DK155332B

DK155332B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af s-adenosylmethionin-derivater

Info

Publication number: DK155332B
Application number: DK349085A
Authority: DK
Inventors: Federico Gennari
Original assignee: Bioresearch Spa
Priority date: 1981-09-11
Filing date: 1985-08-01
Publication date: 1989-03-28
Also published as: PL238201A1; CA1213886A; AU8813582A; ES8403494A1; DK155332C; FI823142A0; NO153397C; NO153397B; PT75516A; FI74290B; RO85286A; DE3265425D1; CS241123B2; IL66713A0; FI823142L; EP0074555B1; ATE14884T1; JPS5857397A; US4558122A; YU204682A

Description

2

DK 155332 B

de en lige så stor eller større stabilitet, også ved forhøjede temperaturer, samt en større biotilgængelighed.

Ikke mindst dette sidste kendetegn gør det muligt at 5 fremstille farmaceutiske formuleringer til oral anvendelse, som er særdeles værdifulde inden for den humane terapi.

De omhandlede S-adenosylmethionin-derivater har den almene formel

K ]—S

i I. i ^3 /°00.

CH - S - CH- CE - CE „ n 7J

J—-M * <r °ei *2°y J' (III) . o ^ 10 hvori og som kan være ens eller forskellige, hver for sig er en lineær eller forgrenet alifatisk eller aromatisk acylgruppe indeholdende 2-12 carbonatomer, A er en ækvivalent af en uorganisk eller organisk syre, hvis pK-værdi er under 2,5 og n kan variere fra 1-5, 15 idet n fortrinsvis er 4.

Det har nu også vist sig, at stabiliteten af de hidtil ukendte forbindelser med formel III påvirkes væsentligt af antallet af syreækvivalenter, som er bundet til hvert molekyle. Mærmere bestemt gælder det, at den maksimale 20 stabilitet opnås, når n er 4.

i

DK 155332 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte S-adenosylmethionin-derivater, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

S-adenosylmethionin (SAM) vides at være en forbindelse, 5 som er til stede i alle levende organismer, og som deltager i et stort antal biologiske processer af fundamental betydning, eftersom SAM er den væsentligste donor for methylgrupper i organismen.

Det vides ligeledes, at SAM indtil 1975 ikke har haft 10 nogen praktisk anvendelse på grund af den extreme instabilitet.

Fra og med 1975 har der været offentliggjort et antal pa-tenskrifter (USA patentskrifterne nr. 3 893 999, 3 954 726 og 4 057 686) med relation til bestemte SAM-15 salte, som ganske uventet har vist stabilitetskarakteristika, der gør det muligt at fremstille farmaceutiske formuleringer til anvendelse inden for adskillige områder af den humane terapi.

Selv om man således har afklaret et af de negative aspekter 20 ved SAM, har disse salte imidlertid stadig ikke løst det andet problem, som er forbundet med dette produkt, nemlig dets lave kapacitet med hensyn til passage igennem celle-barrierer, som medfører, at organismen har vanskeligt ved at absorbere forbindelsen, i særdeleshed når denne 25 indgives oralt.

Med den foreliggende opfindelse er der nu tilvejebragt en fremgangsmåde til fremstilling af en hidtil ukendt klasse af forbindelser, som har den nedenfor viste almene formel III, og disse forbindelser har overraskende vist 30 sig at besidde en lige så høj grad af farmakologisk virkning som den, der er kendt fra SAM-saltene, og at besid-

DK 155332B

3

Det har også vist sig, at stabiliteten af de hidtil ukendte forbindelser med formel III påvirkes væsentligt af antallet af syreækvivalenter, som er bundet til hvert molekyle.

Nærmere bestemt gældet det, at den maksimale stabilitet 5 opnås, når n er 4.

1 den efterfølgende tabel 1 er anført stabilitetsdata for nogle af de hidtil ukendte forbindelser. Nærmere bestemt viser tabel 1 stabiliteten i tør tilstand (ved 45 °C) af visse SAM-acylderivater med formel III sammenlignet med SAM: 10 TABEL 1 ___Nedbrydning ved 45 °C efter___

Produkt 60 dage 120 dage 180 dage 240 dage 360 dage SAM H2S04 80 % 100 % 100* 100 * 100» SAM monoacetyl.

2 H2S04 (R2=H) 0 1,4 * 3 * 4,6 % 5,5 * SAM triacetyl.

2 H2S04 1 * 1,9 * 4,1 % 5,9 * 8 *

Som indledningsvis anført udmærker de hidtil ukendte produkter med formel III sig ved det overordentlig nyttige aspekt, der ligger' i deres evne til at kunne passere igen-15 nem cellebarrierer.

De i tabel 2 angivne værdier påpeger vigtige træk ved de nye produkter.

I det første forsøg, der er kendt som "intestinale sække" (in situ), blev 2 mg af hvert produkt, der skulle afprøves, 20 sammen med 1 ml af en fysiologisk opløsning anbragt i intestinale sække tilvejebragt i rotter under etherbedøvelse. Rotterne blev dræbt efter 2 timers forløb, og residualind-holdet af sækken (omgivende væg + indhold) blev analyseret.

DK 155332B

4 I det andet forsøg anvendtes tarmdele, hvis inderside var vendt udefter, inkuberet ved 37 °C i overensstemmelse med Krebs Ringer overfor en ekstern produktkoncentration på 1Θ"4 M.

5 Produkterne blev alle behandlet med H^SO^ til opnåelse af salte, hvori n er 3.

TABEL 2

Produktabsorption

Afprøvet i sække tarme med indersiden R R % af dosis , ,, , _____nmol/h/mq væg_ C0CH3 H 10 0,046 C0C4H9 H 18 0,028 p.tol

Sulfon H 13 0,021

Succinyl H 23 0,016

Glutaryl H 23 0,018

Octyl H 62 0,023

Dodecyl H 65 0,019 C0CH3 C0CH3 65 0,047 C0C4H9 C0C4Hg 87 0,031

Succinyl C0CH3 91 0,035

De hidtil ukendte forbindelser med formel III blev fremstillet som beskrevet i det følgende: 10 Udgangsmaterialet er et vilkårligt opløseligt SAM-salt, fortrinsvis sulfatsaltet.

Man fremstiller en opløsning af SAM-saltet i 1^0 på en sådan måde, at SAM-koncentrationen ligger på mellem 50 og 200 g/1, fortrinsvis på 100 g/1.

DK 155332 B

5

Man afkøler opløsningen til 1 °C, og mens man holder denne temperatur konstant ved afkøling, indstiller man PH -værdien til 7 ved anvendelse af 2 N natriumhydroxid.

Derefter når man frem som beskrevet i det følgende, af-5 hængigt af det derivat, som man ønsker at opnå: a) Monoacylderivater af alifatiske syrer med 2-6 car-bonatomer og aromatiske syrer:

Abyleringsmidlet (anhydridet eller chloridet af den ønskede syre) tilsættes i små portioner i et molforhold 10 på 1:1,2 i forhold til SAM, mens temperaturen holdes på 1 °C og pH holdes ved 7 ved tilsætning af 2 N natriumhydroxid.

Efter endt reaktion (dvs. når pH forbliver stabil) får temperaturen lov til at stige til 20 °C.

15 Opløsningen fortyndes til en koncentration på 20 g/1, og et eventuelt bundfald filtreres fra.

Omdannelsesgraden for SAM ved omdannelse til monoacylderi-vatet er større end 90 %.

Den således opnåede opløsning chromatograferes over en 20 ionbytterharpiks.

b) Monoacylderivater af alifatiske syrer med 7-12 car-bonatomer:

Chloridet af den ønskede syre opløses i et vandfrit opløsningsmiddel (acetone, DMFA, DMS0 eller lignende) i en 25 molær mængde på 1:3 i forhold til SAM til opnåelse af en 10 % opløsning, og denne tilsættes i små mængder, mens temperaturen holdes på 1 °C og pH holdes på 7 ved tilsætning af 2 N natriumhydroxid.

6

DK 155332 B

Når reaktionen er forløbet til ende, får temperaturen lov til at stige til 20 °C.

Opløsningen fortyndes til en koncentration på 20 g/1, og opløsningsmidlet afdampes under vakuum, hvorefter det dan-5 nede bundfald filtreres fra.

Omdannelsen til monoacyIderivatet andrager omkring 80¾ i dette tilfælde.

Den således opnåede opløsning chromatograferes over en ionbytterharpiks.

10 c) Triacylderivater af alifatiske syrer med 2-6 carbon-atomer og blandede syrer:

Acyleringsmidlet tilsættes i en molær mængde på mellem 1:5 og 1:10 i forhold til SAM, mens temperaturen hele tiden holdes på 1 °C og pH holdes på 7 ved tilsætning af 15 2 N natriumhydroxid.

Omdannelsen af SAM til triacetylderivatet er omkring 80¾.

Opløsningen fortyndes til en koncentration på 20 g/1, og 20 et eventuelt bundfald filtreres fra.

Den således opnåede opløsning chromatograferes over en ionbytterharpiks.

I alle de ovenfor beskrevne tilfælde anvender man en kolonne indeholdende en svagt sur ionbytterharpiks (AMBER-25 LITE IRC 50 eller CG 50) på H+-form, som forinden er vasket med H2O, idet man overholder de følgende operationspara- 7

DK 155332 B

metre: forholdet imellem diameteren og højden af harpiksfyldningen skal være 1:10; der påfyldes 20 g SAM-derivat pr. liter harpiks, og 5 strømningen skal være 1 kolonnevolumen pr. time.

Kolonnen vaskes derefter med 1 kolonnevolumen h^O og 1,0 N eddikesyre, indtil pH i eluatet er 3. Der vaskes med 20 mN svovlsyre, indtil elueringen af den resterende SAM og andre biprodukter er fuldstændig. Det ønskede produkt elue-10 res med 0,1 N svovlsyre (eller med en anden stærk syre, hvis man ønsker et andet salt).

Den således opnåede opløsning koncentreres under vacuum til 50 g/1.

Den koncentrerede opløsning filtreres med aktiveret træ-15 kul (1/10 af SAM-derivatet) og syresammensætningen indstilles til den ønskede støkiometriske værdi, hvorefter opløsningen lyofiliseres.

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler. EKSEMPEL 1 20 En mængde SAM-sulfat svarende til 1 kg SAM-ioner opløses i 10 liter vand og afkøles til 1 °C.

Ved hjælp af 2 N natriumhydroxid indstilles pH til 7, mens temperaturen holdes konstant ved cirkulationen af en kølevæske. 1

Mens temperaturen stadig holdes på 1 °C, tilsættes 285 liter eddikesyreanhdyrid over en periode på 1 time, og samtidig hermed holdes pH på 7 ved tilsætning af 2 N

8

DK 155332 B

natriumhydroxid.

Efter tilsætningen af eddikesyreanhydrid får pH-værdien lov at stabiliseres sig under samme temperaturbetingel-ser, hvorefter temperaturen får lov at stige til 20 °C, 5 Graden af omdannelse til monoacetyl-derivatet er 95¾. Reaktionsblandingen fortyndes med 20 liter destilleret vand.

Man fremstiller en kolonne indeholdende 50 liter AMBER-LITE IRC 50 ionbytterharpiks på H^-form, som forinden er 10 aktiveret med 100 liter 0,5 N svovlsyre og vasket indtil neutral reaktion.

Reaktionsblandingen ledes igennem denne kolonne med en hastighed på 50 liter/time.

Kolonnen vaskes med 50 liter destilleret vand. Man leder 15 en 0,1 N opløsning af eddikesyre (omkring 400 liter) igennem kolonnen, indtil pH-værdien af eluatet er 3.

Kolonnen vaskes med 50 liter 20 mN svovlsyre til elue-ring af de sidste spor af uomsat SAM. Derefter elueres kolonnen med 50 liter 0,1 N svovlsyre. Opløsningen kon-20 centreres under vakuum (30 mmHg, 35 °C) til et volumen på omkring 10 liter. Derefter behandles opløsningen med 50 g aktiveret trækul og filtreres.

Opløsningen titreres, og der tilsættes en mængde koncentreret svovlsyre, som er tilstrækkelig til at opnå et mo-25 lært forhold imellem SAM-monoacetyl og svovlsyre på 1:2, hvorefter opløsningen lyofiliseres.

Der opnås 900 g af saltet SAM-monoacetyl · 21^50^ · 0,5 h^Q, 9

DK 155332 B

huis sammensætning er følgende: - SAM-monoacetyl 68,3% - H2S04 30,3% - H20 1,4% 5 dette svarer til et udbytte på 61,3% med hensyn til SAM.

Når produktet analyseres ved højtryksvæskechromatografi (kolonne: PARTISIL 10 SCX, eluent: 0,1 M ammoniumformiat, pH 4, 20% methanol, strømningshastighed: 1 ml/min.), giver det et enkelt udslag med en retentionstid på 360 sekunder.

10 Produktet blev identificeret ved sine UV- og NMR-spektre med følgende resultater: UV-spektrum: ved pH 4: absorptionsmaksimum ved 258 nm med £= 14040 ved pH 1: absorptionsmaksimum ved 256 nm med £=.13500.

15 NMR-spektrum: ved 2 p.p.m.: singlet fra acetylgruppen ved 3 p.p.m.: singlet fra S-CH^-gruppen.

Produktet giver ikke nogen positiv respons ved nihydrin-testen, hvilket angiver en modifikation af aminosyregrup-20 pen.

Når det molære støkiometriske forhold indstilles til 1,5 eller 2,5 med hensyn til svovlsyren inden lyophiliserin-gen, opnås de følgende salte: - SAM-monoacetyl. 1,5H2S04· 0,5H20 25 - SAM-monoacetyl. 2,5H2S04· 0,5H20 10

DK 155332 B

Ved anvendelse af saltsyre eller methansulfonsyre i stedet for svovlsyre til elueringen af kolonnen opnås følgende salte: - SAM-monoacetyl. 3HC1. 0,5^0 3 - SAM-monoacetyl. 4HC1. 0,51^0 - SAM-monoacetyl. 5HC1. 0,5^0 - SAM-monoacetyl. 3CH^S0^H. 0,5^0 - SAM-monoacetyl. 4CH^S0-jH. 0,5^0 - SAM-monoacetyl. 5CH-jS0^H. 0,5H^D.

10 Alle disse salte har samme UV- og NMR-karakteristika som det ovennævnte produkt.

De analytiske data for disse salte fremgår af den følgende tabel:

n DK 155332 B

ε ο ο-

•Η “JI^-CVJOOOSiHacO'H

ι: lj.hoco'Olaonvoia

0¾ ^CMCMCMCMCMrHrHrH

•Η X LU CL

^ OsONOi-MCAOiHVO-sJ· 0 —I O PA i—ί M3 -Q Λ*»*'*'*'»*'·'·'*' c KN<tvovoNom.r^o\o

in ^ Η Η H

uJ U_

0?’tuovoiHr'-cMcM<)-cDiA C <J-CO'HlA'Hf'-rAiHVO

CP

2 ΓΛ<1·νθΌνθιΛΓ^θΝθ

ø i—i 1—I i—I -pH pH CM

JD

j, o'>voi'f'>cN'sr c''ima'' '—i ø oonopa'ooiaoo

"O

c vj-cvicvir-'Voirir-too

1—li—|i—1<—I Ή 1—1'—1'—I

Z C)_

°° ω r^OCALASOPACOr'-l'A

c ooocMoarAoo

2 vtrACMA-VOlArHOCA

ø ι—i »—I 1—1'—I Ή ιΗ Ή 1—i

XI

O O

CM CM O O O

X O X CM CM CM O O

LA CM LA X X X CM CM ^ X — LA LA lA X X

OlAO ·»·*· lA ΙΛ - O O o

4 O · OOO

LA la · · · CO . . · (Λ et 1A · · ·

• HiH CM ΓΑ ΓΑ 1—1'—li—t <t LA LO

h cd locntncjcjcjcntAtn •he cm <r cd cn ca cn m æ .h

Q.U i—IrHiHVOvOvOrHiHCM

EO OOOOOOOOO

LiJ Ci_ νθ\ΟΜ3Μ3νΟΜ3ΆΜ3Ά zzzzxxxxx r^coø"r^-coa\\oo<J· CMCMCMCMCMCMrA<J-<J· XXXXXXXXX Α-Α'Γ'Γ^-Γ^Γ'Οι—icm

i—! i—I ι—I rH pH i—I CM CM CM

CJUCJUCJ-OCJCJCJ

o o o o

CM CM CM CM O

X O X X X CM

LA CM LA LA LA X

·> X - OOO - - LA

OlAO CMCMCMOO —

- XXX O

• O ♦ LA iA LA · ·

<j- <t - - - X X

O *0000 PA fA X CA <J- CA O O PA

CM O CM· · 4 CA CA O

X CA X pH Ή pH PA PA CA

LA CMiAOOCJX X PA

-X-XXXCJCJX

rHCMCMPA<tlAPA<fC_) I—1 rH pH i—I pH i—I I—1 1—1 1—1 _μ.ρ.ί-).Ρ-Ρ4->4->-Ρ4-> (U 0003 13 03 03 03 03 0) cn ooouaoooo fHcococacDcacocarocn 03 000000000 -o ccccccccc

C OOOOOOOOO

•H eeeeeeeee X lllllll.il u sssxxszxxx O <<C<C<t<CC<£<C<£

U_ CACACACACACACACACA

EKSEMPEL 2 12

DK 155332 B

Proceduren fra eksempel 1- blev gentaget med den undtagelse, at man i stedet for eddikesyreanhydrid anvendte pro-pionsyreanhydrid, smørsyreanhydrid, hexanoylchlorid, 5 benzoylchlorid, p-toluensulfonylchlorid, ravsyreanhydrid- og glutarsyreanhydrid. Man opnåede de tilsvarende SAM-acylderivater, hvis analytiske karakteristika fremgår af den efterfølgende tabel:

13 DK 155332 B

E

to-d- rA co cd oo ia cr\ \o

, i—I CD CD CJN CD CT\ CJD

CM CM CM Ή <H ·—I r—f 6? x

—I CL

u

^ r-i-sJ-OCJNiArHiA

0 ia cm r^· ia cd md fA

τη*'·'*'*'’·*'*'

C -ς|· -et ΙΑ IA MD ΙΑ IA

yj ^ fH i—I i—I <H <—I i—f Ή 'O _p

Qj ΙΛ <t CD MD CO <J- l''

C lA CM MD cA OD MD IA

CO* r\ ** ~ ·" *n *> ^

£ <t <f ΓΑ ΙΑ Ό ΙΑ IA

ø r-H i-H i—li—ii—li—i i

XI

. OCOiAiAOlAr^- o] r^* <r o co ή on vo *Q «\ Λ **»»·*·% *»

C CM N '—I i—I·—I <-H *H

—p fp i—}i—} i—I *-H 1—ii—I i—I

“'"cu/AvoA-MDcorACD

c a. <)· cr\ co cd ex r- CTl »s vs r% «s #\ «s ij3 CSICSJi—IpHpHfHi—1

ø i—l i—I i—i —I Ή r—I i—I

XI

O CD O CD CD CD CD

CM IM Cs] CM CM CM CM

x x x x x nr x LA lA ΙΛ ΙΑ ιΑ LA ΙΛ «ν «« ·« ο κ rv ·« ο ο ο ο ο ο ο

-X

(0 .......

•ΗγΗ ΓΑ ΙΑ fA ΓΑ <}· ΙΑ ΓΑ f-ttu co to to to ud cn ud

•HE <j- <f <t LA VD MD

n pi rH i—I i—I i—I i—I i—I 1—I

EO CD CD CD CD CD CD CD

UJ (μ VO CO VO MD MD MD MD

Z Z Z Z Z Z Z

CD CM vO CD CS1 O CS|

ΙΑ ΙΑ ΙΑ ΙΑ ΙΑ ΙΑ IA

X X X X X X X

CO σ\ Ή csl cs] o\ o .

iH —I CM CM CM r-H CM

u cj u o · c_> ο a

CD

CM

X

LA

CD

a cm ο ο-οο

X CM CD O CM CM

la cd x cm co x x

*> CM LA X CM ΙΑ IA CD 1A ·» ΙΑ X

~ CD ^ CM CD CD

• CD O

<J- · ...

CD * * rH <t<J· to <t cd <r >> ο cd

CM CD CO CD C to CO

X CO CM CO 0 CM CM

CM CM X CM C— X X

X CM X i-l CM CM

• CM CM 3

r-H · CO

>^ · r-i · C I—I I—I

(U Cl—I >ϊ Ή GD >> D*' CO CD >> O Ds D C Pi

•H -H Pi C O r-| -H CO

ω o. >. ro n a o -u.

xq+jxc-pcjd c u η ω ω i n r-i •h a. x x x a. to cn

X I I I I I 1 I

P< x z z z z z z o <<<<<<<

u. (A UD CO CO CO CO CO

EKSEMPEL 3 14

DK 155332 B

Man fulgte den i eksempel 1 beskrevne procedure med den undtagelse, at man i stedet for eddikesyreanhydrid anvendte 1540 ml decanoylchlorid i omkring 15 liter acetone.

5 Ved reaktionens afslutning blev opløsningen fortyndet med 20 liter vand, og acetonen blev bortdampet under vakuum, hvorefter bundfaldet af fri syre. blev filtreret fra.

Idet man gik frem som beskrevet i .eksempel 4, opnåede man saltet 5AM-decanoyl. 2H2S0^. 0,5H20.

10 Når produktet analyseredes ved højtryksvæskechromatografi under' de i eksempel 4 beskrevne betingelser, viste det et enkelt udslag med en retentionstid på 340 sekunder.

Produktet udviste endvidere følgende UV-karakteristika: - ved pH 4: absorptionsmaksimum ved 258 nm med 8. 14040 15 - ved pH 1: absorptionsmaksimum ved 256 nm med £/13500.

Når man i stedet for decanoylchlorid anvendte octylchlorid og dodecylchlorid, opnåede man følgende produkter: - SAM-n-octyl. 2H2S04· 0,5H20 - SAM-n-dodecyl. 2H2S0^. 0,5H20.

20 De analytiske data for disse produkter fremgår af den efterfølgende tabel: 15

DK 155332 B

E

O

<r i—Ϊ

|| CM in ON

SS crs oor-

iH I Ή |H I—I

U1 ΟΧ CTv 0 i—I VO *—f XI ·> - ' -

C ΙΛ CM CM

D r-t r-i r-H

m u- SS X> ø ιΛ vO Ή

C <—I M3 CM

Dl ·>

0 1·^ CM CM

h «Η Ή r_· 0

XI

4J CO O VO

0 <3· —1 VO

XI " ~ ~

C i-H (H O

D Μ Ή Ή

Z CIS'S 4J

0 t—I 03 On C ιΛ O M3

Di *> ·* *·

0 «—I 1—1 CD

(-1 1—I * 1 * 1

0 XI

<j- <1- <r

JC i-t O >-t O Ή O

m o CM O CM o CM

•H rH VO X. VO _J VO -X

ί-10 ΖιΛΖιΑΖιΛ H S O - MJ- - 00 - d_ i-t <30 o- □ <r o E o x x x LU C*— ΙΛ · ΙΛ · Γ·« · .

CM ΙΑ CM ΓΛ CM ΙΛ cj tn o co o 10 o <r <3 cn

O O CM

in m x

CM CM CM

• X X

CM CM ·

rH

• · >>

0 i—I i—I O

CI3 >s >.0

rH 4J O X

ØD. ØO

X O XI XI

C I O I O I O

•ri C CM C CM C CM

XI I X t X I X

u 2: m 2: m z »n O '<·><" <c " u_ cn cd t n o cn □ EKSEMPEL 4 16

DK 155332 B

En mængde af et vilkårligt SAM-salt ækvivalent med 1 kg SAM-ioner opløses i 10 liter vand og afkøles til 1°C.

Opløsningens pH indstilles til 7 ved hjælp af 2 N natri-5 umhydroxid, mens temperaturen holdes konstant ved cirkulation af en kølevæske.

Temperaturen holdes stadig på 1°C, mens 1200 ml eddikesy-reanhydrid langsomt tilsættes over en periode på 2 timer.

Under tilsætningen holdes pH på 7 ved tilsætning af 2 N 10 natriumhydroxid.

Graden af omsætning til triacetyl-derivatet er 80¾.

Fra dette punkt og videre frem følges den i eksempel 1 beskrevne procedure.

Der opnås 720 g af saltet SAM-triacetyl. 2H2S04.0,5H20 15 med følgende sammensætning: - SAM-triacetyl 71,9¾ - H2S04 26,8¾ - H20 1,3¾ dette svarer til et udbytte på 51,8¾ med hensyn til SAM.

20 Når produktet analyseres ved højtryksvæskechromatografi under de i eksempel 1 angivne betingelser, udviser det et enkelt udslag med en retentionstid på 820 sekunder.

Produktet udviser endvidere følgende UV- og NMR-karakteris-tika:

DK 155332B

17 UV-spektrum: - ved pH 4: absorptionsmaksimum ved 258 nm med £= 14050 - ved pH 1: absorptionsmaksimum ved 256 nm med G = 13500 NMR-spektrum: 5 - ved 2 p.p.m.: singlet fra acetylgruppen i methionim - ved 2.2 p.p.m.: singlet sv arende til de 2 acetylgrojipper i ribose - ved 3 p.p.m.: singlet fra S-CH^-gruppen.

Hvis man anvender propionsyreanhydrid eller smørsyreanhy-10 drid i stedet for eddikesyreanhydrid, opnår man følgende produkter: - SAM-tripropionyl. 2H2S0^. 0,5H20 - SAM-tributyryl. 2H2S0^. 0,5H20.

De analytiske data for SAM-triacetyl-derivaterne er an-15 givet i den efterfølgende tabel: 18

DK 155332 B

£

O

-d-

^ CM CD CM

11 ON CO r- ^ - ^ bj o.

CM O Γ" “ rH <t r-

Ej ΓΑ CM <-{

t r—1 «—I **H

<*- -4-> 0 C LA ΓΛ ch S' -i * ^ ø ΓΑ CM Ή jQ i—i r—I i—i

-P

CD CD ΙΑ ΓΑ "C LA CD ΓΑ G ·> ~

-D Ή O O

ti— i—i i—i ‘—i 4->

CD

C Ή CD CM

C7> LA CO ΓΑ

CD

C-l ι-H O O

G i—I Ή i—I

-O

VO VO MD

CO i—i O Ή O Ή CD

*H ·—l O CM O CM O CM

p cd vo x vo x vox •HE Z la X LA X · ιΑ

CLUCM-CO^-d·-ε O KV O ΓΑ O <t O

bj b- X X X

r-i <t r- *

CM ΓΑ CM IA CM iA

CJ CO CJ CO CJ CO

<t -d· o

CD CO

CO CM

CM X

X » CM

CM >—1 >· • C O Ή ι—I O CM >»

>, -Η X U

CD 4-> Ω- IA >.

CO CD O - -P

i-H CJ bi O O

cd ca o. xi

Ό -Η -Η -H

c u o ih -d- u o

•H 4-1 CM 4-1 CD 4-> CM

XI IX I to IX

C-ι X ΙΑ X CM X IA

O < ~ < X <

Lu CO O CO CM CO O I

EKSEMPEL 5 19

DK 155332 B

Man følger den i eksempel 2 beskrevne procedure til opnåelse af reaktionsblandinger, der indeholder henholdsvis SAM-hexanoyl, SAM-benzoyl og SAM-succiny1.

5 Herefter tilsætter man, mens man holder temperaturen på 1 °C, 1000 ml eddikesyreanhydrid over en periode på 1 time, mens man holder pH på 7 ved tilsætning af 2 N natriumhydroxid. Den efterfølgende procedure følger den i eksempel 1 beskrevne procedure.

10 Man opnår følgende triacyl-derivater af blandet type: - SAM-hexanoyl-diacetyl. 2H2S0^. 0,5H20 - SAM-benzoyl-diacetyl. 2H2S0^. 0,5^20 - SAM-succinyl-diacetyl. 2H2S0^. 0,5H20 de analytiske data for disse derivater er angivet i den 15 efterfølgende tabel: i

20 DK 155332 B

E

o <r on r-' co •—i η r-~ r> r-- (—I i—i i—i o? x •-M Q.

UJ

On O O

4-) i—! i—i CM

DJ ·>

X) CM CM CM

C i—i i—I fH

O

LO U_ . o° 4-> DJ i—I CM . 00 C CM >H Ή cn

QJ CM CM CM

fH i—I Ή Ή

0 JO

-U CO O ΓΛ Q) v£J VO Ό “0 »s *c c o o o 0 i—I i—I Ή

Ct-

X

s? -μ 0 Ον Ή Ό

C VO Ό VO

CJ1 r» ^ Λ 0 o o o μ i-H i—! i—i

0 JO

Ό Ό 00

v i—i O i—i O i—I O

CO O CM O CM O CM

• H i—I Ό X VOX ΌΧ

UiØ Z ιΛ Z ΙΛ Z ΙΛ •HE O - <t ~ <f-

Q.C-1 <fO 1Ά O ΓΛ O

E O X X X

IjjCi- LA · Ό · IA ·

CM ΓΑ CM ΓΛ CM IA

o co o co cj cn ♦ · I—I · i—t

Jk i—I >s ·

4J >. -P

0 -P 0

0 0 O

co o ro •h ro *h

X O -Η O X O

1 CM X CM I CM

i—I X I X ι-i X

0 >, LA I~t LA >s LA

CO O - >n *· C

i—I C O O O -H O

ø ro n o X X · c · o C 0 -d- 0 <J- D <f

•Η X' O JO O CD O

x i cn i tn i co

in X CM s: CM X CM

O < X . «C X < X

U- cn cm cn cm tn cm

DK 155332B

21

Alle derivaterne ifølge den foreliggende opfindelse er afprøvet i et bred-spektret farmakologisk undersøgelsesprogram, og i alle tilfælde har disse derivater udvist særdeles interessante aktivitets- og toxicitets-karakte-5 ristika.

Det viste sig, at aktiviteten af de omhandlede forbindelse i det væsentlige afhænger af disse forbindelsers evne til at frigøre SAM+-ioner i organismen og af disse ioners evne til at virke som donorer for methylgrupper som det 10 naturlige substrat for et stort antal transmethylase-en- zymer, der katalyserer fundamentale reaktioner i lipid-, protid- og glucocid-metabolismen.

De omhandlede forbindelsers betydning kan således i det væsentlige udledes af det faktum, at de gør S-adenosyl-15 methionin absolut stabil, hvorved det bliver muligt at udnytte denne forbindelses transmethylerende virkning i den menneskelige organisme 100¾ uden risiko for dannelse af toxiske nedbrydningsprodukter, som udviser en skadelig virkning på de biologiske processer, der aktiveres, af SAM -20 ionerne.

Forbindelsernes betydning skyldes også deres evne til at gøre SAM i stand til at passere igennem cellebarierer og derved gøre denne forbindelse særdeles biotilgængelig.

Toxici tet 25 Man har bestemt den akutte toxicitet hos mus, og i alle tilfælde opnåedes følgende værdier: LD^p ved oral administration ^ 3 g/kg LD^p ved intravenøs administration >*1 g/kg.

Undersøgelser af tolerancen og den kroniske toxicitet 30 blev gennemført på rotter af stammerne Wistar og Sprague- 22

DK 155332 B

Dowley, idet man indgav forbindelserne i doser på 20. mg/kg pr. dag i 12 måneder. Ved behandlingens afslutning udviste de forskellige organer og systemer ingen patologiske ændringer.

5 Han har udført teragonese-forsøg på kaniner. Ved indgivelse af saltene i doser, som var 10 gange større end den maksimale terapeutiske dosis, konstaterede man ikke nogen teratogenvirkning eller misdannende virkning på fostrene eller på de terminale fostre.

10 Intravenøse indgivelser af doser på op til 200 mg/kg bevirkede ikke nogen pyrogene manifastationer hos .kaniner.

En venøs administration på 40 mg/kg til kaniner og rotter bevirker ingen ændringer i trykket i halspulsåren eller i hjerte- og respirationsfrekvensen, og der iagttages heller 15 ingen ændringer i elektrocardiogrammets form.

Den lokale tolerance ved intramuskulære injektioner, også efter gentagne indgivelser i 30 - 60 dage, og ved intravenøse injektioner i den marginale vene i det ydre øre hos kaniner har vist sig at være fremragende.

20 Farmakologi

En lang række forsøg udført på rotter har vist, at de hidtil ukendte forbindelser ifølge opfindelsen udviser en meget betragtelig beskyttende og helbredende virkning på steatosis hepatis induceret ved hjælp af en hyperlipid-25 hyperprotein-diæt i overensstemmelse med metoden beskrevet af Handler, og på steatosis induceret ved akut alkoholfor giftning og ved hjælp af andre toxiske midler, også når der indgives doser på 10 mg/kg SAM+.

Med hensyn til hyperlipidsmi hos rotter, eksempelvis in-30 duceret med Triton S, har de omhandlede produkter udvist

DK 155332B

23 en meget iøjnefaldende hypolipedæmisk virkning, som, i relation til den anvendte dosis, dvs. 10 mg/kg (igen udtrykt i SAM+), var meget mere intens end i det tilfælde, hvor der anvendtes andre medikamenter med hypolipidæmisk 5 virkning.

Hos kyllinger, som er gjort atherosclerotiske ved indgivelse af diether beriget med cholesterol og. fructose, kan en parenteral indgivelse af forbindelserne ifølge opfindelsen i- doser på 10 mg/kg reducere forekomsten af chole-10 sterolemi og på favorabel måde modificere de læsioner, som iagttages hos kontroldyr med hensyn til den torakale og abdominale aorta og de små kar i hjernens basis.

Med hensyn til phosphorlipid-metabolismen har det eksperimentelt, vist sig, at der sker en forøgelse af mængde af 15 phosphatidylcholin i hjernevævet hos rotter med ikke-kom- penseret steatosis. En tydelig forøgelse i indholdet af phosphatidylcholin kunne også bestemmes på bekostning af de hematiske a-lipoproteiner i eksperimentelle ændringer fremkaldt af β/α-lipoprotein-forholdene.

20 Alle disse forsøg har klart vist, at de omhandlede derivater har en helbredende virkning ved ændringer af lipid-metabolismen. En yderligere række af forsøg udført på rotter har vist, at en indgivelse på 1 mg/kg bevirker en akkumulering af de glycogene reserver på lever- og muskel-25 niveau, hvilket er eftervist. ved såvel histokemiske metoder som ved kvantitative bestemmelser. I eksperimentelt fremkaldt diabetes induceret med alloxan har den mængde insulin, som er påkrævet for at bringe glykæmi-værdier-ne tilbage til normalt niveau, kunnet reduceres betrag-30 teligt ved indgivelser svarende til 0,5 mg/kg SAM+.

Denne række af forsøg har udvist en klart positiv virkning af forbindelserne ifølge opfindelsen på glycosid-metabolismen.

24

DK 155332 B

Endelig har man behandlet rotter med eksperimentelt induceret hypodiproteinæmi med SAM-derivater i mængder på 10 mg/kg. Det viste sig, at disse produkter bevirker, at de totale proteinæmi-værdier vender tilbage til normale ni-5 veauer, idet der sker en væsentlig forøgelse af albuminniveauet, og således udviser de omhandlede forbindelser en bemærkelsesværdig protein-anabolisk virkning.

Disse og andre forsøg har eftervist den kurative aktivitet af de omhandlede forbindelser overfor forstyrrelser i pro-10 tid-metabolismen.

Sammenfattende kan det på basis af de ovenfor beskrevne farmakologiske forsøg og på basis af mange andre forsøg, som har gjort det muligt at klarlægge virkningen af de omhandlede forbindelser på alle niveauer i den menneske-15 lige organisme, siges, at de omhandlede forbindelsers virkning er klinisk fastslået inden for hepatologien, når der er tale om akutte og kroniske leverforgiftninger, inden for neurologien, når der er tale om den antidepressi-ve virkning, og inden for osteologien, når der er tale om 20 rhematoid arthritis.

Forbindelsernes virkning inden for et antal andre områder af den humane terapi er for øjeblikket under udforskning.

Forbindelserne har også ganske uventet udvist en betragtelig antiinflammatorisk og analgetisk virkning. 1 2 3 4 5 6

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan indgives oralt, el 2 ler de kan indgives ved intramuskulær eller intravenøs 3 injektion. Da forbindelserne .imidlertid udmærker sig ved 4 en større intestinal absorption end SAM, er de specielt 5 nyttige til fremstilling af farmaceutiske formuleringer 6 til oral anvendelse.

DK 155332B

25

Blandt de andre mulige indgivelsesformer kan anføres stikpiller, væsker til okular installation, aerosoler og salver til topisk påføring.

Claims

1· Analogifremgangsmåde til fremstilling af S-adenosylmethio-ninderivater med den almene formel • NH2 ? I—* i 1 J |CB3 too" I_I CV S - cb2- CE2 - CH^ . η 1A jijp\ »SS, (III) hvori R^ og R2, som kan være ens eller forskellige, be-5 tegner en lineær eller forgrenet aromatisk eller ali-fatisk acylgruppe med 2-12 carbonatomer, A er en ækvivalent af en uorganisk eller organisk syre med en pK-værdi på under 2,5, og n er 1-5, kendetegnet ved, at man behand-10 ler en vandig opløsning af et S-adenosylmethioninsalt med et acyleringsmiddel ved en temperatur på omkring 1 °C og en pH-værdi på 7, at man ved reaktionens afslutning leder den dannede opløsning igennem en svagt sur ion-bytterharpiks, som elueres med en vandig opløsning af 15 den ønskede syre, og at man til opløsningen, som opnås efter en koncentrering, sætter den støkiometriske mængde syre, som er nødvendig for den valgte værdi af n.

2. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man opnår C2~C^-monoacyl-derivater ved at- anvende 20 et syreanhydrid eller et syreehlorid som acyleringsmiddel. DK 155332 B

3. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man opnår C^-C^-monoacyl-derivater ved at anvende et overskud af et syrechlorid i acetoneopløsning.

4. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, at man opnår C2-Cg-triacyl-derivater ved at anvende et stort overskud af et syreanhydrid eller et syrechlorid .