DE69632716T2

DE69632716T2 - Verfahren zur drogenuntersuchung

Info

Publication number: DE69632716T2
Application number: DE69632716T
Authority: DE
Inventors: Matthew Ashby; Jasper Rine
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1995-08-09
Filing date: 1996-08-09
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2016-08-10
Also published as: ES2219692T3; EP0791078A1; CA2202154A1; DE69632716D1; EP0791078B1; AU724474B2; US5569588A; JPH10507647A; ATE269414T1; CA2202154C; AU6720996A; WO1997006277A1; DK0791078T3

Description

Hintergrund
Das Gebiet der Erfindung ist das pharmazeutische Wirkstoff-Screening. Die pharmazeutische Forschung und Entwicklung ist eine Multimilliarden-Dollar-Industrie. Eine Menge von diesen Ressourcen werden bei Anstrengungen verbraucht, die Spezifität von Leitverbindungen zu bestimmen. Außerdem werden viele Programme nach Dekaden kostspieliger, jedoch vergeblicher, Anstrengungen, um die Nebenwirkungen oder die Toxizität von Wirkstoffkandidaten zu begrenzen, abgebrochen. Demzufolge sind Hilfsmittel, die die Forschungs- und Entdeckungsphase bei der Wirkstoffentwicklung abkürzen können, wünschenswert. Mehrere in vitro oder auf Zellkultur- basierende Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit einer bestimmten biologischen Wirkung durch die Aktivierung eines verbundenen Reporters sind beschrieben worden. Gadski et al. (1992), EP 92 304 902.7 , beschreibt Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, welche die Synthese eines Apolipoproteins steuern; Evans et al. (1991), US Patent Nr. 4,981,784, beschreibt Verfahren zur Identifizierung eines Liganden für einen Rezeptor und Farr et al. (1994), WO 94/17208, beschreibt Verfahren und kits, die Streßpromotoren verwenden, um die Toxizität einer Verbindung zu bestimmen.
Allgemein war das Prinzip, das in der existierenden pharmazeutischen Industrie zur Entdeckung und Entwicklung von neuen Leitverbindungen für Wirkstoffe angewandt wurde, die Etablierung von empfindlichen und verläßlichen in vitro Assays für gereinigte Enzyme, und anschließend das Screenen von einer großen Anzahl von Verbindungen und Kulturüberständen auf jegliche Fähigkeit, die Enzymaktivität zu inhibieren. Die vorliegende Erfindung nützt die jüngsten Fortschritte der Genomwissenschaft aus, um das schnelle Screenen einer großen Anzahl von Verbindungen gegen ein systemisches Ziel, substantiell umfassend alle Ziele in einem Stoffwechselweg, Organismus, etc., nach seltenen Verbindungen mit der Fähigkeit, das Protein von Interesse zu inhibieren, zu ermöglichen. Die hierin beschriebene Erfindung stellt im wesentlichen den Wirkstoff-Entdeckungsprozeß auf den Kopf. Diese Erfindung stellt Information über den Wirkmechanismus von jeder Verbindung bereit, die Zellen beeinflußt, unabhängig vom Ziel. Außerdem wird die relative Spezifität von allen Leitverbindungen sofort festgestellt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Abschätzung der physiologischen Spezifität eines Wirkstoffkandidaten bereit. Allgemein, die betreffenden Verfahren umfassen: (a) das Ermitteln der Reporter-Genprodukt-Signale von jeder von einer Vielzahl von verschiedenen, getrennt isolierten Zellen eines Zielorganismus, wobei jede der Zellen ein rekombinantes Konstrukt enthält, das ein Reporter-Gen umfaßt, das so mit einem verschiedenen endogenen Transcriptions-Regulatorelement (z. B. Promotor) des Zielorganismus funktional verbunden ist, daß das Transcriptions-Regulatorelement die Expression des Reporter-Gens reguliert, wobei die Vielzahl von Zellen ein Ensemble der Transcriptions-Regulatorelemente des Organismus umfaßt, ausreichend, um das Transcriptions-Ansprechverhalten des Organismus auf einen Wirkstoff zu modellieren; (b) das in Berührung bringen von jeder Zelle mit einem Wirkstoffkandidaten; (c) das Ermitteln der Reporter-Genprodukt-Signale von jeder der Zellen; (d) das Vergleichen der Reporter-Genprodukt-Signale von jeder der Zellen vor und nach dem in Berührung bringen von jeder der Zellen mit dem Wirkstoffkandidaten, um ein Wirkstoffansprechprofil zu erhalten; wobei das Wirkstoffansprechprofil eine Abschätzung der physiologischen Spezifität oder biologischen Interaktionen des Wirkstoffkandidaten bereitstellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Genom-Reporter-Matrix
Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Abschätzung der physiologischen Spezifität eines Wirkstoffkandidaten bereit, indem die Transcriptions-Antworten des Zielorganismus mit einem Ensemble von Reporten modelliert werden, deren Expressionen durch genetische Transcriptions-Regulatorelemente reguliert werden, die aus dem Genom des Zielorganismus stammen. Das Ensemble der als Reporter arbeitenden Zellen umfaßt eine so umfassende Sammlung von genetischen Transcriptions-Regulatorelementen, wie sie für den als Ziel ausgewählten Organismus bequem erhältlich ist, um die systemische Transcriptions-Antwort genauest möglich zu modellieren. Geeignete Ensemble umfassen im Allgemeinen Tausende von individuellen als Reporter arbeitenden Elementen; bevorzugte Ensemble sind im wesentlichen umfassend, d. h. sie stellen eine Transcriptions-Antwort-Mannigfaltigkeit bereit, vergleichbar zu der des Zielorganismus. Im allgemeinen benötigt ein im wesentlichen umfassendes Ensemble genetische Transcriptions-Regulatorelemente von wenigstens einer Mehrheit der Gene des Organismus, und enthält vorzugsweise jene von allen oder nahezu allen Genen. Wir bezeichnen solch ein substantiell umfassendes Ensemble als eine Genom-Reporter-Matrix.
Es ist häufig bequem, ein Ensemble oder eine Genom-Reporter-Matrix, stammend aus einem niederen Eukaryoten oder einem üblichen Tiermodell, zu verwenden, um vorläufige Information über die Wirkstoffspezifität in höheren Eukaryoten, wie z. B. Menschen zu erhalten. Weil Hefe, wie z. B. Saccharomyces-Cerevisial, ein echter Eukaryot ist, gibt es eine substantielle Konservierung der biochemischen Funktion zwischen Hefe und menschlichen Zellen in den meisten Stoffwechselwegen, von dem Biosyntheseweg von Sterol bis zum Ras-Oncogen. In der Tat zeigt die Abwesenheit von vielen wirksamen antifungalen Verbindungen, wie schwierig es war, therapeutische Ziele zu finden, die selektiv Pilzzellen aber keine menschlichen Zellen töten würden. Ein Beispiel für einen gemeinsamen Antwort-Stoffwechselweg ist die Sterolbiosynthese. In menschlichen Zellen inhibiert der Wirkstoff Mevacor (Lovastatin) die HMG-CoA-Reduktase, das regulatorische Schlüsselenzym des Biosynthesewegs von Sterol. Als Folge davon nimmt der Level eines bestimmten regulatorischen Sterols ab und die Zellen antworten durch zunehmende Transcription des für den LDL-Rezeptor kodierenden Gens. In Hefe inhibiert Mevacor auch die HMG-CoA-Reduktase und verringert den Level eines regulatorischen Schlüsselsterols. Hefezellen antworten in einer zu den menschlichen Zellen analogen Weise. Jedoch hat Hefe kein Gen für den LDL-Rezeptor. Statt dessen wird die gleiche Wirkung durch die Zunahme der Transcription des ERG10-Gens gemessen, das für die Acetoacetyl CoA Thiolase kodiert, einem Enzym, das auch an der Sterolsynthese beteiligt ist. Somit ist die regulatorische Antwort zwischen Hefe und Menschen konserviert, auch wenn die Identität des antwortenden Gens verschieden ist.
Vorteile der Genom-Reporter-Matrix als ein Vehikel für die pharmazeutische Entwicklung
Die Vorteile der betreffenden Verfahren gegenüber den Screening-Verfahren des Standes der Technik können durch Beispiele veranschaulicht werden. Man betrachte den Unterschied zwischen einem in vitro Assay für HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren, wie er gegenwärtig von der pharmazeutischen Industrie praktiziert wird, und einem Assay für Inhibitoren der Sterolbiosynthese, wie durch den ERG10-Reporter aufgedeckt. Im Falle des ersteren wird Information nur für jene seltenen Verbindungen erhalten, die dieses eine Enzym inhibieren. Im Gegensatz dazu wird im Falle des ERG10-Reporters jegliche Verbindung, die annähernd irgendeinen der ungefähr 35 Schritte im Biosyntheseweg von Sterol inhibiert, durch das Absenken des intrazellulären Sterollevels, die Synthese des Reporters induzieren. Somit kann der Reporter einen viel breiteren Bereich von Zielen als das gereinigte Enzym ermitteln, in diesem Fall 35-mal mehr als der in vitro Assay.
Wirkstoffe haben oft Nebenwirkungen, die teilweise auf ihre fehlende Zielspezifität zurückzuführen sind. Jedoch stellt der in vitro Assay der HMG-CoA-Reduktase keine Information über die Spezifität einer Verbindung bereit. Im Gegensatz dazu deckt eine Genom-Reporter-Matrix das Spektrum von anderen Genen in dem Genom auf, die auch durch die Verbindung beeinflußt werden. Beim Betrachten von zwei verschiedenen Verbindungen, die beide den ERG10-Reporter induzieren, ist es a priori wahrscheinlicher, daß die erste Verbindung weniger Nebenwirkungen hat, wenn eine Verbindung die Expression von 5 anderen Reportern beeinflußt und eine zweite Verbindung die Expression von 50 anderen Reportern beeinflußt. Weil die Identität der Reporter bekannt oder bestimmbar ist, ist die Information über andere beeinflußte Reporter bezüglich der Art der Nebenwirkung informativ. Eine repräsentative Gruppe von Reportern kann verwendet werden, um Derivate der Leitverbindung zu testen, um zu bestimmen, welche der Derivate eine größere Spezifität als die erste Verbindung haben.
Als ein weiteres Beispiel betrachte man den Fall einer Verbindung, die den in vitro Assay für die HMG-CoA-Reduktase nicht beeinflußt und die Expression des ERG10-Reporters nicht induziert. Bei dem traditionellen Ansatz zur Wirkstoffentdeckung stellt eine Verbindung, die das Ziel, welches getestet wird, nicht inhibiert, keine nützliche Information bereit. Jedoch hat eine Verbindung mit irgendeiner merklichen Wirkung auf einen biologischen Prozeß im Allgemeinen einigen Einfluß auf die Genexpression. Eine Genom-Reporter-Matrix kann somit zwei verschiedene Arten von Information für die meisten Verbindungen bereitstellen. In einigen Fällen verdeutlicht die Identität der durch den Inhibitor beeinflußten Reporter-Gene, wie der Inhibitor funktioniert. Z. B. kann eine Verbindung, die einen cAMP-abhänigen Promotor in Hefe induziert, die Aktivität des Ras-Stoffwechselweges beeinflussen. Sogar wo die Verbindung die Expression eines Satzes von Genen beeinflußt, die das Verhalten der Verbindung nicht verdeutlichen, stellt die Matrix eine umfassende Beurteilung des Verhaltens der Verbindung bereit, die in einer Datenbank für spätere Analysen gespeichert werden kann. Eine Bibliothek von solchen Matrix-Antwortprofilen kann kontinuierlich untersucht werden, ähnlich wie in den chemischen Fachbereichen fortwährend auf die Spektren-Handbücher der Chemie verwiesen wird. Falls die Datenbank beispielsweise aufdeckt, daß Verbindung X die Expression des Gens Y ändert, und ein Artikel publiziert wird, der berichtet, daß die Expression des Gens Y empfindlich ist, z. B., für den Inositolphosphat-Signalstoffwechselweg, ist Verbindung X ein Kandidat für die Modulierung des Inositolphosphat-Signalstoffwechselweges. Im wesentlichen ist die Genom-Reporter-Matrix ein Übersetzer für Information, die die Information über ein Gen direkt auf eine Verbindung überträgt, für die bereits herausgefunden worden sein kann, das sie die Expression des Gens beeinflußt. Dieses Hilfsmittel sollte die Forschungs- und Entdeckungsphase der Wirkstoffentwicklung dramatisch verkürzen, und den Wert des öffentlich zugänglichen Forschungsportfolios über alle Gene wirkungsvoll verstärken.
In vielen Fällen würde ein Wirkstoff von Interesse auf Proteinziele einwirken, deren Auswirkung auf die Genexpression a priori nicht bekannt wäre. Nichtsdestotrotz kann die Genom-Reporter-Matrix verwendet werden, um abzuschätzen, welche Gene durch den Wirkstoff induziert oder reprimiert würden. In einer Ausführungsform wird eine dominante Form einer Mutante des Gens, das für ein Protein kodiert, auf welches der Wirkstoff abzielt, in alle Stämme der Genom-Reporter-Matrix eingeführt und die Wirkung der dominanten Mutante, welche die normale Funktion des Genprodukts stört, wird für jeden Reporter bewertet. Dieser genetische Assay informiert uns, welche Gene durch einen Wirkstoff beeinflußt würden, der einen ähnlichen Wirkmechanismus hat. In vielen Fällen könnte der Wirkstoff selbst verwendet werden, um die selbe Information zu erhalten. Jedoch kann die Genetik sogar verwendet werden, falls der Wirkstoff selbst nicht verfügbar wäre, um vorherzubestimmen, was dessen Antwortprofil in der Genom-Reporter-Matrix sein würde. Darüber hinaus ist es nicht notwendig, die Identität von jedem der antwortenden Gene zu kennen. Statt dessen sortiert die genetische Kontrolle mit der dominanten Mutante das Genom in jene Gene, die antworten und jene, die dies nicht tun. Falls Wirkstoffe, die eine gegebene zelluläre Funktion zerstören, gewünscht waren, decken dominante Mutanten für solch eine Funktion, die in die Genom-Reporter-Matrix eingefügt wurden, daher auf, welches Antwortprofil für solch ein Mittel zu erwarten ist.
Z. B. wurde gezeigt, daß Taxol, ein kürzlicher Fortschritt bei potentiellen Brustkrebs-Therapien, Tubulin-basierte cytoskeletale Elemente stört. Daher stellt eine dominante Form einer Mutante von Tubulin ein Antwortprofil bereit, das informativ für Brustkrebs-Therapien mit zu Taxol ähnlichen Wirkungsweisen ist. Konkret wird eine dominante Form einer Mutante von Tubulin in alle Stämme der Genom-Reporter-Matrix eingeführt und die Wirkung dieser dominanten Mutante, welche die Mikrotubuli des Cytoskeletons stört, für jeden Reporter bewertet. Somit würde jegliche neue Verbindung, die das selbe Antwortprofil wie die dominante Tubulin-Mutante induziert, einen Kandidaten für ein Taxol-ähnliches Arzneimittel bereitstellen.
Außerdem kann die Genom-Reporter-Matrix verwendet werden, um verschiedene Krankheitszustände genetisch zu erzeugen oder zu modellieren. Auf diese Weise kann auf Stoffwechselwege, die spezifisch im Krankheitszustand vorhanden sind, abgezielt werden. Z. B. identifiziert das spezifische Antwortprofil zur Umwandlung der Ras2^val19 Mutante Ras2^val19 induzierte Reporter. Hierbei wird die Matrix, in welcher jede Einheit die Ras2^val19 Mutation enthält, verwendet, um nach Verbindungen zu screenen, die das Antwortprofil zu dem der Matrix wieder herstellen, der die Mutation fehlt.
Obwohl diese Beispiele auf die Entwicklung von Humantherapeutika gerichtet sind, können informative Antwortprofile oft in nicht-humanen Reporter-Matrices erhalten werden. Für krankheitsverursachende Gene mit Hefe-Homologen kann daher eine dominante Form des Gens in eine Hefe-basierte Reporter-Matrix eingeführt werden, um für den Krankheitszustand spezifische Stoffwechselwege als Ziele zu identifizieren, sogar wenn die Funktion des Gens nicht bekannt ist. Z. B. stellt eine Reporter-Matrix, die die Hefemutante Ras2^val19 umfaßt, ein Entdeckungsvehikel für Stoffwechselwege bereit, spezifisch für das humane Analogon, das Oncogen Ras2^val12.
Anwendung von neuer kombinatorischer Chemie mit der Genom-Reporter-Matrix
Unter den wichtigsten Fortschritten bei der Wirkstoffentwicklung waren Fortschritte bei der kombinatorischer Synthese von chemischen Bibliotheken. Beim üblichen Wirkstoff-Screening mit gereinigten Enzymzielen kann die kombinatorische Chemie oft helfen, neue Derivate von Leitverbindungen zu erzeugen, die auch das Zielenzym inhibieren werden, aber mit etwas unterschiedlicher und wünschenswerter Eigenschaft. Jedoch würden übliche Verfahren versagen, um ein Molekül mit einer substantiell abweichenden Spezifität zu erkennen. Die Genom-Reporter-Matrix bietet eine einfache Lösung an, um neue Spezifitäten in kombinatorischen Bibliotheken zu erkennen. Konkret, Ansammlungen von neuen Verbindungen werden als Mischungen quer durch die Matrix getestet. Falls die Ansammlung irgendeine neue Aktivität hat, die in der original Leitverbindung nicht vorhanden ist, werden neue Gene inmitten der Reporter beeinflußt. Die Identität dieses Gens stellt einen Führer zu dem Ziel der neuen Verbindung bereit. Darüber hinaus bietet die Matrix einen zusätzlichen Bonus an, der eine allgemeine Schwäche der meisten chemischen Synthesen kompensiert. Konkret, die meisten Synthesen stellen das gewünschte Produkt in der größten Menge her und, aufgrund von Nebenreaktionen in der Synthese, eine Sammlung von anderen verwandten Produkten als Verunreinigungen. Traditionell werden Verunreinigungen durch Reinigung beseitigt. Jedoch nutzt die Genom-Reporter-Matrix das Vorhandensein dieser Verunreinigungen aus. Synthesen können angepaßt werden, um sie weniger spezifisch zu machen, mit einer größeren Zahl von Nebenreaktionen und mehr Verunreinigungen, um zu bestimmen, ob irgendetwas in der Gesamtsynthese die Expression der Zielgene von Interesse beeinflußt. Falls es in der Mischung eine Komponente mit der gewünschten Aktivität für einen bestimmten Reporter gibt, kann dieser Reporter verwendet werden, um die Reinigung der gewünschten Komponente aus der Mischung zu untersuchen. Im wesentlichen gestattet die Reporter-Matrix einen konzentrierten Überblick über die Wirkung auf einzelne Gene, um die Unreinheit der Mischung, die getestet wird, zu kompensieren.
Isoprenoide sind eine besonders attraktive Klasse für die Genom-Reporter-Matrix. In der Natur sind Isoprenoide die besten Signalmoleküle. Isoprenoide sind Derivate der fünf-Kohlenstoffverbindung Isopren, welche als ein Zwischenprodukt in der Cholesterol Biosynthese gebildet wird. Isoprenoide beinhalten viele der berühmtesten Duftstoffe, Pigmente, und andere biologisch aktive Verbindungen, wie z. B. die antifungalen Sesquiterpenoide, welche Pflanzen zur Abwehr von Pilzinfektion verwenden. Es gibt ungefähr 10000 charakterisierte Isoprenderivate und weit mehr potentielle. Weil diese Verbindungen in der Natur verwendet werden, um biologische Prozesse auszulösen, ist es wahrscheinlich, daß sie einige der besten Membran durchgängigen Moleküle beinhalten.
Isoprene besitzen eine weitere Eigenschaft, wodurch sich diese gut für die Wirkstoffentdeckung durch die Genom-Reporter-Matrix eignen. Aufgrund der bestimmten Anordnung der Doppelbindungen in den Kohlenwasserstoffketten können reine Isoprenoid-Verbindungen chemisch behandelt werden, um eine umfangreiche Mischung von unterschiedlichen Verbindungen schnell und leicht zu erzeugen. Im wesentlichen können Isoprenoide von einer Form in viele verschiedene Formen mutagenisiert werden, ähnlich wie ein Wildtypgen in viele verschiedene Mutanten mutagenisiert werden kann. Z. B. wird das zur Anreicherung von Milch verwendete Vitamin D hergestellt, indem das als Ergosterol bekannte Isoprenderivat ultraviolett bestrahlt wird. Neue biologisch aktive Isoprenoide werden erzeugt und wie folgt mit einer Genom-Reporter-Matrix analysiert. Zuerst wird ein reines Isoprenoid, wie z. B. Limonen, getestet, um dessen Antwortprofil quer durch die Matrix zu bestimmen. Anschließend wird das Isoprenoid (z. B. Limonen) chemisch verändert, um eine Mischung von verschiedenen Verbindungen zu erzeugen. Diese Mischung wird dann quer durch die Matrix getestet. Falls irgendwelche neuen Antworten beobachtet werden, weist die Mischung neue biologisch aktive Spezies auf. Außerdem stellt die Identität der Reporter-Gene Information bereit, betreffend was die neue aktive Spezies tut, einer Aktivität die verwendet werden kann, um deren Reinigung zu verfolgen, etc. Zusätzlich zu den Isoprenoiden wird diese Strategie auch auf andere mutierbare chemische Verbindungsklassen angewandt.
Anwendungen der Genom-Reporter-Matrix bei der Entdeckung von Antibiotika und Fungiziden
Pilze sind wichtige Phatogene auf Pflanzen und Tieren und haben einen großen Einfluß auf die Produktion von vielen Nahrungspflanzen und auf die Gesundheit von Tieren, einschließlich des Menschen. Eine große Schwierigkeit bei der Entwicklung von fungiziden Verbindungen war das Problem, pharmazeutische Ziele in Pilzen zu finden, die spezifisch für den Pilz sind. Die Genom-Reporter-Matrix bietet ein neues Hilfsmittel an, um dieses Problem zu lösen. Konkret, alle Moleküle, die versagen, irgendeine Antwort im Saccharomyces-Reporter hervorzurufen, werden in einem Satz gesammelt, welcher per Definition entweder biologisch inaktiv sein muß, oder eine sehr hohe Spezifität hat. Eine Reporter-Bibliothek wird aus den Pathogenen erzeugt, auf die abgezielt wird, wie z. B. Cryptococcus, Candida, Aspergillus, Pneumocystis etc. Alle Moleküle aus dem Satz, die Saccharomyces nicht beeinflussen, werden gegen das Pathogen getestet, und jegliches Molekül, das ein verändertes Antwortprofil bei dem Pathogen hervorruft, identifiziert prinzipiell ein Ziel, das Pathogen-spezifisch ist. Als ein Beispiel, ein Pathogen kann ein neues Signalenzym haben, wie z. B. eine Inositol-Kinase, das eine Position im Inositol-Ring verändert, die in anderen Spezies nicht verändert wird. Eine Verbindung, die dieses Enzym inhibiert, würde den Signalstoffwechselweg des Pathogens beeinflussen und ein Antwortprofil verändern, aber aufgrund der Abwesenheit von diesem Enzym in anderen Organismen, keine Wirkung haben. Durch das Sequenzieren der spezifisch in dem Zielpilz beeinflußten Reporter-Gene und durch Vergleichen der Sequenz mit anderen in der Genbank kann man die biochemischen Stoffwechselwege identifizieren, die einzigartig für die Zielspezies sind. Nützliche identifizierte Produkte beinhalten nicht nur Mittel, die den Zielpilz töten, sondern auch die Identifikation von spezifischen Zielen in dem Pilz für andere pharmazeutische Screening-Assays.
Die Identifizierung von Verbindungen, die Bakterien töten, wurde für Dekaden von der pharmazeutischen Industrie erfolgreich betrieben. Es ist ziemlich einfach, eine Verbindung, die Bakterien tötet, in einem Fleckentest auf einer Petri-Schale zu erspähen. Leider haben die Wachstums-Inhibierungsscreens eine sehr begrenzte Leitverbindungs-Diversität bereitgestellt. Jedoch gibt es bei der bakteriellen Physiologie und Ökologie viel Komplexität, die einen Ansatzpunkt für die Entwicklung von Kombinationstherapien für Bakterien bieten könnte, sogar für Verbindungen, die die Bakterien-Zelle eigentlich nicht töten. Man betrachte z. B. die Bakterien, die in die Harnröhre eindringen und durch die Entwicklung von Anheftungen an die Oberfläche, bekannt als Fimbrien, dort verbleiben. Antibiotika im Urinstrom haben begrenzten Zugang zu den Bakterien, weil der Urinstrom kurzlebig und unregelmäßig ist. Jedoch könnten existierende Therapien wirksamer werden, falls man die Synthese der Fimbrien blockieren könnte, um die Bakterien loszulösen. Ähnlich würde die Fähigkeit der Bakterien, eine wirksame Infektion zu etablieren, in einigen Spezies beeinträchtigt, falls der Mechanismus der Chemotaxis der Bakterien gelähmt wäre. Eine Genom-Reporter-Matrix für ein bakterielles Pathogen, die Reporter für die Expression von Genen enthält, die beispielsweise an der Chemotaxis oder Fimbriensynthese beteiligt sind, identifiziert nicht nur Verbindungen, die die Bakterien in einem Fleckentest töten, sondern auch jene, die Schlüsselschritte in der Biologie des Pathogens stören. Diese Verbindungen würden mit üblichen Mitteln außerordentlich schwierig zu entdecken sein.
Anwendungen von human-Zell-basierten Genom-Reporter-Matrices
Eine Genom-Reporter-Matrix, basierend auf humanen Zellen stellt viele wichtige Anwendungen bereit. Eine interessante Anwendung ist beispielsweise die Entwicklung von antiviralen Verbindungen. Wenn humane Zellen durch eine umfangreiche Reihe von Viren infiziert werden, antworten die Zellen auf eine komplexe Weise, von der nur wenige der Komponenten identifiziert worden sind. Z. B. werden gewisse Interferone induziert, wie auch eine doppelstrangige RNase. Von diesen beiden Antworten stellt jede individuell ein gewisses Maß an Schutz bereit. Eine Matrix, die die Induktion der Interferon-Gene und der doppelsträngigen RNase berichtet, ist fähig, Verbindungen zu ermitteln, die Zellen prophylaktisch vor der Ankunft des Virus schützen können. Andere schützende Wirkungen können parallel dazu induziert werden. Die Aufnahme von einer Ansammlung von anderen Reporter-Genen in die Matrix wird verwendet, um jene Verbindungen mit dem höchsten Maß an Spezifität zu identifizieren.
Verwendung der Genom-Reporter-Matrix
Die Handlungsweise, der bei den betreffenden Verfahren gefolgt werden soll, wird nun skizziert. Der Anfangsschritt beinhaltet das Bestimmen des basalen oder Hintergrund-Antwortprofils durch Ermittlung der Reporter-Genprodukt-Signale von jeder von einer Vielzahl von verschiedenen, getrennt isolierten Zellen eines Zielorganismus unter einer oder mehr von einer Vielzahl von physikalischen Bedingungen, wie z. B. Temperatur und pH, Medium und Osmolarität. Wie vorstehend erörtert, kann der Zielorganismus eine Hefe, ein Tiermodell, ein Mensch, eine Pflanze, ein Pathogen etc. sein. Allgemein sind die Zellen in einer physikalischen Matrix, wie z. B. einer Mikrotiterplatte, angeordnet. Jede der Zellen enthält ein rekombinantes Konstrukt, das ein Reporter-Gen umfaßt, das so mit einem verschiedenen endogenen Transcriptions-Regulatorelement des Zielorganismus funktional verbunden ist, daß das Transcriptions-Regulatorelement die Expression des Reporter-Gens reguliert. Eine ausreichende Anzahl von verschiedenen rekombinanten Zellen, um ein Ensemble von Transcriptions-Regulatorelementen des Organismus bereitzustellen, das ausreicht, um das Transcriptions-Ansprechverhalten des Organismus auf einen Wirkstoff zu modellieren, sind beinhaltet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Matrix substantiell umfassend für die ausgewählten Regulatorelemente, z. B. sind nahezu alle Genpromotoren des Zielorganismus beinhaltet. Andere cis-wirkende oder trans-wirkende Transcriptions-Regulatorbereiche des Organismus, auf den abgezielt wird, können auch bewertet werden. In einer Ausführungsform wird eine Genom-Reporter-Matrix aus einem Satz von LacZ-Fusionen zu einem substantiell umfangreichen Satz von Hefe-Genen konstruiert. Die Fusionen werden vorzugsweise in einer diploiden Zelle vom Paarungstyp a/a konstruiert, um die Einführung von dominanten Mutationen bei der Paarung zu erlauben, obwohl auch haploide Stämme mit bestimmten empfindlichen Reportern für gewisse Funktionen Verwendung finden. Die Fusionen werden bequem auf einer Microtiterplatte mit 96 Vertiefungen angeordnet, die unterschiedliche Fusionen in Vertiefungen mit definierten alphanumerischen X-Y-Koordinaten trennen, wobei jede Vertiefung (definiert als eine Einheit) eine Zelle oder Kolonie von Zellen begrenzt, die ein Konstrukt eines Reporter-Gens aufweisen, das funktional an einen verschiedenen Transcriptions-Promotor gekoppelt ist. Dauerhafte Sammlungen von diesen Platten werden bei –80C° mühelos aufrecht erhalten und Kopien von dieser Sammlung können angefertigt werden und durch einfache Mechanik vermehrt werden und mit kommerziellen Robotern automatisiert werden.
Die Verfahren umfassen das Ermitteln eines Reporter-Genprodukt-Signals für jede Zelle der Matrix. Eine umfangreiche Vielzahl von Reportern kann verwendet werden, wobei bevorzugte Reporter bequem ermittelbare Signale bereitstellen (z. B. durch Spektroskopie). Typischerweise ist das Signal ein Wechsel in einer oder mehr elektromagnetischen Eigenschaften, insbesondere optischer Eigenschaften bei der Einheit. Als Beispiele, ein Reporter-Gen kann für ein Enzym kodieren, welches bei der Einheit eine Reaktion katalysiert, welche die Lichtabsorbtions-Eigenschaften bei der Einheit ändert, radioaktiv markierte oder mit einem Fluoreszenz-Marker versehene Nukleotide können in die naszierenden Transcripte aufgenommen werden, welche dann identifiziert werden, wenn sie an Nukleotid-Sonden gebunden sind, etc. Beispiele umfassen: β-Galactosidase, Invertase, das grün-fluoreszierende Protein, etc. Invertase-Fusionen haben den Vorzug, daß funktionelle Fusionen aus komplexen Bibliotheken ausgewählt werden können, durch die Fähigkeit der Invertase, jene Gene, deren Expression zunimmt oder abnimmt, durch Messen des relativen Wachstums auf Medium, das Sucrose mit oder ohne Verbindung von Interesse enthält, in Betracht zu ziehen. Elektronische Detektoren für optische, strahlende, etc. Signale, sind kommerziell erhältlich, z. B. automatisierte, colorimetrische Detektoren für Vielfachvertiefungen, ähnlich den automatisierten ELISA-Lesern. Reporter-Genprodukt-Signale können auch als eine Funktion von anderen Variablen überwacht werden, z. B. Anregungsintensität oder Dauer, Zeit (für dynamische Antwortanalyse), etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die basalen Antwortprofile durch die colorimetrische Ermittlung eines LacZ-Reaktionsproduktes bestimmt. Das bei jeder Vertiefung erzeugte optische Signal wird ermittelt und linear umgewandelt, um ein entsprechendes digitales elektrisches Ausgabesignal zu erzeugen. Die resultierenden elektrischen Ausgabesignale werden in einem Computerspeicher als eine Genom-Reporter-Ausgabesignal-Matrix-Datenstruktur gespeichert, die jedem Ausgabesignal die Koordinaten der entsprechenden Microtiterplattenvertiefung und den Stimulus oder Wirkstoff zuordnet. Diese Information wird gegenüber der Matrix indiziert, um Referenz-Antwortprofile zu bilden, die verwendet werden, um die Antwort von jedem Reporter auf jegliches Milieu für das ein Stimulus bereitgestellt werden könnte, zu bestimmen.
Nach der Etablierung eines basalen Antwortprofils für die Matrix wird jede Zelle mit einem Wirkstoffkandidaten in Berührung gebracht. Der Ausdruck Wirkstoff wird frei verwendet, um Mittel zu bezeichnen, welche eine spezifische zelluläre Antwort provozieren können. Bevorzugte Wirkstoffe sind pharmazeutische Mittel, insbesondere therapeutische Mittel. Der Wirkstoff induziert ein komplexes Antwortmuster aus Repression, Stummschaltung und Induktion quer durch die Matrix (d. h. eine Abnahme der Reporteraktivität bei einigen Einheiten, eine Zunahme bei anderen, und keine Veränderung bei noch anderen). Das Antwortprofil spiegelt die transcriptionellen Anpassungen der Zelle zur Aufrechterhaltung der Homöostase in der Gegenwart des Wirkstoffs wider. Während ein umfangreiche Vielzahl von Wirkstoffkandidaten bewertet werden kann, ist es wichtig, die Bedingungen für die Inkubation anzupassen (z. B. Konzentration, Zeit, etc.), um zellulären Streß auszuschließen, und daher die Messungen der pharmazeutisch bedeutsamen Antwortprofile zu gewährleisten. Daher überwachen die Verfahren transcriptionelle Wechsel, welche die Zelle verwendet, um zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Zellulärer Streß kann auf jegliche bequeme Weise überwacht werden, wie z. B. Membranpotential (z. B. Farbstoffausschluß), zelluläre Morphologie, Expression von Streßantwort-Genen, etc. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Behandlung mit der Verbindung durchgeführt, indem eine Kopie der gesamten Matrix in frisches Medium überführt wird, das die erste Verbindung von Interesse enthält.
Nach dem in Berührung bringen der Zellen mit dem Wirkstoffkandidaten werden die Reporter-Genprodukt-Signale von jeder der Zellen erneut gemessen, um ein stimuliertes Antwortprofil zu bestimmen. Das basale oder Hintergrund-Antwortprofil wird dann mit dem stimulierten Antwortprofil verglichen (z. B. abgezogen von, oder geteilt in), um das zelluläre Antwortprofil des Wirkstoffkandidaten zu identifizieren. Die zelluläre Antwort kann auf zahlreichen Wegen charakterisiert werden. Z. B. kann das basale Profil von dem stimulierten Profil abgezogen werden, um ein reines Stimulierungsprofil zu erhalten. In einer weiteren Ausführungsform wird das stimulierte Profil durch das basale Profil geteilt, um ein Induktionsverhältnisprofil zu erhalten. Solche Vergleichsprofile stellen eine Abschätzung der physiologischen Spezifität des Wirkstoffkandidaten bereit.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Matrix von Hybridisierungssonden, die einer vorher festgesetzten Population von Genen des ausgewählten Organismus entspricht, verwendet, um spezifisch die Wechsel bei der Gentranscription zu ermitteln, welche daraus resultieren, daß der ausgewählte Organismus oder Zellen desselben einem Wirkstoffkandidaten ausgesetzt werden. In dieser Ausführungsform wird eine oder mehr Zellen, stammend aus dem Organismus, dem Wirkstoffkandidaten in vivo oder ex vivo unter Bedingungen ausgesetzt, bei denen der Wirkstoff einen Wechsel bei der Gentranscription in der Zelle bewirkt, um die Homöostase aufrechtzuerhalten. Danach werden Gentranscripte, vorwiegend mRNA, der Zelle oder Zellen durch übliche Mittel isoliert. Die isolierten Transcripte oder die dazu komplementären cDNAs werden dann mit einer geordneten Matrix von Hybridisierungssonden in Berührung gebracht, wobei jede Sonde spezifisch für eines der verschiedenen Transcripte ist, unter Bedingungen, bei denen jedes der Transcripte mit einer entsprechenden der Sonden hybridisiert, um Hybridisierungspaare zu bilden. Die geordnete Sonden-Matrix stellt, in einer Ballung, Komplemente für ein Ensemble von Genen des Organismus bereit, das ausreicht, die transcriptionelle Ansprechempfindlichkeit des Organismus auf einen Wirkstoff zu modellieren. Die Sonden sind im allgemeinen immobilisiert und auf einem festen Träger angeordnet, wie z. B. einer Microtiterplatte. Spezifische Hybridisierung kann beispielsweise bewirkt werden, indem die hybridisierte Matrix mit einem Überschuß nicht-spezifischer Oligonukleotide gewaschen wird. Ein Hybridisierungssignal wird dann bei jedem Hybridisierungspaar ermittelt, um ein Matrix-weites Signalprofil zu erhalten. Eine umfangreiche Vielzahl von Hybridisierungssignalen kann verwendet werden; bequemerweise werden die Zellen mit radioaktiven Nukleotiden vormarkiert, so daß die Gentranscripte ein radioaktives Signal bereitstellen, das bei den Hybridisierungspaaren ermittelt werden kann. Das Matrix-weite Signalprofil der Wirkstoff-stimulierten Zellen wird dann mit einem Matrix-weiten Signalprofil von Zellen einer Negativkontrolle verglichen, um ein spezifisches Wirkstoff-antwortprofil zu erhalten.
Die Erfindung stellt auch Mittel für eine Computer-basierte qualitative Analyse der Wirkstoffkandidaten und unbekannter Verbindungen bereit. Eine umfangreiche Vielzahl von Referenz-Antwortprofilen kann erzeugt und bei solchen Analysen verwendet werden. Z. B. wird die Antwort einer Matrix auf den Verlust einer Funktion von jedem Protein oder Gen oder RNA in der Zelle bewertet, indem ein dominantes Allel eines Gens in jede Reporter-Zelle eingeführt wird, und die Antwort des Reporters als eine Funktion der Mutation bestimmt wird. Für diesen Zweck werden dominante Mutationen bevorzugt, aber andere Arten von Mutationen können verwendet werden. Dominante Mutationen werden erzeugt durch in vitro Mutagenese von geklonten Genen, gefolgt vom Screenen auf dominante Mutanten-Allele in diploiden Zellen.
In einer alternativen Ausführungsform wird die Reporter-Matrix in einem für die UPF Gen-Funktion defizienten Stamm entwickelt, wobei die Mehrheit der Nonsense-Mutationen einen dominanten Phänotyp bewirkt, wodurch dominante Mutationen für jegliches Gen konstruiert werden können. UPF1 kodiert für ein Protein, das den Abbau von mRNA's bewirkt, die aufgrund einer Mutation vorzeitige Stopcodons enthalten. In Mutatanten, denen die UPF1-Funktion fehlt, kodieren die meisten Nonsense-Mutationen für kurze, trunkierte Proteinfragmente. Viele von diesen stören die normale Proteinfunktion und haben daher dominante Phänotypen. Somit verhalten sich in einer UPF1-Mutante viele Nonsense-Allele als dominante Mutationen (siehe z. B. Leeds, P. et al. (1992) Molec. Cell Biology. 12: 2165–77).
Die resultierenden Daten identifizieren genetische Antwortprofile. Diese Daten werden nach der individuellen Genantwort sortiert, um die Spezifität von jedem Gen auf einen bestimmten Stimulus zu bestimmen. Eine gewichtende Matrix wird etabliert, welche die Signale proportional zu der Spezifität der entsprechenden Reporter gewichtet. Die gewichtende Matrix wird durch die Aufnahme von Daten aus jedem Screen dynamisch überarbeitet. Eine Gen-Regulierungsfunktion wird dann verwendet, um Regulierungstabellen zu konstruieren, um zu identifizieren, welche Zellen der Matrix auf welche Mutation in einem indizierten Gen antworten, und welche Mutationen welche Zellen der Matrix beeinflussen.
Antwortprofile für einen unbekannten Stimulus (z. B. neue Chemikalien, unbekannte Verbindungen oder unbekannte Mischungen) können durch das Vergleichen der Antwortprofile des neuen Stimulus mit den Antwortprofilen von bekannten chemischen Stimuli analysiert werden. Solche Vergleichsanalysen nehmen im allgemeinen die Form eines Verzeichnis-Berichts der Übereinstimmungen mit den chemischen Referenz-Antwortprofilen ein, gereiht nach dem gewichteten Wert von jedem übereinstimmenden Reporter. Falls es eine Übereinstimmung (d. h. perfekten Treffer) gibt, identifiziert das Antwortprofil einen Stimulus mit dem selben Ziel wie von einer der bekannten Verbindungen auf der die Antwortprofil-Datenbank aufgebaut ist. Falls das Antwortprofil eine Teilmenge von Zellen in der durch eine bekannte Verbindung stimulierten Matrix ist, ist die neue Verbindung ein Kandidat für ein Molekül mit größerer Spezifität als die Referenzverbindung. Insbesondere kann auf eine größere Spezifität der neuen Verbindung geschlossen werden, falls die Reporter, die einzigartig auf die Referenz-Chemikalie antworten, einen gering gewichteten Antwortwert haben. Alternativ kann für die neue Verbindung geschlossen werden, stromabwärts im selben Stoffwechselweg aktiv zu sein, falls die Reporter, die einzigartig auf die Referenzverbindung antworten, einen hoch gewichteten Antwortwert haben. Falls die Ausgabe mit dem Antwortprofil einer bekannten Referenzverbindung überlappt, wird die Überlappung durch eine quantitative Bewertung mit der gewichtenden Matrix sortiert, um gemeinsame und einzigartige Reporter zu erhalten. Die einzigartigen Reporter werden dann im Vergleich zu den Regulationstabellen sortiert und die besten Übereinstimmungen verwendet, um das Kandidatenziel abzuleiten. Falls das Antwortprofil weder überlappt noch mit einem chemischen Antwortprofil übereinstimmt, dann ist die Datenbank ungeeignet, um die Funktion daraus zu folgern, und das Antwortprofil kann zu den chemischen Referenz-Antwortprofilen hinzugefügt werden.
Das Antwortprofil eines neuen chemischen Stimulus kann auch mit einem bekannten genetischen Antwortprofil für (ein) Ziel-Gen(e) verglichen werden. Falls es eine Übereinstimmung zwischen den zwei Antwortprofilen gibt, ist das Ziel-Gen oder dessen funktioneller Stoffwechselweg das mutmaßliche Ziel der Chemikalie. Falls das chemische Antwortprofil eine Teilmenge eines genetischen Antwortprofils ist, ist das Ziel des Wirkstoffs stromabwärts von der Gen-Mutante aber in dem selben Stoffwechselweg. Falls das chemische Antwortprofil ein genetisches Antwortprofil als eine Teilmenge beinhaltet, wird abgeleitet, daß das Ziel der Chemikalie in dem selben Stoffwechselweg wie das Ziel-Gen ist, aber stromaufwärts und/oder die Chemikalie zusätzliche zelluläre Komponenten beeinflußt. Falls nicht, ist das chemische Antwortprofil neu und definiert einen einmaligen Stoffwechselweg.
Obwohl die Erfindung in Form von Zellen beschrieben wurde, die Reporter unter der transcriptionellen Kontrolle von endogenen Regulatorbereichen umfassen, gibt es eine Anzahl von anderen Mitteln die Erfindung auszuführen. Z. B. könnte jede Einheit einer über die Gen-Expression berichtenden Genom-Reporter-Matrix eine unterschiedliche Oligonukleotid-Sonde begrenzen, die zur Hybridisierung mit einem entsprechenden unterschiedlichen Reporter-Transcript fähig ist. Alternativ könnte jede Einheit einer Matrix, die über DNA-Protein Interaktion berichtet, eine Zelle begrenzen, die ein erstes Konstrukt eines Reporter-Gens, das funktional an eine Transcriptionsfaktor-Bindungsstelle, auf die abgezielt wird, gekoppelt ist, und ein zweites Hybridkonstrukt hat, das für eine Transcriptions-Aktivierungsdomäne kodiert, die mit einem unterschiedlichen strukturellen Gen fusioniert ist, d. h. eine eindimensionale Ein-Hybrid-System Matrix. Alternativ könnte jede Einheit einer Matrix, die über Protein-Protein Interaktionen berichtet, eine Zelle begrenzen, die ein erstes Konstrukt eines Reporter-Gens hat, das funktional an eine Transcriptionsfaktor-Bindungsstelle, auf die abgezielt wird, gekoppelt ist, ein zweites Hybridkonstrukt, das für eine Transcriptions-Aktivierungsdomäne kodiert, die mit einem unterschiedlichen konstitutionell exprimierten Gen fusioniert ist, und ein drittes Konstrukt, das für eine DNA-Bindungsdomäne kodiert, die mit noch einem unterschiedlichen konstitutionell exprimierten Gen fusioniert ist, d. h. eine zweidimensionale Zwei-Hybrid-System Matrix.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angeboten.
Beispiele
1. Transcriptionelle Promotor-Reporter-Gen-Matrix
A) Konstruktion einer physikalischen, mit dem Wirkstoff Mevinolin (Lovastatin, Meracon) stimulierten Matrix
Mevinolin ist eine Verbindung, von der bekannt ist, daß sie die Cholesterin Biosynthese inhibiert. Anfänglich wurde durch serielle Verdünnung bestimmt, daß die maximale, nicht-toxische (gemessen durch Zellwachstum und Lebensfähigkeit) Konzentration von Mevinolin für die Reporterzellen 25 μg/ml ist. Um eine Mevinolin-stimulierte Matrix herzustellen, wird jede Vertiefung von 60 Microtiterplatten mit 100 μl Kulturmedium, enthaltend 25 μg/ml Mevinolin in einer 2%-igen Ethanollösung, gefüllt. Ein Aliquot von jedem Mitglied der Reporter-Matrix wird zu jeder Vertiefung hinzugefügt, wodurch eine Verdünnung von ungefähr 1 : 100 erreicht wird. Die Zellen werden in dem Medium inkubiert bis die Trübung des durchschnittlichen Reporters um den Faktor 20 zunimmt. Als ein Maß für das Wachstum wird dann die Trübung jeder Vertiefung quantifiziert und zur Messung der β-Galactosidase von jeder Fusion wird jede Vertiefung mit einer Lyselösung behandelt.
B) Generierung einer Ausgabesignal-Matrix-Datenstruktur
Sowohl die Trübung als auch die β-Galactosidase werden mit kommerziell erhältlichen Microtiterplatten-Lesern (z. B. BioRad) gelesen und die Daten als eine ASCII-Datei erfaßt. Von dieser Datei wird der Wert der einzelnen Zellen in der Reporter-Matrix gegenüber einer 2%-igen Ethanollösung in dem Referenz-Antwortprofil abgezogen. Der Unterschied entspricht dem Mevinolin-Antwortprofil. Diese Datei wird in dem Computer in eine Tabelle umgewandelt, die die Antwort von jeder Zelle auf den Inhibitor verzeichnet. Z. B. nehmen die Gene, die für Acetoacetyl-CoA Thiolase und Squalen-Synthase kodieren, um den Faktor 10 zu, während SIR3 und LEU2, zwei unbeteiligte Gene, unverändert bleiben. Die Antwort der Reporter-Matrix auf andere Verbindungen wird ähnlich bestimmt und als Ausgabe-Antwortprofile gespeichert.
C) Vergleich einer Signal-Matrix-Datenstruktur mit einer Signal-Matrix-Datenbank
Eine physikalische Matrix wird wie vorstehend beschrieben konstruiert, außer, daß Mevinolin durch eine unbekannte Testverbindung ersetzt wird. Das resultierende Antwortprofil wird mit den Antwortprofilen einer Bibliothek von bekannten, bioaktiven Verbindungen verglichen und wie vorstehend beschrieben analysiert. Z. B., falls das Ausgabeprofil der Testverbindung zeigt, daß sowohl das Acetoacetyl-CoA Thiolase-Gen als auch das Squalen-Synthase-Gen induziert sind, dann stimmt das Ausgabeprofil mit dem für einen Inhibitor der Cholesterinsynthese erwarteten überein. Falls das Antwortprofil weniger andere Zellen beeinflußt hat als das Antwortprofil von Mevinolin, ist die unbekannte Verbindung ein Kandidat für größere Spezifität. Falls das Antwortprofil der neuen Chemikalie weniger andere Reporter beeinflußt hat als das Antwortprofil von Mevinolin, und falls die anderen von Mevinolin beeinflußten Reporter einen niedriger gewichteten Wert haben, dann ist die Verbindung ein Kandidat für größere Spezifität. Falls das Antwortprofil mehr unterschiedliche Zellen beeinflußt hat als das Antwortprofil von Mevinolin, dann ist die Verbindung ein Kandidat für weniger Spezifität. In dem Fall, in dem Mischungen von Verbindungen getestet werden, werden die am höchsten gewichteten Antworten bewertet, um zu bestimmen, ob sie in ein Antwortprofil von zwei unterschiedlichen Verbindungen, oder von zwei unterschiedlichen genetischen Antwortprofilen, aufgelöst werden können.
2. Reporter Transcript-Oligonukleotid Hybridisierungssonden-Matrix: Konstruktion einer stimulierten physikalischen Matrix und Generierung einer Ausgabesignal-Matrix-Datenstruktur
Unmarkierte Oligonukleotid-Hybridisierungssonden, die komplementär zu dem mRNA-Transcript von jedem Hefe-Gen sind, werden auf einem durch Standardverfahren (z. B. Fodor et al. (1991) Science 252, 767) geätztem Siliziumträger angeordnet. Die Sonden haben eine Länge und Sequenz, die die Spezifität für die entsprechenden Hefe-Gene sicherstellen, typischerweise eine Länge von etwa 24–240 Nukleotiden.
Eine konfluente HeLa-Zellkultur wird mit 15 μg/ml Mevinolin in 2% Ethanol für 4 Stunden behandelt, während sie in einer feuchten 5% CO₂-Atmosphäre bei 37°C gehalten wird. Boten-RNA wird gemäß Standardverfahren extrahiert, revers transcribiert, und Fluoreszenz-markiert (Sambrook et al., Molecular Cloning, 3. Auflage). Die resultierende cDNA wird an die Anordnung von Sonden hybridisiert, die Anordnung wird durch Waschen von nicht-hybridisierter markierter cDNA befreit, das Hybridisierungssignal von jeder Einheit der Anordnung unter Verwendung eines Konfokalmikroskop-Scanners (Instrumente von Molecular Devices und Affymetrix) quantifiziert, und die resultierenden Matrix Antwortdaten in digitaler Form gespeichert.
3. Zweidimensionale Zwei-Hybrid-Matrix
A) Konstruktion einer stimulierten physikalischen Matrix
Die zweidimensionale Zwei-Hybrid (siehe z. B. Chien et al. (1991)PNAS, 88, 9578) Matrix ist gestaltet, um nach Verbindungen zu screenen, die spezifisch die Interaktion von zwei Proteinen beeinflussen, z. B. die Interaktion von einem humanen Signalüberträger und Aktivator der Transcription (STAT) mit einem Interleukinrezeptor. Zwei-Hybridfusionen werden durch Standardverfahren generiert: jeder Stamm enthält einen Teil des humanen STAT-Gens, auf das abgezielt wird, fusioniert mit einem Teil von einem bakteriellen oder Hefe-Gen, das für eine DNA-Bindungsdomäne (z. B. GAL4: 1–147) kodiert. Die DNA-Sequenz, die diese DNA-Bindungsdomäne (z. B. UAS_G) erkennt, wird anstelle der Enhancer-Sequenz 5' zu dem ausgewählten Reporter (z. B. LacZ) insertiert. Der Stamm enthält auch eine weitere Fusion, die aus einem intrazellulären Teil des Rezeptor-Gens, auf das abgezielt wird, besteht, dessen Proteinprodukt mit dem STAT interagiert. Dieses Rezeptor-Gen ist mit einem Gen-Fragment fusioniert, das für eine transcriptionelle Aktivierungsdomäne (z. B. GAL4: 768–881) kodiert.
B) Generierung einer Signal-Matrix-Datenstruktur
Sowohl die Trübung als auch die Galactosidase werden mit kommerziellen Microtiterplatten-Lesern (BioRad) gelesen und die Daten als eine ASCII-Datei erfaßt.
C) Vergleich der Signal-Matrix-Datenstruktur mit der Datenbank
Die Daten werden für jene Verbindungen analysiert, die die Interaktion der zwei humanen Proteine blockieren, indem sie das Signal, das von dem Reporter in den verschiedenen Stämmen, die Paare von humanen Proteine enthalten, hergestellt wird, reduzieren. Die Ausgabe wird prozessiert, um Verbindungen mit einer großen Auswirkung auf einen Reporter zu identifizieren, dessen Expression von einem einzelnen Paar interagierender humaner Proteine abhängig ist. Eine invertierte gewichtende Matrix wird verwendet, um diese Daten zu bewerten, da bevorzugte Verbindungen nicht einmal die am wenigsten spezifischen Reporter in der Matrix beeinflussen.

Claims

Verfahren zur Abschätzung eines Ansprechprofils eines Zielorganismus auf ein Mittel, das eine zelluläre Antwort auslösen kann, umfassend: (a) das in Berührung Bringen jeder von einer Vielzahl von verschiedenen getrennt isolierten Zellen eines Zielorganismus mit dem Mittel, wobei jede der Zellen ein rekombinantes Konstrukt enthält, das ein Reporter-Gen umfasst, das so mit einem verschiedenen endogenen Transcriptions-Regulatorelement des Zielorganismus funktional verbunden ist, dass das Transcriptions-Regulatorelement die Expression des Reporter-Gens reguliert, wobei die verschiedenen Transcriptions-Regulatorelemente der Vielzahl von Zellen endogene Transcriptions-Regulatorelemente von einer Mehrheit der Gene des Organismus umfassen; (b) das Nachweisen der Reporter-Genprodukt-Signale von jeder der mit dem Mittel in Berührung gebrachten Zellen; (c) das Vergleichen der Reporter-Genprodukt-Signale von jeder der mit dem Mittel in Berührung gebrachten Zellen mit einem Hintergrundansprechprofil, um ein Ansprechprofil auf das Mittel zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Vielzahl von Zellen rekombinante Konstrukte umfasst, die Transcriptions-Regulatorelemente von Tausenden von Genen des Organismus umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Vielzahl von Zellen rekombinante Konstrukte umfasst, die Transcriptions-Regulatorelemente von nahezu allen Genen des Organismus umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Reporter-Gen das LacZ-Gen, das Suc2-Gen oder ein für ein grün-fluoreszierendes Protein codierendes Gen ist.
Verfahren zur Abschätzung eines Ansprechprofils eines Zielorganismus auf ein Mittel, das eine zelluläre Antwort auslösen kann, umfassend: (a) das in Berührung Bringen von Gen-Transcripten, oder davon abstammender cDNAs, mit einer geordneten Matrix von Hybridisierungssonden, jede Sonde spezifisch für eines der verschiedenen Transcripte, oder davon abstammender cDNAs, unter Bedingungen, bei denen jedes der Gen-Transcripte, oder der davon abstammenden cDNAs, mit einer entsprechenden der Sonden hybridisiert, um Hybridisierungspaare zu bilden, wobei die geordnete Sondenmatrix Sonden bereitstellt, die spezifisch für Transcripte von, oder für davon abstammende cDNAs, einer Mehrheit von Genen des Organismus sind, und wobei die Gen-Transcripte, oder davon abstammende cDNAs, aus mit dem Mittel in Berührung gebrachten Zellen des Zielorganismus isoliert werden; (b) das Nachweisen eines Hybridisierungssignals bei jedem Hybridisierungspaar, um ein matrixweites Signalprofil zu erhalten; und (c) das Vergleichen des matrixweiten Signalprofils, stammend von mit dem Mittel in Berührung gebrachten Zellen, mit einem matrixweiten Signalprofil von Zellen einer Negativkontrolle, um ein Ansprechprofil auf das Mittel zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die geordnete Sondenmatrix Sonden bereitstellt, die spezifisch für Transcripte von, oder für davon abstammende cDNAs, Tausenden von Genen des Organismus sind.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei die geordnete Sondenmatrix Sonden bereitstellt, die spezifisch für Transkripte, oder für davon abstammende cDNAs, von nahezu allen Genen des Organismus sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Sonden Oligonucleotide mit einer Länge zwischen 24 und 240 Nucleinsäuren umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, zusätzlich umfassend den Schritt, das Mittel als einen Kandidaten für ein Therapeutikum für den Menschen auszuwählen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Zielorganismus eine Hefe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Zielorganismus ein Bakterium ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Zielorganismus ein Mensch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, zusätzlich umfassend (a) das Speichern jedes Ansprechprofils als digitale Daten in einer Ansprechprofildatenstruktur, die mit dem das Ansprechprofil erzeugenden Mittel verbunden ist, und (b) das Vergleichen der Ansprechprofildatenstruktur mit einer Ansprechprofildatenbank, wobei die Datenbank Ansprechprofile für eine Vielzahl bekannter Mittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Vergleichen bestimmt, ob das mit dem Ansprechprofil verbundene Mittel dasselbe Ziel wie ein mit einer Ansprechdatenstruktur in der Ansprechprofildatenbank verbundenes Mittel hat, oder eine größere Spezifität als ein Mittel in der Datenbank hat, oder ein neues Mittel ist.
Festes Trägermaterial zur Abschätzung eines Ansprechprofils eines Zielorganismus auf ein Mittel, das eine zelluläre Antwort auslösen kann, wobei das feste Trägermaterial eine Vielzahl von aus dem Zielorganismus isolierten Zellen umfasst, wobei jede der Zellen ein rekombinantes Konstrukt enthält, das ein Reporter-Gen umfasst, das so mit einem verschiedenen endogenen Transcriptions-Regulatorelement des Zielorganismus funktional verbunden ist, dass das Transcriptions-Regulatorelement die Expression des Reporter-Gens reguliert, wobei die verschiedenen Transcriptions-Regulatorelemente der Vielzahl von Zellen Transcriptions-Regulatorelemente einer Mehrheit von Genen des Organismus umfassen.
Festes Trägermaterial nach Anspruch 15, wobei die verschiedenen Transcriptions-Regulatorelemente der Vielzahl von Zellen Transcriptions-Regulatorelemente von Tausenden von Gegen des Organismus umfassen.
Festes Trägermaterial zur Abschätzung eines Ansprechprofils eines Zielorganismus auf ein Mittel, das eine zelluläre Antwort auslösen kann, wobei das feste Trägermaterial eine Vielzahl von Hybridisierungssonden umfasst, wobei jede Sonde spezifisch an Transcripte von, oder an davon abstammende cDNAs, einem verschiedenen Gen des Zielorganismus hybridisieren kann, und wobei die Vielzahl der Sonden spezifisch an Transcripte von, oder an davon abstammende cDNAs, einer Mehrheit von Genen des Organismus hybridisieren kann.
Festes Trägermaterial nach Anspruch 17, wobei die Vielzahl der Sonden spezifisch an Transcripte, oder an davon abstammende cDNAs, von mehr als eintausend Genen des Organismus hybridisieren kann.