17

Pripravci koji sadržavaju netopljive smjese

Slijedi pregled ostalih postupaka koji su korišteni za pripravu taloga i mikrokristala ovog izuma. Pregled se mora čitati zajedno s Tablicom 6 koja slijedi u nastavku.

Izmjerena masa derivatiziranog proteina, pripravljenog kako je opisano, otopi se u 0,6 ml 0,1M HCl. Izmjerena masa proteina otopi se u 0,2 ml 0,1M HCl (cinkovi kristali humanog inzulina ili LysB28, Pro29 analoga humanog inzulina). Dvije se otopine spoje uz snažno miješenje. Smjesi ova dva proteina doda se 0,32 ml otopine cink(II)-klorida koncentracije 1000 ppm, te 3,2 ml otapala koje sadržava 50 mM TRIS pufera, 10,0 mg/ml fenola, 16 mg/ml glicerola, te 29,5 mM Na-citrata. Nastaloj otopini podesi se pH na oko 7,60 (7,55 -7,64) pomoću malih količina 1 M NaOH odnosno 1 M HCl. Ova se otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. 4 ml protaminske otopine (oko 37,3 mg protamin-sulfata u 100 ml vode, iznos: 37,18 - 37,48 mg) doda se u 4 ml inzulinske otopine. Dolazi do trenutačnog stvaranja taloga. Dobiveni pripravak ostavi se stajati na temperaturi od 25 °C.

Test otpuštanja djelatne tvari provodi se na prije opisano način. Pod istim uvjetima, NPH inzulin se otopio u 6 minuta.

Tablica 6. Priprava netopljivih smjesa

[image]

[image]

[image]

[image]

Slijedi pregled slijedećeg postupka koji je korišten za pripravu taloga i mikrokristala ovog izuma. Pregled se mora čitati zajedno s Tablicom 7 koja slijedi u nastavku.

Izmjerena masa proteina otopi se u 3,2 ml otapala (50 mM TRIS pufera, 10,0 mg/ml fenola, 16 mg/ml glicerola, te 29,5 mM Na-citrata ). Izmjerena masa derivatiziranog proteina, pripravljenog kako je opisano, otopi se u 0,6 ml 0,1M HCl (cinkovi kristali humanog inzulina ili LysB28, Pro29 analoga humanog inzulina). Dvije se otopine spoje uz snažno miješenje u trajanju od 5 do minuta.. Nastaloj otopini podesi se pH na oko 7,60 (7,55 -7,64) pomoću malih količina 1 M NaOH odnosno 1 M HCl. Ova se otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. Alikvot protaminske otopine (oko 37,3 mg protamin-sulfata u 100 ml vode, iznos: 37,18 - 37,48 mg) doda se jednakom alikvotu filtrata. Dolazi do trenutačnog stvaranja taloga. Dobiveni pripravak ostavi se stajati na temperaturi od 25 °C. Test otpuštanja djelatne tvari provodi se na prije opisano način. Pod istim uvjetima, NPH inzulin se otopio u 6 minuta.

Tablica 7. Priprava netopljivih smjesa

[image]

Slijedi pregled slijedećeg postupka koji je korišten za pripravu taloga i mikrokristala ovog izuma. Pregled se mora čitati zajedno s Tablicom 8 koja slijedi u nastavku.

Izmjerena masa derivatiziranog proteina, pripravljenog kako je opisano, otopi se izmjerenom volumenu 0,1M HCl (cinkovi kristali humanog inzulina ili LysB28, ProB29 analoga humanog inzulina). Izmjerena masa proteina otopi se u izmjerenom volumenu 0,1M HCl. Dvije se otopine spoje uz snažno miješenje u trajanju od 5 do minuta. Smjesi se dodaju mjereni volumeni otopine koja sadržava 1000 ppm cink(II)-klorida i volumeni otapala (50 mM TRIS pufera, 10,0 mg/ml fenola, 32 mg/ml glicerola, te 30 mg/ml Na-citrat dihidrata, pH 8,47 ). Nastaloj otopini podesi se pH na oko 7,60 (7,55 -7,64) pomoću malih količina 1 M NaOH odnosno 1 M HCl. Ova se otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine. 2 ml protaminske otopine (oko 37,5 mg protamin-sulfata u 100 ml vode, iznos: 37,18 - 37,48 mg) doda se u 2 ml filtrata. Dolazi do trenutačnog stvaranja taloga. Dobiveni pripravak ostavi se stajati na temperaturi od 25 °C. Test otpuštanja djelatne tvari provodi se na prije opisano način. Pod istim uvjetima, NPH inzulin se otopio u 6 minuta.

Tablica 8. Priprava netopljivih smjesa

[image]

[image]

[image]

* Doda se 3,096 ml 37,5 mg/100 ml otopine protamin-sulfata prije nego što se doda otapalo. pH se podesi nakon dodavanja otapala.

Priprava 18

Pripravci u obliku amorfne suspenzije

Izmjerena masa krutog B28-tetradekanoil- Lys(B28), Pro(B29) analoga humanog inzulina, otopi se 0,375 ml 0,1M HCl. Izmjerena masa humanog inzulina s cinkom (7,40 mg proteina) otopi se u 207 mikrolitara 0,1M HCl. U otopinu koja sadržava B28-tetradekanoil- Lys(B28), Pro(B29) analog humanog inzulina doda se alikvot (125 µl) otopine inzulina (koja sadržava 4,47 mg humanog inzulina) Smjesi se doda 180 µl otopine koja sadržava 1000 ppm cink(II)-klorida i 2 ml otapala (1,6 mg/ml fenola, 4 mg/ml m-krezola, 40 mg/ml glicerola, 5 mg/ml bezvodnog dibazičnog natrij-fosfata, te 7,5 mg/ml Na-citrat dihidrata, pH 7,6 ). pH se poveća s 5,6 na 8,0 pomoću 100 mikrolitara 1M NaOH te nakon toga na 7,59 pomoću 20 mikrolitara 1M HCl i 1M NaOH. Koncentracija B28-tetradekanoil- Lys(B28), Pro(B29) analoga humanog inzulina iznosi 4,94 mg/ml, a koncentracija humanog inzulina 1,60 mg/ml. Ova se otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine, nakon čega se ostavi u hladnjaku preko noći. Slijedeće jutro nije primijećen nastanak taloga u otopini. 2,88 ml protaminske otopine (0,75 mg/ml krutog protamin-sulfata u vodi) doda se u 2,5 ml filtrata. Dolazi do trenutačnog stvaranja taloga. Dobiveni pripravak ostavi se stajati na temperaturi od 25 °C.

Nakon dodavanja protamina, koncentracija B28-tetradekanoil- Lys(B28), Pro(B29) analoga humanog inzulina, te koncentracija humanog inzulina u otopini ponovno se određuje. Pripravci za HPLC analizu pripremaju se odmah nakon dodatka protamina. Iz retencijskih vremena pikova, pokazalo se HPLC analizom da netopljiva tvar u suspenziji sadržava protamin, B28-tetradekanoil- Lys(B28), Pro(B29) analog humanog inzulina, te humani inzulin. Koncentracija B28-tetradekanoil- Lys(B28), Pro(B29) analoga humanog inzulina u otopini iznosi 2,30 mg/ml, a koncentracija humanog inzulina 0,74 mg/ml.

Određena je koncentracija B28-tetradekanoil- Lys(B28), Pro(B29) analoga humanog inzulina i koncentracija humanog inzulina u kiselim uzorcima uzetim iz suspenzije, supernatanta i taloga, te je prikazana u tablici koja slijedi. Podaci se poprilično podudaraju s očekivanim vrijednostima.

Tablica 9. Priprava netopljivih smjesa.

[image]

Priprava 19

Pripravci u obliku amorfne suspenzije

Slijedi pregled drugog postupka koji je korišten za pripravu taloga ovog izuma Postupak je korišten za pripravu pripravaka koji sadržavaju amorfne taloge inzulina s jednim od tri derivatizirana proteina: B29-Nε-oktanoil humani inzulin, B29-Nε-nonanoil humani inzulin, B28-Nε-oktanoil- LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

Izmjerena masa krutog derivatiziranog proteina otopi se 3 ml 0,1M HCl, te nastaje otopina koncentracije 16 mg/ml. Izmjerena masa humanog inzulina s cinkom (73 mg, od čega je 61,17 mg masa proteina) otopi se u 4,198 ml 0,1M HCl, te nastaje otopina koncentracije 16 mg/ml inzulina. 3 m otopine koja sadržava derivatizirani protein pomiješa s 1 ml otopine inzulina. Smjesi se doda 1,137 ml otopine koja sadržava 1000 ppm cink(II)-klorida, te 16 ml otapala (koje sadržava 1,625 mg/ml fenola, 4 mg/ml m-krezola, 40 mg/ml glicerola, 5 mg/ml bezvodnog dibazičnog natrij-fosfata, te 7,5 mg/ml Na-citrat dihidrata, pH 7,6 ). pH se podesi na oko 7,6 (7,58 - 7,61) pomoću 5M NaOH te 5M HCl. Ova se otopina profiltrira kroz 0,22 mikronski filter koji slabo veže proteine, nakon čega se ostavi u hladnjaku preko noći. Slijedeće jutro nije primijećen nastanak taloga u otopini. 2,88 ml protaminske otopine (0,75 mg/ml krutog protamin-sulfata u vodi) doda se u 2,5 ml Otopina uključuje protein i derivatizirani protein (u masenom omjer od oko 1 : 3), pri čemu ukupna količina proteina iznosi oko 85 jedinica po mililitru. Neposredno prije testiranja na štakorima, pomiješaju se jednaki alikvoti pripravljene otopine i protaminske otopine (0,355 mg/ml protamin-sulfata ). Dolazi do trenutačnog stvaranja taloga. Odmah zatim životinjama se daje uzorak pripravka (injekcije) u obliku suspenzije koji sadržava amorfni talog. Nakon miješanja s proteinom ukupna koncentracija proteina iznosi 4,4 jedinica/ml.

Priprava 20

Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32) analog humanog inzulina

Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32) humani inzulin dobiven je fermentacijom E. coli u kojem se prekursor Gly(A21) humanog proinzulina prekomjerno izlučuje u separatne supstancije. Dio (94,7 g) supstancije otopi se na sobnoj temperaturi u 500 ml 6M otopini gvanidin hidroklorida koja sadržava 0,1 M TRIS, 0,27 M natrij-sulfita, 0,1 M natrij-tetrationata, pH otopine je 10,5. PH se brzo smanji na 8,8 pomoću 12 M HCl. Otopina se snažno miješa tijekom 45 minuta, nakon čega se snizi pH na 2,1 pomoću fosfatne kiseline. Uzorak se centrifugira tijekom noći na temperaturi od 4 °C. Supernatant se odlije te pohrani na 4 °C u svrhu daljnje obrade. Ostatak se ponovno ekstrahira s dodatnih 200 ml otopine čiji je pH 10,5 (vidi gore), nakon čega se centrifugira 3 sata na temperaturi od 4 °C. Ovaj i prije dobiveni supernatant razrijede se 4 puta sa 100 mM natrij-fosfatom (pH 4), pri čemu dolazi do taloženja ciljanog spoja i ostalih kiselih komponenti. Nakon što se talog slegne, većina supernatanta se odlije te odbaci. Nastala se suspenzija centrifugira, te se ponovno odlije te odbaci preostali supernatanta. Dobivene su vlažne, sirove kuglice prekursora Gly(A21) humanog proinzulin S-sulfonata. Kuglice se otope u 1,5 l 7M deionizirane uree, pri čemu se podesi pH na 8 pomoću 5 M otopine NaOH, a otopina se miješa nekoliko sati na temperaturi od 4 °C. Nakon toga doda se sol (NaCl) kako bi se dobila koncentracija od 1 M. Dobiveni uzorak stavi se na XAD-7 kolonu (14 cm × 20 cm, Toso-Haas, Montgomerywille, PA), koja je neposredno prije isprana s nizom smjesa otapala: 50 % acetonitril : 50 % 50 mM amonij-dikarbonat, 10 % acetonitril : 90 % 50 mM amonij-dikarbonat, te 7 M deionizirana urea : 1 M NaCl : 20 mM TRIS (pH 8). Kada se na kolonu nanese uzorak, kroz nju se propusti 4,5 l otopine koja sadržava smjesu deionizirane uree : 1 M NaCl : 20 mM TRIS (pH 8), te 2,8 l otopine koja sadržava 50 mM amonij-dikarbonat : 1 M NaCl, te na kraju 6,5 l 50 mM amonij-dikarbonata. Kolona se eluira linearnim gradijentom pomoću otapala koje sadržava acetonitil u 50 mM amonij-dikarbonatu, pri čemu se otapalo promatra na 280 nm (UV). Ciljani spoj u djelomično pročišćenom obliku sakupi se, liofilizira te podvrgne postupku prekrivanja/vezanja disulfidnim mostom. 5,4 g prekursora otopi se u 3 l 20 mM otopine glicina, čiji je pH 10,5, na temperaturi od 4 °C. Nakon toga doda se uz miješanje15 ml 240 mM otopine cistein HCl, pri čemu se pH održava na 10,5, a temperatura na 4 °C. Na navedenoj temperaturi miješa se reakcijska smjesa tijekom 27 sati. Reakcija se zaustavi sniženjem pH na 3,1 pomoću fosfatne kiseline. Doda se 155 ml acetonitrila, a otopina se kromatografira na C4 reverzno-faznoj koloni 5 × 25 cm kroz koju se prethodno propusti smjesa: 60 % acetonitil : 40 % voda : 0,1 % TFA, te se uravnoteži otopinom: 60 % acetonitil : 40 % voda : 0,1 % TFA. Kada je uzorak nanesen na kolonu, kolona se eluira slijedećom mobilnom fazom: 17,5 % acetonitil : 82,5 % voda : 0,1 % TFA, a nakon toga uz linearni gradijent acetonitrila u 0,1 %-tnoj otopini TFA, pri čemu se otapalo promatra na 280 nm (UV). Spoje se odabrane frakcije. Dobiveno je 714 mg liofilizata. Kako bi se prekursor inzulina preveo u traženi analog inzulina, otopi se 697 mg Gly(A21) prekursora humanog inzulina u 70 ml 50 mM otopine amonij-dikarbonata. Otopina se ohladi na 4 °C (pH 8,3). U otopinu s uzorkom doda se uz lagano miješanje 0,14 ml otopine svinjskog tripsina u 0,01 M HCl (1 mg/ml; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo) ). Otopina se miješa tijekom 24 sata na temperaturi od 4 °C. U reakcijsku smjesu doda se slijedećih 0,14 ml otopine tripsina. Nastala smjesa miješa se tijekom 21 sata i 45 minuta. Reakcija se prekine snižavanjem pH na 3,2 dodatkom 0,2 ml glacijalne octene kiseline te 0,3 ml fosfatne kiseline. Dobivena otopina Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32) humanog inzulina nastala u trostrukoj reakciji cijepanja razrijedi se 4 puta otopinom koja se sastoji od 30 % acetonitrila i 70 % mM octene kiseline (pH otopine je 3,1), te nakon toga nanese na S HyperD F kolonu za kationsku izmjenu (1× 30 cm, Biosphera, Marlborough, MA). Kolona je prethodno kondicionirana mobilnom fazom slijedećeg sastava: 30 % acetonitril : 70 % mM octena kiseline/500 mM NaCl (pH mobilne faze je 3,3), te mobilnom fazom: 30 % acetonitril : 70 % mM octena kiseline. Nakon što je na kolonu nanesen uzorak, propuštala se s 50 ml mobilne faze čiji je sastav: 30 % acetonitril : 70 % mM octena kiseline, nakon čega se primjenjuje linearni gradijent NaCl u mobilnoj fazi čiji je sastav: 30 % acetonitril : 70 % mM octena kiseline. Detektor je podešen na 276 nm. Skupe se odabrane frakcije koje sadržavaju Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32) humani inzulin, 3 puta razrijede pročišćenom vodom, nakon čega se uzorak nanese na C4 reverzno-faznu kolonu (Vydac, Hesperia, CA) koja je prethodno kondicionirana mobilnom fazom čiji je sastav na početku bio: 60 % acetonitril : 40 % voda : 0,1 % TFA, te zatim: 10 % acetonitril : 90 % voda : 0,1 % TFA. Nakon što je na kolonu nanesen uzorak, propuštala se s 200 ml mobilne faze čiji je sastav: 10 % acetonitril : 90 % voda : 0,1 % TFA, nakon čega se primjenjuje linearni gradijent acetonitrila u 0,1 % TFA. Skupe se odabrane frakcije, te liofiliziraju čime nastaje 101 mg uzorka. HPLC analizo dobivena je čistoća uzorka u iznosu od 95 %. Analizom pročišćenog proteina pomoću ES masene spektroskopije (ESMS) dobivena je molekulska masa od 6062,9 (teorijski predviđen rezultat je 6063,0).

Priprava 21

Des(B30) humani inzulin

Des(B30) humani inzulin pripravlja se od humanog proinzulina kontroliranom trostrukom hidrolizom. U 400 ml o,1 M HEPES pufera (pH 7,5) otopi se 2 g humanog inzulina dobivenog biosintetskim puten u rekombinantnim E. coli, te pročišćenog uobičajenim postupcima (B. H. Frank i suradnici, u PEPTIDES: Sinteza - Struktura - Funkcija. Postupci Sedmog američkog simpozija o peptidima, D. H. Rich i E. Gross (Eds.), Pierce Chemical Company, Rockford, stranice 729 - 738, 1981. godina, te također B. H. Frank, U.S. Patent br. 4, 430, 266, objavljen 7. veljače 1984. godine, pri čemu oba navoda predstavljaju sastavni dio ovog izuma u obliku literaturnih podataka). Nakon toga doda se 8 ml 1 M CaCl2 (otopljen u vodi), te podesi se pH na 7,5 pomoću 5 M NaOH. Zatim se uz polagano miješanje doda u smjesu 2 ml otopine svinjskog tripsina u 0,01 M HCl(10 mg/ml; Sigma). Reakcijska smjesa miješa se na sobnoj temperaturi tijekom 2 sata i 42 minute, nakon čega se temperatura povisi na 37 °C, te se povremeno promiješa. Nakon 1 sata i 45 minuta na 37 °C, reakcija se prekine snižavanjem pH na 3,0 fosfatnom kiselinom, te snižavanjem temperature na 4 °C, na kojoj se uzorak i pohranjuje. Kasnije se otopina zagrije na sobnu temperaturu, razrijedi s 50 ml acetonitrila, te nadopuni do 500 ml pročišćenom vodom. Uzorak se nanese na CG-161 (Toso-Haas) kolonu (2,5 × 58 cm) koja je prethodno kondicionirana u iznosu od jednog volumene kolone s mobilnom fazom slijedećeg sastava: 40 % acetonitril : 60 % 0,1 M amonij-sulfat, pH 2,5, te nakon toga u iznosu od dva volumena kolone s mobilnom fazom slijedećeg sastava: 10 % acetonitril : 90 % 0,1 M amonij-sulfat, pH 2,5. Nakon što se na kolonu nanese uzorak, kroz kolonu se propusti jedan volumen kolone mobilne faze čiji je sastav: 10 % acetonitril : 90 % 0,1 M amonij-sulfat, pH 2,5. Kolona se ispire linearnim gradijentom acetonitrila u 0,1 M amonij-sulfatu, pH 2,5. Detektor je podešen na 276 nm. Spoje se odabrane frakcije koje sadržavaju djelomično pročišćeni traženi spoj (des(B30) humani inzulin). Ove spojene frakcije djelomično pročišćenog des(B30) humanog inzulina razrijede se na 1,28 l pročišćenom vodom (pH 3,5). Uzorak se nanese na S HyperD F kolonu za kationsku izmjenu (1× 29 cm, Biosphera). Kolona je prethodno kondicionirana 1 volumenom kolone s mobilnom fazom slijedećeg sastava: 30 % acetonitril : 70 % 0,1 % TFA : 0,5 M NaCl (pH mobilne faze je 1,9), te nakon toga u iznosu od dva volumena kolone s mobilnom fazom slijedećeg sastava: 30 % acetonitril : 70 % 0,1 % TFA (pH mobilne faze je 2,3). Nakon što je na kolonu nanesen uzorak, propuštala se jedan volumen kolone mobilne faze čiji je sastav: 30 % acetonitril : 70 % 0,1 % TFA (pH mobilne faze je 2,3), a zatim se primjenjuje linearni gradijent NaCl u mobilnoj fazi čiji je sastav: 30 % acetonitril : 70 % 0,1 % TFA (pH se kreće u području od 1,9 do 2,3). Detektor je podešen na 276 nm. Skupe se odabrane frakcije koje sadržavaju djelomično pročišćeni des(B30) humani inzulin, razrijede 2,5 puta te nanesu na 35-c.c C8 SepPak (Waters, Milford, MA) kolonu, koja je prethodno ispirana te kondicionirana u iznosu od 2 volumena kolone acetonitrilom, 2 volumena kolone s mobilnom fazom slijedećeg sastava: 60 % acetonitril : 40 % 0,1 % TFA, te 2 volumena kolone s mobilnom fazom slijedećeg sastava: 10 % acetonitril : 90 % 0,1 % TFA. Nakon što je na kolonu nanesen uzorak, ispire se SepPak kolona s 3 volumena kolone mobilne faze čiji je sastav: 10 % acetonitril : 90 % 0,1 % TFA, te s 2 volumena kolone mobilne faze čiji je sastav: 40 % acetonitril : 60 % 0,1 %. Dobiveno je 500 mg uzorka u obliku liofilizata. HPLC analizom dobivena je čistoća uzorka u iznosu od 95 %. Analizom pročišćenog proteina pomoću ES masene spektroskopije (ESMS) dobivena je molekulska masa od 5706,5 (teorijski predviđen rezultat je 5707).

Priprava 22

Inzulin kunića

Inzulin kunića pripravljen je kao što su opisali R. E. Chance i suradnici (Proinzulin, Inzulin, C-peptid, S. Baba i suradnici (Eds.), Excerpta Medica, Amsterdam - Oxford, stranice 99 - 105 (1979)).

Priprava 23

Asp(B30) analog humanog inzulina

Asp(B30) analog humanog inzulina pripravljen je i pročišćen sukladno opisanim tehnikama u primjerima 31 i 32 (E. R. Chance i suradnici, U.S. Patent br. 5, 700, 662, objavljen 23. prosinca 1997. godine), koje se u ovom tekstu navode u obliku literaturnih navoda. Des(B23 - 30) humani inzulin (W. W. Bromer i R. E. Chance, Biochim. Biophys. Acta, 133 : 219 - 223 (1967), u ovom tekstu navodi se u obliku literaturnih navoda) te sintetski oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys(Tfa)-Thr kondenziraju se polusintezom potpomognutom tripsinom, te pročiste gel filtracijom i reverzno-faznom tekućinskom kromatografijom visokog učinka, zatim se na njih djeluje pomoću 15 % amonij-hidroksida (v/v) tijekom 4 sata na sobnoj temperaturi kako bi se uklonio trifluoroacetat (Tfa - zaštitna skupina lizina(B29)). Nakon toga dobiveni produkt ponovno se pročišćava reverzno-faznom tekućinskom kromatografijom visokog učinka i na kraju liofilizira.

Priprava 24

Načini sinteze derivatiziranih proteina

Slijedi pregled sinteza određenih derivatiziranih proteina koji se koriste prilikom priprave taloga i mikrokristala opisanih u ovom izumu. Pregled se treba čitati zajedno s Tablicom 10 koja slijedi u daljnjem tekstu.

Uz miješanje otopi se izmjerena masa pročišćenog inzulina u izmjerenom volumenu dimetilsulfoksida (DMSO). Nakon toga u otopinu se doda izmjereni volumen tetrametilgvanidin-hidroklorida (TMG). Nastala smjesa mora se vrlo pozorno promiješati. U posebnoj posudi otopi se izmjerena masa N-acil-sukcinimida (NAS) u izmjerenom volumenu dimetilsulfoksida (DMSO), te se nastala otopina doda prvoj otopini. Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi, a napredovanje reakcije promatra se analizirajući uzorke dobivene iz reakcijske smjese pomoću tekućinske kromatografije visokog učinka. Reakcija se zaustavlja dodatkom određenog volumena etanolamina. Reakcijska se smjesa zakiseli tako da pH bude u području od 2 - 3.

Nakon toga reakcijska se smjesa pročišćava pomoću tekućinske kromatografije visokog učinka te u kombinaciji s kromatografijom kationske izmjene. Pročišćavanje reverzno- faznom HPLC kromatografijom uključuje FPLC® sustav (Pharmacia), uz UV detektor podešen na 214 odnosno 280 nm, aparat za skupljanje kromatografskih frakcija, C18 kolonu (2,2 × 25 cm ili 5 × 30 cm ), protok od 2,5 odnosno 5 ml/min, te sobnu temperaturu. Vodene faze bile su smjese tekućina A (0,1 % trifluoroctena kiselina(TFA) u otopini koja sadržava acetonitril i vodu u omjeru 10 : 90, v/v) te otopine B (0,1 % trifluoroctena kiselina(TFA) u otopini koja sadržava acetonitril i vodu u omjeru 70 : 30), koje su prikladne za eluiranje i razdvajanje ciljnih spojeva. Uobičajeno je da se kolona kondicionira, te da se na nju nanosi uzorak dok se eluira sa 100 % otopine A. Nakon toga primjenjuje se gradijent otopine B, uz odgovarajući omjer, čime se postiže razdvajanje produkata reakcije. Spoje se frakcije koje sadržavaju ciljni produkt. Razvoj postupaka čišćenja kreće se u okvirima zadanim samom problematikom.

U Tablici 10 navedeni su eksperimentalni podaci koji su u skladu s gore navedenim pregledom, a odnose se na sintezu derivatiziranih proteina korištenih prilikom priprave različitih spojeva ovog izuma. Početni proteini pripremaju se prema gore opisanom postupku, odnosno u skladu s uobičajenim postupcima. Uobičajeni načini čišćenja koriste s kako ni se odbili izrazito čisti početni proteini koji se koriste u dolje opisanoj sintezi. Sinteza inzulina, analoga inzulina i proinzulina kreće se u poznatim okvirima ove problematike, a može uključivati rekombinantnu ekspresiju, sintezu, ili pak sintezu na kruto fazi nakon koje slijedi lančana kombinacija. Pomoću uobičajenih postupaka čišćenja dobivaju se proteini čistoće adekvatne za uporabu u sintezi derivatiziranih proteina opisnih u ovom postupku. Molekulske mase čistih derivata potvrđene su masenom spektometrijom (ESMS). Asigniranje položaja acilranja temeljila se na podacima dobivenim HPLC analizom, N-terminalnoj nalazi ili na obje analize.

Tablica 10. Sažeti prikaz sinteze različitih derivatiziranih proteina.

[image]

[image]

* čišćenje koje je uključivalo prvo reverzno-faznu HPLC, zatim kromatografiju kationske izmjene, te reverzno-faznu HPLC

Slijedi pregled sinteze dodatnih derivatiziranih proteina. Pregled se treba čitati zajedno s Tablicom 11 koja slijedi u daljnjem tekstu.

Otopi se izmjerena masa pročišćenog inzulina u izmjerenom volumenu 50 mM borne kiseline (pH 2,57). Nakon toga uz miješanje doda se u otopinu izmjereni volumen acetonitrila koji je jednak volumenu otopine borne kiseline. Volumen otapala predstavlja sumu volumena borne kiseline i acetonitrila. pH otopine podesi se pomoću NaOH tako da se nalazi u području od 10,2 do 10,5. U posebnoj posudi otopi se izmjerena masa N-acil-sukcinimida (NAS) u izmjerenom volumenu dimetilsulfoksida (DMSO), te se nastala otopina doda prvoj otopini. Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi, pH se održava na 10,2, a napredovanje reakcije promatra se analizirajući uzorke dobivene iz reakcijske smjese pomoću tekućinske kromatografije visokog učinka. Reakcija se zaustavlja zakiseljavanjem tako da pH bude u području od 2 - 3. Nakon toga reakcijska se smjesa pročišćava pomoću tekućinske kromatografije visokog učinka (kao što je već opisano).

U Tablici 11 navedeni su eksperimentalni podaci koji su u skladu s gore navedenim pregledom, a odnose se na sintezu derivatiziranih proteina korištenih prilikom priprave različitih spojeva ovog izuma. Početni proteini pripremaju se prema gore opisanom postupku. Molekulske mase čistih derivata potvrđene su masenom spektometrijom (ESMS). Asigniranje položaja acilranja temeljila se na podacima dobivenim HPLC analizom, N-terminalnoj nalazi ili na obje analize.

Tablica 11. Sažeti prikaz sinteze različitih derivatiziranih proteina.

[image]

[image]

[image]

[image]

[image]

* otopljen u acetonitrilu umjesto u DMSO

[image]

* otopljen u acetonitrilu umjesto u DMSO

** iskorištenje A1-Nα, B29-Nε-diacil derivata humanog inzulina

*** određen MALDI masenom spektroskopijom umjesto ES masenom spektroskopijom

[image]

Slijedi općeniti pregled sheme sinteze dodatnih derivatiziranih proteina. U posebnim slučajevima pregled treba čitati zajedno s Tablicom 12 koja slijedi u daljnjem tekstu, kako bi se razumjela shema sinteze za određene derivatizirane proteine. Otopi se izmjerena masa pročišćenog inzulina ili analoga inzulina u izmjerenom volumenu DMSO. pH otopine podesi se pomoću 10 ekvivalenata tetrametilgvanidina. U posebnoj posudi otopi se izmjerena masa N-acil-sukcinimida (NAS) u izmjerenom volumenu dimetilsulfoksida (DMSO), te se nastala otopina doda prvoj otopinu kako bi se postigao suvišak od 1,9 ekvivalenata. Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi, a napredovanje reakcije promatra se analizirajući uzorke dobivene iz reakcijske smjese pomoću tekućinske kromatografije visokog učinka. Reakcija se zaustavlja dodavanjem 20 mikrolitara etanolamina, nakon toga se hladi u ledenoj kupelji, te razrijedi 2,1 puta pomoću 0,1 M HCl. Nakon toga reakcijska se smjesa pročišćava pomoću tekućinske kromatografije visokog učinka slijedeći navedeni propis: 1) kolona se navlaži 100 % acetonitrilom, zatim se eluira količinom od 3 do 4 volumena kolone mobilnom fazom čiji je sastav: 0,1 % TFA : 70 % acetonitril (pufer B), te konačno količinom od 4 do 5 volumena kolone kolone mobilnom fazom čiji je sastav: 0,1 % TFA : 10 % acetonitril (pufer A); 2) na kolonu se nanese razrijeđena reakcijska smjesa te se kolona eluira s 5 do 6 volumena kolone puferom A; 3) derivatizirani protein eluira se količinom od 5 do 6 volumena kolone puferom B. Smrzne se tekućina koja se skupi za vrijeme kromatografiranja te naknadno liofilizira. Dobivena liofilizirana krutina ponovno se čisti reverzno faznom kromatografijom kako po postupku koji je gore opisan.

U Tablici 12 navedeni su eksperimentalni podaci koji su u skladu s gore navedenim pregledom, a odnose se na sintezu derivatiziranih proteina korištenih prilikom priprave različitih spojeva ovog izuma. Molekulske mase čistih derivata potvrđene su masenom spektometrijom (ESMS). Asigniranje položaja acilranja temeljila se na podacima dobivenim HPLC analizom.

Tablica 12. Sažeti prikaz sinteze različitih derivatiziranih proteina.

[image]

*iskorištenje računano na temelju mase liofilizirane krutine u obliku baze

Pokus 1

Duljina djelovanja kokristala kod pasa

Duljina djelovanja tri pripravka na temelju kokristala ovog izuma određena je kod zdravih pasa koji su dobivali kontinuiranu infuziju somatostatina kako bi se uzrokovao dijabetes. Prvi kokristalinični pripravak, koji je uključivao humani inzulin i B29- Nε-oktanoil humani inzulin, a pripravljen je sukladno Pripravku D u Pripravi 16 (koja je već prethodno opisana), primjenjuje se subkutano u dozi od 3 nmol/kg (“8753”). Drugi kokristalinični pripravak, koji je uključivao humani inzulin i B29- Nε-oktanoil humani inzulin, a pripravljen je sukladno Pripravku D u Pripravi 16 (koja je već prethodno opisana), primjenjuje se subkutano u dozi od 2,5 nmol/kg (“8752,5”). Te konačno, treći kokristalinični pripravak, koji je uključivao humani inzulin i B29- Nε-oktanoil humani inzulin, a pripravljen je prema propisu opisanom u Pripravi 16, primjenjuje se subkutano u dozi od 2,5 nmol/kg (“10252,5”). Dobiveni podaci uspoređeni su s podacima dobivenim za isti model nakon primjene Humulina N (2,0 nmol/kg “NPH”), goveđe-svinjskog ultratlente inzulina (3 nmol/kg, “BP-UL”), te otopine soli u vodi.

Eksperiment se provodio na malim lovačkim psima, ženkama i mužjacima težine 10 - 17 kg (Marshall Farms, North Rose, NY), koji su bili na noćnoj dijeti, te pri punoj svijesti. Životinjama je kontinuirano aplicirana kanila. Najmanje deset dana prije pokusa, životinjama se da anestetik Izofluran (Anaquest, Madison, WI), a silikonski su kateteri pričvršćeni na vaskularnim ulazima, a uvode se u femoralnu arteriju i femoralnu venu. Kroz katetere se propušta otopina glicerina i heparina (3 :1, v/v; konačna koncentracija heparina iznosi 250 kjedinica/ml; glicerin je kupljen od Sigma Chemical Co., St Louis, Mo, a heparin od Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, NJ) kako bi se spriječila začepljivanje katetera. Rane se zatvore. Kefzol se primjenjuje predoperativno (Eli Lilly & Co. Indianapolis, IN; 20 mg/kg, i.v. te 20 mg/kg im.), a Keflex postoperativno (250 mg, p.o. jednom na dan tijekom sedam dana), kako bi se spriječila moguća infekcija. Torbugesic se primjenjuje (1,5 mg/kg, im.) postoperativno kako bi se ublažila bol.

Jedan dan prije pokusa životinjama se vadi krv kako bi im se odredilo zdravstveno stanje. U pokusu se koriste samo one životinje kojima su hematokriti iznad 38 %, a leukociti ispod 16 000 po mm3 (analizator krvi: Cell-Dyn 900, Sequoia Turner. Mountain View, CA).

Na dan pokusa ujutro, otvore se ulazi (Acess Technologies, Norfolk Medical, Skokie, IL); ispuše se sadržaj katetera, te se isperu otopinom soli u vodi (Baxter Healthcara Corp., Deerfield, IL); pas se stavi u kavez; na ulaze se pričvrste produživači (zaštićeni čeličnom sponom te pričvršćeni na stožer s prstenom, Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA). Psima se dozvoli oko 10 minuta da se prilagode na uvjete u kavezu prije nego što im se izvadi uzorak krvi potreban za određivanje inzulina za vrijemegladovanja, glukoze te koncentracije glukagona (vrijeme = -30 minuta). Tada se počne davati kontinuirana i.v. infuzija cikličkog somatostatina (0,65 µg/kg/min; BACHEM California, Torrance, CA), pri čemu vrijeme davanja infuzije iznosi 30,5 sati. Pola sata nakon početka davanja infuzije (vrijeme = 0 minuta), izvadi se uzorak krvi iz arterije, te se subkutano injektira test uzorak ili nosač, u leđnom području vrata. Nakon toga, svaka tri sata vade se uzorci krvi iz arterije kako bi se odredila glukoza u plazmi i koncentracija inzulina, a svakih 6 sati kako bi se odredila koncentracija glukagona. Cjelokupni pokus traje 30 sati.

Uzorci krvi izvađeni iz arterije sakupljaju se u vakuum epruvetama za skupljanje krvi u kojima se nalazi dinatrij-EDTA (Terumo Medical Corp., Elkton, MD) te se odmah stavljaju na led. Dio uzorka krvi (1,5 ml) prebaci se u propilensku epruvetu koja sadržava 40 µl aprotinina (10 000 k jedinica/ml; Trasylol, Miles, Inc. Diagnostic Division, Kanakee, IL) kako bi se pripravio za određivanje konncentracije glukagona u plazmi. Uzorci se centrifugiraju, prebace u propilenske kivete te pohrane na led za vrijeme trajanja pokusa.

Koncentracija glukoze u plazmi određuje se na dan pokusa pomoću glukoza oksidaze na komercijalnom aparatu za određivanje glukoze. Ostali uzorci iz kojih se određivao sadržaj pohranjeni su na -80 °C do trenutka kada se provodi analiza. Koncentracija inzulina određuje se imunoradiometrijskom metodom uz korištenje dvostrukih antitijela. Koncentracije glukagona određuju se uz pomoć pribora za određivanje radioaktivnosti imunog kompleksa (LINCO Research, Inc., St. Charles, MO).

Na kraju pokusa kateteri se isperu otopinom soli u vodi, primjeni se Kefzol (20 mg/kg), ispune smjesom glicerina i heparina; primjeni se p.o. antibiotik (Keflex; 250 mg). Kako bi se smanjio broj životinja korištenih u pokusu, a kako bi svejedno bilo moguće sparivanje baze podataka, proučavanje na životinjama provodi se više puta. Ponovljeni pokus na istim životinjama provodi se najranije jedan tjedan kasnije u odnosu na prvi eksperiment.

Vrijeme djelovanja 1 : 3 kokristala humanog inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina 9 puta je dulje od NPH inzulina (24 sata u odnosu na 15 sati) veće doze (8753), te 6 puta je dulje od NPH inzulina (21 sata u odnosu na 15 sati) manje doze (8752,5). Vrijeme djelovanja određuje se statistički usporedbom nivoa glukoze u krvi i nivoa u kontrolnoj skupini (otopina soli u vodi).

Profil glukoze za 1 : 3 kokristala humanog inzulina i B29- Nε-oktanoil humanog inzulina bio je sličniji onome koji se očekivao za bazalni inzulin nego profil NPH humanog inzulina. 1 : 3 kokristali imali su veću aktivnost te pogodniji profil glukoze u odnosu na goveđe svinjski ultralente inzulin. Smanjenje glukoze u krvi, u usporedbi s kontrolnim uzorkom (otopina soli u vodi), koje su uzrokovali kokristalični pripravci trajalo je duže u odnosu na smanjenje prouzrokovano goveđe-svinjskim ultralente inzulinom.

Vrijeme djelovanja 3 : 1 kokristaliničnog pripravka humanog inzulina i B29- Nε-oktanoil humanog inzulina (10252,5) 9 puta je dulje od NPH humanog inzulina (24 sata u odnosu na 15 sati). Razlika je statistički značajna ( p < 0,05). Kod istih životinja, vrijeme djelovanja 3 : 1 kokristaliničnog pripravka humanog inzulina (2,5 nmol/kg, SC) i B29- Nε-oktanoil humanog inzulina 6 puta je dulje od Humulina U ili goveđeg U pripravka (24 sata u odnosu na 18 sati). Razlika je statistički značajna ( p < 0,05). Profil glukoze kokristaliničnih pripravaka bio je sličniji onome koji se očekivao za bazalni inzulin nego profil NPH humanog inzulina. Nadalje, variranje vremena djelovanja kod pasa bilo je najmanje kod primjene 3 : 1 kokristala.

Iz ovih podataka može se zaključiti da kokristali ovog izuma djelotvorno i produženo kontroliraju nivo glukoze u krvi pasa. Također se može zaključiti da se kokristali ovog izuma mogu koristiti za djelotvornu noćnu kontrolu glukoze kod pacijenata koji boluju od dijabetesa tipa 2 ili se pak mogu koristiti u bazalnoj inzulinskoj terapiji kod pacijenata koji boluju od dijabetesa tipa 1 ili tipa 2. Ovi podaci također upućuju na to da pripravci mogu proizvesti manje varijabilni odgovor u odnosu na komercijalno dostupne inzulinske pripravke.

Pokus 2

Duljina djelovanja kokristala kod svinja

Pokusi su provedeni na zdravim ženkama svinja koje su bile pri punoj svijesti, mase 17 - 25 kg. Arterijski (karotidni ili femoralni) kateter implantira se kirurškim putem uzduž vratne vene za primjenu somatostatina, te za uzimanje uzoraka. Prije pokusa svinje kojima je aplicirana kanila podvrgnute su dijeti tijekom 22 do 24 sata. Daju se subkutano inzulinske injekcije u omekšalu kožu iza uha u dozi od 3,0 nmol/ kg (0,5 jedinica / kg). Istovremeno se daje somatostatin u iznosu od 0,3 µg/kg/min (otopljen u 0,9 % NaCl koji sadržava 1 % humanog albumina iz seruma, Miles, Canada, Etobicoke, ON) kako bi vršio supresiju endogenog izlučivanja inzulina. Stanje blisko normoglikemiji održavalo se 20 % infuzijom dekstroze davane u različitim obrocima, pri čemu se učestalo promatrala koncentracija glukoze. Razine glukoze u plazmi određene su iz svježih uzoraka plazme na dan provođenja pokusa primjenom postupka s glukoza oksidazom korištenjem komercijalnog aparata za određivanje glukoze. U združenom euglikemijskom pokusu, pripravak mikrokristala koji se sastoji od 1 : 3 inzulina i B29-Nε-oktanoil humanog inzulina, primijenjen je subkutano u dozi od 0,5 jedinica/kg (ekvivalentno oko 3 nmol/kg) na početku pokusa (vrijeme = 0). Pokus je proveden na pet svinja. Kontinuirano se određivala količina infuzije glukoze potrebne da bi se održalo stanje euglikemije (oko 90 mg/dl). Kontrolna skupina životinja dobila je iste doze (N = 6)Humulina N (100 jedinica) subkutanom primjenom. Davana je i propratna infuzija somatostatina (0,3 µg kg/min) tijelom cijelog eksperimenta. Kod primjene mikrokristala ovog izuma količina glukoze u infuziji povećavala se kontinuirano tijekom prva dva sata, kako bi dosegla maksimalnu vrijednost u iznosu oko 7 mg/kg/min. Od tada do 17,5 sata količina glukoze u infuziji kontinuirano se smanjivala do oko 0,5 mg/kg/min. Većinu preostalog vremena od 17,5 sati do 24 sata količina glukoze u infuziji kretala se u području od 0,5 do 2 mg/kg/min. Suprotno tome, srednja vrijednost količina glukoze u infuziji koja se davala kontrolnoj skupini (Humulin NPH) kontinuirano se povećavala do maksimalne vrijednosti od oko 14 mg/kg/min koja je postignuta nakon tri sata poslije primjene. Nakon toga količina glukoze u infuziji smanjivala se do vrijednosti od oko 7 mg/kg/min (nakon 4,5 sati), te 5 mg/kg/min (nakon 13 sati od trenutka primjene). Nisu skupljani dodatni podaci za kontrolnu skupinu. Ovi rezultati poklapaju se sa zaključkom da mikrokristalinični pripravci koji uključuju inzulin i B29-Nε-oktanoil humani inzulin u omjeru 1 : 3 imaju ujednačenije glukodinamički profil u odnosu na inzulin NPH.

Pokus 3

Duljina djelovanja kokristala kod štakora

Mikrokristalinični pripravci ovog izuma koji uključuju 1 : 3 inzulin i B29-Nε-oktanoil humani inzulin testirani su na BBDP/Wor štakorima, životinjama specifične genetike, koji se mogu nabaviti u Sveučilišnom bolničkom centru Massachusetts (Worchester, MA) povezanim s Biomedical Research Models, Inc. (Rutland, MA). BBDP/Wor štakor je životinja koja je genetski sklona dijabetesu, te ima autoimuni dijabetes mullitus. Svi pripravci primjenjuju se subkutano u dozi od 0,9 jedinica/100 g tjelesne težine.

Mužjaci BBDP/Wor štakora stari između 4 i 5 mjeseci, a koji se nalaze na terapiji inzulina s dugim djelovanjem (PZI), odabrani su po sistemu slučajnog izbora te podijeljeni u 5 skupina, A, B, C, D i E. Skupina A (n = 32) tretirana je tijekom tri dana humanim inzulinom ultrlente (Humulin UL, 40 jedinica); skupina B (n = 18) tretirana je tijekom tri dana Iletinom ultrlente (65 % goveđi inzulin, 35 % svinjski inzulin, 40 jedinica); skupina C (n = 10) tretirana je tijekom tri dana mikrokristaliničnim pripravkom koji uključuje uključuju 1 : 3 inzulin i B29-Nε-oktanoil humani inzulin, pripravljen po gore opisanom postupku; skupina D (n = 21) tretirana je tijekom tri dana mikrokristaliničnim pripravkom koji uključuje uključuju 100 % B29-Nε-oktanoil humani inzulin, pripravljen po gore opisanom postupku; te skupina E koja je dobila goveđe-svinjski PZI inzulin (PZI, 40 jedinica). Svakom štakoru daje se jedna injekcija pripravka dnevno (ovisno o skupini kojoj pripada) sve do dva dana prije vađenja uzorka za određivanje glukoze u krvi, te na dan kada se određuje glukoza u krvi.

Krv se vadi pola sata prije primjene pripravaka. U 11.30 (prijepodne) štakorima su se injektirali uzorci pripravaka. Životinji se zareže rep (bez anestetika) te se izvadi doza krvi. Uzorci se kratko stave na led, zatim centrifugiraju, nakon čega se glukoza odredi pomoću Beckman II analizatora glukoze. Uzorci krvi vade se neposredno prije primjene odgovarajućeg test pripravka, te zatim svakih 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 i 24 sata nakon primjene. Uz korištenje odgovarajućeg postupka kontrole razine glukoze u krvi u iznosu manjem od 200 mg/dl, dobiveno je vrijeme djelovanja pojedinih pripravaka. Tako je Humulin UL omogućavao oko 9,5 sati kontrole, oko 12 sati Iletin U, oko 15,5 sati pripravak opisan u ovom izumu, 20,5 sati 100 %-tni B29-Nε-oktanoil humani inzulin, te PZI oko 21,5 sati. Iz toga je jasno vidljivo da mikrokristalinični pripravak ovog izuma kontrolira razinu glukoze u krvi duže od Humulina UL, te Iletina U, no kraće od 100 %-tnog mikrokristaliničnog pripravka B29-Nε-oktanoil humanog inzulina, te PZI pripravka.

Pokus 4

Duljina djelovanja amorfnih taloga kod štakora

Amorfni pripravci ovog izuma koji uključuju 1 : 3 inzulin i B29-Nε-oktanoil humani inzulin, 1 : 3 inzulin i B28-Nε-oktanoil-Lys(B28), Pro(B29) humani inzulin te 1 : 3 inzulin i B29-Nε-nonanoil humani inzulin pripravljeni su skladu s opisanim postupkom Priprave 19, a testirani su na BBDP/Wor štakorima. Svi pripravci primjenjuju se subkutano u dozi od 0,9 jedinica/100 g tjelesne težine.

Mužjaci BBDP/Wor štakora stari između 4 i 5 mjeseci, a koji se nalaze na terapiji inzulina s dugim djelovanjem (PZI), odabrani su po sistemu slučajnog izbora te podijeljeni u 5 skupina, A, B, C, D i E. Skupina A (n = 7) tretirana je tijekom tri dana humanim inzulinom NPH (Humulin N, 40 jedinica); skupina B (n = 8) tretirana je tijekom tri dana i B29-Nε-oktanoil humanim inzulinom (42,2 jedinica); skupina C (n = 8) tretirana je tijekom tri dana B28-Nε-oktanoil-Lys(B28), Pro(B29) humanim inzulinom (42,6 jedinica); te; skupina D (n = 8) tretirana je tijekom tri dana pripravkom 1 : 3 inzulina i B29-Nε-nonanoil humanim inzulinom (42,7jedinica); te skupina E koja je dobila goveđe-svinjski PZI inzulin (PZI, 40 jedinica).

Krv se vadi pola sata prije primjene pripravaka. U 11.30 (prijepodne) štakorima su se injektirali uzorci pripravaka. Životinji se zareže rep (bez anestetika) te se izvadi doza krvi. Uzorci se kratko stave na led, zatim centrifugiraju, nakon čega se glukoza odredi pomoću Beckman II analizatora glukoze. Uzorci krvi vade se neposredno prije primjene odgovarajućeg test pripravka, te zatim svakih 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 i 24 sata nakon primjene. Uz korištenje odgovarajućeg postupka kontrole razine glukoze u krvi u iznosu manjem od 200 mg/dl, dobiveno je vrijeme djelovanja pojedinih pripravaka. Tako je 1 : 3 inzulin i B28-Nε-oktanoil-Lys(B28), Pro(B29) humani inzulin omogućavao oko 7,5 sati kontrole, oko 9 sati NPH, oko 15,5 sati 1 : 3 inzulin i B29-Nε-nonanoil humani inzulin, oko 16 sati 1 : 3 inzulin i B29-Nε-nonanoil humani inzulin, te PZI oko 22,5 sati.

U ovoj specifikaciji opisani su prvenstveno pogodni oblici i načini djelovanja ovog izuma. Izum kojeg se želi zaštititi ne odnosi se isključivo na određene opisane oblike, jer se oni trebaju smatrati više ilustrativnima, a manje restriktivnima. Varijacije i promjene su moguće, a mogu ih izvoditi obučene osobe upoznate s ovom problematikom, a da se pri tome ne udaljavaju od duha samog izuma.

Claims (83)

1. Netopljiva smjesa, naznačena time, da uključuje: a) protein odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, te proinzulina; b) derivatizirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, te proinzulina; c) kompleksirajući spoj d) tvar za stabiliziranje heksamera; te e) dvovalentni kation metala.

2. Smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time, da je amorfni talog.

3. Smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time, da je mikrokristal.

4. Smjesa prema zahtjevu 3, naznačena time, da u njoj mikrokristal ima prutićastu morfologiju.

5. Smjesa prema zahtjevu 3, naznačena time, da u njoj mikrokristal ima nepravilnu morfologiju.

6. Smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina aciliranog masnom kiselinom, analoga od inzulina aciliranih masnom kiselinom, te proinzulina aciliranih masnom kiselinom.

7. Smjesa prema zahtjevu 6, naznačena time, da je u njoj kompleksirajuća tvar protamin, tvar za stabiliziranje heksamera je fenolski konzervans, a dvovalentni kation metala je cink.

8. Smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina aciliranog masnom kiselinom, te analoga od inzulina aciliranog masnom kiselinom.

9. Smjesa iz prema zahtjevu 8, naznačena time, da je u njoj kompleksirajuća tvar protamin, tvar za stabiliziranje heksamera je fenolski konzervans, a dvovalentni kation metala je cink.

10. Smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od aciliranog inzulina, aciliranih analoga inzulina, te aciliranih proinzulina.

11. Smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od aciliranog inzulina, te aciliranih analoga inzulina.

12. Smjesa prema zahtjevu 11, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein mono-aciliran na svojoj Lys-Nε-amino skupini.

13. Smjesa prema zahtjevu 12, naznačena time, da je u njoj kompleksirajuća tvar protamin, prisutan u količini od 0,15 mg do 0,5 mg na 3,5 mg ukupnog proteina.

14. Smjesa prema zahtjevu 13, naznačena time, da je u njoj dvovalentni kation metala cink, prisutan u količini od 0,3 mola do 0,7 mola po molu ukupnog proteina.

15. Smjesa prema zahtjevu 14, naznačena time, da je u njoj tvar za stabiliziranje heksamera fenolni konzervans odabran iz skupine koja se sastoji od fenola, m-krezola. o-krezola, p-krezola, klorokrezola, metilparabena, te njihovih smjesa, a prisutna je u omjeru od najmanje 3 mola fenolnog konzervansa u odnosu na 6 mola ukupnog proteina.

16. Smjesa prema zahtjevu 15, naznačena time, da je u njoj protein odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina i analoga inzulina.

17. Smjesa prema zahtjevu 16, naznačena time, da je u njoj protein inzulin.

18. Smjesa prema zahtjevu 17, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein inzulin mono-aciliran na svojoj LysB29-Nε-amino skupini.

19. Smjesa prema zahtjevu 18, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein inzulin aciliran nerazgranatim lancem zasićene masne kiseline.

20. Smjesa prema zahtjevu 19, naznačena time, da je u njoj nerazgranati lanac zasićene masne kiseline odabran iz skupine koja se sastoji od n-heksanske kiseline, n-heptanske kiseline, n-oktanske kiseline, n-nonanske kiseline i n-dekanske kiseline.

21. Smjesa prema zahtjevu 20, naznačena time, da se u njoj omjer molova proteina i derivatiziranog proteina nalazi u području od oko 1 : 9 do oko 9 : 1.

22. Smjesa prema zahtjevu 21, naznačena time, da je u njoj nerazgranati lanac zasićene masne kiseline odabran iz skupine koja se sastoji od n-heksanske kiseline, n-, n-oktanske kiseline, i n-dekanske kiseline.

23. Smjesa prema zahtjevu 22, naznačena time, da je u njoj nerazgranati lanac zasićene masne kiseline odabran iz skupine koja se sastoji od n-oktanske kiseline i n-dekanske kiseline.

24. Smjesa prema zahtjevu 23, naznačena time, da je u njoj nerazgranati lanac zasićene masne kiseline n-oktanska kiselina.

25. Smjesa prema zahtjevu 24, naznačena time, da se u njoj omjer molova proteina i derivatiziranog proteina nalazi u području od oko 1 : 3 do oko 3 : 1.

26. Smjesa prema zahtjevu 22, naznačena time, da se u njoj omjer molova proteina i derivatiziranog proteina nalazi u području od oko 1 : 9 do oko 9 : 1.

27. Smjesa prema zahtjevu 16, naznačena time, da je u njoj protein analog inzulina.

28. Smjesa prema zahtjevu 27, naznačena time, da je u njoj protein analog LysB28, ProB29 humanog inzulina.

29. Smjesa prema zahtjevu 27, naznačena time, da je u njoj protein analog AspB28 humanog inzulina.

30. Smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time, da je u njoj protein inzulin ili analog inzulina, a derivatiziran protein je acilirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od aciliranog inzulina, te aciliranih analoga inzulina.

31. Smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time, da je u njoj derivatiziran protein je inzulin koji je mono-aciliran nerazgranatim lancem masne kiseline na položaju LysB29-Nε-amino skupine.

32. Smjesa prema zahtjevu 31, naznačena time, da je u njoj nerazgranati lanac zasićene masne kiseline odabran iz skupine koja se sastoji od n-heksanske kiseline, n-heptanske kiseline, n-oktanske kiseline, n-nonanske kiseline i n-dekanske kiseline.

33. Smjesa prema zahtjevu 32, naznačena time, da je u njoj derivatiziran protein odabran iz skupine koja se sastoji od B29-Nε-heksanoil humanog inzulina, B29-Nε-oktanoil humanog inzulina, te B29-Nε-dekanoil humanog inzulina.

34. Smjesa prema zahtjevu 31, naznačena time, da je u njoj nerazgranati lanac zasićene masne kiseline odabran iz skupine koja se sastoji od n-dodekanske kiseline, n-tetradekanske kiseline i n-heksadekanske kiseline.

35. Smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time, da je u njoj derivatiziran protein di-aciliran na svojoj LysB29-Nε-amino skupini, kao i također na svojoj N-termalnoj Nα-amino skupini, a u kojoj je masna kiselina odabrana iz skupine koja se sastoji od n-heksanske kiseline, n-heptanske kiseline, n-oktanske kiseline, n-nonanske kiseline i n-dekanske kiseline.

36. Smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein inzulin aciliran razgranatim lancem zasićene masne kiseline.

37. Smjesa prema zahtjevu 36, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein inzulin aciliran razgranatim lancem zasićene masne kiseline koja ima od 3 do 10 C atoma u svom najdužem lancu.

38. Smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein analog inzulina mono-aciliran na svojoj Lys-Nε-amino skupini pomoću nerazgranatog lanca zasićene masne kiseline.

39. Smjesa prema zahtjevu 38, naznačena time, da je u njoj masna kiselina odabran iz skupine koja se sastoji od n-heksanske kiseline, n-heptanske kiseline, n-oktanske kiseline, n-nonanske kiseline i n-dekanske kiseline.

40. Smjesa prema zahtjevu 38, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein analog inzulina mono-aciliran na svojoj Nε-amino skupini pomoću masne kiselinekoja se sastoji iz skupine od n-dodekanske kiseline, n-tetradekanske kiseline i n-heksadekanske kiseline.

41. Smjesa prema zahtjevu 38, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od životinjskih inzulina aciliranih masnom kiselinom, monomernih analoga inzulina aciliranih masnom kiselinom, analoga “deletion” aciliranih masnom kiselinom, te pI pomaknutih analoga aciliranih masnom kiselinom.

42. Smjesa prema zahtjevu 41, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od des(B30) analoga humanog inzulina aciliranog masnom kiselinom, LysB28, ProB29 analoga humanog inzulina aciliranog masnom kiselinom, te AspB28 analoga humanog inzulina aciliranog masnom kiselinom.

43. Smjesa prema zahtjevu 42, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od des(B30) analoga humanog inzulina aciliranog masnom kiselinom.

44. Smjesa prema zahtjevu 43, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein analog B29- Nε-miristoil-des(B30) humanog inzulina.

45. Smjesa prema zahtjevu 42, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein LysB28, ProB29 analog humanog inzulina aciliran masnom kiselinom.

46. Smjesa prema zahtjevu 45, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein B28- Nε-miristoil-LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

47. Smjesa prema zahtjevu 42, naznačena time, da je u njoj derivatizirani protein AspB28 analog humanog inzulina aciliran masnom kiselinom.

48. Smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time, da se u njoj omjer molova proteina i derivatiziranog proteina nalazi u području od oko 1 : 9 do oko 9 : 1.

49. Smjesa prema zahtjevu 48, naznačena time, da se u njoj omjer molova proteina i derivatiziranog proteina nalazi u području od oko 1 : 3 do oko 3 : 1.

50. Smjesa prema zahtjevu 48, naznačena time, da se u njoj omjer molova proteina i derivatiziranog proteina nalazi u području od oko 1 : 9 do oko 1 : 1.

51. Smjesa prema zahtjevu 48, naznačena time, da je u njoj protein inzulin.

52. Smjesa prema zahtjevu 48, naznačena time, da je u njoj protein analog inzulina.

53. Smjesa prema zahtjevu 48, naznačena time, da je u njoj protein monomerni analog inzulina.

54. Pripravak u obliku suspenzije, naznačen time, da uključuje netopljivu fazu i otopinu, pri čemu netopljiva faza uključuje netopljivu smjesu iz zahtjeva 1, a otopina uključuje vodeni medij.

55. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjeva 54, naznačen time, da otopina također uključuje fenolni konzervans čija je koncentracija od oko 0,5 mg po ml do oko 6 mg po ml otopine, farmaceutski prihvatljivi pufer, te sredstvo za izotonizaciju.

56. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjevu 54, naznačen time, da otopina također uključuje inzulin, analog inzulina, derivatizirani inzulin ili analog derivatiziranog inzulina.

57. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjevu 56, naznačen time, da otopina ključuje inzulin.

58. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjevu 56, naznačen time, da otopina ključuje derivatizirani inzulin.

59. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjevu 56, naznačen time, da otopina uključuje analog inzulina.

60. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjevu 56, naznačen time, da je analog inzulina monomerni analog inzulina.

61. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjevu 56, naznačen time, da je analog inzulina LysB28, ProB29 analog humanog inzulina.

62. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjevu 56, naznačen time, da je analog inzulina AspB28 analog humanog inzulina.

63. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjevu 54, naznačen time, da otopina također uključuje protein koji je odabran iz skupine koja sadržava inzulin i analog inzulina, te derivatizirani protein koji je odabran iz skupine koja sadržava derivatizirani inzulin i analog derivatiziranog inzulina.

64. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjevu 63, naznačen time, da je protein u otopini onaj isti protein koji se nalazi i u netopljivoj fazi, te u kojem je derivatizirani protein u otopini onaj isti derivatizirani protein koji se nalazi i u netopljivoj fazi.

65. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjevu 54, naznačen time, da se njegova netopljiva faza u svojoj suštini sastoji od amorfnog taloga.

66. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjevu 54, naznačen time, da se njegova netopljiva faza u svojoj suštini sastoji od mikrokristala.

67. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjevu 54, naznačen time, da se njegova netopljiva faza sastoji od smjese amorfnog taloga i mikrokristala.

68. Pripravak u obliku suspenzije prema zahtjevu 54, naznačen time, da njegova netopljiva faza također uključuje cink i protamin, pri čemu se omjer cinka i ukupnog proteina u pripravcima u obliki suspenzije kreće u području od oko 5 do oko 7 mola cinkovih atoma po molu ukupnog proteina, a omjer protamina i ukupnog proteina u pripravcima u obliki suspenzije kreće u području od oko 0,25 do oko 0,5 mola po molu ukupnog proteina.

69. Način liječenja dijabetesa, naznačen time, da uključuje primjenu smjese prema zahtjevu 1 na pacijentima kojima je to potrebno u količini koja je dovoljna za regulaciju razine glukoze u krvi.

70. Način liječenja hiperglikemije, naznačen time, da uključuje primjenu smjese prema zahtjevu 54 na pacijentima kojima je to potrebno u količini koja je dovoljna za regulaciju razine glukoze u krvi.

71. Hibridna smjesa heksamera, naznačena time, da uključuje šest monomera i cink, u kojoj je barem jedan monomer odabran iz skupine koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, te proinzulina; te u kojoj je barem jedan monomer odabran iz skupine koja se sastoji od derivatiziranog inzulina, analoga derivatiziranog inzulina, te derivatiziranih proinzulina.

72. Smjesa heksamera, naznačena time, da uključuje heksamere cinka i proteina te heksamere cinka i derivatiziranog proteina, pri čemu heksameri cinka i proteina uključuju cink i protein odabran iz grupe koja se sastoji od inzulina, analoga inzulina, te proinzulina; te pri čemu heksameri cinka i derivatiziranog proteina uključuju cink i derivatizirani protein odabran iz skupine koja se sastoji od derivatiziranog inzulina, analoga derivatiziranog inzulina, te derivatiziranih proinzulina.

73. Postupak priprave netopljive smjese prema zahtjevu 1, naznačen time, da uključuje: a) otapanje proteina, derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da dozvoljava nastajanje heksamera, te b) dodavanje kompleksirajuće tvari.

74. Postupak priprave netopljive smjese prema zahtjevu 1, naznačen time, da uključuje: a) otapanje proteina, derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da ne dozvoljava nastajanje heksamera, te b) podešavanje pH tako da se nalazi u području od 6,8 do 7,8 i c) dodavanje kompleksirajuće tvari.

75. Postupak priprave netopljive smjese prema zahtjevu 1, naznačen time, da uključuje: a) otapanje proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da dozvoljava nastajanje heksamera, b) odvojeno otapanje derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da dozvoljava nastajanje heksamera, te c) miješanje otopina pripravljenih u stupnjevima a) i b), d) dodavanje kompleksirajuće tvari otopini pripravljenoj u stupnju c).

76. Postupak priprave netopljive smjese prema zahtjevu 1, naznačen time, da uključuje: a) otapanje proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da ne dozvoljava nastajanje taloga, b) odvojeno otapanje derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da ne dozvoljava nastajanje taloga, c) miješanje otopina pripravljenih u stupnjevima a) i b), d) podešavanje pH otopine pripravljene u stupnju c) tako da dođe do procesa taloženje.

77. Postupak priprave netopljive smjese prema zahtjevu 1, naznačen time, da uključuje: a) otapanje proteina, derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da ne dozvoljava nastajanje taloga, te b) podešavanje pH otopine pripravljene u stupnju a) tako da dođe do procesa taloženje.

78. Postupak priprave netopljive smjese prema zahtjevu 1, naznačen timea, da uključuje: a) otapanje proteina, derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da ne dozvoljava nastajanje taloga, te b) dodavanje kompleksirajuće tvari, te c) podešavanje pH otopine pripravljene u stupnju b) tako da dođe do procesa taloženje.

79. Postupak priprave netopljive smjese prema zahtjevu 1, naznačen time, da uključuje: a) otapanje proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da ne dozvoljava nastajanje taloga, b) odvojeno otapanje derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da ne dozvoljava nastajanje taloga, c) miješanje otopina pripravljenih u stupnjevima a) i b), d) dodavanje kompleksirajuće tvari otopini iz stupnja c), te e) podešavanje pH otopine pripravljene u stupnju d) tako da dođe do procesa taloženje.

80. Postupak priprave netopljive smjese prema zahtjevu 1, naznačen time, da uključuje: a) otapanje proteina, derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da ne dozvoljava nastajanje taloga prilikom dodavanje kompleksirajuće tvari, b) podešavanje vrijednosti pH otopine pripravljene u stupnju a) tako da dođe do procesa taloženje prilikom dodavanje kompleksirajuće tvari, te c) dodavanje kompleksirajuće tvari otopini iz stupnja b).

81. Postupak priprave netopljive smjese prema zahtjevu 1, naznačen time, da uključuje: a) otapanje proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da ne dozvoljava nastajanje taloga prilikom dodavanje kompleksirajuće tvari, b) otapanje derivatiziranog proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da ne dozvoljava nastajanje taloga prilikom dodavanje kompleksirajuće tvari, c) miješanje otopina pripravljenih u stupnjevima a) i b), d) podešavanje vrijednosti pH otopine pripravljene u stupnju c) tako da dođe do procesa taloženje prilikom dodavanje kompleksirajuće tvari, te e) dodavanje kompleksirajuće tvari otopini iz stupnja d).

82. Postupak za dobivanje hibridnih heksamera, naznačen time, da sadrži otapajući protein, derivatizirani protein, spoj za stabilizaciju heksamera i divalentni metalni kation u otapalu koje je miješano vodom i koje posjeduje pH koji dozvoljava formiranje heksamera.

83. Postupak priprave hibridnih heksamera, naznačen time, da uključuje: a) otapanje proteina, tvari za stabiliziranje heksamera, te dvovalentnog kationa metala u vodenom mediju čiji je pH podešen tako da ne dozvoljava nastajanje taloga prilikom dodavanje kompleksirajuće tvari, b) podešavanje pH tako da se nalazi u području od 6,8 do 7,8.