CZ20001492A3 - Přípravky nerozpustného inzulínu - Google Patents

Abstract

Předložené řešení se týká nerozpustných přípravků obsahujících acylované proteiny zvolené ze skupiny zahrnující acylovaný inzulín, acylovaný analog inzulínu a acylovaný proinzulín a jejich formulace. Lormulace jsou vhodné pro parenterální podání nebo jiné způsoby podání pacientovi pro podloužené řízení hladin glukózy v krvi. Obzvláště se předložené řešení týká přípravků obsahujících acylovaný protein tvořící komplex se zinkem, protaminem a fenolickou sloučeninou tak, že výsledný mikrokrystal je analogický krystalické formě neutrálního protaminového inzulínu Hagedom (NPH). Překvapivě bylo zjištěno, že přípravky takových acylovaných proteinů mají terapeuticky výhodnější farmakokinetiku subkutánního uvolňování a prodlouženější a plošší glukodynamiku než v současnosti dostupné komerční přípravky inzulínu NPH. Přitom si předložené kiystaly zachovávají jisté výhodné vlastnosti krystalů NPH, které jsou snadno schopné resuspendování a také mísitelné s rozpustnými inzulíny.

Description

- 1 Přípravky nerozpustného inzulínu

Tato přihláška nárokuje prioritu pro US předběžnou přihlášku sériové číslo 60/063104, podanou 24. října 1997 a US předběžnou přihlášku sériové číslo 60/088930, podanou 11. června 1998.

Oblast techniky

Tento vynález'je z oblasti humánní medicíny. Zvláště je z oblasti farmaceutického léčení nemocí diabetů a hyperglykémie.

Dosavadní stav techniky

Dlouho je cílem inzulínové terapie napodobit vzor endogenní sekrece inzulínu u normálních jedinců.

Denní fyziologická potřeba inzulínu kolísá a muže se rozdělit do dvou fází: ;

a) abso.řpční fáze vyžadující prudký vzestup inzulínu, aby. se odstranil vzestup glukózy související s jídlem a

b) postabsorpční fáze vyžadující trvalé uvolňování inzulínu, aby se reguloval výdej glukózy z jater, jímž se udržuje optimální hladina glukózy v krvi při hladovění.

Účinná terapie pro lidi s diabetem tudíž obecně zahrnuje kombinované použití dvou typů přípravků éxogenního inzulínu: rychle působící inzulín po jídle poskytovaný bolusovými injekcemi a dlouhodobě působící, takzvaný bazální inzulín, podávaný injekcí jednou nebo dvakrát denně, jímž se řídí hladiny glukózy v krvi mezi • 4 4

4 · 4 ·

4· 444 4 4444 4 .44 4 4 · 4 4 44 4

4« 44 4 6 ·4 44 44 jídly. Ideální bazální inzulín poskytuje prodloužený a plochý průběh účinku v čase - to jest, řídi hladiny glukózy v krvi přinejmenším 12 hodin, výhodně 24 hodin a více, bez významného rizika hypoglykémie. Dále ideální bazální inzulín by měl být míchatelný s rozpustným inzulínem pro podání po jídle a neměl by způsobovat podráždění nebo reakci v místě podání. Konečně přípravky bazálního inzulinu,' které jsou formulacemi suspenzí, by měly být pacientem před podáním snadno a rovnoměrně resuspendovány.

Jak odborník v oboru dobře zná, přípravky dlouhodobě působícího inzul/nu se získávají formulací mormálního inzulinu jako mikrokrystalických.suspenzí pro subkutánní injekci. Příklady komerčních přípravků bazálního inzulinu zahrnují NPH (Neutrál Protamine Hagědorn) inzulín, PZI (protamine zinc insulin) a UL (ultralente). NPH inzulín je nej rozšířenější používaný . přípravek inzulinu, tvořící 50 až 70 % světové spotřeby inzulinu. Je to suspenze mikrokrystalického komplexu inzulinu, zinku, protaminu a jednoho nebo více fenolických < konzervancií. Přípravky NPH inzulinu jsou komerčně dostupné s obsahem lidského inzulinu, prasečího inzulínu, hovězího inzulinu nebo jejich směsí. V oboru jsou také známy NPH přípravkům podobné přípravky monomerního analogu inzulinu, analog LysB298,ProB29-lidského inzulinu.. (Zde zkracované jako NPL: De Felippis, M. R., US patent č.

461 031, vydaný 24. října 1995, De Felippis, M. R., US patent č. 5 650 486, vydaný 22. července 1997 a De Felippis, M. R., US patent'č. 5 747 642, vydaný 5. května 1998).

Mikrokrystaly NPH inzulinu mají výraznou • ftftft · ·· · . ft · · * • · · ftftft ······ ft· ft

3· · ft · · ft · ftftft·

- ··«· ft··· ftftft· tyčinkovitou morfologii s typickými rozměry asi 5 μηι délky a 1 μπι tloušťky a 1 μπι šířky. Prodloužené trváni účinku mikrokrystalů NPH inzulínu je výsledkem jejich pomalé absorpce z místa subkutánní injekce.

Terapie využívající v současné době.dostupné přípravky NPH' inzulínu selhává při udržování ideální ploché farmakokinetiky nezbytné k udržování optimální hladiny glukózy v krvi po delší dobu mezi jídly. Z toho vyplývá, že léčení NPH inzulínem může vyústit v nežádoucí vysoké hladiny inzulínu v krvi, což může způsobit život ohrožující hypoglykémii.

. Vedle selhávání při udržování ideálního plochého farmakokinetického profilu není trvání účinku NPH inzulínu rovněž ideální. Obzvláště velkým problémem s terapií NPH je fenomén poklesu, což je hyperglykémie, která je výsledkem ztráty účinného řízení glukózy přes noc, když pacient spí. Tyto nedostatky v řízení glykémie přispívají k vážným dlouhodobým lékařským komplikacím diabetů a pro pacienta znamenají výraznou obtíž a zhoršení kvality života.

PZI (protamine zinc insulin) má složení podobné NPH, ale obsahuje vyšší hladiny protaminu a zinku než NPH. Přípravky PZI se mohou připravit jako střednědobě působící amorfní sraženiny nebo dlouhodobě působící krystalické materiály. PZI však není ideálním bazálním inzulínovým farmaceutikem, protože jej nelze míchat s rozpustným inzulínem pro podání v době jídla a vysoký obsah protaminu a zinku může způsobit podráždění nebo reakci v místě podání.

• · · · · · · ·«· · · · · · • · · ·· 9 · · · ·· · • · ·· ··.··' · · 99 ' . Lidský inzulín ultralente je mikřokrystalický přípravek inzulínu, který má vyšší hladiny zinku než NPH a do krystalů nemá ínkorpprován ani protamin ani fenolické konzervans. Lidské přípravky ultralente poskytují mírný účinek v čase, který není vhodně plochý a s inzulínem nevytvářejí stabilní směsi. Navíc jsou obtížně resuspendovatelné.

Byly učiněny pokusy určit pozorované nedostatky známých suspenzí inzulínu..Pro bazáíní řízení krevní glukózy byly zkoumány inzulíny acylované mastnými kyselinami (Havelund S. a kol., publikace WIPO WO 95/07931, 23. března 1995).. Jejich prodloužený účinek je způsoben vazbou acylové části mastné, kyseliny těchto molekul na sérový albumin. Délka řetězce acylu mastné kyseliny těchto molekul je taková, že je možno využít výhodu vazebné schopností sérového albuminu pró mastné kyseliny. Řetězce mastných kyselin použité u inzulínů acylovaných mastnými kyselinami jsou typicky delší než asi 10 atomů uhlíku, přičemž délky řetězců 14 až 16 atomů uhlíku jsou pro vazbu na sérový albumin a prodloužení účinku optimální.

Narozdíl od inzulínu NPH, který je nerozpustný, jsou výše- zmíněné inzulíny acylované mastnými kyselinami při běžných terapeutických koncetracích inzulínu rozpustné. Doba účinku těchto, přípravků však nemůže být dostatečně dlouhá nebo účinek nemůže mít dostatečně plochý průběh, aby poskytly ideální bazální řízení a jsou méně účinné než inzulín, v důsledku čeho vyžadují podávání větších množství léčiva (Radziuk J. a kol., Diabetologia, 41. 116 - 120, 489 - 490 (1998)). ’ • · 9« 9999 99

9 9 9 9 9 9 9 9 » · · • ••tt · · · tt tt··· • ·· tttttt · ····« ·· « • ·· · 9 9 · ···· ·· ·· tttt tttt 9999

Whittingham, J. L- a kol. (Biochemistry, 36.,

2826 - 2831 (1997)) krystalizoval pro účely strukturních studií pomočí rentgenové krystalografie B29-N-eta-tetradekanoyl-des(Β3Ό)-analog lidského inzulínu jako hexamerový komplex se' zinkem a fenolem. Bylo shledáno, že hexamer je v konformaci R6 a má- jisté vlastnosti odlišné od hexamerů lidského inzulínu. Whittingham a kol. nezveřejňují žádné farmaceutické nebo farmakologické vlastnosti vytvořeného krystalu, ani nenavrhují, že by takový krystal měl mít nějaké výhodné vlastnosti.pro léčení diabetů a hyperglykémie. Z Whittinghama a kol. není možné predikovat zda krystaly NPH typu obsahující protamin mohou být vytvořeny s derivovaným inzulínem a.analogy inzulínu nebo jaká by na takové krystaly byla farmakokinetická nebo farmakodynamické odpověď.

Zůstává tedy potřeba identifikovat přípravky inzulínu, které mají plošší průběh a delší dobu účinku než NPH inzulín, které lze míchat s rozpustnými inzulíny podávanými v době jídla, které mohou byt snadno resuspendovány a které nepředstavují riziko dráždění nebo reakce v místě podání.

fe

Podstata vynálezu ♦

Bylo neočekávaně pozorováno, že pokud Se rozpustnost inzulínu sníží derivací jedné nebo více jeho reaktivních postranních skupin, může být derivovaný inzulín inkorporován do krystalů s protaminem podobných NPH. Pokud se derivovaný protein vysrážen nebo krystalován, je míra,' jakou *se derivát inzulínu rozpouští z tuhé formy, silně snížena ve srovnání s mírou, jakou se rozpouštějí, podobné tuhé formy složené z nederivovaného • · · · · · · · ·· ·· * · · · ···· · « t · ♦ ··· · · · · · · · · • · · ««· · ·«··« ·· · • · « · · · « · · · · • · * · 9 9 9 9 9 9 9 9 proteinu.. Dále bylo odhaleno, že krystaly derivovaných proteinů poskytují plošší průběh a delší dobu účinku než krystaly složené z nederivovaného proteinu. Navíc bylo překvapivě zjištěno, že přínos ploššího průběhu a delší doby účinku se dá dosáhnout dokonce i u amorfních sraženin obsahujících derivovaný protein.

Ve svém nej širším aspektu poskytuje tudíž předložený vynález nerozpustné přípravky obsahující derivovaný protein zvolený ze skupiny sestávající z derivátů inzulínu, derivátů analogu inzulínu a derivátů proinzulinu, kde jsou deriváty méně rozpustné než nederivovaný inzulín, analog inzulínu nebo proinzulin.. Nerozpustné přípravky jsou.také složeny z komplexační sloučeniny, sloučeniny stabilizující hexamer a kationtů dvoumocného kovu. Tyto nerozpustné přípravky jsou užitečné pro léčení diabetů a hyperglykémie a poskytují výhody ploššího průběhu a delší doby účinku než NPH inzulín. Dále jsou míchatelné do formulace s rozpustným proteinem a s rozpustným derivovaným proteinem. Nerozpustné přípravky podle předloženého vynálezu jsou ve formě amorfních sraženin a také výhodněji.ve formě mikrokrystalů.

Předložený vynález zvláště poskytuje mikrokrystalické formy proteinů acylovaných mastnými kyselinami, které jsou užitečné pro léčení diabetů a hyperglykémie. Tyto mikrokrystaly obsahují protein acylovaný mastnou kyselinou zvolený ze skupiny sestávající z inzulínu acylovaného mastnou kyselinou, analogu inzulínu . acylovaného mastnou kyselinou a proinzulinu acylovaného mastnou kyselinou, protaminu, fenolického konzervancia,a zinku. Takové mikrokrystaly poskytují jak plošší průběh,, tak delší dobu účinku⁵než NPH inzulín a jsou mísitelné s » · · <

» · · I • · · · rozpustnými proteiny a rozpustnými derivovanými proteiny.

Vynález poskytuje formulace vodných suspenzí obsahující nerozpustný přípravek a vodné rozpouštědlo. Takové suspenzní formulace mohou případně obsahovat rozpustný protein, jako je lidský inzulín, nebo rozpustný analog lidského inzulínu, jako je moriomerní analog inzulínu, které řídí hladinu glukózy v krvi bezprostředně po jídle. 'Mikrokrystalické formulace inzulínů acylovaných mastnými kyselinami mají ve srovnání s lidským inzulínem NPH lepší farmakodynamiku. Předložený vynález se liší od předchozí technologie inzulínu acylovaného mastnou kyselinou tím, že prodložení doby účinku předloženého vynálezu nespočívá nezbytně ve vazbě na albumin, ačkoliv vazba na albumin může dobu účinku jistých přípravků podle předloženého vynálezu dále prodloužit.

Vynález se také vztahuje na způsob přípravy nerozpustných přípravků a způsobu léčení diabetů a hyperglykémie sestávající z podávání formulace obsahující nerozpustný přípravek pacientovi, který to potřebuje v množství dostatečném pro regulaci hladin.glukózy v krvi pacienta.

Částí předloženého vynálezu jsou také amorfní sraženiny zahrnující, v jejich nejširším aspektu, derivovaný protein zvolený ze skupiny sestávající z derivovaného inzulínu, analogu derivovaného inzulinu a derivovaného proinzulinu, protaminu, fenolického konzervancia a zinku, kde derivovaný protein je méně rozpustný než nederivovaný protein.

Popis obrázku .na výkrese ·· ·· • · · * ·

9 ·· · • · · · · · • · · · · ·· 44 44

Na Obr. 1. .jsou srovnány míry rozpouštění . mikrokrystalů prasečího inzulínu NPH (--—j a B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulínu podle tohoto vynálezu (-_) . ,

Popis vynálezu

- Pojem nerozpustný přípravek odkazuje na látku, která je buď ve stavu mikrokrystalickém nebo ve stavu amorfní sraženiny. Přítomnost mikrokrystalů nebo amorfní sraženiny může být zjištěna vizuálně, nebo pomocí, mikroskopu. Rozpustnost závisí na rozpouštědle, přičemž určitý přípravek může být nerozpustný v jednom rozpouštědle, ale rozpustný v jiném. . Pojem mikrokrystal znamená tuhou látku, která je složena především z hmoty v krystalickém stavu, kde jednotlivé krystaly mají převážně jedinou krystalografickou strukturu a mají mikroskopickou velikost, typicky je nejdelší rozměr v rozmezí 1 až 100 pm. Pojem mikrokrystalický odkazuje na stav, kdy je hmota mikrokrystalém.

Pojem amorfní sraženina odkazuje na nerozpustný materiál, který nemá krystalickou formu. . Odborník v oboru je schopen krystaly od amorfní sraženiny rozlišit. Amorfní sraženiny podle předloženého vynálezu, mají výhodné farmakologické vlastnosti samy· o sobě a jsou také meziprodukty při tvorbě mikrokrystalů podle předlo-, ženého vynálezu.

Pojem derivovaný protein.odkazuje na protein φφ φφ φφ φφ φφ

ΦΦΦ· φφφφ φφφφ • •ΦΦ φφφ φφφφ φ φ φ φφφ φ φφφ φ φ · * φ

9· φ φ φ φφ φ φφφφ

- ΦΦΦΦΦΦ·· φφφφ zvolený ze skupiny sestávající z derivovaného inzulínu, analogu derivovaného inzulínu a derivovaného, proinzulinu, který je derivován funkční skupinou tak, že derivovaný protein je měně rozpustný ve vodném rozpouštědle než nederivovaný protein. Mnoho příkladů takových derivovaných proteinů je v óboru známo, přičemž stanovení rozpustnosti proteinů a derivovaných proteinů je odborníkovi v oboru dobře známo. Příklady derivovaných; inzulínů a analogů inzulínu zahrnují benzoyl-, p-tolylsulfonamidkarbonyl- a indolylderiváty inzulínu a analogů inzulínu [Havelund, S., a kol., WO 95/07931, zveřejněno 23. března 1995], alkyloxykarbonylderiváty inzulínu [Geiger, R., a kol., US patent č. 3 684 791, vydaný 15. srpna 1972, Brandenberg,

D., a kol.,. US patent č. 3 907 763, vydaný 23. září 1975], aryloxykarbonylderiváty inzulínu [Brandenberg, D., a kol.,

US patent č. 3 907 763, vydaný 23. září 1975], alkylkarbamylderiváty [Smyth, D. G., US patent č.

864 325, vydaný 4. února 1975, Lindsay, D. G., a kol.,

US patent č. 3 950 517, vydaný 13. dubna 1976], karbamyl-,· O-acetylderíváty inzulínu [Smyth, D. G., US patent č.

864 325 vydaný 4. února 1975], zesítěné alkyldikarboxylderiváty [Brandenberg, D., a kol., US patent č. 3 907 763, vydaný 23. září 1975], N-karbamyl-, O-aceťylované deriváty inzulínu [Smyth,. D. G., US patent č. 3 868 356, vydaný 25. února 1975], různé O-alkylestery [Markussen, J., US patent č. 4 343 898, vydaný 10. srpna 1982, Morihara, K., a kol., US patent č. 4 400 465, vydaný 23. srpna 1983, Morihara, K., a kol., US patent č.

401 757, vydaný 30. srpna 1983, Markussen, J., US patent č. 4489 159, vydaný 18. prosince 1984, Obermeier, R., a kol., US patent č. 4 601 852, vydaný 22. července 1986, a Andresen, F. H,, a kol., US patent, č. 4 601 979,. vydaný

22. července 1986), alkylamidové deriváty inzulínu

44 44 44 44 ·· • ·4 4 4 4 4 · 4 · * · •••• 4 4 4 4 4 4 4 4 • · . · 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4« 4

ΙΛ 444444 44444

IV “ ·· ·· ·· 44 44 44 [Balschmidt, P., a kol., US patent. č. 5 43.0 016, vydaný 4. července 1995), různé jiné deriváty inzulinu [Lindsay, D.

G., US patent č. 3 869 437, vydaný 4. března 1975] a proteiny acylované mastnými kyselinami, které jsou zde popsány.

Pojem acylovaný protein, jak je zde používán, odkazuje na derivovaný protein zvolený ze skupiny sestávající z inzulinu, analogů inzulinu a proinzulinu, který je acylován.částí organické kyseliny, která je vázána na protein prostřednictvím amidové vazby vytvořené mezi kyselou skupinou sloučeniny organické kyseliny a aminoskupinou proteinu. Obecně může být aminoskupinou. alfa-aminoskupina N-konce aminokyseliny proteinu nebo jí může být eta-aminoskupina zbytku Lys v proteinu. Acylovaný protein může být acylován na 1 nebo více ze 3 aminoskupin, které jsou přítomny v inzulinu a většině analogů inzulinu. Monoacylované proteiny jsou acylovány na 1 aminoskupině. Diacylované proteiny jsou acylovány na 2 aminoskupinách.

r

Triacylované proteiny jsou acylovány na 3 aminoskupinách. Sloučeninou organické kyseliny může být například mastná kyselina, aromatická kyselina nebo jiná organická sloučenina, která má karboxylovou skupinu, která bude s aminoskupinou proteinu vytvářet amidovou-vazbu a která způsobí, že rozpustnost derivovaného proteinu ve vodě bude nižší než rozpustnost nederivovaného proteinu.

Pojem protein acylovaný mastnou kyselinou odkazuje na acylovaný protein zvolený ze skupiny sestávající z inzulinu, analogů inzulinu,a proinzulinu, který je acylován částí mastnou kyselinou, která je vázá_na na protein prostřednictvím amidové vazby vytvořené mezi kyselou skupinou mastné kyseliny a aminoskupinou proteinu.

- 11 •9 99 99 99 99 • 9 9 9-9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9 9 • · · ··· 9 999 9 9 9 9 9

9.9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 99

Obecně může být aminoskupinou alfa-aminoskupina N-konce aminokyseliny.proteinu nebo jí může být eta-aminoskupina zbytku Lys v proteinu. Protein acylovaný mastnou kyselinou může být acylován na 1 nebo více ze 3 aminoskupin, .které jsou přítomny v inzulínu a většině analogů inzulínu. Monoacylované proteiny jsou acylovány na 1 aminoskupině. Diacylované. proteiny jsou acylovány na 2 aminóskupinách. Triacylované proteiny jsou acylovány na 3 aminóskupinách. Inzulín acylovaný mastnou kyselinou je zveřejněn v japonské přihlášce vynálezu 1-254 699. Viz také Hashimoto, M.,.akol., Pharmaceutical Research, 6., 171 - 176 (1989) a Lindsay, D. G., a kol., Biochemical J., 121, 737 - 754 (1971). Další zveřejnění inzulínů acylovaných mastnou kyselnou a analogů inzulínu acylovaných mastnou kyselinou a způsoby jejich syntézy se dají nalézt v Baker, J. C,., a kol., US- patentová přihláška 08/342'931 podaná 17.- listopadu 1994 a vydaná jako US patent č. 5 693 609, 2. prosince 1997, Havelund, S., a kol., WO 95/07931, zveřejněná

23. března 1995 a odpovídající US patent č. 5 750 497, 12. května 1998 a Jonassen, I., a kol., WO 96/29342, zveřejněná 26. září 1996. Tato zveřejnění jsou zde .výslovně zahrnuta formou odkazu pro popis inzulínů acylovaných mastnou kyselinou a analogů inzulínu' acylovaných mastnou kyselinou a pro umožnění jejich přípravy.

Pojem protein acylovaný mastnou kyselinou zahrnuje farmaceuticky přijatelné soli a komplexy proteinů acylovaných mastnou kyselinou. Pojem protein acylovaný * mastnou kyselinou také zahrnuje přípravky acylovaných proteinů, kde je populace molekul acylovaných proteinů homogenní s ohledem namísto nebo místa acylace. Například N-eta~monoacylovaný protein, Bl-N-alfa-monoacylovaný

- 12 • ft ·· ftft ·· • ·· · · ft. ft · • · ·· ftftft· • ··. ··· · · · ft • ftftft · · · • ft ftft ·· ·· • ft • · protein, Al-N-alfa-monoacylovaný protein, Al,Bl-N-alfa-diacylovaný protein, N-ěte,Al-N-alfa-diacylovaný protein,

N-eta,Bl-N-alfa-diacylovaný protein a N-eta-Al,Bl-N-alfa»

-tríacylovaný protein jsou pro účely předloženého vynálezu všechny zahrnuty pod pojem protein acyiovaný mastnou kyselinou. Pojem také odkazuje na přípravky, kde je populace molekul acylovaného proteinu acylována heterogenně. V posledně uvedeném případě zahrnuje pojem protein . acyiovaný mastnou kyselinou směsi monoacylovaných a diacylováných proteinů, směsi monoacylovaných a triacylovaných proteinů, směsi diacylovaných a triacylovaných proteinů a směsi monoacylovaných, diacylovaných a triačylovaných proteinů.

Pojem inzulín, jak je zde používán, odkazuje na lidský inzulín, jehož sekvence aminokyselin a speciální struktura jsou dobře známy. Lidský inzulín se skládá z A řetězce o 21 aminokyselinách a B řetězce o 30 aminokyselinách, které -jsou spojeny di sulfidovými vazbami. . Řádně spojený inzulín, obsahuje 3 disulfidové můstky: 1 mezi pozicí 7 řetězce A a pozicí 7 řetězce B, druhý mezi pozicí 20 řetězce A pozicí 19 řetězce B a třetí mezi pozicemi 6 a 11 řetězce A.

Pojem analog inzulinu znamená proteiny, které mají řetězec A a řetězec B, které mají v podstatě stejné sekvence aminokyselin jako řetězec A respektive řetězec B lidského inzulínu, ale liší se od řetězce A a řetězce B lidského inzulinu tím, že 1 nebo .více aminokyselin chybí, 1 nebo více aminokyselin je nahrazených jinou a/nebo 1 nebo více aminokyselin je přidaných, přičemž inzulínová aktivita analogu inzulinu není porušena.

- 13 ·· 49 «to toto ·· ·» • · · · · « · · · * to to • to to· » toto · · toto to • · · · · · · tototo · · · · · • »· · · · · · ·· · ·· ·· ·> toto ·· to·

Zvířecí inzulíny jsou analogy inzulínu. Čtyřmi těmito inzulíny jsou inzulín králičí, prasečí, hovězí a ovčí. Substituce aminokyselin, které ťyto zvířecí inzulíny odlišují od lidského inzulínu jsou pro čtenáře uvedeny níže.

		Pozice aminokyseliny
	A8	A9	A10	B30
lidský inzulín	Thr	Ser	Ile	Thr
králičí inzulín	Thr	. Ser	, Ile	Ser
prasečí inzulín	Thr	Ser	Ile	Ala
hovězí iznulin	Ala	Ser	Val	Ala
ovčí inzulin	Ala	Gly	Val	Ala
Jiný	'typ	analogu inzulínu,	monomerní	analog

inzulínu je v oboru dobře znám. Monomerní analogy inzulínu“jsou strukturně podobné lidskému inzulínu, přičemž mají aktivitu podobnou nebo stejnou jako lidský inzulín, ale jedna nebo více aminokyselin jim chybí, nebo jsou nahrazeny jinými nebo mají jednu nebo více aminokyselin navíc, což jim dává tendenci k rozpadu kontaktů účastných dimerizace a hexamerízace, což vede k jejich větší tendenci k disociaci na méně agregované stavy. Monomerní analogy inzulínu jsou rychlé účinkujícími analogy lidského inzulínu a jsou zveřejněny například v Chance, R. E., a kol., US patent č. 5 514 646, 7. května 1996, Brems, D. N., a kol., Protein Engeneering, 5., 527 533 (1992), Brange, J. J.V., a kol., EPO publikace č.

214 826, publikovaná 18. března 1987, Brange, J. J.’V., a kol., US patent č. 5 618 913, 8. dubna 1997 a Brange, J. a kol., Current Opinion in Structural Biology, 1, 934 - 940 (1991). Příklad monomerního analogu inzulínu je popsán jako lidský inzulín, kde Pro v pozici B28 je substituován Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala, a kde Lys v pozici B29 je Lys

- 14 <

»·

nebo je substituován Pro, a také AlaB26-lidský inzulín, des(B28-B30)-lidský inzulín a des(B27)-lidský inzulín. Monomerní analogy inzulínu použité jako deriváty v předložených krystalech nebo použité nederivované ve fázi roztoku .přípravy suspenzních formulací jsou řádně zesítěný •na stejných pozicích jako u lidského inzulínu.

Další skupina analogů inzulínu pro použití podle předloženého vynálezu je ta, kde isoelektrický bod analogu inzulínu je mezi asi 7,0 a asi 8,0. Tyto analogy jsou označovány jako analogy inzulínu s posunem pl. Příklady . takových analogů inzulínu zahrnují ArgB31,ArgB32-lidský inzulín, GlyA21, ArgB31-lidský inzulín,. ArgAO,ArgB31,ArgB3.2-lidský inzulín a ArgAO,GlyA21,ArgB31,ArgB32-lidský inzulín.

Další skupina analogů inzulínu sestává z analogů inzulinu, jimž chybí 1 nebo více aminokyselin, což významně nenarušuje aktivitu molekuly. Tato skupina analogů inzulinu je zde označována jako analogy s delecí. Například analogy inzulinu s delecí 1 nebo více aminokyselin v pozicích Bl až B3 jsou aktivní. Podobně . analogy inzulinu s delecí 1 nebo více aminokyselin v pozici B28 až B30 jsou aktivní. Příklady analogů s .delecí zahrnují des(B30)-lidský inzulín, desPhe(Bl)-lidský inzulín, des(B27)-lidský inzulín, des(B28-B30) lidský inzulín a des(Bl-B3) lidský inzulín. Analogy s delecí použité jako deriváty v předložených krystalech, nebo použité nederivované ve fázi roztoku přípravy suspenzních formulací jsou řádně zesítěný na stejných pozicích jako u lidského inzulinu.

Případně může mít analog inzulinu nahrazenu 1 • to • · • ·

• toto · to toto · • to to to to · to toto · to · · · ·· » ·· to· ·· «· nebo více ze svých amidovaných aminokyselin jinou aminokyselinou kvůli chemické stabilitě. Například Asn a Gin mohou být nahrazeny Gly, Ser, Thr, Asp nebo Glu. ' Obzvláště AsnAÍ8, AsnA21 nebo jakákoli kombinace těchto zbytků může být nahrazena například Gly, Asp nebo Glu. Také GlnAlS nebo GlnB4 nebo oba mohou být nahrazeny buď Asp nebo Glu. Výhodnými nahrazeními jsou Asp .v pozici B21 a Asp v pozici. B3.

Pojem proinzulin znamená jednořetězcovou peptidovou molekulu, která je prekurzorem inzulínu. Proinzulin. může být převeden na inzulín nebo na analog inzulínu chemickými nebo, výhodně, enzymaticky katalyzovanými reakcemi.. U proinzulinu jsou řádné disulfidové vazby vytvořeny jak je zde popsáno. Proinzulin zahrnuje inzulín nebo analog inzulínu a spojovací vazbu nebo spojovací peptid. Spojovací peptid má mezi 1 a asi 35 aminokyselinami. Spojovací vazba nebo spojovací peptid se váže na koncovou aminokyselinu řetězce A a koncovou aminokyselinu řetězce B alfa-amidovou vazbou nebo respektive 2 alfa-amidovými vazbami. Výhodně není žádná z aminokyselin ve spojovacím peptidu cystein. Výhodně C-koncová aminokyselina spojovacího peptidu je Lys nebo Arg. Proinzulin může mít vzorec

X-B-C-A-Y nebo může mít vzorec

X-A-C-B-Y, kde ·· ·· ·· • · · · · · • · · · · · ····· · · · «I 9 9 9 9

99 99 je vodík nebo peptid o 1 až asi 100 aminokyselinách, který má jako C-koncovou aminokyselinu Lys nebo Arg, je hydroxyskupina nebo peptid o 1 až asi 100 aminokyselinách, která má jako N-koncovou aminokyselinu Lys nebo Arg, je A-řetězec inzulínu nebo A-řetšzec analogu inzulínu, ' . * je peptid o 1 až 35· aminokyselinách,.přičemž žádná z nich není cystein, kde C-koncová aminokyselina je Lys nebo Arg, a je B-řetězec inzulínu nebo B-řetězec analogu inzulínu.

Farmaceuticky přijatelná sůl znamená sůl vytvořenou mezi alespoň jednou nabitou skupinou v proteinu a alespoň jedním farmaceuticky přijatelným netoxičkým katioňtem nebo aníontem. Organické a anorganické soli zahrnují například soli připravené z kyselin jako jsou kyselina chlorovodíková, sírová, sulfonová, vinná, fumarová, bromovodíková, glykolová, citrónová, maleinová, fosforečná, jantarová, octová, dusičná, benzoová, akorbová, p-toluensulfonová, benzensulfonová, naftalensulfonová, propionová, uhličitá apod., nebo například amoniak, sodík, draslík, vápník nebo hořčík.

Sloveso acylovat znamená vytvořit amidovou vazbu mezi mastnou kyselinou a aminoskupinou proteinu.

• ·

- 17 Protein je aeylován když je 1 nebo více jeho aminoskupin spojeno amidovou vazbou s kyselou skupinou mastné kyseliny.

Pojem mastná kyselina znamená nasycenou nebo nenasycenou mastnou kyselinu s přímým nebo rozvětveným řetězcem, která má 1 až 18 atomů uhlíku.

Pojem Ci až C₁₈ .mastná kyselina odkazuje.na nasycenou mastnou kyselinu s přímým nebo rozvětveným řetězcem, která má 1 až 18 atomů uhlíku.

Pojem dvoumocný kation kovu odkazuje na ion nebo ionty, které se účastní tvorby komplexu s mnoha molekulami proteinu. Přechodné kovy, alkalické kovy a kovy alkalických, zemin jsou příklady kovů, o nichž je známo, že tvoří komplexy s inzulínem. Přechodné kovy jsou výhodné. Zinek je obzvláště výhodný. Jiné přechodné kovy, které mohou být farmaceuticky přijatelné pro tvorbu komplexů s inzulínem zahrnují měď,.kobalt a železo.

Pojem komplex má v předloženém vynálezu dva významy. V prvním odkazuje na komplex vytvořený mezi 1 nebo více atomy v proteinech, které tvoří komplex a 1 nebo více kationty dvoumócného kovu. Atomy v proteinech slouží jako elektrondonorní ligandy. Proteiny typický tvoří hexamerový komplex s dvoumocnými kationty přechodných kovů. Druhým významem pojmu komplex v předloženém vynálezů je spojení mezi komplexující sloučeninou a hexamery. Komplexující sloučeninou je organická molekula, která typicky má četné kladné náboje, 'které váží (neboli komplexují)· hexamery v nerozpustném přípravku) čímž je stabilizují proti rozpuštění. Příklady • · • ·

- 18 I · · ’ » 9 · 4 > · 9 4 • · 9 9 komplexujících sloučenin vhodných pro předložený vynález zahrnují protamin, surfen, různé globinové proteiny (Brange J., Galenics of Insulin, Springer-Verlag, Berlín Heidelberg (1987) a různé polykationické polymerní sloučeniny o nichž je známo, že tvoří komplexy s inzulínem.

Pojem protamin odkazuje na směs silně bazických proteinů, které.se získávají z mlíčí. Průměrná molekulová hmotnost proteinů v protaminu je asi 4 200 (Hofmann, J. A., a kol., 'Protamin Expression and Purification, 1., 127 - 133 (1990)). Protamin může odkazovat na přípravek proteinů relativně bez soli, často označovaný protaminová báze. Protamin také odkazuje na přípravky sestávající ze solí proteinů. Komerční přípravky se v obsahu soli velmi liší.

Protaminy jsou odborníkovi v oboru inzulínu dobře známy a v současnosti jsou začleňovány’do produktů NPH inzulínu. Čistá frakce protaminu je použitelná v předloženém vynálezu stejně jako směsi proteinů. Komerční přípravky protaminu však typicky nejsou homogenní s ohledem na přítomné proteiny. Ty však jsou v předloženém vynálezu praktické. Protamin složený z protaminové báze je praktický v předloženém vynálezu stejně jako jsou protaminové přípravky složené ze solí protaminu a ty .přípravky, které jsou směsemi protaminové báze a solí protaminu. Protamin sulfát je často používanou solí protaminu.

Pojem suspenze odkazuje na směs kapalné fáze a tuhé fáze, která sestává z nerozpustných nebo málo rozpustných částic, které jsou větší než je velikost, ko• · • · • 4

- 19 44 44 • 4 4 lodních částic. Směsi mikrokrystalů NPH a vodného rozpouštědla tvoří suspenze. Směsi amorfní sraženiny a. vodného rozpouštědla také tvoří suspenze. Pojem suspenzní přípravek znamená farmaceutický přípravek, ve kterém je aktivní látka přítomna v tuhé fázi,, například mikrokrystalické tuhé fázi, amorfní sraženině nebo obou, která je· jemně dispergována vé vodném rozpouštědle. Jemně dispergovaná tuhá látka je takové povahy, že může být celkem rovnoměrně suspendována ve vodném rozpouštědle působením jemného třepání směsí, a tedy poskytující rozumně rovno- měrnou suspenzi, z níž může být odňat dávkovaný objem. Příklady komerčně dostupných formulací suspenzí inzulínu zahrnují například NPH, PZI a ultralente. Malá část tuhé hmoty ve formulaci mikrokrystalické suspenze může být amorfní. Výhodně je podíl amorfního materiálu menší.než 10 %, nejvýhodněji menší než 1 % z tuhé hmoty v mikrokrystalické suspenzi. Podobně malý podíl tuhé hmoty v suspenzi amorfní sraženiny může být mikrokrystalický.

NPH inzulín odkazuje na přípravek inzulínu Neutrál Protamine Hagedorn. Význam takového pojmu a způsoby přípravy takového přípravku inzulínu jsou odborníkovi v oboru inzulínu dobře známy.

Pojem vodné rozpouštědlo odkazuje.na kapalné rozpouštědlo, které obsahuje vodu; Systém vodného rozpouštědla se může skládat pouze z vody, může se skládat z vody plus 1 nebo více mísitelných rozpouštědel a může obsahovat rozpuštěné látky. Běžněji používaná mísitelná rozpouštědla jsou organické alkoholy S krátkým řetězcem, jako je methanol, ethanol a propanol, ketony s krátkým řetězcem, jako je aceton, a polyalkoholy, jako je glycerol.

• 9 • 9 ··

' Iso.toríizačním činidlem je sloučenina, která je fyziologicky toler-ována a která přípravku dává vhodnou tonicitu, aby se zabránilo celkovému prostupu vody přes membrány, které jsou v kontaktu s podanou formulací. Glycerol, který je také znám jako glycerin, je .obecně používán jako isotonizační činidlo. Další isotonizační činidla Zahrnují soli, např. chlorid, sodný,, a monosacharidy, např. dextrózu a laktózu.

Nerozpustné přípravky podle předloženého vynálezu obsahují sloučeninu stabilizující hexamer. Pojem sloučenina stabilizující hexamer odkazuje na neproteinovou sloučeninu o malé molekulové hmotnosti, která stabilizuje derivovaný protein ve stavu hexamerní agregace. Nejlepšími známými stabilizujícími sloučeninami pro inzulin· a deriváty inzulinu jsou fenoíické sloučeniny, obzvláště fenolická konzervancia. Taková sloučenina * « stabilizující·hexamer stabilizuje hexamer inzulinu, tím, že se na něj váže prostřednictvím intermolekulárních kontaktů. Příklady takových činidel stabilizujících hexamer zahrnují: různé fenoíické sloučeniny, fenolická konzervancia, resorcinol, 4'-hydroxyacetanilid (tylenol), 4-hydroxybenzamid a 2,7-dihydroxynaftalen. Formulace k vícenásobnému použití nerozpustných přípravků podle _; . předloženého vynálezu budou vedle sloučeniny stabilizující hexamer obsahovat konzervans. Konzervans, použité ve formulacích podle předloženého vynálezu může být fenolickým konzervanciem.

Pojem konzervans odkazuje na sloučeninu¹ přidanou k farmaceutické formulaci, aby působila jako antimikrobiální činidlo.. Matečná .formulace musí vyhovovat

- 21 to · to · to <

• toto · » · • to to pokynům pro účinnost konzervancií, aby.byla komerčně použitelným produktem k vícenásobnému použití. Mezi konzervancií známými v oboru jako účinnými a přijatelnými pro parenterální formulace jsou benzalkoniumchlorid, benzethonium, chlorhexidin, fenol, m-kresol, benzylakohol, methylparaben, chlorbutanol, o-kresol, p-kresol, chlorkresol, dusičnan fenylrtuťnatý, ethylhydrargyriumthiosalicylat sodný, kyselina benzoová a·jejich různé směsi. Viz např. Wallhausser, K. H., Develop. Biol. Standard, 24. 9-28 (1974) (S. Krager, Basilej).

Pojem fenolické konzervans zahrnuje sloučeniny fenol, m-kresol, o-kresol, p-kresol, chlorkresol, methylparaben a jejich směsi. 0 jistých fenolických konzervanciích, jako fenol a m-kresol, je známo, že váží molekuly podobné inzulínu a že tedy indukují konformační změny, které zvyšují jejich fyzikální nebo chemickou stabilitu nebo obojí (Birnbaum, D. T., a kol.,. Pharmaceutical Res., 14, 25 - 36' (1997), Rahuel-Clermont, S. a kol., Biochemistry, 36, 5837 - 5845 (1997)). 4

Pojem pufr nebo farmaceuticky přijatelný pufr odkazuje na sloučeninu, která je známa jako bezpečná pro použití v inzulínových formulacích a která má ten účinek, že udržuje pH formulace na pH pro formulaci požadovaném. Hodnota pH formulací podle předloženého vynálezu je od asi 6,0 do asi 8,0. Výhodně mají formulace, podle předloženého vynálezu pH mezi asi 6,8 a asi 7,8. Farmaceuticky přijatelné pufry pro udržování pH v mírně kyselé oblasti až v oblasti mírně bazické zahrnují takové sloučeniny, jako je fosfát, acetat, citrát, arginin, TRIS a histidin. TRIS odkazuje na 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propand'iol a na jeho farmaceuticky přijatelnou

- 22 • tt tttt • tt • I • · •tttt · ·« sůl. Volná báze a hydrochloridová forma jsou dvěma známými formami TRIS. TRIS je v oboru také znám jako trimethylolaminomethan, tromethamin a tris. (hydroxymethyl) aminomethan. Další pufry, které jsou farmaceuticky přijatelné a které jsou vhodné pro uržování pH na požadované úrovni jsou odborníkovi v oblasti chemie, známy.'

Pojem podat znamená zavést formulaci podle předloženého vynálezu do těla pacienta, který to potřebuje k léčení nemoci nebo stavu.

Pojem léčení odkazuje na ošetřování a péči o pacienta, který má diabetes nebo hyperglykém.ii nebo jiný stav, při němž je podání inzulínu indikováno za účelem boje proti symptomům a komplikacím tohoto”stavu nebo za účelem jejich zmírnění. Léčení, zahrnuje podávání formulace podle předloženého vynálezu, aby sg zabránilo nástupu symptomů nebo komplikací, zmírnily se symptomy nebo komplikace nebo se choroba, stav nebo porucha eliminovala.

Jak je zmíněno výše, poskytuje předložený vynález nerozpustné přípravky, které mají v jistém ohledu vlastnosti podobné NPH inzulínu a v jiném ohledu lepší než NPH inzulín. NPH inzulínu jsou podobny s ohledem na fyzikální vlastnosti. K vyšetření mikrokrystalů složených z B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulínu, zinku, protaminu a fenolu’připravených podle postupu z přípravy 18 se použije světelný mikroskop vybavený olejovým imerzním objektivem a překříženým polarizátorem. Vyšetření při tisícinásobném zvětšení ukázalo, že mikrokrystaly B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulínu byly samostatné a tyčinkovité, přičemž vykazovaly jednotnou krystalovou morfologii..Velikosti těchto mikrokrystalů spadají obecně do rozpětí přibližně 2 • · μιη délky až 8 μιη délky. Přímé srovnání za použití tohoto mikroskopu ukázalo, že morfologie těchto mikrokrystalů se jeví podobná mikrokrystalům komerčně vyráběných mikrokrystalů prasečího NPH, který byl někde popsán jako tyčinkovitý. Rozmezí velikostí těchto mikrokrystalů B29-N-eta-oktanoýl-lidského inzulínu bylo také podobné jako u komerčně vyráběných mikrokrystalů NPH, které mají průměrnou délku asi 5 μιη. Specifikace střední délky mikrokrystalů NPH při komerční výrobě je. od 1 μπι do 40 μπι.

Mikrokrystaly podle předloženého vynálezu jsou však neočekávaně a nepředpovídatelně odlišné od krystalů NPH inzulínu pokud jde o jejich vlastnosti při rozpouštění a pokud jde o účinek v čase. Obzvláště se mikrokrystaly podle předloženého vynálezu rozpouštějí za podmínek, které napodobují fyziologické podmínky mnohem pomaleji než krystaly NPH inzulínu a poskytují delší' a plošší profil řízení glukózy v krvi než poskytuje NPH inzulín, To je ukázáno v následujících experimentech.

U jistých derivovaných proteinů, v rozpustné formě, bylo· shledáno, že jejich účinky v čase se významně neliší od řádného lidské inzulínu. Byly použity 3 skupiny zvířat. Každé zvíře v první skupině dostalo dávku. (0,75 nmol/kg) přípravku Humulin^(R) R (rozpustný lidský inzulín) , ♦

každé zvíře ve druhé skupině, dostalo dávku (0,75 nmol/kg) rozpustného B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulínu (C8-hI) a každé zvíře ve třetí skupině dostalo dávku (0,75 nmol/kg) rozpustného B29-N-eta~dekanoyl-lidského inzulínu (ClO-hl). Experimenty se prováděly jak je v podstatě popsáno v příkladu 5 se skupinami, o 5 psech. Proteiny se podávaly subkutánně. Byly stanoveny koncetrace glukózy v krvi a jsou uvedeny v tabulce uvedené níže.

. to· • ·

- 24 ·· ·· • ·· · ' · • · ·· · • · · to » to * to · · · · ·· ·· · ···· ·· ·· ·· toto ·· ··

Tabulka 1

Koncentrace glukózy v krvi před a po podání přípravku Humulin^(R) R, rozpustného B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulínu (C8-hI), rozpustného B29-N-eta-dekanoyl-lidského inzulínu (ClO-hl) u normálních psů, kterým byl zároveň podán somatostatin, aby se vytvořil přechodný diabetický stav. Hodnoty jsou střední + směrodatná odchylka.

	Koncentrace	glukózy v krvi (mg/dl) - - - ...................-.................... . ····
Čas (h)	Humulin(R)R	Rozpustný C8-hI	Rozpustný ClO-hl
-0,5	110±2	115±4	108 ±2
0	101 ±2	101 ±7	96±4
0,5	83 ±5	......... ' ' · ' ............... 80 ±5	85 ±6
1	54 ±6	52±4	70 ±5
1,5	49 ±4	51 ±2	57±4
2	48 + 4	51 ±2	52±3
2,5	55 ±4	60 ±3	56±4
3	59 + 2	65 ± 4	58±4
3,5	65 ±2	73 ±5	63 ±4
4	71+2	85 ±6	68 ± 4
5	87±2	110± 8	79 ±3
6	104 ±3	124±4	91 ± 7
7	119 ±8	145 ±14	106 ±8
8	• 144 + 5	153 ±16	119±11

Tato data jasně.ukazují, že rozpustný B29-N-eta-oktanoyl-lidský inzulin a B29-N-eta-ďekanoyl-lidský inzulin podané subkutánně normálním psům v přechodném diabetickém stavu poskytuje snížení glukózy ·· ·· ·· ·· ·· ·· ···· · · · · · » · · • · ·· · · · · ···· • φ · · · · · ··· t · · · φ ···· · · · ···· ·· ··- ·· ·· ·· ·· zhruba srovnatelné s tím, jakého se dosáhne rozpustným lidkým inzulínem. Nejvíce stojí za zmínku, že B29-N-eta• -oktanoyl-lidský inzulín vykazuje rychlejší nástup a kratší dobu účinku než lidský inzulín.

Ve druhém experimentu bylo zjištěno, že rychlost rozpouštění, krystalů B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu připraveného podle předloženého vynálezu je výrazně delší než u komerčně vyráběného prasečího .NP$ inzulinu. To je ve světle výše uvedených dat vrcholně neočekávané. Rychlost rozpouštění prasečího NPH inzulinu se měří umístěním 5 mikrolitrů U100 prasečího NPH inzulinu do 3 ml fyziologického roztoku ošetřeného Dulbeccovým fosfátovým pufrem (bez vápníku nebo hořčíku) v krychlové křišťálové kyvetě s délkou průchodu světla 1 cm při teplotě. 22 °C. Tento roztok se míchá konstantní rychlostí za použití magnentického kyvetového míchadla. Měření absorbance při 320 nm se provádějí v jednominutových intervalech. Absorbance při 320 nm odpovídá světlu zachycenému nerozpustnými částicemi přítomnými ve vodné suspenzi. V důsledku toho se absorbance blíží nule, jak se mikrokrystaly rozpouštějí.

Data získaná při tomto experimentu jsou předložena «na obr..

jako přerušovaná čára a ukazují, že prasečí NPH mikrokrystaly se po asi 1 hodině úplně rozpustí.

Analogicky se postupuje při měření míry rozpouštění mikrokrystalů B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu.. Objem 12 mikrolitrů suspenze mikrokrystalů ” B29-N-eta-oktanoyl-lídského inzulinu (obsahujících ne více než 50 j./ml) připravených podle postupu z přípravy 18 se umístí do 3 ml fyziologického roztoku ošetřeného

Dulbeccovým fosfátovým pufrem (bez vápníku nebo hořčíku) v krychlové křišťálové kyvetě s délkou průchodu světla 1 cm.

»· ·· ·· ** ·· ·· • ·· · · ·· · · ·· ···« ···· ···· • ·· « · · · ··· · · ·· * · ··· ·· · · · · ·

- 26 - ........ ’* ·’

Tento roztok se míchá konstantní rychlostí a při stejné teplotě 22 °C. Data získaná při tomto experimentu jsou předložena na obr. 1 jako nepřerušovaná čára a ukazují, že mikrokrystaly B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu vyžadují mnohem více než 5 hodin než se rozpustí.

Tyto experimenty ukazují., že ve fyziologickém roztoku ošetřeném Dulbeccovým fosfátovým pufrem (bez vápníku nebo hořčíku), což je roztok, který, v jistých ohledech napodobuje intersticiálrií kapalinu, je rychlost rozpouštění mikrokrystalů B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu významně pomalejší než rychlost rozpouštění mikrokrystalů prasečího NPH. Znovu je potřeba uvést, že toto zjištění je velmi překvapivé ve světle předchozích zjištění, že rozpustný B29-N-eta-oktanoyl-lidský inzulín má dobu'působení ve skutečnosti mírně kratší než lidský inzulín!

Subkutánní intersticiální kapalina obsahuje 0,3 mM lidského sérového albuminu. Další experiment byl tedy uspořádán tak, aby srovnal míry rozpouštění přibližně stejných množství mikrokrystalů B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu a mikrokrystalů prasečího NPH ve fyziologickém roztoku ošetřeném Dulbeccovým fosfátovým pufrem obsahujícím 0,3 mM lidského sérového albuminu.

Tento experiment se provádí tak, že do 2 ml fyziologického roztoku ošetřeného Dulbeccovým. fosfátovým pufrem (bez vápníku a hořčíku) obsahujícího .0,3 mM lidského sérového albuminu se vloží 25 mikrolitrů prasečího NPH inzulinu (přibližně 3,5.mg inzulinu/ml). Výsledná suspenze se rukou jemně-protřepe, přičemž se

- 27 • « · · · * · ·« · • · » · ♦ · • · · · · · ·· ·· «· • · · » • » · · · • ··· · a« ·♦ ·· • · * • ··· pozoruje, že mikrokrystaly se po asi 3 až 5 minutách rozpustí.

Rychlost rozpouštění mikrokrystalů B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu se pozoruje tak, že do 2 ml fyziologického roztoku ošetřeného Dulbeccovým fosfátovým pufrem (bez vápníku a hořčíku) obsahujícího 0,3 mM lidského sérového albuminu se vloží 50 mikrolitrů mikrokrystalů B29-N-eta-okt,anoyl-lidského inzulinu (přibližně 1,8 mg/ml) připravených v podstatě tak, jak je zde popsáno v přípravě 18. Výsledná suspenze se rukou jemně asi 3 až 5 minut protřepává, přičemž se pozoruje, že došlo k minimálnímu rozpuštění suspendovaných mikrokrystalů. Pokračování mírného míchání tohoto roztoku za použití magnetického míchadla vede k úplnému, rozpuštění suspendovaných mikrokrystalů B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu po asi 2 hodinách.

Tyto experimenty ukazují, že rychlost rozpouštění mikrokrystalů B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu ve fyziologickém roztoku ošetřeném Dulbeccovým fosfátovým pufrem (bez vápníku a hořčíku) obsahujícím 0,3 mM lidského sérového albuminu je výrazně pomalejší než rychlost rozpouštění komerčně vyráběných mikrokrystalů prasečího NPH.

Jelikož profil účinku přípravků NPH inzulinu v čase je v silném vztahu k rychlosti rozpouštění mikrokrystalů v subkutánní intersticiální kapalině, je z těchto experimentů činěn závěr, že formulace mikrokrystalické suspenze B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu bude mít protrahovanější dobu účinku při subkutánním podání diabetickým pacientům něž existující přípravky NPH

-- 28 • · · · • · 9 · O · inzulínu.

Nerozpustné přípravky podle předloženého vynálezu mohou být krystaly s tyčinkovitou morfologií nebo s nepravidlenou morfologií, nebo to mohou být amorfní sraženiny. Výhodné nerozpustné přípravky se skládají z acylovaného inzulínu nebo acylovaného analogu inzulínu,

v.

iontů zinku, které jsou přítomny v koncentraci asi 0,3 do asi 0,7 molu na mol derivovaného proteinu, fenolického konzervancia zvoleného ze skupiny sestávající z fenolu, m-kresolu, o-kresolu, p-kresolu, chlorkresolu, methylparabenu a jejich směsí, a které je přítomno v množství dostatečném pro usnadnění vytvoření konformace R6 hexameru, a protaminu, který je přítomen v koncentraci, asi 0,15 do asi 0,7 molu na mol derivovaného proteinu.

Výhodnými derivovanými proteiny jsou acylované proteiny, výhodnými acylovanými proteiny pro mikrokrystaly a formulace podle předloženého vynálezu jsou inzuliny acylované mastnou kyselinou a analogy inzulínu acylované mastnou kyselinou. Velmi výhodný'je lidský inzulín acylovaný mastnou kyselinou. Analogy inzulínu acylovaného mastnou kyselinou jsou stéjně velmi výhodné.

Výhodná skupina analogů inzulínu pro přípravu analogů acylovaného inzulínu použitýqh pro tvorbu' mikrokrystalů podle předloženého vynálezu sestává z analogů inzulinu, kde zbytek aminokyseliny v pozici. B28 je . Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala, zbytek' aminokyseliny, v. poloze B29 je Lys nebo Pro, zbytek aminokyseliny v pozici BIO je His nebo Asp, zbytek aminokyseliny v pozici BI je Phe, Asp nebo chybí samotný nebo v kombinaci s deleci zbytku v pozici B2, zbytek aminokyseliny v pozici B30 je Thr, Ala,.

- 29 Ser nebo chybí a zbytek aminokyseliny v pozici B9 je Ser nebo Asp, za předpokladu, že buď v pozici B28.. nebo B29 je Lys. ’

Další výhodná skupina, analogů inzulinu pro použití podle předloženého vynálezu sestává z těch analogů inzulinu, kde isoelektrický bod analogu inzulínu je mezi asi 7,0 a asi 8,0. Tyto analogy jsou označovány jako analogy inzulinu s posunem pí. Příklady analogů inzulinu s posunem pí zahrnují například ArgB31,ArgB32-lidský inzulín, GlyA21,ArgB31,ArgB32-lidský inzulín, ArgAO,

ArfB31,ArgB32-lidský inzulín a ArgAO,GlyA21,ArgBSl,ArgB32-lidský inzulín.

Další'výhodná skupina analogů inzulínu sestává z LysB28, ProB29-lidský inzulín ,(B28 je Lys, B29 je Pro), AspB28-lidský inzulín (B28 je Aspj, AspBl-lidský inzulín, ÁrgB31,ArgB32-lidský inzulín, ArgAO-lidský inzulín,

AspBl,GlúB13-lidský inzulín, AlaB26-lidský inzulín, GlyA21-human inzulín, des (ThrB3O)--lidský inzulín a GlyA21,ArgB31,ArgB32-lidský inzulín.

Obzvláště výhodné analogy inzulinu zahrnují LysB28,ProB29-lidský .inzulín, des(ThrB3O)-lidský inzulín, AspB28-lidský inzulín a AlaB26-lidský inzulín. Další obzvláště výhodný analog inzulinu je GlyA21,ArgB31,ArgB32-lidskýinzulín (Dorschug, M., US patent č. 5 656 722, 12. srpen 1997). Nej výhodnějším analogem inzulinu je LysB28,ProB29-lidský inzulín.

Skupina acylačních částí sestává z mastných kyselin, které mají přímý řetězec a jsou nasycené. Tato skupina sestává z kyseliny methanové (Cl), kyseliny

- 30 e · · · · • · ♦ · · · * • · « · · · * • · · · » · ·· >

• · · · · >

ι * * *· ·· ethanové ,(C2) , kyseliny propanové (C3) , kyseliny n-butanové (C4), kyseliny n-pentanové (C5), kyseliny n-hexanové (C6), kyseliny n-heptanové (C7), kyseliny n-octanové (G8) , kyseliny n-nonanové (C9)., kyseliny, n-dekanové (CIO), kyseliny n-undekanové (Cil), kyseliny n-dodekanové (C12)-, kyseliny h-tridekanové (C13) , kyseliny n-tetradekanové (C14), kyseliny n-pentadekanové .(C15), kyseliny n-hexádekanové (C16) , kyseliny n-heptadekanové (C17) a kyseliny n-octadekanové (C18) . Adjektivní formy .· jsou formyl (Cl), acetyl (C2), propionýl (C3), butyryl (C4), pentanoyl(C5), hexanoyl (C6), heptanoyl (C7), oktanoyl (C8) , nonanoyl (C9) , dekanoyl ’ (CIO), undekanoyl (Cil), dodekanoyl (Č12), tridekanoyl (C13), tetradekanoyl (C14) neboli myristoyl, pentadekanoyl (C15), hexadekanoyl (C16) neboli palmitoyl, heptadekanoyl (C17) a oktadekanoyl (C18).

Výhodná skupina mastných kyselin.pro tvorbu proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých v mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává z mastných kyselin, které mají sudý počet atomů uhlíku to jest, C2, C4, C6, C8, CIO, C12, C14, C16 a C18 nasycených mastných kyselin. .

Další výhodná skupina mastných kyselin pro tvorbu.proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých v mikrokrystalech podle.předloženého vynálezu sestává z mastných kyselin, které mají lichý počet atomů uhlíku - to jest Cl, C3, C5, C7, C9, Cil, C13, C15 a C17 nasycených mastných kyselin.

Další výhodná skupina mastných kyselin pro tvorbu proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých v ···

- 31 » · ·· » - · · «» • · · β · <* · «· ft · ·« «* mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává z .' mastných kyselin, které mají více než 5 atomů uhlíku - to jest C6, C7, C8, C9, CIO, Cil, C12, C13, C14, C15, C16, C17 a C18 nasycených mastných kyselin.

Další výhodná skupina mastných kyselin pro tvorbu proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých v. mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává z mastných kyselin, které mají méně než 9 atomů uhlíku - to jest Cl, C2, C3, C4, C5, C6, C7 a'C8 nasycených mastných r

kyselin.

Další výhodná skupina mastných kyselin pro tvorbu proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých v mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává z mastných kyselin, které mají mezi 6 a 8 atomy uhlíku - to jest C6, C7 a C8 nasycených mastných kyselin.

Další výhodná, skupina mastných kyselin pro tvorbu proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých'v mikrokrystalech podle předloženého vynálezy sestává z mastných kyselin, které mají mezi 4 a 6 atomy uhlíku - to jest C4, C5 a C6 nasycených mastných kyselin.

Další výhodná skupina mastných kyselin pro tvorbu proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých v mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává z mastných kyselin, které-mají mezi 2 a 4 atomy uhlíku - to jest C2,.C3 a C4 nasycených mastnýchkyselin.

Další výhodná skupina mastných kyselin pro tvorbu proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých v mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává z ♦ · · * • ♦ · · · • · · · * « · ♦ * <ř ♦ • « · · · ·· ·· mastných kyselin, které mají méně.než 6 atomů uhlíku - to jest Cl, C2, C3, C4 a C5 nasycených mastných kyselin.

Další výhodná skupina mastných kyselin pro. tvorbu proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých v mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává, z mastných kyselin, které mají méně než 4 atomy uhlíku - to jest Cl, C2 a C3 nasycených mastných kyselin.

•Další' výhodná skupina mastných kyselin pro tvorbu proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých v mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává'z mastných kyselin, které mají více než 9 atomů uhlíku - to jest C8, CIO, Cil, C12, C13, C14, C15, C16, C17 a C18 . nasycených mastných kyselin.

Další výhodná skupina mastných kyselin pro tvorbu-proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých v mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává z mastných kyselin, které mají sudý počet atomů uhlíku a více než' 9 atomů uhlíku, to jest CIO, C12, C14, C16 a C18 nasycených mastných kyselin.

Další výhodná skupina mastných kyselin pro tvorbu proteinů acylovaných.mastnou kyselinou použitých v mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává z mastných kyselin, které mají 12, 14 nebo 16 atomů uhlíku., to jest C12, C14 a C16 nasycených mastných kyselin.

Další výhodná skupina.mastných kyselin pro tvorbu proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých v mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává z mastných kyselin, které mají 14 nebo 16 atomů uhlíku, to • * · · ♦

9 99 ·

9 9 9 9 9

9 9 9 9

- 33 jest C14 a C16 nasycených mastných kyselin. Mastné kyseliny se 14 atomy uhlíku jsou obzvláště výhodné. Mastné kyseliny se 16 atomy uhlíku jsou také obzvláště výhodné.

Další výhodná skupina mastných kyselin pro tvorbu proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých v mikrokrystalech podle, předloženého vynálezu sestává z mastných kyselin, které mají mezi 4 a 10 atomy uhlíku, to jest C4, C5, C6, C7, ČB, C9 a CIO nasycených mastných kyselin.

Další výhodná skupina mastných kyselin pro tvorbu proteinů acylovaných mastnou kyselinou použitých v mikrokrystalech podle, předloženého vynálezu sestává z nasycených mastných kyselin, které mají sudý počet atomů uhlíku mezi 4 a 10 atomy uhlíku, to jest C4, C6, C8a CIO nasycených mastných kyselin.

Další výhodná skupina mastných kyselin pro tvorbu proteinů acylovaných mastnou kyselinou použité v mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává z mastných kyselin, které mají, mezi 6, 8 nebo 10 atomy uhlíku. Mastné kyseliny se 6 atomy uhlíku jsou obzvláště výhodné. Mastné kyseliny s 8 atomy uhlíku jsou také obzvláště výhodné.. Mastné kyseliny s 10 atomy uhlíku jsou obzvláště výhodné.

Odborník v oboru zjistí, že užší výhodné skupiny jsou vytvořeny kombinací výhodných skupin mastných kyselin popsaných výše.

Další výhodná skupina acylujících částí sestává z nasycených mastných kyselin, které jsou rozvětvené.

• · ♦

-· · • ·» • tt

Rozvětvená mastná kyselina má přinejmenším 2 větve. Délka větve rozvětvené mastné kyseliny může být popsána počtem atomů uhlíku ve větvi, počítá se od atomu uhlíku kyselinotvorné skupiny. Například rozvětvená mastná kyselina kyselina 3-ethyl-5-methylhexanová má 3 větve, které mají délku 5., 6 a 6 atomů uhlíku. V tomto případě nejdelší je větev se 6 atomy uhlíku. Jako další příklad poslouží kyselina 2,3,4, 5-tetraethyloktanová, která má 5 větví, které mají délku 4, 5, 6, 7 a 8 atomů uhlíku. Nejdelší větev má délku 8 atomů uhlíku. Výhodnou skupinou rozvětvených mastných kyselin jsou takové rozvětvené mastné kyseliny, které mají v nejdelší větvi od 3 do 10 atomů uhlíku.

Bude uveden representativní výčet takových rozvětvených nasycených mastných kyselin, aby.se zajistilo, že čtenář bude srozuměn s rozsahem těchto mastných kyselin,, které mohou být v předloženém vynálezu použity jako acylující části proteinů: kyselina '2-methylpropioinová, kyselina 2-methylmáselná, kyselina 3-methylmáselná, kyselina 2,2-dimethylpropRonova, kyselina 2-methylpentanová, kyselina 3-methylpentanová, kyselina 4-methylpentanová, kyselina 2,2-dimethylmáselná, kyselina 2,3-dimethylmáselná, kyselina 3,3-dimethylmáselná, kyselina 2-ethylmáselná, kyselina 2-methyl-hexanová, kyselina 5-methylhexanová, kyselina

2.2- dimethylpentanová, kyselina 2,4-dimethylpentanová, kyselina 2-ethyl-3-methylmáselná, kyselina 2-ethylpentanová, kyselina 3-ethylpentanová,· kyselina

2.2- dimethyl-3-methylmáselná, kyselina 2-methylheptanová, kyselina 3-methylheptanová, kyselina 4-methylheptanová, kyselina 5-methylheptanová, kyselina 6-methylheptanová, kyselina 2,2-dimethylhexanová, kyselina 2,.3-dimethyl- 35 hexanová, kyselina 2,4-dimethylhexanová, kyselina 2,5-dímethylhexanová, kyselina 3,3-dimethylhexanová, kyselina 3,4-dimethylhexanová, kyselina 3,5-dimethyl-. hexanová, kyselina 4,4-dimethylhexanová,' kyselina 2-éthylhexanová, kyselina 3-ethylhexanová, kyselina 4-ethylhexanová, kyselina 2-propylpentanová, kyselina 2-ethylhexanová, kyselina' 3-ethylhexanová, kyselina

4- et.hylhexanová, kyselina 2-(1-propyl)pentanová, kyselina 2-(2-propyl) penta.nová, kyselina 2,2-diethylmáselná, kyselina 2,3,4-trimethylpentanová, kyselina 2-methyloktanová, kyselina.4-methyloktanová, kyselina7-methyloktanová, kyselina 2,2-dimethylheptanová, kyselina . 2,6-d'ime.thylheptanová, kyselina 2-ethyl-2-methylhexanová, kyselina 3-ethyl-5-methylhexanová, kyseliná 3-(1-propyl) hexanová, kyselina 2-(2-butyl)pentanová, kyselina 2-(2-(2-methylpropyl))pentanová, kyselina 2-methylnonanová, kyselina 8-methylno.nanoVá, kyselina 6-ethyl.oktanová, kyselina 4-(1-propyl)heptanová, kyselina

5- (2-propyl)heptanová, kyselina 3-methylundekanová, kyselina 2-pentylheptanová, kyselina 2,3,4,5,6-pentamethylheptanová, kyselina 2,6-diethyloktanová, kyselina 2-hexyloktanová, kyselina 2,3,4,5,6,7-hexamethyloktanová, kyselina 3,3-diethyl-4,4-diethylhexanová, kyselina'

2-heptylnonanová, kyselina 2,3,4,5-tetraethyloktanová, *

kyselina 2-oktýldekanová a kyselina 2-(l-propyl)-3-(1-propyl)-4,5-diethyl-6-methylheptanová.

Ještě další výhodná skupina acylujících částí sestává z cyklických alkylkyselin, které mají od 5 do 24 atomů uhlíku, kde cyklická alkylová část nebo části mají. 5 až 7 atomů uhlíku. Bude uveden representativní výčet takových rozvětvených nasycených mastných kyselin, aby se zajistilo, že čtenář bude srozuměn s rozsahem těchto

·· ♦♦ ·· • · · * »9 9 ♦ » » · · · * * φ · · 9 9 »9 9

9 9 · 9 · 9 φ · · · ·» «9 ΦΦ mastných kyselin, které mohou být v předloženém vynálezu použity jako acylující části proteinů: kyselina cyklopentylmravenčí, kyselina cyklohexylmravenčí, kyselina 1-cyklopentyloctová, kyselina 2-cyklohexyloctová, kyselina

1,2-dicykl’opentyloctová a podobně.

Výhodná.skupina derivovaných proteinů pro použití v mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává z monoacylovaných proteinů. Nejvýhodnější je monoacylace eta-aminoskupíny. U inzulinu je výhodná monoacylace na LysB29. Podobně je pro jisté analogy inzulinu, jako je analog LysB28,ProB29-lidského inzulinu, je nej.výhodně j ší monoacylace eta-aminoskupiny LýsB28. Monoacylace alfa-aminoskupiny řetězce Β (Bl) je také výhodná. Monoacylace alfa-aminoskupiny řetězce A (Al) je. také výhodná.

Výhodná skupina acylovaných proteinů pro použití v mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává z diacylovaných proteinů. K. diacylaci může dojít například, na eta-aminoskupině Lys a alfa-aminoskupině řetězce B, nebo k ní může dojít na eta-aminoskupině Lys a alfa-aminoskupině řetězce A, nebo k ní může dojít na alfa-aminoskupině řetězce A a alfa-aminoskupině řetězce B.

Další výhodná skupina acylovaných proteinů pro použití v mikrokrystalech podle předloženého vynálezu sestává z triacylovaných proteinů. Triacylovanými proteiny jsou proteiny, které jsou acylovány na eta-aminoskupině Lys, na alf a-aminoskupině řetězce B a na alfa-aminoskupině řetězce A.

Je také výhodné používat acylované proteiny, • 4 < 9 · · · • 4 ·· · β « 4 · ♦

4 9 · · které jsou·směsí monoacylovaných a diacylovaných proteinů.

Je podobně výhodné používat acylované proteiny, které jsou směsí monoacylovaných a triacylovaných proteinů.

Další výhodná skupina acylovaných proteinů sestává ze směsi diacylovaných a triacylovaných proteinů.

¹ *

Je také výhodné používat acylované proteiny,· které.jsou směsí monoacylovaných, diacylovaných a triacylovaných proteinů.

Jisté mastnou kyselinou acylované proteiny použité v předložených mikrokrystalech budou uvedeny, aby se zajistilo, že čtenář bude srozuměn s rozsahem tohoto vynálezu. Tento seznam je ilustrativní a skutečnost, že určitý mastnou kyselinou acylovaný protein není zmíněn neznamená, že mikrokrystal, který jej obsahuje nespadá do rozsahu předloženého vynálezu.

B29-N-etá-formyl-lidský inzulín,

Bl-N-alfa-formy.l-lidský inzulín,

Al-N-alfa-formyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-formyl-Bl-N-alfa-formyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-formyl-Al-N-alfa-formyl-lidský inzulín,

Al-N-alfa-formyl-Bl-N-alfa-formyl-lidský inzulín,

- 38 • · « · · ·· * ♦ • « toto «toto· · > ·· · · · · ··· to · « ·· » · , · · *

B29-N-eta-formyl-Al-N-alfa-formy1-Bl-N-alfa-formy1-lidský inzulin,

B29-N-eta-acetyl-lidský inzulin,

Bl-N-alfa-acetyl-lidský inzulin,

Al-N-alfa-acetyl-lidský inzulin,

B29-N-eta-acetyl-Bl-N-alfa-acetyl-lidský'inzulin, ‘

B29-N-eta-acetyl-Al-N-alfa-acetyl-lidský inzulin,

Al-N-alfa-acetyl-Bl-N-alfa-acetyl-lidský inzulin,

B29-N-eta-ace.tyl-Al-N-alfa-acetyl-Bl-N-alfa-acetyl-lidský inzulin,

B29-N-eta-propionyl-lidský inzulin,

Bl-N-alfa-propi.onyl-lidský inzulin,

Al-N-alfa-propionyl-lidský 'inzulin,

B29-N-eta-propionyl-Bl-N-alfa-propionyl-lidský inzulin,

B29-N-eta-propionyl-Al-N-alfa-propionyl-lidský inzulin,

Al-N-alfa-propionyl-Bl-N-alfa-propionyl-lidský inzulin,

B29-N-eta-propionyl-Al-N-alfa-propionyl-Bl-N-alfa-propionyl-lidský inzulin, • to • · • · • · ·» toto • · · to to · • · toto · · • · · · · ♦ · to · · · ·· «to ·« · · « ♦ · · to • totototo »·· · · toto * • «««to »» · · ·· inzulín, inzulín, inzulin.

- 39 B29-N-eta-butyryl-lidský inzulín,

Bl-N-alfa-butyryl-lidský inzulín,

Al-N-alfa-butyryl-lidský inzulín,

B29-N-eta-butyryl-Bl-N-alfa-butyryl-lidský

B29-N-eta-butyryl-Al-N-alfa-butyryl-lidský

Al-N-alfa-butyryl-Bl-N-alfa-butyryl-lidský

B29-N-eta-butyryl-Al-N-alfa-butyryl-Bl-N-alfa-butyryl-lidský inzulín,

B29-N-eta-pentanoyl-lidský.inzulín,

Bl-N-alfa-pentanoyl-lidský.inzulín,

Al-N-alfa-pentanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-pentanoyl-Bl-N-alfa-pentanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-pentanoyl-Al-N-alfa-pentanoyl-lidský inzulín,

Al-N-alfa-pentanoyl-Bl-N-alfa-pentanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-pentanoyl-Al-N-alfa-pentanoy1-Bl-N-alfa-pentanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-hexanoyl-lidský inzulín,

Bl-N-alfa-hexanoyl-lidský inzulín, « » * · · ·· 9 • · ♦ · · · • ♦ ···*·.·· '· • · · · · · * ·« ·· ·· ·« inzulín, inzulín, inzulín.

- 40 t.

Al-N-alfa-hexanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-hexanoyl-Bl-N-alfa-hexanoyl-lidský

B29-N-eta-hexanoyl-Al-N-alfa-hexanoyl-lidský

Al-N-alfu-hexanoyl-Bl-N-alfa-hexanoyl-lidský

B29-N-eta-hexanoyl-Al-N-alfa-hexanoyl-Bl-N-alfa-hexanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-heptanoyl-lidský inzulín,

Bl-N-alfa-heptanoyl-lidský inzulín,

Al-N-alfa-heptanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-heptanoyl-Bl-N-alfa-heptanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-heptanoyl-Al-N-alfa-heptanoyl-lidský inzulín,

Al-N-alfa-heptanoyl-Bl-N-alfa-heptanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-heptanoyl-Al-N-alfa-fteptanoyl-Bl-N-alfa-heptanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta.-oktanoyl-lidský inzulín,

Bl-N-alfa-oktanoyl-lidský inzulín,

Al-N-alfa-oktanoyl-lidský inzulín, • ·«· ♦ ·· « » ·· * *·« · ·· · · »♦ « *« · * « · ··· · · ·· « · · · ·.· · ·♦·« ·« ·· ·· ·· »· ·· inzulín, inzulín, inzulín,

-41B29-N-eta-oktanoyl-Bl-N-alfa-oktanoyl-lidský

B297N-eta-oktanoyl-Al-N-alfa-oktanoyl-lídský

Al-N-alfa-oktanoyl-Bl-N-alfa-oktanoyl-lidský'

B29-N-eta-oktanoyl-Al-N-alfa-oktanoyl-,Bl-N-alfa-octanoyllidský inzulín, z? . ·

B29-N-eta-nonanoyl-lidský inzulín,

Bl-N-alfa-nonanoyl-lidský inzulín,

Al-N-alfa-nonanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-nonano.yl-Bl-N-alfa-nonanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-nonanoyi-Al-N-alfa-nonanoyl-lidský inzulín,

Al-N-alfa-nonanoyi-Bl-N-alfa-nonanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-nonanoyl-Al-N-alfa-nonanoyl-Bl-N-alfa-nonanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-dekanoyl-lidský inzulín,

Bl-N-alfa-dekanoyl-lidský inzulín,

Al-N-alfa-dekanoyl-lidský inzulín,

B29-N-eta-dekanoyl-Bl-N-alfa-dekanoyí-lidský inzulín,

B29-N-eta-dekanoyl-Al-N-alfa-dekanoyl-lids.ký inzulín,

- 42 44 *4 • · 4 '4 • 4 444 4

44

4 4 4

4 4 ·

4 4 4 • 4 4 4

4 4 4

Al-N-alfa-dekanoyl-Bl-N-alfa-dekanoyl-lidský inzulin,

B29-N-eta-dekanoyl-Al-N-alfa-dekanoyl-Bl-N-alfa-dekanoyl-lidský inzulin, analog B28-N-eta-formyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Bl-N-alfa-formyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfá-formyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-formyl-Bl-N-alfa-formyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, * ¹ analog B28-N-eta-formyl-Al-N-alfa-formyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu,

4.· analog Al-N-alfa-formyl-Bl-N-alfa-formyl-LysB28,ProB29lidského inzulínu, analog B28-N-eta-formyl-Al-N-alfa-formyl-Bl-N-alfa-formyl-LysB28,ProB29-lidského .inzulinu,.

analog B28-N-eta-acetyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Bl-N-alfa-acetyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfa-acetyl-LysB28, ProB29-lidské.ho inzulinu, analog B28-N-eta-acetyl-Bl-N-alfa-acetyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu analog B28-N-eta-acetyl-Al-N-alfa-acetyl-LysB28, ProB29φφ φφ

- 43 »φ φφ • φ φ φφφφ φ φ φφ φ φ φφ φφ φφ φφ φ φ φ · • φ φ φ · φ φφφφ * φ φ φ · « φ φφ

-lidského inzulínu, analog Al-N-alfa-acetyl-Bl-N-alfa-acetyl-LysB28,ProB29-lidského inzulínu, analog B28-N-eta-ⁱacetyl-Al-N-alfa-acetyl-Bl-N-alfa-acetyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-propionyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Bl-N-alfa-propionyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfa-propionyl-LysB28,PřoB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-propionyl-Bl-N-alfa-propionyl-LysB28, ProB2 9-lids.kého inzulinu, analog B28-Ň-eta-pr.opionyl-Al-N-alfa-propionyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfa-propionyl-Bl-N-alfa-propionylLysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-propionyl-Al-N-alfa-propionyl-Bl-N-alf a-propionyl-LysB28·, ProB29-lidskéhč> inzulinu, · analog B28-N-eta-butyryl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Bl-N-alfa-butyryl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, _ ΔΑ _ ·····» *Τ*τ “ · · · · · · analog Al-N-alfa-butýryl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-butyryl-Bl-N-alfa-butyryl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-butyryl-Al-N-alfa-butyryl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, » analog A'l-N-alfa-butyryl-Bl-N-alfa-butyryí-LysB28, ProB29-lidského inzulinu, analog B28~N-eta-butyryl-Al-N-alfa-butyryl-Bl-N-alfa-butyryl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-pentanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Bl-N-alfa-pentanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfa-pentanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-pentanoyl-Bl-N-alfa-pentanoyl-LysB28, ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-pentanoyl-Al-N-alfa-pentanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfa-pentanoyl-Bl-N-alfa-pentanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-pentanoyl-Al-N-alfa-pentanoyl-Bl-N«· »· ·· ··. .··.

• ·· * 1 ίζ ί β · · · ·.·· · • ♦ · · · · · ·*·

- 45 - ······ · ·> · · · · · · · ·

-alfa-pent.anoyl-LysB28, PřoB29-lidského inzulínu, · analog B28-N-eta-hexanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Bl-N-alfa-hexanoyl-LysB28, ProB29-lidského inzulínu., analog Al-N-alfa-hexanoyl-tysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-hexanoyl-Bl-N-alf.a-hexanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, *

analog B28-N-eta-hexanoyl-Al-N-alfa-hexanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfa-hexanoyl-Bl^N-alfa-hexanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-hexanoyl-Al-N-alfa-hexangyl-Bl-N-alfa-hexanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu,

J ' analog B28-N-eta-heptanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B-l-N-alfa-heptanoyl-LysB28, ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfa-heptanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-heptanoyl-Bl-N-alfa-heptanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-heptanoyl-Al-N-alfa-heptanoyl'44

- 46 9*

4 4 4

4 ·· ·4 4 4

4 4 4 «4 ·4 »· • i · ·

4 4 4

4 4 44

4 4

44

44

4 4 4

4 4 4

4 4 9

4 4 4

44

-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfa-heptanoyl-Bl-N-alfa-heptanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-heptanoyl-Al-N-alfa-heptanoy1-B1-N-alfa-heptanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-oktanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulínu,.

analog Bl-N-alfa-oktanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfa-oktanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-oktanoyl-Bl-N-alfa-oktanoyl-Lys.B28, ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-oktanoyl-Al-N-alfa-oktanoyl-LysB28,ProB29-íirského inzulinu, analog Al-N-alfa-oktanoyl-Bl-N-alfa-oktanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-oktanoy1-Al-N-alfa-oktanoyl-Bl-N-alfa-oktanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-nonanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulínu, analog Bl-N-alfa-nonanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfa-nonanoyl-LysB28, ProB'29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-nonanoyl-Bl-N-alfa-nonarioyltt· *

• « ♦ • · · » • · · ·· tttt • · · • tttt • · · • » tt* tt ·· tttt ·* • «· • ·· • · * • « « tt· tt *·

- 47 -LysB28,ProB29-lidského inzulínu, analog B28-N-eta-nonanoyl-Al-N-alfa-nónanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfa-nonánoyl-Bl-N-alfa-nonanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-nonanoyl-Al-N-alfa-nonanoyl-Bl-N-alfa-nonanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-dekanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Bl-N-alfa-dekanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfa-dekanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-dekanoyl-Bl-N-alfa-dekanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog B28-N-eta-dekanoyl-Ál-N-alfa-dekanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu, analog Al-N-alfa-dekanoyl-Bl-N-alfa-dekanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulínu,

B28-N-eta-dekanoyl-Al-N-alfa-dekanoyl~Bl-N-alf a-dekanoyl-LysB28, ProB2.9-lidský inzulín,

B29-N-eta-pentanoyl-GlyA2í,ArgB31.,ArgB32-lidský inzulín,

J.

Bl-N-alf'a-hexanoyl-GlyA21,ArgB31, ArgB32-lidský inzulín, • « ftft · · ftft ·· • ftft · · ·· · · « · ί ♦ · ♦· · · · · · · · £ ylO ftftft··.·· ··· · * · · *

- 4o - 5 ··*·*' · · · ♦ · * ·* ·· ·· ·· ·.·

Al-N-alfa-heptanoyl-GlyA21,ArgB31,ArgB32-lidSký inzulín.,

B29-N-eta-oktanoy.l-, Bl-N-alfa-octanoyl-GlyA21, ArgB31, ArgB32-lidský inzulín,

B29-N-eta-propionyl-,Al-N-alfa-propionyl-GlyA21,ArgB31,ArgB32-lidský inzulín,

Al-N-alfa-acetyl,Bl-N-alfa-acetyl-GlyA2l,ArgB31,ArgB32lidský inzulín,

B29-N-eta-formy1-Al-N-alfa-formy1-Bl-N-alfa-formy1-GlyA21,ArgB31,ArgB32-lidský inzulín,

B29-N-eta-formyl-des (TyrB26)-lidský inzulín,.

Bl-N-alfa-acetyl-AspB28-lidský inzulín,

B2 9-N-eta-pr'opi onyl-Al-N-alf a-propionyl-Bl-N-alf a-propionyl-AspBl,AspB3,AspB21-lidský inzulin,

B29-N-eta-pentanoyl-GlyA21-lidský inzulin,

Bl-N-alfa-hexanoyl-GlyA21-lidský inzulin,

Al-N-alfa-heptanoyl-GlyA21-lidský inzulín,

B29^,-N-eta-oktanoyl-Bl-N-alfa-oktanoyl-GlyA21-lidský inzulin, » i

B29-N-eta-propionyl-Al-N-alfa-propionyl-GlyA21-lidský inzulin, to··# ·«·· * · · Γ to ··· · ·· · to ·· * • ·· # · · · ··· to Jp toto to to · · · to - · · · to · · · ·· 9? '·« ·«, toto ··

Al-N-alfa-acetyl-Bl-N-alfa-acetyl-GlyA21-lidský inzulin,

B29-N-eta-formyl-Al-N-alfa-formyl-,Bl-N-alfa-formyl-GlyA21-lidský insulin.

B29-N-eta-butyryl-des(ThrB3O)-lidský inzulin,

Bl-N-alfa-butyryl-dés(ThrB3O)-lidský inzulin,

Al-N-alfa-butyryl-des(ThrB3O)-lidský inzulin,

B29-N-eta-butyryl-Bl-N-alfa-butyryl-des(ThrB30)-lidský inzulin,

B29-N-eta-butyryl-Al-N-alfa-butyryl-des(ThrB30)-lidský inzulin. .

Al-N-alfa-butyryl-,Bl-N-alfa-butyryl-des(ThrB30)-lidský inzulín a

B29-N-eta-butyryl-Al-N-alfá-butyryl-Bl-N-alfa-butyryl-.

-des(ThrB30)-lidský inzulin.

Výhodné jsou vodné přípravky obsahující vodu jako hlavní rozpouštědlo. Velmi výhodné jsou vodné suspenze, kde je solventem voda. . Přípravky podle předloženéhq vynálezu se používají k léčení pacientů, kteří mají diabetes nebo hyperglykémii. Formulace podlé předloženého vynálezů . typicky poskytují derivovaný protein v koncentracích od asi 1 mg/ml do asi 10 mg/ml. Předložené formulace inzulínových produktů jsou typicky charakterizovány

- 50 • « · ♦ φ » φ * • φ · φ • 5 φ · • φ φ · φ· » φ • ··· vyjádřením koncetrace v jednotkách inzulínové aktivity· (j/ml), jako je U40, U50, U100 atd., což zhruba odpovídá asi 1,4, 1,75 respektive '3,5 mg/ml přípravku. Dávka, cesta podání a počet podání za den stanoví lékař, přičemž vezme, v úvahu takové faktory, jako jsou terapeutické cíle, povaha a příčina pacientova onemocnění, pacientovo pohlaví a hmotnost, úroveň námahy, potravní zvyklosti, způsob podání a jiné faktory známé zkušenému lékaři. V širokém rozmezí by denní dávka měla být v rozmezí od asi 1 nmol/kg tělesné hmotnosti do asi 6 nmol/kg tělesné hmotnosti (6 nmol se považuje za ekvivalentní asi 1 jednotce inzulínové aktivity)'. Dávka mezi asi 2 .a asi 3 nmol/kg je typická pro současnou terapii inzulínem.

Lékař s běžnou zkušeností léčení diabetů bude schopen zvolit terapeuticky nejvýhodnější prostředky k podání - formulací podle, předloženého vynálezu. Parenterální cesty podání jsou výhodné. Typické cesty parenterálního podání suspenzních formulací inzulinu jsou cesty subkutánní a intramuskulární. Přípravky a formulace podle předloženého vynbálezu mohou být také podávány nasální., bukální, plicní nebo oční cestou.

Jako isotonizační činidlo je výhodný glycerol v koncentraci 12 mg/ml až 25 mg/ml. Ještě výhodnější je pro isotonizaci použít glycerol v koncentraci od aši 15 mg/ml do asi 17 mg/ml.

Ve formulacích podle předloženéhb vynálezu jsou výhodnými konzervancii m-kresol a fenol nebo jejich směsi.

Inzulin, analogy inzulinu nebo' proinzuliny použité pro přípravu derivovaných proteinů mohou být

- 51 ΦΦ «φ Μ Φ· ·· ·· φ 9 φ φ Φ Φ « .Φ ΦΦ Φ φφφφ ΦΦ»· ΦΦΦΦ φ Φ Φ ΦΦΦΦ II·#· Φ » · φ Φ Φ λ φ φ · · ΦΦΦΦ «Φ *« Ο φφ » » «· připraveny kterýmkoli z mnoha uznávaných postupů syntézy peptidů včetně klasických (v roztoku) postupů, postupů na tuhé fázi, semisynteťických postupů a novějších postupů pomocí rekombinantní DNA. Viz například Chance, R. E., a kol., US patent č. 5 514 646, 7. květen 1996, EPO publikace číslo 383 472, 7. únor 1996, Brange, J. J. V., a kol. EPO publikace číslo 214 826, 18. březen 1987 a Belagaje, R. M.,. a kol·., US patent č. 5 304 473, 19. duben 1994, které zveřejňují přípravu různých analogů proinzulinu a inzulinu. Tyto odkazy jsou zde' výslovně zahrnuty formou odkazu.

Obecně platí, že derivované proteiny se připravují za použití postupů známých v oboru. Výše uvedené publikace, použité k popisu derivovaných proteinů obsahují vhodné postupy přípravy derivovaných proteinů.

Tyto publikace jsóu zde výslovně zahrnuty formou.odkazu pro ^způsoby přípravy derivovaných proteinů. K přípravě acylovaných proteinů se protein nechá reagovat a aktivovanou organickou kyselinou, jako je aktivovaná mastná kyselina. Aktivované mastné kyseliny jsou deriváty běžně používaných acylačních činidel a zahrnují aktivované estery mastných kyselin, halogenidů mastných kyselin, aktivovaných amidů mastných kyselin, jako jsou aktivované deriváty azolidu [Hansen, L. B·,. WIPO publikace č. WO 98/02460, 22. leden 1998] a anhydridů mastných kyselin.

Použití aktivovaných esterů, obzvláště N-hydroxyesterů mastných kyselin se sukcinimidem, je obzvláště výhodným prostředkem acylace volné aminokyseliny mastnou kyselinou. Lapidot a kol. popisují přípravu N-hydroxysukcinimidových esterů a jejich použití při přípravě Ν-lauroylglycinú, N-lauroyl-L-serinu a kyseliny N-lauroyl-L-glutamové. Pojem aktivovaný ester mastné

- 52 ·« • 9 9 >Φ kyseliny znamená mastnou kyselinu, která je aktivována za použití obecných postupů známých v oboru [.Riordan, J. F. a Vallee, B. L., Methods in Enzymology, XXV, 494 - 499 (1972), Lapidot, Y., a kol., J. Lipid Res.,, 8., 42 - 145 (1967)). Hydroxybenzotriazid (HOBT),. N-hydroxysukcinimid a jejich deriváty jsou dobře známy pro přípravu aktivovaných kyselin pro syntézu peptidů.

K selektivní acylaci eta-aminoskupiny mohou být póužity různé chránící skupiny, které mají během spojování blokovat alfa-aminoskupinu. Výběr vhodné chránící skupiny je odborníkovi v oboru znám a zahrnuje p-methoxybenzoxykarbonyl (pmZ). Výhodně se eta-aminoskupina acyluje, jednokrokovou syntézou, bez použití skupin chránících aminoskupinu. Způsob selektivní acylace na N-eta-aminoskupině Lys· zveřejnil a nárokuje Baker, J. C., a kol., US patent č. 5 646 242, 8. července 1997, jehož celý obsah je zde výslovně zahrnut formou odkazu. Způsob přípravy suchého prášku, acylovaného proteinu zveřejnil a nárokuje Baker, J. C., a kol., US. patent č. 5 700 904, 23. prosince 1997, jehož celý obsah jezde výslovně zahrnut formou odkazu.

Primární rolí zinku v předloženém vynálezu je usnadnění tvorby zinečnatých hexamerů derivovaného proteinu. O zinku je známo, že usnadňuje tvorbu hexamerů. inzulinu.a analogů inzulinu. Podobně zinek usnadňuje tvorbu hexamerů derivovaného inzulinu a analogů inzulinu.

4* · · · '

Tvorby hexamerů.se. příhodně dosáhne tím, že se hodnota pHroztoku obsahujícícho derivovaný protein uppaví za přítomnosti zinečnatých iontů na hodnotu z neutrální oblasti nebo tím, že . se po úpravě pH na hodnotu z neutrální oblasti přidají zinečnaté ionty.

• · 9· · · ··

9 9 9 9 9 9 9 * · » · ·

Κ dosažení efektivního výtěžku mikrokrystalů nebo amorfní sraženiny je poměr zinku k derivovanému proteinu v mikrokrystalech a amorfní sraženině podle předloženého vynálezu omezen na spodní hranici hodnotou asi 0,33, což představuje 2 atomy, zinku na hexamer derivovaného proteinu, jichž je třeba k efektivní hexamerizaci. Přípravky mikrokrystalů a amorfní sraženiny se budou vhodně vytvářet za přítomnosti asi 2 do asi 4 až 6 atomů zinku. Ještě více zinku se může během postupu použít, když je přítomna sloučenina, která soutěží s proteinem o vazbu zinku, jako je citrát nebo fosfát. Přebytek zinku nad množství potřebné pro hexamerizaci může být žádoucí k dosaženi silněji probíhající hexamerizace. Přebytek zinku nad množství potřebné pro hexamerizaci může také být přítomen ve formulaci podle předloženého vynálezu a může být žádoucí ke zlepšení chemické a fyzikální stability, ke zlepšení suspendability a možná ke dalšímu prodloužení doby účinku. V důsledku toho.existuje ve formulacích podle předloženého vynálezu celkem široký rozsah přípustných poměrů zinek:protein.

V souladu s předloženým vynálezem je zinek přítomen ve formulací v množství od asi 0,3 molu do asi -7 molů na mol derivovaného proteinu a výhodněji od asi 0,3 molu do asi 1,0 molu'derivovaného proteinu. Ještě více výhodný jé poměr zinku k derivovanému proteinu od asi 0, 3 do asi 0,7 molu atomů zinku na· mol derivovaného proteinu . Nej výhodnější je poměr zinku k derivovanému proteinu od asi 0,30 do asi 0,55 molu atomů zinku na mol derivovaného proteinu.' Pro přípravky s vyšším obsahem zinku, které jsou podobné přípravkům PZI, je poměr zinku od asi 5 do asi 7 molů zinku na mol derivovaného proteinu..

- 54 4 4 4 * 4 »4 4 4 «4 9

444» 4444 44«· (#4 4 · * 4 444 '«· 44 4

4444 ·4 4 «444

44 44 44 44 44

Sloučeninou zinku, která poskytuje zinek pro předložený vynález může být farmaceuticky přijatelná sloučenina zinku. Přidání zinku k inzulínovým přípravkům je v oboru známo, stejně jako farmaceuticky přijatelné zdroje zinku. Výhodné sloučeniny zinku k dodání zinku pro předložený vynález zahrnují chlorid zinečnatý, octan zinečnatý, citrát zinečnatý, oxid zinečnatý a dusičnan zinečnatý.

Pro mikrokrystaly a sraženiny podle předloženého vynálezu je vyžadována komplexující sloučenina. Komplexující sloučenina musí být přítomna v dostatečných množstvích, aby způsobila podstatné srážení a krystalizaci hexamerů. derivovaného proteinu. Taková množství dané komplexující sloučeniny se pro každý přípravek snadno určí prostými titračními pokusy. Ideálně je koncetrace komplexující sloučeniny upravena tak, aby v rozpustné fázi po dokončení srážení a křystalizace zbývalo zanedbatelné množství komplexující sloučeniny. To vyžaduje kombinování komplexující sloučeniny založené na experimentálně stanoveném isofanovém poměru.. U tohoto poměru se očekává, že je velmi podobný poměru u NPH a NPL. Může však být mírně odlišný., protože acylace může ovlivnit povahu interakce protein-proťamin.

Pokud je komplexující sloučeninou protamin, je v mikrokrystalu přítomen v množství od asi 0,15 mg do asi 0,5 mg na 3,5 mg derivovaného proteinu. Poměr protaminu k derivovanému proteinu je výhodně od asi 0,25 do asi 0,40 (mg/mg). Výhodněji je poměr od asi 0,25 do asi 0,38 (mg/mg)'. Výhodně je protamin v množství 0/05 mg do asi 0,2 mg na mg derivovaného proteinu a výhďdněji od asi 0,05 do

- 55 • ··'·*· • · · · · ♦· • · · « > · • · 9 9 4 4 • 9 9 * · ♦ · t '4' 9 9 4 ·

99 99 asi 0,15 mg protaminu na mg derivovaného proteinu. Výhodnou formou soli protaminu pro použití podle předloženého vynálezu je protamin sulfát.

K dalšímu prodloužení doby účinku, přípravků podle předloženého vynálezu nebo ke zlepšení, jejich suspendovatelnosti může být po krystalizaci přidán další protamin a zinek. Do předloženého vynálezu tedy také . spadají formulace, které mají protamin ve vyšším poměru než isofan. Pro tyto formulace je poměr protaminu od 0,25 mg do asi 0,5 mg protaminu na mg derivovaného .protaminu.

Požadovanou složkou mikrokrystalů a sraženin podle předloženého vynálezu je sloučenina stabilizující hexamer. Struktury 3 hexamerních konformaci jsou charakterizovány v literatuře a jsou označovány T6, T3R3 a R6. Za přítomnosti sloučeniny stabilizující hexamer, jako jsou různé fenolícké sloučeniny, je konformace R6 stabilizovaná.

Je tedy vysoce'pravděpodobné, že hexamery v krystalech a sraženinách vytvořených za přítomnosti sloučeniny stabilizující hexamer,. jako je fenol, jsou v konformaci R6 nebo T3R3. Sloučenin stabilizujících hexamer je vhodná celá řada. Pro účinnou stabilizaci hexamerů jsou vyžadovány přinejmenším 2 moly sloučeniny stabilizující hexamer na hexamer derivovaného proteinu. Je výhodné, když jsou v mikrokrystalech a sraženinách podle, předloženého vynálezu přítomny přinejmenším 3 moly sloučeniny stabilizující hexamer na hexamer derivovaného proteinu. Přítomnost vyšších poměrů sloučeniny stabilizující hexamer, přinejmenším 25- až 50-krát vyšší, v roztoku, z nějž se mikrokrystaly a sraženiny připravují, neovlivní stabilizaci hexamerů škodlivě.

Ve formulacích podle předloženého vynálezu může • φ

Φ Φ ·· *« «4 • · · * · » » Φ Φ * Φ Φ φ Φφφ « · Φ Φ · >· · • Φφ φ«φ Φ φφφφφ Φφ Φ _ C/C ~ ΦΦΦΦΦΦ φφφφφ φφ «Φ φφ · φφ φ· φφ být přítomno kónzervans, obzvláště pokud je formulace určena k vícenásobnému použití. Jak je zmíněno výše, je známa celá řada vhodných konzervancií. Výhodně je kónzervans v roztoku přítomno v množství vhodném k poskytnutí anťimikřobiálního účinku dostatečném k vyhovění lékopisným požadavkům.

Výhodnými konzervarícii jsou fenolická konzervancia, která jsou vyjmenována výše. Výhodné koncentrace fenolického konzervancia jsou.od asi 2 mg do asi 5 mg na ml,vodné suspenzní formulace. Tyto koncentrace se týkají celkové hmoty fenolických konzervancií, protože se zamýšlí použití směsí.fenolických konzervancií. Vhodná fenolická konzervancia zahrnují například fenol, m-kresol a methylparaben. Výhodnými fenolickými konzervancií jsou fenol a m-kresol. Směsi, fenolických sloučenin, jako je fenol a m-kresol, jsou také zamýšleny jako.velmi výhodné.

Příklady směsí fenolických sloučenin jsou 0,6 mg/ml fenolu a.1,6 mg/ml m-kresolu a 0,7.mg/ml fenolu a 1,8 mg/ml m-kresolu.

►

Mikrokrystaly podle předloženého vynálezu mají výhodně prodloužený tvar, přičemž jednotlivé krystaly jsou složeny z derivovaného proteinu tvořícího komplex s dvoůmocným kationtem a zahrnující komplexující sloučeninu •a sloučeninu stabilizující hexamer. Střední délka -.

mikrokrystalů. podle předloženého vynálezu je výhodně v rozmezí 1 μιτι až 40. μιτι, výhodněji je v rozmezí velikostí 3 μη až 15 μη.. ♦

Výhodný přípravek zahrnuje od asi 3 mg do asi 6 mg protaminsulfátu na 35 mg derivovaného proteinu a od asi 0,1 do asi 0,4 mg zinku na 35 mg derivovaného proteinu.

t

4 t « 4 ·

4

- 57 • · ·4 »4 4 4 • I» · 4 -* * · 4

4« 4 4 4 4 * • « · « 4 · 4 4 4 4 • · · »««* • · < * 4' · 4 4

Další výhodný přípravek zahrnuje od asi 10 mg do asi 17 mg protaminsulfátu na 3.5 mg derivovaného proteinu a od asi 2,0 do asi 2,5 mg zinku na 35 mg derivovaného proteinu.

Další výhodný přípravek zahrnuje na ml 0,34 až 0,38 mg· protaminsulfátu, 0,01 až 0,04 zinku a 3,2 až 3,8 mg derivovaného proteinu..

Použití předložených nerozpustných přípravků k přípravě léčiva pro léčení diabetů nebo hypěrglykémie je zamýšleno také.· Amorfní sraženiny a krystaly podle předloženého vynálezu mohou být připraveny pro použití v léčivech nebo jiné pro použití mnoho různými způsoby. Souhrnně bude vhodný způsob obecně 'Sledovat, sled: rozpouštění, hexamerizace, komplexace, srážení, křystalizace a případná formulace. Rozpouštění znamená dostatečné rozpouštění derivovaného proteinu, aby mu bylo umožněno vytvořit hexamery. Hexamerizace odkazuje na způsob, při- kterém se molekuly derivovaného proteinu váží s atomy zinku(II), aby se vytvořily hexamery. Komplexace označuje tvorbu nerozpustných komplexů mezi hexamery a protaminem. Srážení je typicky výsledkem tvorby nerozpustných komplexů. Křystalizace zahrnuje konverzi sražených komplexů hexamer/protamin na krystaly,, typicky tyčinkovité krystaly.

' . Rozpouštění se provádí rozpouštěním derivovaného proteinu ve vodném rozpouštědle. Vodné rozpouštědlo může být například kyselý roztok, neutrální roztok nebo bazický roztok. Vodné rozpouštědlo se může skládat částečně z mísitelného organického rozpouštědla, jako je,ethanol, acetonitril, dimethylsulfoxid a podobně. Kyselými roztoky mohou být například roztoky HCI, výhodně od asi 0,01N HCI, do asi l,0N HCI. Stejně tak mohou být využity jiné • φ

Φ « ^Λ* «φ φφ φ φ φφ • φφ φ φ φφ φ φ φ φφ φφφφ φ φφ φφφ φ Φφφ «φφφ φ φ φ φφ φφ φφ φφ kyseliny, které jsou farmaceuticky přijatelné. Bazickými roztoky mohou být například roztoky NaOH, výhodně od asi s

Ο,ΟΙΝ NaOH do asi 1,ON NaOH, nebo vyšší. Stejně tak mohou být použity jiné báze, které jsou farmaceuticky přijatelné. Kvůli stabilitě proteinu je koncentrace kyseliny nebo báze tak nízká, jak je možno, přičemž musí být účinná k dosažení odpovídajícího rozpuštění derivovaného proteinu.

Mnoho derivovaných proteinů se může rozpustit při hodnotě pH v neutrální oblasti. Roztoky k rozpuštění derivovaných proteinů při hodnotě pH v neutrální oblasti mohou obsahovat pufr a případně soli, fenolickou sloučeninu nebo sloučeniny, zinek nebo isotonizační činidlo.

Podmínky roztoku požadované pro hexamerizaci jsou takové, aby v roztoku umožňovaly tvorbu hexamerů derivovaný protein-zinek. Typicky vyžaduje.hexamerizace zinek a hodnotu pH v neutrální oblasti. Přítomnost sloučeniny stabilizující hěxamer výhodně ovlivňuje konformaci derivovaného proteinu v hexamerů a usnadňuje konformaci hexamerů R6 nebo T3R6.

Komplexační krok musí zahrnovat spojení protaminu s hexamerem v podmínkách roztoku, kde je každý z nich původně rozpustný. To by mohlo, být splněno spojením oddělených roztoků hexamerního derivovaného proteinu a protaminu nebo vytvořením roztoku derivovaného proteinu a protaminu při hodnotě pH v kyselé nebo bázické oblasti a posunem hodnoty pH do oblasti neutrální.

Během krystalizace musí podmínky roztoku • »

4 • 4

- 59 9 · 4 · 4 • '4 4 4

4 4 4 • 4 4 4 * • 4» 4 · · · 4 • 4 44444 4« 4

4 4 9 4 4 4 »4 44 44 44

Stabilizovat krystalující druhy. Podmínky roztoku tedy určí rychlost a výsledek krystalizace. Krystalizace se pravděpodobně objevuje při rovnováze zahrnující nékrystalické sražené komplexy derivovaný protein-protamin, rozpuštěné komplexy derivovaný protein-protamin a krystalizované komplexy derivovaný protein-protamin. Podmínky jsou zvoleny tak, aby se rovnováha posunula ve směru tvorby krystalu. Ve světle hypotetické rovnováhy se také očekává, že rozpustnost derivovaného proteinu bude ovlivňovat rychlost a velikost, protože nižší rozpustnost zpomalí celkovou čistou konverzi ze sraženiny na roztok na krystal. Dále je dobře známo, že,zpomalení rychlosti krystalizace často vede k větším krystalům. Ma se za to, žě rychlost krystalizace a velikost krystalu závisí na velikosti a povaze derivatizující části v derivovaném proteinu.

Parametry krystalizace, které ovlivňují rychlost krystalizace a velikost krystalů podle předloženého vynálezu jsou: velikost acylové skupiny a její povaha, teplota, přítomnost a koncentrace sloučenin, které soutěží s derivovaným proteinem o zinek, jako je citrát, fosfát apod., povaha a koncentrace fenolické sloučeniny (fenolických sloučenin), koncentrace zinku, přítomnost a koncentrace mísitelného organického rozpouštědla, čas určený pro krystalizaci, pH a ionická síla, identita pufru a jeho koncentrace, koncentrace srážených látek, přítomnost kondenzačních materiálů, tvar a materiál nádoby, rychlost míchání a celková koncentrace proteinu. Má se za to, že zvláštní důležitost má teplota a koncentrace soutěžících sloučenin. '

Soutěžící sloučeniny, jako je citrát, ovlivňují

- 60 •« · * · · · · ·· .·· ♦ 4 4 4 · · · · · ♦ · · »

4*4 4 4 4 · · 9 4 4

4 4 » 4 9 4 444 · 4 · « 4

9 4 4 · » 4 4 9 4 4

4 4 4 tt 4 4 «V «· rychlost, jíž se tvoří krystaly a nepřímo velikost a kvalitu krystalu.· Tyto sloučeniny mohou. vykazovat svůj účinek tvorbou'koordinačních komplexů se zinkem v roztoku, a tedy soutěží o zinek.s relativně slabými místy vážícími zinek na povrchu hexameru derivovaného proteinu. Obsazeni těchto slabých povrchových vazebných míst pravděpodobně brání krystalizací. Navíc mnoho derivovaných proteinů je obzvláště nerozpustných za přítomnosti jen o trochu více ' , než 0,333 mol zinku na mol derivovaného proteinu a přítomnost soutěžících sloučenin obnovuje rozpustnost a umožňuje krystalizací. Přesná koncentrace soutěžících sloučenin bude vyžadovat optimalizaci pro každý derivovaný protein.Horní hranicí je samozřejmě koncentrace, při níž se zinek sráží soutěžící sloučeninou nebo koncentrace, při které by byl zbytek soutěžící sloučeniny farmaceuticky nepřijatelný, jako v případě, kdy by způsoboval bolest nebo podráždění v místě podání.

Následuje příklad způsobu přípravy sraženin a krystalů podle předloženého vynálezu. Odměřené množství · prrášku derivovaného proteinu se rozpustí ve vodném rozpouštědle obsahujícím fenolickě konzervans. K tomuto roztoků se přidá roztok zinku jako jedna z jeho rozpustných solí, například ZnCl₂,' aby se získaly od asi 0,3 molu.zinku, na mol derivovaného inzulinu do asi 0,7 molu nebo do až 1,0 molu zinku na mol derivovaného inzulinu. Případně se může k tomuto roztoku přidat abosolutní ethanol nebo jiné mísitelné rozpouštědlo v takovém množství, aby tvořilo rožtok z asi 5 % do asi 10 % objemových, organického rozpouštědla. Tento roztok se potom zfitruje přes filtr málo vážící protein o velikosti pórů 0,22 pm. Druhý roztok še připraví rozpuštěním odměřeného množství protaminu ve vodě, které se rovná 1 desetině koncetrace hmotnostní výše ♦ ·

- 61 •« toto ·· • to to to · • · toto · • ·· ··· • · · to · · to zmíněného roztoku derivovaného inzulínu. Tento roztok se zfiltruje přes filtr málo vážící protein o velikosti pórů .0,22 jim. Stejné objemy roztoku derivovaného inzulínu a roztoku protaminu se spojí a výsledný roztok se potom, pomalu míchá při teplotě místnosti (typicky okolo 25 °C) , načež se během asi 12 hodin až asi 10 dní vytvoří . mikrokrystaly derivovného proteinu..

Mikrokrystaly se potom mohou oddělit z matečné kapaliny a vložit do jiného rozpouštědla ke skladování a podání pacientovi. Příklady příhodných vodných rozpouštědel jsou následující: voda pro.injekce obsahující 25 mM TRIS, 5 mg/ml fenolu a 16 mg/ml glycerolu, voda pro injekce obsahující 2 mg/ml hydrogenfosforečnanu sodného,

1, 6 mg/ml m-kresolu, 0, 65 mg/ml fenolu a 1’6 mg/ml glycerolu a voda pro injekce obsahující 25 mM TRIS, 5 mg/ml fenolu, 0,1 M citrátu sodného 16 mg/ml glycerolu.

Ve výhodném ztělesnění se krystaly připraví způsobem, který obchází potřebu oddělit krystaly z matečné kapaliny. Je tedy výhodné pokud je matečná kapalina samotná vhodná pro podání pacientovi nebo pokud se matečná kapalina dá upravit pro podávání naředěním vhodným ředidlem. Pojem ředidlo nechť je chápán ve významu roztoku zahrnujícího vodné rozpouštědlo, ve kterém jsou rozpuštěny farmaceuticky přijatelné pomocné látky, včetně a bez omezení pufru, isotonizačního činidla, zinku, konzervancia, protaminu a podobně.

Vedle derivovaného inzulínu,.dvoumocného kationtů, komplexující sloučeniny a sloučeniny .stabilizující hexamer se mohou v přípravku upraveném pro parenterální podání v souladu s předloženým vynálezem ♦ · 4 · ft ft* * « ftft «

9 94 4 9 4 4 4 4 9 «

44 994 « ··· * · 44 9

«. · · ·„ ·*······

4 9 . 94 49 44 44 využít další pomocné látky a nosiče, jako jsou organická rozpouštědla mísitelná s vodou, jako je glycerol, sezamový olej, vodný propylenglykol apod. Pokud jsou' přítomna, použijí se tato činidla obyčejně v množství v rozsahu od ‘ asi 0,5 % do asi 2,0 % hmotnostních, založeno na konečné formulaci. Příklady takových'farmaceutických přípravků zahrnují sterilní, isotonické, vodné fyziologické roztoky derivátu derivovaného inzulinu pufrované farmaceuticky přijatelným pufrem a nepyrogenní. Další informace o různých postupech za použití koncenčních pomocných látek nebo nosičů pro parenterální produkty prosím najděte v.

Remington's Pharmaceutičla Sciences, 17. vydání, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA (1985), jež je zde zahrnuta formou odkazu.

V širokém provedení předloženého vynálezu je také zamýšleno, že formulace může obsahovat směs mikrokrystalické formulace a rozpustné, frakce derivovaného inzulinu nebo· rozpustné frakce normálního inzulinu nebo

A analogu s. rychlým nástupem účinku, jako je LysB28,ProB29-lidský inzulin. Takové směsi jsou určeny k tomu, aby poskytly kombinaci k řízení hladin glukózy v době jídla, což poskytuje rozpustný inzulin, a bazální řízení hladin glukózy,, což poskytuje nerozpustný inzulin.

Následující přípravy a příklady vynález ilustrují a vysvětlují. Rozsah vynálezu není těmito přípravami a příklady omezen. Odkazy na díly u tuhých látek znamenají díly hmotnostní. Odkazy na díly u kapalin znamenají díly objemové. Procenta, pokud jsou použita k vyjádření koncentrace, znamenají hmotu na objem (xlOO). Všechny teploty jsou ve stupních celsia (°C) .

TRIS odkazuje na 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol.

• to • to to · · to to ·· to · · · · ···« · to · to to « · · • ·· to to · · ··· ·* toto · • ' •to-· · · · · ·· · ·· to· ·« #· »· >·

Roztok zinku o koncentraci 1 000 dílů na milion (ppm) se připraví naředěním 1,00 ml atomického standardního roztoku zinku o koncentraci 10 000 ppm (Ricca Chemical Company, zinek v ředěné kyselině dusičné) vodou na konečný objem

10,00 ml.

V mnoha přípravcích popsaných níže je stanoven výtěžek sraženin a krystalů. Stanovení spočívá v určení množství derivovaného inzulínu nebo derivovaného analogu inzulínu ve sraženině nebo krystalu a na stanovení jeho původního množství v roztoku. K určení množství derivovaného proteinu se' vzorky znovu rozpuštěné sraženiny nebo krystalu a supernatantu nad sraženinou nebo krystaly analyzují pomocí gradientově HPLC. s obrácenou fází, jak je popsáno níže.

Ve stručnosti -analytický systém spočívá na sloupci C8 s obrácenou fází při 23 °C. Rychlost toku je 1,0 ml/min a použije se detekce při 214 nm. Rozpouštědlem A je 0,1% (objem:objem) kyselina trifluoroctová ve směsi 10:90 (objem:objem) acetonitril:voda. Rozpouštědlem B je 0,1% (objem:objem) kyselina trifluoroctová ve směsi 90:10^e (objem:objem) acetonitril:voda. Program vývoje je (minuty, % B) : (0,1,.0)., (45, 1, 75), (50, 1, 100), (55, 100), (57,

0), (72, 0). Všechny změny jsou lineární. Odborník v oboru může k dosažení stejného cíle vyvinout další analytické systémy.

Pro přípravu HPLC analýzy se alikvoty dobře promíchaných suspenzí rozpustí naředěním buď 0,01N HCl nebo 0,03N HCl. HPLC analýza těchto roztoků poskytne celkovou, koncentraci derivovaného proteinu v mg/ml. Alikvoty suspenze se odstřeďují přibližně 5 minut v mikrocentrifuze • tt tttt tttt tttt tttt tttt

·.·· tt · ·'· · · · · « • tttttt . tttttt · ···· • · · tttttt tt tttttt tttt tttt · tt.·· · tt tt tt tt tttt tt •tt tttt tttt ♦· .·» tttt

Eppendorf 5415C pří počtu otáček. 14 0Ό0 za minutu. Slitý supernatant. se naředí buď Ο,ΟΙΝ nebo 0,IN HCI a analyzuje se pomocí HPLC. Sraženina se promyje resuspendováním ve fyziologickém roztoku ošetřeném Dulbeccovým fosfátovým pufrem (bez vápníku nebo hořčíku) a repeletuje se odstředěním. Pufr se slije a tuhá látka se znovu rozpustí í

v Ο,ΟΙΝ HCI. Znovu rozpuštěná sraženina se analyzuje pomocí HPLC.

K potvrzení přítomnosti očekávaných proteinů v okyselené suspenzi, znovurozpuštěné sraženině a supernatantu a také ke stanovení koncentrací proteinu se použije HPLC. Retenční časy píků v chromatogramech znovu rozpuštěných sraženin se srovnají s retenčními časy pozorovanými prd protamin a inzulínové sloučeniny použité . k přípravě: formulací. Shoda mezi retenčními časy byla vždycky dobrá, čímž se ukázalo, že protamin a derivované proteiny se do krystalů skutečně inkorporovaly. Koncentrace derivovaných proteinů se stanoví srovnáním ploch pod příslušnými píky s plochami standardů. Koncentrace protaminu se kvantitativně nestanovují. Jako standard se použije roztok derivovaného inzulínu ó koncentraci 0,22 mg/ml. Nechá'se proběhnout standard obsahující protamin, ale pouze za účelem stanovení retenčního času. Koncetrace protaminu se nekvantifikuje.

.V mnohých přípravách popsaných níže se k určení jak rychle se krystaly rozpustí ve fyziologickém roztoku ošetřeném Dulbeccovým fosfátovým pufrem. (pH 7,4) při teplotě místnosti použije standardní spektrofotometrické stanovení. Významné odchylky od postupu popsaného bezprostředně níže jsou v popisech příprav, kde je to příhodné označeny. ,Pro všechna stanovení rozpouštění se

- 65 * · · · 4»* · · ·· ·· • · « · · · · · · · « « ··»··♦·· · ·· · • · · · · · · ··· · · · · · • 999 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 9 9 99 použije spektrofotometr vhodný pro měření, v ultrafialové oblasti, vybavený lem kyvetou a magnetickým míchadlem do kyvety. Kyveta obsahující malé míchadlo a 3,00 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem (PBS) se vloží do komůrky spektrofotometru. Přístroj se nastaví na

320. nm a,proti stejnému pufru se vynuluje. Potom se do kyvety přidají 4,0 mikrolitry dobře suspendované formulace,. která obyčejně má celkovou koncentraci přibližně.ekvivalentní přípravku U50, neboli asi 1,6 až

1,8 mg/ml. Poté, co se 1 minutu čeká na promíchání, se zaznamená optická hustota při 320 nm. Jelikož proteiny zahrnuté v této práci neabsorbují. světlo při. 320 nm, je ’ pokles optické hustoty zapříčiněn snížením rozptylu světla jak se krystaly rozpouštějí. Typicky se zaznamenává čas, za který poklesne optická hustota na polovinu své původní hodnoty (tl/2). Jako kontrola se ke 3,00 ml PBS pufru přidají 2,0 mikrolitry.přípravku U100 Humulin^(R) N (tj.

lidský inzulín NPH, který je také. znám jako lidský NPH inzulín) a optická hustota se sleduje při 320 nm podle výše uvedeného postupu. Poločas rozpouštění (tl/2) formulace Humulín™ N je asi 6 minut.'

Příklady provedení vynálezu

Příprava 1

Analog Gly(A21),Arg(H31),Arg(H32)-lidského inzulinu

Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-lidský inzulín se získá r

A z E. coli fermentaci, při ktere se molekula· prekurzOru

Gly(A21)-lidského proinzulinu přeexpřimuje do inkluzních tělísek; Část (94,7 g) inkluzních tělísek se solubilizuje v 500 ml 6M guanidinhydrochloridu obsahujících 0,1 M TRIS,

- 66 Φ· Μ ΦΦ ΦΦ φφ φφ • ••Φ φφφφ φφ«· • · ΦΦ Φ Φ Φ · Φ · φ · φ ΦΦ ΦΦΦ φφφφφφ φ · φ ···· ·· Φ ΦΦΦΦ ·· ·· ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ

0,27 Μ sulfitu sodného a 0,1 Μ tetrathionatu sodného, pH

10,5, při .teplotě místnosti. Hodnota pH se rychle sníží na.

8,8 pomocí 12N HC1. Po 45 minutách silného míchání v otevřené nádobě se hodnota pH sníží na 2,1 pomocí kyseliny fosforečné a vzorek se odstřeďuje přes noc při 4 °C.

Supernatant se slije a skladuje při 4 °C. pro další zpracování. Peleta se re.extrahuje pomocí 200 ml dalšího roztoku o pH 10,5 (viz výše) a potom se 3 hodiny odstřeďuje při 4 °C. Tento a dříve získaný supernatant se každý naředí 4x pomocí 100 mM fosforečnanu sodného, pH 4, přičemž se sráží produkt a jiné kyselé složky. Poté, co se sraženině nechá usadit, se většina supernatantu dekantuje a odloží. Výsledná suspenze se odstředí, poté se další supernatant slije a odloží, přičemž zbydou pelety surového S-sulf oná.tového prekurzoru Gly(A21)-lidského proinzulinu.

Pelety se solubilizují v 1,5 litru 7M deionižované. močoviny, hodnota pH se upraví na 8 pomocí 5N NaOH a několik hodin se míchá při 4°C. Potom se přidá sůl (NaCl), aby se dosáhlo 1M koncentrace a vzorek se vloží na sloupec.

XAD-7 (14 cm x 20 cm, Toso-Haas, Montgomeryville, PA), který se předtím promyje směsí 50 % acetonitrilu/50 % 50mM hydrogenuhíičitanu amonného, 10’ % acetonitrilu/90 % 50mM hydrogenuhlíčítanu amonného a konečně, směsí 7M deionizovaná močovina/lM NaCl/20mM TRIS, pH 8. Jakmile se vzorek vloží na sloupec, načerpá se do něj 4,5 litrů směsi 7M deionizovaná močovina/ΙΜ NaCl/20mM TRIS, hodnota pH roztoku 8, následuje 2,8 litrů směsi 50mM hydrogenuhíičitanu amonného/lM NaCl a 6,5 litru 50mM roztoku hydrogenuhíičitanu amonného. Sloupec se eluujelineárním gradientem acetonitrilu v 50mM roztoku * hydrogenuhíičitanu amonného, přičémž eluant se sleduje UV při 280 nm. Pík, o nějž jde, částečně vyčištěný

S-sulfonátový prekurzor Gly(A21)-lidského proinzulinu, se • · · · • · · • « ·« • ·

- 67 ·· ·· • · · · • · · · • · · · • · · · shromáždí, lyofilizuje a podrobí se proceduře vkládání /dí sulf idová vazba podle následujícího postupu. Množství (5,4 g) prekursoru se rozpustí ve 3 litrech 20mM roztoku glycin, pH 10,5, při teplotě 4 °C.· Potom se za míchání přidá 15 ml 240mM roztoku hydrochloridu cysteinu, přičemž hodnota pH se udržuje na 10,5 a teplota při 4 °C. Reakční roztok se 27 hodin mírně míchá při 4 °C a potom se uhasí snížením pH na 3,1 pomocí kyseliny fosforečné. Přidá se acetonitril (155 ml) a roztok se potom vloží na sloupec 5 x 25 cm Č4 s obrácenou fází, do nějž bylo předtím . načerpána směs 60 % acetonitrilu/40. % vody/0,1 % TFA, a který byl vyvážen směsí 10 % acetonitrilu/90 % vody/0,1 % TFA. Jakmile se sloupec naplní,.načerpá se do něj 1 litr směsi 17,5 % acetonitrilu/82,5 % vody/0,1 % TFA, potom se eluuje lineárním gradientem acetonitrilu v 0,1 % TFA, přičemž se sleduje při 280 nm. Zvolené frakce se shromáždí a lyofylizují, s výtěžkem 714 mg. Ke konverzí prekurzoru proinzulinu na požadovaný analog inzulinu, se rozpustí 697 mg prekurzoru Gly(A21)-lidského proinzulinu v 70 ml 50mM roztoku hydrogenuhličitanu amonného, potom.se ochladí na 4 °G, pH 8,3. K roztoku vzorku, který se mírně míchá při 4 °C asi 24 hodin, se přidá 0,14 ml roztoku prasečího trypsinu (Sigmá Chemical Company, St. Louis, Mo) o koncentraci 1 mg/ml .v 0,01Ň HCI. K reakčnímu roztoku se přidá dalších 0,14 ml roztoku trypsinu, reakční směs se potom míchá 21 hodin a 45 minut. Reakce se uhasí snížením hodnoty pH na 3,2 pomocí 0,7.ml ledové kyseliny octové a 0,3 ml kyselLny fosforečné. Uhašený vzorek roztoku

Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-lidského inzulinu z reakce štěpení trypsinem se 4x naředí směsí 30 % acetonitrilu/70 % 50mM kyseliny octové, pH 3,1 a vloží se na sloupec kationtového iontoměniče 1 x 30 cm S HyperD F (Biosepra_r Marlborough, MA), do nějž bylo předtím načerpána směs 30 %

9 . 99 . 9 9 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 · · · · · 9 · • 9 9 9 .9 9 · ··· 9 · 9 9.9 £O · · · 9 9 9 9 9 9 9 9 “ vJO 99 99 99 9 9 9 9 99 acetonitrilu/70 % 50mM kyseliny octové/500 mM NaCl, pH

3,3, a který byl vyvážen směsí 30 % acetonitrilu/70 % 50mM kyseliny octové. Jakmile je naplněn, načerpá se na.sloupec asi 50 ml směsi 30 % 'acetonitrilu/70'% 50mM kyseliny octové,' potom se eluuje lineárním gradientem NaCl ve směsi 30 % acetonitrilu/70 % 50mM kyseliny octové,, přičemž se eluant sleduje při 27.6 nm. Zvolené frakce obsahující Gly(A21),Arg(Bl),Arg(B32)-lidský inzulín se shromáždí, naředí 3x pomocí čištěné vody a vloží na sloupec s obrácenou fází, 2,2 x 25 cm C4 (Vydac, Hesperia, CA), do. nějž byla předtíh-načerpána směs 60 % acetonitrilu/40 % ·.

vody/0,1 % TÉA, potom směs 10 % acetonitrilu/90 % vody/0,1 <

% TFA. Jakmile se. sloupec naplní, načerpá se do něj 200 ml směsi 10 % acetonitrilu/90 % vody/0,1 % TFA, potom se i

eluuje lineárním gradientem acetonitrilu v 0,1% TFA.

Zvolené frakce se shromáždí a lyofylizují při výtěžku 101 mg. Pomocí analytické HPLC se zjistí čistota větší než 95 % hlavního píku. Elektropostřikovací hmotnostní spektroskopickou (ESMS) analýzou čištěného proteinu se zjistila molekulová hmotnost 6062,9 (6063,0, teoreticky).

Příprava 2

Sř

Des(B30)-lidský inzulín

Des(B30)-lidský inzulín se připraví z lidského proinzulinu řízenou hydrolýzou trypsinem. Hmota (2 g) ' lidského proinzulinu biosyntetizovaného v rekombinantní E. coli a vyčištěného konvenčními postupy [Frank, Β.. H., a kol., v PEPTIDES: Synthesis-Structure-Fun.ction.

Přoceedings of thé Seventh. Ameřican Peptide Symposium,

Rich,. D.H. a Gross, E. (redaktoři), Pierce Chemical

• · · · · • · · · · • »····· • · · · ·· «· ·* • ♦ · 4 • · ·· ·* * · • · · · ·· ··

Company, Rockford 729 - 738, 1981, také, Frank, B.H., US patent č. 4 430 .266, vydaný. 7. února 198.4, každá z nich je zde zahrnuta formou odkazu] se rozpustí ve 400 ml O,1M, pH

7‘, 5, pufru HEPES. Po přidání 8 ml 1M CaCl₂. (ve vodě) a úpravě pH na 7,5 pomocí 5N NaOH, se do roztoku vzorku za mírného míchání přenesou 2 ml roztoku prasečího trypsinu (Sigma) v 0,01N HG1.o koncentraci 10 mg/ml. Reakční roztok se nechá míchat při teplotě místnosti 2 hodiny a 42 minut, po kteréžto době se přenese do prostředí o teplotě 37 °C za občasného míchání. Po 1 hodině a 45 minutách při 37 °C se enzymatická reakce uhasí snížením pH na 3,0 pomocí kyseliny fosforečně a,teplota se upraví na 4 °C pro skladování. Následně se roztok ohřeje na teplotu místnosti a naředí se 50 ml acetonitrilu, potom na konečný objem 500 ml čištěnou vodou, potom se vloží na sloupec 2,5 x 58 cm, CG-161 (Toso-Háas), do nějž se předtím načerpá 1 objem sloupce (c.v.) směsi 40 % acetonitrilu/60 % 0,lM síranu amonného, pH.2,5, a 2 objemy sloupce směsi 10 % acetonitrilu/90 % 0,lM-síranu amonného, pH 2,5. Jakmile se naplní, sloupec se načerpá 1 objemem sloupce směsi 10 % acetonitrilu/'90 % 0,lM síranu amonného, pH 2,5. Sloupec se eluuje lineárním gradientem acetonitrilu v 0,lM roztoku síranu amonného, pH 2,5, přičemž eluant se sleduje při 276 nm. Pík, o nějž.jde, částečně vyčištěný des(B30)-lidský inzulín, se shromáždí zachycením zvolených frakcí. Tento shromážděný vzorek částečně vyčištěného des(B30)-lidského inzulín se naředí na.1,28 litru čištěnou vodou, pH 3,5, a aplikuje se do.sloupce kationtového iontoměniče 1 x 29 cm S Hyper.D F (Biosepra), do nějž bylo předtím načerpán 1 objem sloupce srftěsi 30 % acetonitrilu/70 % 0,1% TFA/0,5 E NaCl, pH 1,9 a 2 objemy sloupce směsi 30 .% acetonitrilu/7 0 % 0,1% TFA, pH 2,3. Jakmile se naplní, načerpá se do ' sloupce 1 objem sloupce směsi 30 % acetonitrilu/70 % 0,1%

- 70 «· ·· ·· 4« 4· ·· « · · · · · ·· · 4 · ♦ » * β 44 4 4 4 4 9 · 4 · • 4 4 4 4 4 4 ··» 4 4 «* 4

4 4 4 4-4 · 4 4 < 4 ·« · · 4 4 4 « 44

TFA, pH 2,3, potom se eluuje lineárním gradientem NaCl ve směsi 30 % acetonitrilu/70 % 0,1% TFA, pH 1,9 až 2,3, přičemž eluant se sleduje při 276 nm. Zvolené frakce obsahující vyčištěný des(B30)-lidský inzulin se shromáždí, naředí 2,5X čištěnou vodou a vloží do 35-ó.c. C8 SepPak (Wa.ters, Milford, ΜΑ) , který byl předtím vyčištěn 2 objemy sloupce acetonitrilu, 2 objemy sloupce směsi 60 % aceto-. nitrilu/40 % 0,1% TFA a 2 c.v. směsí 10% acetonitrilu/90. .% 0,1% TFA. Jakmile se naplní, promyje se SepPak 3 objemy sloupce směsi 10 % acetonitrilu/90 % 0,1% TFA a potom se eluuje 2 objemy sloupce směsi 60 % acetonitrilu/40 % 0,1% TFA. Lyofylizovaný eluant poskytne výtěžek 500 mg. Analytické HPL,C stanovení naznačilo větší než 95% hlavní pík. Elektropostřiokovací hmotnostní spektroskopická (ESMS) analýza vyčištěného proteinu poskytla molekulární hmotnost 5706,5 (5707, teorie).

Příprava 3

Králičí inzulin

Králičí inzulin se připraví podle postupu, který popsal Chance, R. E., a koi., [Proinsulin, .Insulin, C-Peptide, Baba, Š., a kol. (redaktoři), Excerpta Medica, Amsterdam-Óxford, str. 99 až 105 (1979)].

Příprava 4

Analog.. Asp (B28)-lidského inzulinu

Analog Asp(B28)-lidského inzulinu se připraví. a vyčistí v podstatě podle návodů z příkladů 31 a 32 z Chance, R. E., a kol. (US patent č. 5 700 662, vydaný 23.

* · ·· · to toto to to »· · toto·· · · · · I to · · ·> toto ··.· to ····· ·· >

toto·· « « to to to to ú • · toto • · ·· prosince 1997), který je zde výslovně zahrnut formou odkazu. Des(B23-30)-lidský inzulín [Bromer, W. W. a Chance, R. E., Biochim. Biophys. Acta, 133, 219-223 (1967), který je zde zahrnút formou odkazu] a syntetický oktapeptid Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys (Tfa.)-Thr se kondenzují za použití semisyntézy asistované trypsinem, vyčistí se gelovou filtrací a HPL.C s obrácenou fází, na 4 hodiny se· při teplotě místnosti vystaví působení 15% hydroxidu amonného (objem/objem) ,. aby se odstranila trifluoracetátová (Tfa) blokující skupina· z Lys(B29), vyčistí.se HPLC s obrácenou fází a lyofylizuje se.

Příprava 5

Syntézy derivovaných proteinů

Následující text je náčrtkem syntéz jistých derivovaných proteinů k přípravě sraženin a krystalů podle předloženého vynálezu. Náčrtek nechť, je čten spolu s daty v tabulce 2 uvedené níže. ’. . í

Odměřené množství, vyčištěného, inzudinu nebo analogu inzulínu se za míchání rozpustí v odměřeném objemu dimethylsulfoxidu (DMSO). Potom·se přidá odměřený objem tetramethylguanidinhydrochloridu (TMG) a. roztok -se důkladně míchá. V oddělené nádobě se v odměřeném objemu DMSO rozpustí odměřené množství N-acyl-sukcinimidu (NAS) .

Odměřený objem druhého roztoku se přidá k prvnímu roztoku.

Reakce se provádí při teplotě místnosti a postup reakce se sleduje, analýzou vzorků reakční směsi za použití HPLC.

Reakce se uhasí přidáním odměřeného objemu ethanolaminu a následným okyselením na pH 2 až 3.

•toto

- 72 «· • Β· · • · · 6 ·

Reakční směs se potom vystaví čištění za použití samotné chromatografie s Obrácenou fází nebo za použití kombinace chromatografie na kationtoměniči, po níž následuje chromatografie s obrácenou fází. Čištění obrácenou fází se provádí za použití systému FPLC^(Ri (Pharmacia) s UV detekcí při 214 nm nebo při 280 nm, frakčního kolektoru, sloupce 2,2 x 25 cm nebo 5 x 30 cm C.18, průtoku 2,5 nebo 5 ml/min, při teplotě místnosti. Kapalné fáze jsou směsmi roztoku A (0,1% kyselinatrifluoroctová (TFA) ve směsi 10:90 acetonitril:voda (objem:objem)) a roztoku B (0,1% kyselina trifluoroctová (TFA)-ve směsi 70:30 acetonitril:voda (objem:objem)) příhodné pro eluci a oddělení druhů, o než je zájem.

Typicky se sloupeč vyváží á naplní, když je v něm 100 % roztoku A. Potom se použije lineární gradient určité části roztoku B, aby ,se odpovídajícím způsobem oddělily reakční produkty. Frakce obsahující produkt se shromáždí. Vytvoření čistícího postupu spadá do znalostí oboru.

Tabulka 2 uvedená níže poskytuje experimentální data, podle, náčrtu uvedeného výše, pro syntézu derivovaných, proteinů, které se použití pro přípravu různých ztělesnění předloženého vynálezu. Výchozí proteiny se připraví podle popisu uvedeného výše nebo podle konvenčních postupů. Konvenční čištění se použije k získání vysoce čištěných.výchozích proteinů pro syntézy popsané níže. Syntéza inzulínu, analogů inzulinu a proinzulinu spadá do znalostí oboru a dá se uskutečnint rekombinantní. .expresí, semisyntézou nebo syntézou na tuhé fázi následovanou spojováním řetězců. Vyčištění syntetizovaných proteinů na čistotu odpovídající přípravě derivátů použitých v předloženém vynálezu se provádí konvenčními čisticími postupy.

*

- 73 ·· *· to· • * · * · · · * · · · ř · · · «

Molekulová hmotnost čištěných derivátů se potvrdí hmotnostní spektrometrií prostřednictvím elektropostřikovací hmotnostní analýzy (ESMS). Označení . místa acylace je založeno buď na chromatografické analýze (HPLC) nebo- na analýze N-konce (N-terminální). nebo na obou..

Tabulka 2

Souhrn syntézy různých derivovaných proteinů

Výchozí protein	lidský inzulin	lidský inzulin	lidský inzulin
množství proteinů (mg)	141,3	1080	120
DMSO (ml)	42	30	36
TMG (μΐ)	30,5	233	25,9
NAS acylový řetězec	n-hexanoyl	n-oktanoyl	n-dodekanoyl
množství NAS (mg)	7,76	85,7	9,22
objem DMSO (ml)	LO	1,0	0,701
přidaný objem roztoku
NAS (ml)	0,494	0,785	0,701
reakční doba (min)	40	105	40
množství ethanolaminu	20	100	120
celkový výtěžek (%)	40	33	36
mol.hmotnost (teor.)	5906,0	5933,9	5990,0
mol.hmotnost (ESMS)	5906,8	5933,9	5990,0
HPLC čistota (%)	96	94	98
místo acylace (HPLC)	N-eta	N-eta	N-eta
místo acylace (N-konec)	N-eta	N-eta	N-eta
Výchozí protein	lidský inzulin	lidský inzulin	lidský inzulin
množství proteinů (mg)	194	2040	2050
DMSO (ml)	60	62	58
TMG(pl)	41,9	441	443
acylový řetězec NAS	n-tetradekanoyl	n-butyryl	n-hexanoyl
množství NAS (mg)	23,4	269,3	209
objem DSMS (ml)	1,0	1,0	2,0
přidaný objem roztoku	0,756	0,29	1,44

Tabulk*a 2 - pokračování «

NAS (ml) reakční doba (min)	20	30	30
množství ethanolaminu	5	100	100
celkový výtěžek (%)	45	27*	22
mol.hmotnost (teor.)	6018,1	5877,8	5905,9
mol.hmotnost (ESMS)	6018,2	5877,8	5906,0
HPLC čistota (%)	98	94	93
místo acylace (HPLC)	N-eta	N-eta	N-eta
místo acylace (N-konec)	N-eta	-	-

* Čištění zahrnuje napřed HPLC s obrácenou fází, potom HPLC na kationtoměniči a potom HPLC s obrácenou fází

Následuje náčrt syntézy dalších derivovaných proteinů. Náčrt nechť je čten spolu s daty v tabulce 3 uvedené níže, aby se získala úplná syntetická schémata.

Odměřené množství vyčištěného inzulinu nebo analogu inzulinu se rozpustí tím, že se k němu přidá odměřený objem 50mM kyseliny borité, pH 2,57. Potom se pomalu· za míchání přidá odměřený objem acetonitrilu, který je roven objemu roztoku kyseliny borité. Objem rozpouštědla je součtem objemů kyseliny borité a acetonitrilu. Hodnota pH roztoku se upraví na hodnotu mezi 10,2 a 10,5 použitím NaOH. V oddělené nádobě se rozpustí odměřené množství N-acylsukcinimídu (NAS) v odměřeném objemu DMSO. Odměřený objem druhého roztoku se přidá k prvnímu roztoku. Reakce se. provádí při teplotě místnosti, hodnota pH se udržuje nad 10,2 jak je nezbytné a postup reakce se sleduje analýzou vzorků reakční směsi pomocí ř

•w

- 75 HPLC. Reakce se uhasí okyselením na pH 2 až 3. Reakční směs se potom podrobí čištění za použití.systému chromatografie s obrácenou fází, jak je popsáno výšeř,

Tabulka 3 poskytuje podle náčrtu uvedeného výše experimentální data pro. syntézu derivovaných proteinů, které se použijí pro přípravu různých ztělesnění předloženého vynálezu. Molekulová hmotnost čištěných derivátů se potvrdí hmotnostní spektrometrií prostřednictvím elektropostřikovací hmotnostní analýzy (ESMS). Označení místa acylace je založeno buď na chromatografické analýze (HPLC) nebo na analýze.N-konce (N-terminální) nebo na obou.

Tabulka 3

Souhrn syntézy různých derivovaných proteinů

Výchozí protein	lidský inzulín	lidský inzulín	lidský inzulín
množství proteinů	2170	2420	2250
rozpouštědlo (ml)	200	240	200
acylový řetězec NAS	n-butyryl	n-pentanoyl	n-oktanoyl
množství N-acyl-
sukcinimidu (mg)	108,7	1155	173
objem DMSO (ml)	1,0	5	1,0
přidaný objem roztoku
NAS (ml)	0,955	0,719	0,81
reakční doba (min)	40	40	40
celkový výtěžek (%)	: 25	12 j	37
mol. hmotnost (teor.)	5877,8	5891,8	5933,9
mol. hmotnost (ms)	5877,7	5891,9	5933,8
HPLC čistota (%)	96	95	96
místo acylace (HPLC)	N-eta	N-eta	N-eta

► «4 4 • 4 4«

Tabulka 3 - pokračování

Výchozí protein	lidský inzulin	lidský inzulin	lidský inzulin
množství proteinů	1960	2750	1040
rozpouštědlo (ml)	200	200	200
acylový řetězec NAS	n-nonanoyl	n-dodekanoyl	n-tetradekanoyl
množství N-acyl-
sukcinimidu (mg)	145,8	19,9	102,3
objem DMSO (ml)	1,0	1,0	1,0
přidaný objem roztoku
NAS (ml)	0,887	0,771	0,885
reakční doba (min)	40	30	35
celkový výtěžek (%)	35	14	39
mol. hmotnost (teor.)	5947,9	5990,0	6018,0
mol. hmotnost (ms)	5948	5989,9	6018,1
HPLC čistota (%)	94	93	94
místo acylace (HPLC)	N-eta	N-eta	N-eta

Výchozí protein	ovčí inzulin	hovězí inzulin	vepřový inzulín
množství proteinů	312	275	200
rozpouštědlo (ml)	100	100	100
acylový řetězec NAS	n-hexanoyl	n-hexanoyl	n-oktanoyl
množství N-acyl-
sukcinimidu (mg)	27,2	19,9	16,4
Objem DMSO (ml)	1,0	1,0	1,0
přidaný objem roztoku
NAS (ml)	0,644	0,771	0,764
reakční doba (min)	45	30	82
celkový výtěžek (%)	31	50	41
mol. hmotnost (teor.)	5801,7	5831,8	5903,9
mol. hmotnost (ms)	5801,8	5831,7	5903,9
HPLC čistota (%)	96	96	96
místo acylace (HPLC)	N-eta	N-eta	N-eta

• · · · ft · ft ftft ft ' · ft · · · ft

Výchozí protein	králičí inzulin	des (B30)-lidský inzulin	AspB28-lidský inzulin
množství proteinů (mg)	211,4	205,3	132,3
rozpouštědlo (ml)	100	20	20
acylový řetězec NAS	n-oktanoyl	n-oktanoyl	n-oktanoyl
množství N-acyl-
sukcinimidu (mg)	16,8	21,5	11,5
objem DMSO (ml)	1,0	0,5	L0
přidaný objem roztoku
NAS (ml)	0,786	0,303	0,715
reakční doba (min) ,	57	40	85
celkový výtěžek (%)	39	47	32
mol.hmotnost (teor.)	5919,9	5833,6	5951,9
mol.hmotnost (ms)	5920,0	5832,7	5 952,2
HPLC čistota (%)	95	96	94
místo acylace (HPLC)	N-eta	N-eta t	N-eta 1

Výchozí protein .	analog	lidský inzulin	analog
GlyA21,ArgB31,		des(B27)-lidského
ArgB32-lidského		inzulinu
množstm proteinů (mg)	inzulinu 86,2	134,8	44,8
rozpouštědlo (ml)	10	20	7
acylový řetězec NAS	n-oktanoyl	2-methylhexanoyl	n-oktanoyl
množství N-acyl- sukcinimidu (mg)	22,4 .	749	3,6
objem DMSO (ml)	0,5	4,93*	1,0
přidaný objem roztoku NAS (ml)	0,115	0,052	0,993

.« · • tt « *

- 78 V tt tttt • tt tt · tttt · · tt tt • tttt · • tttt « tttt tttt

Tabuka 3 - pokračování

reakční doba (min)	40	45	40
celkový výtěžek (%)	45	45	53 mol
hmotnost (teor.)	6189,2	5919,9	5832,8
mol. hmotnost (ms)	6189,2	5919,9	5832,9
HPLC čistota (%)	97	96	93
místo acylace (HPLC)	N-eta.	N-eta	N-eta

* Rozpuštěno v acetonitrilu místo, v DMSO.

Výchozí protein	lidský inzulín	lidský inzulín	lidský inzulín
množství proteinů (mg)	160	147,7	2080
rozpouštědlo (ml)	20	20	200
acylový řetězec NAS	4-methyloktanoyl	3-methyloktanoyl	n-oktanoyl
množství N-acyl-
sukcinimidu (mg)	715	22,5	146,7
objem DMSO (ml)	4,79*	1,0*	1,0*
přidaný objem roztoku
NAS (ml)	0,0734	0,609	0,884
reakční doba (min)	60	45	40
celkový výtěžek (%)	54	38	5,3**
mol.hmotnost (teor.)	5947,9	5976,0	6060,1
mol.hmotnost (ms)***	5947,8	5976,2	. 6060,5
HPLC čistota (%)	96'	96	92
místo acylace (HPLC)	N-eta	N-eta	Al-N-alfařN-eta

* Rozpuštěno v· acetonitrilu místo v DMSO.

★★ Výtěžek derivátu Al-N-alfa,B29-N-eta-diacyl-lidského inzulinu.

**★ Stanoveno hmotnostní spektroskopií Matrix-Assisted

Laser Desorption Ionization (MALDL) místo elektropostřikovací hmotnostní spektroskopií • to to to to · to ··· toto • «· · « · · < ··'· · · «· «« «· toto to· toto ·· to··· · · ···· ···»· «· · ·, ···« toto toto «·

Tabulka 3 -pokračování

Výchozí protein	analog	lidský inzulín	lidský inzulín
des(B30)-lidského
inzulínu
množství proteinů (mg)	205,3	1960	2110
rozpouštědlo (ml)	20	200	200
acylový řetězec NAS	n-oktanoyl	n-nonanoyl	n-dodekanoyl
množství N-acyl-
sukcinimidu (mg)	21,5	154,8	150,5
objem DMSO (ml)	1,0	1,0	1,0
přidaný objem roztoku
NAS (ml)	0,089	0,0887	0,975
reakční doba (min)	40	40	60
celkový výtěžek (%)	11,0	' 11,5	11,1
mol. hmotnost (teor.)	5959,5	6088,2	6116,2
mol. hmotnost (ms)	5959,3	6088,3	6116,4
HPLC čistota (%)	96	92	92
místo acylace (HPLC)	Al-N-alfa,N-eta	Al-N-alfazN-eta	Al-N-alfařN-eta

* Rozpuštěno v acetonitrilu místo v DMSO.

** Výtěžek derivátu ΑΙ-N-alfa-, B29-N-eta-diacyl-lidského inzulínu.

Příprava 6

Mikrokrystaly B29-N-eta-oktanoyl-LysB29-lidského inzulínu

- 80 • 4)

• * * · • · · · • · · · · • · * ·· ·· * * · · • · · · » · · · · • 4>· · · *« ··

Suchý prášek B29-N-eta-oktanoyl-LysB29-lidského inzulínu (7 dílů hmotnostních) se rozpustí v 1 000 dílech objemových vodného rozpouštědla složeného z 25 mM TRIS, . 0,1 M citrátu sodného a 10 mg/ml fenolu při pH. 7,6. K tomuto roztoku se přidá Γ50 dílů 15,3mM .roztoku chloridu zinečnatého. Hodnota pH se upraví na 7,6 pomocí IN kyseliny chlorovodíkové a/nebo IN roztoku hydroxidu . sodného. Potom se přidá 120 dílů .objemových ethanolu.

Tento roztok s zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů.0,22 pm. Připraví se druhý roztok rozpuštěním 6 dílů hmotnostních protaminsulfátu v 10 000 dílech objemových vody, potom se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 pm.'Stejné objemy roztoku acylovaného inzulinu a roztoku protaminsulfátu se spojí. Vytvoří se amorfní sraženina. Suspenze se 24 hodin pomalu míchá při teplotě místnosti (typicky okolo 22 °C) . Amorfní sraženina se. přemění na mikrokrystalickou tuhou látku.

Příprava 7

Formulace mikrokrystalů B29-N-eta-oktanoyl-LysB29-lidského inzulinu

Mikrokrystaly připravené postupem z přípravy 6 se oddělí z matečné kapaliny'a znovu se získají konvenčními oddělovacími postupy tuhá látka/kapalina., jako je filtrace, odstřeďování nebo dekantace. Znovu získané mikrokrystaly se potom suspendují v roztoku sestávajícím, z 25 mM TRIS, 5 mg/ml fenol, a 16 mg/ml glycerol, pH 7,4, tak‘aby konečná koncentrace acylovaného inzulinu odpovídala, ekvivalentu 100· j/ml roztoku inzulinu.

« 9

- 81 ·· «· • 9 9 9

9 99

9 9 9

9 9 9

9 9 9 • 9 99

9 · 9 9

9 9 9 9 · 99999

9 9 9

9 9

9 9

9 9

9 9

Příprava 8

Mikrokrystaly B29-N-eta-hexanoyl-LysB29-lidského inzulinu

Suchý prášek B29-N-eta-hexanoyl-LysB29-lidského inzulinu (7 dílů hmotnostních) se rozpustí v 1 000 dílech objemových vodného rozpouštědla složeného z 25 mM TRIS,

0,1 M citrátu sodného, 10 mg/ml fenolu a 16 mg/ml glycerolu při hodnotě pH 7,. 6. K tomuto roztoku se přidá 150 dílů 15,3mM .roztoku chloridu zinečnatého. Hodnota pH se upraví na 7,6 pomocí IN kyseliny chlorovodíkové a/nebo IN. roztoku'hydroxidu sodného. Potom se přidá 120 dílů objemových ethanolu. Tento roztok se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 pm. Druhý roztok se připraví rozpuštěním 6 dílů hmotnostních protaminsulfátu v 10 000 dílech objemových vody, potom se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů

0,22 pm. Stejné objemy roztoku acylovaného inzulínů a roztoku protaminsulfátú se spojí. Vytvoří se amorfní sraženina. Tato suspenze se pomalu míchá 24 hodin při teplotě místnosti (typicky okolo 22 °C) . Amorfní sraženina se přemění na a mikrokrystalickou tuhou látku.

Příprava 9

Formulace mikrokrystalů B29-N-eta-hexanoyl-LysB29-lidský inzulín '

Mikrokrystaly připravené postupem z přípravy 8 se oddělí z matečné kapaliny a znovu se získají konvenčními oddělovacími postupy tuhá látka/kapalina, jako je filtrace, odstřeďování nebo dekantace. Znovu získané mikrokrystaly se· potom suspendují v roztoku sestávajícím • ·· • to

- 82 • to • to • « ' ♦-··-· to «to · « ·· to toto to · · · · * · to • to · · ♦ · · · *· to · ze 2 mg/ml hydrogenfosforečnanu sodného, 1,6 mg/ml m-kresolu, 0,65 mg/ml fenolu a 16 mg/ml glycerolu, pH 6,8, ’ tak, aby konečná koncentrace acylovaného inzulínu odpovídala přibližně koncnetraci ekvivalentu .100 j/ml roztoku inzulínu.

Příprava 10

Mikrokrystaly B28-N-eta-oktaňoyl-LysB28,ProB29-lidský inzulin

Suchý prášek B28-N-eta-oktanoyl-LysB28,LysB28,ProB29-lidského inzulinu (7 dílů hmotnostních) se rozpustí v 1000 dílech objemových vodného* rozpouštědla složeného z 25 mM TRIS, 0,1 M citrátu sodného a 10 mg/ml fenolu při hodnotě pH 7,6. K tomuto roztoků se přidá 150 dílů 15,3 mM roztoku chloridu zinečnatého. Hodnota pH se upraví na 7,6 pomocí IN kyseliny chlorovodíkové a/nebo IN roztoku hydroxidu sodného. Potom se přidá 120 dílů objemových ethanolu. Tento roztok se zfiltruje přes filtr málo·vážící proteiny o průměru pórů 0,22'gm. Druhý roztok se připraví, rozpuštěním 6 dílů hmotnostních protaminsulfátu v 10 000 dílech objemových vody, potom se * zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů

0,22 gm. Stejné objemy roztoku acylovaného inzulinu a roztoku protaminsulfátu se spojí. Vytvoří se amorfní sraženina. Po 24 hodinách při teplotě místnosti (typicky okolo 22 °C), se amorfní sraženina přemění na mikrokrystalickou tuhou látku.

Příprava 11

Formulace mikrokrystalů B28-N-eta-oktanoyl-LysB28,ProB29- 83 ·♦ ·· ·· ·» «· ·· • · φ · · φ φ . φ · ♦ · · φ « ·· » · · · · · φ ♦ φ φφ φφφ φ ··· · » · φ φ « φ φ φ ·^υφ φ φφφφ φφ « · Φ· «φ φφ φφ lidského inzulinu

Mikrokrystaly připravené postupem z přípravy 10 . se z matečné kapaliny oddělí a znovu se získají konvenčními oddělovacími postupy tuhá látka/kapalina. Znovu získané mikrokrystaly. se potom suspendují v roztoku ♦

sestávajícím z 25 mM TRIS, 5 mg/ml fenolu, 0,1 M citrátu sodného a 16 mg/ml glycerolu, pH 7,6, tak, aby konečná koncentrace acylovaného inzulinu odpovídala přibližně koncentraci ekvivalentní 100 j/ml roztoku inzulinu.

Příprava 12

Mikrokrystaly B28-N-eta-butyryl-LysBz8,ProB29-lidského inzulinu . * Suchý prášek B29-N-eta-butyryl-LysB29 human inzulin (7 dílů hmotnostních) se rozpustí in 1000 dílech objemových vodného rozpouštědla složeného z 25 mM TRIS,

0,1 M citrátu sodného a 10 mg/ml fenolu při hodnotě'pH 7,6. K tomuto roztoku se přidá 150 dílů 15,3 mM' roztoku * chloridu zinečnatého. Hodnota· pH se upraví na 7,6 pomocí

IN kyseliny chlorovodíkové a/nebo IN roztoku hydroxidu sodného. Potom se přidá 120 dílů objemových ethanolu.

Tento roztok se zfiltruje přes. filtr málo· vážící proteiny . · o průměru pórů 0,22 pm. Druhý roztok se připraví rozpuštěním 6 dílů hmotnostních protaminsulfátu v 10 000 dílech objemových vody, potom se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 pm. Stejné objemy roztoku acylovaného inzulínu a roztoku protaminsulfátu se spojí. Vytvoří se amorfní sraženina. Po 24 hodinách při teplotě místnosti (typicky okolo 22 °C) se amorfní sraženina přemění na mikrokrystalickou tuhou látku.

4* 4» 44 99 44 • 4« · · 44 4 4 44 4 ··« 9 44 4 * 99 9

4 4 444 4 4 4 4 · 4 94 4

49 4 9 9 9 4 44 4

- 84 Příprava 13 .

Formulace mikrokrystalů B28-N-eta-butyryl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu

Mikrokrystaly připravené postupem z přípravy 7 se z matečné kapaliny oddělí a znovu se získájí'konvenčními oddělovacími postupy tuhá látka/kapalina. Znovu získané mikrokrystaly se potom suspendují v roztoku sestávajícím z 25 ínM TRIS, 2,5 mg/ml m-kresol a. 16 mg/ml glycerolu, pH 7,8, tak, abý konečná koncentrace acylovaného inzulínu odpovídala přibližně koncentraci ekvivalentní 100 j/ml roztoku inzulínu.

Příprava 14

Mikrokrystaly B29-N-eta-butyryl-lidského inzulinu

B29-N-eta-Butyryl-lidský inzulín se připraví podle popisu v přípravě 5. Vzorek B29-N-eta-butyryl-lidského inzulinu (16,21 mg) se rozpustí v.0,8 ml O,1N kyseliny chlorovodíkové. Po 5 až 10 minutách míchání se přidá objem (0,32 jnl) roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1 000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů, přičemž se výsledný roztok důkladně mísí mícháním. Potom, se přidá 3,2 ml krystalizačního ředidla a výsledná směs se míchá dokud se zcela nesmísí. Krystalizační ředidlo se připraví tak, že se za míchání ve vodě rozpustí 0,603 g TRIS, 1,007 g fenolu, 1,582 g glycerolu a 2,947 g citrátu sodného. Přidá se další voda, aby se objem roztoku zvětšil na 100 ml. Po smíchání' roztoku zinku a derivátu inzulinu s krystalizačním ředidlem se pH výsledného roztoku upraví • 4 ·4 ·♦ ·4 • · * 4 · · · · · 4 4 · · 44 4 4 4 4 « 4 · · _ _ 4 44 444 4 44444 44 4 « XS - 4 4 4 4 4 4 · 4 · · · v ·./ 4··· 4444 4 4 44

7.59 za použití malých alikvotů IN kyseliny chlorovodíkové a IN roztoku hydroxidu sodného, podle potřeby. Roztok s upraveným pH se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny s průměrem pórů 0,22 μη. K objemu zfiltrovaného roztoku se přidá stejný objem vodného roztoku protaminu, připraveného · rozpuštěním 18,59 'mg protaminsulfátu ve vodě na konečný objem 50 ml. Směsí obou objemů se jemně krouží, aby se míchání dokončilo a potom se nechá stát při 25 °C. Ve velmi velkém výtěžku (větší než 90 %) se vytvoří tyčinkovité krystaly. Při spektrofotomeťrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B29-N-eta-butyryl-lidského inzulinu tl/2 32 až 33 minut, ve srovnání s asi minutami pro Humulin^(R> N při stejném stanovení.

Příprava 15

Mikrokrystaly B29-N-eta-pentanoyl-lidského inzulinu

B29-N-eta-Pentanoyl-lidský inzulín se připraví, podle popisu v přípravě 5. Vzorek B29-N-eta-pentanoyllidského inzulinu (16,14 mg)‘se rozpustí v 0,8 ml O,1N kyseliny chlorovodíkové. Sleduje se postup popsaný v přípravě 14 s tím rozdílem, že hodnota pH se upraví na

7.60 a roztok protaminu obsahuje 18,64 mg protaminsulfátu v celkovém objemu.50 ml. Ve velkém výtěžku (větší než 80

%) se vytvoří tyčinkovité krystaly. Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B29-N-eta-pentanoyl-lidského inzulinu tl/2 až 34 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pro Humulin^(R)

N ve stejném stanovení.

Příprava 16

- 86 » ·· • · 4 t ·· ·· ·· » ·₍ • · · ► · · 4 ) · · <

» · · 4 » · · 4 ·· ··

Mikrokrystaly B29-N-eta-hexanoyl-lídskěho inzulinu » B29-N-eta-Hexanoyl-lidský inzulinu se připraví podle popisu v přípravě 5. Vzorek B29-N-eta-hexanoyllidského inzulínu (15,87 mg) se rozpustí v 0,8 ml O,1N kyseliny chlorovodíkové. Sleduje se postup popsaný v přípravě 14 s tím rozdílem, že hodnota pH se upraví na 7,58. Ve velmi velkém výtěžku (větší než 90 %) se vytvoří tyčinkovité krystaly. Při spektrofotometrickém stanovení, rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B29-N-eta-hexanoyl-lids'kého inzulinu tl/2 69 až 70 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pro Humulin^(RÍ N ve stejném štanovení.

Příprava 17

Mikrokrystaly B29-N-eta-(2-methylhexanoyl)-lidského inzulinu B29-N-e.ta- (2-Methylhexanoyl) -lidský inzulin se připraví podle popisu v přípravě 5. Vzorek B29-N-eta-(2-methylhexanoyl)-lidského inzulinu (8,19 mg) se rozpustí v .0,400 ml 0,1’n kyseliny chlorovodíkové. Po 5 až 10 minutách míchání se přidá 0,160 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů, přičemž se výsledný roztok důkladně mísí mícháním. Potom se se přidá ředidlo (ve 100 ml 0,604 g TRIS, 1,003 g fenolu, 3,218 g glycerolu a 3,069 g citrátu sodného) a mísí se; Hodnota pH tohoto roztoku se upráví 7,61 za., použití malých množství l,0N kyseliny chlorovodíkové a l,0N roztoku hydroxidu sodného a potom se roztok s upraveným pH zfiltruje přes' filtr málo vážící proteiny s průměrem pórů 0,22 pm..Ke 2 ml tohoto zfíltrovaného roztoku ·' · ·

- 87 - ϊ t ·· φφφφ φφφφ • · φφφ φ φφφ φ φ φ φ φ φφφ φφ φ φφφφ φφ φ'φ φφ φφ φφ se‘přidají 2 ml roztoku protaminu (ve 100 ml 37,41 g protaminu). Směsí se jemně krouží. Vytvoří se sraženina. V dobrém výtěžku (větší než 65%) se vytvoří tyčinkovité krystaly. Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B29-N-eta-butyryl-. -lidského inzulinu tl/2 23 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pro Humulin^(R) N ve stejném stanovení.

Příprava 18

Mikrokrystaly B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu

B29-N-eta-oktanoyl-LysB29-lidský inzulín (4,17 mg) se rozpustí v 1 ml rozpouštědla složeného z 25 mM TRIS, 0,lM citrátu sodného a 10 mg/ml fenolu při hodnotě pH 7,6. K tomuto roztoku se přidá 0,15 ml 15,3mM roztoku chloridu zinečnatéhp. Hodnota pH výsledného roztoku se upraví na 7,6 pomocí IN roztoku hydroxidu sodného. K tomuto roztoku se přidá 0,12 ml ethanolu. Výsledný roztok se zfiltruje. přes filtr málo vážící proteiny s průměrem pórů 0,22 gm. Druhý roztok se připraví rozpuštěním 3,23 mg protaminsulfátu v 10 ml vody, potom se zfiltruje přes ^; filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 μιη. Spojí se objemy 1 ml roztoku B29ⁱ-N-eta-oktanoyl-LysB29~lidského inzulínu μ 1 ml roztoku protamin sulfátu, což vede k okamžitému vzniku amorfní sraženiny. Tento roztok se rozdělí na dvě lml části, které se přenesou do skleniček, kterými· se '19 hodin při teplotě místnosti (přibližně 22 °G) mírně třepe za použití automatické třepačky. Tento postup vede k,tvorbě bílé až bělavé mikrokrystalické tuhé látky. HPLC analýza krystalů, které se vyjmou z matečné kapaliny a důkladně promyjí, ukázala přítomnost protaminu uvnitř krystalického materiálu.

• ft

- 88 • ft ftft ftft ftft ftft • ftft ft · ftft · · ftft·· ft··· · • · · ftftft · ··♦ ftft ftft · • ftftft ftft · ···· ftft ftft ftft ftft ftft ··

Příprava 19

Krystalické suspenzní formulace obsahující N-eta-oktanoyllidský inzulin

Kyselý roztok N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu se připraví rozpuštěním 39,7 mg N-eta-oktano.yl-lidského inzulinu v 1 ml 0,IN kyseliny chlorovodíkové. Tento roztok se míchá přibližně 5 minut. K tomuto roztoku se za míchání přidá 0., 4 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zihečnatých iontů. Roztok dusičnanu zinečnatého je ředěním 1:10 atomického absorpčního standardu 10 000 ppm Zn(II). K roztoku N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu plus zinek se přidají 4 ml krystalizačního ředidla (40 mg/ml- glyoerolu, 50 mM TRIS, 4 mg/ml m-kresolu, 1,625 mg/ml fenolu, 100 mM citrátu sodného, pH 7,4). Hodnota-pH výsledného roztoku se upraví na 7,61. Roztok s upraveným pH se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny s průměrem pórů 0,22 μπι.· Přidá se 5 mililitrů (5 ml) roztoku protaminu (37,6 mg protamin— sulfátu v 50 ml vody) k 5 ml zfiltřováného roztoku N-eta-oktanoyl-lidskéhó inzulinu. Roztok se nechá nerušeně -stát 63 hodin při kontrolované teplotě 25 °C. *

Mikroskopickou inspekcí (za 63 hodin) se zjistí^f, že došlo ke krystalizaci a že přípravek získal rovnoměrné, samostatné, tyčinkovité krystaly, které mají přibližnou průměrnou délku asi 10 μη.

Krystaly se sedimehtují tak, že se formulace nechá nerušeně stát. 8 mililitrů (8 ml) supernatantu se potom odstraní a nahradí se 8 ml ředidla (16 mg/ml • tt

I tttt « » · tttt » · · « » tttt « • tt tttt • tt tttt tttt tttt • · » · · · · · • •tttt tttttttt tttt · tttt··· tttt · • · · tttttttt • tt tttt tttt tttt glycerolu, 20 mM TRIS, 1,6 mg/ml m-kresolu, 0,65 mg/ml fenolu, 40 mM citrátu sodného, pH 7,4). Krystaly'se potom resuspenduji. Tento postup se provádí stejným způsobem .

3-krát s tím rozdílem, že při 3. příležitosti se 8 ml supernatantu nahradí 7 ml ředidla.

Množství inzulínů ve formulaci se analyzuje pomocí HPLC, aby se. kvantifikovala celková síla. Celková síla odkazuje na celkovou koncentraci lidského inzulinu a. N-eta-hexanoyl-lidského inzulinu. Alikvoty (0,050 ml) plně resuspendované formulace se- rozpusti v 0,950 ml Ο,ΟΙΝ kyseliny chlorovodíkové a podrobí se analýze HPLC.podle popisu uvedeného níže. Pro analýzy HPLC se použijí, následující podmínky: sloupec s obrácenou fází C8, konstantní teplota 23 °C, 1,0 ml/min, detekce při 214 nm, rozpouštědlo A = 10% acetonitril (objem/objem) v 0,1% vodné kyselině trifluoroctové, rozpouštědlo B = 90% acetonitril (objem/objem) v 0,1% vodné kyselině trifluoroctové, lineární gradienty (0,1 min 0 % B, 45,1 min 75 % B, -50,1 min ,100 % B, 55 min 100 % B, 57 min 0 %

B, 72 min, 0 % B). Standardy se připraví rozpuštěním dávky inzulinu a dávky acylovaného inzulinu v 0,01N kyselině chlorovodíkové. Koncentrace každého standardu se stanoví UV spektroskopií. Pro roztok 1,000 mg/ml lidského inzulinu v 1 cm kyvetě se uvažuje o absorbanci 1,05 jednotek optické hustoty při vlnové délce s maximem absorbance (přibližně 276 nm). To odpovídá molárnímu extinkčnímu koeficientu 6098. Pro acylované inzulíny se předpokládá, že mají stejný molární extinkční koeficient jako lidský inzulín.

Roztoky kalibrované pomocí UV se potom naředí, aby se získaly standardy o koncentracích 0,220, 0,147, 0,073 a 0,022 mg/ml. Standardy se nechají projít HPLC a tím se získá standardní křivka plochy proti koncentraci.

··

- 90 « · « · · · • · ·· · · • · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99. 99 99

99 99

9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9

99999 99 9

9 9 9 9

99 99

Celková síla N-eta-oktanoyl-lidského inzulínu v krystalické formulaci je 3,76 mg/ml. Koncentrace rozpustného N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu se stanoví na hodnotě 0,01 mg/ml. Pomocí HPLC analýzy nebyl nalezen žádný neacylova.ný lidský inzulín.

Rychlost rozpouštění krystalů se měří tak, že se 0,005 ml stejnoměrně suspendované formulace vloží do 3 ml fyziologického roztoku ošetřeného Dulbeccovým fosfátovým pufrem (bez vápníku nebo hořčíku) v křemenné krychlové, kyvetě s délkou průchodu světla 1 cm při teplotě 22 °C. Tento roztok se míchá konstantní rychlostí.za použití magnetického kyvetového míchadla. Měření absorbance při 320 nm se provádějí v 1-minutových intervalech. Absorbance při 320 nm odpovídá světlu rozptýlenému nerozpustnými částicemi přítomnými, ve vodné suspenzi. V důsledku toho, jak se mikrokrystaly rozpouštějí se absorbance blíží nule. Přibližný čas nutný k rozpuštění 0,005 ml této formulace je více než 400 minut. Čas nutný k rozpuštění 0,005 ml vzorku U100 komerčního přípravku Humulin^(R) N je za stejných podmínek asi 10 minut.

Měření velikosti částic se provádí na vzorku formulace za použití přístroje na měření velikosti částic (Multisizer Model IIE, Coulter Corp., Miami, FL

33116-9015) . K provedení tohoto měření se 0,25 ml' krystalové formulace přidá k 100 ml.ředidla sestávajícího z 14 mM hydrogenfosforečnanu sodného, 16 mM glycerolu, 1,6 mg/ml m-kresolu a 0,65 mg/ml fenolu, pH 7,4. Velikost otvoru ústí trubice přístroje je 50 pm. Data o velikosti. částic se shromažďují každých 50 sekund. Střední průměr částic krystalů je přibližně 6 pm, s přibližně normálním «I ·· ·* #· ·» ·· « « « « · · · * ««.»·»··· »··» ~ - ····«·· «·· · · · ·. · - 9] - ····«· ····· rozložením, zahrnujícím rozsah.velikostí částic od přibližně 2 pm do· přibližně 12 pm. Tento výsledek je podobný rozložení.velikosti částic v komerčním NPH, jak je uvedeno v DeFelippis, M. R., a. kol., J. Pharmaceut. Sci.,

87, 170-176 (1998).

Příprava 20

Mikrokrystaly B29-N-eta-nohanoyl-lidského inzulinu

N-eta-Nonanoyl-lidský inzulín se připraví podle popisu v přípravě 5. Vzorek N-eta-nonanoyl-lidského inzulinu (16,16 mg) se rozpustí v 0,8 ml. 0,IN .kyseliny chlorovodíkové. Sleduje se postup popsaný, v přípravě 14 s tím rozdílem, že roztok protaminu obsahuje 18,64 mg protaminsulfátu v celkovém objemu 50 ml. Ve velkém výtěžku (větší než* 80 %) se vytvoří tyčinkovité krystaly. Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B29-N-eta-pentanoyl-lidského . inzulinu tl/2 83 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pró .Humulin^(R> N ve stejném stanovení. '

Příprava 21 '

Mikrokrystaly B29-N-eta-dekanoyl-lidského inzulinu

B29-N-eta-Dékanoyl-lidský inzulín se připraví v podstatě stejně jak je popsáno v přípravě 5. Vzorek B29-N-eta-dekanoyl-lidského inzulinu (60,7 mg) se rozpustí v 1,5 ml 0,lN kyseliny chlorovodíkové. Přidá se 0,6 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1 000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů a důkladně se promíchá. 1C 0,7 ml výsledného roztoku ve skleničce A se-přidá 2,0 ml • · • ·

- 92 « ► · · ·· ι · · « > · · « ·* ·· ředidla A (50 mM citrátu, 5 mg/ml fenolu,'16 mg/ml v

glycerolu, 25 mM TRIS, pH 7,6). K další 0,7ml části roztoku komplexu zinek-derivovaný protein se přidá 2,0 ml ředidla B (100 mM citrátu, 2 mg/ml fenolu, 50. mM TRIS, pH 7,6). Hodnota pH ve skleničkách se upraví na 7,62 respektive 7,61 a každý roztok se. zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 pm. Obsah skleničky A (2,5 ml) se smíchá s 2,5 ml roztoku protaminsulfátu (7,4 mg protaminsulfátu rozpuštěných v 10 ml . ředidla A). Ihned se vytvoří zakalená sraženina. Přípravek se nechá nerušeně stát při 25 °C. Podobně se obsah skleničky B (2,5 ml) smíchá s 2,5 ml roztoku protaminsulfátu (37,8 mg protamin sulfátu se rozpustí v 50 ml vody). Ihned se vytvoří zakalená sraženina. Přípravek se nechá nerušeně stát 25 °C. Mikroskopickým vyšetřením obsahů obou. skleniček po 60 hodinách se zjistí, že v obou se vytvořily malé krystaly. Pro krystaly ve skleničce B je jasně průkazná tyči-nkovitá morfologie. Výtěžek krystalů ve skleničce B se stanoví pomocí HPLC na 80 %. Př.i spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B29-N-eta-dekanoyl-lidského inzulinu ve skleničce B tl/2 70 minut, ve. srovnání s asi 6 minutami pro Humulin^(R) N ve stejném stanovení.

Příprava 22

Mikrokrystaly B29-N-eta-dodekanoyl-lidského inzulinu

B29-N-eta-Dodekanoyl-lídský inzulin sepřipra-ví podle postupu popsaného v přípravě 5. Vzorek ,B29-N-eta-dodekanoyl-lidského inzulinu (17,00 mg) se rozpustí ve 4,0 ml ředidla (obsahujícího vodný roztok, na ml roztoku, 10 mg fenolu, 32 mg glycerolu, 30 mg dihydratu citrátu • 4

- 93 4 4 44 • 4 4 4 4 • 4 4 4 β » 4 ί

4 • · · · • · 4 4 • 4 4·4

4 4

4· · · • · · • 4 ·

4 4 • 4 4

4 sodného a 6,1 mg TRIS, pH 8,47). Hodnota pH roztoku derivátu analogu inzulinu se upraví na 8,57 za použití malých alikvotů. IN roztoku hydroxidu sodného. K roztoku s upraveným pH se přidá 0,320 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů. Hodnota pH roztoku derivátu analogu inzulinu tvořícího komplex se zinkem se upraví na 7,59 za použití malých alikvotů IN kyseliny chlorovodíkové a IN roztoku hydroxidu sodného. Roztok s upraveným pH se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny s průměrem pórů

0,22 pm., K 2,0 ml výsledného roztoku ve skleničce A se přidá 0,25 ml ethanolu. Směs se mírně míchá. K dalším 2,0 ml“výsledného roztoku ve skleničce B se přidá 0,6 ml ethanolu. Směs se mírně míchá. K obsahům skleničky A skleničky B se přidá 2,0 ml roztoku protaminu (obsahujícího, rozpuštěn je ve vodě, 0,37.6 mg protaminu na ml). Po přidání roztoku protaminu obsahuje každá sklenička zakalenou suspenzi. Každou skleničkou se mírně krouží, aby se míchání dokončilo a potom se nechá stát při 25 °C. Vytvoří se malé, nepravidelné krystaly s velmi velkým výtěžkem (větší než 90 %). Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly. B29-N-eta-dodekanoyl-lidského inzulinu tl/2'více než 300 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pro Humulin^(R) N ve stejném stanovení.

Příprava 23

Mikrokrystaly B29-N-eta-tetradekanoyl-lidského inzulinu

B29-N-eta-Tetradekanoyl-lidský inzulín se. připraví podle popisu v přípravě 5. Vzorek B29-N-eta-tetra-dekanoyl-lidského inzulinu (16,42 mg) se rozpustí v

• a · « i · · * ► ·· ·

0,5 ml O,1N kyseliny, chlorovodíkové# Po 5 až 10 minutách míchání se přidá 0,32 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího· 1000 dílů na. milion (ppm) zinečnatých iontů a výsledný roztok.se důkladně mísí mícháním. Potom 3,2 ml ředidla (obsahujícího ve vodném roztoku, na ml roztoku, 10 mg fenolu,. 32 mg glycerolu, 30.mg dihydratu citrátu .. sodného a 6,1'mg TRIS, pH 7,58) a výsledná směs se míchá dokud se úplně nesmísí. Po smíchání roztoku zinku a derivátu inzulínu s ředidlem se pH výsledného roztoku upraví napřed na 7,9 a potom zpátky na 7,59, přičemž se použijí malé. alikvoty IN kyseliny chlorovodíkové a IN roztoku hydroxidu sodného, dle potřeby. Roztok s upraveným pH se·zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 pm. K 1,97 ml výsledného - roztoku v lahvičce A se přidá 0,246 ml ethanolu. Směs se mírně míchá. K dalšímu objemu 1,97 ml výsledného roztoku v lahvičce B se přidá

0,591 ml ethanolu, což v lahvičce vede k tvorbě zákalu.

Směs se mírně míchá. K obsahu jak lahvičky A, tak lahvičky

B se přidá 1,97 ml roztoku protaminu (obsahujícího, «

rozpuštěného ve vodě, 0,376 mg protaminu na ml). Po přidání roztoku protaminu každá lahvička obsahuje zakalený roztok. Každou lahvičkou se mírně krouží k dokončení míšení a potom se nechá stát při 25 °C. Vytvoří se malé, nepravidelné krystaly s velmi velkým výtěžkem (větší než 90 %). Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B29-N-eta-tetrade- » kanoyl-lidského inzulínu tl/2 vice než 300 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pro Humulin^<R) N ve stejném stanovení. - .

Příprava 24

Mikrokrystaly B29-N-eta-hexadekanoyl-lidského inzulinu • 9

- 95 • 4 ·· ► 4 4 4 », 4 4 · » 9 999

Β 9 9 • 9 4 * » e 9 ι

I 4 4 <

• .9 9 9

B29-N-eta-Hexadekanoyl-lidský inzulín se připraví podle popisu, v přípravě. 5. Vzorek B29-N~eta-hexaděkanoyl-lidského inzulinu (16,29 mg) se rozpustí v 0,5 ml O,1N kyseliny chlorovodíkové. Po 5 až. 10 minutách míchání se přidá 0,32 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů a výsledný roztok se důkladně mísí mícháním. Potom 3,2 ml ředidla (obsahujícího, ve vodném- roztoku, na ml roztoku, 10 mg fenolu, 32 mg glyc.erolu, 30 mg dihydratu citrátu sodného a 6,1 mg TRIS, pH 7,58) a výsledná směs se míchá dokud se úplně nesmísí. Po smíchání roztoku zinku a derivátu inzulinu s ředidlem se pH výsledného roztoku upraví napřed na 8,0 a potom zpátky na 7,61,' přičemž se použijí malé alikvoty IN kyseliny chlorovodíkové a IN roztoku hydroxidu sodného, dle potřeby. Roztok s.upraveným pH se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny .o průměru pórů 0,22 pm. K 2,0 ml výsledného roztoku v lahvičce A se přidá 0,25.ml ethanolu. Směs se mírně míchá. K dalšímu . objemu 2,0 ml výsledného roztoku v lahvičce B se přidá 0,6 ml-ethanolu, což,v lahvičce vede k tvorbě zákalu. Směs se mírně míchá. K obsahu jak lahvičky A, tak lahvičky B se přidá 2,0 ml roztoku protaminu (obsahujícího, rozpuštěného ve vodě, 0,376 mg protaminu na ml). Po přidání roztoku protaminu každá lahvička obsahuje zakalený roztok. Každou lahvičkou se mírně krouží, k dokončení míšení a potom se_t nechá stát při 25 °C. Vytvoří se malé, nepravidelné krystaly. S velmi velkým výtěžkem (větší než 90 %). Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B.29-N-eta-hexadekanoyl-lidského inzulinu tl/2 více než 300 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pro Humulin^(R| N ve stejném stanovení.

- 96 Příprava 25'

Mikrokrystaly Al-N-alfa-oktanoyl-B29-N-eta-oktanoyl-lid.ského inzulinu

8,13 mg. hmoty analogu Al-N-alfa-oktanoyl-B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu se rozpustí v 1,60 ml ředidla (ve 100'ml: 0,604 g TRIS, 1,003 g fenolu, 3,218 g glycerolu a 3,069.. g citrátu sodného) . Hodnota pH tohoto roztoku se upraví na 7,61 pomocí malých množství l,0N kyseliny chlorovodíkové a l,0N NaOH. Po 5 až 10 minutách míchání se přidá 0,160 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1 .000 dílů na milion (ppm)· zinečn.atých iontů a výsledný roztok se znovu důkladně mísí. Hodnota pH se znovu upraví na 7,62 a potom se roztok zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 μιη. Ke 2 ml •tohoto zfíltrovaného roztoku se přidají 2 ml roztoku protaminu (ve 100 ml, 37,41 mg protaminu). Směsí se mírně krouží. Vytvoří se sraženina. Směs se nechá nerušeně při 25 °C. Vytvoří se malé nepravidelné krystaly.

Příprava 26 » * Mikrokrystaly Al-N-alfa-oktanoyl-B29-N-eta-oktanoyl- -desB30-lidského inzulinu

Způsob z přípravy 25 se v podstatě následuje s tím rozdílem, že se použije 8,08 mg Al-N-alfa-oktanoyl-B29-N-eta~oktanoyl-desB30-lidského inzulinu. Vytvoří se malé nepravidelné krystaly.

Příprava 27 • · ·» to· ♦ · « • · · • ··· ·

Mikrokrystaly' Al-N-alf a-nonanoyl-B29-N-eta-nonanoyl--desB30-lidského inzulinu

Způsob z přípravy· 25. se. v podstatě následuje s tím rozdílem, že se použije 8,07 mg Al-N-alfa-nonanoyl-B29-N-eta-nonanoyl-desB30-lidského inzulinu. Vytvoří se. malé nepravidelné krystaly.

Příprava 28

Mikrokrystaly Al-N-alfa-dekanoy.l-B29-Ň-eta-dekanoyl-desB30-lidského inzulinu

Způsob z přípravy 25 se v podstatě následuje s tím rozdílem, že se použije 8,22 mg Al-N-alfa-dekanoyl-B29-N-eta-dekanoyl-desB30-lidského inzulinu. Vytvoří se malé nepravidelné krystaly.

Příprava 29

Mikrokrystaly analogu B29-N-eta-oktanoyl-Gly(A21),

Arg(H31),Ařg(H32)-lidského inzulinu

Analog B29-N-eta-oktanoýl-Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-lidského inzulinu se připraví podle popisu v přípravě 5. Hmota (8,6 mg) analogu B29-N-eta-oktanoyl~

-Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-lidského inzulinu se rozpustí v 0,4 ml O,1N kyseliny chlorovodíkové. Po 5 až 10 minutách míchání se přidá 0,160 ml roztoku dusičnanu zinečnatého . obsahujícího 1 000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů a výsledný roztok se opět důkladně mísí. Potom se přidá

1,60 ml ředidla (ve 1.00 ml: 0, 604. g TRIS, 1,003 g fenolu., 3,218 g glycerolu a 3,069 g citrátu sodného) a mísí se • 4 dalším.mícháním. Hodnota pH tohoto roztoku se upraví na

7,59 pomocí malých množství 1,ON kyseliny chlorovodíkové a

1,ON NaOH a potom se roztok zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 pm. Ke 2 ml tohoto filtrovaného roztoku se přidají 2 ml roztoku protaminu (ve 100 ml, 37,41 mg protaminu). Směsí se mírně krouží.

Vytvoří se sraženina. Směs se nechá nerušeně při 25 °C. Vytvoří se malé, nepravidelné krystaly.

Příprava 30

Mikrokrystaly B29-N-eta-oktanoyl-des(ThřB30)-lidského . inzulinu

B29-N-eta-oktanoyl-des(ThrB30)-lidský inzulín se připraví podle popisu v přípravě 5. Vzorek B29-N-eta-oktaríoyl-des(ThrB30)-lidského inzulinu (16,21 mg) se rozpustí v 0,5 ml O,1N kyseliny chlorovodíkové. Po 5 až jLO minutách míchání se přidá 0,32 ml roztoku dusičnanu ' zinečnatého obsahujícího 1 000 dílů na milion, (ppm) zinečnatých iontů a výsledný roztok se opět důkladně mísí. Potom se přidá 3,2 ml ředidla (obsahujícího ve vodném roztoku, na ml, roztoku, 10 mg' fenolu, 32 mg glycerolu, 3 0 mg dihydrátu citrátu sodného a 6,1 mg TRIS, pH 7,58) a výsledná směs se míchá dokud není úplně promísena. Po smíchání roztoku zinku a derivátu inzulinu s ředidlem se hodnota pH výsledného roztoku upraví nejprve na 8,45 pomocí malých množství l,0N NaOH, podle potřeby. To nevede k. úpnému vyčeření roztoku. Hodnota pH se potom upraví na

7,61 za použití malých alikvotů IN kyseliny chlorovodíkové, podle potřeby. Roztok s upraveným pH se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 gm. K objemu tohoto filtrovaného roztoku se přidá stejný objem

- 99 ii ·· ftft ·· ft··· · · · · ftftft· ···· ft· · · ft ft « · · » · • · · ft · · · ftft ·· ftft ·· roztoku protaminu (obsahující 0,376 mg protaminu na ml rozpuštěného ve vodě,) . Po přidání roztoku protaminu se vytvoří zakalená suspenze. Suspenzí se mírně krouží k dokončení míšení a potom se nechá nerušeně stát při 25 °C.

S velkým výtěžkem (více než 80 %) se vytvoří tyčinkovité krystaly. Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B29-N-eta-oktanoyl-des(ThrB30)-lidského inzulinu tl/2 více než 300 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pro. Humulin^(R) N ve stejném stanovení.

Příprava 31

Mikrokrystaly analogu B29-N-eta-oktanoyl-des(B30)-lidského inzulinu

I *

B29-N-eta-Oktanoyl-des(ThrB30)-lidský inzulin se připraví podle postupu popsaného v přípravě 5. Vzorek B29-N-eta-oktanoyl-des(ThrB30)-lidského inzulinu se rozpustí v 0,400 ml0,lN kyseliny chlorovodíkové. Po 5 až 10 minutách míchání se. přidá 0,16 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů a výsledný roztok se opět důkladně mísí. Po 5 až .10 minutách míchání se přidá 0,160 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů a výsledný roztok se opět důkladně mísí. Potom se přidá 1,60 ml ředidla (ve 100 ml: 0,604 g. · TRIS, 1,003 g fenolu, 3,218 g glycerolu a 3,069 g citrátu sodného) a mísí se. Hodnota pH tohoto roztoku se upraví na

7,61 pomocí malých množství l,0N kyseliny chlorovodíkové a 1,ON NaOH a potom se roztdk zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 pm. Ke 2 ml tohoto filtrovaného roztoku se přidají 2 ml roztoku protaminu (ve ··

-100100 ml, 37,41 mg protaminu). Směsí se mírně krouží. Vytvoří se sraženina. Směs se nechá nerušeně při 25 °C.

Příprava 32

Mikrokrystaly B29-N-eta-hexanoyl-hovězího inzulinu .B29-N-eta-Hexanoyl-hovězí inzulin se připraví podle popisu v přípravě. 5. Vzorek B29-N-eta-hexarioylhovězího inzulinu (16,14 mg) se rozpustí v 0,8 ml 0,lN kyseliny chlorovodíkové. Po 5 až 10 minutách míchání se přidá^O,32 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů a výsledný roztok se důkladně mísí mícháním. Potom §e přidá 3,2 ml ředidla, (obsahujícího, na. ml roztoku, 10 mg fenolu, 16 mg glycerolu, 30. mg, dihydrátu citrátu sodného a. 6^1 mg TRIS, ve vodě, pH neupraveno) a výsledná směs se míchá dokud není úplně promísena. Po smíchání roztoku zinku a. derivátu inzulinu s krystalizačním ředidlem se hodnota pH výsledného roztoku upraví napřed 7,58 pomocí malých alikvotů IN kyseliny chlorovodíkové a IN NaOH podle potřeby. Roztok s upraveným pH se zfiltruje přes filtr málo yážící proteiny o průměru pórů 0,22 nm. K objemu tohoto filtrovaného roztoku se přidá stejný objem roztoku protaminu (obsahující 0,375 mg sulfátu protaminu na ml roztoku rozpuštěného ve vodě, ve vodě, pH neupraveno). Směsí obou objemů se mírně, krouží k dokončeni míšení. Vytvoří se zakalená suspenze, kterou se mírně krouží k dokonční míšení a potom se nechá stát při 25 °C. S velmi velkým výtěžkem, (více než.90 %) se vytvoří tyčinkovité krystaly. Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění l 1 krystalů popsaném výše měly krystaly B29-N-eta-hexanoyl-hovězího inzulinu' tl/2 více než 300 minut, ve. srovnání s ·· ·· - ’* ···· · · · · ·· · 4 · · * : :.······» · · ;

-101- ·..· -· ·..···· asi 6 minutami pro Humulin^(R|. N ve stejném'stanovení.

Příprava 33

Mikrokrystaly B29-N-eta-hexanoyl-ovčího inzulinu

B29-N-eta-Hexanoýl-ovčí inzulín se připraví podle popisu v přípravě 5. Vzorek of B29-N-eta-hexanoylovčího inzulinu (1.6,15 mg) se rozpustí v 0,8 ml O,1N kyseliny chlorovodíkové. Po 5 až 10 minutách míchání se přidá 0,32 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů a výsledný roztok se důkladně mísí mícháním. Roztok se zakalí, přičemž přidání 0,1 ml O,1N kyseliny chlorovodíkové nezpůsobilo úplné rozptýlení zákalu. Poté se,následuje postup z přípravy 32, s tím rozdílem, že hodnota pH se upraví na .7,61 místo na 7,58. S vysokým výtěžkem (více než 80 %) se vytvoří malé, nepravidelné krystaly. Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B29-N-eta-hexanoyl-ovčího inzulinu tl/2 více než 184 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pro Humulin^(R) N ve stejném stanovení.

Příprava 34

Mikrokrystaly B29-N-eta-oktanoyl-prasečí inzulín

B29-N-eta-Oktanoyl-prasečí inzulín se připraví podle popisu v přípravě 5. Vzorek B29-N-eta-oktanoyl-prasečího inzulinu (16,78 mg) se rozpustí v 0,5 ml 0, IN kyseliny.chlorovodíkové. Po 5 až 10 minutách míchání se přidá 0,32 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů a výsledný

φ φ φ Φ-102Φ φφ « · · φ φ φ » φ φφφ φφ ·· roztok se důkladně mísí mícháním. Potom se přidá 3,2 ml ředidla (obsahujícího ve vodném roztoku, na ml roztoku, 10 mg fenolu, 32 mg glycerolu, 30 mg dihydratu citrátu sodného a 6,1 mg TRIS, pH 8,5) a výsledná směs se míchá dokud se úplně nesmísí. Po smísení roztoku zinku a derivátu inzulinu s ředidlem se pH výsledného roztoku upraví nejprve na 8,4 za použití malých alikvotů IN roztoku hydroxidu sodného, dle,potřeby. Hodnota pH se potom upraví na 7,-60 za použití malých alikvotů IN kyseliny chlorovodíkové, dle potřeby. Potom se postupuje podle postupu z přípravy 32. S vysokým výtěžkem (více než 80 %) se vytvoří malé, nepravidelné krystaly. Při spektrofo- - tometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B29-N-eta-hexanoyl-prasečího inzulinu tl/2 více než 300 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pro Humulin^(R) N ve stejném stanovení.

Příprava 35

Mikrokrystaly B29-N-eta-oktanoyl-králičího inzulinu

B29-N-eta-Oktanoyl-králičí inzulin se připraví podle postupu popsaného v přípravě 5. Vzorek B29-N~eta-oktanoyl-králičího inzulinu (8,10 mg) se rozpustí v 0,25 ml 0,lN kyseliny chlorovodíkové. Po 5 až 10 minutách míchání se přidá 0,16 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1 000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů a výsledný roztok se důkladně mísí mícháním. Potom se přidá 1,6 ml ředidla (obsahujícího ve vodném roztoku, na ml roztoku, 10 mg fenolu, 32 mg glycerolu, 30 mg dihydratu citrátu sodného a 6,1 mg TRIS, pH 8,5) a výsledná směs se míchá dokud se úplně nesmísí. Po smísení roztoku zinku a derivátu inzulinu s ředidlem se pH výsledného roztoku

9 » t • · to •

• ·

-103• to ·· • · to * • to toto • · to to • · · · ·· toto upraví nejprveha 8,34 za použití malých alikvotů IN roztoku hydroxidu sodného, dle potřeby. Hodnota pH se potom upraví na 7,57. za použití malých alikvotů IN kyseliny chlorovodíkové, dle potřeby. Potom se postupuje podle postupu z přípravy 32. S vysokým výtěžkem (více než 80 %) se vytvoří malé, nepravidelné krystaly. Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B29-N-eta-oktanoyl-králičího inzulinu tl/2 více než 119 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pro Humulin^(R> N ve stejném stanovení.

Příprava 36

Mikrokrystaly analogu B29-N-eta-okt'anoyl-des (B27)-lidského inzulinu to · • to • ·

Analog B29-N-.eta-oktanoyl-des (B27)-lidského inzulinu se připraví podle postupu popsaného v přípravě 5. Hmota (8,02 mg) analogu B29-N-eta-oktanoyl-deš(B27)-lidského inzulinu se rozpustí v 0,400. ml 0,lN kyseliny chlorovodíkové. Po 5 až 10 minutách míchání se přidá 0,160 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů a výsledný roztok se důkladně mísí mícháním. Potom se přidá 1,60 ml ředidla (ve 100 ml: 0,604 g. TRIS., 1,003 g fenolu, 3,218 g glycerolu a 3,069 g citrátu sodného) a mísí se. Hodnota pH tohoto roztoku se upraví na 7,61 pomocí malých množství l,0N kyseliny chlorovodíkové a 1,ON NaOH a. potom se roztok zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů

0,22 μπι. Ke 2 ml tohoto zfiltrovaného roztoku sě přidají 2 ml roztoku protaminu (ve 100 ml, 37,41 mg protaminu).. Směsí se mírně krouží. Vytvoří se sraženina. Směs.se nerušeně nechá při 25 °C. Po .6 dnech se vytvoří dobře

-104 tvarované, jednotlivé/ tyčinkovité krystaly.

Příprava 37 ·

Mikrokrystaly analogu B29-N-eta-oktanoyl-Asp(B28)-lidského inzulinu

Hmpta (8,16 mg) analogu B29-N-eta-oktanoyl-Asp(B28)-lidského inzulinu se rozpustí v 1,60 ml ředidla (ve 100 ml: 0,604 g TRIS, 1,003 g fenolu, 3,218 y glycerolu a 3,069 g citrátu sodného). Hodnota pH tohoto roztoku se upraví na 7,61 pomocí malých množství l,0N kyseliny chlorovodíkové a l,0N NaOH. Po 5 až 10 minutách míchání se přidá 0,16 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1 000 dílů na milion (ppm)‘ zinečnatých iontů a výsledný roztok se opět důkladně mísí mícháním. Hodnota pH se opět upraví na 7,62 a potom se roztok zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 pm. Ke 2.ml. tohoto zfiltrovaného roztoku se přidají 2 ml roztoku protaminu (ve 100 ml, 37,41 mg protaminu). Směsí se mírně krouží. Vytvoří se sraženina. Směs se n^schá nerušeně při 25 °C. S vysokým výtěžkem (více než 80 %) se vytvoří malé, nepravidelné krystaly. Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly analogu B29-N-eta-oktanoyl-Asp(B28)-lidského inzulinu tl/2 15 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pro Humulin^(R) N ve stejném stanovení.

Příprava 38

Mikrokrystaly B28-N-eta-butyryl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu «X

44 • 4 4 ·

-105 • 4 ·4

4 · ·

4 44 «44 44

4 4 · • 4 44

B28-N-eta-Butyryl-LysB28,ProB29-lidský inzulín se připraví podle postupu popsaného v přípravě 5. Vzorek B28-N-eta-butyryl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu (16,09 mg) se rozpustí v 0,8 ml O,1N kyseliny chlorovodíkové. Po 5 až 10 minutách míchání se přidá 0,32 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů a výsledný roztok.se důkladně mísí mícháním. Potom se přidá 3,2 ml krystalizačního ředidla á výsledná'směs se míchá dokud se úplně nesmísí. (Krystalizační ředidlo se připraví tak, že za míchání se ve vodě rozpustí 0,603 g TRIS, 1,007 g fenolu, 1,582 g glycerolu a 2,947 g citrátu sodného. Přidá se další voda, aby se objem roztoku upravil na 100 ml.) Po smíchání roztoku zinku a derivátu-inzulinu s krystalizačním ředidlem se pH výsledného roztoku upraví na 7,60 za použití malých alikvotů IN kyseliny chlorovodíkové a IN roztoku hydroxidu sodného, dle potřeby. Roztok s upraveným pH se zfiltruje přes fitr málo vážící proteiny s průměrem pórů 0,22 gm. K objemu zfiltrovaného roztoku se přidá stejný objem vodného roztoku protaminu, připraveného rozpuštěním 18,64 mg protaminsulfátu ve vodě na konečný objem 50 ml. Směsí obou objemů se mírně krouží, aby se míšení dokončilo a potom se nechá stát při 25 °C.

Příprava 39

Mikrokrystaly B28-N-eta-hexanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu

B28-N-eta-Hexanoyl-LysB28,ProB29-lidský inzulín se připraví podle postupu popsaného v přípravě 5. Vzorek B28-N-eta-hexanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu (15,95 mg) se rozpustí v 0,8 ml 0,lN kyseliny chlorovodíkové.

-106: ..... ...... ·.· · '·«· ·· · ···* *<♦ ·· ·· ·· ·· **

Následně se následuje postup z přípravy 38. S vysokým výtěžkem (více než 80 %) se vytvoří malé, .nepravidelné krystaly. Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly.B28-N-eta-hexanoyi-LysB28,ProB29-lidského inzulinu tl/2 5 až 6 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pro Humulin™ N ve stejném stanovení.

Příprava 40

Mikrokrystaly B28-N-e.ta-hexanoyl-LysB28, ProB29-lidského inzulinu

B28-N-eta-Hexanoyl-LysB28,ProB29-lidský inzulín se připraví podle postupu popsaného v přípravě 5. Vzorek B28-N-eťa-hexanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu (16,8 fl mg) se rozpustí ve 4,0 ml ředidla (obsahujícím ve vodném roztoku, na ml roztoku, 10 mg fenolu, 32 mg glycerolu, 30 mg dihydratu citrátu sodného a 6,1 mg TRIS, pH 7,58). . Hodnota pH roztoku derivátu analogu inzulinu se upraví na

8,4 za použití malých alikvotů IN roztoku hydroxidu sodného. K.roztoku s upraveným pH se přidá 0,320 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů. Hodnota pH roztoku zinku a derivátu analogu inzulinu se upraví na 7,61 za použití malých alikvotů IN kyseliny chlorovodíkové a IN roztoku hydroxidu sodného. Roztok s upraveným pH se zfiltrůje přes filtr málo vážící proteiny-o průměru pórů 0,22 μπι. Ke 2,0 ml výsledného roztoku ve skleničce A se přidá 0,25 ml ethanolu. Směs se mírně mísí a roztok se zakalí. K dalším , >5!

2,0 ml objemu výsledného roztoku ve skleničce B se přidá 0,6 ml ethanolu. Směs se mírně mísí a -roztok se zakalí. K ·. obsahům jak skleničky A, tak skleničky B se přidají 2,0 ml

-107·· 44

4.44 · • 4 44 · 4 4 • 4 4 · ·· 44

44· 4 · ·

«

4* roztoku protaminu (obsahujícího 0,376 mg protaminu na ml rozpuštěného ve vodě). Po přidání roztoku protaminu obsahuji obě skleničky zakalenou suspenzi. Oběma skleničkami se mírně krouží, aby $e dokončilo míšení a potom se nechají ,stát při 25 °C. V obou skleničkách se vytvoří krystaly. Složení roztoku ve skleničce A se analyzuje na zbytkovou,koncentraci derivátu analogu inzulinu a krystaly se vystaví testu rozpustnosti.

Příprava 41

Mikrokrystaly B28-N-eta-oktanoyl-LyšB28,ProB29-lidského inzulinu

B28-N-eta-Oktanoyl-LysB28,ProB29-lidský inzulin se připraví podle postupu popsaného v přípravě 5. Vzorek B28-N-eta-oktanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu (16,02 mg) se rozpustí v 0,8 ml O,1N kyseliny chlorovodíkové. Následně se v podstatě následuje postup z přípravy 38. S vysokým výtěžkem (více než 80 %) se vytvoří malé, nepravidelné krystaly. Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B28-N-eta-oktanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu tl/2 7 až 8 minut, ve srovnání s' asi 6 minutami pro Humulin^(R) N ve stejném stanovení. . , . , ·

Příprava 42

Mikrokrystaly B28-N-eta-oktanoyl-LysB28, ProB29-lids.kého. inzulinu ·

B28-N-ěta-Oktanoyl-LysB28,ProB29-lidský inzuli n se připraví podle postupu popsaného v přípravě 5. Vzorek φφ φφ φ « φ

Φ φ

φ

108 φφ φφ φφφ φφ φφ φ φ φ φ * φ φ · • · ··· • · ♦ φφ . φφ

B28-N-eta-oktanoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu (16,35 mg) se rozpustí ve 4,0 ml ředidla (obsahujícím ve vodném roztoku, na ml rpztoku, 10 mg fenolu, 32 mg glycerolu, 30 mg dihydratu citrátu sodného a 6,1-mg TRIS, pH 7,58). Hodnota pH roztoku derivátu analogu inzulinu se upraví na

8,4 za použití malých alikvotů IN roztoku hydroxidu sodného. K roztoku s upraveným pH se přidá 0,320 ml roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů. Hodnota pH·roztoku zinku a derivátu analogu inzulinu se upraví na 7,62 za použití malých alikvotů IN kyseliny chlorovodíkové a IN roztoku hydroxidu sodného. Roztok s upraveným pH se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 pm. Ke. 2,0 ml výsledného roztoku ve skleničce A se přidá 0,25 ml ethanolu. Směs se mírně mísí a roztok se zakalí. K dalším 2,0 ml objemu výsledného roztoku ve skleničce B se přidá 0,6 ml ethanolu. Směs se mírně mísí a roztok se zakalí. K obsahům jak skleničky A, tak skleničky B se přidají 2,0 ml roztoku protaminu (obsahujícího,, rozpuštěného ve vodě,

0,376 mg protaminu na ml). Po přidání roztoku protaminu obsahují obě skleničky zakalenou suspenzi. Oběma skleničkami se mírně krouží, aby se dokončilo míšení a potom se nechají stát při 25 °C. V obou skleničkách se vytvoří krystaly. Složení roztoku ve skleničce A se analyzuje na zbytkovou koncentraci derivátu analogu inzuling a krystaly se vystaví testu rozpustnosti.

S vysokým výtěžkem (více než 80%) se vytvoří malé, nepravidelné krystaly. Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B29-N-eta-oktarioyl-králičího inzulinu tl/2 '15 minut, ve srovnání s asi 6 minutami pro Humulin^(R) N ve stejném stanovení.

-109

Příprava 43 '

Amorfní suspenze B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu

B29-N-eta-Oktanoyl-lidský inzulín se připraví, podle postupu popsaného v přípravě 5. Vzorek· B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu {20,31 tuhé látky, obsahující 16,95 mg proteinu) se rozpustí v 5,0 ml O,1N kyseliny chlorovodíkové. Potom se přidá 200 mikrolitrů roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1 000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontů a následně 2,0 ml ředidla obsahujícího na ml: 1,625 mg fenolu, 4 mg m-kresolu, 40 mg glycerolu, 5 mg bezvodého hydrogenfosforečnanu sodného a

7,5 mg dihydratu citrátu sodného, konečné pH 7,6). Po přidání ředidla se pH výsledného roztoku upraví na 7,58 pomocí 0, 090'ml.IN roztoku hydroxidu'sodného. Roztok se potom zfiltruje přes sterilní filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 pm a. přes noc dá do chladničky. V tomto, bodě je koncentrace derivátu inzulinu 6,074· mg/ml.

Příštího rána nebyla v roztoku viditelná sraženina. Objem roztoku (2,50 ml) se smísí s 2,875 ml roztoku protamin ' sulfátu ve vodě a bezprostředně se vytvoří amorfní sraženina. Koncentrace· B29-N-eta-oktanoyl-lidského •inzulinu je po přidání protaminu 2,825 mg/ml. Suspenze se přibližně 1 hodinu a 40 minut po smísení derivátu innzulinu s protaminem rnjikuje dvěma psům.

Příprava 44·

Amorfní suspenze analogu B28-N-eta-myristoyl-LysH28,ProH29-lidské.ho inzulinu

B28-N-eta-Myr.istoyl-’LysB28, Pro829-lidský inzulin ·

· · « 4 4 4· 4 4 4 tj 9 44 · · », · ftftft i 4 · «* · · ··· I · 9·

11Λ ···*·» ···♦ “ 1 lu · · · · »··· ·· se připraví podle postupu v podstatě popsaného v přípravě 5, Vzorek B28-N-eta-myristoyl-LysB28, Pro82’9-íidského inzulinu (20,43 mg tuhé látky, 18,53 mg proteinu) se rozpustí v 0,5 ml O,1N kyseliny chlorovodíkové. Potom se přidá 200 mikrolitrů roztoku dusičnanu zinečnatého obsahujícího 1000 dílů na milion (ppm) zinečnatých iontůa přidají se 2,0 ml ředidla pro formulaci. Ředidlo pro formulaci'obsahuje na ml: 1,6 mg fenolu, 4 mg m-kresolu, mg glycerolu, 5 mg bezvodého hydrogenfosforečnanu sodného a 7,5 mg dihydrátu fosforečnanu sodného, přičemž konečná hodnota je pH 7,6. Hodnota pH formulace se upraví z 5,9 na 8,7 pomocí 100 mikrolitrů IN roztoku hydroxidu sodného. Formulace je čirá. Hodnota pH potom sníží na 7,59 přidáním 20 mikrolitrů IN kyseliny chlorovodíkové. V tomto bodě je koncentrace proteinu 6,57 mg/ml. Roztok se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů

0,22 μπι a přes noc se dá do lednice. Příštího rána nevykazovala formulace přítomnost žádné viditelné sraženiny..Část tohoto roztoku (2,50 ml) se smísí s 2,875 ml roztoku protaminu (0,75 mg/ml tuhého protaminsulfátu rozpuštěného ve vodě), přičemž se vytvoří amorfní suspenze. Koncentrace B28-N-eta-myristoyl-LysB2B,ProB29-lidského inzulinu se sníží na 3,056 mg/ml přidáním roztoku protaminu. Vzorky pro HPLC analýzu se připraví urychleně po přidání protaminu. Se znalostí retenčních časů píků HPLC analýza ukázala, že nerozpustný materiál obsahuje protamin a B28-Ň-eta-myristoyl-LysB28, Pro829-lidský inzulin. Koncentrace B28-N-eta-myristoyl-LysB2B,ProB29-lidského inzulinu v supernatantu byla nalezena 0,005 mg/ml, ve vzorku sraženiny znovu rozpuštěné na původní objem byla 3,13 mg/ml. Koncentrace B28-N-eta-myristoyl-LysB2B,ProB29-lidského inzulinu ve vzorku okyselené suspenze je 3,34 mg/ml.

<5

-111 4 · * · • · · 4 4 '· • 4 · · 4 ·

4 4 «44 4

4 4 · · ·

4 1* 4·

44 44

4 4 · 4 ·

4 4 4 4 4

4 4 4 4 44 4 « 4 4 4 •4 «4 44

Příprava 45

Mikrokrystaly B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu

Suchý prášek B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu (7 dílů hmotnostních) se rozpustí ve 175 dílech objemových O,1N kyseliny chlorovodíkové a se přidá roztok chloridu zinečnatého (.60 dílů objemových, připravený rozpouštěním oxidu zinečnatého v kyselině chlorovodíkové tak, aby se získala 15,3mM koncentrace zinku). K tomuto roztoku se přidá 800 dílů objemových vodného rozpouštědla obsahujícího 25 mM TRIS, 10 mg/ml fenolu,' 0,1 M citrátu a 40 mg/ml glycerolu, ve vodě o hodnotě pH 7,6. Hodnota pH výsledného roztoku se upraví na 7,6 a ten se potom zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,2 2 μπι.

Další roztok se připraví rozpuštěním 7 dílů hmotnostních protaminsulfátu v 10 000 dílech objemových vody. Roztok protaminu se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny· o průměru pórů 0,22 μπι. Stejné objemy roztoku derivovaného proteinu a roztoku protaminu se spojí přidáním roztoku protaminu k roztoku acylováného inzulinu. Vytvoří se amorfní sraženina. Tato.suspenze se nechá 48 hodin nerušeně stát při teplotě 25 °C. Mikrokrystaly ve výsledném přípravku poskytnou prodloužený a plošší průběh účinku v čase ve srovnání se stejnou dávkou NPH lidského inzulinu.

Příprava 46

Mikrokrystaly B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu

- 112 • · · ·

4 4 · • · · · • · 4444 • · ·

49 ·· ·· <ř · ·

4 4 ·

4 4 4

4 4 4 ·4

Následuje se postup ze způsobu přípravy 45. Suspenze se nechá 48 hodin nerušeně.stát při teplotě 30 °C. Získají se podobné výsledky.

Příprava 47

Mikrokrystaly B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu

Suchý prášek B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu (7 dílů hmotnostních) se rozpustí ve 175 dílech objemových 0,lN kyseliny, chlorovodíkové a se přidá roztok chloridu zinečnatého (60 dílů objemových, připravený

Φ» rozpouštěním oxidu zinečnatého v kyselině chlorovodíkové tak, aby se získala 15,3mM koncentrace zinku). K tomuto roztoku se přidá 1 000 dílů hmotnostních vodného rozpouštědla obsahujícího 35 mM hydrogenfosforečnanu. sodného, 4 mg/ml m-kresolu, 1,6 mg/ml fenolu, 25.mMcitrátu a 40 mg/ml glycerolu, ve vodě o hodnotě pH 7,6. Hodnota pH výsledného roztoku se. upraví na 7,6 a ten se potom zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 μπι.

Další roztok se připraví rozpuštěním 6 dílů hmotnostních protamin sulfátu v 10 000 dílech objemových vody, roztok se potom zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 μπι. Stejné objemy roztoku derivovaného proteinu a roztoku protaminu se spojí přidáním roztoku protaminu k roztoku acylovaného inzulinu. Vytvoří se amorfní sraženina. Táto suspenze se nechá l· týden nerušeně stát při teplotě 25 °C. Mikrokrystaly ve výsledném přípravku poskytnou prodloužený a plošší průběh účinku v čase. ve srovnání se stejnou dávkou NPH lidského »

-113 • to ·* • · · ·' • to toto » toto toto • toto · •« to· • to • to to · • toto « * • «· · to to« · • toto · • »· · toto ·· inzulínu.

Příprava 48

Mikrokrystaly B29-N-eta-o.ktanoyl-lidského inzulinu

Suchý prášek B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu (7 dílů hmotnostních) se rozpustí ve 175 dílech objemových, O,1N kyseliny chlorovodíkové a se přidá roztok chloridu zinečnatého (60 dílů objemových,' připravený rozpouštěním oxidu zinečnatého v kyselině chlorovodíkové tak, aby se získala 15,3mM koncentrace zinku). K tomuto roztoku se přidá 1 000 dílů hmotnostních vodného rozpouštědla obsahujícího 35 mM hydrogenfosforečnanu sodného, 4 mg/ml m-kresolu, 1,6 mg/ml fenolu, 10 mM citrátu,a 40 mg/ml glycerolu, ve vodě o hodnotě pH 7,6. Hodnota pH výsledného roztoku se upraví na 7,6 a ten se potom zfiltruje přes filtr málo.vážící proteiny o průměru pórů 0,22 μπι.

Další roztok se připraví rozpuštěním 6 dílů hmotnostních proťamin sulfátu v 10 000 dílech objemových vody, roztok se potom zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 μπι. Stejné objemy roztoku acylovaného inzulinu a roztoku protaminu se spojí přidáním roztoku protaminu k roztoku acylovaného inzulinu. Vytvoří se amorfní sraženina. Tato suspenze Se nechá 1 týden nerušeně stát při teplotě 25 °C. Mikrokrystaly ve výsledném přípravku poskytnou prodloužený a plošší průběh účinku v čase ve srovnání se stejnou dávkou NPH lidského inzulinu.

Příprava 49

-114-

to. · · toto to· ·· to · • · · · to · «·· ·· · ♦ · toto • ·· · , • ·· · • toto ·

Mikrokrystaly B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu iP

Postupuje se podle postupu popsaného v přípravě 47. Suspenze se nechá 60 hodin nerušeně stát při teplotě 30 °C. Mikrokrystaly ve výsledném přípravku poskytnou' prodloužený a plošší průběh účinku v čase ve srovnání se Stejnou dávkou NPH lidského inzulinu. «

A

Příprava 50

Mikrokrystaly B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu

Roztok se připraví smísením vody pro injekce (WFI, 1 000 dílů objemových), fenolu (0,65 dílů hmotnostních), m-kresolu (1,6 dílů - hmotnostních) a glycerinu (16 dílů hmotnostních). V tomto roztoku' se potom rozpustí prášek protaminsulfátu (0,6 dílu hmotnostního). Potom se přidá roztok chloridu zinečnatého (60 dílů objemových) připraveného rozpuštěním oxidu zinečnatého v kyselině chlorovodíkové,, aby se získala 15,3mM koncentrace zinku v 0,lN kyselině chlorovodíkové.·. Přidá se suchý prášek B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulínu (7 dílů hmotnostních) a mícháním se rozpustí. Hodnota pH se upraví na asi 3, aby se napomohhlo rozpouštění, pokud je to nezbytné, pomocí malých množství IN kyseliny chlorovodíkové a IN roztoku hydroxidu sodného. Hodnota pH se potom upraví do rozmezí 3 až 3,6 pomocí malých množství IN kyseliny chlorovodíkové a IN roztoku hydroxidu sodného. Tento, roztok se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22 gm.

Druhý roztok se připraví rozpuštěním hydrogen— fosforečnanu sodného (7,56 dílů hmotnostních), fenolu • · • » • ·

-115• · • · · · ♦ !» • · * · · . · · • « # 9 · · · • · · · · ♦

W · · β · · ·

9 · · · · · 9 9 9 9

99999 99 · • · · · · • · *· · · (0,6,5 dílů hmotnostních), m-kresolu (1,6 dílů hmotnostních) a glycerinu (16 dílů hmotnostních) vévodě pro injekce (1000 dílů objemových). Hodnota pH tohoto, roztoku se upraví- tak, aby spojení objemu, tohoto roztoku se stejným objemem, roztoku B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu vedlo k hodnotě pH.asi 7,5 až asi 7,7. Po řádném upravení pH tohoto pufrovacího roztoku se tento roztok zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů

0,22 pm. Spojí se stejné objemy pufrovacího roztoku a roztoku B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu.. Bezprostřeně se vytvoří amorfní sraženina, která po 60 hodinách nerušeného stání při teplotě 25 °C krystaluje. Mikrókrystaly ve výsledném přípravku poskytnou prodloužený a plošší průběh účinku v čase ve srovnání se stejnou dávkou NPH lidského inzulinu.

Příprava 51 ' , .

Mikrokrystaly B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu

Roztok se připraví smísením vody pro injekce (WFI, 1.000 dílů objemových), hydrogenfosforečnanu sodného (3,78 dílů hmotnostních), fenolu (0,65 dílů hmotnostních), m-kresolu (1,6 dílů hmotnostních) a glycerinu (16 dílů hmotnostních.) . Přidá se roztok chloridu zinečnatého (6 dílů objemových) připraveného rozpuštěním oxidu zinečnatého v kyselině chlorovodíkové, aby se získala· 153mM koncentrace zinku v 0,lN kyselině chlorovodíkové. Přidá se suchý prášek B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulínu (7 dílů hmotnostních) a mícháním se rozpustí. Hodnota pH se upraví na asi 3, aby se napomohhlo rozpouštění, pokud je to nezbytné, pomocí malých množství IN kyseliny chlorovodíkové a IN roztoku hydroxidu sodného. Hodnota pH se

4 « 4

4 4 4- *

4 4 4

4 44444 • 4 · 4 4 4 4

4» ·· .·· ·4

-116.4 4 4 · · 4 4 potom upraví 7,6 pomocí malých množství 10% kyseliny chlorovodíkové a 10% roztoku hydroxidu sodného. Tento roztok se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22. gm.

Druhý roztok se připraví rozpuštěním hy^rogenfosforečnanu sodného (3,78 dílů hmotnostních), fenolu (0,65 dílu hmotnostního), m-kresolu (1,6 dílů hmot-, nostních) a glycerinu (16 dílů hmotnostních) ve vodě pro injekce (1 000 dílů objemových). V tomto roztoku se rozpustí prášek protaminsulfátu (0, 6 dílu. hmotnostního) . Hodnota pH tohoto roztoků se upraví na 7,6'. Tento roztok' se zfiltruje přes filtr málo vážící proteiny o průměru pórů 0,22· mikronu. Spojí se stejné objemy tohoto roztoku protaminu a roztoku B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu. Bezprostřeně se vytvoří amorfní sraženina, která po 60 hodinách nerušeného stání při teplotě 25. °C krystaluje. Mikrokrysťaly ve výsledném přípravku poskytnou prodloužený a plošší průběh účinku v čase ve srovnání se stejnou dávkou NPH lidského inz.ulihu.

Příprava 52

Mikrokrystaly B29-N-eta-(2-ethylhexanoyl)-lidského inzulinu i

'B29-N-eta-(2-Ethylhexanoyl)-lidský inzulín se připraví. podle postupu popsaného v přípravě 5. Hmota ('8,00 mg) B29-N-eta-(2-ethylhexanoyl)-lidského inzulinu se

T 6 rozpustí v 0,400 ml 0, IN kyseliny chlorovodíkové. Poté se v podstatě následuje postup z přípravy 17. Vytvoří se sraženina. Směs se nechá nerušeně při teplotě 25 ÍC.* S vysokým výtěžkem (více než 80 %) se vytvoří tyčinkovité • · # · · · · · • ♦ · · · · ♦ » » • · · · · ♦ · · • ·····«; · · Λ • · · · · · · o· · · ·« ·· minut, v-e N ve stejném formulace

-117krystaly. Při spektrofotometrickém stanovení rozpouštění krystalů popsaném výše měly krystaly B28-N-eta-(2-hexanoyl)-lidského inzulinu tl/2 34 až srovnání s asi 6 minutami pro Humulin^(R) stanovení.

Příklad 1 . Test na diabetických psech in vivo

Protrahovaný účinek suspenzní obsahující mikrokrystaly připravený podle některé z příprav zde uvedených se testuje na diabetických psech srovnáním její schopnosti řídit hyperglykémii se schopností řídit hyperglykémii, kterou mají kontrolní sloučeniny. Použije se dávka asi 0,2 jednotky/kg tělesné hmotnosti podaná jednou za den. Tato dávka je ekvivalentní asi 1,2.nmol/kg. Ve dnech testování se hladina glukózy v krvi sleduje' 24 hodin po subkutánní injekci suspenzní formulace.

Kontrolními sloučeninami jsou. lidský inzulín a lidský inzulín NPH.' Suspenzní formulace mikrokrystalů podle předloženého vynálezu sníží hladiny glukózy v krvi a bude srovnání s lidským ve srovnatelných dávkách.

mít prodlouženou dobu učmku ve inzulínem NPH, pokud se testují

Příklad 2

Doba působení krystalů u krys

K 1,898 ml krystalové formulace připravené podle přípravy 19 se přidá 3,102 ml ředidla (16 mg/ml glycerolu, 20 mM TRIS, .1,6 mg/ml m-kresolu, 0,65 mg/ml fenolu, 40 mM citrátu sodného, pH 7,4). Tím se získá 5 ml U40 formulace, • ·

-1184 .9

44 ·· • ··,··.

• 4 ·* · · 9 4

9 4 449 9 9 4 9 4

4 9 9 4 9 4 · · · · ··' která se testuje na krysách BBDP/Wor, geneticky charakterizovaném zvířecím modelu, chovaném na University of

Massachusetts Medical Center (Worchester, MA) ve spojení with Biomedical Research Models, lne. (Rutland, ΜΑ), odkud se zvířata získala. Linie krys DPBB/Wor,má sklon k diabetů a vykazuje inzulindependentní (autoimmunní) diabetes mellitus.

kusů krys BBDP/Wor [20 samců/20 samic, věk 4 až 5 měsíců, udržované na dlouhodobě působícím inzulinu (PZI)], se náhodně rozdělí podle pohlaví na 8 experimentálních skupin, A, B, C, D, E, F, G a H. Skupiny A (5 «jí* samců) a B (5 samic) se léčí 2 dny přípravkem U40 lidského inzulinu ultralente, který má 2,5 mg/ml zinku. Skupiny C (5 samců) a D (5 samic) se léčí.2 dny přípravkem U40 lidského inzulínu ultralente, který má 1,25 mg/ml zinku.

Skupiny E (5 samců) a F (5 samic) se léčí 2 dny přípravkem U40 hovězí-prasečí PZI insulin (PZI). Skupiny G (5 samců) a H (5 samic) se léčí 2 dny krystalovou formulací podle předloženého vynálezu podle popisu v tomto příkladu. Každá krysa dostává denní injekce formulace své· skupiny po 2 dny před stanovením hladiny glukózy v krvi a v den stanovení hladiny glukózy v krvi.

Krev se odebere půl hodiny před podáním testovaných formulací. Zvířatům se podá subkutanně buď 0,9 j./100 g tělesné hmotnosti (samci) nebo 1,1 j./ΙΟΟ g tělesné hmotnosti (samice) v 11 hodin 30 minut.dopoledne.

Krev sé odebere říznutím do ocasu (bez anestezie), krátce se uloží na led, odstředí se a. stanoví se hladina glukózy za použití glykózového analyzátoru Beckman II. Vzorky krve se získají těsně před podání testovaných formulací a 2, 4,

6, 8, 12, 16, 20 a 24 hodin po podání. Krystalová • ·

-119formulace podle předloženého vynálezu řídi hladinu glukózy v krvi po dobu srovnatelnou s dobou naměřenou pro přípravky dlouhodobě působícího inzulinu.

·4 44 ·4

4 4 4 · · 4

4 4 · · *4

44 444 4 44

4 4 4 4 4 · ·

4 4

4 4

4 4

Příklad 3

Doba působení krystalů u krys

Testovací postup popsaný výše v příkladu 2 se opakuje s druhým vzorkem U40 formulace suspenze připravené podle výše uvedeného popisu. .

> φ kusů krys BBDP/Wor [18 samců/17 samic, věk 4 až 5 měsíců, udržované na dlouhodobě působícím inzulinu (PZI)], se náhodně rozdělí podle pohlaví na 6 experimentálních skupin, I, J, K, L, M a N. Skupiny I (8 samců) a J (8 samic) se léčí 3 dny krystalovou formulací podle předloženého vynálezu podle popisu v tomto příkladu výše. Skupiny K (5 samců) a L (4 samice) se léčí 3 dny přípravkem U40 lidského inzulinu ultralente, který má 2,5 mg/ml zinku. Skupiny M (5 samců) a N (5 samic) se léčí 3 dny přípravkem U40 hovězí-prasečí PZI'insulin (PZI). Každá krysa dostává denní injekce formulace své skupiny po 3 dny před stanovením hladiny glukózy v krvi a v den stanovení hladiny glukózy v krvi.

Krev se, odebere půl hodiny před podáním , testovaných formulací. Zvířatům se podá subkutánně buď 0,9 j./ΙΟΟ g tělesné hmotnosti (samci) nebo 1,1 j./ΙΟΟ g tělesné hmotnosti (samice) v 11 hodin .30 minut dopoledne. Krev se odebere říznutím do ocasu (bez anestezie), krátce se uloží na led, odstředí Se a stanoví se hladina glukózy za použití glykózového analyzátoru Beckman II. Vzorky krve

-120• · ·· ·· • 4 4 4 * • 4 4 · · • 4 4 4 4» • 4 · 4 · ·· ·· ·· ♦· 44 • · «φφ·

4 4 4 4 «

4·44· 44 4

4 4 4 4

44 44 se získají těsně před podání testovaných formulací a 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 a 24 hodin po podání. Krystalová formulace podle předloženého vynálezu řídí hladinu glukózy v krvi po dobu srovnatelnou s dobou naměřenou pro přípravky dlouhodobě působícího.inzulinu.

Příklad 4

Doba působení krystalů u krys kusů krys BBDP/Wor [13 samců/13 samic, věk 4 až 5 měsíců, udržované na dlouhodobě působícím inzulinu (PZI)], se náhodně rozdělí podle pohlaví na 4 experimentální skupiny., O, P, Q a R. Skupiny O (8 samců) a P (8 .

samic) se léčí 3 dny krystalovou formulací podle předloženého vynálezu podle popisu v tomto příkladu 2. Skupiny Q (5.samců) a R (5 samic) se léčí 3 dny přípravkem U40 hovězí-prasečí PZI insulin (PZI). Každá krysa dostává denní injekce formulace své. skupiny po 3 dny před stanovením hladiny glukózy v krvi a v den stanovení hladiny glukózy'v krvi.

Krev se odebere půl hodiny před podáním testovaných formulací. Zvířatům se podá subkutánně buď 0,9' j./100 g tělesné hmotnosti (samci) nebo 1,1 j./100 g

J tělesné hmotnosti (samice) v 11 hodin 30 minut dopoledne. Krev se odebere říznutím do ocasu (bez anestezie), krátce se uloží na led, odstředí se a stanoví' se hladina glukózy za použití glykózového analyzátoru Beckman II. Vzorky krve se získají.těsně před podání testovaných formulací a 2, 4,

6, 8, 12, 16, 20 a 24 hodin po podání. Krystalová formulace podle předloženého vynálezu řídí hladinu glukózy v krvi po dobu srovnatelnou s dobou naměřenou pro přípravky

- 121 -

• to ··· · tototo · • · · · > · • * • to • to ·· dlouhodobě působícího inzulinu.

Příklad 5

Test amorfní sraženiny B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu na psech

Doba působení formulace obsahující amorfní sraženinu protaminu a B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu, připravená podle popisu v přípravě 43 se stanoví na 2 normálních psech (2 nmol/kg, subkutánně). Psům se podává konstantní infuze somatostatinu, aby se vytvořil přechodný diabetický stav. Data se srovnají s daty . získanými na stejném modelu po podání lidského inzulinu ultralente (3 nmol/kg, n = 5) a fyziologického roztoku (n = 6)·.

Experimenty se provádějí na samcích a samicích psů bígl, kteří hladoví přes noc, mají chron,icky zavedenu kany.lu, jsou při vědomí a mají hmotnost 10 až 17 kg (Marshall Farms, Nosth Rose, NY). Přinejmenším 10 dní před studií se zvířata anesťetizují isofluranem (Anaquest, Madison, WI) a do femorální arterie a femorální vény se zavedou silikonové katetry (V-A-P™, Access Technologies, Norfolk Medical, Skokie, IL).připevněné na cévní přístupové brány. Katetry se naplní roztokem glycerol/heparin (3:1, objem/objem, konečná koncentrace heparinu 250 kmez.j./ml, glycerol od firmy Sigma Chemical Co., St. Louis, MO a heparin od firmy ElkinšSinn, Tne., Cherry Hill, NJ), aby se zabránilo uzavření katetru a rány se uzavřou. Preoperativně se podává Kefzol (Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN) (20 mg/kg i.v. a 20 mg/kg i.m.) a pooperativně Keflex (2.50 mg, p.o. 1-krát denně po 7 dní) ,

-122 φ Φ φ • · φ φ φφφφ φφ φφ φφφ · φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ · aby se zabránilo infekcím. Pooperativně se pro zvládání bolesti podává Torbugesic (1,5 mg/kg i.m.)..

Těsně přede dnem studie se odebere krev,' aby se určil .zdravotní stav zvířete. Použita byla pouze zvířata s hematokrity nad 38% a počty leukocytů pod 16 000/ml (hematologický analyzátor: Cell-Dyn 900, SequoiaTurner, Mountain View, CA).

Ráno v den experimentu se cévní přístupové brány zpřístupní (Access-Technologies, Norfolk Medical, Skokie, IL), obsahy katetru se odsají a katetry se propláchnou fyziologickým roztokem (Baxter Healthcare Corp.,'

Deerfield, IL), pes se umístí do klece a na trubice přístupové brány se připojí prodloužené trubice (chráněné řetízkem z nerezové oceli a připojené na otočný čep [Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA]).·

Psi se před odebráním vzorku arteriální krve ke stanovení koncentrace inzulinu a glukózy v krvi nalačno nechají přinejmenším 10 minut aklimatizovat na.prostředí kleci (čas = -30 minut). V tomto čase se začne podávat kontinuální i.v. infuze cyklického.somatostatinu (0,65 . pg/kg/min, BACHEM California, Torrance, CA) a pokračuje se dalších 30,5 hodin. 30 minut po započetí infuze (čas = 0 minut) se odebere vzorek arteriální krve a do dprzální částí krku se podá subkutánní bolus testované látky nebo nosiče. Vzorky arteriální krve se odebírají každé 3 hodiny poté, co se stanovily koncentrace plasmatické glukozý a plasmatického inzulinu.

Vzorky arteriální krve se shromáždí ve vakuových zkumavkách na sbírání krve obsahujících dvousodnou sůl

-123 • tt ·· • tttt • · ·· • tt

EDTA (Terumo Medical Corp., Elkton, MD) a ihned se umístí do ledu. Vzorky se odstředí a výsledná plasma s přenese do polypropylenových zkumavek a po dobu trvání se skladuje na ledu.

Plasmatické koncentrace glukózy se stanoví v den provedení studie za použití glukóza oxidázové metody na analyzátoru glukózy Beckman (Beckman Instruments, lne.,. Brea, CA). Vzorky pro jiná stanovení se skladují při teplotě -80 °C do .doby analýzy. Koncentrace inzulinu se stanoví za použití radioimunologického stanovení s dvojitými protilátkami.

Na závěr experimentu se katetry propláchnou čerstvým fyziologickým roztokem, ošetří se přípravkem Kefzol (20 mg/kg) a naplní se směsí glycerol/heparin a perorálně se podá antibiotikum (Keflex, 250 mg). K minimalizaci počtu.použitých zvířat a pro umožnění párování datového základu se, tam, kde to je možné, zvířata podrobí studii vícekrát. Experimenty na zvířatech, která se již studie účastnila se provádějí s odstupem nejméně 1 týden.

Formulace amorfní sraženiny B29-N.-eta-oktanoyl-lidského inzulinu připraveného podle výše uvedeného popisu, poskytuje účinné řízení hladiny glukózy v krvi po téměř 27 hodin, ve srovnání s asi 21 hodinami u lidského inzulinu ultralente. Sraženina poskytuje významně plošší a více prodloužené řízeni hladin glukózy v, krvi než lidský inzulin ultralente. Například nejnižšího bodu koncentrace glukózy v krvi se u sraženiny dosáhne po 1,5 hodině a poté hladina glukózy v krvi vzroste na celkem konstantní úroveň. Pro.srovnání,, nejnižšího bodu • · ·« · * · * ·· · · ···« ···· ♦»»· * ··« ·. ·· · · ·· · i ÓA ♦·♦·♦·· ··· · · » · ♦

- ΧΖΗ - ··········· ·· 99 99 99 99 99 koncentrace-glukózy v krvi se u lidského inzulinu ultralente dosáhne po 9 hodinách a poté hladina glukózy v krvi vzrůstá relativně rychle. Nejnižší hladina glukózy je u formulace sraženiny derivovaného inzulinu 720 mg/litr, zatímco u formulace ultralente je 560 mg/litr. Konečně hladiny plasmatického inzulinu tato pozorování potvrzují a dobře korelují s plošším, a delším průběhem účinku v čase u amorfní sraženiny B29-N-eta-oktanoyl-lidského_>inzulinu ve srovnání s lidským inzulínem ultralente.

Příklad 6

Test mikrokrystalů B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu na psech

Glukodynamika dvou formulací Obsahujících krystaly B29-N-eta-oktanoyl-lidského inzulinu připravených podle popisu v přípravě 19 nebo v podstatě podle popisu v přípravě 19 se stanoví na normálních psech za použití v podstatě téhož protokolu, který je popsán v příkladu 5. Jeden ze dvou přípravků mikrokrystalů se podá každému psovi v dávce 2 nmol/kg subkutánně. Experimenty se provádějí při 3 různých příležitostech. Data z těchto 3 experimentů se spojí. Celkem 10 psů dostane dávku.2 nmol/kg jednoho ze dvou přípravků. V odděleném experimentu se subkutánně každému z 5 psů v dávce 3’ nmol/kg podá formulace mikrokrystalů B2 9-N-eta-,oktanoyl-lidského inzulinu připravená v podstatě podle popisu v přípravě 19. Lidský fl inzulín NPH (2 nmol/kg, n = 5) a nosič tvořený fyziologickým roztokem (n = 5) slouží jako. kontroly. V každém experimentu dostávají psi konstantní infúzi somatostatinu, aby se vytvořil přechodný diabetický stav.

-125-

• toto to to • · toto• to • to · ·· · ·· ·

Formulace mikrokrystalů obsahující B29N-eta-oktanoyl-lidský.inzulin podaná v dávce 2 nmol/kg má dobu účinku 27 hodin ve srovnání s 21 hodinami pro lidský inzulin NPH ve stejné dávce. Glukodynamický profil vykazuje menší hypoglykemický sklon než lidský inzulin NPH, který je ve výhodné kvalitě. Mikrokrystaly obsahující B29-N-eta-óktanoyl-lidský inzulin řídí účinně v dávce 3 nmol/kg hladiny glukózy přinejmenším po dobu.30 hodin. Při nejnižší hladině glukózy se·po podání lidského inzulinu NPH (jmenovité asi 650 mg/litr)získaji. přibližně stejné hladiny glukózy. Trvání takového poklesu hladin glukózy však je pro mikrokrystaly obsahující B29-N-eta-oktanoyl-lidský inzulin mnohem kratší (asi 3 hodiny) ve srovnání s lidským inzulínem NPH (asi 7,5 hodiny). Po dosažení minimální koncentrace glukózy kolísají hladiny glukózy u skupiny, která dostává mikrokrystaly obsahující B29-N-eta-oktanoyl-lidský inzulín, během 30 hodin pouze mezi >

910 a 1150 mg/litr, po kteréžto době nejsou žádné další údaje dostupné. Naproti tomu hladiny glukózy ve skupině, která dostává lidský inzulín NPH v dávce 2 nmol/kg, kolísají po dosažení nejnižší hladiny od 890 do 1 450.

Příklad 7

Test mikrokrystalů B29-N-eta-hexanoýl-lidského inzulin na psech

Glukodyn.amika dvou formulací obsahujících krystaly B29-N-eta-hexanpyl-lidského inzulinu připravených podle popisu v přípravě 16 se stanoví na normálních psech za použití.v podstatě téhož protokolu, který je popsán v příkladu' 5. Formulace mikrokrystalů obsahujících B29-N-eta-hexanoyl-lidský inzulin podaná v

-126·· ·· 99 99

9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9

9 9 ··· · 9 9 9

9 9 9 9 9 · ·· »· ·» ·· • · 4 • · « ·· ·· dávce 2 nmol/kg má dobu.účinku 24 hodin ve srovnání s 24 hodinami pro lidský inzulín NPH-ve stejné dávce. Glukodynamický profil je plošší a vykazuje menší hypoglykemický sklon než lidský inzulín NPH.- Při nejnižší hladině glukózy se po podání lidského inzulinu NPH (jmenovitě asi 670 mg/litr proti 640 mg/litr pro lidský inzulín NPH) získají přibližně stejné hladiny glukózy. Trvání takového poklesu hladin glukózy však je pro mikrokrystaly obsahující B29-N-eta-hexanoyl-lidský inzulín mnohem kratší (asi 3 hodiny) ve srovnání s lidským inzulínem NPH (asi 7,5 hodiny).

Principy., výhodná ztělesnění a způsoby provedení předloženého vynálezu jsou popsány v předcházejícím popisu. Vynález, který zde má být chráněn, však nemá být vykládán jako omezený na jednotlivé formy zde zveřejněné, protože ty mají být považovány pouze za ilustrativní spíše než restriktivní. Variace a změny může odborník V oboru provést, aniž by se vzdálil duchu vynálezu.

Claims (81)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Mikrokrystal,· vyznačující s e t í m, že obsahuje: 4

   a) derivovaný protein zvolený ze skupiny sestávající z derivovaného inzulínu, derivovaných analogů inzulinu a derivovaných proinzulínů.

   b) komplexující sloučeninu,

   c) sloučeninu stabilizující hexamer a

   d) kationt dvoumocného kovu.

   <te>
2. 2. Mikrokrystal podle nároku 1, vyznačující se t i m, že komplexující sloučeninou je protamin, který je přítomen v množství asi 0,15 mg do asi 0,5 mg na 3,5 mg derivovaného proteinu.
3. 3. Mikrokrystal podle nároku 2, vyzná, čující se tím, že kationtem dvoumocného kovu'je zinek, který je přítomen v množství asi 0,3 molu do asi 0,7 molu na mol derivovaného proteinu.
4. 4. Mikrokrystal podle nároku 3, vyznačující se tím, že sloučeninou stabilizující hexamer' je fenolické konzervans, zvolené ze skupiny sestávající z fenolu, m-kresolu, o-kresolu, p-kresolu, chlorkresolu, methylparabenu a jejich směsi, a je přítomno, v dostatečném množství -s ohledem na derivovaný protein, k usnadnění tvorby konformace R6 hexámeru.

   -1284 4 · · • · · 9

   9 9 44

   9 9 9 9

   9 4 4 · «4 4 4 • 4 4 ·

   4 4« 4
5. 5. Mikrokrystal podle nároku 4, vyznačující se tím, že derivovaným proteinem je acylovaný protein zvolený ze skupiny sestávající z acylovaného inzulínu a acylovaných analogů inzulínu.
6. 6. Mikrokrystal podle nároku 5, vyznačující se /

   tím, že derivovaným proteinem je inzulín acylovaný mastnou kyselinou.
7. 7. Mikrokrystal podle nároku 6, vyznačuj ícíse t í m, že derivovaným proteinem je inzulín,.který je acylován nasycenou mastnou kyselinou s přímým řetězcem.
8. 8. Mikrokrystal podle nároku: 7, vyznačující se Z tím, že derivovaným proteinem je inzulín, který je monoacylován na LysB29-N-eta-aminoskupině inzulínu.
9. 9. Mikrokrystal podle nároku 8, vyznačující se tím, že derivovaný protein je acylován mastnou kyselinou zvolenou ze skupiny sestávající, z kyseliny n-hexanové, kyseliny n-heptanové, kyseliny n-oktanové, kyseliny n-nonanové a kyseliny n-dekanové.
10. 10. Mikrokrystal podle nároku 9, vyznačuj ící se t í m, že derivovaný protein je zvolen ze skupiny sestávající z B29-N-eta-hexanoyl-lidského inzulínu, B29-N-eta-oktanoyl-lidského.inzulinu a B29-N-eta-dekanoyl-lidského inzulínu.
11. 11. Mikrokrystal podle nároku 8, vyznačuj í c i se t í m, že derivovaný protein je acylován mastnou kyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z kyseliny n-dodekanové, kyseliny n-tetradekanové a kyseliny

    -129 n-hexadekanové.
12. 12. Mikrokrystal podle nároku 7, v y z. n a č u j ící s e ť i m, že mastnou kyselinou acylovaným inzulínem je diacylovaný inzulín, který je acylován na LysB29-N-eta-aminoskupině a je také .acylován na jednom N-konci N-alfa-aminoskupiny a mastná kyselina je zvolena ze skupiny sestávající z kyseliny n-hexanové, kyseliny n-heptanové, kyseliny n-oktanové, kyseliny.n-nonanové a kyseliny n-dekanové.
13. 13. Mikrokrystal podle nároku 6, vyznačující se t í m, že derivovaným proteinem je inzulín, který je acylován nasycenou mastnou kyselinou s rozvětveným řetězcem.
14. 14. Mikrokrystal podle nároku 13, vyznačuj ící se t i m, že nasycená mastná kyselina s rozvětveným řetezcem má ve své nej delší větvi od 3 do 10' atomů uhlíku.
15. 15. Mikrokrystal podle nároku 5, vyznačující se t i m, že derivovaným proteinem je analog inzulínu acylovaný mastnou kyselinou.
16. 16. Mikrokrystal podle nároku 15, vyznačující se t í m, že derivovaným proteinem, je analog inzulínu,. který je acylován nasycenou mastnou kyselinou s přímým řetězcem.
17. 17. Mikrokrystal podle nároku 16,’ vyznačuj ící se t i m, že derivovaný protein je monoacylován na N-eta-aminoskupině.

    • ft

    -130• · ftft • ♦ · · · a ft · ·· ·· • · » o ft · · ftft·· ·· •· ftft wft ftft ftft ftft • ft ft · « · • · » · ft a ·»·♦· ·· · • · . · · · ♦ · ·· ··
18. 18. Mikrokrystal podle nároku 1/7, vyznačuj ící setím, že derivovaný protein je acylován mastnou kyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z kyseliny n-hexanové, kyseliny n-heptanové, kyseliny n-oktanové, kyseliny .n-nonanové a kyseliny n-dekanové.
19. 19. Mikrokrystal podle nároku 18, vyznačuj ící se t i m, že derivovaný protein je zvolen ze skupiny sestávající ze zvířecích inzulínů acylovaných mastnou kyselinou, analogů monomerního inzulínu acylovaných mastnou kyselinou, analogů s chybějícími aminokyselinami acylovaných mastnou kyselinou a analogů, inzulinu s posunutým pí acylovaných mastnou kyselinou.
20. 20. Mikrokrystal podle nároku 19, vyznačuj i o i se ti m, že derivovaným proteinem je analog des(B30)-lidského inzulinu acyiovaný mastnou kyselinou, analog

    LysB28,ProB29-lidského inzulinu acyiovaný mastnou Z kyselinou nebo analog AspB28-lidského inzulínu.acyiovaný mastnou kyselinou.
21. 21. Mikrokrystal podle nároku‘20,. vyznačuj ící se t i m, že derivovaným proteinem je analog des(B30)' Z

    -lidského inzulínu acyiovaný mastnou kyselinou.
22. 22. Mikrokrystal podle nároku 17, vyznačuj ící •se tím, že derivovaný protein je acylován mastnou kyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z kyseliny n-dodekanové, kyseliny n-tetradekanové a kyseliny n-hexadekanové.
23. 23. Mikrokrystal podle nároku 22, vy znač. uj ící se t í m, že derivovaný protein je zvolen ze skupiny • · tt

    -131 « · ·· ««I ·· · · « ·· » · · · * · « · • · tttt ···· ··· • tttt tttttt · ···«· ·· • tttttt tttt · tt tttttt tt · tt tt ·'· tttt · * tttt sestávající ze zvířecích inzulínů acylovaných mastnou kyselinou, analogů monomerníhó inzulínu acylovaných mastnou kyselinou, analogů s chybějícími aminokyselinami /

    'acylovaných mastnou kyselinou a analogů inzulinu s’ posunutým pl acylovaných mastnou kyselinou.
24. 24. Mikrokrystal podle nároku 23, vyznačuj ící se t i m, že derivovaným proteinem je analog des(B30)-lidského inzulínu acylovaný mastnou kyselinou, analog' LysB28,ProB29-lidského inzulínu acylovaný mastnou kyselinou nebo analog AspB28-lidského inzulinu acylovaný mastnou kyselinou.
25. 25. Mikrokrystal podle nároku 24, vyznačuj ící se t i m, že derivovaným proteinem je analog des(B30)-lidského inzulínu acylovaný mastnou kyselinou.
26. 26. Mikrokrystal podle nároku 25, vyznačuj ící s. e t i m, že derivovaným proteinem je analog B29-N-eta-myristoyl-des.(B30)-lidského inzulinu.
27. 27. Mikrokrystal podle nároku 26, vyznačuj ící se t. í.m, že derivovaným proteinem je analog B28-N-eta-myristoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulínu. *
28. 28. Mikrokrystal podle nároku 15, vyz.načující Se .tím, že derivovaným proteinem analog inzulínu, který je acylován nasycenou mastnou kyselinou s rozvětveným řetězcem.

    '29. Mikrokrystal podle nároku 28, vyznačuj ící se t i m,. že nasycená mastná kyselina s rozvětveným, řetězcem má ve své nejdelší větvi'od 3 do 10 atomů uhlíku.

    I • 4 44 4 4 4 · · * 4 ·

    4 44 C«>4 4 44444 44 4

    4444 4 4. · 4444

    -13230. Mikrokrystal podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že mikrokrystal má tyčinkovitou morfologii.

    ' í
29. 31. Mikrokrystal podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že mikrokrystal má nepravidelnou morfologii.
30. 32. Suspenzní formulace obsahující nerozpustnou fázi a a fázi roztoku, vyznačuj ící se t í m,že nerozpustná fáze je složena z mikrokrystalů podle nároku 1 a fáze roztoku je složena z vody.
31. 33. Suspenzní formulace podle nároku 32, vyznačující se t í m, že nerozpustná fáze·se skládá z mikrokrystalů podle nároku 2.
32. 34. Suspenzní formulace podle nároku 33, vyznačující se tím, že fáze roztoku se dále skládá z fenolického konzervancia v koncentraci asi 0,5 mg na ml až asi 6 mg na ml roztoku a farmaceuticky přijatelný pufr a isotonizační činidlo.
33. 35. Suspenzní formulace podle nároku 34, vyznačující se tím, že fáze roztoku dále zahrnuje inzulin, analog inzulinu, acylovaný inzulin nebo acylovaný analog inzul/nu. ,
34. 36. Suspenzní i formulace podle nároku 35, vyznačující se t í m, že fáze roztoku se skládá z inzulínu.
35. 37. Suspenzní formulace podle nároku 35, vyznačující se tím, že fáze roztoku se skládá z analogu inzu l/nu.

    • · • ·· ·

    -133
36. 38. Suspenzní formulace podle nároku 37, v y z n a č uz jící s e t í m, že analogem inzulínu j-e analog monomerního inzulínu. ..
37. 39. Suspenzní formulace podle nároku 38, v y z n a č ující se tím, žé analogem inzulínu je

    LysB28,ProB29-lidský inzulín.
38. 40. Suspenzní formulace podle nároku 32, vyznač ující se tím, že fáze roztoku se dále skládá ze zinku a protaminu, kde poměr zinku k derivovanému, proteinu v suspenzní formulaci je od asi 5 do asi 7 molů atomů zinku na mol derivovaného proteinu a poměr protaminu k derivovanému proteinu v suspenzní formulaci je od asi 0,25 mg do asi 0,5 mg na mg derivovaného proteinu.
39. 41. Způsob přípravy mikrokrystalu podle nároku 1, vyznačující setím, že zahrnuje:

    a) rozpuštění derivovaného proteinu, sloučeniny stabilizující hexamer a katinotu dvoumocného kovu ve vodném rozpouštědle, které má hodnotu pH takovou, že umožní tvorbu hexamerů derivovaného proteinu a

    b) · přidání komplexující sloučeniny.
40. 42. Způsob přípravy mikrokrystalu podle nároku 1, vyznačující se t i m, že zahrnuje:

    a) rozpuštění derivovaného proteinu, sloučeniny stabilizující hexamer a katinotu dvoumocného kovu ve vodném rozpouštědle, které má hodnotu pH takovou, že • φ · φ Φ · • φ · · · Φ φ φ · · φ Φ ··«*·· «Φ φ « φφφ φ φ φ φ φ · ·

    - 134neumožní tvorbu hexamerů derivovaného proteinu a

    b) upravení hodnoty pH na hodnotu mezi asi 6,8 a asi 7,8 a

    c) přidání komplexující sloučeniny.
41. 43. Způsob léčení diabetů, vyznačující se.

    tím, že zahrnuje podávání formulace podle nároku 32 í

    pacientovi, který to potřebuje a v množství dostatečném k regulaci hladin glukózy v krvi u pacienta.
42. 44. Amorfní sraženina vyznač, ující se tím, že obsahuje:

    a) derivovaný protein zvolený ze skupiny sestávající z derivovaného inzulínu, derivovaných analogů inzulinu a derivovaných proinzulfnů,

    b) komplexující sloučeninu,

    c) sloučeninu stabilizující hexamer a

    d) kation dvoumocného kovu.
43. 45. Amorfní sraženina podle nároku 44, vyznačuj íc i s e tím, že komplexující sloučeninou je protamin, který je přítomen v množství od asi 0,15 mg do asi 0,5 mg na 3,5 mg derivovaného proteinu.
44. 46. Amorfní sraženina podle nároku 45, vyznačuj íc í se t i m, že kationtem.dvoumocného kovu je zinek, který je přítomen v množství od asi 0,3 molu do asi 0,7 molu na mol derivovaného proteinu.

    -135
45. 47. Amorfní sraženina podle nároku 46, vyznačuj ίο i se t i m,. že sloučeninou stabilizující hexamer je fenolické kónzervans, zvolené ze skupiny sestávající z fenolu, m-kresolu, o-kresolu, p-kresolu, chlorkresolu, methylparabenu, a jejich směsi, a je přítomno v dostatečných množstvích s ohledem na-derivovaný protein, k usnadnění tvorby konformace R6 hexameru.
46. 48. Amorfní sraženina podle nároku 47, vyznačující se t i m,'že derivovaným proteinem je acylovaný protein zvolený ze skupiny sestávající z acylovaného inzulínu a acylovaných analogů inzulinu.
47. 49. Amorfní sraženina podle nároku 48, vyznačuj íx c i se t i m, že derivovaným proteinem je inzulín acylovaný mastnou kyselinou. .
48. 50. · Amorfní sražénina podle nároku 49, vyznačuj íz c i se t i m, že derivovaným proteinem je inzulín, který je aeylován nasycenou mastnou kyselinou s přímým řetězcem.
49. 51. Amorfní sraženina podle nároku 50, vyznačuj í* cí se t í m, že derivovaným proteinem je inzulín, který je monoacylován na'LysB29-N-eta-aminoskupině inzulínu.
50. 52. Amorfní sraženina podle nároku 51, vyznačuj íi c í se t í m, že derivovaný protein je aeylován mastnou kyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z kyseliny n-hexanové, kyseliny n-heptanové, kyseliny n-oktanové, kyseliny n-nonanové a kyseliny n-dekanové.

    ·· to · · · • · · • · ·♦ • ·· • ·· ·· ··

    -13653. Amorfní sraženina podle nároku 52,. v y z n a> č u j Ιοί s e t í'm, že derivovaný protein je zvolen ze skupiny sestávající z B29-N-eta-hexanoyl-lids.kého

    Z z · inzglinu, B29-N-eta-oktanoyl'-lidskeho inzulínu z

    a B29-N-eta-dekanoyl-lidského inzulinu.
51. 54. Amorfní sraženina podle nároku 51, vyznačuj ίο í se t i m, že derivovaný protein je acylován mastnou kyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z kyseliny . n-dodekanové, kyseliny n-tetradekanové a kyseliny .n-hexadekanové.
52. 55. Amorfní sraženina podle nároku 50, v y z n a č u j íc í se t i m, že mastnou kyselinou acylovaným inzulínem, je diacylovaný inzulin, který je acylován na LysB29-N-eta-aminoskupině a je také acylován na jednom N-konci N-alfa-aminoskupiny a kde mastná kyselina je zvolena ze skupiny sestávající z kyseliny ή-hexanové, kyseliny n-heptanové, kyseliny n-okťanové, kyseliny n-nonanové a kyseliny n-dekanové.
53. 56. Amorfní sraženina podle nároku 49, vyznačuj í* c í se t í m, že derivovaným proteinem je inzulín, který je acylován nasycenog mastnou kyselinou s rozvětveným řetězcem.
54. 57. Amorfní sraženina podle nároku 56, vyznačuj ίο i' se t í m, že nasycená mastná kyselina s rozvětveným řetezcem má ve své nejdelší větvi,od 3 do 10 atomů uhlíku.

    to
55. 58. Amorfní· sraženina podle, nároku 48, vyznačuj ίο í s e t í m, že derivovaným proteinem je analog.

    -137• · «· · · ·· ·· ·· * · · · » ♦ · · · · · » • · ·· · · · · · · · · • 9 · · 9 9 9 999 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

    99 99 99 99 99 99 inzulínu acylovaný mastnou kyselinou.
56. 59. Amorfní sraženina podle nároku 58, vyznačující se ti m, že derivovaným proteinem je analog inzulinu, který je acylován nasycenou mastnou kyselinou s přímým řetězcem.
57. 60. Amorfní sraženina podle nároku 59, vyznačující se ti m, že derivovaný protein je monoacylován na N-eta-aminoskupině..
58. 61. Amorfní sraženina podle nároku 60, vyznačující se t i m, že derivovaný protein je acylován mastnou kyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z kyseliny n-hexanové, kyseliny n-heptanové, kyseliny n-oktanové, kyseliny n-nonanové a kyseliny n-dekanové..
59. 62. Amorfní sraženina podle nároku 61, vyznačující se tím, .že derivovaný protein je zvolen, ze skupiny sestávající ze zvířecích inzulínů acylovaných mastnou kyselinou, analogů monomerního inzulínu acylovaných mastnou kyselinou, analogů s chybějícími aminokyselinami acylovaných mastnou kyšelinou á analogů

    Z inzulínu s posunutým pl acylovaných mastnou kyselinou.
60. 63. Amorfní sraženina podle nároku 62, vyznačující se tím, že derivovaným proteinem analog des(B30)-lidského inzulínu acylovany, mastnou kyselinou, analog LysB28,ProB29-lidského inzulinu acylovaný mastnou kyselinou nebo analog AspB28-lidského inzulinu acylovaný mastnou kyselinou.
61. 64. Amorfní sraženina podle nároku 63, vyznačuj 1• · proteinem je analog •tt tttt · · ·· ·· • tt tt · · · tttt tt · tttt tt tt · tttt tttttttt tttttttt • tttt ··· tttttttt·· tttt · tttttttt tttt · tttttttt ···· tttt tttt tttt tttt

    -138c í s e ,t í m, že derivovaným des(B30)-lidského inzulínu.
62. 65. Amorfní sraženina podle nároku 60, vyznačuj ίο i se tím, že derivovaný protein je acylován mastnou kyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z kyseliny n-dodekanové, kyseliny n-tetradekanové a kyseliny n-hexadekanové.
63. 66. Amorfní sraženina podle nároku 65, vyznačuj ίο i s e t i m,.že derivovaný protein je zvolen ze skupiny sestávající ze zvířecích inzulínů acylovaných • Z mastnou kyselinou, analogu monomerního inzulínu acylovaných mastnou kyselinou, analogů s chybějícími aminokyselinami acylovaných mastnou kyselinou a analogů inzulínů s posunutým pl acylovaných mastnou kyselinou.
64. 67. Amorfní sraženina podle nároku 66, vyznačuj ic i 'se t i m, že derivovaným proteinem je analog des(B30)-lidského inzulínu acylovaný mastnou kyselinou, analog LysB28,ProB29-lidského inzulínu acylovaný.mastnou kyselinou nebo analog AspB28-lidského inzulínu acylovaný mastnou kyselinou.
65. 68. Amorfní sraženina podle nároku 67, vyznačuj ίο i se t i m, že derivovaným proteinem je analog des(B30)-lidského inzulínu acylovany mastnou kyselinou.
66. 69. Amorfní sraženina podle nároku 68, v y zn a č u^j ίο i se t i m, že derivovaným proteinem je analog

    B29-N-eta-myristoyl-des (B30)-lidského .inzulínu.
67. 70. Amorfní sraženina podle nároku,69, vyznačuj í-139·· ·· ·· ·· ·· ·· • . · · · · · · · · 4 9 4

    4 · ·* ···· 9 9 4 4

    4 4 4 444 4 444 49 44 9

    9 9 9 4 4 4 4 4 4 4 4

    9 9 4 4 94 4 4 9 4 94 c í s e t í m, že derivovaným proteinem je analog y

    B28-N-eta-myristoyl-LysB28,ProB29-lidského inzulinu.
68. 71. Amorfní sraženina podle nároku 58, vyznačuj íc í se t í in, že derivovaným proteinem analog inzulínu, který je acylován nasycenou mastnou kyselinou s rozvětveným řetězcem.
69. 72. Amorfní sraženina podle nároku 71, vyznačující s e t í m, že nasycená mastná, kyselina s rozvětveným řetězcem má ve své nejdelší větvi od 3 do ÍO atomů uhlíku.
70. 73. Suspenzní formulace, obsahující nerozpustnou fázi a a fázi roztoku, vyznačující se tím, že nerozpustná fáze je složena z mikrokrystalů podle nároku 44 a fáze roztoku je složena z vody.
71. 74. Suspenzní formulace podle nároku 45, vyznačuj í c í s e t í m, že nerozpustná fáze se skládá z mikrokrystalů podle nároku 2.
72. 75. Suspenzní formulace podle nároku 41, vyznačující se t í m, že fáze roztoku se dále skládá z fenolického konzervancia v koncentraci od asi 0,5 mg na ml do asi 6 mg na ml roztoku, farmaceuticky přijatelného pufru á isotonizačního činidla.
73. 76. Suspenzní formulace podle nároku 75, vyznačující se t í m, že fáze roztoku se dále skládá z inzulínu, analogu inzulínu, acylovaného inzulínu nebo . ácylovaného analogu inzulínu.
74. 77. Suspenzní formulace podle.nároku 76, vyznaču-140·· ·· ·♦ ·· ·♦ ·· • · · · · ·· · · 9 9 » • · .99 9 9 9 9 · 9 · · • · · 9 · · 9 9 99 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

    99 99 99 99 99 99 jící se t í m, že fáze roztoku se.skládá z inzulinu.
75. 78. Suspenzní formulace podle nároku 76, vyznačující se t í m, žé fáze roztoku se skládá z analogu inzulínu.
76. 79. Suspenzní formulace podle nároku 78, v y z n a č u'jící setím, že analogem inzulínu je analog monomeřního inzulinu.
77. 80. Suspenzní formulace podle nároku 79, vyzná č ující se· t i m, že analogem inzulínu je LysB28, . ProB29-lidský inzulín. . .
78. 81. Suspenzní formulace podle nároku 73, vyznačující se t i m,.že fáze roztoku se dále skládá ze zinku a protaminu, kde poměr zinku k derivovanému proteinu v suspenzní formulaci je od asi 5 do asi 7 molů atomů zinku na mol derivovaného proteinu a poměr protaminu k derivovanému proteinu v suspenzní formulaci je od asi 0,25 mg do asi 0,5 mg na mg derivovaného proteinu.

    β
79. 82. Způsob přípravy amorfní sraženiny podle nároku 45, vyznačující se t í m, že zahrnuje:

    a) rozpuštění derivovaného proteinu, sloučeniny stabilizujíc! hexamer a katinotu dvoumoóného kovu ve vodném rozpouštědle, které má hodnotu pH takovou, že umožní tvorbu hexamerů derivovaného proteinu a

    b) přidání komplexující sloučeniny. . '

    44 44 • ·4 4

    4 4 44

    -141 4 4
80. 83. Způsob přípravy amorfní sraženiny podle nároku 45, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    a) rozpuštění derivovaného proteinu, sloučeniny stabilizující hexamer a kationtu dvoumocného kovu ve vodném rozpouštědle, které má hodnotu pH takovou, že neumožní tvorbu hexamerů derivovaného proteinu a

    b) upravení hodnoty pH na hodnotu mezi asi 6,8 a asi 7,8 a

    c) přidání komplexující sloučeniny.
81. 84. Způsob léčení, diabetů, vyznačující se t í m, že zahrnuje podávání formulace podle nároku Ί3. pacientovi, který to potřebuje, a v množství dostatečném k řízení hladin glukózy v krvi u pacienta.