CN102088997A - 用于治疗糖尿病和其他慢性疾病的组合物 - Google Patents

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萨里卡·古普塔
马亨德拉·帕尔·辛格
唐德里卡·查托帕迪艾
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Indian Institute of Science IISC
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Abstract

本发明提供了一种用作蛋白质治疗剂的超分子蛋白质组装体，其可用于治疗代谢障碍，特别是糖尿病。本发明中公开的超分子蛋白质组装体由不溶性和聚集的蛋白质低聚体组成。本发明还提供了包含超分子蛋白质组装体的药物组合物。本发明中公开的组合物尤其包含超分子胰岛素组装体。

Description

用于治疗糖尿病和其他慢性疾病的组合物
技术领域
本发明涉及用于治疗糖尿病和其他慢性疾病的蛋白质治疗剂。
背景技术
对于供糖尿病、癌症、心血管疾病、肾病、胃肠道疾病、风湿病和神经疾病患者使用的治疗剂，在许多其他治疗剂当中，蛋白质药物是发展最为迅速的一类。包括胰岛素、红细胞生成素、G-CSF、纤溶酶原激活物和干扰素在内的蛋白质作为治疗剂的治疗价值和商业价值是毋庸置疑的。改进的蛋白质或其制剂通过增强其效力、作用时间和其他特性增强了这些父代产品的治疗效能。
糖尿病是一种慢性疾病，其特征是身体不能产生胰岛素(I型)或未能对胰岛素作出响应(II型)(http://www.who.int/diabetes/en，King，H.，Aubert，R.E.& Herman，W.H.Global burden of diabetes，1995-2025：Prevalence，numerical estimates，and projections.Diabetes Care 21，1414-1431(1998))。I型和II型糖尿病都是新兴的全球流行病。2005年有接近110万糖尿病患者死亡(Dunstan，D.W.，Zimmet，P.Z.，Welborn，T.A.，De Courten，M.P.，Cameron A.J.，等人，The rising prevalence of diabetes and impaired glucose tolerance：The Australian Diabetes，Obesity and Lifestyle Study.Diabetes Care 25，829-834(2002))。其经济后果甚至更惊人，因为人们可能伴随糖尿病生活多年，他们的死亡原因通常被确定为心脏病和肾衰竭，二者都是由糖尿病的继发后果引起的。通过从外界施用胰岛素恢复正常代谢环境，从而使继发并发症的风险减到最小已经成为糖尿病治疗的基本特征。当前的治疗涉及胰岛素的每日多次皮下(SC)/肌内(IM)注射，这对患者的依从性(遵医嘱性)造成了沉重的负担。这又导致供替换的侵入性较小的递送途径。迄今为止，开发经鼻、口服、经肠胃和经皮途径的尝试大多不成功。对于I型糖尿病，虽然利用每日两次胰岛素注射的传统胰岛素方案有效地控制了餐后血糖水平，但是由于这种治疗未能控制空腹高血糖。因此其价值有限(Cardona，K.，Korbutt，G.S.，Milas，Z.，Lyon，J.，Cano，J.，Jiang，W.，Bello-Labom，H.，Hacquoil B，Strobert E，Gangappa S，Weber CJ，Pearson TC，Rajotte RV，Larsen CP.Long-term survival of neonatal porcine islets in nonhuman primates by targeting costimulation pathways.Nat Med.Mar；12(3)，304-6(2006))。糖尿病患者需要每天一次或两次的胰岛素治疗从而增加体内的胰岛素供应。并通过在每餐前定期注射胰岛素，维持餐后血糖的体内稳态。强化胰岛素治疗可延迟继发并发症的发病和/或减慢它的发展，但患者仍处于空腹低血糖的高风险中。以受控方式在较长的时间内释放胰岛素的胰岛素制剂使得无需对患者每日多次给药。本发明提供了用于治疗I型和II型糖尿病的胰岛素延长释放的组合物。
发明内容
本发明公开了用于治疗糖尿病和其他慢性疾病的蛋白质治疗剂。本发明特别地公开了超分子蛋白质组装体，其中该超分子蛋白质组装体包含不溶性的和聚集的蛋白质低聚体形式的蛋白质，这种蛋白质例如是胰岛素、胰高血糖素、降钙素、肽GNNQQNY、转甲状腺素蛋白(TTR)、人生长激素、凝血因子、白蛋白、人促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺素(HCG)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)、醋酸艾塞那肽-4(毒蜥外泌肽-4，艾塞那肽-4，extendin-4)和红细胞生成素。本发明还公开了包含超分子蛋白质组装体的药物组合物。
本发明公开的超分子蛋白质组装体和组合物可用于治疗需要利用肽、蛋白质或小的药物分子进行持续和长期治疗的代谢障碍，特别是糖尿病，和其他慢性和炎性疾病如风湿性关节炎、骨质疏松症、慢性炎性疼痛和末梢性疼痛(peripheral pain)、脓毒症、和过敏症。
本发明的一个方面提供了作为蛋白质治疗剂的超分子蛋白质或肽组装体(SPA)，其用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍；或选自由骨质疏松症、关节炎、癌症、内毒素性休克组成的组中的慢性疾病，其中该组装体包含不溶性的和聚集的蛋白质或肽低聚体形式。
本发明的另一方面提供了作为蛋白质治疗剂的超分子胰岛素组装体(SIA)，其用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍，其中该组装体包含不溶性的和聚集的胰岛素低聚体形式。
本发明的另一方面提供了用于治疗骨质疏松症的作为蛋白质治疗剂的超分子降钙素组装体(SCA)，其中该组装体包含不溶性的和聚集的降钙素低聚体形式。
本发明的另一方面提供了用于治疗关节炎的作为蛋白质治疗剂的超分子布洛芬组装体(SIbA)，其中该组装体包含肽标记的布洛芬的不溶性的和聚集的形式。
本发明的又一方面提供了用于治疗糖尿病的作为蛋白质治疗剂的超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)，其中该组装体包含不溶性的和聚集的醋酸艾塞那肽-4(extendin-4)的低聚体形式。
本发明进一步提供了一种作为蛋白质治疗剂的药物组合物，其用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍，或选自由骨质疏松症、关节炎、癌症、内毒素性休克组成的组中的慢性疾病，其中该组合物包含治疗有效量的本发明公开的超分子蛋白质或肽组装体(SPA)。
本发明还提供了一种用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的超分子胰岛素组装体(SIA)。
本发明还提供了一种用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的本发明的超分子胰岛素组装体(SIA)和超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)。
在另一方面，本发明提供了一种用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的本发明的超分子胰岛素组装体(SIA)和超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)。
在本发明的另一方面，提供了一种用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的本发明中公开的超分子胰岛素组装体(SIA)和超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)。
本发明还提供了用于治疗骨质疏松症的药物组合物，该组合物包含本发明的超分子降钙素组装体(SCA)。
在又一方面，本发明提供了一种用于治疗关节炎和关节炎疼痛的药物组合物，该组合物包含本发明中公开的超分子布洛芬组装体(SIbA)。
本发明的其他方面提供了一种制备本发明中公开的超分子胰岛素组装体(SIA)的方法，该方法包含：在约25℃至60℃的温度下将胰岛素溶解在pH范围为1.5至7.8的溶液中；以及在不断搅拌的情况下温育上述溶液6-48小时从而获得超分子胰岛素组装体(SIA)，其中SIA包含不溶性的和聚集的胰岛素低聚体形式。
本发明的又一方面提供了制备本发明中公开的超分子降钙素组装体(SCA)的方法，该方法包含在约25℃至60℃的温度下将降钙素溶解在pH范围约为4.0至8.0的溶液中；以及在不断搅拌的情况下温育上述溶液6-48小时从而获得超分子降钙素组装体(SCA)，其中SCA包含不溶性的和聚集的降钙素低聚体形式。
本发明中还公开了制备超分子布洛芬标记的肽组装体(SIbA)的方法，该方法包含：在约25至60℃的温度下将布洛芬-肽溶解在pH范围约为3.5至7.6的溶液中；以及在不断搅拌的情况下温育上述溶液6-48小时从而获得超分子布洛芬组装体(SIbA)，其中SIbA包含肽标记布洛芬的不溶性和聚集的低聚体形式。
本发明还提供了制备如本发明中公开的超分子醋酸艾塞那肽组装体的方法，该方法包含：在约25至60℃的温度下将醋酸艾塞那肽4溶解在pH范围约为2.0至7.6的溶液中；以及在不断搅拌的情况下温育上述溶液6-192小时从而获得超分子醋酸艾塞那肽组装体(SEA)，其中SEA包含醋酸艾塞那肽-4的不溶性和聚集的低聚体形式。
此外，本发明提供了一种用于治疗选自由1型和2型糖尿病组成的组中的代谢障碍，或选自由骨质疏松症、关节炎、癌症、内毒素性休克组成的组的慢性疾病的方法，其中该方法包含向需要其的受试者(受治疗者，对象)给予治疗有效量的、可用于有效缓解该障碍或疾病的药物组合物。
本发明还提供了一种用于治疗选自由1型和2型糖尿病组成的组中的代谢障碍的方法，其中该方法包含向需要其的受试者(受治疗者，对象)给予治疗有效量的包含超分子胰岛素组装体的药物组合物。
本发明的一个方面在于提供一种用于治疗骨质疏松症的方法，其中该方法包含向需要其的受试者(受治疗者，对象)给予治疗有效量的用于治疗骨质疏松症的药物组合物，该药物组合物包含超分子降钙素组装体。
本发明的另一方面提供了一种用于治疗关节炎疼痛的方法，其中该方法包含向需要其的受试者(受治疗者，对象)给予治疗有效量的、可有效缓解该疾病的药物组合物，该药物组合物包含超分子布洛芬组装体。
本发明的又一方面提供了超分子蛋白质组装体用于治疗选自由1型和2型糖尿病组成的组中的代谢障碍或选自由骨质疏松症、关节炎、癌症和内毒素性休克组成的组中的慢性疾病的用途。
附图说明
图1示出了在pH 2.0和7.0下原纤维结构的动力学曲线，其是利用重组人(rH)胰岛素和牛胰岛素的50μM Th-T荧光来监测的。
图2
(a)示出了来自牛胰岛素和rH胰岛素的超分子胰岛素组装体II(也被称为淀粉样蛋白前体(pre-amyloid)胰岛素II中间体)的胰岛素的体外释放，其是通过在280nm处的吸光度和内在酪氨酸荧光来监测的。还给出了在0小时和15天透析膜内溶液的Th-T强度。
(b)示出了牛胰岛素的各种超分子胰岛素组装体中间体的体外单体释放动力学曲线。
(c)示出了rH-胰岛素的各种超分子胰岛素组装体中间体的体外单体释放动力学曲线。
(d)示出了在恒定的1ml PBS溶液内监测的在pH 7.0下形成的SIAII(可替代的淀粉样蛋白前体)的体外释放动力学曲线。
图3示出了天然胰岛素、超分子胰岛素组装体II(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素II)、超分子胰岛素组装体III(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素III)和胰岛素淀粉样蛋白(牛和人)的刚果红结合(Congo-Red binding)研究。
图4示出了重组人胰岛素和牛胰岛素的傅立叶变换红外(FTIR)光谱特征。
图5示出了通过原子力显微镜(AFM)研究的超分子胰岛素组装体(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素)中间体和胰岛素原纤维的形态：
(a)胰岛素单体
(b)超分子胰岛素组装体I(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素I)中间体，pH 7.0的牛胰岛素，
(c)超分子胰岛素组装体II(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素II)，pH 7.0的牛胰岛素，
(d)超分子胰岛素组装体中间体III(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素III)，pH 7.0的牛胰岛素，
(e)超分子胰岛素组装体-I，pH 7.0的rH-胰岛素，
(f)超分子胰岛素组装体-II，pH 7.0的rH-胰岛素，
(g)超分子胰岛素组装体-III，pH 7.0的rH-胰岛素，
(h)在pH 7.0下完全形成的原纤维，(i)示出了在6小时，pH 2.0，在37℃下形成的超分子胰岛素组装体(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素)中间体，
(j)在pH 2.0下形成的淀粉样蛋白原纤维。
图6示出了胰岛素原纤维和超分子胰岛素组装体形成期间的中间体的负染TEM显微照片
(a)超分子胰岛素组装体I(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素I)，pH 7.0，
(b)超分子胰岛素组装体II(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素II)，pH 7.0，
(c)超分子胰岛素组装体III(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素III)，pH 7.0，
(d)在pH 7.0下的成熟纤维
(e)在pH 2.0，37℃下形成的纤维。
图7示出了葡萄糖体内稳态中超分子胰岛素组装体(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素)的体内效能。
(a)响应于皮下和肌内给药的各种剂量的超分子胰岛素组装体-II(牛)的血糖水平。
(b)响应于皮下和肌内给药的各种剂量的超分子胰岛素组装体-II(重组人)的血糖水平。
图8示出了在给予牛SIA-II后135天的时间段内监测的餐后血糖水平
(a)牛胰岛素
(b)rH胰岛素。
图9示出了在给予人SIA-II后160天的时间段内监测的餐前血糖水平
(a)牛胰岛素
(b)rH胰岛素。
图10示出了给予在pH 2.0和pH 7.0下形成的胰岛素淀粉样蛋白后监测的血糖水平。
图11示出了SIA-II处理的糖尿病大鼠、糖尿病对照大鼠和非糖尿病对照大鼠的体重曲线。
图12示出了腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)期间的血糖曲线。
图13示出了
(a)在STZ处理的大鼠中利用固态ELISA进行的响应于SC或IM注射的超分子胰岛素组装体(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素)的由相应SIA-II释放的血清rH和牛胰岛素的量化。
(b)在IPGTT实验期间血清牛胰岛素的量化。
(c)对IPGTT实施的血清大鼠胰岛素ELISA，从而确定响应于输注葡萄糖的内源胰岛素水平。
图14示出了对STZ糖尿病大鼠进行的125I标记的胰岛素SIAII处理
(a)在长达25天的时间内用100μg标记的超分子胰岛素组装体处理的动物血清中的CPM/ml曲线。在插图中给出了24h的曲线。
(b)36天内的血糖(mg/dL)和体内释放的牛胰岛素(ng/ml)曲线。在插图中示出了24h的曲线。
图15示出用标记的SIAII处理的动物的血清的Tricine-SDS-PAGE。考马斯染色(左侧)和在皮下(上图)或肌内(中图)处理之后1-28天的血清磷光体图像(除左侧图之外的其余部分)。下图示出由SIA II在体外释放的单体。
图16示出了在用超分子胰岛素组装II处理之后的高血糖测试研究。GIR-葡萄糖输注速率(mg/kg/min)
图17示出了用于胰岛素信号级联的培养的脂细胞的蛋白质印迹(WB)分析。该脂细胞用如指出的(a)PBS、胰岛素、SIA-II、SIA释放的胰岛素处理，(b)血清，并用于胰岛素信号分析。
图18分别示出了用STZ引起的雄性Wistar大鼠的糖尿病并用超分子胰岛素组装体II(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素II)进行皮下处理，并利用刚果红检查残留超分子胰岛素组装体的存在以及炎症的发生。
(a)皮下刚果红染色的部分(i-v)、刚果红双折射(vi-x)、H&E染色的部分(xi-xv)，和免疫染色的部分(xvi-xx)，时间为第1周至第12周。
(b)用刚果红染色的肌内部分(i-v)、刚果红双折射(vi-x)、H&E染色的部分(xi-xv)，和免疫染色的部分(xvi-xx)，时间为第1周至第12周。
图19示出了
(a)来自大肠杆菌的LPS作为炎性细胞渗透的阳性对照注射到皮下和肌肉组织中。SC免疫染色的部分(i)和IM免疫染色的部分(ii)，以及SC H&E染色的部分(iii)和IM H&E染色的部分(iv)。
(b)利用刚果红染色的部分(i-iv)和刚果红双折射(v-viii)监测在pH 2.0，SC注射下形成的胰岛素淀粉样蛋白纤维，持续1、4、8和12周。
图20示出了用rH-胰岛素SIA-II处理的利用四氧嘧啶引起糖尿病的大鼠的血糖曲线。
(a)空腹
(b)非空腹血
(c)按照制造商方案利用固态ELISA量化血清中的人胰岛素。
图21示出了在以下大鼠中监测白内障的形成
(a)STZ-处理的大鼠
(b)对照大鼠
(c)胰岛素处理的大鼠
(d)超分子胰岛素组装体处理的大鼠
图22示出了切除心脏、肾脏和肝脏组织并通过用CR染色检查淀粉样蛋白沉积。并利用H&E染色评估细胞形态。心脏、肾脏和肝脏的双折射(i-iii)、刚果红染色的部分(iv-vi)、H&E染色的心、肾脏和肝脏(vii-ix)。
图23示出了用SIA-II处理之后大鼠胰岛素降解酶(IDE)的检测。
图24示出了用SIA-II处理的大鼠血清中的抗胰岛素抗体的筛选。
图25示出了细胞增殖的MTT测定：通过给予pH 7.4的PBS、人/牛胰岛素(20nM)、SIA II(人/牛胰岛素)、SIA II释放的胰岛素单体(20nM)、胰岛素样生长因子I(IGF-I)(6ng/ml)测定MCF 7细胞的生长动力学曲线。
图26示出了响应于皮下和肌内给予各种剂量的超分子胰岛素组装体的利用STZ引起糖尿病的小鼠的血糖水平。(a)皮下注射指示剂量的人SIA-II、(b)肌内注射指示剂量的人SIA-II和(c)皮下注射指示剂量的牛SIA-II。
图27示出了响应于皮下给予超分子胰岛素组装体的利用STZ引起糖尿病的家兔的血糖水平。
图28示出了给予图中指出的各种处理的II型糖尿病大鼠在35天内的血糖曲线。
图29示出了在停滞(stagnant)状态下在37℃下PBS中的降钙素原纤维形成动力学曲线。原纤维形成通过测量400nm处的浊度来监测。
图30示出了在1ml恒定体积下和通过对2％甘露醇(5ml)中的膜透析的SCA-II释放的降钙素的体外释放曲线。该释放是通过275nm处的吸光度来观察的。
图31示出了由不同处理组的切除卵巢的大鼠的血清中SCA-II释放的降钙素曲线。血清中的降钙素通过免疫测定试剂盒来测量。
图32示出了
(a)关节炎疼痛的热板试验。利用高岭土/角叉菜胶诱发雄性Wistar大鼠关节炎。半小时之后，分别对该大鼠给予如图中指出的药物剂量。在处理后1小时，在55℃下将大鼠放置在痛觉测量器(analgesiometer)上。借助停表确定它们舔爪子的潜伏期(latency)。结果表示为同一天完成的三组独立实验的平均值±S.E.M(n＝5)。
(b)评价关节炎疼痛用的热板试验。利用高岭土/角叉菜胶诱发雄性Wistar大鼠关节炎。30分钟之后，分别对该大鼠给予如图中指出的药物剂量。每日对其口服给予布洛芬，并在一小时后在55℃下将其放置在痛觉测量器上。结果表示为同一天完成的三组独立实验的平均值±S.E.M(n＝5)。
图33示出了通过用超分子布洛芬-TTR组装体处理的角叉菜胶诱发的大鼠爪子水肿的抑制。该水肿表示为接受注射的爪子体积(ml)相比其基础体积的增加。结果表示为同一天完成的三组独立实验的平均值±S.E.M(n＝5)。
具体实施方式
本发明提供了用于治疗糖尿病和其他慢性疾病/障碍的蛋白质治疗剂。本发明特别提供了超分子蛋白质或肽组装体(SPA)，其中该超分子蛋白质或肽组装体(SPA)包含蛋白质的不溶性和聚集的低聚体形式，其中该蛋白质选自由以下物质组成的组，即，胰岛素、胰高血糖素、降钙素、GNNQQNY、转甲状腺素蛋白(TTR)、人生长激素、凝血因子、白蛋白、人促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺素(HCG)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)、醋酸艾塞那肽-4和红细胞生成素。本发明还提供了包含超分子蛋白质组装体的药物组合物。
本发明中公开的超分子蛋白质或肽组装体(SPA)和药物组合物用于治疗代谢障碍，特别是糖尿病、和其他慢性和炎性疾病，如风湿性关节炎、骨质疏松症、慢性炎性和末梢性疼痛、脓毒症和过敏症，其中需要利用肽、蛋白质或小药物分子进行持续和长期治疗。
本发明还提供了治疗II型糖尿病和一些慢性病如关节炎疼痛以及急性症状例如外伤造成的疼痛的适用性(feasibility)。在关节炎疼痛的情况下，对肽进行标记的药物分子如GNNQQNY形成稳定的低聚体，这将导致缓解此种受试者疼痛的抗关节炎药物缓慢和持续释放。本发明的方法也可以扩展到利用降钙素治疗骨质疏松症，其中降钙素是一种治疗用肽激素。
术语“超分子蛋白质组装体”也指在原纤维形成过程中形成的蛋白质的中间体形式，其特征是肽/蛋白质单体的寡聚缔合体(oligomeric association)。
本文使用的术语“超分子胰岛素组装体”或“SIA”是指超分子胰岛素组装体I、II和III，它们是胰岛素的不溶性和聚集的低聚体形式。
本文使用的术语“SIA I”是指第I阶段中的“超分子胰岛素组装体”，其中“SIAI”包含胰岛素的不溶性和聚集的低聚体形式，其中该低聚体由呈珠状排列的胰岛素单体伸长簇组成。
本文使用的术语“SIA II”是指第II阶段中的“超分子胰岛素组装体”，其中“SIA II”包含不溶性的和聚集的胰岛素低聚体形式，其中该胰岛素低聚体布置为呈珠状排列的胰岛素单体伸长簇的线性缔合体。
本文使用的术语“SIA III”是指第III阶段中的“超分子胰岛素组装体”，其中“SIA III”由密集的胰岛素低聚体形式的线性缔合体组成。
阶段III中的SIA，即，SIA II由约90％的SIA-II组成。
本文使用的术语“超分子布洛芬组装体”或“SIbA”是指超分子布洛芬组装体，其是与止痛药布洛芬共价连接(标记)的肽GNNQQNY、NFLVH、DFNKF、NFGAIL和KFFE的不溶性和聚集的形式。
本文使用的术语“超分子降钙素组装体”或“SCA”是指超分子降钙素组装体，其是降钙素的不溶性和聚集的低聚体形式。
根据本发明，一种实施方式提供了用作蛋白质治疗剂的超分子蛋白质或肽组装体(SPA)，其用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍；或选自由骨质疏松症、关节炎、癌症、内毒素性休克组成的组中的慢性疾病，其中该组装体包含所述蛋白质或肽的不溶性和聚集的低聚体形式。
本发明另一种实施方式提供了用于制备本发明中公开的超分子蛋白质组装体的蛋白质或肽，其中该蛋白质选自由以下物质组成的组，即，胰岛素、胰高血糖素、降钙素、转甲状腺素蛋白(TTR)、人生长激素、凝血因子、白蛋白、人促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺素(HCG)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)、醋酸艾塞那肽-4和红细胞生成素，或者使用肽GNNQQNY。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种用作蛋白质治疗剂的超分子胰岛素组装体(SIA)，其用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍，其中该组装体包含胰岛素的不溶性和聚集的低聚体形式。
在又一种实施方式中，本发明提供了超分子胰岛素组装体(SIA)，其包含不溶性的和聚集的如SIA I、SIA II、SIA III阶段或它们的组合的胰岛素低聚体形式，其中SIA I由呈珠状安排的胰岛素单体的伸长簇组成，SIA II由珠状排列的胰岛素单体的伸长簇的线性缔合体组成，并且SIA III由约90％的SIAII组成，SIAIII是胰岛素低聚体的密集的线性缔合体。
在其他的实施方式中，提供了如本发明中公开的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中该组装体包含不溶性的和聚集的SIAII阶段的胰岛素低聚体形式，其中SIAII阶段由呈珠状排列的胰岛素单体伸长簇的线性缔合体组成。
在另外的实施方式中，提供了如本发明中公开的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中该组装体在傅里叶变换红外光谱(FTIR)中的1647-1645cm-1处出现尖形峰。
在一种实施方式中，本发明提供了超分子胰岛素组装体(SIA)，其中该胰岛素是重组人胰岛素。
在另一种实施方式中，本发明提供了超分子胰岛素组装体(SIA)，其中该胰岛素是人、牛或猪胰岛素。
本发明的一种实施方式提供了超分子胰岛素组装体(SIA)，其中该组装体以每小时约0.2IU至0.6的速率体外释放胰岛素单体。
本发明的另一种实施方式提供了超分子胰岛素组装体(SIA)，其中胰岛素的释放速率范围为0.1ng/ml至5.4ng/ml，持续约7至180天。
本发明的又一种实施方式提供了超分子胰岛素组装体(SIA)，其中胰岛素的释放速率范围为0.5ng/ml-1.5ng/ml，持续长达180天。
本发明的另一种实施方式提供了超分子胰岛素组装体(SIA)，其中在向对其有需要的受试者中给予该组装体后维持接近血糖正常水平(120±30mg/dl)长达180天。
在本发明的一种实施方式中，提供了超分子胰岛素组装体(SIA)，其中在向对其有需要的受试者给予单剂量的该组装体后维持接近血糖正常水平(120±30mg/dl)4-180天，其中该剂量中该组装体的浓度范围为25至750μg。
在本发明的另一种实施方式中，提供了超分子胰岛素组装体(SIA)，其中在向对其有需要的受试者给予单剂量的该组装体后维持接近血糖正常水平(120±30mg/dl)至少长达180天，其中该剂量中该组装体的浓度范围为150至250μg。
在本发明的又一种实施方式中，提供了超分子胰岛素组装体(SIA)，其中该组装体在给药后释放胰岛素单体。
本发明还提供了用于治疗骨质疏松症的用作蛋白质治疗剂的超分子降钙素组装体(SCA)，其中所述组装体包含降钙素的不溶性和聚集的低聚体形式。
本发明中公开的超分子降钙素组装体(SCA)在对其有需要的受试者中给药后持续约55-60天释放降钙素。
本发明进一步地提供了超分子蛋白质组装体，其中组装体中的肽与小分子药物结合(couple)。
本发明还提供了用作蛋白质治疗剂的用于治疗关节炎的超分子布洛芬组装体(SIbA)，其中该组装体包含肽标记的布洛芬的不溶性和聚集的形式。
本发明的一种实施方式涉及用肽标记的超分子布洛芬组装体(SIbA)，其中该肽选自由GNNQQNY、NFGAIL、NFLVH、DFNKF和KFFE组成的组。
本发明还提供了用作蛋白质治疗剂的用于治疗糖尿病的超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)，其中该组装体包含不溶性的和聚集的醋酸艾塞那肽-4的低聚体形式。
本发明的一种实施方式提供了起到前药作用的本发明中公开的超分子蛋白质组装体。
本发明的另一种实施方式提供了起到前药作用的本发明中公开的超分子蛋白质组装体，其中该组装体选自由超分子胰岛素组装体(SIA)、超分子降钙素组装体(SCA)、超分子布洛芬组装体(SIbA)和超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)组成的组。
在本发明的一种实施方式中，提供了非细胞毒性超分子蛋白质组装体。
在本发明的另一种实施方式中，提供了非细胞毒性超分子蛋白质组装体，其中该组装体选自由超分子胰岛素组装体(SIA)、超分子降钙素组装体(SCA)、超分子布洛芬组装体(SIbA)和超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)组成的组。
根据本发明，一种实施方式提供了用作蛋白质治疗剂的药物组合物，其用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组的代谢障碍，或选自由骨质疏松症、关节炎、癌症、内毒素性休克组成的组的慢性疾病，其中该组合物包含治疗有效量的本发明中公开的超分子蛋白质或肽组装体(SPA)。
一种实施方式涉及包含本发明的超分子蛋白质或肽组装体(SPA)的药物组合物，其中该蛋白质或肽选自由以下物质组成的组：胰岛素、胰高血糖素、降钙素、转甲状腺素蛋白(TTR)、人生长激素、凝血因子、白蛋白、人促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺素(HCG)、IL-1RA、醋酸艾塞那肽-4、红细胞生成素、GNNQQNY和其他肽。
本发明进一步提供了一种用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组的代谢障碍的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的本发明的超分子胰岛素组装体(SIA)。
另外，在一种实施方式中，本发明提供了一种用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组的代谢障碍的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中该组装体包含不溶性的和聚集的SIAI、SIAII、SIAIII阶段或它们的组合中的胰岛素低聚体形式，其中SIA I由呈珠状排列的胰岛素单体伸长簇组成，SIA II由呈珠状排列的胰岛素单体伸长簇的线性缔合体组成，并且SIA III由约90％的SIA II组成，SIAIII是致密的线性缔合体的胰岛素低聚体。
在另一种实施方式中，本发明提供了超分子胰岛素组装体(SIA)，其中该组装体包含不溶性的和聚集的SIA II胰岛素的低聚体形式，其中SIAII由呈珠状排列的胰岛素单体伸长簇的线性缔合体组成。
在本发明的另一种实施方式中，提供了一种用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组的代谢障碍药物组合物，该组合物包含治疗有效量的如本发明中公开的超分子胰岛素组装体(SIA)和/或超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)。
在另外的实施方式中，提供了一种用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组的代谢障碍的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中该组装体包含不溶性的和聚集的SIAI、SIAII、SIAIII阶段或它们的组合的胰岛素低聚体形式，其中SIAI由呈珠状排列的胰岛素单体伸长簇组成，SIA II由呈珠状排列的胰岛素单体伸长簇的线性缔合体组成，且SIA III由约90％的SIA II组成，SIA III是胰岛素低聚体和如本发明中公开的超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)的致密的线性缔合体。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组的代谢障碍的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中该组装体包含不溶性的和聚集的SIAII中胰岛素的低聚形式，其中SIAII由呈珠状排列的胰岛素单体和本发明中公开的超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)伸长簇的线性缔合体组成。
本发明的一种实施方式提供了包含本发明的超分子胰岛素组装体的药物组合物，其中在给予该组合物后持续释放胰岛素约7天至180天。
在另一种实施方式中，本发明提供了包含如所附权利要求中任一项中所述的超分子胰岛素组装体的药物组合物，其中在向对其有需要的受试者给予所述组合物后维持接近血糖正常水平(120±30mg/dl)约180天。
在本发明的又一种实施方式中，提供了包含本发明中公开的超分子胰岛素的药物组合物，其中在向对其有需要的受试者给予单剂量的所述组合物后维持接近血糖正常水平(120±30mg/dl)约4-180天，所述组合物中的所述组装体的浓度范围为25至750μg。
其他的实施例提供了包含本发明的超分子胰岛素组装体的药物组合物，其中在向对其有需要的受试者给予单剂量的所述组合物后维持接近血糖正常水平(120±30mg/dl)约180天，所述组合物中的所述组装体的浓度范围为150至250μg。
在这种实施方式中，该药物组合物包含本发明超分子胰岛素组装体，其中胰岛素释放速率范围为0.5-1.5ng/ml，持续至少长达180天。
在另一种实施方式中，提供了治疗骨质疏松症的药物组合物，该组合物包含如本发明中公开的超分子降钙素组装体(SCA)。
在另一种实施方式中，本发明提供了包含如本发明中公开的超分子降钙素组装体(SCA)的药物组合物，其中所述组合物释放降钙素。
在另一种实施方式中，本发明提供了包含如本发明中公开的超分子降钙素组装体(SCA)的药物组合物，其中所述组合物在给药后持续约55至60天释放降钙素。
在又一种实施方式中，本发明提供了包含如本发明中公开的超分子降钙素组装体(SCA)的药物组合物，其中单剂量的该组合物在给药后持续约55至60天释放降钙素，其中从超分子降钙素组装体(SCA)释放的降钙素浓度范围为15-20pg/ml。
本发明还提供了用于治疗关节炎的药物组合物，该组合物包含本发明的超分子布洛芬组装体(SIbA)。
在本发明的一种实施方式中，提供了包含本发明的超分子布洛芬组装体(SIbA)的药物组合物，其中该组合物释放布洛芬。
在另一种实施方式中，本发明提供了包含本发明的超分子布洛芬组装体(SIbA)的药物组合物，其中该组合物在给药后持续约3至6天释放布洛芬。
在本发明的又一种实施方式中，提供了包含本发明的超分子布洛芬组装体(SIbA)的药物组合物，其中在给予单剂量的该组合物后持续约3至6天释放布洛芬，其中该超分子布洛芬组装体(SIbA)的浓度范围为10至20mg。
本发明中公开的药物组合物包含药用载体、添加剂或稀释剂。
本发明中公开的药物组合物可静脉内、肌内、口服或皮下给药。
本发明中公开的药物组合物可通过能够释放该组合物的装置给药，其中该装置选自由泵、导管和植入物组成的组。
本发明中公开的药物组合物，其中在给予单剂量的该组合物后释放所述蛋白质，持续延长的时间段。
根据本发明，一种实施例提供了制备如本发明中公开的超分子胰岛素组装体(SIA)的方法，该方法包含：在约25至60℃的温度下将胰岛素溶解在pH范围为约1.5至7.8的溶液中；以及在不断搅拌的情况下温育上述溶液6-48小时从而获得超分子胰岛素组装体(SIA)，其中SIA包含不溶性的和聚集的胰岛素低聚体形式。
在本发明的另一种实施方式中，提供了用于制备如本发明中公开的超分子胰岛素组装体(SIA)的方法，其中该方法进一步包含用PBS清洗该SIA；以及将该SIA重悬浮在PBS中。
在本发明的又一种实施方式中，提供了用于制备如本发明中公开的超分子降钙素组装体(SCA)的方法，该方法包含：在约25至60℃的温度下将降钙素溶解在pH范围为约4.0至8.0的溶液中；以及在不断搅拌的情况下温育上述溶液6-48小时从而获得超分子降钙素组装体(SCA)，其中SCA包含不溶性的和聚集的降钙素低聚体形式。
在其他的实施方式中，制备如本发明中公开的超分子降钙素组装体(SCA)的方法进一步包含用PBS清洗该SCA；以及将该SCA重悬浮在水或2％甘露醇中。
在本发明的又一种实施方式中，提供了制备本发明的超分子布洛芬组装体(SIbA)的方法，该方法包含：在约25至60℃的温度下将肽标记的布洛芬溶解在pH范围为约3.5至7.6的溶液中；以及温育上述溶液6-192小时从而获得超分子布洛芬组装体(SIbA)，其中SIbA包含不溶性的和聚集的肽标记布洛芬的低聚体形式。
在又一种实施方式中，本发明提供了制备本发明的超分子布洛芬组装体(SIbA)的方法，其中该方法进一步包含用PBS清洗该SIbA；以及将所述SIbA重悬浮在PBS中。
本发明还提供了制备本发明的超分子醋酸艾塞那肽组装体的方法，该方法包含：在约25至60℃的温度下将醋酸艾塞那肽-4溶解在pH范围为约2.0至7.6的溶液中；以及在不断搅拌的情况下温育上述溶液6-192小时从而获得超分子醋酸艾塞那肽组装体(SEA)，其中SEA包含不溶性的和聚集的醋酸艾塞那肽-4的低聚体形式。
制备本发明的超分子醋酸艾塞那肽组装体的方法进一步包含用PBS清洗所述SEA；以及将该SEA重悬浮在PBS中。
一种实施方式提供了用于溶解该蛋白质的溶液，其中该溶液选自由pH范围为1.5至2.5的盐酸或乙酸水溶液、pH范围为3.5至5.5的醋酸钠缓冲液、pH为6的磷酸盐缓冲液(PBS)、和pH范围为4至6的柠檬酸盐缓冲液组成的组。
制备本发明中公开的超分子蛋白质组装体的方法包含在37℃的温度下溶解该蛋白质。
制备本发明中公开的超分子蛋白质组装体的方法包含在pH为7.2的溶液中溶解该蛋白质。
制备本发明中公开的超分子胰岛素组装体的方法包含温育该溶液中的胰岛素约10小时。
制备本发明中公开的超分子降钙素组装体的方法包含温育该溶液中的降钙素约8小时。
制备本发明中公开的超分子布洛芬组装体的方法包含温育该溶液中用肽标记的布洛芬32小时。
制备本发明中公开的超分子蛋白质组装体的方法包含温育该溶液中的蛋白质6-192小时。
本发明进一步提供了治疗选自由1型和2型糖尿病组成的组中的代谢障碍或选自由骨质疏松症、关节炎、癌症和内毒素性休克组成的组中的慢性疾病的方法，其中该方法包含向对其有需要的受试者给予治疗有效量的、有效缓解障碍或疾病的本发明中公开的药物组合物。
在一种实施方式中，本发明提供了治疗选自由1型和2型糖尿病组成的组中的代谢障碍的方法，其中该方法包含向对其有需要的受试者给予治疗有效量的、用于有效缓解障碍或疾病的药物组合物，其包含本发明的超分子胰岛素组装体。
在本发明的另一种实施方式中，提供了治疗骨质疏松症的方法，其中该方法包含向对其有需要的受试者给予治疗有效量的、用于有效缓骨质疏松症的药物组合物，其包含本发明中公开的超分子降钙素组装体。
在本发明的又一种实施方式中，提供了治疗关节炎和关节炎疼痛的方法，其中该方法包含向对其有需要的受试者给予治疗有效量的、用于有效缓解关节炎和关节炎疼痛的药物组合物，其包含本发明的超分子布洛芬组装体。
利用如本发明中公开的组合物进行治疗的方法，其中该组合物可肌内、腹膜内或皮下给药。
根据本发明，提供了本发明的超分子胰岛素组装体用于治疗选自由1型和2型糖尿病组成的组中的代谢障碍或选自由骨质疏松症、关节炎、关节炎疼痛、癌症和内毒素性休克组成的组中的慢性疾病的用途。
进一步地，在本发明的一种实施方式中，提供了本发明的超分子胰岛素组装体用于治疗选自由1型和2型糖尿病组成的组中的代谢障碍的用途。
本发明还提供了本发明中公开的超分子降钙素组装体用于治疗骨质疏松症的用途。
本发明提供了如本发明中公开的超分子布洛芬组装体用于治疗关节炎和关节炎疼痛的用途。
在另一种实施方式中，本发明提供了包含超分子蛋白质组装体的组合物，该组合物稳定、耐蛋白酶并具有较长的保存期。
在另一种实施方式中，本发明提供了包含肽标记的超分子组装体的组合物，该组合物稳定、耐蛋白酶并具有较长的保存期。
在另一种实施方式中，本发明提供了包含超分子蛋白质组装体的组合物，该组合物稳定、耐蛋白酶并具有较长的保存期，其范围为约10天至150天或更长。
各种超分子蛋白质或肽组装体(SPA)也包括在本发明的范围内，其中该SPA包含不溶性的和聚集的蛋白质或肽的低聚体形式，其中该蛋白质或肽可用作治疗蛋白质。
任何可以形成如本发明公开的超分子蛋白质组装体(SPA)的蛋白质或肽都包括在本发明的范围内。
进一步地，任何可通过本发明中公开的方法形成超分子蛋白质组装体(SPA)的蛋白质或肽都包括在本发明的范围内。
本领域人员应理解，诸如已知缓冲液的各种溶液都可以用于重悬浮和清洗本发明中公开的超分子蛋白质组装体。
如本文使用的术语“治疗有效量”是指治疗、改善或阻止期望疾病或病况的治疗剂的量，或表现出可检测的治疗或预防效果的治疗剂的量。受试者的准确有效量取决于受试者的体重和健康状况、病况性质和程度，以及选择用于给药的疗法或疗法的组合。对于给定情形的有效量可由常规实验确定并在临床医师的判断范围内。
对于本发明的目的，对于所给药的受试者，SIA的有效剂量一般为约0.1mg/kg至约1.0mg/kg，或约0.2mg/kg至约2.0mg/kg或约0.5mg/kg至约3.0mg/kg的本发明组合物。
对于本发明的目的，对于所给药的受试者，SCA的有效剂量一般为约0.1mg/kg至约0.3mg/kg，或约0.3mg/kg至约0.8mg/kg或约0.5mg/kg至约1.0mg/kg的本发明组合物。
对于本发明的目的，对于所给药的受试者，SIbA的有效剂量一般为约2.0mg/kg至约10.0mg/kg，或约10.0mg/kg至约15.0mg/kg或约15.0mg/kg至约30.0mg/kg的本发明组合物。
对于本发明的目的，对于所给药的受试者，SEA的有效剂量一般为约0.1mg/kg至约0.5mg/kg，或约0.5mg/kg至约1.0mg/kg或约1.0mg/kg至约3.0mg/kg的本发明组合物。
药物组合物也可以含有药用载体。术语“药用载体”是指用于给予诸抗体或多肽、基因、和其他治疗剂的治疗剂的载体。该术语是指自身不会导致产生有害于接受该组合物的个体的抗体并可以给药而没有不适当的毒性的任何药物载体。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、和不活跃的病毒颗粒。这样的载体是本领域普通技术人员所熟知的。治疗组合物中的药用载体可以包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等也可以存在于这样的载体中。典型地，该治疗组合物制备成可注射形式，为液体溶液或混悬液；也可以制备成适合于在注射之前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式。脂质体和新核蛋白体(neosome)包括在药用载体的定义范围内。该药物组合物中也可以存在药用盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。
该药物组合物可以制备成各种形式，如颗粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊剂、混悬剂、软膏剂、洗剂等。适合于口服和局部使用的药用级有机或无机载体和/或稀释剂可用来配制含有治疗活性化合物的组合物。本领域已知的稀释剂包括含水介质、植物和动物油和脂肪。稳定剂、润湿和乳化剂、用于改变渗透压的盐或用于保证适当pH值的缓冲液、以及皮肤渗透促进剂可用作辅助剂。
本发明中公开的药物组合物可用于治疗代谢障碍，尤其是糖尿病，和其他慢性和炎性疾病如风湿性关节炎、骨质疏松症、慢性炎性和末梢性疼痛、脓毒症和过敏症，其中需要利用肽、蛋白质或小药物分子进行持续和长期治疗。
本发明中公开的组合物包含相关/适用的治疗性蛋白的超分子蛋白质组装体，并适用于治疗许多慢性疾病和急性症状。
本发明中公开的组合物包含治疗性蛋白质的低聚体，特别是用于持续释放蛋白质的蛋白质超分子组装体。
一些广泛使用的生物药物，如胰岛素、胰高血糖素和降钙素可被诱导从而形成淀粉样蛋白。与可溶性的前体蛋白相比，作为形成淀粉样蛋白的前驱物(prelude)而形成的无定形聚集物获得了新的特性，例如增强的稳定性、蛋白酶耐性、自增长(self-propagation)、较长的保存期、高度组织的结构，并能够用作纯分子的集中致密源(concentrated compact source)。
本发明中公开的超分子蛋白质组装体以所定义的结构存在，其具有α-螺旋和β-折叠组分。采用上述独特结构可使得溶液中天然胰岛素分子的溶解性和结构的改变。重要的是，由这种超分子结构释放的胰岛素单体是有生物活性的，因而类似于天然胰岛素结构。在这种超分子结构形成后赋予了新的溶解特性，该结构用作前药，即其本身就是前药。发现它的前药形式对胰岛素敏感的脂肪细胞的信号事件或葡萄糖体内稳态没有作用或影响。它通过从储存体(depot)或注射部位体内释放胰岛素单体而转化成药物。体外和体内结果都表明该制剂释放生物活性胰岛素分子的独特性，该生物活性胰岛素分子表现出对葡萄糖体内稳态和通常用于评估I型和II型糖尿病的其他临床参数的影响。
本发明提供了一种用于治疗糖尿病的包含超分子胰岛素组装体的组合物。超分子胰岛素是胰岛素无定形物和新生纤维低聚体的杂交体，并充当释放生物活性胰岛素的持续释放制剂。该葡萄糖调节激素胰岛素是51个残基的多肽，其作为不同低聚体状态的混合物处于平衡中，根据环境该低聚体状态包括六聚体、二聚体和单体。在胰腺分泌小泡中，胰岛素作为六聚体在生理pH下储存，而作为单体与其受体相互作用。在变性条件下，如低pH或在强变性剂的存在下，胰岛素发生聚集从而形成淀粉样蛋白纤维(Paul Bevan Insulin signalling.J.Cell Sci.，114，1429-1430(2001))。
本发明的一种实施方式提供了一种制备用于治疗各种疾病如代谢障碍，特别是糖尿病的超分子蛋白质低聚体的方法。本发明人还要求保护其他急性和慢性疾病如骨质疏松症、炎性和慢性疼痛、风湿性关节炎、关节炎疼痛、癌症、内毒素性休克等，其中将该肽转化为“超分子低聚蛋白质或肽”或将药物分子连接于此种转化的“超分子低聚蛋白质或肽”并将它们用作天然药物储存体的类似途径取得了良好的结果。
本发明中公开的超分子胰岛素低聚体是在6.8至7.8的pH范围内，优选pH为7.2下制备的。
本发明提供了包含能够持续释放胰岛素单体的超分子胰岛素组装体的组合物。包含给定超分子胰岛素组装体(即，SIAI、II、III或它们的组合)的组合物可用于获得更好的血糖控制。
本发明提供了胰岛素低聚体，超分子胰岛素组装体II，该超分子胰岛素组装体II用于通过实现持续释放胰岛素而获得更严格的血糖控制。当皮下或肌内给药时，超分子胰岛素组装体II可将STZ诱发的糖尿病大鼠体内的胰岛素在持续约10天至180天或更长的延长时间段内维持在基础水平(basal level)，并同时保持严格的血糖控制，从而提供糖尿病的长期持续治疗。
根据本发明，一种实施方式提供了包含超分子胰岛素组装体II的组合物，当肌内或皮下给予时该组合物可使得胰岛素单体在0.5-1.5ng/ml的范围内持续释放并持续至少约180天。
本发明的另一种实施方式提供了包含超分子胰岛素组装体II的组合物，其中在血清中由超分子胰岛素组装体II释放的胰岛素单体量的范围为0.5-1.5ng/ml。
在本发明的一种实施方式中，已利用STZ诱导的糖尿病大鼠证实了包含超分子胰岛素低聚体的组合物对控制血液血糖水平的体内影响。
本发明的另一种实施方式提供了包含超分子胰岛素组装体的组合物剂量，其中在实验时间段监测到的该剂量范围为约50μg至约400μg胰岛素。
本发明的另一种实施方式提供了包含超分子胰岛素组装体的组合物剂量，其中该剂量为200μg胰岛素。
本发明的另一种实施方式提供了包含超分子胰岛素组装体的组合物剂量，其中该剂量为100μg胰岛素。
在本发明的另一种实施方式中，提供了包含超分子胰岛素组装体的组合物，其中该组合物在10天至180天或更长的时间内没有在注射位置处或周围引发胰岛素降解酶活性(IDE)。
在本发明的又一种实施方式中，在10天至150天或更长的时间内受试者血清中不存在抗胰岛素抗体。
在再一种实施方式中，本发明提供了包含超分子胰岛素组装体的组合物，其稳定、耐蛋白酶并具有较长的保存期，其保存期的范围为10天至150天或更长。
在本发明的又一种实施方式中，提供了包含超分子胰岛素组装体的组合物，其能够以受控方式长期释放胰岛素单体而不会发生任何急剧快速释放。可在体内和体外控制转化的动力学。
进一步地，包含本发明中公开的超分子胰岛素组装体的组合物可用作长效单剂量药物，其无需对患者每天给予多剂胰岛素。
包含本发明中公开的超分子胰岛素组装体的组合物没有表现出阻碍糖尿病受试者低血糖阶段的胰岛素突发大量释放。
包含本发明中公开的超分子胰岛素组装体的组合物能够在体内和体外以一定速率释放胰岛素单体。
在本发明的另一种实施方式中，较高低聚(物)阶段的超分子胰岛素组装体实现了严格调节的血糖控制，糖尿病患者未出现空腹低血糖。
在本发明的另一种实施方式中，较高低聚(物)阶段的超分子胰岛素组装体实现了严格管理的血糖控制，在1型糖尿病受试者中未出现空腹低血糖。
在本发明的另一种实施方式中，较高低聚(物)阶段的超分子胰岛素组装体实现了严格管理的血糖控制，在2型糖尿病受试者中未出现空腹低血糖。
在本发明的又一种实施方式中，当用本发明的超分子胰岛素组装体或包含该超分子胰岛素组装体的组合物进行治疗时，受试者体重没有突然增加。
在本发明的又一种实施方式中，在受试者腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)血糖曲线中，超分子胰岛素组装体II释放生物活性胰岛素单体的过程没有滞后期(lag phase)，这类似于游离胰岛素给药。
在本发明的又一种实施方式中，观察到超分子胰岛素组装体II在体内释放胰岛素单体的过程为零级动力学或持续释放。
在本发明的另一种实施方式中，超分子胰岛素组装体II释放的胰岛素在生物学功能上等效于可溶性胰岛素。
进一步地，在本发明的另一种实施方式中，通过对血清谷草转氨酶(SGOT)、血清谷丙转氨酶(SPGT)、总胆红素、胆红素、碱性磷酸酶、血清总蛋白、血清白蛋白、血清球蛋白、血清A/G比、肾机能试验(KFT)、白内障形成、脂肪组织重量、体重和外部特征实施生物学测定而排除了超分子胰岛素组装体的毒性。
在又一种实施方式中，葡萄糖输注速率在受治疗的动物中仍然不变。这可推定为从注射位置储存体释放的单体具有生物学活性并刺激肌肉和肝脏从而吸收葡萄糖。
在再一种实施方式中，对MCF 7细胞实施MTT测定从而证实从SIAII中释放的胰岛素单体的不变结构和结合动力学。
进一步地，在本发明的另一种实施方式中，利用另一种化合物四氧嘧啶使得雄性Wistar大鼠患糖尿病。进一步用SIA II处理这些糖尿病大鼠，并表现出类似于STZ诱发的糖尿病大鼠的结果。观察到严格的血糖控制。
在本发明的再一种实施方式中，利用链脲佐菌素使得C57BL/6小鼠患上糖尿病，之后用SIAII处理，也表现出正常的血糖水平。
在本发明的另一种实施方式中，超分子胰岛素组装体是一种对于该超分子胰岛素组装体末端(termini)的活性肽药物的受控释放有用的稳定储存体。
根据本发明的一种实施方式，该超分子胰岛素组装体II能够提供糖尿病的长期持续治疗。
在另一种实施方式中，用于制备超分子胰岛素组装体的胰岛素优选为重组人胰岛素、牛胰岛素和猪胰岛素。
在再一种实施方式中，本发明中公开的包含超分子胰岛素组装体I和II(SIA I和II)或它们的组合的组合物，能够降低用链脲佐菌素处理从而诱发II型糖尿病的动物受试者体内的血糖水平。
本发明的另一种实施方式利用通过在C-末端用G-N-N-Q-Q-N-Y的肽序列标记的醋酸艾塞那肽-4形成的低聚组装体(称为醋酸艾塞那肽-4a)作为辅助治疗，与超分子胰岛素组装体(SIA I和II)一起用于治疗II型糖尿病。
进一步地，在本发明的另一种实施方式中，超分子低聚复合物与醋酸艾塞那肽-4一起形成。
在再又一种实施方式中，向患II型糖尿病(DM II)的大鼠给予以更快速率释放胰岛素单体的SIAI。
根据本发明的一种实施方式，也向DM II大鼠给予SIA II以用于治疗。
在又一种实施方式中，用SIA I和SIA II处理的糖尿病大鼠在餐前和餐后(180±15mg/dl)状态中都表现出接近血糖正常水平，接近于较高侧。
在本发明的又一种实施方式中，在皮下和肌内这两处注射的SIA II剂量为150μg。
本发明的另一种实施方式证明了SIA I和SIA II维持接近血糖正常水平长达30天的能力。
在又一种实施方式中，醋酸艾塞那肽-4a与胰岛素疗法一起施用可以使接近血糖正常水平维持长达45天(135±10mg/dl)，并且为治疗DM II的较好制剂。
进一步地在另一种实施方式中，以非常低的速率(0.05-0.3ng/ml)释放胰岛素单体的SIA III可用于治疗临界糖尿病患者，即在葡萄糖耐量试验中不良预后、需要非常少量的胰岛素作为治疗的前驱糖尿病患者或受试者。
在本发明的又一种实施方式中，在糖尿病大鼠血清中检测到的人胰岛素水平为约0.7-0.85ng/ml。
在本发明的再一种实施方式中，为了证明该治疗的效果，评价了各种血清参数，如甘油三酯(TAG)、游离脂肪酸(FFA)。
在又一种实施方式中，对于胰岛素SIA+醋酸艾塞那肽-4a处理的大鼠，血清中的TAG水平在0.45-0.6mmol/l范围内，其与对照组几乎相同。
进一步地在另一种实施方式中，对于胰岛素SIA+醋酸艾塞那肽-4a处理的大鼠，血清中的FFA水平估计为约0.85-0.9mmol/l，其与对照组几乎相同。
在本发明的再一种实施方式中，受治疗动物体重的增加与对照大鼠几乎相同。
在又一种实施方式中，本方法可以扩展到需要利用肽、蛋白质或小分子进行持续和连续治疗的那些慢性和炎性疾病。
本发明的另一种实施方式涉及降钙素、醋酸艾塞那肽-4和肽GNNQQNY标记的布洛芬的超分子组装体的形成，及其在治疗各种疾病中的治疗应用。
在本发明的再一种实施方式中，鲑鱼降钙素的超分子低聚体可用于治疗患病受试者的骨质疏松症。
根据本发明的一种实施方式，由鲑鱼降钙素形成淀粉样蛋白纤维是浓度依赖性的并且经由44小时完全形成。
在又一种实施方式中，超分子降钙素组装体(SCA)I、II和III分别经由6、8和12小时形成。
进一步地，在本发明的另一种实施方式中，SCA中游离降钙素的释放遵循胰岛素那样的钟形曲线(小体积)，通过透析膜连续释放(在大体积水溶剂中)。
在本发明的再一种实施方式中，完全长成的纤维中降钙素单体的释放可以忽略。
在本发明的又一种实施方式中，超分子降钙素组装体(SCA)被合并到Alzet泵中，通过该Alzet泵可获得降钙素单体以2.5μl/h的速率缓慢和受控释放。
根据本发明的一种实施方式，对切除卵巢的大鼠给予载体或人/鲑鱼降钙素，间歇地通过皮下注射或连续地通过Alzet渗透压微泵给药，其中该Alzet渗透微泵含有2％甘露醇中的200μl降钙素(CT)或超分子降钙素组装体(SCA，2mg/ml)。
在再一种实施方式中，通过该泵给予切除卵巢的大鼠8U/kg b wt剂量，并隔天皮下给予16U/kg b wt剂量。
在又一种实施方式中，在处死前的10天和3天，分别给予15mg/kgb wt剂量的地美环素和钙黄绿素。
根据本发明的一种实施方式，与其他组相比，用SCA处理的大鼠体内的降钙素血清水平维持在较高水平(19pg/ml)。
在本发明的又一种实施方式中，利用含SCA的单个泵，降钙素血清水平可维持在较高水平，持续长达60天。
在本发明的又一种实施方式中，与给予载体的切除卵巢的大鼠相比，超分子降钙素处理的大鼠的体重、钙和磷水平表现出轻微的增加，而给予载体的切除卵巢的大鼠在实验时间范围内体重增加近11％并且血清中的钙和磷水平增加。
进一步地，在本发明的另一种实施方式中，在受治疗动物的血清中，发现可忽略水平的抗鲑鱼降钙素的抗体。
本发明的实施例1提供了一种制备超分子胰岛素组装体II的方法。附图提供了胰岛素(人和牛)原纤维形成的详细信息，其是通过利用硫磺素T(Th-T)荧光(Le Vine，H.Quantification of -Sheet Amyloid Fibril Structures with Thioflavin T.Methods Enzymol 309，274-284(1999))监测的。当在pH 7.0(50mM PBS)和pH2.0(水中的盐酸)时，在37℃下以180rpm搅拌牛胰岛素时，通过获得Th-T荧光记录经由该胰岛素的原纤维形成(图1)。对于在pH 7.0下温育的胰岛素，因其结合到胰岛素原纤维上所引起的Th-T荧光增加在48小时到达最大值，而在pH2.0下，该原纤维形成迅速，因而Th-T荧光在20小时就到达最大值。图1比较了牛胰岛素和人胰岛素的原纤维形成。
本发明的实施例2提供了超分子胰岛素组装体II中胰岛素单体释放的动力学。胰岛素的超分子胰岛素组装体形式起到了用于长期持续释放胰岛素单体的贮器(reservoir)(图2a)。其淀粉样蛋白和胰岛素的各种超分子组装体中胰岛素单体的释放由图2b和图2c记录和描述。完全形成的淀粉样蛋白纤维释放的胰岛素可忽略不计而与pH无关。在pH为2.0时，超分子胰岛素组装体中间体，尤其是超分子胰岛素组装体II以非常低的速率释放胰岛素，该非常低的速率暗示了这些低聚体是坚固和紧密相联的。然而，在600nm处表现出0.9-1.3的混浊度的pH 7.0中间体(称为超分子胰岛素组装体II)以可观的速率释放胰岛素。观察到，在15±5天的时间内在280nm吸收下胰岛素单体释放呈线性增加。当在1mL恒定体积下观察由SIA释放的胰岛素时，观察到钟形曲线(图2d)。这说明低聚体形成程序的可逆性和游离胰岛素与SIA之间存在平衡。如在图2a中示出的，释放样品的酪氨酸荧光证实了这些观察结果。胰岛素淀粉样蛋白中间体，即超分子胰岛素组装体II(或者称为胰岛素淀粉样蛋白前体II)满足在体外每小时2-4μM(0.4-0.6IU)胰岛素单体持续释放的要求，从而实现恒定但缓慢的体内释放，从而维持体内的基础胰岛素水平。
实施例3提供了利用刚果红(CR)结合(Klunk，W.E.，Jacob，R.F.&Mason，R.P.Quantifying amyloid by Congo red spectral shift assay.Methods Enzymol 309，285-305(1999))分析的超分子胰岛素组装体性质。如同Th-T一样，CR也特异性结合于淀粉样蛋白的富含β-折叠的结构，并常规应用于检测它们。通过扫描最大吸收在400-600nm区域中的红移，监测用50μM CR于37℃在PBS中温育1小时获得的与样品结合的CR。图3说明，超分子胰岛素组装体(rH和牛)表现出与CR的较弱结合，而完全长成的纤维则在pH2.0和7.0下表现出显著的结合。
实施例4超分子胰岛素组装体I、II和III也利用ATR-FTIR进行表征。观察了对应于每个阶段的不同光谱(图4)。观察到IR条带朝较低频率方向迁移。对于牛胰岛素和rH胰岛素，超分子胰岛素组装体II分别在1647-1645cm-1处具有尖峰，而完全形成的胰岛素原纤维(淀粉样蛋白)分别在1630-1628cm-1处具有峰。超分子胰岛素组装体II的FTIR光谱与CR数据具有良好的一致性，表明该蛋白质仍主要是螺旋结构，但无规卷曲结构的含量增加。
通过如实施例5和6中提供的原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)，评估了在pH 7.0和pH 2.0下形成的纤维形态。pH 7.0和2.0下的天然胰岛素分子(牛和rH)表现出高度为1.3±0.21nm的随机分布，其与胰岛素单体尺寸(1.11nm)和二聚体尺寸(1.49nm)相关联(图5a)。牛胰岛素在pH 7.0下原纤维形成过程中的中间体在图5(b-d)中示出，而rH胰岛素在pH 7.0下原纤维形成过程中的中间体在图5(e-g)中示出。SIA-I表示呈珠状排列的伸长簇。中间有一些高度为12±2nm的伸长的线形颗粒，这暗示了进一步缔合成较高的低聚状态。SIA-II中间体在牛胰岛素和rH的情况下都被视为上述伸长簇的线性缔合体，其具有超低聚结构组织的独特实体(unique entity)(图5(c和e))。SIA-III(继SIA-II之后的原纤维阶段)表现出较高低聚物结构的密度增大。在pH 7.0下完全长成的纤维表示出胰岛素淀粉样蛋白的典型交联β结构(图5h)。pH 2.0原纤维形成过程的中间体在6-7h时出现高度为7.2-8.3nm的两种原纤维的横向缔合体，而在20h之后观察到宽度为10-12nm的大合股纤维(twisted fiber)(图5(i和j))。
实施例6提供了透射电子显微镜谱(TEM)来评估可能的胰岛素组装体的存在。TEM照片示出在超分子胰岛素组装体II阶段(图6a)中存在一些无定形结构和较高的低聚物结构。在超分子胰岛素组装体II阶段之后的阶段(图6b)具有更多的原纤维结构，如(图6(c和d))中示出的。相比之下，在pH 2.0下温育胰岛素时存在丰富的原纤维形式[图6(e)]。
实施例7提供了用于研究胰岛素淀粉样蛋白和超分子胰岛素组装体形式效果的动物模型的详细信息。发明人已利用四种不同的糖尿病模型检验假设和SIA在治疗糖尿病中的治疗潜力，即，(a)STZ处理的大鼠，(b)四氧嘧啶处理的大鼠、(c)STZ处理的小鼠、和(d)STZ家兔。
为了使剂量标准化，将50μg、100μg、200μg和400μg超分子胰岛素组装体II皮下注射和可替代地肌内注射到糖尿病大鼠中。如图7a和图7b中所概括的，超分子胰岛素组装体的50μg和100μg单剂量仅可分别维持接近血糖正常水平达10和30天，相比之下，当分别使用200μg牛和人超分子胰岛素组装体时可长达135和160天。在400μg剂量的情况下，观察到突然的非空腹正常血糖和空腹低血糖而与给予的路径无关，揭这暗示从牛胰岛素的SIA储存体释放了基础水平胰岛素单体的初始推注量(initial bolus)。选择作为治疗剂量的200μg超分子胰岛素组装体用于详述的长期前瞻性研究。
实施例8提供了利用胰岛素的超分子胰岛素组装体形式对糖尿病动物进行治疗的方法。分别用胰岛素(4IU/kg，IP)、超分子胰岛素组装体(SC和IM均为200μg)处理分配为多组的STZ-诱导的糖尿病大鼠，从而研究该超分子胰岛素组装体治疗对控制血液血糖水平的体内影响。另外，一组PBS处理的糖尿病大鼠和另一组正常大鼠用作糖尿病和非糖尿病对照。监测大鼠的餐前血糖和餐后血糖水平一段时间，直至观察到胰岛素的生理效应。如图8a和图8b所示，用200μg超分子胰岛素组装体进行的处理，通过在STZ-诱导的糖尿病大鼠中由超分子胰岛素组装体储存体持续且缓慢释放胰岛素单体而维持胰岛素的基础水平，导致非空腹血糖水平显著降低而不引起空腹低血糖(图9a和图9b)。不论超分子胰岛素组装体是经由皮下或肌内途径注射，都未观察到显著差异。在游离胰岛素(即，在它的正常配对物中；非超分子组织形式)处理(4IU/kg单剂量)的情况下，每日血糖仅降低到非空腹值为350-450mg/dl和空腹为300-400mg/dl。每天腹膜内给予糖尿病大鼠可维持高血糖血糖水平(300±100mg/dl)的胰岛素。与需要每日给药来抑制血糖骤降至非常高的水平的游离胰岛素的处理相比，超分子胰岛素组装体的单次注射足以在糖尿病大鼠中获得3个月的接近血糖正常水平(150±60mg/dl)而不致引起空腹低血糖(90±50mg/dl)。如图8b和图9b中描述的，利用由人胰岛素形成的超分子胰岛素组装体获得了类似的结果。如从图10中可以看出，给予在pH 7.0和pH 2.0下形成的胰岛素淀粉样蛋白对糖尿病大鼠的血糖状态没有有益的影响。在整个治疗期间的所有情况下，监测正常健康的指标体重和BGL。如图11中所示的，在STZ处理之后体重立即开始下降，但在用超分子胰岛素组装体II处理之后糖尿病大鼠体重逐渐增加，并且超分子胰岛素组装体处理的动物的曲线平行于非糖尿病对照组。因而，用于长期治疗糖尿病的超分子胰岛素组装体II的出人意料的效力被认为是对传统方法的改进。
实施例11提供了腹膜内葡萄糖耐量试验从而评估超分子胰岛素组装体以连续方式释放胰岛素的效能。监测了胰岛素的体内释放。所释放单体的生物活性通过从血液中的血糖情况(disposal)来评价。所进行的独立实验的详细信息在图12中示出。对于空腹正常和STZ处理的大鼠，在用PBS、超分子胰岛素组装体II和胰岛素处理之后，在(T0)之前和给予葡萄糖之后的30、90、150、270和330min确定葡萄糖水平。如图12中所示的，葡萄糖输注在1.5小时内恢复到激发前水平之后，胰岛素注射、超分子胰岛素组装体II处理或单独的体外释放单体显著改善了接受治疗的动物的葡萄糖耐量试验，以及所评价的血糖水平。
实施例12描述了对给予超分子胰岛素组装体进行的牛胰岛素和rH的血清胰岛素量化(图13a)。血清胰岛素对于牛胰岛素和rH胰岛素SIA-II来说分别在长达150和180天的时间内是可检测的，其对应于BGL的降低。血糖水平的降低对于牛胰岛素和rH胰岛素SIA-II来说分别持续长达150和180天，用单剂量的超分子胰岛素组装体II维持近正常葡萄糖值20-25周以上。实施固态ELISA，从而量化用于维持血糖正常值的从胰岛素SIA II中释放的胰岛素的血浆水平。正如所期望的，与在经PBS处理的糖尿病大鼠中不能检测到的胰岛素水平(0.08ng/ml)相比，超分子胰岛素组装体处理的糖尿病大鼠(0.5-1.2ng/ml)的情况获得了基础水平或略超过基础水平的胰岛素释放(图13a和图13c)。不论途径如何，均在注射当天到长达150-180天观察到胰岛素的持续释放(0.8-1.1ng/ml)，其使得超分子胰岛素组装体处理的动物体内的血糖接近正常值。虽然在动物之间观察到一些差异，但可以获得的显著的胰岛素释放值在0.5-1.2ng/ml范围内。这种基础水平足以维持血糖正常水平，直至该超分子胰岛素组装体耗尽。然而，在胰岛素处理的糖尿病动物中，检测到相对较高的平均血糖水平，但动物之间有着高度的差异。这是由仅通过胰岛素处理的BGL中的受试者间差异引起的。还对所实施的葡萄糖耐量试验进行了血清胰岛素水平的量化，该试验的葡萄糖数据已示出。图13b描述了在IPGTT实验中，在长达270分钟的时间内大鼠血清中牛胰岛素值。在对照和仅给予PBS的STZ处理的大鼠的情况下，该牛胰岛素值都几乎可以忽略(图13b)。然而，在给予胰岛素的情况下，该胰岛素值在30min内增大到～0.9ng/ml，然后在一段时间内降低。当使用等效于游离胰岛素的终端释放(terminally released)的胰岛素时观察到类似的曲线。这对应于血糖水平的降低，接着是由胰岛素吸收和降解引起的血糖水平的升高。在另一方面，在超分子胰岛素组装体处理中，在30min内血清中胰岛素水平达到相当于基础水平的0.8-0.9ng/ml，然后在研究的一段时间内保持恒定，如通过牛胰岛素量化所看到的。这种持续的基础水平确保了血糖正常水平，而没有大幅度降低该水平并使动物血糖过低。进一步地，实施大鼠胰岛素ELISA，从而评价对照大鼠和STZ处理的大鼠的血清胰岛素水平。如图13c所示，大鼠基础胰岛素水平是0.501ng/ml并根据输注的葡萄糖增加支管(manifold)。在STZ处理的大鼠的情况下，由于STZ造成的胰腺β细胞被破坏，基础胰岛素水平几乎可以忽略。这证实了，在超分子胰岛素组装体处理的情况下观察到的血糖水平降低是由从SIA II中释放的牛/rH胰岛素的释放引起的。在制备胰岛素SIA II的过程中，除牛胰岛素和rH胰岛素以外，采用选自由但不局限于猪胰岛素组成的组中的胰岛素。
实施例13提供了胰岛素的I125标记从而验证并量化了SIA II末端中的体外释放。由标记的胰岛素形成的超分子胰岛素组装体II的比活性(specific activity)为49912CPM/ml/μg。皮下和肌内注射50μl超分子胰岛素组装体(4991200CPM)，并监测血糖水平，在0、30分钟、1小时、4小时、10小时、24小时，其后每天一次，然后每隔一日或每周一次地采集血清样品。测量每毫升血清中的数值(count)(图14)。如所示出的，血糖曲线与用未标记的SIA II观察到的相同。当对处理天数作图时，经计算的CPM/ml仍然是几乎恒定的(图14a)。但在30分钟-4小时期间存在初始高数值(initial high count)，其然后在10小时内逐渐减小到2000-3000的恒定水平。计算血液中释放的胰岛素量，该量在0.5-1.2ng/ml范围内，其对应于如用ELISA观察到的血清中胰岛素的基础水平或略超过基础水平(图14b)。为了进一步证明超分子胰岛素组装体释放的胰岛素是单体的，在tricine-SDS-PAGE上分析不同时间点的血清，并利用磷屏成像系统(phosphor imager)形成射线照片。如图15所示，当装入等量的血清时，血清的条带对应于游离胰岛素单体且其强度长期保持恒定。在20天之后观察到强度减小，表明在一段时间内超分子胰岛素组装体储存体的使用和消耗以及放射性标记物自身衰减的一些影响。
实施例14描述了所实施的高血糖测试研究，从而评价所注射的SIAII中胰岛素单体的缓慢和连续释放。在一周、一个月和三个月的时间间隔中，用以维持高血糖状态的葡萄糖输注速率在实验过程中保持不变。这表明注射部位处的储存体持续释放胰岛素。在给予游离胰岛素的组的情况下，输注的葡萄糖量随时间减少，这是因为在游离胰岛素没有连续供应的情况下肌肉和肝吸收的血糖的减少(图16a-图16c)。
实施例15提供了胰岛素对葡萄糖运输和细胞内信号级联介导的脂肪组织中其他代谢事件的影响，其中在细胞表面上该细胞内信号级联在胰岛素结合到胰岛素受体之后开始(Paul Bevan Insulin signalling.J.Cell Sci.，114，1429-1430(2001))。细胞中胰岛素的影响可通过细胞内介质的活化介导，该介质为，例如PI3K、AKT和ERK。PI3激酶和Akt的活化可介导胰岛素诱导的葡萄糖吸收和GLUT-4小泡位移到血浆膜上，并涉及各种其他胰岛素影响，包括抑制脂解和激活脂肪酸、糖原、蛋白质和DNA的合成。另一方面，细胞外信号调节激酶(ERK)途径的活化涉及脂肪细胞前体对生长因子的促有丝分裂反应。研究了PI3K水平，其是胰岛素信号下游的第一激酶。如图17a所示，当使用超分子胰岛素组装体和由它们体外释放的胰岛素时，PI3K水平相比于对照组显著提高。与胰岛素相比，未观察到显著差异。还评估了总蛋白质和Akt活化水平、苏氨酸/丝氨酸激酶，它们对胰岛素作用及其在脂肪细胞中的各种代谢反应的调节是很重要的。观察到p-Akt水平显著提高，再次类似于利用游离胰岛素所观察到的反应。总Akt蛋白质水平没有差异，因而未观察到它在胰岛素或其超分子胰岛素组装体II的存在下的表达的差异。为了评估在脂肪细胞中观察到的时间曲线(temporal profile)和Akt磷酸化水平是否与Akt活性的差异有关，利用抗GSK3β和p-GSK3β的抗体通过免疫印迹法监测内源Akt底物GSK3β的磷酸化。GSK3β通过Akt在ser-21被直接磷酸化，并在其磷酸化之后被灭活。与对照组相比，GSK3β的磷酸化在用游离胰岛素或超分子胰岛素组装体II处理的脂肪细胞中增加了数个折叠，并且在所处理的细胞中没有显著差异。未观察到总GSK3β蛋白质水平的差异，这暗示了在处理之后它的表达没有发生变化。因此，Akt和GSK3β都对超分子胰岛素组装体II和由超分子胰岛素组装体释放的胰岛素表现出迅速和明显反应，并类似于在刺激时利用游离胰岛素作为对照组所观察到的反应。在脂肪细胞中，观察到在用超分子胰岛素组装体和由它释放的胰岛素处理中ERK的活化，因为这种激酶涉及胰岛素介导的脂肪细胞转录因子和脂肪组织发育的调节。在用胰岛素、超分子胰岛素组装体和由超分子胰岛素组装体释放的胰岛素处理脂肪细胞时，对比对照组观察到ERK 1/2显著活化。ERK 2的磷酸化是ERK 1的两倍，这暗示了ERK 2对处理的更高表达。在SIA、胰岛素或血清处理的细胞中，在SIA中ERK 1/2的磷酸化形式没有显著差异。因此，在PI3K、Akt和GSK3β介导的信号中，超分子胰岛素组装体II和胰岛素处理的细胞中ERK磷酸化类似。当将来自胰岛素或其SIA-II处理的动物的血清加入到培养的脂肪细胞中时，观察到信号介质的类似活化(图17b)。这些数据同时表明由超分子胰岛素组装体II释放的胰岛素可以像胰岛素自身一样活化脂肪细胞中的胰岛素信号途径。观察到的效果甚至更好，因为单体形式的胰岛素主要从它的超分子胰岛素组装体中释放。
实施例17描述了胰岛素的超分子胰岛素组装体的组织和免疫组织化学详细信息。从注射之日起的1周至12周，监测用超分子胰岛素组装体处理的糖尿病大鼠，以便确定是否存在超分子胰岛素组装体残留量。利用刚果红检测皮下组织和肌肉组织中沉积的超分子胰岛素组装体。按照材料和方法中描述的，准备、染色并分析皮下和肌肉组织切片。发现在超分子胰岛素组装体注射24h之后获得的组织与刚果红有效地结合，这证实了存在较多量的超分子胰岛素组装体原纤维(图18)。刚果红结合以时间依赖性的方式下降，并且在12周之后可以忽略不计(图18a(i-x)和图18b(i-x))，这证实了超分子胰岛素组装体储存体的终端释放了胰岛素。还检查了一些组织，以确定利用H&E和免疫染色的超分子胰岛素组装体是否使得该组织产生炎症。利用H&E染色法和免疫组织化学法对代表性切片进行染色，以确定是否存在炎性细胞(图18a(xi-xx)和图18b(xi-xv))。
与注射了LPS的大鼠的切片相比，其中在用H&E染色的皮下和肌肉细胞中都可观察到促炎性细胞浸润(Fig 19a(i-ii))，而超分子胰岛素组装体注射的切片甚至在12周之后都没有表现出任何炎症迹象。在免疫染色的切片的情况下观察到类似结果，其中72小时之后在注射部位，来自大肠杆菌(Escherichia coli)的LPS足以吸引大量的促炎性细胞(图19a(iii-iv))，但在用超分子胰岛素组装体处理的动物中则没有观察到这种反应(图18a(xv-xx)和图18b(xi-xv))。这些观察结果增强了所使用的超分子胰岛素组装体的非细胞毒性性质。当皮下注射时，在PH 2.0下形成的淀粉样蛋白与刚果红染料非常有效地结合，如图19b中所示。而且，储存体没有减少，这证实了完全形成的淀粉样蛋白没有释放胰岛素单体的数据(图19b i-图19b viii)。
实施例18描述了糖尿病的四氧嘧啶模型。利用四氧嘧啶使雄性wistar大鼠患糖尿病，并监测它们的血糖水平。对糖尿病大鼠给予超分子胰岛素组装体II，在餐前和餐后条件下都将血糖水平降低到接近血糖正常水平，并维持严格的血糖控制，持续长达＞120天(图20a和图20b)。利用ELISA完成血清胰岛素的量化。从注射之日起，在经处理的大鼠血清中观察到人胰岛素持续且恒定释放(0.5-0.9ng/ml)(图20c)。因而，通过降低糖尿病大鼠体内的葡萄糖水平所看到的生理效应时由于在注射部位形成的SIA-II储存体连续释放的胰岛素单体造成的。
实施例19与I型糖尿病有关的继发并发症的减少：在1型糖尿病中，胰岛素供应不足导致骨骼肌中蛋白质的降解和脂肪细胞中的脂解增多。糖尿病大鼠的骨骼肌(～20-40％)和腹部脂肪明显增加(＞60％)(Nathan，D.M.，Cleary，P.A.，Backlund，J.Y.，et al.Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1diabetes.N.Engl.J.Med.353，2643-53(2005))。相比而言，超分子胰岛素组装体处理的糖尿病动物是健康的，它们的这些组织具有正常的重量。在糖尿病大鼠和胰岛素处理的大鼠中观察到白内障的形成(图21)。而在SIA II处理的动物中未观察到白内障，大多数未处理的大鼠产生白内障，如图21中所示的。此外，与未经处理或输注游离胰岛素的大鼠相比，通常会受到糖尿病严重损伤的身体两个主要器官，肝和肾的功能在超分子胰岛素组装体II处理的大鼠中是正常的，其总结在表1中。
在12周之后，检查利用刚果红染料而可视化的心、肾和肝切片，以确定注射到糖尿病大鼠中的SIA-II的较高低聚体是否发生沉积。在该组织切片中的任何一个中都未观察到低聚体沉积。
实施例20提供了胰岛素降解酶(DIE)的检测和筛选抗胰岛素的抗体的详细信息。在1型糖尿病中，皮下胰岛素抵抗是一种罕见的综合征(Paulsen，E.P.，Courtney，J.W.& Duckworth，W.C.Insulin resistance caused by massive degradation of subcutaneous insulin.Diabetes 28，640-645(1979)和Freidenberg，G.R.，White，N.，Cataland，S.，O’Dorisio，T.M.，Sotos，J.F.& Santiago，J.V.Diabetes responsive to intravenous but not subcutaneous insulin：effectiveness of aprotinin，N.Engl.J.Med.305，363-368(1981))，这种综合征被定义为皮下注射的胰岛素的缺乏生物活性；但保留了静脉内输注的胰岛素的效能。这主要是由于皮下组织中的IDE导致胰岛素降解增加。IDE使胰岛素特异性降解(Duckworth，W.C.，Bennett，R.G.& Hamel，F.G.Insulin degradation：progress and potential，Endocr.Rev.19，608-624(1998))，并且部分降解的胰岛素被再吸收进入循环，使得免疫原性增加但没有生物活性。IDE存在于胰岛素应答组织和对胰岛素不敏感的细胞中，如单核白细胞和淋巴细胞。为了检查超分子胰岛素组装体处理的动物中是否形成这种抵抗，按方法部分中描述的方法确定IDE的生物活性和是否存在抗胰岛素抗体。在来自超分子胰岛素组装体处理的动物的所有血清样品(1-12周)中，IDE活性都是可以忽略的(图23)。类似地，甚至在处理12周之后，也不存在抗胰岛素抗体，这支持了没有IDE活性的结论(图24)。
为了探究由超分子胰岛素组装体II释放的胰岛素单体是否经受了结构或结合动力学的任何变化，对MCF 7细胞系实施MTT测定。当将SIA加入到培养物中时，MCF 7细胞的增殖类似于其中加入了天然胰岛素的那些细胞。此外，由所形成的SIA II释放的单体也表现出相同的细胞增殖动力学。胰岛素样生长因子I用作MCF 7细胞增殖的阳性对照(图25)。胰岛素和IGF 1具有类似的结构，并且在其中的一种不存在的情况下，每一种都可以结合到其他的受体上。但是IGF 1是促有丝分裂的，胰岛素在结合到胰岛素受体或IGF受体上时不引起细胞的增殖。因而，由SIAII释放的单体具有与天然胰岛素相同的结合动力学，并且不经受任何结构变化。
实施例21描述了用于诱导小鼠患糖尿病的链脲佐菌素模型。在利用STZ致使糖尿病的小鼠中，研究了人和牛SIA的剂量反应。向糖尿病小鼠基于的多种剂量20、50、100和200μg各个SIA分别使血糖正常/接近血糖正常状态维持5、15、30、120天(图26a-图26c)。
实施例22描述了用于诱导家兔患糖尿病的链脲佐菌素模型。向糖尿病家兔基于的1mg/kg体重的rH-胰岛素SIA-II，使血糖正常/接近血糖正常状态维持至少80天(图27)。
实施例23提供了用超分子胰岛素组装体和醋酸艾塞那肽-4进行的实验的详细信息。超分子胰岛素组装体和醋酸艾塞那肽-4一起用于II型糖尿病治疗的辅助治疗。所实施的组合治疗可以降低血糖水平并可以维持糖尿病大鼠的接近血糖正常水平长达＞30天(图28)。与血清水平增加多达1.5倍的仅用胰岛素或PBS处理的大鼠相比，TAG和FFA水平也保持在接近约正常水平，如表2中所示出的。
本发明的超分子胰岛素组装体制剂表现出长期释放胰岛素单体的出人意料的结果。进一步地，本发明的超分子胰岛素组装体II不会发生胰岛素的急剧大量释放，从而防止了STZ处理的糖尿病大鼠发生低血糖状态。为了验证上述出人意料的结果，评估了在胰岛素原纤维形成过程中在PH7.0下获得的胰岛素超分子组装体II中间体。发现该中间体超分子胰岛素组装体II以恒定速率释放胰岛素单体，且持续时间长。所选择的中间体(超分子胰岛素组装体II)没有表现出显著的刚果红结合，表明它不能发展到淀粉样蛋白状态，并且ATM分析证实了伸长低聚体的线性缔合体作为优势物质存在。与高度为12±5nm高度扭曲的完全长成的纤维相比，这种独特实体的高度为18±5nm，这暗示了形成超分子胰岛素组装体的伸长低聚体发生溶胀(swollen)并保留了类似天然的结构(native like structure)。通过TEM研究也观察到类似的非原纤维结构。一般通过胰岛素调节血液中血糖水平的能力来评价其生物有效性。所产生的血糖浓度降低代表胰岛素的最显著和在治疗上最重要的作用。评价了用单剂量超分子胰岛素组装体处理并与每日1次(single-daily)胰岛素注射相比的STZ-诱导的糖尿病大鼠的血糖控制效率。超分子胰岛素组装体处理和胰岛素注射都降低了高血糖的严重程度。与胰岛素处理相比，单剂量的本发明的超分子胰岛素组装体可维持糖尿病动物接近血糖正常水平(120mg/dL)约150-180天。
本发明进一步评价了超分子胰岛素组装体II在调节血糖水平中的作用。使接收超分子胰岛素组装体处理的糖尿病动物整夜禁食。可以使这些禁食的动物空腹血糖水平维持在正常范围内(60-100mg/dl)，并且未观察到餐前低血糖。综合起来看，这些数据表明，与传统的胰岛素治疗相比，超分子胰岛素组装体II的较高低聚状态可以实现严格调节的血糖控制，而不引起糖尿病动物出现空腹低血糖。
本发明进一步评估了超分子胰岛素组装体II对体重的影响。进行腹腔葡萄糖耐量试验从而确定在严重高血糖情况下超分子胰岛素组装体的起效时间。IPGTT血糖曲线示出了胰岛素和超分子胰岛素组装体处理都在30分钟内产生效果，这暗示了超分子胰岛素组装体II储存体中生物活性胰岛素单体的释放没有滞后期。
本发明通过利用ELISA量化血清中的牛/人胰岛素，提供了超分子胰岛素组装体中胰岛素的体内释放曲线。与体外观察到的S形释放动力学(sigmoid release kinetic)相比，超分子胰岛素组装体中胰岛素单体的体内释放遵循持续释放所期望的零级动力学。观察到用于维持正常血糖的基础水平和高于基础水平(0.5-1.2ng/ml)的胰岛素持续释放，这与治疗的持续时间具有很好的相关性。为了验证上述释放动力学，用125I放射性标记胰岛素，并向STZ处理的动物皮下或肌内注射125I标记的超分子胰岛素组装体。通过监测CPM/ml测量胰岛素释放量。CPM/ml/μg(49912)用于量化特定时间点血清中释放的胰岛素，并且这与利用ELISA量化的牛胰岛素量有关。在测量数值之后，在Tricine-SDS-PAGE上分析血清样品。形成的磷屏图像(phosphor image)出现对应于胰岛素单体的条带。由超分子胰岛素组装体储存体释放的胰岛素单体有效地引发胰岛素应答脂肪细胞中的胰岛素信号级联。在将由超分子胰岛素组装体在体外和体内(血清)释放的胰岛素加入分离的脂肪细胞中时可以活化信号途径的细胞内介质(即，PI3K、Akt、ERK1/2和GSK3β)。因此，由超分子胰岛素组装体储存体释放的胰岛素单体是有生物活性的，并遵循与胰岛素相同的机制调节身体中的葡萄糖体内稳态。组织化学研究也表明，注射到动物体内的超分子胰岛素组装体II形成储存体，从该储存体缓慢而持续地释放生物活性胰岛素。此外，未观察到与应答皮下或肌内注射的LPS的白细胞浸润相对的炎症。
本发明提供了的对于治疗糖尿病动物具有极大的生理益处的超分子胰岛素组装体。这可以从如表1中给出的糖尿病大鼠肝和肾功能改善而引起的血糖控制显著改善以及尿素和肌酐浓度明显降低中部分地反映出来。
本发明提供了与基于超分子胰岛素组装体血清有关的抗胰岛素抗体和胰岛素降解酶(IDE)的详细信息。甚至是在第12周结束时，抗胰岛素抗体的缺乏也增加了超分子胰岛素组装体在治疗糖尿病方面的价值。不会在注射部位处或周围引发IDE，是延长超分子胰岛素组装体中胰岛素的释放以及伴随的抗糖尿病效果的重要因素。
本发明提供了由超分子胰岛素组装体II释放的胰岛素单体具有与可溶性胰岛素等效的功能。显著差异是作用持续时间，对于标准的胰岛素注射液其仅为6-10小时，而出人意料的是，超分子胰岛素组装体II的作用持续时间为约10天至约180天或更长，这取决于其剂量。这可能归功于胰岛素在超分子胰岛素组装体中的显著稳定性，该超分子胰岛素组装体在注射部位形成储存体，用于长期提供生理上最适当的胰岛素形式，即胰岛素单体。
在135-180天观察到，基于人胰岛素的超分子组装体II获得甚至更好的血糖控制。从图中明显可以看出，皮下和肌内注射的胰岛素低聚体都使得血糖量接近正常。
利用ELISA来量化血清中释放的胰岛素，并观察到它可以维持在几乎恒定的水平，这是由于来自储存体的缓慢且持续的释放引起的。
用四氧嘧啶致使糖尿病的雄性wistar大鼠和链脲佐菌素处理的糖尿病C57bl/6小鼠(作为另一种糖尿病模型)在用超分子胰岛素组装体II处理之后都表现出接近血糖正常的血糖水平。
用人超分子组装体II胰岛素获得的蛋白质印迹数据基本上相同，表明释放的胰岛素单体致使信号途径活化。
超分子胰岛素组装体I的特点是溶胀和更多高度为18±2nm的球状物质。在淀粉样蛋白形成过程中肽结构的伸展(解折叠，unfolding)导致球状单体物质各自随机分布在表面上。进一步地，在人胰岛素超分子组装体II的第II阶段这些单体发生线性缔合，但保留了它们的溶胀形态。所形成的低聚体被描绘成伸长的簇，与高度为18±4nm的牛胰岛素相同。在超分子胰岛素组装体III(更接近继SIAII之后的原纤维阶段)的情况下，发现较高的低聚结构密度增大。该结构更加密实，其高度为5±1nm。总体结构形态类似于牛SIA阶段，其具有进一步在先观察到的完全形成的纤维。
本发明提供了超分子胰岛素组装体的治疗在显著改善STZ-诱导的糖尿病动物模型的血糖水平而不引起空腹低血糖方面的效能和适用性。与通过增加胰岛素注射频率来控制血糖水平并伴随有低血糖风险的强化胰岛素治疗不同，可以实现利用超分子胰岛素组装体来显著改善血糖控制，而不需多次注射胰岛素并且不会使体重过多增加。
如同II型糖尿病(DM II)的情况，通过将这些研究扩展到需要持续且连续输注胰岛素治疗的那些疾病可进一步增加本发明的价值。醋酸艾塞那肽-4和胰岛素结合使用可用于有效治疗DM II。已知醋酸艾塞那肽-4可以通过减少食物在胃中的吸收来降低血糖水平。它还延迟了胃排空，降低HbAc水平并阻止由于胰岛素治疗而观察到的体重大幅增加。将GNNQQNY的淀粉样蛋白形成标记物连接于醋酸艾塞那肽-4的C-末端，从而促进它聚集成可释放天然的醋酸艾塞那肽-4单体的低聚络合物，如同上文中所报道的胰岛素的情况。醋酸艾塞那肽-4a与SIAI和SIAII一起用于动物受试者DM II治疗的辅助治疗。
本发明还提供了超分子降钙素组装体作为治疗切除卵巢的大鼠骨质疏松症的潜在治疗候选药物的用途。详细信息在实施例24中给出。将超分子降钙素组装体或SCA合并在Alzet泵中，降钙素可以从该Alzet泵中缓慢而连续地释放到血液中。降钙素的这种缓慢释放缓解了骨质疏松症的症状，维持了正常体重以及血清钙和磷水平。
配制1和2mg/ml鲑鱼降钙的PBS溶液，并在37℃下温育80小时。以不同的时间间隔测量400nm处的混浊度，监测降钙素淀粉样蛋白原纤维形成的动力学。如图29所示，原纤维形成速率是浓度依耐性的并在44h之后基本完成。SCA-I、SCA-II和SCA-III分别在6、8和12小时形成。
在1ml恒定体积中的2％甘露醇中并通过透析膜透析来监测SCA中降钙素的释放。该释放通过275nm处的吸光度来监测。如图30所示，1ml恒定体积的SCA中降钙素的释放遵循钟形曲线，该曲线类似于超分子胰岛素组装体的曲线。但是在通过膜透析的情况下观察到连续释放，其类似于SIA中胰岛素的释放。完全长成的降钙素纤维中降钙素的释放非常缓慢，并且对于后续实验来说可以忽略不计。该降钙素SCA进一步用于治疗切除卵巢的大鼠骨质疏松症的体内实验。
如实验部分中所述，给予五组大鼠不同的处理(每组中10只大鼠)。监测钙、磷和降钙素的体重和血清曲线。确定了Alzet中的用SCA处理的切除卵巢大鼠的SCA中鲑鱼降钙素和对照组大鼠中内源大鼠降钙素的释放动力学曲线，它们示出在图31中。与其他组相比，用SCA处理的大鼠中的降钙素水平维持在相对较高的水平。这表明Alzet泵中降钙素SCA溶液以恒定且缓慢的速率释放生物活性形式的降钙素，与每日用可溶性降钙素的治疗相比，该降钙素又可治疗OVX大鼠的骨质疏松症症状长达60天。
监测了该四组大鼠的最终体重。四组中的大鼠在该研究过程中体重增加。在8周的研究结束时，载体处理的OVX大鼠的体重比载体处理的对照大鼠重约11％(328±19g vs.296±09g，p＜0.05)。与载体处理的OVX大鼠相比，间歇地用CT处理或连续地用SCA处理的OVX大鼠的平均体重显著减少。
血清生化数据在表3中列出。在8周期间和结束时，测量所有组中用SCA处理的OVX大鼠的血清CT浓度，其显著高于载体处理的OVX大鼠的血清CT浓度，但并不比对照组高。用SCA处理的OVX大鼠的平均血清钙水平显著小于所有其他组的。载体处理的OVX大鼠的平均血清磷水平相对于载体处理的对照大鼠的也显著增大。相反，SCA的情况下，与载体处理OVX大鼠相比，用CT间歇或连续处理的OVX大鼠的血清磷浓度显著降低。此外，用SCA处理的OVX大鼠的变异性显著低于用CT间歇处理的OVX大鼠。
在所有组中筛选抗鲑鱼降钙素的抗体，结果显示在对照组、载体处理和降钙素SCA处理的大鼠的情况下抗体可忽略不计。但是，在降钙素处理的组(间歇或连续)中，存在较低水平的抗鲑鱼降钙素的抗体。
本发明还提供了肽标记的超分子布洛芬组装体作为治疗关节炎和关节炎疼痛的潜在治疗候选药物的用途。详细信息在实施例25中给出。
关节炎是一种非常重要的临床病症并且对于中老年人而言尤其是常见的致残疾病。非甾体抗炎药(NSAID)广泛用于治疗疼痛、发热和包括骨关节炎在内的炎性病症。目前，对这种障碍的治疗是并不令人满意，常用的药物具有许多毒副作用且大部分仅是起到缓解的作用(palliative)。角叉菜胶诱发的关节炎产生急性炎症，其可通过皮质类固醇和血管收缩剂而受到抑制。膝关节骨性关节炎利用关节炎的KC模型，通过将高岭土和角叉菜胶注射到膝关节滑膜腔中产生。将雄性wistar大鼠分成五组，在其中的四组中利用高岭土/角叉菜胶(KC)诱发关节炎。将PBS注射到对照组中。半小时之后，分别口服和腹膜内基于各种剂量的布洛芬(10和50mg/kgb wt)和布洛芬-TTR。在1小时后，将大鼠放置在热板痛觉测量器上，并监测它们舔爪子的潜伏期。注射PBS的对照大鼠在约6-7秒内通过舔爪子对该热量作出反应(图32a)。注射KC的大鼠极其敏感，无法承受该热量多于3-5秒。相比之下，对于口服给予布洛芬的那些大鼠，10mg/kg b.wt布洛芬可使其忍受该热量长达12秒，而50mg/kg b.wt布洛芬可使其忍受长达17秒。对于腹腔内注射给予超分子布洛芬-TTR组装体的大鼠，潜伏时期约为15秒。由超分子组装体缓慢而连续释放的布洛芬甚至更明显，在连续几天内，该大鼠仍表现出舔爪子的潜伏期为约12-16秒而不需第二次给予该药物(图32b)，而布洛芬需要每日注射以观察它对该大鼠的影响。超分子布洛芬-TTR组装体的影响持续长达3-4天，如通过潜伏时间的锐减所指示的(图32b)。
通过将角叉菜胶注射到大鼠爪子中引起的炎症引发水肿。大鼠爪子体积增大的测量是监测关节炎期间引起的炎症的有效方法。对照和经处理的大鼠爪子体积利用水器官充满度测量器(hydroplethysmometer)，通过减去注射KC之前爪子的基础体积测得。当用PBS处理角叉菜胶对照组时，观察到爪子的体积急剧增加，将近增大了0.8-0.92ml(图33)。对于用超分子布洛芬-TTR组装体处理的那些大鼠，爪子体积的增加相对较少(0.4ml)，并且在第四天才开始增加，这表明随着药物布洛芬的释放消耗储存体。然而，对于组III(groupie and III)，必须每日注射布洛芬以防止大鼠爪子体积的急剧增加，其中50mg/kg b.wt更有效。该数据表明仅通过单次注射该络合物，超分子布洛芬-TTR组装体就可以有效缓解关节炎症状长达3-4天。
因而，本发明不仅包括诸如I型和II型糖尿病的代谢疾病，并可进一步扩展到需要连续输注肽、蛋白质或小药物分子治疗剂的所有疾病，如慢性疼痛、败血症、关节炎、骨质疏松症、炎症等。本发明还讨论了利用胰岛素低聚体(SIAI、SIAII和SIAIII)治疗DM I、DM II和临界糖尿病的适用性。这种利用药物低聚体作为治疗储存体的方法可以扩展到更多的疾病，其具有全面、广谱适用性。
包含在本发明中的以下实施例是为了说明本发明，因而不应当被解读为限制本发明的范围。
实施例
应当理解，本文描述的实施例仅仅是为了说明，本领域技术人员根据本说明书可以联想到各种修改或改变，并且这些修改或改变都包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。
实施例1
胰岛素原纤维形成
将2mg/ml牛胰岛素和rH胰岛素溶解在磷酸盐缓冲盐水(50mM，pH7.0)或pH 2.0(盐酸水溶液)中，并在180rpm不断搅拌的条件下在37℃下温育72小时-7天。利用通过硫磺素T(Th-T)获得的荧光来监测原纤维形成动力学。
实施例2
硫磺素T荧光
在Jobin Yvon Fluoromax荧光光谱仪上，分别利用3nm和5nm狭缝宽度进行激发和发射，测量Th-T荧光。在450nm处激发用50μM Th-T温育15分钟的样品，并在460-560nm范围内监测它们的发射。利用下面的等式校正数据的空白和内滤效应，Fc＝F antilog[(Aex+Aem)/2]
其中Fc是校正的荧光，F为测量的荧光，Aex和Aem分别为反应溶液在激发和发射波长处的吸光度。
通过牛胰岛素和rH胰岛素在37℃下的原纤维形成动力学曲线在图1中示出。图1(a)示出了用50μM Th-T荧光监测的在pH 7.0下原纤维形成动力学曲线。
实施例3
在pH 2.0和pH 7.0下形成的中间体和完全形成的原纤维的体外单体释放动力学
在不同时间点从在pH 2.0和pH 7.0、37℃下的胰岛素原纤维形成反应液中取出200μl(等于400μg胰岛素)等分试样。通过离心分离获得超分子胰岛素组装体中间体。用PBS清洗所获得的片状沉淀，并在eppendorf(艾本德微量离心管)中将其重悬浮于1ml PBS中。除去含有该中间体的eppendorf盖，并用截留值为12kDa的透析膜密封。然后通过eppendorf的膜侧将其插入到50ml Falcon管中，该Falcon管包含0.02％叠氮化钠的20ml PBS，并在不断搅拌下持续15天监测胰岛素释放动力学。在280nm处利用分光光度法并通过它的内在(酪氨酸)荧光来监测释放动力学。计算每小时释放的胰岛素的量。图2a提供了超分子胰岛素组装体II中间体中胰岛素的体外释放，其是通过280nm处的吸光度和内在酪氨酸荧光监测的。还给出在0h和15天透析膜内侧溶液的Th-T强度。
为了研究不同中间体的释放曲线，每隔一定时间从原纤维形成过程中取出在pH 2.0和pH 7.0、37℃下的小等分中间体和完全形成的淀粉样蛋白原纤维，并将其在10,000rpm下离心10分钟。除去上清，用PBS清洗该沉淀两次之后，将其重悬浮在新鲜的PBS中。在37℃下用分光光度法在280nm处监测单体胰岛素的释放。在两种不同条件下研究了释放动力学。在一种条件下，将该沉淀物悬浮在PBS中，并在不断搅拌的情况下在20ml PBS中通过截留值为12kDa的膜透析(图2a-图2c)。在第二种条件下，将所获得的沉淀物悬浮在1ml PBS中并在280nm处读取上清液的吸光度(图2d)。
实施例4
刚果红结合
利用以下等式，刚果红结合/L的淀粉样蛋白悬浮物摩尔数＝A540nm/25295-A477nm/46306，按照此前的报道(Klunk，W.E.，Jacob，R.F.&Mason，R.P.Quantifying amyloid by Congo red spectral shift assay.Methods Enzymol 309，285-305(1999))来评价结合到胰岛素低聚体/淀粉样蛋白的刚果红量。
图3提供了用天然胰岛素、超分子胰岛素组装体II、超分子胰岛素组装体III和淀粉样蛋白胰岛素进行的刚果红结合研究。
实施例5
酪氨酸荧光
在270nm处激发0.2ml石英比色皿中在不同时间间隔取出的超分子胰岛素组装体透析液，并在320至370nm之间记录发射。5nm狭缝宽度用于激发和发射。图2(a)提供了通过280nm处的吸光度和内在酪氨酸荧光监测的超分子胰岛素组装体II中胰岛素的体外释放。还示出在0h和15天透析膜内溶液的Th-T强度。
实施例6
傅里叶变换红外光谱(FTIR)
用配备有液氮冷却的汞镉碲检测器的Bruker Tensor 27台式FTIR光谱仪记录IR光谱。在Bio-ATR上分析胰岛素样品，并在室温下记录2cm-1分辨率的256干涉图。对于每个光谱，扣除水蒸气并进行基线校正。
SIA I、II和III也利用ATR-FTIR表征。观察到对应于每个阶段的不同光谱(图1d)。
牛胰岛素和rH胰岛素的超分子胰岛素组装体I、II和III也利用ATR-FTIR表征。观察到对应于每个阶段的不同光谱(图4)。在原纤维形成期间观察到IR条带向较低频率迁移。超分子胰岛素组装体II(SIA-II)分别在1647cm-1和1645cm-1处具有牛胰岛素和rH胰岛素的尖峰，而对于同一超分子胰岛素组装体II，完全形成的淀粉样蛋白峰出现在1630cm-1和1628cm-1。FTIR光谱与CR数据具有良好的一致性，表明SIA-II的构象仍主要是螺旋结构，但无规卷曲结构的含量增加。
实施例7
原子力显微镜(AFM)
选用Picoplus原子力显微镜(Agilent Technologies)的磁声MAC(接触)模式成像。利用MAC悬臂型II(悬臂弹簧常数：2.8N/m，频率：59.722kHz)，在包含无样品(bare)云母表面的空气中或包含样品的云母中记录图像。在不同时间点从原纤维形成反应混合物中取出样品，用水稀释20倍并固定在新切开的云母表面上2分钟。用超纯水(nanopure water)清洗该样品，在N2下干燥并进行AFM分析。
图5提供了通过原子力显微镜研究的超分子胰岛素组装体中间体和胰岛素原纤维的形态。图5(a)胰岛素单体(b)超分子胰岛素组装体-I中间体，pH 7.0，(c)超分子胰岛素组装体II，pH 7.0，(d)超分子胰岛素组装体中间体III，pH 7.0，(e)人SIA I，(f)人SIA-II，(g)人SIA-III，和(h)在pH 7.0下完全形成的原纤维，(i)提供在6小时，pH 2.0，37℃下形成的超分子胰岛素组装体中间体，(j)提供了在pH 2.0下完全形成的淀粉样蛋白原纤维。
实施例8
透射电镜(TEM)
为了TEM研究，因此涡旋样品，并立即将其吸附到fomber-涂覆的300目铜网上或用mili-Q水稀释1：2-20倍，并用去离子水清洗。在3％的醋酸双氧铀(Uranyl Acetate)中温育该网2-5分钟并在红外光下干燥，以便通过负染法检查该样品。用Phillips CM-10在80kV下使该网可视化。利用MegaView III照相机捕获图片并利用Imaging System Phillips的成像软件进行分析。图6提供了胰岛素原纤维和超分子胰岛素组装体的负染TEM照片，其中6(a)提供了超分子胰岛素组装体I中间体，pH 7.0，图6(b)提供了超分子胰岛素组装体II，pH 7.0，图6(c)提供了超分子胰岛素组装体中间体III，pH 7.0，图6(d)提供了在pH 7.0下的成熟纤维，图6(e)提供了在pH 2.0，37℃下形成的纤维。
实施例9
糖尿病的大鼠模型
选用九周龄、体重为210±10g的雄性Wistar大鼠(Rattus norvegicus albinus，Rodentia mammalia)。将大鼠饲养在市售的聚丙烯笼中，并将其保持在受控制的12小时亮-暗循环的温度条件下，允许其自由进食或饮水。
诱发大鼠糖尿病的链脲佐菌素模型
将体重为250-300g的雄性Wistar大鼠分成四组，利用Roche Accu葡萄糖试条完成血糖的评价。使大鼠禁食48小时。向10-20只大鼠腹膜内给予在柠檬酸盐缓冲液(pH 4.5)中新配制的50mg/kg b.wt链脲佐菌素。立即提供食物，并在3天之后检查血糖水平。根据血糖水平对这些动物进行分组(组I：250-350mg/dl、组II：350-450mg/dl和组III：＞450mg/dL)。用2-6U/kg体重(b.wt)的牛胰岛素维持高血糖水平1周。STZ注射后5天，所有STZ-处理的大鼠都患有高血糖症(血糖水平＞250mg/dl)，并利用大鼠血清固体酶联免疫吸附测定(ELISA)(Mercodia)量化它们的血清胰岛素水平。将葡萄糖＞250mg/dL且血清胰岛素水平可忽略(～0.08ng/ml)的大鼠视为患有糖尿病并用于该实验。
实施例10
超分子胰岛素组装体处理
在用胰岛素维持高血糖水平一周之后，将该大鼠分成三组，每组包含5只大鼠。每天向组I的大鼠腹膜内给予单剂量的4U/kg b.wt牛胰岛素。每日对组II的大鼠注射两次4U/kg b.wt胰岛素。用100μl PBS中的200μg超分子胰岛素组装体II(皮下和肌内)处理组III的大鼠，并用100μl PBS处理组IV的大鼠，该组IV的大鼠构成糖尿病对照组。注射100μl PBS的5只正常大鼠的组用作非糖尿病对照组。起初每天检查体重以及禁食8-10小时后的餐前血糖水平和餐后血糖水平，然后降低频率。图7示出了葡萄糖体内稳态中超分子胰岛素组装体(可替代的淀粉样蛋白前体胰岛素)的体内效能。(a)响应于皮下和肌内给药的各种超分子胰岛素组装体-II(牛)剂量的血糖水平。(b)响应于皮下和肌内概要的各种超分子胰岛素组装体-II(r-人)剂量的血糖水平。
图8示出了在给予牛SIA-II后135天的时间段内监测的餐后血糖水平(a)牛胰岛素，(b)rH胰岛素。图9示出了在给予人SIA-II后160天的时间段内监测的餐前血糖水平(a)牛胰岛素，(b)rH胰岛素。图10示出了在pH 2.0和pH 7.0下形成的胰岛素淀粉样蛋白施用之后监测的血糖水平。图11示出了SIA-II处理的糖尿病大鼠、糖尿病对照和非糖尿病对照大鼠的体重曲线。
实施例11
腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)
使STZ处理的大鼠(n＝12)和正常大鼠(n＝4)禁食12小时。按照上面所述的，监测血糖水平。完成葡萄糖耐量试验。简言之，向动物腹膜内输注3g/kg体重的葡萄糖，接着为组I的大鼠注射4U/kg b.wt牛胰岛素，为组II的大鼠注射100μl淀粉样蛋白胰岛素并为组III的大鼠注射100μlPBS(载体)。在处理之后的0、30、90、150、270和330分钟监测血糖水平。分离出各个时间点的血清，绘制血糖水平和时间之间关系的图表。图12提供了腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)的血糖曲线。
实施例12
血清胰岛素量化
从采集并在进一步分析之前储存在-20℃下的血液样品中分离出血清。牛胰岛素和大鼠胰岛素水平利用Mercodia(瑞典)的固相双位酶免疫测定法(ELISA)按照制造商方案进行量化。图13(a)提供了在对SC或IM注射的超分子胰岛素组装体作出反应的STZ处理的大鼠中，利用ELISA对血清人和牛胰岛素的量化，13(b)提供了IPGTT的血清牛胰岛素量化，13(c)提供了对IPGTT实施的牛血清大鼠胰岛素ELISA。
实施例13
I125标记的胰岛素：
为了进一步验证和量化胰岛素SIAII末端的体外释放，用125I来标记胰岛素(Pause，E.，Bormer，O.& Nustad，K.Radioiodination of proteins with the iodogen method，in RIA and related procedures in medicine，international atomic agency，Vienna，161-171(1982))。由标记的胰岛素形成的超分子胰岛素组装体的比活性为49912CPM/ml/μg。皮下和肌内注射50μl超分子胰岛素组装体(4991200CPM)，并监测血糖水平，在0、30min、1h、4h、10h、24hrs，之后每天一次，然后每隔一日或每周一次地采集血清样品。测量每毫升血清中的数值(图14a)。如图14b所示，血糖分布与用未标记的SIA II所观察到的相同。当对处理天数作图时，计算出的CPM/ml仍然几乎是恒定的(图14a)。但在30分钟-4小时存在初始高数值(initial high count)，然后在10小时内逐渐减小到2000-3000的恒定水平。计算出血液中释放的胰岛素量，该量在0.5-1.2ng/ml范围内，其对应于如用ELISA观察到的血清中胰岛素的基础水平或略超过基础水平(图14b)。为了进一步证明超分子胰岛素组装体释放的胰岛素是单体的，在tricine-SDS-PAGE(H.& Von Jagow，G.Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1to 100kDa.Anal Biochem 166，368-379(1987))上分析不同时间点的血清，并利用磷屏成像器形成射线照片。如图15所示，当装入等量的血清时，血清的条带对应于游离胰岛素单体且其强度长期保持恒定。在20天后观察到强度减小，表明在一段时间内超分子胰岛素组装体储存体的使用和消耗以及放射性标记物自身衰减的一些影响。
实施例14
在用超分子胰岛素组装体II处理之后的高血糖测试
将雄性Wistar大鼠麻醉(异氟烷2％)并安装颈动脉和颈静脉导管从而能够进行抽血和葡萄糖注射(20％葡萄糖溶液)以600mg/dL测试血糖水平。在12小时的禁食时期之后，在所有组中输注葡萄糖从而使它们发生高血糖。在这之后，以对血糖测量指定的时间间隔抽血，并计算保持它们高血糖的葡萄糖输注速率。在给予SIA II 1个月和3个月之后重复这个程序(图16a-图16c)。
实施例15
大鼠脂肪细胞的分离和原代培养
根据
Figure BDA0000036675560000501
等人(P.，Karlsson，M.，Pettersson，P.&Sypniewska，G.Differentiation and function of rat adipocyte precursor cells in primary culture.J.Lipid Res.21，714-723(1987))描述的方法分离和培养大鼠脂肪细胞。处死自由喂养的雄性Wistar大鼠，切开附睾脂肪组织并收集在试剂A(HBSS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和50μg/L庆大霉素)中。在HBSS中适当地清洗该组织。在这之后，切割该组织，细细剁碎，并转移到falcon中，以2分钟200g的速率离心。除去透明的油层，在烧瓶中加入脂肪细胞层(稠且密度大)至三倍于试剂B(含0.1％BSA的试剂A和1mg/ml胶原酶)的体积。在37℃下温育该烧瓶60分钟，并不断地缓慢振荡。通过添加三倍于该体积的DMEM完全培养基(含有HEPES 15mM、glc、0.1％BSA、50nM腺苷和1％胎牛血清)终止该反应，并在室温下温育5分钟。将该反应液转移到falcon中，并以10分钟200g的速率离心。弃去顶油层之后收集脂肪细胞，并利用试剂A以10分钟200g的速率离心清洗二次。将细胞分散到含有适当体积的DMEM完全培养基的烧瓶中，并在37℃下温育24小时。为了产生胰岛素信号，离心脂肪细胞，并在植入约2ml到6孔培养板中之前将其维持在无血清培养基中12小时，并进一步温育2小时。
实施例16
总细胞裂解液的蛋白质印迹分析
板内细胞(Plated cell)用20nM胰岛素、50μl超分子胰岛素组装体，以及用胰岛素、超分子胰岛素组装体和PBS处理的大鼠体外释放的胰岛素(单体)或该大鼠的50μl血清温育10分钟。温育之后，将该细胞收集在falcon管中并以10分钟200g的速率离心。将脂肪细胞的顶层收集在eppendorf中，并保存在冰中。加入500μl裂解缓冲液(20mM Tris pH 8.0、1％NP 40、137mM NaCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM DTT、10％甘油、1mM PMSF、0.4mM原钒酸钠和蛋白酶抑制剂混合物)，并将该样品在-80℃冷冻2小时。在这之后，在4℃下解冻并温育4小时，并不断地转动。在13000rpm下离心30分钟之后收集上清液，并利用Bradford试剂评价细胞裂解液中的蛋白质浓度。将50微克细胞总蛋白施加到每个泳道中，在10％SDS-PAGE上分离，并在4℃下过夜利用Bio-rad湿转移装置转移到硝酸纤维素膜中。转移之后，除去印迹，并用丽春红S(Ponceau-S)染色以便使转移带可见，并进一步用水脱色。在37℃下用pH 7.4的PBS中的5％脱脂乳阻塞该膜1小时，清洗并然后在4℃下在PI3K、p-Akt、总Akt、p-Gsk3β、Gsk3β、ERK1/2、GAPDH和β-肌动蛋白(细胞信号抗体)的一抗(primary antibody)(利用PBS中的1％脱脂乳进行1∶1000稀释)中温育过夜。在用PBST清洗之后，在各二抗(HRP结合的)中温育该印迹1hr，并使用ECL蛋白质印迹方案(Amersham)使免疫活性带可见。图17提供了用于胰岛素信号级联的培养的脂肪细胞的蛋白质印迹(WB)分析。如指出的，该脂肪细胞用(a)PBS、胰岛素、SIA-II、由SIA-II释放的胰岛素处理，(b)血清处理，并用于胰岛素信号分析。
实施例17
组织学和免疫组织化学
给大鼠注射200μg胰岛素SIA-II或150μg来自大肠杆菌(Sigma-Aldrich，MO，USA)的脂多糖(LPS)，分别通过肌内或皮下注射到大腿肌肉和背部皮肤中。在注射48小时之后处死注射了LPS的大鼠，而从1至12周监测注射胰岛素SIA-II的大鼠，并每隔7天切除组织切片。用开他敏(ketamine)麻醉大鼠，并灌注4％的低聚甲醛。取出皮肤和大腿肌肉，并切除注射部位。然后处理该组织用于石蜡包埋，并径向(sagitally)切下10μm厚度，并进一步进行常规的苏木精-曙红染色(H&E)处理以观察组织学特点和炎性细胞浸润、刚果红染色(Lee，G.& Luna，H.T.Manual of Histologic staining methods of armed forces institute of pathology.3rd Ed.McRaw-Hill book company(1960))以便确定是否存在残留的SIA-II，和具有抗CD11b、RT-1A、和CD6的抗体(BD Pharmigen，CA，USA)的免疫组织化学特点(Sanz MJ，Marinova-Mutafchiev L，Green P，Lobb RR，& Feldmann M，Nourshargh S.IL-4-induced eosinophil accumulation in ratskin is dependent on endogenous TNF-alpha and alpha 4integrin/VCAM-1adhesion pathways.J Immunol.160，5637-5645(1998))。所有免疫荧光切片永久地与不变色试剂+固定介质(分子探针，Eugene，Oregon，美国)一起固定，并在荧光下观察结合FITC的抗体。CR和H&E染色切片与citramount介质(Polysciences，PA，美国)一起固定。在亮光(bright light)下观察H&E切片，而在亮光和偏振光(Nikon Eclipse 80i，Nikon，日本)下观察CR染色的切片。利用DS SMc CCD照相机捕获图像，并通过NIS-Element软件(Nikon，日本)进行分析。
实施例18
诱发大鼠糖尿病的四氧嘧啶模型
将体重为250-300g的雄性Wistar大鼠分成四组，利用Roche Accu葡萄糖试条完成血糖的评价。使大鼠禁食24小时。向10-20只大鼠腹膜内给予在柠檬酸盐缓冲液(PH 4.5)中新配制的150mg/kg b.wt四氧嘧啶。立即提供食物，并在3天之后检查血糖水平。根据血糖水平对这些动物进行分组(组I：250-350mg/dl、组II：350-450mg/dl和组III：＞450mg/dL)。用2-6U/kg体重(b.wt)的牛胰岛素维持高血糖水平1周。注射后5天，所有四氧嘧啶-处理的大鼠都患有高血糖症(血糖水平＞250mg/dl)，并利用大鼠血清固体酶联免疫吸附测定(ELISA)(Mercodia)量化它们的血清胰岛素水平。将葡萄糖＞250mg/dL且血清胰岛素水平可忽略(～0.08ng/ml)的大鼠视为患有糖尿病并用于该实验。
实施例19
检查的临床参数实例
实施生物化学测定，以便评价超分子胰岛素组装体处理的毒性。利用印度默沙东(Merck)公司的测定试剂盒，评价血清谷草转氨酶(SGOT)、血清谷丙转氨酶(SPGT)、总胆红素、胆红素、碱性磷酸酶、血清总蛋白、血清白蛋白、血清球蛋白、血清A/G比率、肾机能试验(KFT)、白内障形成、脂肪组织重量、体重和外部特征。表1提供了用于评价胰岛素SIAII毒性的临床参数。在三个月研究结束时采集从血液样品中分离的血清，并对其进行表中指出的各种试验。结果为三个不同试验的平均值±s.d.，每组中有n＝4只动物。
实施例20
血清中抗胰岛素抗体和胰岛素降解酶(IDE)的检测
实施间接ELISA，以便通过遵循标准的ELISA方案检测大鼠血清中的抗胰岛素抗体。实施间接ELISA，以便通过遵循标准的ELISA方案检测大鼠血清中的抗胰岛素抗体。简言之，将200μl 2mg/ml牛胰岛素在50mM pH 9.6的碳酸盐缓冲液中的溶液涂布在96孔ELISA板上，并保持在4℃下过夜。PBS中的5％BSA用于在37℃下阻断1小时。该板然后用PBST(0.02％的吐温20)清洗，加入2003l 1∶100稀释的血清，并在37℃下保持1hr。在用PBST进行再一轮清洗之后，加入1∶10000稀释的抗大鼠IgG-HRP结合的二抗(2°抗体)，并在37℃下温育2小时。利用TMB作为底物形成颜色，并加入浓H2SO4终止反应。在450nm处用分光光度法读板。抗胰岛素抗体用作该反应的阳性对照。利用Insulysin/IDEInnoZymeTM免疫捕捉活性测定试剂盒(Calbiochem)按照制造商方案量化血清中的IDE。试剂盒中提供的大鼠IDE充当阳性对照。
细胞增殖测定：
在含10％PBS的常规DMEM培养基中，按照10,000细胞/孔，将细胞置于24-孔板中。将细胞换成无血清培养基，持续12h，然后按照图例中指出的进行处理。所有处理重复三次。在处理3天后测量生长量。通过MTT测定法评估生长量。向每个孔中加入总共50μl的5mg/ml MTT在PBS中的溶液。在37℃下温育4h之后，用500μl增溶溶液(20％SDS、50％DMSO)溶解甲
Figure BDA0000036675560000531
(甲臜，formazan)晶体。利用670nm差接滤波器(differential filter)，在570nm处通过平板读数器(Plate Reader)测量吸光度。
实施例21
诱发糖尿病大鼠的链脲佐菌素模型
使用12-16周大的近交系C57BL/6雄性小鼠。每天给小鼠腹膜内注射50mg/kg b.wt的链脲佐菌素，持续5天。在2周之后评价血糖水平。血糖水平＞300mg/dl的小鼠视为患有糖尿病，并选用于进一步实验中。总共制作六组，每组均由六只小鼠组成。向小鼠皮下或肌内给予各种剂量的牛/人胰岛素SIA-II，如10μl、25μl、50μl和100μl，从而利用链脲佐菌素致使小鼠患上糖尿病，另两组充当糖尿病和非糖尿病组。空腹和饱腹血糖水平都利用Roche Accu葡萄糖试条检测。
实施例22
诱发糖尿病家兔的链脲佐菌素模型
使用体重在1000至1200g之间的雄性新西兰家兔。将动物在控制的湿度、温度(22±2℃)以及12h亮和暗循环的条件下饲养。该实验方案和动物处理满足印度新德里国家免疫学研究所(National Institute of Immunology，New Delhi，India)动物伦理委员会制度相一致。为了诱发实验性糖尿病，使所用的家兔禁食12小时，接着施用在pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液中配制的80mg/kg b.wt链脲佐菌素。3天后检测血糖水平。表现出BGL＞450mg/dL的家兔被认为患有糖尿病，并将家兔进一步分为三组，每组三只。组I-正常健康的家兔，组II-用胰岛素处理的糖尿病家兔，组III-用SIA-II(SC)处理的糖尿病家兔，和组IV-用PBS处理的糖尿病家兔。
实施例23
诱发Wistar大鼠II型糖尿病的模型及其利用SIA进行的处理
使用7周龄、重约200g的雄性Wistar大鼠用于所有的研究。饲喂动物由12％脂肪、60％碳水化合物和28％蛋白质组成(占总kcal的百分比)的普通食物，或者由40％脂肪、41％碳水化合物和18％蛋白质组成的高脂食物。在饲喂任一种食物2周之后，在整夜禁食之后为动物(除了未注射的对照组)注射STZ(50mg/kg)，该STZ经由暂时插入的24-号(gauge)导管进入尾静脉。在STZ注射之后，动物可以自由采食和饮水，继续为注射STZ和未注射的动物给予初始食物(普通或高脂)，以便持续本研究。将胰岛素SIA，或胰岛素SIA与醋酸艾塞那肽4a一起皮下给予具有高血糖水平的动物，其中PBS用作载体。采集血液，并通过离心分离出血清，分析葡萄糖浓度(葡萄糖试条，Accucheck，Roche)、胰岛素(胰岛素Elisa试剂盒，Mercodia)、甘油三酸酯(TG)(甘油磷酸氧化酶[GPO]-Trinder方法，Sigma)和游离脂肪酸(酰基辅酶A合成酶[ACS-ACOD]方法，WakoDiagnostics，Richmond，VA)。
实施例24
降钙素原纤维形成
在PBS中配制1和2mg/ml的鲑鱼降钙素，并在37℃下温育80小时。通过以不同的时间间隔测量400nm处的混浊度，监测降钙素淀粉样蛋白原纤维形成的动力学。如图29所示，原纤维形成的速率是浓度依耐性的，并在44小时后基本完成。SCA-I、SCA-II和SCA-III分别在12、22和28h形成。
超分子降钙素组装体中降钙素的体外释放
在1ml恒定体积中的2％甘露醇中并通过透析膜透析，监测SCA中降钙素的释放。该释放通过275nm处的吸光度来监测。如图30所示，在1ml恒定体积中，SCA中降钙素的释放遵循钟形曲线，类似于胰岛素。但是在通过膜透析的情况下观察到连续释放，而且类似于SIA中胰岛素的释放。完全长成的降钙素纤维中的降钙素释放非常缓慢，并且对于进一步实验来说可以忽略不计。该降钙素SCA进一步用于治疗切除卵巢的大鼠骨质疏松症的体内实验。
利用降钙素治疗骨质疏松症的方法
在研究开始时，将44只约90天大、平均体重为230g的雌性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratory，Wilmington，MA)分成四组。腹膜内注射剂量分别为50和10mg/kg体重(BW)的开他敏盐酸盐和赛拉嗪(xylazine)将所有的大鼠麻醉。在来自背部方法(dorsal approach)的三组中，执行双侧卵巢切除术。将所有大鼠单独在25℃、12h亮/12h暗的循环下饲养。将切除卵巢的(OVX)大鼠的食物消耗量限制于对照大鼠的食物消耗量，从而将与卵巢切除关联的体重增加减至最低。所有大鼠用载体或人/鲑鱼CT(Sigma)处理8周，通过间歇地皮下注射或连续地通过Alzet渗透压微泵(Model 2ML4；Alza Corp.，Palo Alto，CA)来给予，该渗透压微泵含有2％甘露醇中的200μl CT(4μg/kg)或SCA(超分子降钙素组装体)(2mg/ml)，其设计用于以2.5μl/h的恒定速率递送溶液28天。该间歇处理在术后一天开始。用于连续CT或降钙素SCA或载体处理的微泵在手术时(0天)植入，在连续CT和载体处理的情况下在3周之后替换。但是，在这个期间注射的SCA形成了储存体，该储存体持续释放降钙素长达约6-8周。对于CT的皮下注射，将激素溶解在2％甘露醇的载体中。基于OVX大鼠先前研究获得的阳性结果，选择16IU/kg(4μg/kg)体重的剂量。
隔天，为这个组中的一半OVX大鼠皮下注射作为载体的2％甘露醇。在这个组中其余的OVX大鼠中皮下植入用于连续输注载体的Alzet渗透压微泵。因为在用载体间歇或连续处理的OVX大鼠之间未观察到骨变量(bone variable)的统计学显著差异，所以合并来自这些亚组的数据。
隔天为一个组中的每只OVX大鼠皮下注射16U/kg BW(4μg/kg bwt)剂量的鲑鱼CT，并且在另一组大鼠中皮下植入用于连续输注载体的Alzet渗透压微泵。通过微泵递送到每只大鼠的每日剂量为8U/kg BW(2μg/kg BW)，这等效于隔天通过皮下注射给在前组的剂量(16U/kg)。
血清样品储存在-80℃下，直至利用市售试剂盒(Bio-Merica)通过免疫测定法分析它们的CT浓度。在我们先前的其中一个研究中，这种试剂盒成功地用于测量大鼠的血清鲑鱼CT。15个血清样品液通过甲酚酞络合剂和钼酸铵比色法，分光光度法分析它们的钙和磷含量(表3)。图31示出了由不同处理组中切除卵巢大鼠的血清中SCA-II释放的降钙素曲线。血清中的降钙素通过免疫测定试剂盒测量。
利用降钙素的单克隆抗体通过间接ELISA监测在所有处理组中产生的抗鲑鱼降钙素的抗体。数据表示为平均值±每组的标准差(SD)。通过分析变化量来评价统计学差异。P＜0.05视为显著。
实施例25
肽与布洛芬利用EDC进行的共价结合
在含NaCl(0.15M)、pH为4.7-6.0的0.1MES中溶解TTR/GNNQQNY，从而将浓度调节为10mg/ml。在相同的缓冲溶液中溶解布洛芬从而结合，或以适当过量的方式直接加入到蛋白质溶液中。然后将EDC加入到上述溶液中，从而获得至少超过EDC 10倍的摩尔数。在室温下反应2-3小时。通过凝胶过滤纯化该结合物，或利用所选的缓冲液(0.01M磷酸钠，0.15MNaCl，pH 7.4)透析。
布洛芬组装体对关节炎的效果
挑选体重为180-220g的雄性Wistar大鼠，随意喂养。在适应环境四天之后，将该大鼠分成五组。组I-对照组、组II-布洛芬(10mg/kg b.wt.)、组III-布洛芬(50mg/kg b.wt.)、组IV-腹膜内注射的结合到转甲状腺素蛋白(TTR)或GNNQQNY的布洛芬，和组V-角叉菜胶对照。组II-V用氟烷(halothane)麻醉，通过用3％高岭土和3％角叉菜胶(0.1ml在无菌盐水中)的混合物关节内注射到右膝关节的滑膜腔中来诱发KC关节炎。然后，使该关节屈伸运动1分钟。在高岭土/角叉菜胶注射后半小时，如上文指出的处理动物，组II和II每日口服接受布洛芬注射。在热板试验中，在55℃下将每组中的大鼠放置在痛觉测量器上，并在处理后1小时(图32a)，之后的四天内每天(图32b)利用停表确定它们舔爪子的潜伏期。强加90-s的截止时间从而防止组织损伤。
爪子水肿的测量
利用水器官充满度测量器(model 7150，Ugo Basile，意大利)，在高岭土/角叉菜胶注射之前立即测量，以及此后在四天内每隔1小时测量爪子体积。结果表示为通过减去基础体积计算出的爪子体积(ml)的增加(图33)。
表1：评价胰岛素组装体II(SIA II)毒性的临床参数分析。
Figure BDA0000036675560000571
Figure BDA0000036675560000581
表3：体重以及降钙素、钙和磷
  组   体重   降钙素   钙   磷
  对照+VEH   296±09   14.6±2.9   10.0±0.1   6.7±0.6
  OVX+VEH   328±19   13.3±2.1   11.2±0.4   8.5±1.1
  OVX+CT   274±10   15.3±4.6   10.3±0.4   7.6±0.8
  OVX+CT(MP)   280±11   18.7±5.0   9.5±0.4   6.1±0.7
  OVX+SCA(MP)   276±0.9   19.1±4.2   9.3±0.3   6.0±0.6
数据表示为平均值±SD.p＜0.05OVX+SCAvs.OVX+VEH。

Claims (73)

1.一种用作蛋白质治疗剂的超分子蛋白质或肽组装体(SPA)，其用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍；或选自由骨质疏松症、关节炎、癌症、内毒素性休克组成的组中的慢性疾病，其中，所述组装体包含所述蛋白质或肽的不溶性和聚集的低聚体形式。
2.根据权利要求1所述的超分子蛋白质组装体，其中，所述蛋白质或肽选自由以下物质组成的组：胰岛素、胰高血糖素、降钙素、转甲状腺素蛋白(TTR)、人生长激素、凝血因子、白蛋白、人促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺素(HCG)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)、醋酸艾塞那肽-4和红细胞生成素，以及由肽GNNQQNY、NFGAIL、NFLVH、DFNKF和KFFE组成的组。
3.一种用作蛋白质治疗剂的超分子胰岛素组装体(SIA)，其用于治疗选自由1型、2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍，其中，所述组装体包含胰岛素的不溶性和聚集的低聚体形式。
4.一种用作蛋白质治疗剂的超分子胰岛素组装体(SIA)，其用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍，其中，所述组装体包含SIA I、SIA II、SIA III或其组合的胰岛素的不溶性和聚集的低聚体形式，其中，SIA I由具有珠状排列的胰岛素单体伸长簇组成，SIA II由具有珠状排列的胰岛素单体伸长簇的线性缔合体组成，而SIA III由约90％的SIA II组成，即胰岛素低聚体的密集的线性缔合体。
5.一种用作蛋白质治疗剂的超分子胰岛素组装体(SIA)，其用于治疗选自由1型和2型糖尿病及其并发症组成的组的代谢障碍，其中，所述组装体包含SIA II的胰岛素的不溶性和聚集的低聚体形式，其中，SIA II由珠状排列的胰岛素单体伸长簇的线性缔合体组成。
6.根据前述权利要求中任一项所述的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中，所述组装体在傅里叶变换红外光谱(FTIR)中的1647-1645cm-1处出现尖峰。
7.根据前述权利要求中任一项所述的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中，所述胰岛素是重组人胰岛素。
8.根据前述权利要求中任一项所述的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中，所述胰岛素是人、牛或猪胰岛素。
9.根据权利要求3所述的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中，所述组装体以每小时约0.2至0.6IU的速率在体外释放胰岛素单体。
10.根据权利要求3所述的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中，胰岛素的释放速率范围为0.1至5.4ng/ml，持续约7至180天。
11.根据权利要求5所述的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中，胰岛素的释放速率范围为0.5-1.5ng/ml，持续长达180天。
12.根据权利要求3所述的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中，所述组装体在给予对其有需要的受试者后维持接近血糖正常水平(120±30mg/dl)长达180天。
13.根据前述权利要求中任一项所述的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中，单剂量的所述组装体在给予对其有需要受试者后维持接近血糖正常水平(120±30mg/dl)长达180天，其中，所述剂量中的所述组装体浓度范围为25至750μg。
14.根据前述权利要求中任一项所述的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中，单剂量的所述组装体在给予对其有需要的受试者后维持接近血糖正常水平(120±30mg/dl)至少长达180天，其中，所述剂量中的所述组装体浓度范围为150至250μg。
15.根据前述权利要求中任一项所述的超分子胰岛素组装体(SIA)，其中，所述组装体在给药后释放胰岛素单体。
16.一种用作蛋白质治疗剂的超分子降钙素组装体(SCA)，其用于治疗骨质疏松症，其中，所述组装体包含降钙素的不溶性和聚集的低聚体形式。
17.根据权利要求16所述的超分子降钙素组装体(SCA)，其中，所述组装体在给予对其有需要的受试者后持续约55-60天释放降钙素。
18.根据前述权利要求中任一项所述的超分子蛋白质组装体，其中，所述组装体与小分子药物结合。
19.一种用作蛋白质治疗剂的超分子布洛芬组装体(SIbA)，其用于治疗关节炎和关节炎疼痛，其中，所述组装体包含肽标记的布洛芬的不溶性和聚集的形式。
20.根据权利要求15所述的超分子布洛芬组装体(SIbA)，其中，所述肽选自由GNNQQNY、NFGAIL、NFLVH、DFNKF和KFFE组成的组。
21.一种用作蛋白质治疗剂的超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)，其用于治疗糖尿病，其中，所述组装体包含醋酸艾塞那肽-4的不溶性和聚集的低聚体形式。
22.根据前述权利要求中任一项所述的超分子蛋白质组装体，其中，所述超分子蛋白质组装体是前药。
23.根据前述权利要求中任一项所述的超分子蛋白质组装体，其中，所述超分子蛋白质组装体是非细胞毒性的。
24.一种用作蛋白质治疗剂的药物组合物，其用于治疗选自由1型、2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍或选自由骨质疏松症、关节炎、癌症、内毒素性休克组成的组中的慢性疾病，其中，所述组合物包含治疗有效量的如权利要求1中所述的超分子蛋白质或肽组装体(SPA)。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中，所述蛋白质或肽选自由胰岛素、胰高血糖素、降钙素、GNNQQNY、转甲状腺素蛋白(TTR)、人生长激素、凝血因子、白蛋白、人促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺素(HCG)、IL-1RA、醋酸艾塞那肽-4、红细胞生成素和其他肽组成的组。
26.一种用于治疗选自由1型、2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的如权利要求3所述的超分子胰岛素组装体(SIA)。
27.一种用于治疗选自由1型、2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的如权利要求4所述的超分子胰岛素组装体(SIA)。
28.一种用于治疗选自由1型、2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的如权利要求5所述的超分子胰岛素组装体(SIA)。
29.一种用于治疗选自由1型、2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的如权利要求3所述的超分子胰岛素组装体(SIA)和如权利要求21所述的超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)。
30.一种用于治疗选自由1型、2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的如权利要求4所述的超分子胰岛素组装体(SIA)和如权利要求21所述的超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)。
31.一种用于治疗选自由1型、2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的如权利要求5所述的超分子胰岛素组装体(SIA)和如权利要求21所述的超分子醋酸艾塞那肽-4组装体(SEA)。
32.根据前述权利要求中任一项所述的包含超分子胰岛素组装体的药物组合物，其中，所述组合物在给药后持续约7天至180天释放胰岛素。
33.根据前述权利要求中任一项所述的包含超分子胰岛素组装体的药物组合物，其中，所述组合物在给予对其有需要的受试者后维持接近血糖正常水平(120±30mg/dl)约180天。
34.根据前述权利要求中任一项所述的包含超分子胰岛素组装体的药物组合物，其中，单剂量的所述组合物在给予对其有需要的受试者后维持接近血糖正常水平(120±30mg/dl)长达180天，所述组合物中的所述组装体的浓度范围为25至750μg。
35.根据前述权利要求中任一项所述的包含超分子胰岛素组装体的药物组合物，其中，单剂量的所述组合物在给予对其有需要的受试者后维持接近血糖正常水平(120±30mg/dl)长达180天，所述组合物中的所述组装体的浓度范围为150至250μg。
36.根据前述权利要求中任一项所述的包含超分子胰岛素组装体的药物组合物，其中，胰岛素释放速率范围为0.5-1.5ng/ml，持续至少长达180天。
37.一种用于治疗骨质疏松症的药物组合物，所述组合物包含如权利要求16所述的超分子降钙素组装体(SCA)。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中，所述组合物释放降钙素。
39.根据权利要求37所述的药物组合物，其中，所述组合物在给药后持续约55至60天释放降钙素。
40.根据权利要求37所述的药物组合物，其中，单剂量的所述组合物在给药后持续约55至60天释放降钙素，其中，超分子降钙素组装体(SCA)的浓度范围为15-20pg/ml。
41.一种用于治疗关节炎的药物组合物，所述组合物包含如权利要求19所述的超分子布洛芬组装体(SIbA)。
42.根据权利要求41所述的药物组合物，其中，所述组合物释放布洛芬标记的肽。
43.根据权利要求41所述的药物组合物，其中，所述组合物在给药后持续约3至6天释放布洛芬标记的肽。
44.根据权利要求41所述的药物组合物，其中，单剂量的所述组合物在给药后持续约3至6天释放布洛芬标记的肽，其中，布洛芬标记的超分子肽组装体(SIbA)的浓度范围为5至20mg。
45.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物可选地包含药用载体、添加剂或稀释剂。
46.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物通过肌内、口服或皮下给药。
47.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物通过能够释放所述组合物的装置给药，其中所述装置选自由泵、导管和植入物组成的组。
48.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，单剂量的所述组合物在给药后在长时间内释放所述蛋白质。
49.一种制备前述权利要求中任一项所述的超分子胰岛素组装体(SIA)的方法，所述方法包括：
a.在约25至60℃的温度下将胰岛素溶解在pH范围为约1.5至7.8的溶液中；和
b.在不断搅拌下温育上述溶液6至48小时的时间段以获得超分子胰岛素组装体(SIA)，其中SIA包含胰岛素的不溶性和聚集的低聚体形式。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述方法进一步包括
c.用PBS清洗所述SCA；和
d.将权利要求49的步骤(b)中所述的SIA重悬浮于PBS中。
51.根据权利要求49所述的方法，其中，所述时间段为10小时。
52.一种制备权利要求16所述的超分子降钙素组装体(SCA)的方法，所述方法包括：
a.在约25至60℃的温度下将降钙素溶解在pH范围为约4.0至8.0的溶液中；和
b.在不断搅拌下温育上述溶液6至48小时的时间段以获得超分子降钙素组装体(SCA)，其中SCA包含降钙素的不溶性和聚集的低聚体形式。
53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述方法进一步包括
c.用PBS清洗所述SCA；和
d.将权利要求51的步骤(b)中的所述SCA重悬浮于水或2％甘露醇中。
54.根据权利要求52所述的方法，其中，所述时间段为8小时。
55.一种制备权利要求19所述的超分子布洛芬组装体(SIbA)的方法，所述方法包括：
a.利用EDC和NHS使布洛芬与肽GNNQQNY共价结合；
b.在约25至60℃的温度下将肽标记的布洛芬溶解在pH范围为约3.5至7.6的溶液中；和
c.在不断搅拌下温育上述溶液8至96小时的时间段以获得超分子布洛芬组装体(SIbA)，其中SIbA包含肽标记布洛芬的不溶性和聚集的低聚体形式。
56.根据权利要求55所述的方法，其中，所述方法进一步包括
c.用PBS清洗所述SIbA；和
d.将权利要求53的步骤(b)中的所述SIbA重悬浮于PBS中。
57.根据权利要求55所述的方法，其中，所述时间段为32小时。
58.一种制备权利要求21中所述的超分子醋酸艾塞那肽组装体的方法，所述方法包括：
a.在约25至60℃的温度下将醋酸艾塞那肽-4溶解在pH范围为约2.0至7.6的溶液中；和
b.在不断搅拌下温育上述溶液6至192小时的时间段以获得超分子醋酸艾塞那肽组装体(SEA)，其中SEA包含醋酸艾塞那肽-4的不溶性和聚集的低聚体形式。
59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述方法进一步包括
c.用PBS清洗所述SEA；和
d.将权利要求55的步骤(b)中的所述SEA重悬浮于PBS中。
60.根据权利要求58所述的方法，其中，所述时间段为148小时。
61.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(a)的所述溶液选自由pH范围为约1.5至2.5的盐酸或醋酸水溶液、pH范围为约3.5至5.5的醋酸钠缓冲液、pH为6的磷酸盐缓冲液(PBS)、和pH范围为约4至6的柠檬酸盐缓冲液组成的组。
62.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述温度为37℃。
63.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述溶液的pH为7.2。
64.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述时间段为6-192小时。
65.一种用于治疗选自由1型、2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍；或选自由骨质疏松症、关节炎、癌症、和内毒素性休克组成的组中的慢性疾病的方法，其中，所述方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的、用于有效缓解所述障碍或疾病的前述权利要求中任一项所述的药物组合物。
66.一种用于治疗选自由1型、2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍的方法，其中，所述方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的、用于有效缓解所述障碍或疾病的药物组合物，所述药物组合物包含前述权利要求中任一项所述的超分子胰岛素组装体。
67.一种用于治疗骨质疏松症的方法，其中，所述方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的、用于有效缓解骨质疏松症的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求16所述的超分子降钙素组装体。
68.一种用于治疗关节炎的方法，其中，所述方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的、用于有效缓解关节炎和关节炎疼痛的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求19所述的超分子布洛芬组装体。
69.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述组合物通过肌内、腹膜内或皮下给药。
70.权利要求1所述的超分子蛋白质组装体用于治疗选自由1型、2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍或选自由骨质疏松症、关节炎、癌症和内毒素性休克组成的组中的慢性疾病的用途。
71.前述权利要求中任一项所述的超分子胰岛素组装体用于治疗选自由1型、2型糖尿病及其并发症组成的组中的代谢障碍的用途。
72.权利要求16所述的超分子降钙素组装体用于治疗骨质疏松症的用途。
73.权利要求19所述的超分子布洛芬组装体用于治疗关节炎的用途。
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