DE909495C

DE909495C - Verfahren zur Reinigung von Kallikrein

Info

Publication number: DE909495C
Application number: DEF9769A
Authority: DE
Inventors: Dipl-Chem Willy Koerbel; Dr Heinrich Kraut
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1952-08-26
Filing date: 1952-08-26
Publication date: 1954-04-22

Description

Verfahren zur Reinigung von Kallikrein Es ist bekannt, daß Kallikrein in unreinen Lösungen von einer Anzahl von Schwermetalisalzen, wie Uranylacetat, basisches Bleiphosphat usw., niedergeschlagen wird. Hierbei handelt es sich, wie schon in der Abhandlung von H. K r a u t, E. K.
Fr e y, E. Bauer uiid F. Schultz, Zs. physiol.
Chem. 205, 99 (I937), beschrieben, um Adsorptioneu an die von diesen Schwermetallen erzeugten Niederschläge, sei es mit Eiweiß oder mit Phosphorsäure; denn in reineren Präparaten blieben unter den damals gewählten Bedingungen die Fällungen aus.
Es wurde nun gefunden, daß das Kallikrein mit Zink eine Verbindung eingeht, die besondere präparative Vorteile besitzt. Die Zinksalze des Kallikreins sind nämlich im pH-Bereich von 5 bis 6 in Wasser verhältnismäßig leicht löslich, dagegen schwer löslich in verdünntem, z. B. in 30°/oigem Alkohol oder entsprechenden Mischungen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, z. B. Aceton.
Man kann daher aus reineren Lösungen durch Zusatz von Zinkacetat bei pH 5 bis 6 ohne wesentlichen Verlust an Kallikrein unwirksame Begleitstoffe ausfällen und nach deren Abtrennung durch Zusatz von Alkohol oder Aceton das Kallikrein selbst als Zinksalz von hohem Reinheitsgrad ausfällen.
Bei unreinen Lösungen, in denen durch Zinksalze voluminöse Niederschläge von Eiweiß oder von Zinkphosphat entstehen, die das Kallikrein adsorbieren, ist es notwendig, den Kallikreinlösungen vor dem Zinkacetatzusatz 300/0 an Alkohol oder Aceton zuzusetzen, wodurch ohne wesentlichen Kallikreinverlust die das Verfahren störenden Verunreinigungen niedergeschlagen werden.
Versetzt man nun mit Zinkacetat, so fallen zusammen mit dem Kallikrein alle in wäßriger und in verdünnt alkoholischer Lösung schwerlöslichen Zinksalze aus. Aus diesem Niederschlag läßt sich mit wenig Wasser oder Neutralsalzlösung, z. B. mit physiologischer Kochsalzlösung, das Kallikrein-Zinksalz in Lösung bringen, während die auch in Wasser schwerlöslichen Zinksalze im Niederschlag bleiben und abgetrennt werden können.
Die Zinksalze des Kallikreins sind in wäßriger Lösung längere Zeit beständig, sie können jedoch nicht nach den üblichen Verfahren als Trockenpulver gewonnen werden, ohne einen großen Teil ihrer biologischen Wirkung einzubüßen. Man kann aber aus den Lösungen des Zinksalzes das Zink durch Ionenaustauscher entfernen und dann das Kallikrein in der üblichen Weise, z. B. durch Eindampfen im Vakuum oder durch Fällung mit Alkohol oder Aceton, als wirksames Trockenpulver gewinnen. Diese Trockenpulver sind auch zur weiteren Reinigung des Kallikreins geeignet.
Beispiel 31 eines Pankreasautolysates werden mit 1,5 1 Alkohol versetzt und der Niederschlag mit der Zentrifuge entfernt. Die klare Lösung versetzt man mit 50 g Zinkacetat, gelöst in 500 ccm 300/obigem Alkohol. Der sich sofort bildende Niederschlag wird nach I2 Stunden mit der Zentrifuge abgetrennt und in I 1 physiologischer Kochsalziösung suspensiert. Das Kallikrein-Zinksalz geht dabei in Lösung und wird durch Filtration vom Niederschlag getrennt. Die Ausbeute beträgt etwa 8o 0/o des Kallikreins, der Reinheitsgrad 40 bis 60; je KE.
Die gewonnene Lösung des Kallikrein-Zinksalzes wird in Beuteln aus regenerierter Zellulose 24 Stunden gegen fließendes Wasser dialysiert, wobei man das pH zwischen 5 und 6 hält. Dann werden erneut IO g Zinkacetat je Liter Flüssigkeit zugesetzt und der geringe kallikreinfreie Niederschlag abzentrifugiert. Nun bringt man die Lösung auf einen Gehalt von 30°/o Alkohol oder Aceton und sammelt den sich langsam ausscheidenden Niederschlag mit der Zentrifuge. Er löst sich vollständig in Wasser.
Die Ausbeute beträgt 60 bis So°/o des angewandten Kallikreins. Der Reinheitsgrad steigt auf 20 bis 30 y je KE.
Die Lösung des Kallikrein~Zinksalzes wird durch eine Säule von Kationenaustauscher, der mit Natriumchlorid aufgeladen ist, filtriert, in der Kälte mit dem vierfachen Volumen Alkohol versetzt und der Niederschlag nach längerem Stehen in der Kälte abzentrifugiert und anschließend mit Aceton und Äther getrocknet. Die Ausbeute beträgt 60°/o der Wirksamkeit. Das Trockenpulver ist wasserlöslich und haltbar.

Claims

PATENTANSPRUCHE: I. Verfahren zur Reinigung von Kallikrein über die Zinksalze, dadurch gekennzeichnet, daß Kallikrein aus verdünnt alkoholischer, vorzugsweise 3oo/oiger alkoholischer Lösung oder aus wäßrigen Lösungen entsprechender, mit Wasser mischbarer organischer Lösungsmittel mit Zinkacetatlösung bei PH 5 bis 6 ausgefällt und aus dem Niederschlag das Kallikrein-Zinksalz mit Wasser oder verdünnter Neutralsalzlösung extrahiert wird, um gegebenenfalls weiterverarbeitet zu werden.
2. Verfahren zur Gewinnung von Zinksalzen des Kallikreins, dadurch gekennzeichnet, daß in wäßrigen Kallikreinlösungen von PH 5 bis 6 mit Zinkacetatlösung unwirksame Begleitstoffe ausgefällt und anschließend das Kallikrein-Zinksalz durch Zusatz von Alkohol oder anderen mit Wasser mischibaren organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Aceton, ausgefällt wird.
3. Verfahren zur Gewinnung von Trockenpräparaten des Kallikreins aus seinen Zinksalzen, dadurch gekennzeichnet, daß das Zink durch einen Ionenaustauscher aus der Lösung entfernt und dann das Kallikrein nach üblichen Verfahren getrocknet wird.