PT2133091E - Composições úteis para o tratamento de diabetes e de outros distúrbios crónicos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES ÚTEIS PARA O TRATAMENTO DE DIABETES E DE OUTROS DISTÚRBIOS CRÓNICOS"

Este pedido de patente reivindica prioridade relativamente ao Pedido de Patente Indiano N° 914/DEL/2008 entregue em 7 de Abril, 20008.

CAMPO TÉCNICO O presente invento está relacionado com fármacos proteicos para o tratamento de diabetes e de outras doenças crónicas.

FUNDAMENTO DO INVENTO

Os medicamentos proteicos são a classe de fármacos em mais rápida expansão, servindo doentes com diabetes, cancro, doenças cardiovasculares, renais, gastrointestinais, reumatológicas e neurológicas, entre muitas outras. O valor terapêutico e comercial das proteínas como fármacos, incluindo insulina, eritropoietina, G-CSF, activador do plasminogénio e interferões, é indiscutível. As proteínas, ou as suas formulações, melhoradas aumentaram a eficácia terapêutica destes produtos originais, aumentando a sua potência, tempo de actuação e outras propriedades. 2 ΡΕ2133091 A diabetes é uma doença crónica caracterizada pela incapacidade do corpo para produzir insulina (Tipo I) ou pela inaptidão para responder a ela (Tipo II) (http://www.who.int/diabetes/en King, H., Aubert R E. & Herman, W. H. Global burden of diabetes, 1995--2025: Prevalence, numerical estimates, and projections. Diabetes Care 21, 1414 1431 (1998) ) . Existe uma epidemia global emergente de diabetes, tanto da forma Tipo I como da forma Tipo II. Cerca de 1,1 milhões de diabéticos morreram da doença em 2005 (Dunstan, D. W., Zimmet, P. Z., Welborn T. A., De Courten, Μ. P., Cameron A. J., et al. The rising prevalence of diabetes and impaired glucose tolerance: The Australian Diabetes, Obesity and Lifestyle Study. Diabetes Care 25, 829--834 (2002)). As suas consequências económicas são ainda mais impressionantes uma vez que as pessoas podem viver muitos anos com diabetes, sendo a sua causa de morte frequentemente registada como doenças cardiaca e falência renal, ambas surgindo como consequência secundária da diabetes. A restauração do meio metabólico normal através da administração de insulina exógena, e assim diminuindo o risco de complicações secundárias, tornou-se uma caracteristica essencial do tratamento da diabetes. A terapia actual envolve múltiplas injecções diárias subcutâneas (SC)/intramusculares (IM) de insulina, o que leva a uma carga pesada de concordância pelos doentes. Isto por sua vez levou ao desenvolvimento de vias de entrega alternativas menos invasivas. Tentativas para explorar as vias nasal, oral, gastrointestinal e transdérmica, até 3 ΡΕ2133091 agora foram maioritariamente mal sucedidas. Ainda que um regime convencional de insulina para diabetes tipo I com duas injecções diárias de insulina seja eficaz no controlo dos niveis de glucose no sangue pós-prandiais, este tratamento tem um valor limitado devido à sua incapacidade para controlar a hiperglicemia de jejum. Os doentes com diabetes melllitus necessitam de terapia com insulina para reforçar o fornecimento de insulina intrínseco, uma ou duas vezes por dia. Igualmente, a homeostasia pós-prandial da glucose é mantida através de injecções regulares de insulina antes de cada refeição. A terapia intensiva com insulina retarda o estabelecimento e/ou torna mais lenta a progressão de complicações secundárias, ainda que os doentes mantenham um risco elevado de hipoglicemia. Uma formulação de insulina que liberte insulina numa forma controlada durante longos períodos de tempo libertaria os doentes da necessidade de administrar múltiplas doses de insulina diariamente. 0 presente invento proporciona uma composição para a libertação prolongada de insulina para o tratamento de diabetes, tanto do tipo I como do tipo II.

SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento divulga fármacos proteicos para o tratamento de diabetes e de outras doenças crónicas. 0 presente invento divulga, particularmente, complexos supramoleculares de insulina, em que o complexo supra-molecular de insulina compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina e/ou exendina-4. 0 pre- 4 ΡΕ2133091 sente invento também divulga o complexo supramolecular de exendina-4 (SEA).

Um aspecto do presente invento está relacionado com um complexo supramolecular de insulina (SIA) para usar no tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo que consiste em diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 e complicações dos mesmos, o referido complexo compreendendo uma forma oligomérica insolúvel e agregada da insulina como SIA I, SIA II, SIA III ou combinações das mesmas, em que SIA I consiste em aglomerados alongados tendo um arranjo tipo pérola do monómero de insulina, SIA II consiste numa associação linear de agregados alongados tendo um arranjo tipo pérola de monómeros de insulina e SIA III consistem em cerca de 90% de SIA-II e é uma associação densa linear de oligómeros de insulina.

Um outro aspecto do presente invento está relacionado com um complexo supramolecular de insulina (SIA) útil como fármaco proteico para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos, em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina como SIA I, em que SIA I consiste em agregados alongados tendo uma arranjo tipo pérola de monómeros de insulina.

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com um complexo supramolecular de insulina 5 ΡΕ2133091 (SIA) útil como fármaco proteico para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina como SIA II, em que SIA II consiste numa associação linear de agregados alongados tendo um arranjo tipo pérola de monómeros de insulina.

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com um complexo supramolecular de insulina (SIA) útil como fármaco proteico para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina como SIA III, em que SIA III consiste numa associação densa linear de oligómeros de insulina.

Um outro aspecto do presente invento está relacionado com um complexo supramolecular de exendina-4 (SEA) útil como fármaco proteico para o tratamento de diabetes, em que o referido complexo compreende a forma oligomérica insolúvel e agregada de exendina-4.

Um outro aspecto do presente invento está relacionado com uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes melittus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos, a composição compreendendo uma quantidade terapeu-ticamente eficaz do complexo supramolecular de insulina (SIA) como descrito no presente invento. 6 ΡΕ2133091

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos, a referida composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do complexo supramo-lecular de insulina-II (SIA-II) descrito no presente invento .

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos, a composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do complexo supramolecular de insulina (SIA) e do complexo supramolecular de exendina-4 (SEA) como aqui descrito.

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos, a composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do complexo supramolecular de exendina-4 (SEA) como aqui descrito.

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com um processo de preparação do complexo 7 ΡΕ2133091 supramolecular de insulina (SIA) como descrito no presente invento, o processo compreendendo: dissolução da insulina a uma temperatura entre cerca de 25 e cerca de 60°C, numa solução tendo um pH na gama de cerca de 1,5 a cerca de 7,8; e incubação da solução durante um periodo entre cerca de 6 e 48 horas, com agitação constante, para se obter um Complexo Supramolecular de Insulina (SIA), em que SIA compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina.

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com um processo de preparação do complexo supramolecular de exendina-4 como aqui descrito, em que o processo compreende a dissolução da exendina-4 a uma temperatura entre cerca de 25°C e 60°C, numa solução tendo um pH na gama de cerca de 2,0 a 7,6; e incubação da solução durante um periodo entre cerca de 6 e 192 horas com agitação constante para se obter um Complexo Supramolecular de Exendina-4 (SEA) , em que SEA compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de exendina-4.

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com um método para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos, em que o método compreende administração, a um indivíduo necessitado, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreendendo o complexo supramolecular de insulina como descrito no presente invento, a qual é eficaz para o alívio do distúrbio. ΡΕ2133091

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com um método para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos, em que o método compreende a administração, a um indivíduo necessitado, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreendendo o complexo supramolecular de insulina-II (SIA-II) como descrito no presente invento, o qual é eficaz para o alívio do distúrbio.

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com um método para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos, em que o método compreende a administração, a um indivíduo necessitado, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreendendo o complexo supramolecular de exendina-4 como descrito no presente invento, a qual é eficaz para o alívio do referido distúrbio.

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com um método para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos, em que o método compreende a administração a um indivíduo necessitado de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreendendo o complexo supramolecular de insulina-II (SIA-II) e o complexo supramolecular 9 ΡΕ2133091 de exendina-4 como aqui descritos, a qual é eficaz para o alivio do referido distúrbio.

Um outro aspecto do presente invento está relacionado com o uso do complexo supramolecular de insulina como descrito no presente invento para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos.

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com o uso do complexo supramolecular de exendina-4 como aqui descrito para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos.

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com o uso do complexo supramolecular de insulina em combinação com o complexo supramolecular de exendina-4 como aqui descrito para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a cinética de formação de fibrilhas, a pH 2,0 e 7,0, de insulina humana recombinante (rH) e bovina, monitorizada com fluorescência de Th-T 50μΜ 10 ΡΕ2133091

Figura 2 (a) mostra a libertação in vitro de insulina a partir do complexo supramolecular de insulina II (também referido como intermediário pré-amilóide de insulina II) de insulina bovina e rH, monitorizada através da absorvância a 280 nm e fluorescência intrinseca da tirosina. É igualmente apresentada a intensidade Th-T da solução dentro da membrana de diálise às Oh e aos 15 dias. (b) mostra a cinética de libertação de monómeros in vitro pelos vários intermediários do complexo supramolecular de insulina da insulina bovina. (c) mostra a cinética de libertação de monómeros in vitro pelos vários intermediários do complexo supramolecular de insulina da insulina rH. (d) mostra a cinética de libertação de SIA II (alternativamente pré-amilóide) formada a pH 7,0 monitorizada constantemente em 1 ml de solução de PBS. A Figura 3 mostra os estudos de ligação de vermelho Congo com insulina nativa, complexo supramolecular de insulina II (alternativamente insulina pré-amilóide II) e insulina amilóide (bovina e humana). A Figura 4 mostra a caracterização espectros-cópica no infravermelho por Transformada de Fourier de insulina r-humana e bovina. 11 ΡΕ2133091 A Figura 5 mostra as morfologias dos intermediários do complexo supramolecular de insulina (como alternativa insulina pré-amilóide) e das fibrilhas de insulina estudadas por Microscopia de Força Atómica (AFM): (a) monómero de insulina, (b) intermediário do complexo supramolecular de insulina I (em alternativa insulina pré-amilóide I) , pH 7,0 da insulina bovina, (c) complexo supramolecular de insulina II (em alternativa insulina pré-amilóide II), pH 7,0 da insulina bovina, (d) intermediário do complexo supramolecular de insulina III (em alternativa insulina pré-amilóide III), pH 7,0 da insulina bovina, (e) complexo supramolecular de insulina I, pH 7,0 da insulina rH, (f) complexo supramolecular de insulina II, pH 7,0 da insulina rH, (g) complexo supramolecular de insulina III, pH 7,0 da insulina rH, (h) fibrilhas totalmente formadas a pH 7,0, (i) mostra o intermediário complexo supramolecular de insulina (como alternativa insulina pré-amilóide) formado às 6 hrs, pH 2,0 a 37°C, (j) fibrilhas pré-amilóides formadas a pH 2,0, A Figura 6 mostra micrografias TEM de contraste 12 ΡΕ2133091 negativo das fibrilhas de insulina e dos intermediários durante a formação do complexo supramolecular de insulina (i) Complexo supramolecular de insulina I (como alternativa insulina pré-amilóide I), pH 7,0, (ii) Complexo supramolecular de insulina II (como alternativa insulina pré-amilóide II), pH 7,0, (iii) Complexo supramolecular de insulina III (como alternativa insulina pré-amilóide III), pH 7,0, (iv) Fibras maduras a pH 7,0, (v) Fibras formadas a pH 2,0, 37°C. A Figura 7 mostra a eficácia in vitro do complexo supramolecular de insulina (como alternativa insulina pré-amilóide) na homeostasia de glucose.

(a) Nivel de glucose no sangue como resposta a várias dosagens de complexo supramolecular de insulina II (bovina) administradas subcutaneamente e intramuscularmente . (b) Nivel de glucose no sangue como resposta a várias dosagens de complexo supramolecular de insulina II (r-humana) administradas subcutaneamente e intramuscularmente . A Figura 8 mostra os níveis pós-prandiais de glucose no sangue monitorizados durante um período de 135 dias após administração de SIA-II bovina. 13 ΡΕ2133091 (a) Insulina bovina (b) insulina rH. A Figura 9 mostra os niveis pós-prandiais de glucose no sangue monitorizados durante um periodo de 160 dias após administração de SIA-II humana. (a) Insulina bovina (b) insulina rH. A Figura 10 mostra o nivel de glucose no sangue monitorizado após administração de insulina amilóide formada a pH 2,0 e 7,0. A Figura 11 mostra o perfil de peso do corpo de ratos diabéticos tratados com SIA-II, ratos diabéticos controlos e ratos não diabéticos controlos. A Figura 12 mostra o perfil da glucose no sangue durante o teste de tolerância à glucose intraperitoneal (IPGTT). A Figura 13 mostra

(a) quantificação de insulina rH e bovina libertadas no soro a partir do correspondente SIA-II, usando ELISA em suporte sólido, em ratos tratados com STZ 14 ΡΕ2133091 como resposta ao complexo supramolecular de insulina (em alternativa insulina pré-amilóide) injectado SC ou IM. (b) Quantificação da insulina bovina no soro durante a experiência de IPGTT. (c) ELISA da insulina no soro de rato realizada para IPGTT para determinar o nivel insulina endógena como resposta a glucose administrada por infusão.

A Figura 14 mostra o tratamento com insulina bovina SIA II marcada com 125I de ratos diabéticos STZ (a) perfil de CPM/ml em soro de animais tratados com 100 yg de complexo supramolecular de insulina marcada até 25 dias. O perfil de 24 h é apresentado numa caixa interior. (b) Perfil de glucose no sangue (mg/dl) e insulina bovina (ng/ml) libertada in vivo durante 36 dias. O perfil de 24 h é apresentado numa caixa interior. A Figura 15 mostra Tricina-SDS-PAGE de soro de animais tratados com SIA II marcado. Coloração com Coomas-sie (esquerda) e imagens do sistema Phosphorlmage (restante) do soro de 1-28 dias após tratamento subcutâneo (painel superior) ou intramuscular (painel do meio). O painel inferior mostra os monómeros libertados in vitro a partir de SIA II. 15 ΡΕ2133091 A Figura 16 mostra os estudos de "clamp" hiper-glicémico após tratamento com o complexo supramolecular de insulina II. Velocidade de infusão da glucose, GIR (mg/kg/min). A Figura 17 mostra a análise de transferência Western (WB) de adipócitos em cultura relativamente à cascata de sinalização da insulina. Adipócitos tratados com (a) PBS, insulina, SIA-II, insulina libertada a partir de SIA-II, (b) soro, como indicado e analisados relativamente à sinalização de insulina. A Figura 18 mostra ratos Wistar machos tornados diabéticos com STZ e tratados subcutaneamente com o complexo supramolecular de insulina II (em alternativa insulina pré-amilóide II) e testados relativamente à presença de complexo supramolecular de insulina residual usando vermelho Congo e à ocorrência de inflamação, respectivamente. (a) Secções subcutâneas coradas com vermelho Congo (i-v) , birrefringência do vermelho Congo (vi-x), secções coradas com H&E (xi-xv) e secção imunocorada (xvi-xx) entre a semana 1 e a semana 12. (b) secções intramusculares coradas com vermelho Congo (i-v), birrefringência do vermelho Congo (vi-x), secções coradas com H&E (xi-xv) e secção imunocorada (xvi-xx) entre a semana 1 e a semana 12. 16 ΡΕ2133091 A Figura 19 mostra (a) LPS de E. coli foi injectado em tecidos subcutâneos e musculares como controlo positivo da infiltração de células inflamatórias. Secção imunocorada SC (i) e IM (ii) e secções SC (iii) e IM (iv) coradas com H&E. (b) Fibras amilóides de insulina formadas a pH 2,0 injectadas SC foram monitorizadas durante 1, 4, 8 e 12 semanas usando secções coradas com vermelho Congo (i-iv) e Birrefringência de vermelho Congo (v-viii). A Figura 20 mostra o perfil de glucose no sangue do tratamento com insulina rH SIA-II de ratos tornados diabéticos usando Alloxan. (a) Jejum (b) Sangue sem jejum (c) Quantificação de insulina humana no soro usando ELISA em suporte sólido de acordo com o protocolo do fabricante. A Figura 21 mostra a monitorização da formação de cataratas em (a) Rato tratado com STZ. (b) Rato controlo. (c) -(d) Ratos tratados com insulina. (e) Ratos tratados com o complexo supramolecular de insulina. 17 ΡΕ2133091 A Figura 22 mostra tecido de coração, rim e figado seccionados e examinados relativamente à deposição de amilóide através da coloração com CR. A morfologia celular foi também avaliada usando coloração com H&E. Birrefringência de vermelho Congo de coração, rim e figado (i-iii), secções coradas com vermelho Congo (iv-vi), coloração com H&E de coração, rim e figado (vii-ix). A Figura 23 mostra a detecção da enzima degradadora de insulina de rato (IDE) após tratamento com SIA-II. A Figura 24 mostra o rastreio de anticorpos anti-insulina em soro de rato tratado com SIA-II. A Figura 25 mostra o ensaio MIT para a proliferação celular: células MCF 7 foram testadas relativamente à sua cinética de crescimento através da administração de PBS, pH 7,4, insulina humana/bovina (20 nM), SIA II (insulina humana/bovina) , monómeros de insulina libertados a partir de SIA II (20 nM) , Factor do Crescimento tipo Insulina (IGF-I) (6 ng/ml). A Figura 26 mostra o nivel de glucose no sangue como resposta a várias dosagens do complexo supramolecular de insulina administradas subcutaneamente e intramuscularmente em murganhos tornados diabéticos usando STZ. SIA-II humana injectada (a) subcutaneamente, (b) intramuscular- 18 ΡΕ2133091 mente e (c) SIA-II bovina subcutaneamente na dosagem indicada. o nível de glucose supramolecular de em coelho tornado no sangue insulina diabético A Figura 27 mostra em resposta ao complexo administrado subcutaneamente com STZ. A Figura 28 mostra o perfil de glucose no sangue de ratos diabéticos Tipo II aos quais foram administrados vários tratamentos como indicado na figura, durante um período de 35 dias. A Figura 29 mostra a monitorização da resposta contra-reguladora de insulina usando estudos de "clamp" Hiperinsulinémico Euglicémico/Hipoglicémico. (a) nível de glucose no sangue (b) nível de glucagon (c) nível de epinefrina. A Figura 30 mostra um gel de 20% corado com Coomassie mostrando o padrão de clivagem de (i) insulina rH, (ii) SIA-I, (iii) SIA-II e (iv) SIA-III com diferentes diluições de 2 mg/ml de tripsina e proteinase K.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento proporciona fármacos proteicos 19 ΡΕ2133091 para o tratamento de diabetes e de outras doenças/dis-túrbios crónicos. O presente invento, particularmente, proporciona complexos supramoleculares de insulina (SIA), em que o SIA compreende a forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina. 0 presente invento também descreve o complexo supramolecular de exendina-4 (SEA) , em que SEA compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de exendina-4. 0 presente invento também proporciona as composições farmacêuticas compreendendo complexos supramoleculares de insulina. 0 presente invento também proporciona a viabilidade do tratamento de diabetes Tipo II. O termo "complexo supramolecular de insulina" ou "SIA" aqui usado refere-se à forma oligomérica insolúvel e agregada da insulina. 0 termo "complexo supramolecular de insulina" ou "SIA" aqui usado refere-se à forma oligomérica insolúvel e agregada da insulina, em que a forma oligomérica de ordem superior de SIA-II e IIII evita que as proteases as cortem. A resistência de SIA-II e SIA-III à clivagem pela tripsina e proteinase K demonstra a diferença na organização estrutural destes oligómeros. Insulina rH e SIA-I são mais susceptiveis à clivagem pelas proteases comparativamente a SIA-II e SIA-III, as quais adoptam uma forma oligomérica de ordem superior resistente à acção das proteases. 20 ΡΕ2133091 O termo "complexo supramolecular de insulina" ou "SIA" aqui usado refere-se ao complexo supramolecular de insulina I, II e III que são a forma oligomérica insolúvel e agregada da insulina. O termo "SIA I" aqui usado refere-se ao "complexo supramolecular de insulina" na fase I, em que "SIA I" compreende a forma oligomérica insolúvel e agregada da insulina, em que os oligómeros consistem em agregados alongados tendo arranjo tipo pérola do monómero de insulina. 0 termo "SIA II" aqui usado refere-se ao "complexo supramolecular de insulina" na fase II, em que "SIA II" compreende a forma oligomérica insolúvel e agregada da insulina, em que os oligómeros de insulina estão arranjados como uma associação linear dos agregados alongados atrás referidos, tendo uma entidade única com uma organização estrutural supra-oligomérica. O termo "SIA III" aqui usado refere-se ao "complexo supramolecular de insulina" na fase III, em que "SIA III" consiste numa associação linear densa da forma oligomérica da insulina. SIA na fase III, i.e. SIA III, consiste em cerca de 90% de SIA-II.

De acordo com o presente invento, uma realização proporciona um complexo supramolecular de insulina (SIA) 21 ΡΕ2133091 para usar no tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo que consiste em diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 e complicações dos mesmos, o referido complexo compreendendo uma forma oligomérica insolúvel e agregada da insulina como SIA I, SIA II, SIA III ou combinações das mesmas, em que SIA I consiste em aglomerados alongados tendo um arranjo tipo pérola do monómero de insulina, SIA II consiste numa associação linear de agregados alongados tendo um arranjo tipo pérola de monómeros de insulina e SIA III consistem em cerca de 90% de SIA-II e é uma associação densa linear de oligómeros de insulina.

Numa outra realização do presente invento, é proporcionado um complexo supramolecular de insulina (SIA) útil como fármaco proteico para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos, em que o complexo compreende a forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina como SIA I, em que SIA I consiste em agregados alongados tendo uma arranjo tipo pérola de monómeros de insulina.

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com um complexo supramolecular de insulina (SIA) útil como fármaco proteico para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e 22 ΡΕ2133091 agregada de insulina como SIA II, em que SIA II consiste numa associação linear de agregados alongados tendo um arranjo tipo pérola de monómeros de insulina.

Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com um complexo supramolecular de insulina (SIA) útil como fármaco proteico para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina como SIA III, em que SIA III consiste numa associação densa linear de oligómeros de insulina.

Uma realização proporciona o complexo supramolecular de insulina (SIA) , em que a insulina é insulina humana recombinante ou mutantes/análogos de insulina.

Uma realização do presente invento proporciona o complexo supramolecular de insulina (SIA) , em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada da insulina, em que o complexo liberta insulina a uma velocidade que varia entre cerca de 0,2 e 0,6 UI por hora in vitro.

Uma realização do presente invento proporciona o complexo supramolecular de insulina (SIA), em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada da insulina como SIA I, SIA II, SIA III ou combinações das mesmas, em que SIA I consiste em 23 ΡΕ2133091 aglomerados alongados tendo um arranjo tipo pérola do monómero de insulina, SIA II consiste numa associação linear de agregados alongados tendo um arranjo tipo pérola de monómeros de insulina e SIA III consiste em cerca de 90% de SIA-II e é uma associação densa linear de oligómeros de insulina, em que o complexo liberta insulina a uma velocidade que varia entre cerca de 0,2 e 0,6 UI por hora in vitro.

Uma realização do presente invento proporciona o complexo supramolecular de insulina (SIA), em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada da insulina, em que o complexo liberta insulina a uma velocidade que varia entre cerca de 0,1 e 5,4 ng/ml, em que a velocidade de libertação da insulina é na gama de cerca de 7 a 180 dias in vivo.

Uma realização do presente invento proporciona o complexo supramolecular de insulina (SIA), em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina como SIA I, SIA II, SIA III ou combinações das mesmas, em que SIA I consiste em aglomerados alongados tendo um arranjo tipo pérola do monómero de insulina, SIA II consiste numa associação linear de agregados alongados tendo um arranjo tipo pérola de monómeros de insulina e SIA III consistem em cerca de 90% de SIA-II e é uma associação densa linear de oligómeros de insulina, em que o complexo liberta insulina a uma velocidade que varia entre cerca de 0,1 e 5,4 ng/ml, em que 24 ΡΕ2133091 a velocidade de libertação da insulina é naquela gama durante cerca de 7 a 180 dias in vivo.

Uma realização do presente invento proporciona o complexo supramolecular de insulina (SIA), em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada da insulina, em que o complexo liberta insulina a uma velocidade que varia entre cerca de 0,2 e 0,6 UI por hora in vitro, em que a velocidade de libertação da insulina é na gama de 4-5,4 ng/ml durante pelo menos 7-10 dias.

Uma realização do presente invento proporciona o complexo supramolecular de insulina (SIA), em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina como SIA I, SIA II, SIA III ou combinações das mesmas, em que SIA I consiste em aglomerados alongados tendo um arranjo tipo pérola do monómero de insulina, SIA II consiste numa associação linear de agregados alongados tendo um arranjo tipo pérola de monómeros de insulina e SIA III consistem em cerca de 90% de SIA-II e é uma associação densa linear de oligómeros de insulina, em que complexo liberta insulina a uma velocidade que varia entre cerca de 0,2 e 0,6 UI por hora in vitro, em que a velocidade de libertação da insulina é na gama de 4-5,4 ng/ml durante pelo menos 7-10 dias.

Ainda numa outra realização do presente invento, é proporcionado um complexo supramolecular de insulina 25 ΡΕ2133091 (SIA) útil como fármaco proteico para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina como SIA II, em que SIA II consiste numa associação linear de agregados alongados tendo um arranjo tipo pérola de monómeros de insulina, em que a velocidade de libertação da insulina é na gama de 0,5-1,8 ng/ml durante pelo menos 160 dias.

Ainda numa outra realização do presente invento, é proporcionado um complexo supramolecular de insulina (SIA) útil como fármaco proteico para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina como SIA III, em que SIA III consiste numa associação linear densa de agregados alongados de oligómeros de insulina, em que a velocidade de libertação da insulina é na gama de 0,1-0,7 ng/ml durante pelo menos 180 dias.

Ainda numa outra realização do presente invento, é proporcionado um complexo supramolecular de insulina (SIA) útil como fármaco proteico para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina como SIA II, em que SIA II consiste 26 ΡΕ2133091 numa associação linear de agregados alongados tendo um arranjo tipo pérola de monómeros de insulina, em que o complexo quando administrado a indivíduos diabéticos mantém um nivel quase normoglicémico (120130 mg/dl) durante pelo menos 160 dias num indivíduo necessitado. O complexo de insulina supramolecular (SIA) como descrito no presente invento, em que uma única dose do complexo, quando administrado, mantém um nivel quase normoglicémico (120130 mg/dl) durante pelo menos 7 a 180 dias num indivíduo necessitado, em que a concentração do complexo na dose situa-se na gama de 25 a 750 pg. O complexo de insulina supramolecular (SIA) como descrito no presente invento, em que uma única dose do complexo, quando administrada, mantém um nivel quase normoglicémico (120130 mg/dl) durante pelo menos 160 dias num indivíduo necessitado, em que a concentração do complexo na dose situa-se na gama de 150 a 250 pg.

Uma realização do presente invento proporciona um complexo supramolecular de exendina-4 (SEA) útil como fármaco proteico para o tratamento de diabetes, em que o complexo compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de exendina-4.

Uma outra realização do presente invento proporciona o complexo supramolecular de insulina, em que o complexo é um pró-fármaco não citotóxico, não imunogénico, não apoptótico e não mitogénico. 27 ΡΕ2133091

Uma realização do presente invento proporciona uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, a composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do complexo supramolecular de insulina (SIA) como descrito no presente invento.

Uma outra realização do presente invento proporciona uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, a composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do complexo supramolecular de insulina-II (SIA-II).

Ainda uma outra realização do presente invento proporciona uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, a composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do complexo supramolecular de insulina (SIA) e do complexo supramolecular de exandina-4 (SEA).

Uma outra realização do presente invento proporciona uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo 28 ΡΕ2133091 consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, a composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do complexo supramolecular de exandina-4 (SEA). A(s) composição(ões) farmacêutica(s) descrita(s) no presente invento facultativamente compreende(m) veículos, aditivos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. A(s) composição(ões) farmacêutica(s) descrita(s) no presente invento é(são) administrada(s) intramuscularmente, intradermicamente ou subcutaneamente. A(s) composição(ões) farmacêutica(s) descrita(s) no presente invento é(são) administrada(s) através de um dispositivo capaz de libertar a referida composição, em que o referido dispositivo é seleccionado de um grupo consistindo em bombas, cateteres, emplastros e implantes.

Numa realização é proporcionado um processo de preparação do complexo supramolecular de insulina (SIA) , o processo compreendendo a dissolução da insulina, a uma temperatura entre cerca de 25 e cerca de 60°C, numa solução tendo um pH na gama de cerca de 1,5 a cerca de 7,8; e incubação desta solução durante um período entre cerca de 6 e 48 horas com agitação constante para se obter um Complexo Supramolecular de Insulina (SIA), em que SIA compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina. 29 ΡΕ2133091 O processo de preparação do complexo supramo-lecular de insulina (SIA) descrito no presente invento, em que o processo ainda compreende lavagem de SIA com PBS; e ressuspensão do SIA lavado em PBS. O processo de preparação do complexo supramo-lecular de insulina (SIA) descrito no presente invento, em que o período de incubação é 10 horas.

Numa outra realização do presente invento é proporcionado um processo de preparação do complexo supra-molecular de exendina-4 (SEA), o processo compreendendo dissolução da exendina-4, a uma temperatura entre cerca de 25 e 60°C, numa solução tendo pH na gama de cerca de 2,0 a 7,6; e incubação desta solução durante um período entre cerca de 6 e 192 horas com agitação constante para se obter um Complexo Supramolecular de Exendina-4 (SEA), em que SEA compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de exendina-4. 0 processo de preparação do complexo supramolecular de exendina-4 (SEA) aqui descrito, ainda compreendendo a lavagem de SAE com PBS; e ressuspensão em PBS do SEA lavado. O processo de preparação do complexo supramolecular de exendina-4 (SEA) aqui descrito, em que o período de incubação é 148 horas. 30 ΡΕ2133091 O processo de preparação do complexo supramo-lecular de insulina (SIA) descrito no presente invento, em que a solução é seleccionada do grupo consistindo em ácido clorídrico ou acético em água tendo pH na gama de cerca de 1,5 a 2,5; tampão acetato de sódio tendo pH na gama entre cerca de 3,5 e 5,5; tampão fosfato (PBS) tendo pH 6-7,5 e tampão citrato tendo pH na gama de aproximadamente 4 a 6. 0 processo de preparação do complexo supramo-lecular de exendina-4 (SEA) aqui descrito, em que a solução é seleccionada do grupo consistindo em e ácido clorídrico ou acético em água tendo pH na gama de cerca de 1,5 a 2,5; tampão acetato de sódio tendo pH na gama entre cerca de 3,5 e 5,5; tampão fosfato (PBS) tendo pH 6-7,5 e tampão citrato tendo pH na gama de aproximadamente 4 a 6. O processo de preparação do complexo supramole-cular de insulina (SIA) descrito no presente invento, em que a temperatura é 37°C. 0 processo de preparação do complexo supramole-cular de exendina-4 (SEA) descrito no presente invento, em que a temperatura é 37°C. 0 processo de preparação do complexo supramole-cular de insulina (SIA) descrito no presente invento, em que o pH da referida solução é 7,2. O processo de preparação do complexo supramole- 31 ΡΕ2133091 cular de exendna-4 (SEA) descrito no presente invento, em que o pH da referida solução é 7,2. 0 processo de preparação do complexo supramole-cular de insulina (SIA) descrito no presente invento, em que o referido periodo é de 6-192 horas.

Uma realização do presente invento está relacionada com um método para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos, em que o método compreende a administração ao indivíduo necessitado de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreendendo o complexo supramolecular de insulina, o qual é eficaz no alívio do distúrbio.

Ainda, uma outra realização do presente invento proporciona um método para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, em que o método compreende a administração a um indivíduo necessitado de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreendendo o complexo supramolecular de insulina-II (SIA-II), que é eficaz no alívio do distúrbio.

Ainda, uma outra realização do presente invento proporciona um método para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, em que o 32 ΡΕ2133091 método compreende a administração a um indivíduo necessitado de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreendendo o complexo supramolecular de exendina-4, a qual é eficaz no alívio do distúrbio.

Ainda, uma outra realização do presente invento proporciona um método para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e suas complicações, em que o método compreende a administração, a um indivíduo necessitado, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica compreendendo o complexo supramolecular de insulina e o complexo supramolecular de exendina-4, a qual é eficaz no alívio do distúrbio.

Numa outra realização do presente invento, é proporcionado o uso do complexo supramolecular de insulina para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e complicações dos mesmos.

Ainda numa outra realização do presente invento é proporcionado o uso do complexo supramolecular de insulina em combinação com o complexo supramolecular de exendina-4 para o tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 complicações dos mesmos.

Numa realização adicional, é proporcionado um 33 ΡΕ2133091 complexo supramolecular de insulina (SIA), em que o complexo apresenta um pico acentuado a 1647-1645 cm-1 em espec-troscopia de infravermelhos transformada de Fourier (FTIR).

Numa realização, o presente invento proporciona o complexo supramolecular de insulina (SIA), em que a insulina é insulina humana recombinante.

Numa outra realização, o presente invento proporciona o complexo supramolecular de insulina (SIA), em que a insulina é insulina humana, bovina ou de porco.

Ainda numa outra realização do presente invento é proporcionado o complexo supramolecular de insulina (SIA), em que o complexo quando administrado liberta monómeros de insulina.

Ainda, o presente invento proporciona o complexo supramolecular de proteínas, em que o péptido no complexo está acoplado a um fármaco de molécula pequena.

Uma realização do presente invento proporciona o complexo supramolecular de proteina descrito no presente invento que actua como um pró-fármaco. A composição farmacêutica descrita no presente invento compreende veiculos, aditivos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. 34 ΡΕ2133091 A composição farmacêutica descrita no presente invento é administrada intramuscularmente ou subcutanea-mente. A composição farmacêutica descrita no presente invento é administrada através de um dispositivo capaz de libertar a composição, em que o dispositivo é seleccionado de um grupo consistindo em bombas, cateteres e implantes. A composição farmacêutica descrita no presente invento, em que a dose única da composição quando administrada liberta a referida proteína durante um período prolongado. O processo de preparação do complexo supramo-lecular de insulina no presente invento compreende incubação da insulina na solução durante 10 horas. 0 processo de preparação do complexo supramo-lecular de insulina no presente invento compreende incubação da proteína na solução durante 6-192 horas. 0 método para o tratamento usando a composição farmacêutica como descrito no presente invento, em que a composição é administrada intramuscularmente, intraperito-nealmente ou subcutaneamente.

Ainda noutra realização, o presente proporciona uma composição compreendendo o complexo supramolecular de 35 ΡΕ2133091 insulina (SIA) que é estável, resistente a proteases e possui maior vida de prateleira.

Ainda numa outra realização, o presente invento proporciona uma composição compreendendo o complexo de exendina-4 (SEA) o qual é estável, resistente a proteases e possui uma maior vida de prateleira.

Ainda noutra realização, o presente invento proporciona uma composição compreendendo o complexo supramolecular de insulina (SIA) que é estável, resistente a proteases e possui maior vida de prateleira, entre cerca de 10 dias e 150 dias ou mais.

Ainda noutra realização, o presente invento proporciona uma composição compreendendo o complexo supramolecular de exendina-4 (SEA) que é estável, resistente a proteases e possui maior vida de prateleira, entre cerca de 10 dias e 150 dias ou mais.

Como será apreciado pelos familiarizados com a área, pode ser usada uma variedade de soluções tais como tampões conhecidos para ressuspensão e lavagem do complexo supramolecular de proteínas descrito no presente invento. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" como aqui usado refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição pretendida ou para exibir um efeito terapêutico ou 36 ΡΕ2133091 preventivo detectável. A quantidade eficaz precisa para um individuo dependerá do tamanho e da saúde do indivíduo, da natureza e grau da condição e do fármaco ou combinação de fármacos seleccionados para administração. A quantidade eficaz para uma determinada situação é determinada por experimentação de rotina e está dentro da capacidade de avaliação do clínico.

Para fins do presente invento, uma dose eficaz de SIA será, de um modo geral, entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 1,0 mg/kg ou cerca de 0,2 mg/kg e cerca de 2,0 mg/kg ou cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 3,0 mg/kg da composição do presente invento no indivíduo a que é administrado.

Uma composição farmacêutica pode também conter um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um veículo para administração de um agente terapêutico, como sejam anticorpos ou um polipéptido, genes e outros agentes terapêuticos. O termo refere-se a qualquer veículo farmacêutico que não induz ele próprio a produção de anticorpos prejudiciais no indivíduo que recebe a composição e que pode ser administrado sem toxicidade indesejada. Os veículos adequados podem ser grandes macromoléculas lentamente metabolizadas tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicóis, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e partículas de vírus inactivos. Tais veículos são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria. 37 ΡΕ2133091

Veículos farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem incluir líquidos tais como água, soro fisiológico, glicerol e etanol. Substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, substâncias tamponantes de pH e similares, podem também estar presentes em tais veículos. Tipicamente, as composições terapêuticas são preparadas como injectáveis, soluções líquidas ou suspensões; podem ser igualmente preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injecção. Os lipossomas e neossomas estão incluídos dentro da definição de um veículo farmaceuticamente aceitável. Sais farmaceuticamente aceitáveis podem estar igualmente presentes na composição farmacêutica, e.g., sais de ácidos minerais tais como ácidos clorídrico, ácido bromídrico, fosfatos, sulfatos e similares; e os sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malo-natos, benzoatos e similares.

As composições farmacêuticas podem ser preparadas em várias formas, tais como grânulos, comprimidos, pílulas, supositórios, cápsulas, suspensões, pomadas, loções e similares. Veículos e/ou diluentes orgânicos ou inorgânicos de grau farmacêutico adequados para uso oral e tópico podem ser usados para preparar composições contendo os compostos terapeuticamente activos. Diluentes conhecidos na área incluem meios aquosos, óleos e gorduras vegetais e animais. Agentes estabilizadores, agentes molhantes e emulsionantes, sais para variar a pressão osmótica ou tampões para 38 ΡΕ2133091 assegurar um valor de pH adequado e estimuladores da penetração na pele podem ser usados como agentes auxiliares.

As composições descritas no presente invento compreendem complexos supramoleculares de proteína das proteínas relevantes/aplicáveis como fármacos e são aplicáveis ao tratamento de uma série de doenças crónicas e sintomas agudos.

As composições descritas no presente invento compreendem oligómeros de proteínas terapêuticas particularmente o complexo supramolecular de uma proteína para libertação controlada da proteína.

Alguns biofármacos largamente usados, tais como insulina, glucagon e calcitonina podem ser induzidos para formar amilóides. Comparativamente com as proteínas precursoras solúveis, os agregados amorfos formados como prelúdio da formação de amilóides, adquirem novas propriedades tais como maior estabilidade, resistência a proteases, autopropagação, vida de prateleira mais longa, estrutura altamente organizada e podem servir como uma fonte compacta concentrada de moléculas puras.

Os complexos supramoleculares de insulina descritos no presente invento existem numa estrutura definida tendo componentes de hélice α e de folhas β. A adopção da estrutura única referida resulta numa alteração na sua solubilidade e na sua estrutura relativamente às moléculas 39 ΡΕ2133091 de insulina nativas em solução. Significativamente, os monómeros de insulina libertados desta estrutura supra-molecular são biologicamente activos e assim assemelham-se à estrutura de insulina nativa. Novas propriedades de dissolução são conferidas a esta estrutura supramolecular formada, as quais actuam, por sua vez, como pró-fármacos. Nesta forma de pró-fármaco encontrou-se que não têm acção ou efeito nos efeitos de sinalização ou homeostasia da glucose das células gordas sensíveis à insulina. É transformada num fármaco pela libertação dos monómeros de insulina a partir do depósito ou local da injecção in vivo. Tanto os resultados in vitro como in vivo demonstram o carácter original da formulação para libertar moléculas de insulina bioactivas, mostrando um efeito na homeostasia da glucose e outros parâmetros clínicos geralmente avaliados para diabetes tipo I e II. 0 presente invento proporciona uma composição compreendendo complexos supramoleculares de insulina úteis no tratamento de diabetes mellitus. A insulina supramolecular é um híbrido de oligómeros amorfos e fibrilares nascentes de insulina e serve como formulação de libertação controlada para a libertação de insulina bioactiva. A hormona reguladora da glucose insulina é um polipéptido de 51 resíduos que existe em equilíbrio como uma mistura de diferentes estados oligoméricos, incluindo hexâmeros, dímeros e monómeros, dependendo do ambiente. Nas vesículas secretoras pancreáticas, a insulina é armazenada como um hexâmero a pH fisiológico, mas interage com o seu receptor 40 ΡΕ2133091 como um monómero. Em condições desnaturantes, como seja pH baixo ou na presença de desnaturantes fortes, os agregados de insulina formam fibrilhas amilóides (Paul Bevan Insulin signalling. J. Cell Sei., 114, 1429-1430 (2001)).

Os oligómeros supramoleculares de insulina descritos no presente invento são preparados a um pH que varia entre 6,8 e 7,8, de preferência sendo 7,2. O presente invento proporciona uma composição compreendendo um complexo supramolecular de insulina capaz de libertar de forma controlada monómeros de insulina. A composição compreendendo um determinado complexo supramolecular de insulina (viz. SIA I, II, III ou uma combinação dos mesmos) é útil para se conseguir melhor controlo glicémico. O presente invento proporciona oligómeros de insulina, complexo supramolecular de insulina II que é útil para se atingir controlo glicémico mais apertado através da libertação controlada de insulina. O complexo supramolecular de insulina II, quando administrado subcutaneamente ou intramuscularmente, mantém um nivel basal de insulina em ratos diabéticos induzidos por STZ durante um periodo prolongado, variando entre cerca de 10 dias e 180 dias ou mais, mantendo ao mesmo tempo um apertado controlo glicémico, proporcionando assim um tratamento duradoiro contra diabetes mellitus. 41 ΡΕ2133091

De acordo com o presente invento, uma realização proporciona uma composição compreendendo um complexo supramolecular de insulina II que causa uma libertação controlada de monómeros de insulina variando entre 0,5-1,5 ng/ml e dura cerca de pelo menos 180 dias quando administrado intramuscularmente ou subcutaneamente.

Uma outra realização do presente invento proporciona uma composição compreendendo um complexo supramolecular de insulina II em que a quantidade de monómero de insulina libertado do complexo de supramolecular de insulina II situa-se na gama de 0,5-1,5 ng/ml no soro.

Numa realização do presente invento, o efeito in vivo da composição compreendendo oligómeros supramolecula-res de insulina no controlo de niveis glicémicos no sangue foi verificado usando ratos diabéticos induzidos usando STZ.

Uma outra realização do presente invento proporciona a dosagem da composição compreendendo um complexo supramolecular de insulina em que a dosagem variando entre cerca de 50 pg e cerca de 400 pg de insulina foi monitorizada durante o período experimental.

Uma outra realização do presente invento proporciona a dosagem da composição compreendendo um complexo supramolecular de insulina em que a dosagem é 200 pg de insulina. 42 ΡΕ2133091

Uma outra realização do presente invento proporciona a dosagem da composição compreendendo um complexo supramolecular de insulina em que a dosagem é 100 yg de insulina.

Ainda noutra realização, o presente invento proporciona uma composição compreendendo um complexo supramolecular de insulina, em que a composição não induz actividade enzimática de degradação da insulina (IDE) no local da injecção e à volta dele durante um periodo de tempo entre cerca de 10 dias e 180 dias ou mais.

Numa outra realização do presente invento, observa-se ausência de anticorpos anti-insulina no soro do indivíduo durante um período de tempo que varia entre cerca de 10 dias e 150 dias ou mais.

Ainda noutra realização, o presente invento proporciona uma composição compreendendo o complexo supramolecular de insulina que é estável, resistente a proteases e possui vida de prateleira mais longa variando entre cerca de 10 dias e 150 dias ou mais.

Ainda noutra realização do presente invento é proporcionada uma composição compreendendo o complexo supramolecular de insulina que é capaz de libertar monó-meros de insulina de forma controlada durante um longo período de tempo sem qualquer pico de libertação rápida. As 43 ΡΕ2133091 cinéticas de transformação podem ser controladas in vivo e in vitro.

Ainda, uma composição compreendendo o complexo supramolecular de insulina descrito no presente invento pode ser usada como dose única tendo efeito duradoiro que liberta os doentes da necessidade de administrar múltiplas doses de insulina diariamente. A composição compreendendo o complexo supramolecular de insulina descrito no presente invento não apresenta libertação abrupta grande de insulina anulando a fase hipoglicémica em indivíduos diabéticos. A composição compreendendo o complexo supramolecular de insulina descrito no presente invento é capaz de libertar monómeros de insulina a uma velocidade constante in vitro e in vivo.

Ainda numa outra realização do presente invento, a fase oligomérica superior do complexo supramolecular de insulina atinge um controlo glicémico estreitamente regulado, sem hipoglicemia de jejum num indivíduo diabético.

Ainda numa outra realização do presente invento, a fase oligomérica superior do complexo supramolecular de insulina atinge um controlo glicémico estreitamente regulado sem hipoglicemia de jejum num indivíduo diabético Tipo 1. 44 ΡΕ2133091

Ainda numa outra realização do presente invento, a fase oligomérica superior do complexo supramolecular de insulina atinge um controlo glicémico estreitamente regulado sem hipoglicemia de jejum num indivíduo diabético Tipo 2.

Ainda numa outra realização do presente invento, não existe aumento repentino do peso do corpo de indivíduos quando tratados com o complexo supramolecular de insulina ou composição compreendendo o complexo supramolecular de insulina do presente invento.

Ainda numa outra realização do presente invento, não se observa atraso na libertação de monómeros de insulina bioactivos a partir do complexo supramolecular de insulina II no perfil da glucose no sangue do indivíduo quando do Teste de Tolerância à Glucose Intraperitoneal (IPGTT), semelhante ao que acontece com a administração de insulina livre.

Ainda numa outra realização do presente invento, observa-se cinética de ordem zero ou libertação controlada para a libertação in vivo de monómeros de insulina a partir do complexo supramolecular de insulina II.

Ainda noutra realização do presente invento, a insulina libertada a partir do complexo supramolecular de 45 ΡΕ2133091 insulina II é equivalente em termos de função biológica à insulina solúvel.

Ainda, numa outra realização do presente invento, a toxicidade do complexo supramolecular de insulina é excluida ao realizarem-se os ensaios biológicos da transa-minase de glutamato oxalo-acetato sérica (SGOT), transa-minase de glutamato piruvato sérica (SGPT) , bilirrubina total, bilirrubina, fosfatase alcalina, proteínas séricas totais, albumina sérica, globulina sérica, razão A/G sérica, teste da função renal (KFT), formação de cataratas, peso do tecido adiposo, peso e aspecto do corpo.

Ainda numa outra realização, a velocidade de infusão da glucose permanece a mesma em animais tratados. Isto permite concluir que os monómeros libertados do depósito no local de injecção são biologicamente activos e estimulam os músculos e o fígado para a utilização de glucose.

Ainda numa outra realização, o ensaio MTT foi realizado em células MCF7 para validar a dinâmica inalterada estrutural e de ligação dos monómeros de insulina, libertados a partir de SIA II.

Ainda, numa outra realização do presente invento, ratos machos Wistar foram tornados diabéticos usando um outro composto químico Alloxan. Estes ratos diabéticos foram ainda tratados com SIA II e mostraram resultado 46 ΡΕ2133091 semelhante ao dos ratos diabéticos induzidos com STZ. Observou-se um estreito controlo glicémico.

Ainda noutra realização do presente invento, murganhos C57BL/6 foram tornados diabéticos usando estre-ptozotocina, depois tratados com SIA II, também apresentaram niveis normoglicémicos.

Uma outra realização do presente invento é que o complexo supramolecular de insulina é um depósito estável útil para a libertação controlada de fármacos peptídicos activos a partir dos extremos do complexo supramolecular de insulina.

De acordo com uma realização do presente invento o complexo supramolecular de insulina II é capaz de proporcionar um tratamento duradoiro contra a diabetes.

Numa outra realização, a insulina usada para a preparação do complexo supramolecular de insulina é, de preferência, insulina humana recombinante, insulina bovina e insulina de porco.

Aida numa outra realização, a composição compreendendo o complexo supramolecular de insulina I e II (SIA I e SIA II) ou uma combinação dos mesmos, descrito no presente invento é capaz de baixar os niveis de glucose no sangue em animais tratados com estreptozotocina para induzir diabetes tipo II. 47 ΡΕ2133091

Ainda numa outra realização, SIA I, que liberta monómeros de insulina a uma velocidade mais rápida, foi administrada a ratos que sofrem de diabetes mellitus tipo II (DM II).

De acordo com uma realização do presente invento, SIA II foi iqualmente administrado a ratos DM II para o tratamento.

Ainda numa outra realização, os ratos diabéticos tratados com SIA I e II mostraram niveis quase normo-glicémicos perto do nivel superior, em estados pré-prandiais e pós-prandiais (180 ± 15 mg/dl).

Ainda numa outra realização do presente invento, a dosagem de SIA II injectada foi 150 yg em dois locais, subcutaneamente e intramuscularmente.

Uma outra realização do presente invento demonstra a capacidade de SIA I e II para manter níveis quase normoglicémicos durante até 30 dias.

Ainda numa outra realização, a administração de exendina-4 juntamente com a terapia com insulina foi capaz de manter niveis quase normoglicémicos (135±10 mg/dl) durante até 45 dias e foi a melhor formulação para tratamento de DM II. 48 ΡΕ2133091

Ainda numa outra realização, SIA III, que liberta monómeros de insulina mas a uma velocidade muito lenta (0,05-0.3 ng/ml) que pode ser útil no tratamento de doentes diabéticos na zona cinzenta, viz. pré-diabéticos ou indivíduos com mau prognóstico em testes de tolerância à glucose, que necessitam de muito pouca quantidade de insulina como terapia.

Ainda numa outra realização do presente invento, o nivel de insulina humana detectada no soro de ratos diabéticos é cerca de 0,7-0,85 ng/ml.

Ainda numa outra realização do presente invento, foram estimados vários parâmetros séricos, tais como triglicéridos (TAG), ácidos gordos livres (FFA), para demonstrar a eficácia do tratamento.

Ainda numa outra realização, o nivel de TAG no soro foi na gama de 0,45-0,6 mmol/1 para os ratos tratados com exendina-4, o que é quase o mesmo do controlo.

Ainda numa outra realização, os niveis FFA no soro foram estimados como sendo cerca de 0,85-0,9 mmol/1 para os ratos tratados com exendina-4, o que é quase o mesmo do controlo.

Ainda numa outra realização do presente invento, o aumento no peso do corpo dos animais a serem tratados foi quase o mesmo dos ratos controlo. 49 ΡΕ2133091

Ainda numa outra realização, a presente metodologia pode ser estendida às doenças crónicas e inflamatórias em que seja necessária uma terapia controlada e continua usando péptidos, proteínas ou pequenas moléculas.

Os exemplos 1 e 2 do presente invento proporcionam um processo para a preparação do complexo supra-molecular de insulina II. A Figura 1 proporciona detalhes sobre a formação de fibrilhas de insulina (humana e bovina) monitorizada através do uso de fluorescência de Tioflavina T (Th-T) (Le Vine, H. Quantification of b-Sheet Amyloid Fibril Structures with Thioflavin T. Methods Enol 309, 274-284 (1999)). A formação de fibrilhas pela insulina bovina foi notada pela aquisição de fluorescência Th-T, quando a insulina foi agitada a 180 rpm a 37°C, a pH 7,0 (PBS 50 mM) e a PH 2,0 ( ácido clorídrico em água) (Fig. 1) . 0 aumento na fluorescência Th-T ocorreu devido à sua ligação a fibrilhas de insulina atingindo um valor máximo às 48 horas para a insulina incubada a pH 7,0, enquanto a pH 2,0 a formação de fibrilhas foi rápida e assim, a fluorescência Th-T atingiu um valor máximo às 20 hr. A Fig. 1 compara a formação de fibrilhas de insulina bovina e humana. O Exemplo 3 do presente invento proporciona a cinética de libertação de monómeros de insulina a partir do complexo supramolecular de insulina II. A forma da insulina do complexo supramolecular de insulina actua como reservatório para a libertação controlada do monómero de 50 ΡΕ2133091 insulina durante longo tempo (Fig. 2a) . A libertação de monómeros de insulina a partir da sua estrutura amilóide e dos vários complexos supramoleculares de insulina foi observada e está descrita nas Fig. 2b & c. As fibras amilóides totalmente formadas libertam insulina negligivel independentemente do pH. A pH 2,0, os intermediários de complexos supramoleculares de insulina, particularmente o complexo supramolecular de insulina II, libertam insulina a uma velocidade muito lenta sugerindo que estes oligómeros estão associados de forma intima e robusta. No entanto, o intermediário do pH 7,0 (designado complexo supramolecular de insulina II), apresentando uma turbidez de 0,9-1,3 a 600 nm, liberta insulina numa velocidade apreciável. Observou-se um aumento linear na libertação dos monómeros de insulina a uma absorvância de 280 nm durante um periodo de 15 ± 5 dias. Quando a libertação de insulina a partir de SIA foi observada sob volume constante de 1 ml, observou-se uma curva em forma de sino (Fig. 2d) . Isto demonstra a reversibilidade do procedimento de formação de oligómeros e a existência de equilibrio entre a insulina livre e SIA. A fluorescência de tirosina da amostra libertada corroborou estas observações como se mostra na Fig 2a. O intermediário amilóide da insulina, complexo supramolecular de insulina II (em alternativa designado pré-amilóide de insulina II) preenche o requisito de libertação controlada de 2-4 μΜ (0,4-0,6 UI) dos monómeros de insulina por hora in vitro, atingindo assim uma libertação constante, ainda que lenta, in vivo para manter os niveis basais de insulina no corpo. 51 ΡΕ2133091 O exemplo 4 proporciona a caracterização do complexo supramolecular de insulina usando a ligação do vermelho Congo (CR) (Klunk, W.E., Jacob, R.F. & Mason, R.P. Quantifying amyloid by Congo red spectral shift assay. Methods Enzymol 309, 285-305 (1999) ) . À semelhança de Th-T, CR também se liga especificamente a estruturas ricas em folhas β de amilóide e tem sido de rotina usado para a sua detecção. A ligação de CR a amostras incubadas com CR 50 M em PBS durante 1 h a 37°C foi monitorizada pelo desvio no vermelho no seu máximo de absorção através do varrimento nas regiões de 400-600 nm. A Fig. 3 mostra que o complexo supramolecular de insulina (rH e bovina) apresenta ligação fraca a CR, enquanto as fibras totalmente crescidas a pH 2,0 e 7,0 apresentam ligação significativa. O Exemplo 5 apresenta o estudo de fluorescência de tirosina. O Exemplo 6 proporciona o estudo de espec-troscopia de infravermelhos transformada de Fourier. Os complexos supramoleculares de insulina I, II e III foram igualmente caracterizados usando ATR-FTIR. Foram observados espectros distintos correspondentes a cada fase (Fig. 4). Observou-se um desvio da banda IR no sentido de frequências mais baixas. O complexo supramolecular de insulina II possui um pico bem distinto a 1647-1645 cm-1, enquanto as fibrilhas de insulina totalmente formadas (amilóide) possuem um pico a 1630-1628 cm-1 para insulina bovina e rH, respectivamente. Os espectros FTIR do complexo supramolecular de insulina II estão de acordo com os dados de CR, mostrando que a proteína ainda é largamente helicoidal, 52 ΡΕ2133091 apesar do aumento no teor de estrutura enrolada aleatoriamente . A morfologia das fibras formadas a pH 2,0 e 7,0 foi avaliada por Microscopia de Força Atómica (AFM) e Microscopia Electrónica de Transmissão (TEM) como descrito no Exemplo 7 e 8 respectivamente. As moléculas nativas de insulina (bovina e rH) a pH 7,0 e a pH 2,0 mostram distribuição aleatória com uma altura de 1,3 ± 0,21 nm, o que está correlacionado com a dimensão dos monómeros de insulina (1,11 nm) e dimeros (1,49 nm) (Fig. 5 (i) ) . Os intermediários do processo de fibrilação a pH 7,0 estão apresentados na Fig. 5(ii-iv) para insulina bovina e Fig. 5 (v-vi) para insulina rH. SIA-I representa agregados alongados tendo um arranjo tipo pérola. Entre eles existe algumas partículas lineares alongadas com 12+2 nm de altura, sugerindo associação em estados oligoméricos superiores. O intermediário SIA-II é observado como uma associação linear dos agregados alongados atrás referidos no caso de insulina bovina e rH, tendo uma entidade única com uma organização estrutural supra-oligomérica. SIA-III (fase de fibrilhas que sucede a SIA-II) mostrou um aumento na densidade de estruturas oligoméricas superiores. As fibras totalmente crescidas a pH 7,0 representam a estrutura cruzada β tipica de amilóide da insulina (Fig. 5(vii)). Os intermediários do processo de fibrilação a pH 2,0 às 6-7 h revelam uma associação lateral de duas fibrilhas com 7,2-8,3 nm de altura e após 20 h, foram 53 ΡΕ2133091 observadas fibras maiores torcidas de 10-12 nm de largura (Fig. 5ix e 5x). 0 Exemplo 8 proporciona Microscopia Electrónica de Transmissão (TEM) para avaliar a presença dos possíveis complexos de insulina. As micrografias de TEM mostram a presença de algumas estruturas oligoméricas amorfas e superiores na fase de complexos supramoleculares de insulina II (Fig 6i). As fases após complexo supramolecular de insulina II (Fig 6 (ii)) possuem estrutura mais fibrilar como se mostra na Fig 6 (iii & iv) . Pelo contrário, existe uma abundância de formas fibrilares quando a insulina é incubada a pH 2,0 (Fig 6 (v)). O Exemplo 9 proporciona detalhes dos modelos animais usados para estudar a eficácia da amilóide de insulina e as formas dos complexos supramoleculares de insulina. Os autores usaram quatro modelos diferentes de diabetes para testar a hipótese e o potencial terapêutico de SIA, no tratamento de diabetes, nomeadamente, (a) ratos tratados com STZ, (b) ratos tratados com Alloxan e (c) murganhos tratados com STZ (d) coelho STZ.

Para normalizar a dosagem, 50 yg, 100 yg, 200 yg e 400 yg do complexo supramolecular de insulina-II foi injectado subcutaneamente e, como alternativa, intramuscularmente, em ratos diabéticos. Conforme resumido na Fig 7a&b, uma dose única de 50 e 100 yg do complexo supramolecular de insulina manteve os níveis quase normoglicémicos 54 ΡΕ2133091 até apenas 10 e 30 dias, respectivamente, comparativamente com 135 e 160 dias quando foi usado 200 yg do complexo supramolecular de insulina, bovina e humana, respectivamente. No caso da dosagem de 400 yg, observou-se normogli-cemia repentina sem jejum e hipoglicémia de jejum, independentemente da via usada, sugerindo libertação de um bolus inicial de um nivel basal do monómero de insulina a partir do depósito SIA de insulina bovina. A utilização de 200 yg do complexo supramolecular de insulina como dosagem terapêutica foi escolhida para estudos prospectivos detalhados a longo prazo. O Exemplo 10 proporciona o tratamento dos animais diabéticos com a forma da insulina de complexo supramolecular de insulina. Os ratos diabéticos induzidos com STZ, distribuídos por múltiplos grupos, foram tratados com insulina (4 Ul/kg, IP), complexo supramolecular de insulina (200 yg Sc e IM), respectivamente, para estudar o efeito in vivo da terapia com o complexo supramolecular de insulina no controlo dos níveis glicémicos do sangue. Ainda, um grupo de ratos diabéticos tratados com PBS e um outro grupo de ratos normais serviram como controlos diabético e não diabético. Os níveis de glucose pré-prandiais e pós-prandiais no sangue dos ratos foram monitorizados durante um período até o efeito fisiológico da insulina ser observado. Como se mostra na Fig 8a&b, o tratamento com 200 yg do complexo supramolecular de insulina manteve o nível basal de insulina devido à libertação controlada e lenta de monómeros de insulina a partir do depósito de complexo 55 ΡΕ2133091 supramolecular de insulina em ratos diabéticos induzidos com STZ, levando a uma redução significativa nos niveis de glucose do sangue sem hipoglicemia de jejum (Fig 9a&b). Não se observou diferença significativa quando o complexo supramolecular de insulina foi injectado pela via subcutânea ou intramuscular. No caso do tratamento com insulina livre (viz. na sua contraparte normal; forma não organizada supramolecularmente) (dose única de 4 Ul/kg), a glucose diária no sangue foi reduzida para um valor de não jejum de 350-450 mg/dl e de jejum de 300-400 mg/dl apenas. Os ratos diabéticos que diariamente receberam insulina intraperitonealmente mantiveram niveis hiperglicémicos de glucose no sangue (300 ± 100 mg/dl) . Ao contrário do tratamento com insulina livre, em que a dose diária foi necessária para manter a glucose no sangue entre niveis baixos e niveis muito elevados, uma única injecção de complexo supramolecular de insulina foi suficiente para se atingir niveis de glicémia quase normoglicémicos (150 ± 60 mg/dl) no rato diabético durante três meses sem hipoglicemia de jejum (90±50 mg/dl). Resultados semelhantes foram obtidos com o complexo supramolecular de insulina formado a partir de insulina humana, como descrito na Fig 8b&9b. A administração de insulina amilóide, formada a pH 7,0 e 2,0, não teve efeito benéfico no estatuto glicémico de ratos diabéticos, conforme evidente a partir da Fig 10. Novamente, o peso do corpo, que é um indicador de estado de saúde normal, foi monitorizado juntamente com BGL em todos os casos ao longo de todo o periodo do tratamento. Como se mostra na Fig 11, houve uma perda inicial do peso do corpo 56 ΡΕ2133091 imediatamente após tratamento com STZ, mas foram conseguidos ganhos de peso progressivos após tratamento com o complexo supramolecular de insulina II e a curva dos animais tratados com o complexo supramolecular de insulina foi paralela à do controlo não diabético. Assim, a surpreendente eficácia do complexo supramolecular de insulina II para usar no tratamento a longo prazo de diabetes mellitus é considerada uma melhoria relativamente aos métodos convencionais. 0 Exemplo 11 proporciona o teste de tolerância à glucose intraperitoneal para avaliar a eficácia do complexo supramolecular de insulina para libertar insulina numa forma continua. Foi monitorizada a libertação in vivo e ín vivo. A actividade biológica do monómero libertado foi estimada pelo nivel de glucose no sangue. Os detalhes das experiências independentes realizadas estão apresentados na Fig 12. Os niveis de glucose foram determinados antes (TO) e aos 10, 90, 150, 270 e 330 min após a administração de glucose a ratos em jejum, normais e tratados com STZ, quando do tratamento com PBS, complexo supramolecular de insulina II e insulina. Como se mostra na Fig 12, a injec-çao de insulina, complexo supramolecular de insulina II ou monómeros libertados in vitro apenas aumentou significativamente o teste de tolerância à glucose nos animais tratados e o seu nivel elevado de glucose no sangue após a infusão da glucose voltou para niveis pré-infusão em 1,5 hrs. O Exemplo 12 descreve a quantificação de insulina 57 ΡΕ2133091 no soro da insulina bovina e rH quando da administração do complexo supramolecular de insulina (Figura 13 a). A insulina no soro foi detectável até um período de 150 e 180 dias para SIA-II de insulina bovina e de rH, respectivamente, o que correspondeu a um decréscimo em BGL. O decréscimo dos níveis de glucose no sangue foi mantido até um período de 150 e 180 dias para SIA-II de insulina bovina e de insulina rH, respectivamente, mantendo valores de glucose perto do normal durante mais de 20-25 semanas com uma única dose do complexo supramolecular de insulina II. A ELISA de fase sólida foi realizada para quantificar os níveis de insulina no plasma libertada a partir de SIA II de insulina, que é responsável pela manutenção dos valores normais de glucose no sangue. Conforme esperado, a libertação de insulina ao nível basal ou ligeiramente acima do nível basal foi conseguida no caso de ratos diabéticos tratados com o complexo supramolecular de insulina (0,5-1,2 ng/ml) comparativamente com o nível de insulina não detectável (0,08 ng/ml) em ratos diabéticos tratados com PBS (Fig 13a&c). Uma libertação controlada de insulina (0,8-1,1 ng/ml) foi observada a partir do dia da injecção até 150-180 dias independentemente da via, o que contribuiu para valores quase normoglicémicos nos animais tratados com o complexo supramolecular de insulina. Ainda que tenha sido observada alguma variação de animal para animal, foram conseguidos valores notáveis de libertação de insulina, variando entre 0,5 e 1,2 ng/ml. Este nível basal foi suficiente para manter níveis normoglicémicos até à exaustão do complexo supramolecular de insulina. No 58 ΡΕ2133091 entanto, em animais diabéticos tratados com insulina, foi detectado um nivel médio no soro relativamente superior, mas com elevado grau de variação entre os animais. Isto foi atribuível à variabilidade inter-indivíduos em BGL pelo tratamento apenas com insulina. Os níveis séricos de insulina foram também quantificados para o teste de tolerância à glucose efectuado, para o qual os dados da glucose já foram mostrados. A Fig 13b descreve os valores de insulina bovina no soro de ratos até 270 min em experiências de IPGTT. No caso de ratos controlo e tratados com STZ a que foi dado apenas PBS, o valor da insulina bovina é quase negligível (Fig 13b) . No caso da administração de insulina, os valores de insulina aumentaram para ~0,9 ng/ml em 30 min e depois decresceram ao longo de um período de tempo. Um perfil semelhante foi observado quando se usou insulina terminalmente libertada que é equivalente a insulina livre. Isto corresponde ao decréscimo nos níveis de glucose no sangue, seguido do seu aumento devido à tomada e degradação de insulina. Por outro lado, no tratamento com o complexo supramolecular de insulina, os níveis de insulina no soro atingiram 0,8-0.9 ng/ml, equivalente ao nível basal em 30 min e depois permaneceram constantes durante o período do estudo, como observado pela quantificação de insulina bovina. Este nível basal conseguido de forma controlada assegura um nível normoglicémico, em vez do decréscimo drástico dos níveis e de causar hipoglicemia no animal. Ainda, o ELISA da insulina no rato foi realizado para avaliar os níveis de insulina sérica para ratos controlo e tratados com STZ. 59 ΡΕ2133091

Como se mostra na Fig 13c, o nível de insulina basal do rato é de 0,501 ng/ml e aumenta muitas vezes como resposta à glucose infundida. No caso dos ratos tratados com STZ, os níveis basais de insulina são quase negligíveis, devido à destruição das células pancreáticas β por STZ. Isto confirma que o decréscimo nos níveis de glucose do sangue, observado no caso do tratamento com o complexo supramo-lecular de insulina é devido à libertação de insulina bovina/rH a partir de SIA II. No processo de preparação de insulina SIA II, pode ser empregue outra insulina para além da insulina bovina ou rH seleccionada do grupo que inclui insulina de porco mas não lhe está limitado. 0 Exemplo 13 proporciona marcação com 125I da insulina para validar e quantificar a libertação in vitro a partir dos extremos de SIA III. O complexo supramolecular de insulina II formado a partir de insulina marcada tem uma actividade específica de 49912 cpm/ml/yg. 50 μΐ do complexo supramolecular de insulina (4991200 cpm) foram injectados subcutaneamente assim como intramuscularmente e os níveis de glucose no sangue foram monitorizados e as mostras de soro foram colhidas a 0, 30 min, lh, 4h, lOh, 24hrs, e depois uma vez ao dia e em seguida em dias alternados ou uma vez por semana. Mediram-se as contagens por ml de soro (Fig 14a). Como mostrado, o perfil de glucose no sangue foi o mesmo observado com SIA II não marcado. Os cpm/ml calculados permaneceram quase constantes (Fig. 14a) quando representados em função do número de dias de tratamento. No entanto, houve uma contagem inicial elevada aos 30 min- 60 ΡΕ2133091 4hrs, que depois diminuiu gradualmente para o nível constante de 2000-3000 em 10 hrs. A quantidade de insulina libertada no sangue foi calculada e foi na gama de 0,5-1,2 ng/ml, que corresponde ao nível basal ou ligeiramente acima do nível basal de insulina no soro, como observado por ELISA (Fig 14b) . Para provar melhor que a insulina libertada a partir do complexo supramolecular de insulina é monomérica, o soro de diferentes pontos de tempo foi separado em tricina-SDS-PAGE e o radiograma foi revelado usando um sistema Phospholmager. Como se mostra na Fig 15, a banda no soro corresponde ao monómero de insulina livre e a sua intensidade manteve-se constante durante um longo período quando foi aplicada igual quantidade de soro. Foi observado um decréscimo na intensidade após 20 dias mostrando a utilização e a depleção do depósito do complexo supramolecular de insulina durante um período de tempo, juntamente com algum efeito do decaimento da própria marca radioactiva. O Exemplo 14 descreve estudos de "clamp" hiperglicémico realizados para avaliar a libertação lenta e contínua de monómeros de insulina a partir de SIA II injectado. Com um intervalo de uma semana, um mês e três meses, a velocidade de glucose infundida para manter o estado hiperglicémico permaneceu inalterada no decurso da experiência. Isto mostra que houve libertação constante de insulina a partir do depósito no local de injecção. No caso do grupo a que foi administrada insulina livre, a quantidade de glucose infundida decresceu ao longo do 61 ΡΕ2133091 tempo, o que é devido a um decréscimo na tomada de glucose do sangue pelo músculo e fígado na ausência de fornecimento continuo de insulina livre (Figura 16a-c). 0 Exemplo 15 proporciona o efeito da insulina no transporte de glucose e outros eventos metabólicos nos tecidos adiposos fazendo cultura primária de adipócitos de rato que são mediadas pelas cascatas de sinalização intracelular que se iniciam após ligação da insulina aos receptores de insulina na superfície celular (Paul Bevan insulin signaling J. Cell Sei., 114, 1429-1430 (2001)). O efeito da insulina na célula é mediado pela activação de mediadores intracelulares tipo PI3K, AKT e ERK. A activação da cinase PI3 e Akt, medeia a tomada de glucose pela insulina e a translocação de vesículas GLUT-4 para a membrana plasmática e está envolvida em vários outros efeitos da insulina, incluindo a inibição da lipólise e a activação da síntese de ácidos gordos, glicogénio, proteínas e DNA. Por outro lado, a activação da via de sinal extracelular regulada por cinases (ERK) está implicada nas respostas de pré-adipócitos a factores de crescimento. Estudou-se o nível de PI3K que é a primeira cinase a jusante da sinalização da insulina. Como se mostra na Fig 17a, o nível de PI3K aumenta significativamente quando o complexo supramolecular de insulina e a insulina libertada a partir dele in vitro é usada comparativamente com o controlo. Não se observou diferença significativa comparativamente com a insulina. O nível de proteína total e activada de Akt, uma cinase treonina/serina importante na regulação da acção da 62 ΡΕ2133091 insulina e as suas várias respostas metabólicas em adipócitos foram igualmente avaliadas. Foi observado um aumento significativo no nivel de pAkt, o qual foi novamente semelhante à resposta observada com insulina livre. Não houve diferença no nivel de proteína Akt total, assim não se observou diferença na sua expressão na presença de insulina ou do seu complexo supramolecular de insulina II. Para avaliar se os perfis temporais observados e o nível de fosforilação Akt em adipócitos era paralelo à diferença na actividade Akt, a fosforilação do substrato Akt endógeno 0εΚ3β foi monitorizada por imunotransferência em membranas usando anticorpos contra Θ3Κ3β e ρ-Θ3Κ3β. Θ3Κ3β é directamente fosforilado por Akt na Ser-21 e é inactivada após a sua fosforilação. A fosforilação de Θ3Κ3β aumentou várias vezes em adipócitos tratados com insulina livre ou com o complexo supramolecular de insulina II comparativamente com o controlo e não houve diferença significativa entre as células tratadas. Não se observou diferença no nível de proteína total Θ3Κ3β sugerindo a não alteração da sua expressão subsequentemente ao tratamento. Assim, Akt e Θ3Κ3β mostraram respostas rápidas e pronunciadas ao complexo supramolecular de insulina II e à insulina libertada do complexo supramolecular de insulina e foram semelhantes às respostas observadas na estimulação com insulina livre usada como controlo. Observou-se a activação de ERK no tratamento de adipócitos com o complexo supramolecular de insulina e com a insulina libertada a partir dele, uma vez que esta cinase está envolvida na regulação mediada por insulina de factores de transcrição 63 ΡΕ2133091 de adipócitos e no desenvolvimento de tecido adiposo. No tratamento de adipócitos com insulina, o complexo supramolecular de insulina e a insulina libertada a partir do complexo supramolecular de insulina, observou-se uma activação significativa de ERK 1/2 comparativamente com o controlo. A fosforilação de ERK2 foi duas vezes superior à de ERK1 sugerindo mais expressão de ERK2 quando do tratamento. Não houve diferença significativa no padrão de fosforilação de ERK 1/2 em células tratadas com SIA, insulina ou soro. Assim, a fosforilação de ERK nas células tratadas com o complexo supramolecular de insulina II e com a insulina foi semelhante no contexto da sinalização mediada por PI3K, Akt e Θ3Κ3β. Observou-se activação semelhante dos mediadores de sinalização, quando o soro de animais tratados com insulina ou com SIA-II foi adicionado aos adipócitos em cultura (Fig. 17b) . Em conjunto estes dados demonstram que a insulina libertada pelo complexo supramolecular de insulina II é capaz de activar a via de sinalização da insulina em adipócitos como a própria insulina. Os efeitos observados são ainda melhores uma vez que a insulina na sua forma monomérica é libertada predominantemente a partir do seu complexo supramolecular de insulina. 0 Exemplo 16 descreve a análise de transferências Western de insulina, complexo supramolecular de insulina e insulina libertada in vitro (monómeros) e soro de ratos tratados com insulina, complexo supramolecular de insulina e PBS. 64 ΡΕ2133091 O Exemplo 17 descreve os detalhes de histologia e imuno-histoquimica do complexo supramolecular de insulina. Os ratos diabéticos tratados com o complexo supramolecular de insulina foram monitorizados relativamente à presença de quantidade residual de complexo supramolecular de insulina a partir do dia da injecção entre uma e doze semanas. O depósito do complexo supramolecular de insulina nos tecidos subcutâneos e músculo foi detectado usando vermelho Congo. As secções subcutâneas e de músculo foram preparadas, coradas e analisadas como descrito em materiais e métodos. Observou-se que os tecidos obtidos após 24 h da injecção do complexo supramolecular de insulina ligam-se ao vermelho Congo eficazmente, confirmando a presença de quantidades elevadas de fibrilhas do complexo supramolecular de insulina (Fig 18) . A ligação do vermelho Congo baixou de forma dependente do tempo e era negligivel após 16 semanas (Fig 18a (i-x) & b(i-x)), confirmando a libertação da insulina a partir dos extremos dos depósitos de complexos supramoleculares de insulina. Os mesmos tecidos foram também testados relativamente a inflamação causada por complexo supramoleculares de insulina através de H&E e imunocoloração. Lâminas representativas foram sujeitas ao método de coloração H&E e imuno-histoquimica relativamente à presença de células inflamatórias (Fig 18a(xi-xx) e 18b (xi-xv)).

Comparativamente com as secções de ratos injectados com LPS, em que a infiltração das células pro- 65 ΡΕ2133091 inflamatórias era visivel em tecidos subcutâneos e de músculo corados com H&E (Fig 19a(i-ii)), secções injectadas com o complexo supramolecular de insulina não apresentaram qualquer sinal de inflamação mesmo após 16 semanas (Fig 18a(xi-xv)). Resultados semelhantes foram observados no caso de lâminas imunocoradas em que LPS de Escherichia coli foi suficiente para atrair grande número de células pro-inflamatórias após 72h no local da injecção (Fig. 19a (iii-iv) ) enquanto tal reacção não foi observada em animais tratados com o complexo supramolecular de insulina (Fig 18a (xv-xx) e b(xi-xv)). Estas observações reforçam a natureza não tóxica do complexo supramolecular de insulina a ser usado. As estruturas amilóides formadas a pH 2,0 ligam-se ao corante vermelho Congo eficazmente como observado na Fig 19b, quando injectadas subcutaneamente. Ainda, não houve decréscimo detectável no depósito, corroborando os dados que não ocorre libertação de monómeros de insulina a partir do amilóide totalmente formado (Fig 19b i-viii). O Exemplo 18 descreve o modelo Alloxan de diabetes. Os ratos machos Wistar foram tornados diabéticos usando Alloxan e os seus niveis de glucose foram monitorizados. A administração do complexo supramolecular de insulina II a ratos diabéticos, baixou o nivel de glucose no sangue para perto dos niveis normoglicémicos e manteve um controlo glicémico apertado até >120 dias, em condições pré-prandiais e pós-prandiais (Fig 20 a&b) . A quantificação de insulina no soro foi feita usando ELISA. A partir do dia da injecção, uma libertação controlada e 66 ΡΕ2133091 constante de insulina humana foi observada no soro dos ratos tratados (0,5-0,9 ng/ml) (Fig 20c). Assim, o efeito fisiológico observado pelo abaixamento dos niveis de glucose em rato diabético é devido à libertação continua de monómeros de insulina a partir do depósito SIA-II formado no local da injecção.

Exemplo 19. Redução de complicações secundárias relacionadas com hiperglicemia em diabetes tipo 1: Em diabetes tipo 1, o fornecimento insuficiente de insulina conduz ao aumento da degradação proteica em músculos esqueléticos e lipólise em adipócitos. Os ratos diabéticos apresentaram um decréscimo marcado no músculo esquelético (~20-40%) e gordura abdominal (< 6 0 %) (Nathan, D. M., Cleary, P.A., Backlund, J. Y., et al. intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type I diabetes. N. Engl. J. Med. 353, 2643-53 (2005)). Pelo contrário, os animais diabéticos tratados com o complexo supramolecular de insulina tiveram peso normal para estes tecidos e estavam saudáveis. Observou-se o desenvolvimento de cataratas em ratos diabéticos assim como nos tratados com insulina (Fig 21). Ainda que não se tenha observado a formação de cataratas em animais tratados com SIA II, a maioria dos ratos não tratados apresentaram cataratas conforme demonstrado na Fig 21. Ainda, a função do figado e do rim, os dois principais órgãos do corpo que tipicamente e gravemente são atingidos pela diabetes estavam normais em ratos tratados com o complexo supramolecular de insulina II 67 ΡΕ2133091 comparativamente com os ratos não tratados ou infundidos com insulina livre, o que está resumido na Tabela 1.

As secções de coração, rim e figado foram avaliadas relativamente ao depósito de oligómeros superiores de SIA-II injectados em ratos diabéticos após 12 semanas, visualizados usando vermelho Congo (Fig 22). Não se observou depósito de oligómeros em qualquer uma das secções de tecido. 0 Exemplo 20 proporciona os detalhes da detecção da enzima degradadora de insulina (IDE) e o rastreio de anticorpos contra insulina. A resistência subcutânea à insulina em diabetes tipo 1 é uma síndroma rara (Paulsen, E.P., Courtney, J.W. & Duckworth, W.C. insulin resistance caused by massive degradation of subcutaneous insulin. Diabetes 28, 640-645 (1979) and Freidenberg, G.R., White, N., Cataland, S., 0'Dorisio, T.M., Solos, J.F. & Santiago, J.V. Diabetes responsive to intravenous but not subcutaneous insulin: effectiveness of aprotinin, N. Engl. J. Med. 305, 363-368 (1981)), definida como a ausência de acti- vidade biológica da insulina injectada subcutaneamente; no entanto, a eficácia da insulina infundida intravenosamente é mantida. Isto é principalmente atribuído ao aumento da degradação de insulina por IDE nos tecidos subcutâneos. IDE degrada insulina especificamente (Duckworth, W.C., Bennett, R.G. & Hamel, F.G. insulin degradation: progress and potential, Endocr. Rev. 19, 608-624 (1998)) e a insulina parcialmente degradada é reabsorvida na circulação, com 68 ΡΕ2133091 aumento da imunogenicididade mas sem actividade biológica. IDE está presente em tecidos que respondem à insulina e em células insensíveis à insulina, tais como monócitos e lin-fócitos. Para testar o desenvolvimento de tal resistência nos animais tratados com o complexo supramolecular de insulina, a actividade biológica de IDE e a presença de anticorpos anti-insulina foram determinadas como descrito na secção dos métodos. A actividade de IDE era negligível em todas as amostras de soro (1-12 semanas) derivadas de animais tratados com o complexo supramolecular de insulina (Fig 23). De forma semelhante, não houve presença de anticorpos anti-insulina mesmo após 12 semanas de tratamento, apoiando a ausência de actividade IDE (Fig 24).

Para ver se os monómeros de insulina libertados pelo complexo supramolecular de insulina sofrem alguma alteração na sua estrutura ou na sua dinâmica de ligação, realizou-se o ensaio MTT em linhas celulares MCF 7. A proliferação de células MCF 7, quando foi adicionada SIA à cultura foi semelhante à das células a que se adicionou insulina nativa. Ainda, os monómeros libertados a partir de SIA II formado, também apresentaram as mesmas cinéticas de proliferação celular. O factor de crescimento tipo insulina foi usado como controlo positivo para a proliferação de células MCF 7 (Fig. 25). Insulina e IGF 1 possuem estrutura semelhante e na ausência um do outro, podem ligar-se ao receptor de um e do outro. Mas enquanto IGF1 é mitogénico, a insulina quando se liga ao receptor de insulina ou ao receptor de IGF não causa proliferação das células. Assim, 69 ΡΕ2133091 os monómeros libertados a partir de SIA II possuem a mesma cinética de ligação da insulina nativa, e não sofrem qualquer alteração estrutural. 0 Exemplo 21 descreve o modelo de Estreptozoto-cina para a indução de diabetes em murganhos. A dose resposta para SIA humano e bovino em murganhos tornados diabéticos usando STZ. A administração das várias dosagens de 20, 50, 100 e 200 yg do respectivo SIA a murganhos diabéticos mantiveram normo/quase normoglicemia durante 5, 15, 30, 120 dias respectivamente (Fig 26a-c). O Exemplo 22 descreve o modelo de Estreptozo-tocina para a indução de diabetes em coelhos. A administração de 1 mg/kg de peso do corpo de SIA-II de insulina rH a coelhos diabéticos manteve a normoglicemia/quase normoglicemia durante pelo menos 80 dias (Fig 27) . O Exemplo 23 proporciona detalhes da experiência realizada com o complexo supramolecular de insulina juntamente com exendina-4. Para o tratamento de diabetes tipo II, foi administrado o complexo supramolecular de insulina ou exendina-4. A terapia administrada foi capaz de baixar os níveis de glucose e manter níveis quase normo-glicémicos em ratos diabéticos até >30 dias (Fig 28) . Os níveis de TAGs e FFA também permaneceram quase perto do normal comparativamente com os ratos tratados apenas com insulina ou com PBS, enquanto os níveis aumentaram até 1,5 vezes no soro como se mostra na Tabela 2. 70 ΡΕ2133091 A formulação do complexo supramolecular de insulina do presente invento mostra o resultado surpreendente da libertação dos monómeros de insulina durante um longo periodo. Ainda, o complexo de insulina supramolecular II do presente invento não apresenta uma libertação abrupta grande de insulina; anulando a fase hipoglicémica em ratos diabéticos tratados com STZ. Para validar o resultado inesperado atrás referido, foram analisados os intermediários do complexo supramolecular de insulina II obtidos durante o processo de fibrilação da insulina a pH 7,0. Encontrou-se que o complexo supramolecular de insulina intermediário II liberta monómeros de insulina a uma velocidade constante durante um longo periodo de tempo. O intermediário seleccionado (complexo supramolecular de insulina II) não apresenta ligação significativa de vermelho Congo indicando a sua incapacidade de progredir para uma fase amilóide e a análise por AFM confirmou a presença de uma associação linear dos oligómeros alongados como a espécie predominante. A altura desta entidade única é 18±5 nm comparativamente com a fibra totalmente alongada altamente enrolada com uma altura de 12±5 nm, sugerindo que os oligómeros alongados que formam o complexo supramolecular de insulina estão inchados e retiveram a estrutura tipo nativa. Estruturas não fibrilares semelhantes foram igualmente observadas por estudos de TEM. A eficácia biológica da insulina é, de um modo geral, avaliada pela sua capacidade para regular o nivel glicémico no sangue. O decréscimo resultante na concentração de glucose no sangue 71 ΡΕ2133091 representa o efeito mais notório e, terapeuticamente, o mais importante da insulina. Avaliou-se a eficiência do controlo glicémico nos ratos diabéticos STZ tratados com dose única do complexo supramolecular de insulina e comparativamente a injecção diária de insulina. Tanto o tratamento com o complexo supramolecular de insulina como a injecção de insulina reduziram a gravidade da hipergli-cemia. Comparativamente com o tratamento com insulina, a dose única do complexo supramolecular de insulina do presente invento mantém niveis quase normoglicémicos (120 mg/dl) no animal diabético durante um período de apro-ximadamente 150-180 dias. O presente invento ainda avalia o efeito do complexo supramolecular de insulina II na regulação do nível de glucose no sangue. Os animais diabéticos tratados com o complexo supramolecular de insulina foram sujeitos a jejum durante a noite. Estes animais com jejum foram capazes de manter os seus níveis de glucose no sangue em jejum dentro da gama normal (60-100 mg/dl) e não foi observada hipoglicemia pré-prandial. Em conjunto estes dados demonstram que a terapia com o estado oligomérico superior do complexo supramolecular de insulina II, comparativamente com a insulina convencional, atinge um controlo glicémico estreitamente regulado sem hipoglicemia de jejum nos animais diabéticos. O presente invento ainda avalia o efeito do tratamento com o complexo supramolecular de insulina II no 72 ΡΕ2133091 peso do corpo. 0 teste de tolerância à glucose intraperi-toneal foi conduzido para determinar o estabelecimento da actuação do complexo supramolecular de insulina no caso de hiperglicemia severa. 0 perfil de glucose no sangue IPGTT mostrou que o tratamento com insulina e com o complexo supramolecular de insulina apresenta efeito dentro de 30 min, sugerindo a ausência de atraso na libertação dos monómeros de insulina bioactivos a partir do depósito do complexo supramolecular de insulina II. 0 presente invento proporciona o perfil de libertação in vivo de insulina a partir do complexo supramolecular de insulina através da quantificação de insulina bovina/humana no soro usando ELISA. Contrariamente à cinética de libertação sigmóide observada in vitro, a libertação in vivo dos monómeros de insulina a partir do complexo supramolecular de insulina seguiu uma cinética de ordem zero, conforme esperado para uma libertação controlada. Observou-se uma libertação controlada do nivel basal e acima do basal (0,5-1,2 ng/ml) de insulina para manutenção de normoglicemia, o que estava bem correlacionado com a duração do tratamento. Para validar as cinéticas de libertação acima, fez-se a marcação radioactiva de insulina com 125I e o complexo supramolecular de insulina marcado com 125I foi injectado subcutaneamente ou intramuscularmente em animais tratados com STZ. A quantidade de insulina libertada foi medida através da monitorização de cpm/ml. CPM/ml/yg (49912) foi usado para a quantificação da insulina libertada no soro num ponto do 73 ΡΕ2133091 tempo particular e esta foi paralela à quantidade de insulina bovina quantificada usando ELISA. Após medição das contagens, as amostras de soro foram separadas em Tricina-SDS-PAGE. As imaqens de Phospholmaqer reveladas mostraram bandas correspondendo ao monómero de insulina. Os monómeros de insulina libertados a partir dos depósitos de complexo supramolecular de insulina induziram eficazmente a cascata de sinalização de insulina em adipócitos que respondem a insulina. A insulina libertada a partir do complexo supramolecular de insulina, in vitro e in vivo (soro), quando adicionada a adipócitos isolados foi capaz de activar os mediadores intracelulares (i.e. PI3K, Akt, ERK1/2 e Θ3Κ3β) da via de sinalização. Assim, os monómeros de insulina libertados a partir do depósito de complexo supramolecular de insulina são biologicamente activos e seguem o mesmo mecanismo da insulina para regular a homeostasia da glucose no corpo. A histoquimica também mostra que o complexo supramolecular de insulina II injectado em animais formou um depósito a partir do qual existe uma libertação lenta e controlada de insulina bioactiva. Ainda, não se observou inflamação em oposição à infiltração de leucócitos como resposta a LPS injectado subcutaneamente ou intramuscularmente. 0 presente invento mostra que a terapia com o complexo supramolecular de insulina confere profundos beneficios fisiológicos em animais diabéticos. Isto é parcialmente reflectido no controlo glicémico significativamente melhorado assim como nas concentrações 74 ΡΕ2133091 de ureia e creatinina marcadamente reduzidas devido à melhoria das funções hepática e renal nos ratos diabéticos como se mostra na Tabela 1. 0 presente invento proporciona detalhes de anticorpos anti-insulina e da enzima degradadora de insulina (IDE) no soro quando da administração do complexo supramolecular de insulina. A ausência de anticorpos anti-insulina mesmo no final da 12a semana reforça o valor do complexo supramolecular de insulina como tratamento de diabetes mellitus. A sua incapacidade para induzir IDE no local de injecção ou à volta dele é um factor importante no prolongamento da libertação de insulina a partir do complexo supramolecular de insulina e o concomitante efeito anti-diabético. 0 presente invento mostra que o monómero de insulina libertado a partir do complexo supramolecular de insulina II tem função biológica equivalente à insulina solúvel. Uma diferença significativa reside na duração da actuação, enquanto é apenas de 6-10 horas para a injecção de insulina convencional, surpreendentemente é cerca de 10 dias a cerca de 180 dias ou mais, dependendo da dosagem, para o complexo supramolecular de insulina II. Isto pode ser atribuído à notável estabilidade da insulina no complexo supramolecular de insulina, o qual forma um depósito no local de injecção para fornecimento da forma fisiologicamente mais relevante da insulina, viz. monómeros de insulina, durante longos períodos de tempo. 75 ΡΕ2133091 A administração do complexo supramolecular de insulina II da insulina humana leva a um controlo glicémico ainda melhor, observado durante um periodo de 135-180 dias. Tanto a injecção subcutânea como intramuscular do oligómero de insulina resultou em quase normoglicemia como é evidente nas figuras 8b e 9b. A insulina libertada no soro foi quantificada usando ELISA e foi observado que se mantém num nivel quase constante, resultando de uma libertação lenta e controlada a partir do depósito.

Ratos machos Wistar tornados diabéticos com Alloxan e murganhos C57BL/6 diabéticos tratados com estreptozotocina (serviu como um outro modelo de diabetes), ambos mostraram nivel de glucose no sangue quase normoglicémico quando tratados com o complexo supramolecular de insulina II. 0 complexo supramolecular de insulina I caracteriza-se por espécies inchadas e mais globulares com 18±2 nm de altura. O desenrolamento da estrutura peptidica durante o processo de formação da estrutura amilóide resulta em espécies globulares monoméricas aleatoriamente distribuídas individualmente sobre a superfície. Posteriormente, existe uma associação linear destes monómeros na fase II do complexo supramolecular de insulina II, ainda que retendo a sua morfologia inchada. Os 76 ΡΕ2133091 oligómeros formados representam agregados alongados, o mesmo para a insulina bovina, com uma altura de 1814 nm. No caso do complexo supramolecular de insulina III (mais perto da fase de fibrilhas, sucedendo a SIA III), observa-se um aumento na densidade das estruturas oligoméricas superiores. A estrutura é mais compacta com uma altura de 5 ±1 nm. A morfologia da estrutura global assemelha-se às fases de SIA bovinas, com as fibras totalmente formadas observadas posteriormente. 0 presente invento mostra a eficácia, assim como a exequibilidade da terapia com o complexo supramolecular de insulina para melhorar significativamente o nivel de glucose do sangue sem causar hipoglicemia de jejum no modelo animal diabético induzido com STZ. Ao contrário da terapia intensiva com insulina, através da qual os niveis de glucose no sangue são controlados através de um aumento da frequência da injecção de insulina com concomitante risco de hipoglicemia, o controlo glicémico melhorou significativamente usando a terapia com o complexo supramolecular de insulina, sem necessidade de múltiplas injecções e sem aumento excessivo do peso do corpo.

Uma outra mais-valia desta inovação deriva da extensão destes estudos a outras doenças que requerem uma infusão controlada e continua de insulina como terapia, como é o caso de diabetes mellitus tipo II (DM II) . Exedina-4 e insulina, em combinação, são utilizadas como terapia potente para DM II. A exendina-4 é conhecida por 77 ΡΕ2133091 baixar os níveis de glucose do sangue, através do decréscimo na absorção dos alimentos do estômago. Também retarda o esvaziamento gástrico, baixa os níveis de HbAc e previne o aumento grande de peso observado devido à terapia com insulina. Exendina-4 agrega-se num complexo oligomérico, a partir do qual os monómeros nativos de exendina-4 são libertados como é o caso da insulina descrito na secção anterior. A exendina-4 é usada como terapia adjuvante juntamente com SIA I e II para o tratamento de DM II em animais. 0 Exemplo 24 descreve a monitorização de hormonas contra-reguladoras, em que os estudos de "clamp" hiperinsu-linémico euglicémico/hipoglicémico foram realizados para monitorizar os níveis de hormonas contra-reguladoras de insulina, como seja glucagon e epinefrina. Foi observado um decréscimo de 40% no nível do pico de glucagon para ratos tratados com SIA-II comparativamente com ratos Wistar controlo normais (Fig 29) . Pelo contrário, os ratos tratados diariamente com insulina mostraram 8-90% de redução na resposta ao glucagon. Assim, a libertação de insulina basal a partir de SIA-II simula a fisiologia do corpo e não causa uma alteração significativa no mecanismo contra-regulador do corpo para manutenção da homeostasia de glucose, ao contrário do tratamento diário com insulina. A recorrência de hipoglicemia durante o tratamento com SIA-II em ratos diabéticos foi excluída através da monitorização da resposta da hormona contra- 78 ΡΕ2133091 reguladora da insulina à hipoglicemia induzida em vários grupos tratados. A regulação glicémica através da contra-regulação da insulina foi mantida em ratos tratados com SIA-II. 0 Exemplo 25 descreve o estudo de resistência à protease para avaliar a estabilidade do complexo supramolecular de insulina I, II e III. A resistência de SIA-II e SIA-III à clivagem por tripsina e proteinase K demonstrou a diferença na organização estrutural destes oligómeros. A insulina rH e S ΙΑ-1 são mais susceptiveis à clivagem pelas proteases comparativamente a SIA-II e SIA-III (Fig 30), as quais adoptam uma forma oligomérica de ordem superior resistente à acção das proteases.

Assim, o presente invento não só abrange doenças metabólicas tais como diabetes, tipo I e II, como pode ser estendido a doenças tais como dor crónica, sépsis, artrite, osteoporose, inflamação, etc., em que seja necessária uma infusão continua do fármaco, seja ele um péptido, proteina ou um fármaco de molécula pequena. Este invento também discute a exequibilidade da utilização do oligómero de insulina (SIA I, SA II e SIA III) para o tratamento de DM I, DM II e casos diabéticos na zona cinzenta. Esta metodologia de utilização dos oligómeros de fármacos como um depósito para o tratamento pode ser estendida a muitas mais doenças, tendo um largo espectro de aplicabilidade. 79 ΡΕ2133091

Os exemplos que se seguem contidos no presente invento são dados para ilustração do invento e, assim, não devem ser pensados como limitantes do âmbito do seu âmbito.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Fibrilação da insulina

Insulina bovina e rH, 2 mg/ml, foram dissolvidas em soro fisiológico tamponado com fosfatos (50 mM, pH 7,0) ou pH 2,0 (ácido clorídrico em água) e incubadas a 37°C, durante 72 h - 7 dias, com agitação constante a 180 rpm. As cinéticas de formação de fibrilhas foram monitorizadas através da monitorização da aquisição de fluorescência da Tioflavina T (ThT).

Exemplo 2

Fluorescência de tioflavina T A fluorescência de Th-T foi medida num espectro-fluorímetro Jobin Yvon Fluoromax usando larguras de abertura de 3 mm e 5 mm para excitação e emissão, respec-tivamente. As amostras incubadas com Th-T 50 μΜ, durante 15 minutos, foram excitadas e a sua emissão foi monitorizada na gama de 460-560 nm. Os dados foram corrigidos para o 80 ΡΕ2133091 branco e efeito do filtro interno usando a seguinte equação, Fc = F antilog[(Aex + Aem)/2]

Quando Fc é a fluorescência corrigida e F é a medida, Aex e Aem são a absorvância da solução de reacção nos comprimentos de onda de excitação e de emissão, respectivamente. A cinética de formação de fibrilhas pela insulina bovina e rH, a 37°C, está apresentada na Figura 1. A figura 1 (a) mostra a cinética de formação de fibrilhas a pH 7,0 monitorizada com fluorescência de Th-T 50 μΜ.

Exemplo 3

Cinética da libertação de monómeros in vitro a partir de intermediários e de fibrilhas totalmente formadas a pH 2,0 e a 7,0

Aliquotas de 200 μΐ (igual a 400 gg de insulina) foram retiradas em diferentes pontos de tempo a partir da reacção de fibrilação da insulina a pH 2,0 e 7,0, 37°C. O intermediário complexo supramolecular de insulina produzido foi isolado por centrifugação. O sedimento obtido foi lavado com PBS e ressuspenso em 1 ml de PBS num eppendorf. A tampa do eppendorf contendo os intermediários foi removida e o eppendorf fechado com membrana de diálise com 12 kDa de exclusão. O eppendorf foi então inserido, através do lado da membrana, num tubo Falcon de 50 ml contendo 20 ml 81 ΡΕ2133091 de PBS com 0,02% de azida de sódio e a cinética da libertação de insulina foi monitorizada durante 15 dias com agitação constante. A cinética de libertação foi monitorizada espectrofotometricamente a 280 nm e através da sua fluorescência intrínseca (tirosina). Calculou-se a quantidade de insulina libertada por hora. A Figura 2a mostra a libertação in vitro da insulina a partir do complexo supramolecular de insulina II monitorizada pela absorvância a 280 nm e a fluorescência intrínseca de tirosina. A intensidade de Th-T da solução dentro da membrana de diálise às 0 h e aos 15 dias está igualmente apresentada.

Para estudar o perfil de libertação de diferentes intermediários, pequenas alíquotas de intermediários e de fibrilhas amilóides totalmente formadas a pH 2,0 e 7,0, 37°C, foram retiradas do processo de fibrilação em intervalos regulares e centrifugadas a 10000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi removido e após lavagem do sedimento duas vezes com PBS, este foi ressuspenso em PBS. A libertação de insulina monomérica foi monitorizada espectrofotometricamente a 280 nm, 37°C. A cinética de libertação foi estudada em duas condições diferentes. Numa, o sedimento foi suspenso em PBS e dialisado através de uma membrana de 12 kDa de exclusão contra 20 ml de PBS com agitação constante (Fig 2a-c). Na segunda, o sedimento obtido foi suspenso em 1 ml de PBS e a absorvância do sobrenadante foi lida a 280 nm (Fig 2d). 82 ΡΕ2133091

Exemplo 4

Ligação de vermelho Congo A quantidade de vermelho Congo ligada aos oligó-meros de insulina/amilóide foi estimada como anteriormente descrito (Klunh, W.E., Jacob, R F. & M5son, R P. Quanti-fying amyloid by Congo red spectral shift assay. Methods Emymol 309, 285-305 (1999) ) usando a equação, moles de vermelho Congo ligado/L de suspensão amilóide = A540nm/ 252 95-A477nm/4 630 6. A figura 3 mostra os estudos de ligação do vermelho Congo com insulina nativa, complexo supramolecular de insulina II, complexo supramolecular de insulina II e insulina amilóide.

Exemplo 5

Fluorescência de tirosina O dialisato do complexo supramolecular de insulina, retirado em diferentes intervalos de tempo, numa cuvete de quartzo de 0,2 ml foi excitado a 270 nm e a emissão registada entre 320 e 370 nm. Usou-se uma largura de abertura de 5 nm para excitação e emissão. A figura 2 (a) mostra a libertação in vitro de insulina a partir do intermediário complexo supramolecular de insulina II monitorizada pela absorvância a 280 nm e pela fluorescência 83 ΡΕ2133091 intrínseca de tirosina. A intensidade de Th-T da solução dentro da membrana de disálise ao dia 0 e 15 está igualmente apresentada.

Exemplo 6

Espectroscopia de infravermelhos transformada de Fourier (FTIR)

Os espectros IR foram registados com um espec-trómetro de bancada para FTIR Bruker Tensor, equipado com um detector de telureto de mercúrio e cádmio arrefecido com N2 líquido. As amostras de insulina foram analisadas em Bio-ATR e 256 interferogramas foram registados à temperatura ambiente com uma resolução de 2 cm-1. Para cada espectro, o vapor de água foi subtraído e corrigida a linha de base. SIA I, II e III foram igualmente caracterizados usando ATR-FTIR. Foram observados diferentes espectros correspondendo a cada fase (Fig 4). 0 complexo supramolecular da insulina I, II e III da insulina bovina e rH foram também caracterizados usando ATR-FTIR. Observaram-se diferentes espectros correspondendo a cada fase.

Um desvio da banda IR no sentido de frequências mais baixas foi observado durante a fibrilação. 0 complexo 84 ΡΕ2133091 supramolecular de insulina II (SIA-II) possui um pico bem definido a 1647 cm-1 e 1645 cm-1 para insulina bovina e rH, respectivamente, enquanto o amilóide totalmente formados tem picos a 1630 cm-1 e 1628 cm-1 para os mesmos. Os espectros FTIR estão de acordo com os dados de ligação de CR, mostrando que a conformação de SIA-II é ainda largamente helicoidal, apesar de um aumento do teor da estrutura com enrolamento aleatório.

Exemplo 7

Microscopia de força atómica (AFM) 0 microscópio de força atómica Pico plus (Agilent Technologies) foi usado no modo MAC magnético acústico (contacto) para imagiologia. As imagens foram registadas no ar com uma superfície mica nua ou mica com amostra usando MAC cantiléver Typo II (constante da mola do cantiléver: 2,8 N/m, Frequência: 59,722 kHz). Retiraram-se amostras da mistura de fibrilação em vários pontos do tempo, diluíram-se 20 vezes com água e imobilizaram-se em mica clivada de fresco durante 2 minutos. As amostras foram lavadas com água nanopura, secas sob N2 e sujeitas a análise por AFM. A figura 5 proporciona morfologias de intermediários complexos supramoleculares de insulina e as fibrilhas de insulina estudadas por Microscopia de Força Atómica. Figura 5 (a) monómero de insulina (b) intermediário complexo supramolecular de insulina I, pH 7,0, (c) complexo 85 ΡΕ2133091 supramolecular de insulina II, pH 7,0, (d) complexo supramolecular de insulina III, pH 7,0, (e) SIA I humana, (f) SIA II humana, (g) SIA III humana e (h) fibrilhas totalmente formadas a pH 7,0, (i) mostra o intermediário complexo supramolecular de insulina formado às 6 hrs, pH 2,0 a 37°C, (j) mostra fibrilhas amilóides totalmente formadas a pH 2,0.

Exemplo 8

Microscopia electrónica de transmissão (TEM)

Para os estudos TEM, as amostras foram agitadas com vórtex e imediatamente absorvidas a grelhas de cobre de 300 mesh, revestidas com formvar, como tal ou diluídas a 1:2-20 vezes com água mili-Q e lavadas com água desionizada. As grelhas foram incubadas em 3% de acetato de uranilo durante 2-5 min e secas sob luz infravermelha para examinação das amostras por coloração negativa. As grelhas foram visualizadas com Philips CM-10 a 80 kV. As fotografias foram capturadas usando uma câmara MegaView III e analisadas usando o programa Imaging do Imaging System Philips. A Figura 6 mostra micrografias TEM de coloração negativa de fibrilhas de insulina e de intermediários do complexo supramolecular de insulina, em que a Figura 6 (a) mostra o intermediário complexo supramolecular de insulina I, pH 7,0, a Figura 6 (b) mostra o complexo supramolecular de insulina II, pH 7,0, a Figura 6 (c) mostra o intermediário III do complexo supramolecular de insulina, 86 ΡΕ2133091 ρΗ 7,0, a Figura 6 (d) mostra fibras maduras a pH 7,0. A Figura 6(e) mostra as fibras formadas a pH 2,0, 37°C.

Exemplo 9

Modelo de rato da diabetes

Foram usados ratos machos Wistar (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia) com nove semanas de idade, pesando 210±10 g. Os ratos foram alojados em gaiolas de polipropileno comerciais e mantidos em condições controladas de temperatura, num ciclo de luz-escuridão de 12 h e deixados com livre acesso a alimentos e água.

Modelo Estreptozotocina para indução de diabetes em ratos

Ratos machos Wistar pesando 250-300 g foram divididos em quatro grupos e a estimativa de glucose do sangue foi feita usando tiras de glucose Roche Accu Check. Os ratos foram mantidos em jejum durante 48 horas. 50 mg/kg de peso de corpo de Estreptozotocina preparado de fresco em tampão citrato (pH 4,5) foi administrado intraperitoneal-mente a 10-20 ratos. Foram dados alimentos imediatamente e os niveis de glucose no sangue foram avaliados após três dias. Os animais foram agrupados de acordo com o seu nivel de glucose no sangue (grupo I: 250-350 mg/dl, grupo II: 350-450 mg/dl e grupo III: >450 mg/dl). Os niveis elevados de glucose no sangue foram mantidos durante uma semana com 87 ΡΕ2133091 2-6 U/kg de peso do corpo (b.wt) de insulina bovina. Todos os ratos tratados com STZ desenvolveram hiperglicemia (niveis de glucose no sangue >250 mg/dl), 5 dias após injecção de STZ e os seus niveis de insulina sérica foram quantificados usando um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) em suporte sólido para insulina de rato (Mercodia). Os ratos com >250 mg/dl de glucose e niveis séricos de insulina negligiveis (-0,08 ng/ml) foram considerados diabéticos e usados na experiência.

Exemplo 10

Tratamento com o complexo supramolecular de insulina

Após uma semana de manutenção de niveis elevados de glucose no sangue com insulina, os ratos foram divididos em três grupos, cada um deles contendo 5 ratos. Os ratos do Grupo I receberam dose única de 4U/kg b.wt de insulina bovina intraperitonealmente por dia. Os ratos do Grupo II foram injectados com 4U/kg b.wt de insulina duas vezes ao dia. O Grupo III foi tratado com 200 yg do complexo supramolecular de insulina II (subcutaneamente assim como intramuscularmente) em 100 μΐ de PBS e os ratos do Grupo IV receberam 100 μΐ de PBS, constituindo o controlo diabético. Um grupo de 5 ratos normais injectados com 100 μΐ de PBS serviu como controlo não diabético. O peso do corpo e os niveis de glucose no sangue, ambos pré-prandiais após 8-10 horas de jejum e pós-prandiais foram testados inicialmente 88 ΡΕ2133091 diariamente e depois com menor frequência. A Figura 7 mostra a eficácia in vivo do complexo supramolecular de insulina (como alternativa insulina pré-amilóide) na homeostasia da glucose, (a) Nivel de glucose no sangue como resposta a várias dosagens do complexo supramolecular de insulina-II (bovino) administrado subcutaneamente e intramuscularmente (b) Nivel de glucose no sangue como resposta a várias dosagens do complexo supramolecular de insulina II (r-humana) administrada subcutaneamente e intramuscularmente. A Figura 8 mostra os niveis pós-prandiais de glucose no sangue monitorizados durante um período de 135 dias após administração de SIA-II bovina (a) insulina bovina, (b) insulina rH. A Figura 9 mostra os níveis pré-prandiais de glucose no sangue monitorizados durante um período de 160 dias após administração de SIA-II humana (a) insulina bovina, (b) insulina rH. A Figura 10 mostra o nível de glucose no sangue monitorizado após administração de amilóide da insulina formada a pH 2,0 e a pH 7,0. A Figura 11 mostra o perfil de peso do corpo de ratos diabéticos tratados com SIA-II, ratos diabéticos controlo e ratos controlo não diabéticos.

Exemplo 11

Teste de tolerância à glucose intraperitoneal

Os ratos tratados com STZ (n=12) e os ratos 89 ΡΕ2133091 normais (n=4) foram mantidos em jejum durante 12 hrs. Os níveis de glucose no sangue foram monitorizados como descrito atrás. Para a glucose fez-se o teste de tolerância. Resumidamente, os animais foram infundidos com 3 g/kg de peso de corpo de glucose, intraperitonealmente, seguido de injecção de 4U/kg b.wt de insulina bovina ao grupo I, 100 μΐ de insulina amilóide ao grupo II e 100 μΐ de PBS (veiculo) aos ratos do grupo III. Os niveis de glucose no sangue foram monitorizados aos 0, 30, 90, 150, 270 e 330 min após tratamento. O soro foi isolado a partir de vários pontos do tempo e construído um gráfico do nível de glucose no sangue em função do tempo. A Figura 12 mostra o perfil de glucose no sangue do teste de Tolerância à Glucose Intraperitoneal (IPGTT).

Exemplo 12

Quantificação de insulina sérica O soro foi isolado a partir de amostras de sangue colhidas e guardadas a -20°C para posterior análise. Os níveis de insulina bovina e de rato foram quantificados usando imunoensaio com enzima de dois locais em fase sólida (ELISA) da Mercodia (Suécia) , seguindo o protocolo do fabricante. A Figura 13a proporciona quantificação de insulina humana e bovina usando ELISA em ratos tratados com STZ em resposta ao complexo supramolecular de insulina injectado SC ou IM, a Figura 13(b) mostra a quantificação 90 ΡΕ2133091 de insulina sérica bovina de IPGTT, a Figura 13 (c) mostra o ELISA para insulina sérica de rato realizada para IPGTT.

Exemplo 13

Marcação de insulina com 125I

Para melhor validar e quantificar a libertação in vitro a partir dos extremos de SIA-II da insulina, foi feita a marcação da insulina com 125I (Pause, E., Bonner, O. & Nustad, K. Radioiodination of proteins with the iodogen method, in RIA and related procedures in medicine, International atomic agency, Vienna, 161-171 (1982)) . O complexo supramolecular da insulina formado a partir de insulina marcada tinha uma actividade especifica de 49912 cpm/ml/pg. 50 μΐ do complexo supramolecular de insulina (4991200 cpm) foi injectado subcutaneamente ou intramuscularmente e os niveis de glucose no sangue foram monitorizados e as amostras de soro colhidas aos 0, 30 min, lh, 4h, lOh, 24hrs, depois uma vez ao dia e seguidamente em dias alternados ou uma vez por semana. Mediram-se as contagens por ml de soro (Fig 14a) . Como se mostra na Fig 14b, o perfil de glucose no sangue foi o mesmo observado com o SIA II não marcado. Os cpm/ml calculados mantiveram-se quase constantes (Fig 14a) quando reprsentados em função do número de dias de tratamento. No entanto, houve uma contagem inicial elevada aos 30 min-4hrs, que depois diminuiu gradualmente para um nivel constante de 2000-3000 91 ΡΕ2133091 em 10 hrs. A quantidade de insulina libertada no sangue foi calculada e foi na gama de 0,5-1,2 ng/ml, correspondendo ao nivel basal ou sendo ligeiramente superior ao nivel basal de insulina no soro como observado com ELISA (Fig 14b) . Para melhor provar que a insulina libertada a partir do complexo supramolecular de insulina é monomérica, o soro de diferentes pontos do tempo foi separado em tricina-SDS-PAGE (Schaõgger, H. & Von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem 166, 368-379 (1987)) e o radiograma foi revelado usando o sistema Phosphorlmager. Como se mostra na Fig 15, a banda no soro corresponde ao monómero de insulina livre e a sua intensidade manteve-se constante durante um longo periodo quando quantidade igual de soro foi aplicada. Um decréscimo na intensidade foi observado após 20 dias, mostrando a utilização e a depleção do depósito do complexo supramolecular de insulina durante um periodo de tempo juntamente com algum efeito do decaimento da própria marca radioactiva.

Exemplo 14

"Clamp" hiperglicémico após tratamento com o complexo supramolecular de insulina II

Ratos machos Wistar foram anestesiados (2% de Isoflurane) e instalado um cateter na carótida e na jugular 92 ΡΕ2133091 para permitir a remoção de sangue e a injecção de glucose (solução a 20% de glucose) para manter o nivel de glucose no sangue a 600 mg/dl. Após um periodo de jejum de 12 horas, a glucose foi infundida em todos os grupos para os tornar hiperglicémicos. Seguiu-se a remoção de sangue nos intervalos de tempo indicados, sendo calculadas as medições de glucose no sangue e a velocidade de infusão da glucose necessária para os manter hiperglicémicos. Este procedimento foi repetido após um a três meses de administração de SIA II (Fig 16a-c).

Exemplo 15

Isolamento e cultura primária de adipócitos de rato

Os adipócitos de rato foram isolados e cultivados de acordo com o método descrito por Bjõrntorp et ai. (Bjõrntorp, P., Karlsson, M., Pettersson, P. & Sypniewska, G. Differentiation and function of rat adipocyte precursor cells in primary culture. J. Lipid Res. 21, 714-723 (1987)). Os ratos machos Wistar, alimentados livremente, foram mortos e o tecido gordo epididimal foi dissecado e colhido em reagente A (HBSS, 100 U/ml de penicilina, 100 yg/ml de estreptomicina e 50 yg/l de gentamicina). O tecido foi lavado adequadamente em HBSS. Após isto, o tecido foi cortado e finamente picado, transferido para um tubo Falcon e centrifugado a 200 g durante 2 min. A camada transparente 93 ΡΕ2133091 de gordura foi removida e a camada de células adipócitas (espessa e densa) foi adicionada a três volumes do reagente B (reagente A contendo 0,1% BSA e 1 mg/ml de Colagenase) num frasco. 0 frasco foi incubado a 37°C durante 60 min com agitação lenta continua. A reacção foi parada pela adição de meio DMEM completo (com HEPES 15 mM, glc, 0,1% BSA, adenosina 50 mM e 1% de soro fetal bovino) três vezes o volume e incubadas à temperatura ambiente durante 5 min. A reacção foi transferida para um tubo Falcon e centrifugada a 200 g durante 10 min. Os adipócitos foram colhidos após rejeição da camada de gordura superior e lavados duas vezes com o reagente A através de centrifugação a 200 g durante 10 min. As células foram transferidas para um frasco com um volume adequado de meio completo DMEM e incubadas durante 24 hrs a 37°C. Para a sinalização de insulina, os adipócitos foram centrifugados e mantidos em meio sem soro, durante 12 hrs, antes da sementeira de aproximadamente 2 ml em placas de cultura de 6 alvéolos e incubados durante mais 2 hrs.

Exemplo 16

Análise de transferências Western de lisados celulares totais

As células semeadas foram incubadas com insulina 20 nM, 50 μΐ do complexo supramolecular de insulina e a insulina libertada in vitro (monómeros) ou 50 μΐ de soro derivado de ratos tratados com insulina, complexo 94 ΡΕ2133091 supramolecular de insulina e PBS durante 10 min. Após incubação, as células foram colhidas num tubo Falcon e centrifugadas a 200 g durante 10 min. A camada superior de adipócitos foi colhida num tubo eppendorf e mantida em gelo. Adicionou-se 500 μΐ de tampão de lise (Tris 20 mM pH 8,0, 1% NP 40, NaCl 137 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM, DTT 1 mM, 10% glicerol, PMSF 1 mM, ortovanadato de sódio 0,4 mM e mistura de inibidores de proteases) e todas as amostras foram congeladas a -80°C, durante 2 hrs. Seguiu-se descongelação e incubação a 4°C, durante 4 hrs, com rotação constante. O sobrenadante foi colhido após centrifugação a 13000 rpm, durante 30 min e a concentração proteica no lisado celular foi estimada usando reagente de Bradford. Cinquenta microgramas de proteína celular total foram aplicados a cada pista e foram separados em 10% SDS-PAGE e transferidos para membrana de nitrocelulose usando o aparelho de transferência em imersão da Bio-Rad, a 4°C, durante a noite. Após transferência, a membrana foi removida e corada com Ponceau-S para visualização das bandas transferidas e descorada com água. A membrana foi bloqueada durante 1 hr, a 37°C, com 5% de leite em pó desnatado em PBS, pH 7,4, lavada e depois incubada durante a noite em anticorpo primário (diluição 1:1000 usando 1% de leite em pó desnatado em PBS) contra PI3K, p-Akt, Akt total, p-Gsk3b, Gsk3b, ERK 1/2, GAPDH e actina β (anticorpos da sinalização celular) a 4°C. Após lavagem co PBST, a membrana foi incubada durante 1 hr no respectivo 95 ΡΕ2133091 anticorpo secundário (conjugado de HRP) e as bandas imuno-reactivas foram visualizadas usando o protocolo ECL de transferências Western (Amersham). A Figura 17 mostra a análise por transferência Western (WB) de adipócitos em cultura relativamente a cascata de sinalização. Os adipócitos tratados com (a) PBS, insulina, SIA-II, insulina libertada a partir de SIA-II, (b) soro como indicado e analisadas relativamente à sinalização de insulina.

Exemplo 17

Histologia e imuno-histoquímica

Os ratos foram injectados com 200 yg de insulina SIA-II ou 150 yg de Lipopolissacáridos (LPS) de Escherichia coli (Sigma-Aldrich, MO, USA) através de injecções intramusculares ou subcutâneas no músculo da coxa e na pele dorsal, respectivamente. Os ratos injectados com LPS foram mortos após 48 hrs, enquanto os ratos injectados com insulina SIA-II foram monitorizados entre 1 e 12 semanas e as secções de tecido foram removidas com um intervalo de 7 dias. Os ratos foram anestesiados com cetamina e perfundidos com 4% paraformaldeído. A pele e os músculos da coxa foram removidos e o local de injecção foi retirado. Os tecidos foram então processados para embebição em parafina e foram sagitalmente seccionados com uma espessura de 10 ym e ainda processados de rotina para coloração com hematoxilina-eosina (H&E) para observar a histologia e a 96 ΡΕ2133091 infiltração de células inflamatórias, coloração com vermelho Congo (Lee, G. & Luna, Η. T. Manual of Histologic staining methods of armed forces institute of pathology. 3rd Ed McRaw-Hill book company (1960)) relativamente à presença de SIA-II residual e imuno-histoquímica (Sanz MJ, Marinova-Mutafchiev L, Green P, Lobb RR, & Feldmann M, Nourshargh S. IL-4-induced eosinophil accumulation in rat skin is dependent on endogenous TNF-alpha and alpha 4 integrin/VCAM-1 adhesion pathways. J Immunol. 160, 5637-

5645 (1998)) com anticorpos contra CDllb, RT-1A e CD6 (BD

Pharmigen, CA, USA). Todas as lâminas de imunofluorescência foram montadas permanentemente com reagente anti-esbatimento + meio de montagem (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) e observadas sob luz fluorescente relativamente aos anticorpos conjugados com FITC. As lâminas coradas com CR e H&E foram montadas com meio Citramount (Polysciences, PA, USA). As secções de H&E foram observadas com luz clara enquanto as lâminas coradas com CR foram observadas com luz clara e luz polarizada (Nikon Eclipse 80i, Nikon, Japan). As imagens foram capturadas usando uma câmara DS SMc CCD (Nikon Japan) e foram analisadas com o programa NIS-Element (Nikon Japan).

Exemplo 18

Modelo Alloxan para indução de diabetes em ratos

Ratos machos Wistar pesando 250-300 g foram 97 ΡΕ2133091 divididos em quatro grupos e a estimativa de glucose do sangue foi feita usando tiras de glucose Roche Accu Check. Os ratos foram mantidos em jejum durante 24 horas. 150 mg/kg de peso de corpo de Alloxan preparado de fresco em tampão citrato (pH 4,5) foi administrado intraperitoneal-mente a 10-20 ratos. Os animais foram alimentados imediatamente e os niveis de glucose no sangue foram avaliados após três dias. Os animais foram agrupados de acordo com o seu nivel de glucose no sangue (grupo I: 250-350 mg/dl, grupo II: 350-450 mg/dl e grupo III: >450 mg/dl). Os niveis elevados de glucose no sangue foram mantidos durante uma semana com 2-6 U/kg de peso do corpo (b.wt) de insulina bovina. Todos os ratos tratados com Alloxan desenvolveram hiperglicemia (niveis de glucose no sangue >250 mg/dl) , 5 dias após injecção de STZ e os seus niveis de insulina sérica foram quantificados usando um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) em suporte sólido para insulina de rato (Mercodia). Os ratos com >250 mg/dl de glucose e niveis séricos de insulina negligiveis (-0,18 ng/ml) foram considerados diabéticos e usados na experiência.

Exemplo 19

Exemplos dos parâmetros clínicos examinados

Realizaram-se ensaios bioquímicos para avaliação da toxicidade do tratamento com o complexo supramolecular 98 ΡΕ2133091 de insulina. Transaminase de glutamato oxalo-acetato sérica (SGOT), transaminase de glutamato piruvato sérica (SGPT), bilirrubina total, bilirrubina, fosfatase alcalina, proteínas séricas totais, albumina sérica, globulina sérica, razão A/G sérica, teste da função renal (KFT), formação de cataratas, peso do tecido adiposo, peso e aspecto do corpo foram estimados usando kits de ensaio disponíveis na Merck índia Ltd. A Tabela 1 apresenta a análise dos parâmetros clinicos para a avaliação da toxicidade de insulina SIA II. 0 soro isolado das amostras de sangue colhidas no final do estudo de três meses e foi sujeito aos vários testes indicados na Tabela. Os resultados são média ± d.p. de três experiências diferentes tendo n=4 animais em cada grupo.

Exemplo 20

Detecção de anticorpos anti-insulina e enzima degradadora de insulina (IDE) no soro

Realizou-se ELISA indirecta para a detecção de anticorpos anti-insulina no soro de rato seguindo o protocolo de ELISA convencional. O ELISA indirecto foi realizado para a detecção de anticorpos anti-insulina no soro de rato seguindo o protocolo de ELISA convencional. Resumidamente, 200 yl de insulina bovina a 2 mg/ml em tampão carbonato 50 mM, pH 9,6, foi usado para revestir uma 99 ΡΕ2133091 placa de ELISA de 96 alvéolos e mantido durante anoite a 4°C. Usou-se 5% de BSA em PBS para o bloqueio a 37°C durante 1 hr. A placa foi então lavada com PBST (0,02% Tween 20) e 200 μΐ de soro diluído a 1:100 foi adicionado e mantido a 37°C durante lhr. Outros ciclos de lavagem com PBST foram seguidos da adição de anticorpo secundário anti-IgG de rato conjugado com HRP diluído a 1:10000 e incubação durante 2 hrs a 37°C. A revelação da cor foi feita usando TMB como substrato e a reacção foi parada pela adição de H2SO4 concentrado. A placa foi lida a 450 nm num espectrofotómetro. 0 anticorpo anti-insulina foi usado como controlo positivo da reacção. IDE foi quantificada partir do soro usando o kit Insulysin/IDE InnoZyme™ Immunocapture Activity Assay (Calbiochem) seguindo o protocolo do fabricante. IDE de rato fornecido no kit serviu como controlo positivo.

Ensaios de proliferação celular

As células foram semeadas em placas de 24 alvéolos com 10000 células/alvéolo em meio DMEM regular contendo 10% FBS. As células foram transferidas para Meio sem soro durante 12 h e depois tratadas como indicado nas legendas da Fig. 25. Todos os tratamentos foram realizados em triplicados. O crescimento foi medido 3 dias após cada tratamento. O crescimento foi testado pelo ensaio MTT. Um total de 50 μΐ de solução de MTT a 5 mg/ml em PBS foi 100 ΡΕ2133091 adicionado a cada alvéolo. Após incubação durante 4 h a 37°C, os cristais de formazan foram lisados com 500 μΐ de solução de solubilização (20% SDS, 50% DMSO). A absorvância foi medida com um leitor de placas a 570 nm usando um filtro diferencial de 670 nm.

Exemplo 21

Modelo Estreptozotocina para indução de diabetes em murganhos

Usaram-se murganhos machos C57BL/6, singeneicos, com 12-16 semanas de idade. Os murganhos foram injectados intraperitonealmente com 50 mg/kg b.wt de estreptozotocina diariamente durante 5 dias. Os niveis de glucose no sangue foram estimados após duas semanas. Os murganhos com >300 mg/dl de glucose no sangue foram considerados diabéticos e seleccionados para outras experiências. Fez-se um total de seis grupos, cada grupo consistindo em seis murganhos. Várias dosagens, tais como de 10 μΐ, 25 μΐ 50 μΐ e 100 μΐ, de insulina SIA-II foram administradas subcutaneamente ou intramuscularmente a murganhos tornados diabéticos usando Estreptozotocina, com os dois outros grupos servindo como grupo diabético e não diabético. Foram monitorizados os níveis de glucose no sangue em jejum e em animais alimentados usando as tiras de glucose Roche Accu Check. 101 ΡΕ2133091

Exemplo 22

Modelo Estreptozotocina para indução de diabetes em coelhos

Foram usados coelhos machos New Zealand, pesando entre 1000 e 1200 g. Os animais foram mantidos em condições controladas de humidade e temperatura (22±2°C) e num ciclo de 12h de luz e de escuridão. O protocolo experimental e a manipulação animal foram de acordo com a comissão de ética institucional para animais do National Institute of Immunology, New Delhi, índia. Para a indução de diabetes experimental, os coelhos usados jejuaram durante 12 h, seguido da administração de 80 mg /kg b. wt de Estreptozotocina, preparada em tampão citrato, pH 4,5. Os niveis de glucose do sangue foram testados após três dias. Os coelhos que apresentaram BGL>450 mg/dl foram considerados diabéticos e ainda divididos em três grupos de três coelhos cada. Grupo I - coelhos normais, grupo II -diabéticos tratados com insulina, grupo III - diabéticos tratados com SIA-II (SC) e grupo IV - diabéticos tratados com PBS.

Exemplo 23

Modelo para indução de diabetes tipo II em ratos Wistar e seu tratamento usando SIA

Ratos machos Wistar, com 7 semanas de idade e pesando aproximadamente 200 g foram usados em todos os 102 ΡΕ2133091 estudos. Os animais foram alimentados com dieta de ração normal consistindo (como percentagem de kcal totais de 12% de gordura, 60% de açúcares e 28% de proteina ou uma dieta com elevado teor de gordura consistindo em 40% de gordura, 41% de açúcar e 18% de proteina. Após 2 semanas em dieta, os animais (com excepção dos controlos não injectados), após um jejum durante a noite, foram injectados com STZ (50 mg/kg) na veia da cauda através de um cateter de 24 gauge interno temporário. Os animais tiveram livre acesso a alimentos e água após a injecção de STZ e os animais injectados com STZ e não injectados mantiveram-se nas suas dietas originais (ração ou gordura) durante a duração do estudo. Os animais com niveis elevados de glucose no sangue receberam PBS como veiculo, insulina SIA ou insulina SIA com exendina-4a subcutaneamente. Colheu-se o sangue e o soro foi separado por centrifugação e analisado relativamente a concentrações de glucose (tiras de glucose, Accucheck, Roche), insulina (Insulin Elisa Kit, Mercodia), triglicéridos (TG) (oxidase de glicerol fosfato método [GPO]-Trinder, Sigma) e ácidos gordos livres (método da sintetase de acil coenzima-A [ACS-ACOD], Wako Diagnostics, Richmond, VA).

Diabetes tipo II: modelo Db/db

Murganhos Db/db num fundo C57BL/6 foram alimentados ad libitum com uma dieta convencional e mantidos num ciclo de luz/escuridão de 12 h. As amostras de sangue foram colhidas via veia da cauda e os niveis de glucose circulante foram determinados usando um glucómetro (tiras 103 ΡΕ2133091 de glucose Roche Accu Check). Os níveis de insulina sérica foram determinados a partir de amostras do soro usando um kit de ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) para insulina (Mecodia). A glucose no sangue em jejum e a glucose de animais alimentados aleatoriamente foi avaliada na manhã de dias alternados.

Exemplo 24

Monitorização da hormona contra-reguladora de insulina 0 procedimento de "clamp" hiperinsulinémico da glucose foi seguido para proporcionar um estímulo hipoglicémico aos ratos. Os animais foram cateterizados como descrito atrás. Ratos conscientes e sem stress foram alimentados durante 12-24 horas antes do início da experiência. A infusão constante de insulina de 30 mU/kg.min foi iniciada juntamente com uma infusão variável de glucose exógena, a qual foi ajustada com base na medição da glucose no sangue obtida em intervalos de 10 min para se atingir o nível de glucose pretendido. Durante os primeiros 90 min da experiência, os ratos foram levados até à euglicemia, -110 mg/dl. A partir daí, o nível de glucose no sangue foi diminuído para -50 mg/dl (hipoglicemia induzida por infusão de insulina) e foi mantido nos 90 min seguintes. As experiências eram terminadas se os níveis de glucose caíssem abaixo de 80 mg/dl e 40 mg/dl durante as fases euglicémica e hipoglicémica, respectivamente. As amostras de sangue para medição do glucagon e epinefrina 104 ΡΕ2133091 foram retiradas a vários intervalos de tempo, como indicado na Figura 29.

Exemplo 25

Resistência a proteases A 20 μΐ de insulina rH, SIA-I, SIA-II e SIA-III a 2 mg/ml, adicionou-se uma diluição de 1:5, 1:10 e 1:50 de tripsina a 2 mg/ml e 1:1000, 1:2000 e 1:5000 de proteinase K a 2 mg/ml. A mistura de reacção foi incubada durante 12 hrs a 37°C numa estufa. As amostras foram aplicadas em 20% SDS-PAGE e analisadas usando corante Coomassie.

Tabela 1: Análise dos parâmetros clínicos para a avaliação da toxicidade do complexo supramolecular de insulina II (SIA II)

Parâmetros eafimadoa Rato· iwm»» Tratados com S1A ti Uma injesçào de Duas mjecçdes da insulina diária Insultas diárias LFT 0.35 ± 0,03 0.35 *0.06 0,40 * 0.08* 0.35 ±0.1 Biwrybma 0.108* 0,02 0,1 ±0,03 0.36 ± 0.08* 0.25 ±0.06* 223.8*79 219,8 ± 61 35 5 * 83* 300 ±56* SGPTp!) 74,8± Π 77 í: ?í 8á ± 36 85 ± 35 Fasfitiase alaeelina 343 ,2 * 7&.ΪΙ 431 * 70,3 777.8 ±80,4* 489 ±65 Preiefcas Mas totais igidSi 3,92 ±0.095 6,34*03 6,70 ± 0.23* 5,55 * 0.25* Albumina séríea igítíl; 1,77 ±Ô.H 1.85 ±0.13 2.5 ± 6.21 3.2 ± 0,19 Giebaí™ sériea içídíi 2,15 ± 0,08 2,64 ±0.12 4.2 ± Ô.iS 3.35 ± 0.15 Razão AÍS séries 0,823 1,3 0,595 0,955 KF? ureia {mgími) 47.08 ds 10,8 50,9 ± 7.6 58.3 * 0.2 60.1 ± 12,36 0,80 * 0,06 0,83 ± 0.02 1.81 * 0.30 Ô.88±8,21 emafaaina sáriaa ímg;di} ácidc úrlec 2.39*0,12 2,26 ± 0,08 3.0 ±0,81 3.1 ± 0,56 eiectfòiífois se«l« (mEq;í; 140.6* n 144* SO 200 * 26 .198 ±45.5 fèsiere {mÉqffl} 4,5 * },0 S 4,4 * 11 6,5 ± U 6.2 ± 0,95 eíore imlqíi! 102,8* 12 301 J. i7 165 * 23 119 ± 26 Formação de cataratas, Tecídc adiposo (*) (-) (+> W item! itefísaf Jssimskfe Oínssswklo | Peso e aspecís do corpo Φ Φ J: ^ φ φ^ {+) T*rl ΡΕ2133091 105 © Ο Μ £2 Η» Ο Q £Ξ ϊΛ Ο S δ> £

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Lisboa, 19 de agosto de 2013

Claims (15)

1. ΡΕ2133091 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um complexo supramolecular de insulina (SIA) para usar no tratamento de distúrbios metabólicos selec-cionados do grupo que consiste em diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 e complicações dos mesmos, o referido complexo compreendendo uma forma oligomérica insolúvel e agregada da insulina como SIA I, SIA II, SIA III ou combinações das mesmas, em que SIA I consiste em aglomerados alongados tendo um arranjo tipo pérola do monómero de insulina, SIA II consiste numa associação linear de agregados alongados tendo um arranjo tipo pérola de monómeros de insulina e SIA III consistem em cerca de 90% de SIA-II e é uma associação densa, linear, de oligómeros de insulina.
2. 2. O complexo supramolecular de insulina (SIA) para uso da reivindicação 1, em que a referida insulina é insulina humana recombinante, insulina bovina ou de porco, ou mutantes/análogos de insulina.
3. 3. O complexo supramolecular de insulina (SIA) para uso de qualquer uma das reivindicações 1 a 2, em que o referido complexo liberta insulina a uma velocidade que varia entre 0,1 e 5,4 ng/ml, durante cerca de 7 a 180 dias, in vivo.
4. 4 . O complexo supramolecular de insulina (SIA) 2 ΡΕ2133091 para uso da reivindicação 1, em que o referido complexo compreende SIA I e liberta insulina a uma velocidade que varia entre 4 e 5,4 ng/ml durante pelo menos 7-10 dias.
5. 5. O complexo supramolecular de insulina (SIA) para uso de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido complexo compreende SIA II e liberta insulina a uma velocidade que varia entre 0,5 e 1,8 ng/ml durante pelo menos 160 dias.
6. 6. O complexo supramolecular de insulina (SIA) para uso de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido complexo compreende SIA III e liberta insulina a uma velocidade que varia entre 0,1 e 0,7 ng/ml durante pelo menos 180 dias.
7. 7. O complexo supramolecular de insulina (SIA) para uso da reivindicação 1, em que o referido complexo compreende SIA II e quando da administração a individuos diabéticos mantém um nivel quase normoglicémico (120 ± 30 mg/dl) durante pelo menos 160 dias num individuo necessitado do mesmo.
8. 8. O complexo supramolecular de insulina (SIA) para uso de qualquer uma das reivindicações 1 a 2, em que uma única dose do referido complexo quando administrada mantém um nivel quase normoglicémico (120 ± 30 mg/dl) durante pelo menos 7 a 180 dias num individuo necessitado do mesmo, em que a concentração do referido complexo na 3 ΡΕ2133091 referida dose situa-se na gama de 0,125 a 3,75 mg/kg de peso do corpo; ou em que uma dose única do referido complexo quando administrada mantém um nivel quase normoglicémico (120 ± 30 mg/dl) durante pelo menos 160 dias num indivíduo necessitado do mesmo, em que a concentração do referido complexo se situa na gama de 0,75 a 1,25 mg/kg de peso do corpo.
9. 9. O complexo supramolecular de insulina para uso na reivindicação 1, sendo um pró-fármaco não citotó-xico, não imunogénico, não apoptótico e não mitogénico.
10. 10. Uma composição farmacêutica para uso no tratamento de distúrbios metabólicos seleccionados do grupo que consiste em diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 e complicações dos mesmos, a referida composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do complexo supramolecular de insulina (SIA) como definido em qualquer uma das revindicações 1 a 9.
11. 11. A composição farmacêutica para uso da reivindicação 10, compreendendo ainda veículos, aditivos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
12. 12. A composição farmacêutica para uso da reivindicação 10 ou 11, em que a composição farmacêutica é administrada intramuscularmente, intradermicamente ou sub-cutaneamente e/ou em que a composição farmacêutica é 4 ΡΕ2133091 administrada através de um dispositivo capaz de libertar a referida composição, o referido dispositivo sendo selec-cionado do grupo que consiste em bombas, cateteres, emplastros e implantes.
13. 13. Um processo para a preparação de complexo supramolecular de insulina (SIA) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, o referido processo compreendendo : (a) dissolução da insulina a uma temperatura entre cerca de 25 e 60°C, de preferência a 37°C, numa solução tendo pH na gama de cerca de 1,5 a 7,8, de preferência 6,8 a 7,8, mais de preferência 7,2; e (b) incubação da solução acima durante um período de cerca de 6 a 48 horas, de preferência 8 a 12 horas, mais de preferência 10 horas, com agitação constante para se obter um complexo supramolecular de insulina (SIA), em que SIA compreende uma forma oligomérica insolúvel e agregada de insulina.
14. 14. 0 processo da reivindicação 13, ainda compreende: (c) lavagem do referido SISA com PBS; e (d) ressuspensão do referido SIA em PBS.
15. 15. 0 processo de qualquer uma das reivindicações 13 ou 14, em que a solução é seleccionada entre 5 ΡΕ2133091 ácido clorídrico ou acético em água, tendo pH na gama entre cerca de 1,5 e 2,5; tampão acetato de sódio tendo pH na gama entre cerca de 3,5 e 5,5; tampão de fosfatos (PBS) tendo pH 6 a 7,5 e tampão citrato tendo pH na gama de cerca de 4 a 6. Lisboa, 19 de agosto de 2013