DE69817165T2

DE69817165T2 - Sulfonierte xanthenderivate

Info

Publication number: DE69817165T2
Application number: DE69817165T
Authority: DE
Inventors: Fei Mao; Wai-Yee Leung; P. Richard HAUGLAND
Original assignee: Molecular Probes Inc
Current assignee: Molecular Probes Inc
Priority date: 1997-09-23
Filing date: 1998-09-23
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2018-09-24
Also published as: CA2272403A1; WO1999015517A1; US6130101A; EP0966458A1; EP0966458B1; JP4916042B2; DE69817165D1; AU750380B2; AU9504698A; JP2001508494A; ATE247098T1; JP2010180409A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft neue sulfonierte Rhodaminfarbstoffe, reaktive Farbstoffderivate sowie Farbstoffkonjugate; sowie ihre Verwendung in biologischen Systemen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bei den Farbstoffen der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Xanthenfarbstoffe und insbesondere um Rhodaminfarbstoffe (6-Amino-3H-xanthen-3-imin-Derivate), die mit wenigstens einer Sulfonatgruppierung am Xanthenanteil des Farbstoffs substituiert sind. Die erfindungsgemäßen sulfonierten Xanthenfarbstoffe besitzen erhebliche Vorteile gegenüber ihren nicht sulfonierten Analogen.
Zu den „Rhodamin"-Farbstoffen gehören 6-Amino-3H-xanthen-3-imin-Derivate, die typischerweise in der 9-Stellung mit einer 2-Carboxyphenylgruppe substituiert sind:
Typisches Rhodamin
Rhodamine, die nicht in 9-Stellung mit einer 2-Carboxyphenylgruppe substituiert sind, werden Rosamine genannt.
Aus der EP-A-0 582 836 sind Sulforhodaminderivate sowie ihre Verwendung als pH-Fluoreszenzindikatoren bekannt.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Fluoreszenzausbeuten für die erfindungsgemäßen Farbstoffe sind typischerweise höher als diejenigen anderer Farbstoffe mit vergleichbaren Spektren (Tabelle 5). In ähnlicher Weise zeigen die erfindungsgemäßen sulfonierten Farbstoffe eine erhöhte Resistenz gegenüber Quenchen nach Konjugation mit einem Protein (3) sowie eine erhöhte Photostabilität (6). Die Spektren der erfindungsgemäßen sulfonierten Rhodaminfarbstoffe sind gegenüber pH-Änderungen im Bereich zwischen pH 4 und 10 unempfindlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Absorptionsspektren von Ziege-Anti-Maus-(Goat Anti-Mouse, GAM-)IgG-Konjugaten der Verbindung 5 (Verbindung 5-GAM) und Tetramethylrhodamin (TMR-GAM), wie in Beispiel 36 beschrieben.
2: Fluoreszenzemissionsspektren von Ziege-Anti-Maus-IgG-Konjugaten der Verbindung 5 (Verbindung 5-GAM) und des Farbstoffs CY-3 (CY-3-GAM) mit ähnlichem Substitutionsgrad und gleichen optischen Dichten bei einer Anregungswellenlänge von 530 nm, wie in Beispiel 38 beschrieben.
3: Konjugatfluoreszenz in Abhängigkeit vom Substitutionsgrad für Ziege-Anti-Maus-IgG-Konjugate (Fab2-Fragmente) der Verbindung 7 und des Farbstoffs TEXAS RED-X, wobei zu sehen ist, daß die erfindungsgemäßen Farbstoffe bei hohem Substitutionsgrad weniger gequencht werden, wie in Beispiel 38 beschrieben.
4: Fluoreszenzemissionsspektren von R-Phycoerythrin (R-PE) im Vergleich mit dem eines Verbindung-24-Konjugats von R-Phycoerythrin bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm, wie in Beispiel 40 beschrieben. Es zeigt sich ein hoch effizienter Energietransfer vom Protein auf den erfindungsgemäßen Farbstoff.
5: Relative Photobleaching-Geschwindigkeiten von mit einem erfindungsgemäßen Phalloidinkonjugat (Verbindung 35) bzw. Fluoreszeinphalloidin angefärbten Zellen, wie in Beispiel 43 beschrieben. Die bessere Photostabilität der erfindungsgemäßen Farbstoffe wird durch relative Photobleaching-Geschwindigkeiten demonstriert.
6: Relative Photobleaching-Geschwindigkeiten von mit Ziege-Anti-Maus-IgG-Konjugaten der Verbindung 5 (Verbindung 5-GAM) und des Farbstoffs CY-3 (CY-3-GAM) angefärbten Zellen, wie in Beispiel 43 beschrieben. Die bessere Photostabilität der erfindungsgemäßen Farbstoffe wird durch relative Photobleaching-Geschwindigkeiten demonstriert.
7: Vergleich der Fluoreszenzemissionsspektren von quervernetztem Allophycocyanin (XL-APC) und eines Verbindung-l9-Konjugats von quervernetztem Allophycocyanin (Verbindung 19-XL-APC) (Beispiel 57). Die Fluoreszenzemission bei 650 nm wird durch die Zugabe des sulfonierten Rhodaminfarbstoffs über Energietransfer vom erfindungsgemäßen Farbstoff auf das fluoreszierende Protein stark erhöht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG UND BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung beschreibt Rhodaminfarbstoffe, wie unten definiert, die ein- oder mehrfach mit einer Sulfonsäure oder einem Sulfonsäuresalz substituiert sind und sich als Fluoreszenzsonden eignen. Die erfindungsgemäßen Farbstoffe besitzen gegebenenfalls eine zur Herstellung von Fluoreszenzkonjugaten geeignete reaktive Gruppe.
Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich um Rhodamine, die ein- oder mehrfach mit SO₃X oder -CH₂SO₃X, wobei X für H (Sulfonsäure) oder ein Gegenion (Sulfonsäuresalz) steht, substituiert sind. Ist, wie hierin verwendet, X ein Gegenion, so handelt es sich dabei typischerweise um ein Kation, das bei Verwendung nicht toxisch ist und im wesentlichen keine schädliche Wirkung auf Biomoleküle hat. Als Kationen sind beispielsweise unter anderem K⁺-, Na⁺-, Cs⁺-, Li⁺-, Ca²⁺-, MG²⁺-, Ammonium-, Alkylammonium- oder Alkoxyammoniumsalze oder Pyridiniumsalze geeignet. Alternativ kann das Gegenion der Sulfonsäure ein inneres Salz mit einem positiv geladenen Atom am Xanthenfarbstoff selbst, typischerweise dem quaternären Stickstoffatom eines Rhodaminfarbstoffs, bilden.
In einer Ausführungsform besitzen die Farbstoffe die Formel I, wie unten gezeigt:
Formel I
Die Substituenten R², R³, R⁴ und R⁵ stehen unabhängig voneinander für H, F, Cl, Br, I, CN; oder C₁-C₁₈-Alkyl oder C₁-C₁₈-Alkoxy, wobei jede Alkyl- oder Alkoxygruppe gegebenenfalls weiterhin mit F, Cl, Br, I, einer Carbonsäure, einem Carbonsäuresalz oder einem Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols substituiert ist. Als Alternative stehen einer oder mehrere der Reste R², R³, R und R⁵ für -SO₃X oder -L-R_x oder -L-S_c, wobei L eine kovalente Verknüpfung, R_x eine reaktive Gruppe und S_c eine konjugierte Substanz bedeutet. In einer bevorzugten Ausführungsform stehen R³ und R⁴ jeweils für -SO₃X.
Die Substituenten R¹ und R⁶ stehen jeweils für H, oder R¹ zusammen mit R² bzw. R⁵ zusammen mit R⁶ bzw. beide Reste bildet bzw. bilden einen kondensierten aromatischen sechsgliedrigen Ring, der gegebenenfalls mit einer oder mehreren -SO₃X-Gruppierungen substituiert ist.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform stehen R², R³, R⁴ und R⁵ jeweils unabhängig voneinander für H, F, Cl, Br, I oder C₁-C₁₈-Alkyl. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform stehen R¹, R², R⁵ und R⁶ für H. In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform stehen R² und R⁵ jeweils für F oder Cl.
Die Gruppierung A bedeutet NR⁸R⁹, wobei R⁸ und R⁹ unabhängig voneinander für H, C₁-C₆-Alkyl , C₁-C₆-Carboxyalkyl, C₁-C₆-Sulfoalkyl, ein C₁-C₆-Carboxyalkylsalz oder ein C₁-C₆-Sulfoalkylsalz, wobei die Alkylanteile jeweils unabhängig voneinander und gegebenenfalls mit Amino, Hydroxy, Carbonsäure, einem Carbonsäuresalz oder einem Carbonsäureester einer C₁-C₆-Alkylgruppe substituiert sind, stehen. Alternativ bildet R⁸ zusammen mit R⁹ einen gesättigten 5- oder 6gliedrigen Heterocyclus, bei dem es sich um ein Piperidin, ein Morpholin, ein Pyrrolidin oder ein Piperazin handelt, das jeweils gegebenenfalls mit Methyl, Carbonsäure, einem Carbonsäuresalz oder einem Carbonsäureester einer C₁-C₆-Alkylgruppe substituiert ist. In einer weiteren Alternative steht einer der bzw. stehen beide Reste R⁸ und R⁹ für -L-R_x oder -L-S_c.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt bildet bzw. bilden R⁸ zusammen mit R² bzw. R⁹ zusammen mit R³ bzw. beide Reste einen 5- oder 6gliedrigen Ring, der gesättigt oder ungesättigt ist und gegebenenfalls mit einer oder mehreren C₁-C₆-Alkylgruppen oder -CH₂SO₃X-Gruppierungen substituiert ist.
Die Gruppierung B steht für N⁺R¹⁸R¹⁹, wobei R¹⁸ und R¹⁹ unabhängig voneinander für H, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Carboxyalkyl, C₁-C₆-Sulfoalkyl, ein C₁-C₆-Carboxyalkylsalz oder ein C₁-C₆-Sulfoalkylsalz, worin die Alkylanteile jeweils gegebenenfalls mit Amino, Hydroxy, Carbonsäure, einem Carbonsäuresalz oder einem Carbonsäureester einer C₁-C₆-Alkylgruppe substituiert sind, stehen. Alternativ bildet R¹⁸ zusammen mit R¹⁹ einen gesättigten 5- oder 6gliedrigen Heterocyclus, bei dem es sich um ein Piperidin, ein Morpholin, ein Pyrrolidin oder ein Piperazin handelt, das jeweils gegebenenfalls mit Methyl, Carbonsäure, einem Carbonsäuresalz oder einem Carbonsäureester einer C₁-C₆-Alkylgruppe substituiert ist. In einer weiteren Alternative steht einer der bzw. stehen beide Reste R¹⁸ und R¹⁹ für -L-R_x oder -L-S_c.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt bildet bzw. bilden R¹⁸ zusammen mit R⁴ bzw. R¹⁹ zusammen mit R⁵ bzw. beide Reste einen 5- oder 6gliedrigen Ring, der gesättigt oder ungesättigt ist und gegebenenfalls mit einer oder mehreren C₁-C₆-Alkylgruppen oder -CH₂SO₃X-Gruppierungen substituiert ist.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform stehen R⁹ und R¹⁸ unabhängig voneinander für H oder Carboxyalkyl, ein Carboxyalkylsalz, Sulfoalkyl oder ein Sulfoalkylsalz, das jeweils 1–6 Kohlenstoffatome aufweist. Typischerweise stehen R⁹ und R¹⁸ für H, Methyl oder Ethyl.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform bilden R⁸ zusammen mit R² und R¹⁹ zusammen mit R⁵ unabhängig voneinander 5- oder 6gliedrige Ringe, die gesättigt oder ungesättigt sind und gegebenenfalls mit einer oder mehreren, 1–6 Kohlenstoffatome aufweisenden Alkylgruppen oder mit einer oder mehreren -CH₂SO₃X-Gruppierungen substituiert sind. In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform bilden R⁸ zusammen mit R² und R¹⁹ zusammen mit R⁵ unabhängig voneinander 5- oder 6gliedrige Ringe, die gesättigt sind und mit einer oder mehreren -CH₂SO₃X-Gruppierungen substituiert sind. Einige (aber nicht alle) Beispiele von wie hierin beschriebenen kondensierten 5- oder 6gliedrigen Ringen sind unten dargestellt (zusätzliche Substituenten wie z. B. Sulfonsäure- oder Sulfomethylgruppierungen sind nicht gezeigt).
R¹⁰ steht für einen Arylsubstituenten mit der Formel
wobei die Substituenten R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander für H, F, Cl, Br, I, -SO₃X, eine Carbonsäure, ein Carbonsäuresalz, CN, Nitro, Hydroxy, Azido, Amino, Hydrazino stehen oder R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander für C₁-C₁₈-Alkyl, C₁-C₁₈-Alkoxy, C₁-C₁₈-Alkylthio, C₁-C₁₈-Alkanoylamino, C₁-C₁₈-Alkylaminocarbonyl, C₂-C₃₆-Dialkylaminocarbonyl, C₁-C₁₈-Alkyloxycarbonyl oder C₆-C₁₈-Arylcarboxamido, deren Alkyl- oder Arylanteile gegebenenfalls ein- oder mehrfach mit F, Cl, Br, I, Hydroxy, Carbonsäure, einem Carbonsäuresalz, einem Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols, -SO₃X, Amino, Alkylamino, Dialkylamino oder Alkoxy, wobei die Alkylanteile dieser Substituenten wiederum 1–6 Kohlenstoffatome aufweisen, substituiert sind, stehen. Alternativ bildet eines der Paare benachbarter Substituenten R¹³ und R¹⁴, R¹⁴ und R¹⁵ bzw. R¹⁵ und R¹⁶ zusammengenommen einen kondensierten 6gliedrigen aromatischen Ring, der gegebenenfalls weiterhin mit Carbonsäure oder einem Carbonsäuresalz substituiert ist . Alternativ steht einer der Reste R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ für -L-R_x oder -L-S_C.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform stehen R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander für H, Cl, F, Amino, Nitro, -SO₃X, eine Carbonsäure, ein Carbonsäuresalz oder eine carboxysubstituierte Alkylthiogruppe mit der Formel -S-(CH₂)_nCOOH mit n gleich 1–15. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform stehen wenigstens drei der Reste R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ für F oder Cl. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform steht einer der Reste R¹⁴ und R¹⁵ für eine Carbonsäure, ein Carbonsäuresalz oder für -S-(CH₂)_nCOOH mit n gleich 1–15, und der andere der beiden Reste R¹⁴ und R¹⁵ steht für H, F oder Cl.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform steht wenigstens einer der Reste R², R³, R⁴ und R⁵ für -SO₃X, vorzugsweise stehen R³ und R⁴ für -SO₃X. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform bildet bzw. bilden R¹ zusammen mit R² bzw. R⁵ zusammen mit R⁶ bzw. beide Reste einen kondensierten aromatischen sechsgliedrigen Ring, der mit wenigstens einer -SO₃X-Gruppierung substituiert ist. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform bildet R⁸ zusammen mit R² bzw. R⁹ zusammen mit R³ bzw. R¹⁸ zusammen mit R⁴ bzw. R¹⁹ zusammen mit R⁵ einen 5- oder 6gliedrigen Ring, der gesättigt oder ungesättigt ist und mit wenigstens einer -CH₂SO₃X-Gruppierung substituiert ist. Vorzugsweise bilden R⁸ zusammen mit R² sowie R¹⁹ zusammen mit R⁵ einen 5- oder 6gliedrigen Ring, der gesättigt oder ungesättigt ist und mit wenigstens einer -CH₂SO₃X-Gruppierung substituiert ist.
Die Spektraleigenschaften ausgewählter Farbstoffe sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
Tabelle 1: Spektraleigenschaften ausgewählter erfindungsgemäßer Fluorophore
Konjugate reaktiver Farbstoffe
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält das sulfonierte Rhodamin wenigstens eine Gruppe -L-R_x, wobei R_x für die reaktive Gruppe, die an den Fluorophor durch eine kovalente Verknüpfung L gebunden ist, steht. In gewissen Ausführungsformen enthält die das sulfonierte Rhodamin an R_x bindende kovalente Verknüpfung mehrere dazwischen liegende Atome, die als Abstandhalter (Spacer) dienen. Die Farbstoffe mit einer reaktiven Gruppe (R_x) Fluoreszenz-markieren eine große Vielfalt organischer und anorganischer Substanzen, die funktionale Gruppen mit geeigneter Reaktivität entweder enthalten oder so modifiziert sind, daß sie diese enthalten, was zur chemischen Anbindung der konjugierten Substanz (S_c) führt, dargestellt durch -L-S_c. Bei der reaktiven Gruppe und der funktionalen Gruppe handelt es sich typischerweise um ein Elektrophil und ein Nukleophil, die eine kovalente Verknüpfung ausbilden können. Alternativ handelt es sich bei der reaktiven Gruppe um eine photoaktivierbare Gruppe. Typischerweise führt die Konjugationsreaktion zwischen dem reaktiven Farbstoff und der zu konjugierenden Substanz dazu, daß ein oder mehrere Atome der reaktiven Gruppe R_x in eine neue Verknüpfung L, die das sulfonierte Rhodamin an die konjugierte Substanz S_c bindet, eingebaut werden. Ausgewählte Beispiele funktionaler Gruppen und Verknüpfungen sind in Tabelle 2 gezeigt, wobei die Reaktion einer elektrophilen Gruppe und einer nukleophilen Gruppe eine kovalente Verknüpfung ergibt.
Tabelle 2: Beispiele für einige Wege zu geeigneten kovalenten Verknüpfungen
Die kovalente Verknüpfung L bindet die reaktive Gruppe R_x oder die konjugierte Substanz S_c an den Fluorophor, entweder direkt (L ist hierbei eine Einfachbindung) oder mittels einer Kombination aus stabilen chemischen Bindungen, wobei gegebenenfalls Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfach-, -Doppel- oder -Dreifachbindungen oder aromatische Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen ebenso wie Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen, Stickstoff-Stickstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Schwefel-Bindungen, Phosphor-Sauerstoff-Bindungen sowie Phosphor-Stickstoff-Bindungen eingeschlossen sind. L umfaßt typischerweise Ether, Thioether, Carboxamid-, Sulfonamid-, Harnstoff-, Urethan- oder Hydrazingruppierungen.
Bevorzugte Gruppierungen L weisen 1–20 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C, N, O, P und S, auf; und sind aus einer beliebigen Kombination von Ether-, Thioether-, Amin-, Ester-, Carboxamid-, Sulfonamid-, Hyrazidbindungen sowie aromatischen oder heteroaromatischen Bindungen aufgebaut. Vorzugsweise handelt es sich bei L um eine Kombination aus Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfachbindungen und Carboxamid- oder Thioetherbindungen. Das längste lineare Segment der Verknüpfung L enthält vorzugsweise 4–10 Nicht-Wasserstoffatome, einschließlich ein oder zwei Heteroatomen. Zu L zählen beispielsweise gegebenenfalls substituiertes Polymethylen, Arylen, Alkylarylen, Arylenalkyl oder Arylthio. In einer Ausführungsform enthält L 1–6 Kohlenstoffatome; in einer weiteren Ausführungsform steht L für eine Thioetherverknüpfung. In noch einer weiteren Ausführungsform steht L für oder beinhaltet die Formel +(CH₂)_a(CONH(CH₂)_b)_z-, wobei a einen beliebigen Wert von 0–5, b einen beliebigen Wert von 1–5 aufweist und z 0 oder 1 ist. In noch einer weiteren Ausführungsform steht L für oder beinhaltet ein substituiertes Platinatom, wie in dem US-Patent Nr. 5,714,327 von Houthoff et al. (1998) beschrieben.
Die -L-R_x- und -L-S_c-Gruppierungen sind direkt an den Fluorophor an einem beliebigen der Reste R²-R⁵ oder R⁷-R¹⁶, vorzugsweise an einem der Reste R¹³-R¹⁶ weiter bevorzugt an R¹⁴ oder R¹⁵, gebunden oder als Substituent an einem Alkyl-, Alkoxy-, Alkylthio- oder Alkylamino substituenten vorhanden. In einer Ausführungsform steht genau einer der Reste R², R³, R⁴, R⁵, R⁷, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ oder R¹⁶ für eine -L-R_x- oder -L-S_c-Gruppierung. In einer weiteren Ausführungsform steht genau einer der Reste R¹³, R¹⁴, R¹⁵ oder R¹⁶ für eine -L-R_x- oder -L-S_c-Gruppierung. In noch einer weiteren Ausführungsform steht genau einer der Reste R², R³, R⁴, R⁵, R⁷, R⁸, R⁹ oder R¹⁰ für eine -L-R_x- oder -L-S_c-Gruppierung.
Die Wahl der zur Anbindung des Fluorophors an die zu konjugierende Substanz verwendeten reaktiven Gruppe hängt typischerweise von der funktionalen Gruppe auf der zu konjugierenden Substanz sowie von der Art oder Länge der gewünschten kovalenten Verknüpfung ab. Zu den typischerweise auf den organischen oder anorganischen Substanzen vorhandenen Arten von funktionalen Gruppen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Amine, Thiole, Alkohole, Phenole, Aldehyde, Ketone, Phosphate, Imidazole, Hydrazine, Hydroxylamine, disubstituierte Amine, Halogenide, Epoxide, Sulfonsäureester, Purine, Pyrimidine, Carbonsäuren oder eine Kombination aus diesen Gruppen. Es kann entweder nur eine einzige Art einer reaktiven Stelle auf der Substanz verfügbar sein (typisch für Polysaccharide), oder aber es kann eine Vielfalt an Stellen vorliegen (z. B. Amine, Thiole, Alkohole, Phenole), wie es für Proteine typisch ist. Eine konjugierte Substanz kann an mehr als einen Fluorophor, wobei dieser derselbe oder verschieden sein kann, oder an eine Substanz; die zusätzlich mit einem Hapten, wie z. B. Biotin, modifiziert ist, konjugiert sein. Obwohl sich eine gewisse Selektivität durch sorgfältige Einstellung der Reaktionsbedingungen erzielen läßt, wird die Selektivität der Markierung am besten durch Auswahl eines geeigneten reaktiven Farbstoffs erhalten.
Typischerweise läßt sich R_x mit einem Amin, einem Thiol, einem Alkohol, einem Aldehyd oder einem Keton umsetzen. In einer Ausführungsform bedeutet R_x eine Acrylamid-, eine aktivierte Carbonsäureester-, eine Acylazid-, eine Acylnitril-, eine Aldehyd-, eine Alkylhalogenid-, eine Amin-, eine Anhyrid-, eine Anilin-, eine Arylhalogenid-, eine Azid-, eine Aziridin-, eine Boronat-, eine Carbonsäure-, eine Diazoalkan-, eine Halogenacetamid-, eine Halogentriazin-, eine Hydrazin- (einschließlich Hydrazide), eine Imidoester-, eine Isocyanat-, eine Isothiocyanat-, eine Maleimid-, eine Phosphoramidit-, eine Sulfonylhalogenid- oder eine Thiolgruppe. Vorzugsweise steht R_x für eine Carbonsäure-, eine Succinimidylester-, eine Amin-, eine Halogenacetamid-, eine Hydrazin-, eine Isothiocyanat-, eine Maleimidgruppe oder eine Azidoperfluorbenzamidogruppe.
Handelt es sich bei der reaktiven Gruppe um eine photo aktivierbare Gruppe, wie z. B. ein Azid-, Diazirinyl- oder Azidoarylderivat, so wird der Farbstoff nach Bestrahlung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge chemisch reaktiv.
Handelt es sich bei R_x um einen Succinimidylester einer Carbonsäure, so ist der reaktive Farbstoff besonders zur Herstellung von Farbstoffkonjugaten von Proteinen oder Oligonukleotiden geeignet. Handelt es sich bei R_x um ein Maleimid, so ist der reaktive Farbstoff besonders zur Konjugation an thiolhaltige Substanzen geeignet. Handelt es sich bei R_x um ein Hydrazid, so ist der reaktive Farbstoff besonders zur Konjugation an mit Periodatoxidierte Kohlenhydrate und Glykoproteine geeignet und stellt zusätzlich einen mit Aldehyd fixierbaren polaren Indikator („Tracer") für die Mikroinjektion von Zellen dar.
Die erfindungsgemäßen reaktiven Farbstoffe sind zur Herstellung aller konjugierten Substanzen, die eine für die kovalente Bindung des Fluorophors geeignete funktionale Gruppe besitzen, geeignet. Zu den besonders geeigneten Farbstoffkonjugaten gehören beispielsweise unter anderem Konjugate von Antigenen, Steroiden, Vitaminen, Arzneistoffen, Haptenen, Metaboliten, Toxinen, Umweltschadstoffen, Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren, Nukleinsäurepolymeren, Kohlenhydraten, Lipiden, ionenkomplexierenden Gruppierungen sowie nichtbiologischen Polymeren. Alternativ gehören dazu Konjugate von Zellen, Zellsystemen, Zellfragmenten oder subzellulären Partikeln. Dazu gehören beispielsweise unter anderem Viruspartikel, bakterielle Partikel, Virusbestandteile, biologische Zellen (wie z. B. tierische Zellen, pflanzliche Zellen, Bakterien, Hefe oder Protisten) oder auch Zellbestandteile. Sulfonierte reaktive Farbstoffe markieren typischerweise reaktive Stellen an der Zelloberfläche, in Zellmembranen, Organellen oder in Cytoplasma. Bei der konjugierten Substanz handelt es sich vorzugsweise um eine Aminosäure, ein Peptid, Protein, Tyramin, Polysaccharid, eine ionenkomplexierende Gruppierung, ein Nukleotid, Nukleinsäurepolymer, Hapten, einen Arzneistoff, ein Hormon, Lipid, einen Lipidverband, ein Polymer, Mikropolymerpartikel, eine biologische Zelle oder ein Virus. In einer Ausführungsform werden Konjugate von biologischen Polymeren wie z. B. Peptiden, Proteinen, Oligonukleotiden und/oder Nukleinsäurepolymeren außerdem mit einem zweiten fluoreszierenden oder nichtfluoreszierenden Farbstoff, einschließlich einem zusätzlichen erfindungsgemäßen Farbstoff, markiert, um ein Energietransferpaar zu bilden.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei der konjugierten Substanz (S_c) um eine Aminosäure (einschließlich solcher, die von bzw. mit Phosphaten, Kohlenhydraten oder C₁-C₂₂-Carbonsäuren geschützt oder substituiert sind) oder um ein Polymer aus Aminosäuren, wie z. B. ein Peptid oder ein Protein. Bevorzugte Konjugate von Peptiden enthalten wenigstens fünf Aminosäuren, besonders bevorzugt 5 bis 36 Aminosäuren. Zu den bevorzugten Peptiden gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Neuropeptide, Cytokine, Toxine, Proteasesubstrate sowie Proteinkinasesubstrate. Zu den bevorzugten Proteinkonjugaten gehören Enzyme, Antikörper, Lectine, Glykoproteine, Histone, Albumine, Lipoproteine, Avidin, Streptavidin, Protein A, Protein G, Phycobiliproteine und weitere fluoreszierende Proteine, Hormone, Toxine und Wachstumsfaktoren. Typischerweise handelt es sich bei dem konjugierten Protein um einen Antikörper, ein Antikörperfragment, Avidin, Streptavidin, ein Toxin, ein Lectin, ein Hormon oder einen Wachstumsfaktor. Handelt es sich bei der konjugierten Substanz um ein Toxin, so ist dieses typischerweise ein Neuropeptid oder ein Phallotoxin wie z. B. Phalloidin.
Handelt es sich bei der konjugierten Substanz um ein Phycobiliprotein, so ist dieses typischerweise ein Phycoerythrin, ein Phycocyanin oder ein Allophycocyanin, vorzugsweise B- oder R-Phycoerythrin, oder ein Allophycocyanin. Das Phycobiliprotein ist gegebenenfalls chemisch quervernetzt und ist insbesondere ein quervernetztes Allophycocyanin. In dieser Ausführungsform bilden der erfindungsgemäße Farbstoff und das Phycobiliprotein ein Energietransferpaar und zeigen ein beträchtliches Maß an Fluoreszenzresonanzenergietransfer (Beispiel 57, 7). Vorzugsweise dient der erfindungsgemäße Farbstoff als Donorfarbstoff, und das Phycobiliprotein dient als Endakzeptor, wobei eine Anregung mit einer Lichtquelle von 488 nm unter Bildung einer sehr langwelligen Fluoreszenz erlaubt ist. Alternativ handelt es sich bei dem Farbstoff um einen Akzeptorfarbstoff und bei dem Phycobiliprotein um den Anfangsdonorfarbstoff (Beispiele 39 und 40, 4). Vorzugsweise zeigt das Farbstoff-Phycobiliprotein-Konjugat eine effektive Stokessche Verschiebung von > 100 nm mit einem Exzitationsmaximum des Farbstoffs bei 485–515 nm und einer maximalen Fluoreszenzemission des Phycobiliproteins bei 620 nm oder mehr. Diese Energietransferpaare umfassen gegebenenfalls eine chemisch reaktive Gruppe oder eine konjugierte Substanz, typischerweise über das Phycobiliprotein gebunden, um die Verwendung als nachweisbare Markierungen oder Indikatoren zu erleichtern. Wie bei anderen Proteinkonjugaten ist das Phycobiliprotein gegebenenfalls mit zusätzlichen Fluorophoren markiert, die gleich oder verschieden sein können und als zusätzliche Energietransferfarbstoffe, Donorfarbstoffe oder Endemissionsfarbstoffe dienen.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der konjugierten Substanz (S_c) um eine Nukleinsäurebase, ein Nukleotid, Nukleotid oder ein Nukleinsäurepolymer, einschließlich solcher, die nach Modifikation einen zusätzlichen Linker oder Spacer zur Bindung der erfindungsgemäßen Farbstoffe besitzen, wie z. B. eine Alkinylverknüpfung (US-Patent 5,047,519), eine Aminoallylverknüpfung (US-Patent 4,711,955) oder eine andere Verknüpfung. Vorzugsweise handelt es sich bei dem konjugierten Nukleotid um ein Nukleosidtriphosphat oder ein Desoxynukleosidtriphosphat oder ein Didesoxynukleosidtriphosphat.
Bevorzugte Nukleinsäurepolymerkonjugate sind markierte, einzel- oder mehrsträngige, natürliche oder synthetische DNA- oder RNA-Moleküle, DNA- oder RNA-Oligonukleotide oder DNA/RNA-Hybride oder enthalten einen ungewöhnlichen Linker, wie z. B. mit Morpholin derivatisierte Phosphate (AntiVirals, Inc., Corvallis, OR) oder Peptidnukleinsäuren wie z. B. N-(2-Aminoethyl)-glycin-Einheiten. Handelt es sich bei der Nukleinsäure um ein synthetisches Oligonukleotid, so enthält dieses typischerweise weniger als 50 Nukleotide, besonders typisch weniger als 25 Nukleotide. Größere fluoreszierende Nukleinsäurepolymere werden typischerweise aus markierten Nukleotiden oder Oligonukleotiden unter Verwendung von DNA-Polymerisation mit Oligonukleotidprimern, wie z. B. mittels der Polymerase kettenreaktion oder durch Primerverlängerung, oder durch von terminaler Transferase katalysierte Zugabe eines markierten Nukleotids an ein 3'-Ende eines Nukleinsäurepolymers hergestellt. Typischerweise wird der Farbstoff via einer oder mehrerer Purin- oder Pyrimidinbasen über eine Amid-, Ester-, Ether- oder Thioetherbindung gebunden oder er wird an das Phosphat oder Kohlenhydrat über eine Ester-, Thioester-, Amid-, Ether- oder Thioetherbindung gebunden. Das erfindungsgemäße Farbstoffkonjugat kann gleichzeitig mit einem Hapten wie z. B. Biotin oder Digoxigenin markiert oder an ein Enzym wie z. B. alkalische Phosphatase oder an ein Protein wie z. B. einen Antikörper gebunden werden. Die erfindungsgemäßen Nukleotidkonjugate lassen sich leicht mit einer DNA-Polymerase einbauen und zur in-situ-Hybridisierung (Beispiel 52) sowie zur Nukleinsäuresequenzierung (z. B. US-Patente 5,332,666, 5,171,534 und 4,997,928 und WO-Anm. 94/05688) einsetzen.
In einer weiteren Ausführungsform ist die konjugierte Substanz (S_c) ein Kohlenhydrat, bei dem es sich um ein Mono-, Di- oder Polysaccharid handelt. Ist S_c ein Kohlenhydrat, so handelt es sich dabei typischerweise um ein Polysaccharid wie z. B. ein Dextran, FICOLL, Heparin, Glykogen, Amylopectin, Mannan, Inulin, Stärke, Agarose und Cellulose. Das Kohlenhydrat kann aber auch ein Polysaccharid sein, bei dem es sich um ein Lipopolysaccharid handelt. Bevorzugte Polysaccharidkonjugate sind Dextran- oder FICOLL-Konjugate.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der konjugierten Substanz (S_c) um ein Lipid (typischerweise mit 6–60 Kohlenstoffatomen), einschließlich Glykolipide, Phospholipide, Sphingolipide und Steroide. Bei der konjugierten Substanz kann es sich aber auch um einen Lipidverbund, wie z. B. ein Liposom, handeln. Die lipophile Gruppierung kann dazu verwendet werden, die konjugierten Substanzen in Zellen zu speichern, wie in der US-Patentschrift 5,208,148 beschrieben.
Konjugate mit einer ionenkomplexierenden Gruppierung dienen als Indikatoren für Calcium, Natrium, Magnesium, Kalium oder andere biologisch wichtige Metallionen. Bevorzugte ionenkomplexierende Gruppierungen sind Kronenether, einschließlich Diaryldiaza-Kronenether (US-Patent 5,405,975); BAPTA-Chelatoren (US-Patent 5,453,517, US-Patent 5,516,911 und US-Patent 5,049,673); APTRA-Chelatoren (AM. J. PHYSIOL. 256, C540 (1989)); oder Metallionenchelatoren auf Pyridin- und Phenanthrolinbasis (US-Patent 5,648,270). Vorzugsweise handelt es sich bei der ionenkomplexierenden Gruppierung um einen Diaryldiaza-Kronenether oder einen BAPTA-Chelator. Die Ionenindikatoren sind gegebenenfalls an Kunststoff- oder biologische Polymere, wie z. B. Dextrane oder Mikrokügelchen, konjugiert, um ihre Verwendbarkeit als Sensoren zu verbessern. Handelt es sich andererseits bei dem Farbstoff um ein Fluoreszein oder ein Rhodol, so dient der Farbstoff selbst als ein H⁺-Indikator bei pH-Werten, die innerhalb eines Bereichs von etwa 1,5 pH-Einheiten um den pKa-Wert des jeweiligen Farbstoffs liegen.
Zu den Konjugaten von nichtbiologischen Materialien gehören ebenfalls Farbstoffkonjugate von organischen oder anorganischen Polymeren, Polymerfilmen, Polymerwafern, Polymermembranen, Polymerteilchen, Mikropolymerteilchen, einschließlich magnetischen und nichtmagnetischen Mikrokügelchen, leitenden und nichtleitenden Metallen und Nichtmetallen sowie Glas- und Plastikoberflächen und -teilchen. Die Konjugate werden gegebenenfalls durch Copolymerisation eines eine entsprechende Funktionalität enthaltenden sulfonierten Farbstoffs während der Herstellung des Polymers oder durch chemische Modifikation eines funktionale Gruppen mit geeigneter chemischer Reaktivität enthaltenden Polymers hergestellt. Zu den für die Herstellung von Farbstoffkonjugaten von Polymeren geeigneten Reaktionsarten zählen weiterhin katalysierte Polymerisationen oder Copolymerisationen von Alkenen sowie Reaktionen von Dienen mit Dienophilen, Umesterungsreaktionen oder Transaminierungen. In einer weiteren Ausführungsform umfaßt die konjugierte Substanz ein Glas oder ein Silikamaterial, das jeweils zu einer optischen Faser oder einer anderen Struktur ausgebildet werden kann.
Die Herstellung von Farbstoffkonjugaten unter Verwendung reaktiver Farbstoffe ist umfassend dokumentiert, z. B. in R. Haugland, MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Kapitel 1–3 (1996); und Brinkley, BIOCONJUGATE CHEM., 3, 2 (1992). Konjugate werden typischerweise durch Mischen entsprechender sulfonierter reaktiver Farbstoffe und der zu konjugierenden Substanz in einem geeigneten Lösungsmittel, in dem beide Komponenten löslich sind, gebildet. Die erfindungsgemäßen Farbstoffe sind in wäßrigen Lösungen leicht löslich, wodurch die Konjugationsreaktionen mit den meisten biologischen Materialien erleichtert werden. Bei der Konjugation von photoaktivierten Farbstoffen ist zusätzlich eine Bestrahlung erforderlich.
Markierte Mitglieder eines spezifischen Bindungspaars werden typischerweise als Fluoreszenzsonden für das komplementäre Mitglied dieses spezifischen Bindungspaars eingesetzt, wobei jedes Mitglied des spezifischen Bindungspaars auf der Oberfläche oder in einem Hohlraum einen Bereich aufweist, der spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Anordnung des anderen Mitglieds bindet und dazu komplementär ist. Bevorzugte Mitglieder eines spezifischen Bindungspaars sind Proteine, die nichtkovalent an niedermolekulare Liganden wie z. B. Biotin, Arzneistoffhaptene und Fluoreszenzfarbstoffe binden (wie z. B. ein Antifluoreszeinantikörper). Solche Sonden enthalten gegebenenfalls eine kovalent gebundene Gruppierung, die entweder von einem Enzym oder durch Licht abgetrennt wird, oder aber R¹¹ steht für H, und die Verbindung fluoresziert nach Oxidation. Beispiele spezifischer Bindungspaare sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3. Beispiele spezifischer Bindungspaare
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Farbstoff mit einer Blockierungsgruppierung substituiert, die die Fluoreszenz des Fluorophors wesentlich verändert, wobei die Fluoreszenz des Ausgangsfarbstoffs durch anschließendes Entfernen der Blockierungsgruppierung wiederhergestellt wird.
Typischerweise erfolgt die Abspaltung der Blockierungsgruppierung vom Farbstoff mittels einer Enzymaktivität, wodurch der blockierte Farbstoff zu einem Enzymsubstrat wird (wie beispielsweise beschrieben in Mangel et al., US-Patent 4,557,862 (1985)). Bei der Blockierungsgruppierung kann es sich andererseits auch um eine photolabile „Caging"-Gruppe handeln, wie z. B. ein gegebenenfalls substituiertes Derivat von o-Nitroarylmethin (einschließlich α-Carboxy-o-nitroarylmethin (US-Patent 5,635,608 von Haugland et al. (1997)) und Bis(5-t-butoxycarbonylmethoxy)-2-nitrobenzyl), von 2-Methoxy-5-nitrophenyl oder von Desyl.
Zu den Enzymen, die sich mit entsprechend blockierten Farbstoffen nachweisen oder quantifizieren lassen, gehören mikrosomale Dealkylasen (z. B. Cytochrom-P450-Enzyme), Glykosidasen (z. B. β-Galactosidase, β-Glucosidase, α-Fucosidase, β-Glucosaminidase), Phosphatasen, Sulfatasen, Esterasen, Lipasen, Guanidinobenzoatasen und andere. Ist das sulfonierte Rhodamin an ein Tyraminmolekül konjugiert, so eignet sich das gebildete Farbstoffkonjugat als Substrat für Peroxidaseenzyme (wie beschrieben in US-Patent 5,196,306 von Bobrow et al. (1993)). Durch die Sulfonierung der Farbstoffe wird die Wasserlöslichkeit dieser Substrate verbessert.
Anwendungen und Verwendungsverfahren
Die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen werden im allgemeinen verwendet, indem eine wie oben beschriebene sulfonierte Farbstoffverbindung mit der gewünschten Probe unter Bedingungen, die so ausgewählt sind, daß sich eine nachweisbare optische Antwort ergibt, zusammengegeben wird. Der Ausdruck „Farbstoffverbindung" wird hier mit Bezug auf reaktive und nicht reaktive sulfonierte Rhodamine und ihre Konjugate verwendet. Die Farbstoffverbindung bildet typischerweise einen kovalenten oder nichtkovalenten Verbund oder Komplex mit einem Element der Probe oder befindet sich einfach innerhalb des Bereichs der Probe oder eines Teils der Probe. Die Probe wird dann bei einer Wellenlänge, die so ausgewählt ist, daß dadurch die optische Antwort hervorgerufen wird, bestrahlt. Typischerweise verwendet man die Anfärbung der Probe, um eine bestimmte Eigenschaft der Probe zu bestimmen, indem die optische Antwort weiter mit einem Standard oder einer erwarteten Antwort verglichen wird.
Bei biologischen Anwendungen werden die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen typischerweise in einer wäßrigen, größtenteils wäßrigen oder mit Wasser mischbaren Lösung, die nach im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren hergestellt wird, verwendet. Die genaue Konzentration der Farbstoffverbindung hängt von den experimentellen Bedingungen sowie den gewünschten Ergebnissen ab, liegt aber typischerweise in einem Bereich von etwa einem Nanomolar bis ein Millimolar oder darüber. Die optimale Konzentration wird durch systematisches Variieren bestimmt, bis zufriedenstellende Ergebnisse mit minimaler Hintergrundfluoreszenz erhalten werden.
Die Farbstoffverbindungen lassen sich in sehr vorteilhafter Weise zur Anfärbung von Proben mit biologischen Bestandteilen einsetzen. Dabei kann die Probe heterogene Gemische aus Bestandteilen (einschließlich intakter Zellen, Zellextrakten, Bakterien, Viren, Organellen und Gemischen davon) oder einen einzigen Bestandteil oder eine homogene Gruppe von Bestandteilen (z. B. natürliche oder synthetische Aminosäure-, Nukleinsäure- oder Kohlenhydratpolymere oder Lipidmembrankomplexe) enthalten. Diese Farbstoffe sind im allgemeinen in den verwendeten Konzentrationen nicht toxisch für lebende Zellen und andere biologische Bestandteile, obwohl es sich bei denjenigen sulfonierten Farbstoffen, die zusätzlich ein- oder mehrfach mit Br oder I substituiert sind, um wirksame Photosensitizer handelt.
Die Farbstoffverbindung wird mit der Probe in einer Weise kombiniert, die den Kontakt zwischen der Farbstoffverbindung und den gewünschten Probenbestand teilen erleichtert. Typischerweise wird die Farbstoffverbindung oder eine die Farbstoffverbindung enthaltende Lösung einfach zu der Probe gegeben. Sulfonierte Rhodaminderivate sind weniger leicht als andere Rhodaminderivate dazu in der Lage, Membranen biologischer Zellen zu durchdringen, werden aber, sobald sie sich in lebensfähigen Zellen befinden, typischerweise gut gespeichert. Behandlungen, die zur Permeabilisierung der Plasmamembran führen, wie z. B. Elektroporation, Schockbehandlungen oder hohe extrazelluläre ATP-Konzentrationen, lassen sich zum Einschleusen von Farbstoffverbindungen in Zellen verwenden. Die Farbstoffverbindungen können aber auch durch Mikroinjektion mit Druck, „Scrape Loading", „Patch Clamp"-Verfahren, Phagocytose oder durch Osmolyse von Pinocytosevesikeln in die Zellen eingeführt werden.
Sulfonierte Rhodaminfarbstoffe, die einen Amin- oder einen Hydrazinrest enthalten, können in Zellen mikroinjiziert werden, wo sie sich dann mittels Aldehydfixierungsmitteln, wie z. B. Formaldehyd oder Glutaraldehyd, fixieren lassen. Aufgrund dieser Fixierbarkeit sind solche Farbstoffe für intrazelluläre Anwendungen wie z. B. „Neuronal Tracing" geeignet.
Die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen sind aufgrund der Solubilisierung des Fluorophors in Wasser durch die Sulfonatgruppierungen sowie ihre relative Unfähigkeit, Membranen zu durchdringen, besonders als polare Tracer geeignet, gemäß im Fachgebiet allgemein bekannter Verfahren für andere Farbstoffverbindungen, siehe z. B. US-Patent 4,473,693 von Stewart (1984) (Verwendung von „Lucifer Yellow") und US-Patent 5,514,710 von Haugland et al. (1996) (Verwendung von „Caged"-Hydroxypyrensulfonsäuren). Handelt es sich bei dem sulfonierten Farbstoff um einen photoreaktiven Farbstoff, so ist der daraus entstehende polare Tracer photofixierbar.
Farbstoffverbindungen, die einen lipophilen Substituenten, wie z. B. Phospholipide, besitzen, lassen sich nichtkovalent in Lipidverbände einbauen, z. B. zur Verwendung als Sonden für die Membranstruktur; oder zum Einbau in Liposomen, Lipoproteine, Filme, Kunststoffe, 1ipophile Mikrokügelchen oder ähnliche Materialien; oder zum „Tracing". Lipophile sulfonierte Rhodaminfarbstoffe sind als Fluoreszenzsonden für Membranstrukturen geeignet, wobei die Sonde aufgrund der Sulfonsäuregruppierung an oder in der Nähe der Membranoberfläche festhalten läßt.
Chemisch reaktive Farbstoffverbindungen lassen sich kovalent an eine entsprechende funktionale Gruppe auf vielen verschiedenen Materialien binden. Die Verwendung von Farbstoffverbindungen (einschließlich photo reaktiver Varianten) zur Markierung reaktiver Stellen auf oder in Zellen gestattet die Bestimmung ihrer Anwesenheit oder Menge, Zugänglichkeit oder ihre räumliche und zeitliche Verteilung in der Probe. Aufgrund der relativen Unfähigkeit der erfindungsgemäßen Farbstoffe, Membranen biologischer Zellen zu durchdringen, sind sie als Fluoreszenzproben zur Beurteilung der Topographie der Proteinverteilung in lebenden Zellen oder als Indikator für die Lebensfähigkeit einer einzelnen Zelle geeignet (Beispiel 53).
Außerhalb des Zellmilieus wird durch die negative Ladung der Farbstoffverbindungen bei neutralem pH-Wert auch die elektrophoretische Trennung von Farbstoffkonjugaten von Kohlenhydraten, Arzneistoffen und anderen niedermolekularen Verbindungen zur Analyse mittels Kapillarzonenelektrophorese (Capillary Zone Electrophoresis, CZE), HPLC oder anderer Trenntechniken erleichtert. Dabei ist die Präzipitation des Konjugats minimiert, selbst nach Markierung mit mehreren Fluorophoren, da die sulfonierten Rhodaminderivate bei neutralem pH-Wert vollkommen ionisiert sind.
Die Probe wird gegebenenfalls mit einem oder mehreren zusätzlichen Nachweisreagentien kombiniert. Ein zusätzliches Nachweisreagenz produziert typischerweise eine nachweisbare Antwort aufgrund der Gegenwart eines spezifischen Zellbestandteils, einer intrazellulären Substanz oder zellulären Bedingungen, gemäß im Fachgebiet allgemein bekannter Verfahren. Besitzt das zusätzliche Nachweisreagens Spektraleigenschaften, die sich von denen der erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen unterscheiden, oder führt zu einem Produkt mit solchen Spektraleigenschaften, so sind Mehrfarbanwendungen möglich. Dies ist besonders nützlich, wenn es sich bei dem zusätzlichen Nachweisreagens um einen erfindungsgemäßen Farbstoff oder ein erfindungsgemäßes Farbstoffkonjugat mit Spektraleigenschaften, die sich nachweisbar von denen der übrigen Farbstoffe zum Anfärben unterscheiden, handelt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, bei denen es sich um Farbstoffkonjugate handelt, werden gemäß im Fachgebiet weitbekannten Verfahren verwendet; z. B. Verwendung von Antikörperkonjugaten in der Mikroskopie sowie in Immunfluoreszenzassays; und Nukleotid- oder Oligonukleotidkonjugate für Nukleinsäurehybridisierungsassays sowie für Nukleinsäuresequenzierung (z. B. US-Patent 5,332,660 von Prober, et al. (1994); 5,171,534 von Smith, et al. (1992); 4,997,928 von Hobbs (1991); und WO-Anmeldung 94/05688 von Menchen, et al.). Farbstoffkonjugate mit mehreren unabhängigen erfindungsgemäßen Farbstoffen eignen sich für Mehrfarbanwendungen.
Farbstoffkonjugate von Antikörpern an Fluorophore eignen sich zur Fluoreszenzamplifikation. So zeigen beispielsweise die erfindungsgemäßen sulfonierten Rhodaminfarbstoffe keine Kreuzreaktivität mit Anti-Fluoreszein. Die Verwendung von mit grün fluoreszierenden sulfonierten Rhodaminfarbstoffen konjugierten Anti-Fluoreszeinantikörpern zur Amplifikation von Fluoreszeinmarkierungen führt aufgrund der hohen Photostabilität der erfindungsgemäßen Farbstoffe sowohl zur Amplifikation als auch zur Photostabilisierung des Signals. Markierte Antikörper eignen sich ebenfalls für Mehrfarbanwendungen, so daß beispielsweise die Verwendung eines rot fluoreszierenden Anti-Fluoreszeinantikörpers in Verbindung mit Fluoreszeinmarkierung ein helles, photostabiles und rot fluoreszierendes Signal ergibt.
Die Probe wird zu einem beliebigen Zeitpunkt während des Anfärbens oder nach dem Anfärben mit einer Lichtwellenlänge, die so ausgewählt ist, daß eine nachweisbare optische Antwort erhalten wird, bestrahlt und danach mit einem Mittel zum Nachweis der optischen Antwort beobachtet. Zu den für die Bestrahlung geeigneten Geräten gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, UV-Handlampen, Quecksilberbogenlampen, Xenonlampen, Laser sowie Laserdioden. Diese Bestrahlungsquellen sind gegebenenfalls in Laserscanner, Mikroplattenfluoreszenzablesegeräte, Standard- oder Minifluoreszenzspektrometer oder chromatographische Detektoren integriert.
Unter einer nachweisbaren optischen Antwort versteht man eine Veränderung oder das Auftreten eines optischen Signals, das entweder durch Beobachtung oder mit Hilfe von Instrumenten nachweisbar ist. Bei der nachweisbaren Antwort handelt es sich typischerweise um eine Fluoreszenzänderung, wie z. B. eine Intensitätsänderung, eine Änderung der Exzitations- oder Emissionswellenlängenverteilung der Fluoreszenz, eine Änderung der Fluoreszenzlebensdauer, der Fluoreszenzpolarisation oder eine Kombination daraus. Der Grad und/oder der Ort der Anfärbung zeigt, verglichen mit einem Standard oder einer erwarteten Antwort, an, ob und zu welchem Grad die Probe eine gegebene Charakteristik besitzt.
Die optische Antwort wird gegebenenfalls durch visuelle Inspektion oder durch Verwendung einer der folgenden Vorrichtungen: CCD-Kameras, Videokameras, photographischer Film, Laserscanner, Fluoreszenzspektrometer, Photodioden, Quantenzähler, Epifluoreszenzmikroskope, Scanning-Mikroskope, Durchfluflcytometer, Mikroplattenfluoreszenzablesegeräte, oder durch Mittel zur Signalamplifikation, wie z. B. Photomultiplierröhren, nachgewiesen. Wird die Probe in einem Durchfluflcytometer untersucht, so beinhaltet die Untersuchung der Probe gegebenenfalls die Sortierung von Teilen der Probe gemäß ihrer Fluoreszenzantwort.
Farbstoffsynthese
Xanthyliumfarbstoffe werden typischerweise durch Kondensation des entsprechenden Aminophenols mit verschiedenen Derivaten von Benzoesäure, Phthalsäure oder Phthalsäureanhydrid oder Sulfobenzoesäure oder Sulfobenzoesäureanhydrid dargestellt. Diese Kondensation findet in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Säurekatalysatoren statt. Eine Aufarbeitung im wäßrigen Milieu, woran sich typischerweise eine Säulenchromatographie anschließt, ergibt den gewünschten Xanthyliumfarbstoff.
Bei unsymmetrischen Xanthyliumfarbstoffen, wie z. B. unsymmetrischen Rhodaminen, läßt sich die Kondensation unter Verwendung von jeweils einem Äquivalent des entsprechenden, gegebenenfalls substituierten Aminophenols mit einem Äquivalent eines anderen Aminophenols und mit einem Äquivalent des entsprechenden Phthalsäurederivats oder Benzaldehyds (wie oben aufgeführt) unter Säurekatalyse durchführen (wie in Khanna et al., US-Patent 4,439,359 (1984) und Haugland et al., US-Patent 5,227,487 (1993) beschrieben). Die gewünschten asymmetrischen Xanthyliumfarbstoffe werden dann von allen unerwünschten Nebenprodukten aus symmetrischem Farbstoff mit im Fachgebiet allgemein bekannten Kristallisations- oder Chromatographietechniken getrennt.
Unsymmetrische Xanthyliumfarbstoffe lassen sich auch stufenweise aufbauen: ein ausgewähltes Aminophenol wird mit einem Äquivalent des entsprechenden Phthalsäurederivats oder Benzaldehyds zu einem Benzophenon kondensiert, das typischerweise isoliert, gereinigt und dann mit einem Äquivalent eines anderen Aminophenols unter Erhalt des asymmetrischen Farbstoffs kondensiert wird.
Die Sulfonierung von Xanthyliumfarbstoffen erfolgt typischerweise durch Rühren des Farbstoffs in rauchender Schwefelsäure (20–30% SO₃-Gehalt) oder konzentrierter Schwefelsäure bei einer geeigneten Temperatur. Die Sulfonierung findet entweder in 4'- und 5'-Stellung, falls vorhanden, statt oder/und an den vinylischen Methylgruppen des Xanthyliumrests, falls der Xanthyliumfarbstoff mit einem vinylischen Substituenten substituiert ist. Die Sulfonierung der meisten Rhodaminfarbstoffe (einschließlich Rosaminfarbstoffe) erfolgt in 4'- und 5'-Stellung, falls vorhanden, und wird mit rauchender Schwefelsäure bei 0°C durchgeführt; die Sulfonierung ist normalerweise vollständig, sobald man während des Rührens eine homogene Lösung erhält. Besitzt der Xanthyliumfarbstoff eine vinylische Methylgruppe, so erfolgt die Sulfonierung an der vinylischen Methylgruppe durch Behandlung mit konzentrierter Schwefelsäure bei Raumtemperatur. Falls die 4'- und 5'-Stellungen ebenfalls zur Sulfonierung zur Verfügung stehen, kann die Sulfonierung ebenfalls an diesen Positionen erfolgen, vorausgesetzt, daß rauchende Schwefelsäure als Sulfonierungsmittel verwendet wird.
Modifikationen von Xanthyliumfarbstoffen nach erfolgter Kondensation sind allgemein bekannt. So läßt sich beispielsweise der Xanthenanteil des Farbstoffs durch Umsetzung mit dem entsprechenden Halogierungsmittel wie z. B. flüssigem Brom halogenieren. Xanthene mit ungesättigten kondensierten Ringen lassen sich zu den gesättigten Derivaten hydrieren. Bei der Verwendung von Trimellithsäureanhydrid oder seinen Derivaten in der Farbstoffsynthese werden typischerweise zwei isomere Carboxylate gebildet. Diese Isomere werden entweder getrennt oder, in den meisten Fällen, als Isomerengemisch verwendet. Ähnlich wie nicht sulfonierte Xanthene lassen sich die Amino- und Hydroxylgruppen sulfonierter Xanthene acylieren oder alkylieren, so daß Amide, Ester und Ether erhalten werden, von denen einige Enzymsubstrate, Caged-Farbstoffe oder Fluoreszenzsonden sind.
Die Auswahl eines entsprechenden polyhalogenierten Phthalsäurederivats oder Benzaldehyds bei der Kondensation des Xanthyliumfarbstoffs führt zu einem Farbstoff mit einem tetra- oder pentachlorierten bzw. tetra- oder pentafluorierten Phenylring in 9-Stellung. Es konnte gezeigt werden, daß diese polyhalogenarylsubstituierten Farbstoffe über eine Verdrängungsreaktion mit Thiolen reagieren und sich dadurch ein einfaches Verfahren zur Einführung zusätzlicher reaktiver Gruppen ergibt (Beispiel 17; und wie in Gee, et al. TET. LETT. 37, 7905 (1996) diskutiert).
Die Dihydroxanthen- und Xanthyliumausführungen der erfindungsgemäßen Farbstoffe lassen sich mittels allgemein bekannter Oxidationsreagentien (beispielsweise molekularer Sauerstoff, Stickstoffmonoxid, Peroxynitrit, Dichromat, Triphenylcarbenium und Chloranil) oder Reduktionsreagentien (z. B. Borhydride, Aluminiumhydride, Wasserstoff/Katalysator und Dithionite) frei ineinander umwandeln. Die Xanthene werden ebenfalls durch die Einwirkung von Enzymen, einschließlich Meerrettichperoxidase zusammen mit Peroxiden, oder durch Stickstoffmonoxid oxidiert.
Beispiele für Strategien zur Synthese ausgewählter sulfonierter Fluorophore sind ebenso wie ihre Charakterisierung, synthetischen Vorstufen, Konjugate und Verwendungsverfahren unten aufgeführt. Die unten aufgeführten Beispiele dienen zur Erläuterung der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung. Sie sollen dabei den vollen Umfang der vorliegenden Erfindung weder beschränken noch definieren. Die Beispiele 1 bis 7 sowie 15 beziehen sich auf die Darstellung synthetischer Vorstufen, während die Beispiele 8 bis 14 sowie 16 bis 31 die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen erläutern.
BEISPIELE Beispiel 1. Darstellung der Verbindung 2:
Ein Gemisch aus 7-Hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2,3,4-tetrahydrochinolin (20 g, 74 mmol), Trimellithsäureanhydrid (10 g, 52 mmol) und ZnCl₂ wird unter Rühren 3 Std. bei 220–230°C erhitzt. Zu der heißen Reaktionsmischung gibt man 150 ml Wasser. Der entstandene Niederschlag wird filtriert, mit Wasser (3 × 50 ml) gewaschen und getrocknet. Das Rohprodukt wird über Kieselgel unter Verwendung von MeOH/CHCl₃ gereinigt. Ausbeute: 10 g.
Beispiel 2. Darstellung der Verbindung 6:
Verbindung 6 wird analog zu Verbindung 2 (Beispiel 1) dargestellt, außer daß 7-Hydroxy-1,2,2,4-tetramethyl-1,2-dihydrochinolin (15,2 g, 74,9 mmol), Trimellithsäureanhydrid (9,35 g, 48,7 mmol) sowie p-Toluol-sulfonsäure (1 g) in Propionsäure (50 ml) verwendet werden. Nach 24stündigem Erhitzen am Rückfluß wird das Gemisch in 2%ige HCl-Lösung (2 1) gegossen. Das Rohprodukt wird gesammelt, getrocknet und mittels Chromatographie unter Verwendung von CHCl₃ : MeOH = 10 : 1 bis 10 : 3 gereinigt. (8 g, 36%).
Beispiel 3. Darstellung der Verbindung 8:
Verbindung 8 wird analog zu Verbindung 6 (Beispiel 2) dargestellt, außer daß jeweils ein Äquivalent 8-Hydroxyjulolidin, 7-Hydroxy-1,2,3,4-tetrahydrochinolin und Trimellithsäureanhydrid eingesetzt wird.
Beispiel 4. Darstellung der Verbindung 15:
Verbindung 15 wird analog zu Verbindung 6 (Beispiel 2) dargestellt, außer daß Tetrafluorphthalsäureanhydrid anstelle von Trimellithsäureanhydrid eingesetzt wird.
Beispiel 5. Darstellung der Verbindung 28:
Ein nitrosubstituiertes Analog der Verbindung 6 wird aus 7-Hydroxy-N-methyl-2,2,4-trimethyl-1,2-dihydro chinolin und 4-Nitrophthalsäureanhydrid nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren dargestellt. Reduktion der Nitrogruppe unter Verwendung des von MeKinney et al. (MeKinney, et al., J. ORG. CHEM. 27, 3986 (1962)) beschriebenen Verfahrens ergibt Verbindung 28.
Beispiel 6. Darstellung der Verbindung 10:
Ein Gemisch aus 7-Hydroxy-1,2,2,4-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydrochinolinhydrobromid (25,8 g, 94,9 mmol) und 4-Carboxybenzaldehyd (7,1 9, 47,3 mmol) wird in 120 ml 70%iger H₂SO₄ 4 Std. bei 130°C gerührt. Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt und dann mit 70%iger KOH auf pH 7 neutralisiert. Der entstandene Niederschlag wird filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man nimmt den Feststoff in 300 ml MeOH auf und fügt Chloranil (11,6 g, 47,3 ml) zu. Die Suspension wird am Rückfluß 2 Std. erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und am Rotationsverdampfer auf 100 ml eingeengt. Nach Zugabe von Ether (500 ml) wird der Niederschlag filtriert. Das Rohprodukt wird mittels Chromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von MeOH/CHCl₃ gereinigt. Ausbeute: 40%.
Beispiel 7. Darstellung der Verbindung 13:
Ein Gemisch aus 7-Hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2-dihydrochinolin (6 g, 22,2 mmol) und 4-Carboxybenzaldehyd (2,1 g, 14 mmol) wird unter Rühren 6–7 Std. bei 150–160°C erhitzt. Das Gemisch wird in MeOH (300 ml) gelöst und auf etwa 50 ml eingeengt und danach in Et₂O (1,2 1) gegossen. Das Rohprodukt wird gesammelt und mittels Chromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von CHCl₃ : MeOH = 7 : 3 gereinigt. (2,5 g, 21%).
Beispiel B. Darstellung der Verbindung 1:
5-(und-6)-Carboxyrhodamin 110, Hydrochlorid (8,14 g, 19,8 mmol; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) wird langsam und portionsweise zu 30%iger rauchender H₂SO₄ (50 ml) in einem Eisbad gegeben. Nach 12 Std. bei 0°C wird die Lösung in 600 ml kaltes Dioxan gegossen und danach 1,2 1 Et₂O zugegeben. Die Suspension wird durch Diatomeenerde hindurch filtriert. Der Filterkuchen wird in 1,2 1 MeOH suspendiert und der pH-Wert mit Triethylamin auf ~10 eingestellt. Das Gemisch wird filtriert und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird auf SEPHADEX LH-20 mit Wasser als Elutionsmittel gereinigt, so daß Verbindung 1 als orangefarbener Feststoff erhalten wird (9 g).
Beispiel 9. Darstellung der Verbindung 3:
Verbindung 3 wird aus Verbindung 2 unter Verwendung des in Beispiel 8 beschriebenen Verfahrens dargestellt, außer daß für das Alkalisieren der MeOH-Suspension LiOH verwendet wird.
Beispiel 10. Darstellung der Verbindung 9:
Verbindung 9 wird aus Verbindung 8 nach der in Beispiel 9 beschriebenen Vorgehensweise dargestellt.
Beispiel 11. Darstellung der Verbindung 11:
Verbindung 11 wird aus Verbindung 10 nach der in Beispiel 9 beschriebenen Vorgehensweise dargestellt.
Beispiel 12. Darstellung der Verbindung 7:
Zu konzentrierter H₂SO₄ (20 ml) wird bei 0°C Verbindung 6 (1,7 g, 3,02 mmol) gegeben. Das Gemisch wird 2 Std. bei 0°C und danach 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Danach gibt man Dioxan (3 0 ml) sowie Et₂O (1 1) zu und filtriert anschließend den Niederschlag durch Diatomeenerde hindurch. Der Filterkuchen wird in H₂O suspendiert und mit festem NaHCO₃ neutralisiert. Nach Filtration wird das Filtrat eingeengt und der Rückstand mittels Chromatographie auf Kieselgel (Elutionsmittel: CH₃CN : H₂O = 8 : 2) und anschließender Chromatographie auf SEPHADEX LH-20 (Elutionsmittel: H₂O) gereinigt. Das Produkt wird durch Behandlung mit einem Lithium-Kationenaustauscherharz in ein Lithiumsalz umgewandelt. Ausbeute: 0,7 g (31%).
Beispiel 13. Darstellung der Verbindung 12:
Ein Gemisch aus Verbindung 7 (100 mg, 0,14 mmol) und 10% Pd/C (30 mg) in MeOH (10 ml) wird über Nacht bei 45 psi hydriert. Das Rohprodukt wird mittels Chromatographie auf Kieselgel mit CH₃CN : H₂O = 8 : 2 als Elutionsmittel gereinigt (15 mg, 14%).
Beispiel 14. Darstellung der Verbindung 16:
Verbindung 16 wird aus Verbindung 15 unter Verwendung des in Beispiel 12 beschriebenen Verfahrens dargestellt.
Beispiel 15. Darstellung der Verbindung 40:
Verbindung 40 wird aus Tetrachlorphthalsäureanhydrid und 7-Hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2,3,4-tetrahydrochinolin nach der in Beispiel 2 beschriebenen Vorgehensweise dargestellt.
Beispiel 16. Darstellung der Verbindung 41:
Verbindung 41 wird aus Verbindung 40 und rauchender Schwefelsäure nach der in Beispiel 8 beschriebenen Vorgehensweise dargestellt. Abs: 557 (MeOH); Em: 574 nm (MeOH).
Beispiel 17. Darstellung der Verbindung 42:
Zu einer Lösung der Verbindung 41 (425 mg, 0,54 mmol) in 5 ml DMF gibt man unter Stickstoff Mercaptoessigsäure (99 mg, 1,07 mmol) und Natriumacetat (219 mg, 2,67 mmol). Die Lösung wird über Nacht gerührt und danach im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Das Rohprodukt wird mittels Säulenchromatographie auf Kieselgel, wobei mit CH₃CH : H₂O = 85 : 15 eluiert wird, gereinigt. Ausbeute: 79%.
Beispiel 18. Darstellung der Verbindung 14:
Verbindung 14 wird aus Verbindung 13 nach der in Beispiel 12 beschriebenen Vorgehensweise dargestellt.
Beispiel 19. Darstellung der Verbindung 30:
Verbindung 30 wird aus Verbindung 28 unter Verwendung des in Beispiel 12 beschriebenen Verfahrens dargestellt.
Beispiel 20. Darstellung der Verbindung 19:
Zu Verbindung 1 (200 mg, 0,36 mmol) in 10 : 4 DMF/H₂O (14 ml) gibt man bei 0°C O-Succinimidyl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborat (330 mg, 1,10 mmol) in DMF (6 ml). Nach 30 Minuten bei 0°C wird die Lösung eingeengt. Der Rückstand wird mittels Chromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von CH₃CH : H₂O = 8 : 2 als Elutionsmittel gereinigt (60 mg, 26%).
Beispiel 21. Darstellung der Verbindung 20:
Verbindung 20 wird aus Verbindung 11 unter Verwendung des in Beispiel 20 beschriebenen Verfahrens dargestellt. Ausbeute: 80%.
Beispiel 22. Darstellung der Verbindung 21:
Verbindung 21 wird aus Verbindung 14 unter Verwendung des in Beispiel 20 beschriebenen Verfahrens dargestellt.
Beispiel 23. Darstellung der Verbindung 22:
Zu einer Lösung des Succinimidylesters der Verbindung 7 (dargestellt unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 20) (17,3 mg, 21,1 μmol) in H₂O (2 ml) gibt man 6-Aminocaprinsäure (5 mg, 38 μmol) und anschließend 8 Tropfen N,N-Diisopropylethylamin. Nach 15 Minuten wird die Lösung eingeengt und der Rückstand anschließend auf Kieselgel mit CH₃CN : H₂O = 85 : 15 als Elutionsmittel gereinigt. Das Produkt wird mit Li⁺-Kationenaustauscherharz unter Erhalt der Verbindung 22 behandelt (8 mg).
Beispiel 24. Darstellung der Verbindung 23:
Verbindung 23 wird aus Verbindung 22 unter Verwendung des in Beispiel 20 beschriebenen Verfahrens dargestellt.
Beispiel 25. Darstellung der Verbindung 26:
Zu Verbindung 19 (100 mg, 0,16 mmol) in H₂O (10 ml) gibt man N-t-BOC-Cadaverin (300 mg, 1,58 mmol) in CH₃CN (6 ml). Nach 45 Minuten wird das Gemisch zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mittels Kieselgelchromatographie mit CH₃CN : H₂O = 85 : 15 gereinigt. Die gereinigte Verbindung wird in Wasser gelöst und mit Na⁺-Kationenaustauscherharz unter Erhalt der Verbindung 26 behandelt (40 mg, 34%).
Beispiel 26. Darstellung der Verbindung 27:
Zu Verbindung 26 (300 mg, 0,41 mmol) gibt man bei 0°C kalte Trifluoressigsäure (5 ml). Nach 15 Minuten bei 0°C wird das Gemisch eingeengt. Der Rückstand wird in CH₃OH (20 ml) und H₂O (30 ml) mit Et₃N (2 ml) gelöst . Die Lösung wird eingeengt und der Rückstand auf SEPHADEX LH-20 unter Erhalt der Verbindung 27 gereinigt. Das Na⁺-Salz wird unter Verwendung eines Na⁺-Kationenaustauscherharzes hergestellt.
Beispiel 27. Darstellung der Verbindung 43:
Zu einer Lösung von äquimolaren Mengen der Verbindung 27 und Triethylamin in DMF gibt man ein Äquivalent 4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorbenzoesäuresuccinimidylester. Nach 4stündigem Rühren wird das Reaktionsgemisch eingeengt und der Rückstand mittels Kieselgelchromatographie unter Erhalt der Verbindung 43 gereinigt.
Beispiel 28. Darstellung der Verbindung 24:
Zum Succinimidylester der Verbindung 7 (10 mg, 12 μmol) in H₂O gibt man N-(5-Aminopentyl)maleimidtrifluoracetat (5 mg, 17 μmol) in CH₃CN und anschließend 1 Tropfen N,N-Diisopropylethylamin. Nach 15 Minuten wird das Gemisch zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mittels Chromatographie auf Kieselgel mit CH₃CN : H₂O = 85 : 15 gereinigt und danach unter Verwendung eines Na+-Kationenaustauscherharzes in das Na⁺-Salz unter Erhalt der Verbindung 24 umgewandelt (6 mg).
Beispiel 29. Darstellung der Verbindung 25:
Verbindung 25 wird aus Verbindung 19 unter Verwendung des in Beispiel 28 beschriebenen Verfahrens dargestellt.
Beispiel 30. Darstellung der Verbindung 31:
Verbindung 31 wird durch Umsetzung der Verbindung 30 mit einem Überschuß an Thiophosgen dargestellt, wobei das Standardverfahren zur Isothiocyanatdarstellung verwendet wird.
Beispiel 31. Darstellung der Verbindung 33:
Zu Verbindung 21 (0,28 g, 0,37 mmol) in DMF (10 ml) gibt man bei 0°C t-Butylcarbazat (0,15 g, 1,12 mmol). Nach 30 Minuten wird die Lösung eingeengt und die Zwischenverbindung auf Kieselgel mit CH₃CH/H₂O (9 : 1) gereinigt. Nach Zugabe von Trifluoressigsäure (3 ml) wird die Lösung bei 0°C 15 Minuten gerührt und danach eingeengt. Das Produkt wird auf SEPHADEX LH-20 gereinigt, wobei mit H₂O eluiert wird. Das Na⁺-Salz wird über Ionenaustausch unter Verwendung eines Na⁺-Kationenaustauscherharzes hergestellt.
Beispiel 32. Herstellung eines Phalloidinkonjugats eines sulfonierten Rhodamins (Verbindung 35):
Zu Aminophalloidin-p-toluolsulfonat (3,5 mg, 4 μmol) und dem Succinimidylester der Verbindung 7 (5,0 mg, 5 μmol) in DMF gibt man N,N-Diisopropylethylamin (3 μl, 17 μmol). Das Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und danach werden 7 ml Diethylether zugegeben. Der Feststoff wird durch Zentrifugation gesammelt und das Rohprodukt auf SEPHADEX LH-20 mit Wasser als Elutionsmittel unter Erhalt der reinen Verbindung 35 gereinigt (4,0 mg).
Beispiel 33. Herstellung eines Nukleotid-Farbstoff-Konjugats:
Zu 2 mg 5-(3-Aminoallyl)-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat (Sigma Chemical) in 100 μl Wasser gibt man 3 mg Verbindung 19 in 100 μl DMF sowie 5 μl Triethylamin. Nach 3 Stunden wird die Lösung eingeengt und der Rückstand über HPLC gereinigt. Die Produktfraktionen werden unter Erhalt des grün fluoreszierenden Nukleotidkonjugats (Verbindung 36) lyophilisiert.
Als Alternative werden Fluoreszenzfarbstoffkonjugate von Desoxyuridin-5'-triphosphat aus 5-(3-Amino-1-propinyl)-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat (wie in Hobbs, Jr., et al, supra beschrieben) hergestellt.
Beispiel 34. Herstellung eines Oligonukleotid-Farbstoff-Konjugats:
Eine 5'-Amin-modifizierte, 18basige M13-Primersequenz (100 μg) wird in 4 μl 0,1 M Tris-EDTA-Puffer gelöst, dazu gibt man 250 μg Verbindung 25 (Beispiel 29) in 100 μl 0,1 M Natriumborat, pH 8,5. Nach 16 Stunden werden 10 μl 5 M NaCl sowie 3 Volumen kalter Ethanol zugegeben. Das Gemisch wird auf –20°C abgekühlt, zentrifugiert, der Überstand wird abgegossen, das Pellet mit Ethanol gespült und danach in 100 μl H₂O gelöst. Das markierte Oligonukleotid wird über HPLC auf einer 300A-C8-Reverse-Phase-Säule mit einem linear ansteigenden Gradienten von 0,1 M Triethylammoniumacetat (pH ~7) und Acetonitril (5→45% über 40 min) gereinigt. Die gewünschte Peak-Fraktion wird gesammelt und unter Erhalt des fluoreszierenden Oligonukleotids eingeengt.
Beispiel 35. Herstellung eines Arzneistoff-Farbstoff-Konjugats:
Ein fluoreszierender Dopamin-D₂-Antagonist wird wie folgt hergestellt: zu 10 mg N-(p-Aminophenethyl)-spiperon (Amlaiky et al., FEBS LETT 176, 436 (1984)) und 10 μl N,N-Diisopropylethylamin in 1 ml DMF gibt man 15 mg der Verbindung 31 (Beispiel 30). Nach 3 Stunden wird das Reaktionsgemisch in 5 ml Ether gegossen. Der Niederschlag wird zentrifugiert und danach mittels Chromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von 10–30% Methanol in Chloroform gereinigt.
Beispiel 36. Proteinkonjugate sulfonierter Xanthenfarbstoffe:
Eine Reihe von Farbstoffkonjugaten von Ziege-Anti-Maus-IgG oder Streptavidin werden standardmäßig hergestellt (Haugland et al., METH. MOL. BIOL. 45, 205 (1995); Haugland, METH. MOL. BIOL. 45, 223 (1995); Haugland, METH. MOL. BIOL. 45, 235 (1995)), wobei die reaktiven Succinimidylester der folgenden Fluorophore verwendet werden: Verbindung 1, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 14, Fluoreszein und die Farbstoffe CY-3, RHODAMINE GREEN, RHODOL GREEN, RHODAMINE RED-X und TEXAS RED-X.
Es wird eine Lösung von 10 mg/ml des gewünschten Proteins in 0,1 M Natriumhydrogencarbonat hergestellt. Die Markierungsreagentien werden zu 10 mg/ml in DMF oder Wasser gelöst. Zu den Proteinlösungen gibt man unter Rühren vorbestimmte Mengen der Markierungsreagentien. Ein Molverhältnis von 10 Äquivalenten Farbstoff zu 1 Äquivalent Protein ist typisch, obwohl die optimale Menge je nach dem jeweiligen Markierungsreagens, dem zu markierenden Protein und der Proteinkonzentration variiert und empirisch bestimmt wird. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde bei Raumtemperatur oder mehrere Stunden auf Eis inkubiert. Das Farbstoff- Protein-Konjugat wird typischerweise von freiem, nicht umgesetzem Reagens mittels Größenausschlußchromatographie auf mit PBS äquilibriertem CELLUFINE GH-25 getrennt. Die am Anfang auftretende proteinhaltige gefärbte Bande wird gesammelt und der Substitutionsgrad aus der Absorption am Absorptionsmaximum für jeden Fluorophor bestimmt, wobei die in Tabelle 4 aufgeführten Extinktionskoeffizienten verwendet werden. Die Absorption des Farbstoffs bei 280 nm wird von der Gesamtabsorption des Konjugats bei 280 nm subtrahiert, um die Proteinkonzentration zu erhalten. Ein Vergleich der Absorption eines Ziege-Anti-Maus-IgG-Konjugats der Verbindung 5 (DOS = 7) und eines Ziege-Anti-Maus-IgG-Konjugats von Tetramethylrhodamin (DOS = 4,3) bei derselben Proteinkonzentration ist in 1 gezeigt. Das erfindungsgemäße Konjugat zeigt nur ein Absorptionsmaximum (545 nm), wohingegen das Tetramethylrhodaminkonjugat zwei Maxima (558 nm und 522 nm) zeigt. Das Tetramethylrhodaminmaximum bei 522 nm wird durch die Anwesenheit nicht fluoreszierender Rhodamindimere verursacht. Die Neigung einiger Rhodaminfluorophore zur Aggregation bei mäßigen bis hohen Farbstoffsubstitutionsniveaus limitiert das verwendbare Signal, das von diesem Farbstoffkonjugat erhalten werden kann.
Tabelle 4: Extinktionskoeffizienten ausgewählter erfindungsgemäßer Fluorophore
Proteinkonjugate von Antikörperfragmenten, von anderen Avidinen sowie anderen Proteinen werden in ähnlicher Weise hergestellt und analysiert.
Beispiel 37. Fluoreszenzmarkierung von mit Periodat oxidierten Proteinen:
Zwei Proben von jeweils 5 mg Ziege-IgG-Antikörper in 1 ml 0,1 M Acetat, 0,135 M NaCl, pH 5,5 werden 1 bzw. 2 Stunden mit 2,1 mg Natriummetaperiodat auf Eis behandelt. Die Reaktionen werden durch Zugabe von 30 μl Ethylenglykol beendet. Die Antikörper werden auf einer in PBS, pH 7,2, gepackten MATREX GH 25-Säule (1 cm × 30 cm) gereinigt. Zur Erhöhung des pH-Werts gibt man ein Zehntel Volumen 1 M Natriumhydrogencarbonat zu, und danach wird die Verbindung 30 (Beispiel 19) mit einem Farbstoff/Protein-Molverhältnis von 100 : 1 zugegeben. Nach 2stündigem Rühren des Ansatzes bei Raumtemperatur wird Natriumcyanoborhydrid mit einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben und der Ansatz danach 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Antikörperkonjugate werden durch Dialyse und auf MATREX GH 25-Säulen wie oben beschrieben gereinigt. Antikörper, die 1 Stunde oxidiert wurden, ergeben typischerweise einen Substitutionsgrad von 1 mol Farbstoff pro Mol IgG. Antikörper, die 2 Stunden oxidiert wurden, ergeben einen Substitutionsgrad von 1,7 mol Farbstoff pro Mol IgG.
Beispiel 38. Gesamtfluoreszenz ausgewählter Farbstoff-Protein-Konjugate in Abhängigkeit vom Substitutionsgrad:
Eine Reihe von Ziege-Anti-Maus-IgG-Konjugaten wird wie in Beispiel 37 hergestellt, so daß sich Derivate mit ähnlichen Substitutionsgraden (Degrees of Substitution, DOS) ergeben. Beim Messen in einem Fluoreszenzspektrometer besitzen die sulfonierter-Xanthenfarbstoffkonjugate typischerweise eine höhere Fluoreszenz als Farbstoffe mit ähnlichem Spektrum (Tabelle 5). Wie in 2 dargestellt, zeigen die Fluoreszenzemissionsspektren der Ziege-Anti-Maus-IgG-Konjugate der Verbindung 5 (DOS 4,0) und von CY-3 (DOS 3,8) bei denselben optischen Dichten und bei einer Anregungswellenlänge von 530 nm eine durch das erfindungsgemäße Farbstoffkonjugat wesentlich erhöhte Fluoreszenz (Fluoreszenzstandard: Tetramethylrhodamin).
Tabelle 5:
Des weiteren zeigt die Fluoreszenz der Antikörperkonjugate der Verbindungen 1, 4, 5, 7 und 14 kein nennenswertes Quenchen, selbst bei relativ hohen Substitutionsgraden (wie beispielsweise in 3 anhand des Verbindung-7-Ziege-Anti-Maus-IgG-Konjungats und des TEXAS RED-X-Ziege-Anti-Maus-Konjugats gezeigt). Ähnliche Ergebnisse werden mit anderen Peptiden und Proteinen, einschließlich Lectinen, Protein A, Transferrin, Fibronectin, Enzymen, Lipoproteinen, Glykoproteinen und Neuropeptiden, erhalten.
Beispiel 39. Markierung von R-Phycoerythrin mit einem thiolreaktiven sulfonierten Xanthenfarbstoff:
Mit Pyridyldisulfid modifiziertes R-Phycoerythrin (Molecular Probes, Inc.), 0,9 mg in 160 μl PBS, pH 7,5, wird mit Tris(2-carboxyethyl)phosphin zur Reduktion des Disulfids zu einem Thiol umgesetzt. Das thiolierte Protein wird mit 8 μl einer Lösung von 20 mg/ml der Verbindung 24 (Beispiel 28) in DMF behandelt. Nicht umgesetzter Farbstoff wird über eine „Spin Column" abgetrennt. Der Grad der Substitution mit dem Farbstoff wird unter Verwendung von ε = 52600 cm^–1M^–1 bei 595 nm geschätzt. Die Proteinkonzentration wird anhand der Absorption bei 488 nm geschätzt, wobei für die Absorption der Verbindung 24 bei dieser Wellenlänge korrigiert wird.
Beispiel 40. Fluoreszenzenergietransfer in einem sulfoniertes-Rhodaminkonjugat von R-Phycoerythrin:
Das R-Phycoerythrinkonjugat aus Beispiel 39 wird bei 488 nm angeregt und mit dem bei der gleichen Wellenlänge angeregten, nicht modifizierten R-Phycoerythrin verglichen. In 4 ist ein hocheffizienter Energietransfer vom Protein auf den sulfonierten Rhodaminfarbstoff zu sehen. Ein Konjugat dieses Komplexes mit Streptavidin wird im wesentlichen wie in Haugland (METH. MOL. BIOL. 45, 205 (1995), supra) beschrieben hergestellt. In diesem Konjugat sind die Energietransfereigenschaften erhalten, und es eignet sich zur Zellfärbung in Durchflußcytometern, in denen der Argon-Ionenlaser zur Anregung eingesetzt wird.
Beispiel 41. Markierung und Verwendung eines Weizenkeimagglutinin-Farbstoff-Konjugats:
Weizenkeimagglutinin (170 mg, EY Laboratories) wird in 5 ml Na₂CO₃, pH 9,0, mit 14,9 mg N-Acetylglucosamin gelöst. Dazu gibt man 14,8 mg Verbindung 19 (Beispiel 20). Nach 1 Stunde wird die Lösung mittels Gelfiltration gereinigt. Ein Substitutionsgrad von 2–3 Farbstoffen pro Molekül wird aus der Absorption bei 490 nm bestimmt.
Staphylococcus aureus wird mit dem entstandenen Konjugat (Verbindung 37) 15 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt. Mit Verbindung 37 angefärbte Bakterien sind bei der Messung in einem quantitativen Mikroskop 1,4 mal heller als Bakterien, die in ähnlicher Weise mit einem Fluoreszein-Weizenkeimagglutinin-Konjugat angefärbt wurden. Bei einer Verwendung gemäß Sizemore et al. (US-Patent 5,137,810) kann mit Verbindung 37 zwischen gram-positiven und gram-negativen Bakterien unterschieden werden.
Beispiel 42. Gleichzeitige Markierung von Actin und Tubulin in kultivierten Säugerzellen:
Man läßt Lungenarterienzellen aus Rind (Bovine Pulmonary Artery Cells, BPAEC) auf Glas bis zu 30–50% Konfluenz anwachsen. Die Zellen werden mit 3,7% Formaldehyd fixiert, mit 0,2% Triton X-100 permeabilisiert und mit 6% Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumin, BSA) blockiert. Alle Zellen werden 60 min lang mit monoklonalem Maus-Anti-α-Tubulin inkubiert, danach gewaschen und zur Anfärbung auf zwei Gruppen verteilt.
Die erste Gruppe von Zellen wird mit einem Konjugat aus Ziege-Anti-Maus-IgG und Verbindung 5 30 min markiert, danach gewaschen und dann mit einem Phalloidin-Farbstoff-Konjugat (Verbindung 35, Beispiel 31) weitere 30 min inkubiert. Die zweite Gruppe von Zellen wird 30 min mit CY-3-konjugiertem Ziege-Anti-Maus-IgG markiert und danach mit fluoreszeinkonjugiertem Phalloidin. Beide Gruppen von Zellen zeigen mit roter Fluoreszenz markierte Mikrotuboli und mit grüner Fluoreszenz markierte Actinfilamente.
Quantitative Intensitätsmessungen während des Photobleaching des grünen bzw. roten Signals auf beiden Gruppen von Zellen werden durchgeführt, indem der Objektträger einer Anregung bei 485 nm ausgesetzt wird und die grüne bzw. rote Zellfluoreszenzintensität mit einer CCD-Kamera aufgezeichnet wird.
Die Fluoreszein- und CY-3-Signale von in PBS fixierten Zellen weisen niedrigere Anfangsintensitäten und/oder ein schnelleres Photobleaching auf als Verbindung 35 bzw. das Anti-Mauskonjugat der Verbindung 5. Weitere Zellbestandteile werden gegebenenfalls mit zusätzlichen Farbstoffen, deren Spektren voneinander unterschieden werden können, angefärbt. So werden beispielsweise Zellkerne mit DAPI mit einer blauen Fluoreszenz angefärbt, während andere Zellantigene mit Antikörperkonjugaten von CY-5 mit tiefroter Fluoreszenz angefärbt werden.
Beispiel 43. Photobleaching von mit Konjugaten von sulfoniertem Xanthenfarbstoff angefärbten Zellen:
Actinfilamente werden entweder mit Verbindung 35 oder Fluoreszein-Phalloidin angefärbt. Nach dem Waschen wird jede Probe kontinuierlich bestrahlt und in einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Durch relative Photobleachinggeschwindigkeiten, wie in 5 gezeigt ist, wird die bessere Photostabilität des sulfonierter-Rhodaminfarbstoff-Phalloidin-Konjugats in deutlicher Weise demonstriert.
Beispiel 44. Verwendung von Protein-Farbstoff-Konjugaten als Immunreagentien und Stabilität gegenüber Photobleaching:
Antikörperkonjugate der in Tabelle 5 aufgeführten Farbstoffe werden mit Substitutionsgraden von ungefähr 4–6 hergestellt. INOVA-Objektträger werden 30 Minuten in PBS mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) hydratisiert. Man läßt die Flüssigkeit vom Objektträger ablaufen und trägt dann menschlichen Autoantikörper auf, und danach wird der Objektträger 30 min inkubiert und anschließend mit PBS gespült. Danach wird Maus-Anti-Mensch-Antikörper aufgetragen, der Objektträger 30 min inkubiert und mit PBS gespült. Die fluoreszierenden Anti-Maus-Antikörperkonjugate werden jeweils als 10-μg/ml-Lösung, verdünnt in 1% BSA/PBS, aufgetragen. Nach dem Waschen und Fixieren werden die Proben durch einen entsprechenden Filter beobachtet. In allen Proben ist vorwiegend eine Kernfärbung zu sehen. Durch quantitative Intensitätsmessungen lassen sich Farbstoffe miteinander vergleichen. Bei Verwendung einer biotinylierten Anti-Maus-Präparation und fluoreszierenden Streptavidinkonjugaten werden ähnliche Ergebnisse erzielt.
Für die Photobleaching-Messungen wird alle 5 Sekunden über einen Zeitraum von 100 Sekunden bei kontinuierlicher Bestrahlung jeweils ein Bild des Objektträgers aufgenommen. Drei Felder mit Zellen werden gebleacht und danach die Photobleaching-Werte normiert und Bemittelt (6). Die Antikörperkonjugate der sulfonierten Xanthenfarbstoffe sind deutlich photostabliler als andere Farbstoffe mit vergleichbaren Spektren, einschließlich des CY-3-sulfoniertes-Carboncyaninfarbstoffs.
Beispiel 45. Herstellung und Verwendung eines fluoreszierenden α-Bungarotoxin-Farbstoff-Konjugats:
α-Bungarotoxin (1 mg) in 25 μl 0,1 M NaHCO₃ wird mit 1,5 Äquivalenten Verbindung 19 (Beispiel 20) 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Produkt wird über Größenausschluß- und Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Die Anfärbung von Acetylcholinrezeptoren sowie der Nachweis ihrer daraus resultierenden Fluoreszenz ist vergleichbar mit dem von fluoreszeinkonjugiertem α-Bungarotoxin, außer daß die Fluoreszenz des Konjugats mit dem sulfonierten Xanthenfarbstoff heller und stabiler gegenüber Photobleaching ist.
Beispiel 46. Herstellung von Aminodextran-Farbstoff-Konjugaten:
10 mg/ml Aminodextran (50 mg) mit einem Molekulargewicht von 70000 und mit im Durchschnitt 13 Aminogruppen derivatisiert werden in 0,1 M NaHCO₃ gelöst. Ein aminreaktives Derivat des sulfonierten Xanthenfarbstoffs wird zugegeben, so daß ein Farbstoff/Dextran-Verhältnis von ~12 erhalten wird. Nach 6 Stunden wird das Konjugat auf SEPHADEX G-50 gereinigt, wobei mit Wasser eluiert wird. Typischerweise sind ~6 mol Farbstoff an Dextran mit einem Molekulargewicht von 70000 konjugiert.
Beispiel 47. Herstellung von mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Mikrokügelchen:
Zur Modifikation von Mikropolymerkügelchen mit sulfonierten Xanthenfarbstoffen lassen sich verschiedene Verfahren verwenden, beispielsweise kovalente Kopplung an mit Amin oder Carbonsäure modifizierte Mikrokügelchen oder Bindung von farbstoffmarkierten Proteinen an Mikrokügelchen. Beispielsweise werden 1,0 μm große, aminderivatisierte Mikropolystyrolkügelchen in 100 mM NaHCO₃, pH 8,3, supendiert, so daß ~2% Feststoff vorliegt, und mit 2 mg/ml eines aminreaktiven sulfonierten Xanthenfarbstoffs inkubiert. Nach 1 Stunde werden die Mikrokügelchen zentrifugiert und mit Puffer gewaschen.
Die größeren Partikel lassen sich hinsichtlich Gleichmäßigkeit der Anfärbung und Helligkeit im Durchflußcytometer analysieren. Unter einem Mikroskop erscheinen die markierten „Beads" als Kugeln mit dünnen Ringen an ihrer Oberfläche. Sie sind besonders zur Kalibrierung von Mikroskopen, insbesondere von konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen, sowie als photostabilie Standards für die Durchflußcytometrie geeignet. Die Mikrokügelchen lassen sich weiterhin an Proteine, Oligonukleotide, Haptene und andere Biomoleküle für Assays koppeln, wobei im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren verwendet werden. Mit den sulfonierten Xanthenfarbstoffen markierte Mikrokügelchen scheinen photostabiler zu sein als diejenigen, die an der Oberfläche mit anderen Farbstoffen mit vergleichbaren Spektren markiert sind.
Beispiel 48. Herstellung fluoreszierender Liposomen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Farbstoffe:
Die erfindungsgemäßen sulfonierten Xanthenfarbstoffe sind hinreichend wasserlöslich, um in dem Innenraum von Liposomen mit im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren eingebaut werden zu können (J. BIOL. CHEM. 257, 13892 (1982) und PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 75, 4194 (1978)). Alternativ werden Liposomen, die in ihren Membranen sulfonierte Xanthene mit einem lipophilen Substituenten (z. B. Alkyl mit 11–22 Kohlenstoffatomen) enthalten, hergestellt, indem das fluoreszierende Lipid und das (die) nicht markierte(n) Phospholipid(e), aus dem (denen) sich das Liposom zusammensetzt, vor Bildung der Liposomendispersion zusammen gelöst werden, wie es im wesentlichen in Szoka, Jr. et al. (ANN. REV. BIOPHYS. BIOENG. 9, 467 (1980)) beschrieben ist.
Beispiel 49. Herstellung von Fluoreszenzfarbstoffkonjugaten von Bakterien:
10 mg/ml durch Hitze abgetötete Escherichia coli werden in einem Puffer mit pH 8–9 suspendiert und danach mit 0,5–1,0 mg/ml eines aminreaktiven sulfonierten Xanthenfarbstoffs inkubiert. Nach 30–60 Minuten werden die markierten Bakterien zentrifugiert und mehrere Male mit Puffer gewaschen, um jeglichen nicht konjugierten Farbstoff zu entfernen. Opsonisierte markierte Bakterien werden von Makrophagen aufgenommen, wie mittels Durchflußcytometrie bestimmt wird.
Beispiel 50. Herstellung von DNA-Hybridisierungssonden unter Verwendung von fluoreszierenden Nukleotid-Farbstoff-Konjugaten:
Für jeden Markierungsansatz wird ein Mikrozentrifugenröhrchen, das ~1 μg eines 700 bp großen Hind III-Bgl II-Fragments des lacZ-Strukturgens von E. coli enthält, ~10 Minuten bei 95°C erhitzt, so daß die Stränge vollständig getrennt werden. Danach wird die DNA auf Eis abgekühlt. Man gibt 2 μl eines 2-mg/ml-Gemischs aus Hexanukleotiden mit Zufallssequenz in 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 0,1 M MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol und anschließend 2 μl eines dNTP-Markierungsgemischs (1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,65 mM dTTP und 0,35 mM Verbindung 36 (Beispiel 33)) zu. Danach wird das Volumen mit sterilem Wasser auf 19 μl gebracht und 1 μl Klenow-DNA-Polymerase (2 Einheiten/μl) zugegeben. Die Proben werden 1 Std. bei 37°C inkubiert und die Reaktionen dann mit 2 μl 0,2 M EDTA, pH 8,0, beendet. Die markierte DNA wird mit 2,5 μl 4 M LiCl und 75 μl –20°C kaltem Ethanol präzipitiert. Nach 2 Stunden bei –20°C werden die präzipitierten Nukleinsäuren bei 12000 UpM zentrifugiert. Die Pellets werden zunächst mit kaltem 70%igem Ethanol und danach mit kaltem 100%igem Ethanol gewaschen. Danach werden die Pellets getrocknet und in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA gelöst. Von jeder Probe wird jeweils ein Teil mittels Gelelektrophorese auf einem 1%igen Agarose-Minigel unter Standardbedingungen analysiert. Die markierten DNA-Produkte sind für in-situ-Hybridisierungsexperimente zum Nachweis von RNA oder DNA geeignet, wie z. B. in Verbindung mit dem E. coli-lacZ-Gen in Zellen oder Geweben.
Beispiel 51. Einbau von fluoreszierenden Nukleotidkonjugaten in DNA-Amplifikationsprodukte:
Ein DNA-Amplifikationsansatz wird wie folgt hergestellt: jeweils 1 μl von 20-μM-Lösungen zweier Oligonukleotidprimer, die mit dem humanen β-Actingen hybridisieren, wird zu einem Markierungsansatz mit 5 μl Matrizen-DNA (100 pmol eines das gesamte Gen enthaltenden Plasmids), 5 μl 10X-Reaktionspuffer (100 mM Tris, pH 8,3, 500 mM KCl), 2,5 μl 1 mM Verbindung 36 (Beispiel 33), 1 μl 10 mM dATP, 1 μl 10 mM dCTP, 1 μl 10 mM dGTP, 1,5 μl 5 mM dTTP, 3 μl 25 mM MgCl₂ sowie 28 μl destilliertem deionisiertem Wasser gegeben. Die Probe wird in einen Thermocycler übertragen und wie folgt bearbeitet: ein Zyklus, 94°C, 2,5 Minuten; 30 Zyklen, 94°C, 1 Minute, 50°C, 1 Minute, 72°C, 1 Minute; ein Zyklus, 72°C, 5 Minuten; dann 4°C über Nacht. Ein Aliquot der Probe wird mit einem gleichen Volumen 10%igem Glycerin gemischt, auf ein 0,9%iges Agaroseminigel geladen und einer Elektrophorese unterzogen. Durch Illumination des Gels mit ultraviolettem Licht von 300 nm werden Fluoreszenzbanden der erwarteten Größe sichtbar.
Beispiel 52. In-situ-Hybridisierung einer RNA-Sonde:
Maus-Fibroblasten werden mit Standardverfahren fixiert und für in-situ-Hybridisierung mit mRNA vorbereitet. Eine sulfoniertes-Xanthen-RNA-Sonde wird durch in-vitro-Transkription eines Plasmids, das das stromabwärts von einem RNA-Polymerasepromotor des Phagen T3 klonierte Actin-Strukturgen der Maus enthält, hergestellt. Markierungsansätze bestehen aus der Kombination von 2 μl Matrizen-DNA (1 μg DNA), jeweils 1 μl 10 mM ATP, CTP und GTP, 0, 75 μl 10 mM UTP, 2, 5 μl Verbindung 36 (Beispiel 33), 2 μl 10X-Transkriptionspuffer (400 mM Tris, pH 8,0, 100 mM MgCl₂, 20 mM Spermidin, 100 mM NaCl), 1 μl T3-RNA-Polymerase (40 Einheiten/μl), 1 μl 2 mg/ml BSA und 8,75 μl Wasser. Die Reaktionsansätze werden zwei Stunden bei 37°C inkubiert.
Die Matrizen-DNA wird durch 15minütige Behandlung mit 20 Einheiten DNase I bei 37°C entfernt. Das RNA-Transkript wird durch Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol : Chloroform, 1 : 1, und anschließender Chromatographie auf SEPHADEX G50 gereinigt. Die markierte RNA wird 5 Minuten bei 50°C denaturiert und danach mittels Standardverfahren mit Zellpräparationen hybridisiert. Nach Waschen der Präparationen zeigen die Actin-mRNA exprimierenden Zellen bei Beobachtung durch einen Fluoreszein-Filtersatz in einem Fluoreszenzmikroskop eine leuchtend grüne Fluoreszenz.
Beispiel 53. Diskriminierung von lebenden und toten Zellen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Farbstoffe:
Aufgrund der Polarität der sulfonierten Xanthenfarbstoffe sowie ihrer relativen Unfähigkeit, die Membranen lebender Zellen zu durchdringen, lassen sich die reaktiven Farbstoffe dazu verwenden, zwischen Zellen mit intakten Zellmembranen und Zellen mit beschädigten Zellmembranen in einem Einfarbentest wie folgt zu unterscheiden:
Monocyten-Makrophagenzellen, transformiert mit dem Abelson Leukemia Virus, aus Maus (RAW264.7) werden trypsinisiert und mit phosphatgepufferter Kochsalz lösung (Phosphate Buffered Saline, PBS), pH 7,2, gewaschen. Ungefähr 8–10 Millionen, in 180 μl PBS, pH 7,2, suspendierte Zellen werden in ein Test-Glasröhrchen gegeben und in einem Wasserbad 20 Minuten bei 50°C erwärmt, um einen Teil der Zellen abzutöten. Danach gibt man ungefähr 60 μl (2–3 Millionen Zellen) der Zellsuspension und anschließend 0,1 μl einer Lösung von 1 mg/ml Verbindung 1 in DMSO in 940 μl PBS, pH 7,2. Der Ansatz wird 30 Minuten auf Eis inkubiert und dann zweimal mit PBS gewaschen, wonach 200 μl PBS, pH 7,2, sowie 2 μl einer Lösung von 150 μM Propidiumiodid in Wasser (als Kontrolle zur Diskriminierung toter Zellen) zugegeben werden. Die Analyse der Zellsupension mit Durchflußcytometrie zeigt, daß die toten Zellen (wie durch stark rote Fluoreszenz bestimmt) eine durchschnittliche Kanalfluoreszenz- (Mean Channel Fluorescence, MCF-)Intensität von etwa 3100 aufweisen, während die Lebendzellen eine MCF-Intensität von etwa 50 besitzen.
Alternativ werden die Zellen nach Inkubation mit Verbindung 1 vor der Analyse mit Durchflußcytometrie mit 3% Formaldehyd fixiert. Durch die Fixierung wird die Gefahr des Arbeitens mit pathogenen Zellen verringert.
Beispiel 54. Herstellung und Verwendung eines Antifarbstoffkonjugats zur Verstärkung der Fluoreszenzmarkierung:
Polyklonales Anti-Fluoreszein-Kaninchen-IgG (Molecular Probes) wird im wesentlichen wie in Beispiel 36 beschrieben mit Verbindung 19 unter Erhalt der Verbindung 38 konjugiert. A431-Zellen werden mit Standardverfahren mit 0,125 μg fluoreszeinkonjugiertem epidermalen Wachstumsfaktor (Fluoreszein-EGF) angefärbt. Nach zweimaligem Waschen mit 1% BSA in PBS mit 2 mM Natriumazid (Waschpuffer) wird ein Teil der Zellen zusätzlich mit 3,5 μg Verbindung 38 angefärbt. Das Gemisch wird 30 Minuten auf Eis inkubiert, mit dem Waschpuffer gewaschen und dann mittels Durchflußcytometrie analysiert. Die Ergebnisse zeigen eine ungefähr 3fache Verstärkung der Helligkeit der Zelle bei Amplifikation mit Verbindung 38 verglichen mit der Anfärbung mit Fluoreszein-EGF allein.
Das Fluoreszenzsignal läßt sich dadurch verstärken, daß die Kaninchen-Anti-Fluoreszein-Antikörper mit einem zusätzlichen Kaninchen-Antikörper, der mit zusätzlichen erfindungsgemäßen Farbstoffen (mit denselben oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften) konjugiert wurde, behandelt werden. Die Ergebnisse zeigen eine ungefähr 11fache Verstärkung des Fluoreszenzsignals bei Verwendung dieser Art von sequentieller Verstärkung.
Beispiel 55. Herstellung und Verwendung eines Antifarbstoffkonjugats zum Quenchen der Fluoreszenz:
Es werden beispielsweise Antikörper gegen den Fluorophor der Verbindung 1 in Kaninchen unter Verwendung von Standardverfahren und dem Hämocyanin der Schlüsselloch-Schnecke (Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH) als Immunogen hergestellt. Die entstandenen Antikörper werden mit Verbindung 19 markiert. Der entstandene markierte Antikörper quencht mehr als 90% der Fluoreszenz der Verbindung 1 in Lösung.
Beispiel 56. Tracing von Zellen mit einem hydrazidmarkierten Fluorophor:
Neuronen aus Zebrafischembryos werden mit Verbindung 33 (Beispiel 31) mikroinjiziert, wobei Standardverfahren wie in Blankenfeld et al. (J. NEUROSCI. METH. 36, 309 (1991)) beschrieben verwendet werden. Der gesamte Innenraum der Neuronen füllt sich schnell mit dem Farbstoff, so daß ihre rote Fluoreszenz leicht zu beobachten ist, selbst in ihren dünneren Fortsätzen. Die Färbung läßt sich mit Formaldehyd und Standard-Fixierverfahren in den Zellen fixieren. Alternativ werden die Hydrazidfarbstoffe oder ihre Konjugate unter Verwendung des in Okada et al. (CELL, 29, 33 (1982)) beschriebenen Saccharose/Polyethylenglykol-Verfahrens in die Zellen eingeführt.
Beispiel 57. Herstellung und Charakterisierung eines quervernetzten Allophycocyaninkonjugats:
Eine Lösung aus 10 mg/ml von chemisch quervernetztem Allophycocyanin (Yeh et al., CYTOMETRY 8, 91 (1987)) in 0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,5, wird hergestellt. Eine Lösung von Verbindung 19 in wasserfreiem DMF wird bei einer Konzentration von 10 mg/ml hergestellt. Man gibt zu Allophycocyaninlösung soviel Farbstofflösung hinzu, daß sich ein Molverhältnis von Farbstoff zu Protein von 45 ergibt, und die Lösung wird anschließend gerührt. Nach 1stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Reaktion durch Zugabe von 1,5 M Hydroxylamin bei pH 8,0 in einer 0,1 Reaktionsvolumen entsprechenden Menge beendet. Das Reaktionsgemisch wird weitere 30 Minuten inkubiert. Das Energietransferkonjugat wird über Größenausschlußchromatographie auf BioGel P-30 (BioRad) gereinigt.
Lösungen von quervernetztem APC sowie dem Verbindung-l9-Konjugat von quervernetztem APC werden bei vergleichbaren optischen Dichten bei 488 nm angeregt und die resultierenden Fluoreszenzemissionsspektren aufgezeichnet. Quervernetztes Allophycocyanin zeigt eine Fluoreszenzemission bei 650 nm bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm. Die Anregung des Verbindung-l9-Konjugats des quervernetzten Allophycocyanins führt zu einer wesentlich verstärkten Emission durch das Allophycocyanin aufgrund der Anregung des sulfonierten Rhodamins bei 488 nm und nachfolgendem effizientem Energietransfer auf das Phycobiliprotein, wie in 7 gezeigt.

Claims

Verbindung mit der Formel
worin R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander für H, F, Cl, Br, I, CN; oder C₁-C₁₈-Alkyl oder C₁-C₁₈-Alkoxy, wobei jede Alkyl- oder Alkoxygruppe gegebenenfalls weiterhin mit F, Cl, Br, I, einer Carbonsäure, einem Carbonsäuresalz oder einem Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols substituiert ist; oder für -SO₃X, wobei X für H oder ein Gegenion steht, stehen; R¹ und R⁶ für H stehen; A für NR⁸R⁹ steht, R⁸ und R⁹ unabhängig voneinander für H, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Carboxyalkyl, C₁-C₆-Sulfoalkyl, ein Cl-C₆-Carboxyalkylsalz oder ein C₁-C₆-Sulfoalkyl salz, wobei die Alkylanteile gegebenenfalls mit Amino, Hydroxy, Carbonsäure, einem Carbonsäuresalz oder einem Carbonsäureester einer C₁-C₆-Alkylgruppe substituiert sind, stehen; oder R⁸ zusammen mit R⁹ einen gesättigten 5- oder 6gliedrigen Heterocyclus bildet, bei dem es sich um ein Piperidin, ein Morpholin, ein Pyrrolidin oder ein Piperazin handelt, das jeweils gegebenenfalls mit Methyl, Carbonsäure, einem Carbonsäuresalz oder einem Carbonsäureester einer C₁-C6-Alkylgruppe substituiert ist; oder R⁸ zusammen mit R² bzw. R⁹ zusammen mit R³ bzw. beide Reste einen 5- oder 6gliedrigen Ring bilden, der gesättigt oder ungesättigt ist und gegebenenfalls mit einer oder mehreren C₁-C₆-Alkylgruppen oder -CH₂SO₃X-Gruppierungen substituiert ist; B für N+R¹8R¹⁹ steht; wobei R¹⁸ und R¹⁹ unabhängig voneinander für H, Cl-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Carboxyalkyl, C₁-C₆-Sulfoalkyl, ein C₁-C6-Carboxyalkylsalz oder ein C₁-C₆-Sulfoalkylsalz, wobei die Alkylanteile gegebenenfalls mit Amino, Hydroxy, Carbonsäure, einem Carbonsäuresalz oder einem Carbonsäureester einer C₁-C₆-Alkylgruppe substituiert sind, stehen; oder R¹⁸ zusammen mit R¹⁹ einen gesättigten 5- oder 6gliedrigen Heterocyclus bildet, bei dem es sich um ein Piperidin, ein Morpholin, ein Pyrrolidin oder ein Piperazin handelt, das jeweils gegebenenfalls mit Methyl, Carbonsäure, einem Carbonsäuresalz oder einem Carbonsäureester einer C₁-C₆-Alkylgruppe substituiert ist; oder R¹⁸ zusammen mit R⁴ bzw. R¹⁹ zusammen mit R⁵ bzw. beide Reste einen 5- oder 6gliedrigen Ring bilden, der gesättigt oder ungesättigt ist und gegebenenfalls mit einer oder mehreren C₁-C₆-Alkylgruppen oder -CH₂SO₃X-Gruppierungen substituiert ist; R¹⁰ die Formel
besitzt, wobei R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander für H, F, Cl, Br, I, -SO₃X, eine Carbonsäure, ein Carbonsäuresalz, CN, Nitro, Hydroxy, Azido, Amino, Hydrazino; oder für C₁-C₁₈-Alkyl, C₁-C₁₈-Alkoxy, C₁-C₁₈-Alkylthio, C₁-C₁₈-Alkanoylamino, C₁-C₁₈-Alkylaminocarbonyl, C₂-C₃₆-Dialkylaminocarbonyl, C₁-C₁₈-Alkyloxycarbonyl oder C₆-C₁₈-Arylcarboxamido, wobei die Alkyl- bzw. Arylanteile gegebenenfalls ein- oder mehrfach mit F, Cl, Br, I, Hydroxy, Carbonsäure, einem Carbonsäuresalz, einem Carbonsäureester eines C₁-C₆-Alkohols, -SO₃X, Amino, Alkylamino, Dialkylamino oder Alkoxy, wobei die Alkylanteile jeweils 1–6 Kohlenstoffatome aufweisen, substituiert sind, stehen; oder eines der Paare benachbarter Substituenten R¹³ und R¹⁴, R¹⁴ und R¹⁵ bzw. R¹⁵ und R¹⁶ jeweils zusammengenommen einen kondensierten 6gliedrigen aromatischen Ring bilden, der gegebenenfalls weiterhin mit Carbonsäure oder einem Carbonsäuresalz substituiert ist; und worin gegebenenfalls einer oder mehrere der Reste R², R³, R⁴, R⁵, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶, R¹⁸ und R¹⁹ -L-R_x oder -L-S_c bedeutet oder zu -L-R_x oder -L-S_c modifiziert ist; worin L jeweils gegebenenfalls gleich oder verschieden ist und eine kovalente Verknüpfung bedeutet; R_x jeweils gegebenenfalls gleich oder verschieden ist und eine reaktive Gruppe bedeutet; und S_c jeweils gegebenenfalls gleich oder verschieden ist und eine konjugierte Substanz bedeutet, vorausgesetzt, daß wenigstens einer der Reste R², R³, R⁴ und R⁵ für -SO₃X steht; oder R⁸ zusammen mit R² bzw. R⁹ zusammen mit R³ bzw. R¹⁰ zusammen mit R⁴ bzw. R¹⁹ zusammen mit R⁵ einen 5- oder 6gliedrigen Ring bildet, der gesättigt oder ungesättigt ist und mit wenigstens einer -CH₂SO₃X-Gruppierung substituiert ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin einer oder mehrere der Reste R² , R³ , R⁴ , R⁵, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶, R¹⁸ und R¹⁹ -L-R_x oder -L-S_c bedeutet oder zu -L-R_x oder -L-S_c modifiziert ist, wobei -L-R_x oder -L-S_c die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin einer der Reste R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ für -L-R_x oder -L-S_c steht.
Verbindung nach Anspruch 3 , worin R¹⁴ oder R¹⁵ für -L-R_x oder -L-S_c steht .
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin L jeweils unabhängig eine kovalente Einzelbindung oder eine kovalente Verknüpfung, die 1–24 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C, N, O, P und S, aufweist und aus einer beliebigen Kombination aus Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfach-, -Doppel- oder -Dreifachbindungen oder aromatischen Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen, Stickstoff-Stickstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Schwefel-Bindungen, Phosphor-Sauerstoff-Bindungen sowie Phosphor-Stickstoff-Bindungen zusammengesetzt ist, bedeutet; R_x jeweils eine Acrylamid-, eine aktivierte Carbonsäureester-, eine Hydroxyl-, eine Aldehyd-, eine Alkylhalogenid-, eine Sulfonat-, eine Amino-, eine Anhydrid-, eine Anilin-, eine Arylhalogenid-, eine Azid-, eine Aziridin-, eine Boronat-, eine Carbonsäure-, eine Carbodiimid-, eine Diazoalkan-, eine Epoxid-, eine Glykol-, eine Halogenacetamid-, eine Halogentriazin-, eine Hydrazin-, eine Hydroxylamin-, eine Imidoester-, eine Isocyanat-, eine Isothiocyanat-, eine Keton-, eine Maleimid-, eine Phosphoramidit-, eine Sulfonylhalogenid- oder eine Thiolgruppe bedeutet; und S_c jeweils eine Aminosäure, ein Peptid, Protein, Monosaccharid, Disaccharid, Polysaccharid, eine ionenkomplexierende Gruppierung, ein Nukleotid, Nukleinsäurepolymer, Hapten, Arzneistoff, Lipid, einen Lipidverbund, ein nichtbiologisches organisches Polymer, Mikropolymerteilchen, eine tierische Zelle, pflanzliche Zelle, ein Bakterium, eine Hefe, ein Virus oder einen Protisten bedeutet.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin L eine kovalente Einfachbindung und R_x eine Carbonsäure-, eine aktivierte Carbonsäureester-, eine Amino-, eine Azid-, eine Hydrazin-, eine Halogenacetamid-, eine Alkylhalogenid-, eine Isothiocyanat- oder eine Maleimidgruppe bedeutet.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin S_c ein Peptid, Protein, Polysaccharid, Nukleotid oder Nukleinsäurepolymer bedeutet und gegebenenfalls weiterhin mit einem oder mehreren zusätzlichen fluoreszierenden oder nichtfluoreszierenden Farbstoffen substituiert ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin S_c einen Antikörper, ein Avidin, ein Streptavidin, ein Lectin, einen Wachstumsfaktor, ein Actin oder ein Toxin bedeutet und gegebenenfalls ein Phycobiliprotein, das gegebenenfalls chemisch quervernetzt ist, bedeutet.
Verbindung nach Anspruch 8, worin das Phycobiliprotein ein Allophycocyanin ist und/oder weiterhin eine chemisch reaktive Gruppe oder eine konjugierte Substanz enthält.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin R¹² für eine Carbonsäure, ein Carbonsäuresalz oder -SO₃X steht; und entweder (i) wenigstens drei der Reste R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ für F oder Cl stehen; oder (ii) einer der Reste R¹⁴ und R¹⁵ für eine Carbonsäure oder ein Carbonsäuresalz oder für -S-(CH₂)_nCOOH mit n gleich 1–15 steht und der jeweils andere der Reste R¹⁴ und R¹⁵ für H, F oder Cl steht.
Verbindung nach Anspruch 9, worin R¹⁴ oder R¹⁵ für eine Carbonsäure oder für -S-(CH₂)_nCOOH steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin R³ und R⁴ jeweils für -SO₃X stehen.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin wenigstens ein Rest R⁸ zusammen mit R² bzw. R9 zusammen mit R³ bzw. R¹⁸ zusammen mit R⁴ bzw. R¹⁹ zusammen mit R⁵ einen 5- oder 6gliedrigen Ring bildet, der gesättigt oder ungesättigt ist und mit wenigstens einer -CH₂SO₃X-Gruppierung substituiert ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin einer der Reste R⁸, R⁹, R¹⁸ und R¹⁹ für -L-R_x oder -L-S_c steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin R⁸ zusammen mit R² einen 5- oder 6gliedrigen Ring bildet, der gesättigt oder ungesättigt ist und gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten, ausgewählt aus C₁-C₆-Alkylgruppen und -CH₂SO₃X-Gruppierungen, substituiert ist; und R¹⁹ zusammen mit R⁵ einen 5- oder 6gliedrigen Ring bildet, der gesättigt oder ungesättigt ist und gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten, ausgewählt aus C₁-C₆-Alkylgruppen und -CH₂SO₃X-Gruppierungen, substituiert ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin R⁹ und R¹⁸ unabhängig voneinander für H, Methyl oder Ethyl stehen.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin R⁸ zusammen mit R² sowie R¹⁹ zusammen mit R⁵ jeweils einen 5- oder 6gliedrigen Ring bilden, der gesättigt ist; und R³ und R⁴ jeweils für -SO₃X stehen.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin R⁸ zusammen mit R² einen 5- oder 6gliedrigen Ring bildet, der gesättigt oder ungesättigt ist und mit -CH₂SO₃X substituiert ist; und R¹⁹ zusammen mit R⁵ einen 5- oder 6gliedrigen Ring bildet, der gesättigt oder ungesättigt ist und mit -CH₂SO₃X substituiert ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin R¹, R², R⁵ und R⁶ für H stehen, R³ und R⁴ jeweils für -SO₃X stehen und R⁸, R⁹, R¹⁸ und R¹⁹ für H, Cl-C6-Alkyl, C₁-C₆-Carboxyalkyl, C₁-C₆-Sulfoalkyl, ein Cl-C₆-Carboxyalkylsalz oder ein C₁-C₆-Sulfoalkylsalz stehen.
Verbindung nach Anspruch 19, worin R⁸, R⁹, R¹⁸ und R¹⁹ für H stehen und R¹² für eine Carbonsäure oder ein Carbonsäuresalz steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, mit der Formel
worin R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander für H, F, Cl, Br, I, C₁-C₁₈-Alkyl, C₁-C₁₈-Alkoxy oder -SO₃X stehen; R⁸ und R⁹ unabhängig voneinander für H, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Carboxyalkyl, ein C₁-C₆-Carboxyalkylsalz, C₁-C₆-Sulfoalkyl oder ein C₁-C₆-Sulfoalkylsalz stehen; oder R⁸ zusammen mit R² einen 5- oder 6gliedrigen Ring bildet, der gesättigt oder ungesättigt ist und der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten, ausgewählt aus C₁-C₆-Alkylgruppen und -CH₂SO₃X-Gruppierungen, substituiert ist; R¹⁸ und R¹⁹ unabhängig voneinander für H, Cl-C6-Alkyl, C₁-C₆-Carboxyalkyl, ein C₁-C₆-Carboxyalkylsalz, C₁-C₆-Sulfoalkyl oder ein Cl-C₆-Sulfoalkylsalz stehen; oder R¹⁹ zusammen mit R⁵ einen 5- oder 6gliedrigen Ring bildet, der gesättigt oder ungesättigt ist und der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten, ausgewählt aus C₁-C₆-Alkylgruppen und -CH₂SO₃X-Gruppierungen, substituiert ist; R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander für H, Cl, F, Amino, Nitro, -SO₃X, eine Carbonsäure, ein Carbonsäuresalz oder für -S-(CH₂)_nCOOH mit n = 1 – 15 stehen; vorausgesetzt, daß entweder (i) R³ und R⁴ jeweils für -SO₃X stehen; oder (ii) R⁸ zusammen mit R² einen 5- oder 6gliedrigen Ring bildet, der gesättigt oder ungesättigt ist und mit -CH₂SO₃X substituiert ist; und R¹⁹ zusammen mit R⁵ einen 5- oder 6gliedrigen Ring bildet, der gesättigt oder ungesättigt ist und mit -CH₂SO₃X substituiert ist.
Verbindung nach Anspruch 21, die weiterhin das bzw. die in Anspruch 9, Anspruch 10, Anspruch 11 und Anspruch 12 genannte(n) Merkmal (e) oder eine Kombination daraus umfaßt.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin R⁸ zusammen mit R² sowie R¹⁹ zusammen mit R⁵ kondensierte 6gliedrige Ringe bilden, so daß die folgende Struktur erhalten wird:
worin R⁹ und R¹⁸ für H, Methyl oder Ethyl stehen.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 , worin R⁸ zusammen mit R² sowie R¹⁹ zusammen mit R⁵ kondensierte 6gliedrige Ringe bilden, so daß die folgende Struktur erhalten wird:
worin R⁹ und R¹⁸ für H, Methyl oder Ethyl stehen. 25. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin R⁸ zusammen mit R² sowie R¹⁹ zusammen mit R⁵ kondensierte 5gliedrige Ringe bilden, so daß die folgende Struktur erhalten wird:
worin R⁹ und R¹⁸ für H, Methyl oder Ethyl stehen.
Verfahren zum Anfärben einer biologischen Probe, welches die folgenden Schritte umfaßt: a) Zusammenbringen einer Färbelösung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1–25 enthält, mit einer biologischen Probe in einer Konzentration, die ausreicht, um eine nachweisbare optische Antwort unter den gewünschten Bedingungen zu erhalten; b) Bestrahlen der Probe bei einer die optische Antwort hervorrufenden Wellenlänge; und gegebenenfalls weiterhin (i) das Zusammenbringen der Probe mit einem zusätzlichen Nachweisreagens, das Spektraleigenschaften aufweist, die sich sich nachweisbar von der optischen Antwort unter scheiden; und/oder (ii) Bestimmen einer Charakteristik der Probe durch Vergleichen der optischen Antwort mit einem Standardantwortparameter, wobei die Probe gegebenenfalls Zellen umfaßt und es sich bei der bestimmten Charakteristik um die Lebensfähigkeit der Zellen handelt oder der Kombinationsschritt Elektroporation, Schockbehandlung, hohe extrazelluläre ATP-Konzentrationen, Mikroinjektion unter Druck, „Scrape Loading", „Patch Clamp Loading", Phagocytose oder die Osmolyse von Pinocytosevesikeln umfaßt; und/oder (iii) Verfolgen der zeitlichen oder räumlichen Lokalisierung der optischen Antwort innerhalb der Probe umfaßt.
Kit, umfassend eine oder mehrere Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 25.
Komplex, umfassend ein Farbstoffkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 25, worin es sich bei S_c um ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars handelt, das nicht kovalent mit dem komplementären Mitglied des spezifischen Bindungspaars assoziiert ist, wobei das spezifische Bindungspaar gegebenenfalls aus den folgenden Paaren ausgewählt ist: Antigen-Antikörper Biotin-Avidin Biotin-Streptavidin Biotin-Antibiotin Immunglobulin G-Protein A Immunglobulin G-Protein G Arzneistoff-Arzneistoffrezeptor Toxin-Toxinrezeptor Kohlenhydrat-Lectin Kohlenhydrat-Kohlenhydratrezeptor Peptid-Peptidrezeptor Protein-Proteinrezeptor Enzymsubstrat-Enzym DNA-aDNA RNA-aRNA Hormon-Hormonrezeptor Ion-Chelator.