JP2003504037A - 必須遺伝子の遺伝子産物の機能を調節する化合物を同定する方法 - Google Patents

必須遺伝子の遺伝子産物の機能を調節する化合物を同定する方法

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Abstract

(57)【要約】 必須遺伝子の遺伝子産物の機能を調節する化合物を同定する方法。該方法は、異種性の、調節可能なプロモーターの制御のもとで遺伝子が発現している生存能力のある細胞を提供すること、プロモーターを介して遺伝子の発現をスイッチオフすること、細胞を被験化合物と接触させること、および遺伝子産物の機能に対する調節効果を検定することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、新規生物学的標的および／または阻害物質の同定方法を提供する。
このような方法は、処理能力の高いスクリーニングにとって有用であり、かつ便
利な手法を提供する。特に、このような方法は、新規抗菌剤の同定に使用され得
る。
【０００２】 抗菌剤、抗真菌剤、抗マラリア薬のような現在の治療薬に対する耐性の出現に
よって、新薬の開発が必要となっている。標的に基づいた生化学的スクリーニン
グは目的を達し得るが、伝統的な抗菌スクリーニングは、発見された新規の抗菌
薬に関して、論理的な標的選択的手順よりも明らかに優れている。標的に基づい
た生化学的スクリーニングは、標的酵素を効果的に阻害するにもかかわらず、お
そらく細胞内への浸透が低いためまたは細胞外へ排出されるために、細胞活性が
欠如していると見られることが多い。また、限定された入手可能な分子の中から
自分の都合のよいように選んだ標的に、阻害のための構造が存在することは、全
く保証がない。
【０００３】 対照的に、細胞ベースの抗菌薬のスクリーニングは、頻繁に抗菌薬の作用を同
定するが、その後、この阻害は一般毒性、例えば膜阻害もしくはＤＮＡインター
カレーションによるものと判明するか、または宿主機構と薬物との特異的相互作
用を同定できないかのどちらかである。このことは、初期リード化合物の化学的
な最適化を困難にし、構造活性相関の指針を何ら提供しない。
【０００４】 標的に基づいた作用機序を同定するための特定のアプローチは、高感受性によ
るものであった。
【０００５】 歴史的に、所望のタンパクの高感受性のものを作り出す方法は、それをコード
している遺伝子中に温度感受性(ts)突然変異を作り出すことであった(Schmid et
al. Genetics 123, pp625-633, (1989))。温度感受性(Ts)または他の条件的な
表現型は、(例えばＰＣＲを用いる)標的のある、または(例えば化学薬品または
放射線を用いる)ランダムの突然変異形成のどちらかによって作成され得る。し
かしながら、このような条件的な突然変異体は、しばしば、緩やかな条件下でさ
え阻害剤に対して高感受性である。
【０００６】 我々は、今回、阻害剤に対する高感受性が、生存能力のある細胞の特定の必須
機能を停止させ、次いで阻害剤の可能性のあるものの存在／不在下での効果を分
析することによって容易に得られることを見出した。ここで、「停止」とは、特定
の必須機能が、細胞にいかなる発現レベルでも獲得されないことを意味する。
【０００７】 その結果、本発明の最初の観点において、我々は、遺伝子が異種性の、調節可
能なプロモーターの制御のもとに発現する生存可能な細胞を提供すること、プロ
モーターを介して遺伝子発現をスイッチオフすること、被験化合物を細胞と接触
させること、および遺伝子産物の機能に対する調節効果を検定することを含む、
必須遺伝子の遺伝子産物の機能を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【０００８】 その方法は、化合物の高感受性の完全なゲノム解析の可能性における飛躍を提
供する。その方法は、多くの重要な利点、とりわけ、不変の、「正常」タンパクを
、例えば、変えた、突然変異したタンパクと阻害剤との相互作用から推定するこ
とによって、同じ化学物質との相互作用に使用することを提供する。また、プロ
モーター活性をより高いまたはより低いレベルに微調整する作業は、必要とされ
ない。一つの特異的生化学的物質、例えば細胞生長または生存に必要なタンパク
の阻害は、簡便に、不変の親株と比較した調節可能な遺伝子を有する株の高感受
性反応によって示される。
【０００９】 「異種性の、調節可能なプロモーター」は、必須遺伝子本来のプロモーター以外
のプロモーターを意味し、特定の物質の添加および／または除去によって、また
は例えば他の環境の変化によって制御され得る。 「高感受性」は、野生型の細胞と比較して、等しい薬物の濃度の存在下で、細胞
の生長がより大きく減少することを意味する。
【００１０】 さらに、一つの特定の酵素の発現減少によって起こる高感受性は、生化学経路
全体、例えばステロール生合成にまで広がり得る。このことは本発明の図５にお
いて示される結果によって例示され、テルビナフィンに対する感受性は、同一経
路における標的酵素(ＥＲＧ１によってコードされている)の停止ならびにもう一
つの酵素(ＥＲＧ１１によってコードされている)の停止の両方によって変えられ
る。
【００１１】 「生存能力のある」は、ある必須遺伝子の発現が止められた場合、意義ある検定
および速度論的解析が行われ得るほど十分に生長する細胞を意味する。細胞は、
好ましくは、最後の光学密度が測定される定常期初期(early stationary phase)
へと生長する。薬物なしまたはスイッチオフの制御なしの場合と比較した、減少
した光学密度は生長阻害と解釈される。
【００１２】 「必須遺伝子」は、例えば細胞生長および／または細胞生存に必要な遺伝子を意
味する。これは、ある測定可能な条件のもとでのみ必要とされる(すなわち条件
的な必須)遺伝子を含む。もっとも単純な明示において、必須性とは、リッチ培
地上での生物の生長に必要であることと定義される(そのような培地ならびに一
般的な酵母の方法論は、Sherman et al, Methods in Enzymolgy, Vol 194, Guth
rie and Fink eds, Academic Press(1991)参照)。都合のよい遺伝子は、真菌お
よび細菌の遺伝子を含む。
【００１３】 「遺伝子発現をスイッチオフすること」とは、すべての遺伝子発現をオンからオ
フに変えることを意味する。オフの場合においては、低レベルの遺伝子発現も存
在しない。
【００１４】 「細胞」とは、任意の都合のよい供給源からの細胞を意味し、これらはヒト、動
物または細菌の細胞を含む。化合物のスクリーニングと同時標的同定(simultane
ous target identification)を組み合わせる、新規のゲノムに基づいた技術が開
発されている。本発明は、Schizosaccharomyces pombeおよびSaccharomyces cer
evisiaeのような遺伝子的に制御しやすいモデルの生物に特に有用であると同時
に、普遍的に適用でき、実務的考慮によってのみ制限される。S.cerevisiae, S.
pombe, C.elegans, またはD.melanogasterのようなモデル生物を使用することに
よって、真核生物の一定に保たれた機能を研究することが可能である。ヒトまた
は動物の細胞株を直接使用する遺伝学の応用は、また、可能性をさらに広げる。
【００１５】 任意の都合のよい被験化合物、例えばペプチド、核酸および低分子量の化合物
は、本発明の方法に使用され得る。好ましい被験化合物は、治療薬の可能性のあ
るものであり、または治療薬を同定するためのさらなる研究において使用され得
る。特異的な被験化合物は、例えば分子量１０００未満、例えば分子量６００未
満の低分子量の化合物である。
【００１６】 必須遺伝子の遺伝子産物に対する化合物の調節効果は、簡便には、終点の光学
密度を読み取ることによって調べられる(培地の絶対光学密度が高いほど、より
少ない阻害が起こっていると考えられる)。このような分析は、簡便には、酵母
細胞に関して典型的に２４時間にわたって行われる。細菌はずっと短い時間で済
むが(例えば１２時間)、より高度な真核生物の細胞は、初期定常生長期(early s
tationary growth phase)に達するまで数日を要する。その分析は、簡便には光
度計測である(６００ｎｍでの培地の光学密度)。
【００１７】 重要なことに、ＤＮＡの部位特異的組み込みのための非常に最近の技術(例え
ば本来のものを直接置換した切替可能なプロモーターを用いる)と(以下にさらに
詳述するような)高感受性反応の観測された固定した時点の光学密度分析との組
み合わせは新規であり、大規模薬物スクリーニング、化合物および標的のプロフ
ァイリングに活用される。さらに、このような系は、また、非常に容易に大量に
入手可能である(すなわち、S.cerevisiae中に多数の遺伝子)。
【００１８】 S.cerevisiaeにおける使用のための切替可能なプロモーターのいくつかの例は
、ＭＥＴ３(メチオニンの添加によって抑制される)およびＧＡＬ１(ガラクトー
スによって誘導され、グルコースによって抑制される)を含む；S.pombeにおける
使用ため：ＮＭＴ１(チアミンによって抑制される)；C.albicansにおける使用の
ため：ＭＡＬ１(グルコースによって抑制され、マルトース、スクロースによっ
て誘導される)；E.coliにおける使用のため：ａｒａＢ(グルコースによって抑制
され、アラビノースによって誘導される)；Staphylococci, Enterococci, Strep
tococciおよびBacilliのようなグラム陽性の細菌における使用のため：ｘｙｌＡ
／ｘｙｌＢ(S.xylosus由来)(グルコースで抑制され、キシロースで誘導される)
；E.coliおよびB.subtilisにおける使用のため；pSPAC(E.coli lac由来の人工的
プロモーター、ＩＰＴＧによって調節される。Vagner et al. Microbiology(199
8), 144, 3097-3104参照)；および上記のすべての生物に加えてさらに明記され
ていない真菌、細菌および哺乳類の細胞系のため：ｔｅｔＡ／ｔｅｔＲ(さまざ
まな細菌性テトラサイクリン耐性カセット由来)この系はさまざまな系中で生存
する。Gossen et al. Current Opin. Biotechnol. 5, pp516-520(1994)参照。そ
れはさまざまなテトラサイクリン類似物質によって抑制可能または誘導可能であ
る。
【００１９】 我々は、以下の実施例および図において、生化学的な機能を阻害するあらゆる
試薬に対する高感受性を産生することが、厳密に制御可能なプロモーターの制御
のもとにその機能(タンパクまたはｍＲＮＡ)をコードしている遺伝子を配置する
こと、およびオンからオフの状態に切り替えること、さらに相互作用する物質を
同時に加えることによって、可能であることを示す(このような切替の例のため
、図１を参照)。コードされたタンパクの過剰または過少発現を達成するため、
所望の遺伝子の上流に外部のプロモーターを配置することは既知であるが、この
プロセスは非常に煩雑な作業の微調整および計画を必要とする。発現レベルを大
きく変化させることによって、すべての所望の遺伝子は、ちょうど生長律速レベ
ルにある、そのプロモーター強度の異なる調整を必要とする。それゆえ、このよ
うな微調整に依存したプロトコールは、ゲノム解析に必要な高処理スケールで実
行することは好ましくない。
【００２０】 以下に示す実施例で詳述するような、我々の新規の発見により、明確に定義さ
れたオンおよびオフの状態で(すなわち、発現レベルの微調節なしでも明確に)た
だ一つのプロモーターを用いる、単純かつ標準的なプロトコールが、標的物質の
過少発現により特異的高感受性の正確な測定を産生することが示される。過少発
現は、i)ＲＮＡの減少、ii)標的タンパクの減少、iii)再合成のない細胞生長の
間いくつかの娘細胞の中への標的分子の希釈によって、起こる。
【００２１】 以下の実施例は、例えば、化合物によって阻害され得る未知の真菌の標的タン
パクが、制御可能なプロモーターの制御のもとにそれらの必須遺伝子を配置し、
それをスイッチオフし、それを対応する野生型の細胞を阻害しないレベルの化合
物にさらすことによって同定され得ることを証明する。今回、814個のS.cerevis
iae遺伝子が、リッチ培地(ＹＰＤ(登録商標)供給)でさえ、生長に必須であるこ
とが判明した。観察された高感受性反応(例えば、S.cerevisiaeのような真菌に
おいて)により：i)標的は必須である。ii)化合物は、抗真菌剤またはさらに強力
な類似化合物への展開のための出発点である。iii)標的−化合物の対(または複
数の対)は、抗真菌化合物の作用機序を確立する、ことが分かる。１つの標的に
対して検出される１より多い化合物に関し、貴重な構造活性相関(ＳＡＲ)の情報
が得られる。多くの標的に対する多くの化合物の比較およびパターン認識分析に
よって、経路中ごとに新規標的を分類するのに有用な貴重なデータベースが、す
ぐに確立される。高感受性は、また、親株を用いては同定できない低活性の化合
物の標的−特異的検出を可能にする。
【００２２】 本発明のさらに有益な点は、標的分子の特徴的な生化学的活性が、本発明の方
法にとって必要条件ではないことである。高感受性それ自体が、特定の標的と固
有に結びついたアッセイ可能な特徴を提供し得る。ゲノムのスイッチオフ構造は
、非常に高い処理能力で、クローニング・ステップを含まない公開されたＰＣＲ
に基づいた方法を用いて、生物のゲノム中に産生され、完成され得る(Longtine
et al. Yeast, 14, pp953-961(1998); Zhang et al. Nature Genetics, 20, pp1
23-128(1998))。その結果、本発明の方法は、すべての抗真菌標的の可能性があ
るもの、例えば１０まで、２０まで、５０まで、１００まで、５００まで、また
は１０００までの標的に対して、現代的な処理能力の高いスクリーニング技術を
用いて、可能な限り多くの化合物を試験するのに使用され得る。
【００２３】 その結果、本発明のさらなる方法において、我々は、代謝経路中の遺伝子が、
異種性の、調節可能なプロモーターの制御のもとで発現している生存能力のある
細胞、プロモーターを介して遺伝子の発現をスイッチオフすること、さまざまな
種類の細胞をさまざまな被験化合物と接触させること、さらに生存細胞の生長に
対する調節効果を検定し、比較することを含む、薬物代謝産物高感受性の同定方
法を提供する。生化学的経路の一要素の過少発現およびもう一つの部分の化学的
阻害が、共同作業的であることが判明し、その結果、その代謝経路のたった１つ
の要素の過少発現によって、経路特異的な情報が発生する。
【００２４】 ここで、本発明を以下の実施例および図を引用することによって説明するが、
限定するものではない： 図１は、本来のプロモーターをオン／オフが明確できっちりとしたスイッチ；
ここではＧＡＬ１と置換することによって、遺伝子、Ｇｅｎ１の調節可能な対立
遺伝子の発生を示す。 図２は、野生型(ｗｔ)およびＧＡＬ１−ＥＲＧ１１系におけるＥｒｇ１１ｐの
活性を示し、時間と共に触媒活性がどれほど減少するか、阻害剤の濃度がどれほ
ど増加するかを説明する。培養物を時間０においてガラクトースからグルコース
へと移すと、Ｅｒｇ１１ｐ(ラノステロールＣ−１４−デメチラーゼ)の新たな合
成が停止する。フルコナゾールの濃度は、野生型(ｗｔ)の系が全部は阻害されな
いものである。； ：フルコナゾールなし、.....：フルコナゾールあり；閾
値は、Ｅｒｇ１１ｐ活性が生長の律速となる値である。 図３は、フルコナゾールの存在下、野生型(JK9-3da, Kunz et al. Cell, 73,
pp585-596(1993))、ＧＡＬ１−ＥＲＧ１１およびＧＡＬ１−ＡＵＲ１(Longtine
et al. Yeast, 14, pp953-961(1998)に記載されたように産生した)系を示す。 図４は、オーレオバシジンＡ(aureobasidin Ａ)の存在下、ｗｔ、ＧＡＬ１−
ＥＲＧ１１、およびＧＡＬ１−ＡＵＲ１系の生長を示す。 図５は、テルビナフィンの存在下、ｗｔ、ＧＡＬ１−ＥＲＧ１１、およびＧＡ
Ｌ１−ＡＵＲ１系の生長を示す。 図６は、S.cerevisiaeにおけるプロモーターの置換のためのプロトコールを示
す(実質上、Longtine et al. Yeast, 14, pp953-961(1998)に記載されたように)
。
【００２５】 実施例 S.cerevisiaeのエルゴステロールおよびスフィンゴ脂質生合成経路：既知の阻害
剤での研究
【００２６】 低発現の代わりに完全にスイッチオフのものを使用する理論的根拠は、以下の
Ｅｒｇ１１ｐ(ｐ＝タンパク)、ラノステロールＣ−１４−デメチラーゼ、エルゴ
ステロール生合成経路における真菌の酵素の例示のように列挙される：薬物フル
コナゾールは、他のアゾール系抗真菌薬のように、Ｅｒｇ１１ｐを阻害し、細胞
内の総活性が減少する。しかしながら、活性Ｅｒｇ１１ｐの量が生長の律速とな
らないぐらい高い限りは、生長の減少は観察されない(閾値より上、図２参照)。
本実施例において、フルコナゾール濃度は、この閾値以下にＥｒｇ１１ｐ活性を
低下させるには不十分である。しかしながら、ＧＡＬ１駆動のＥＲＧ１１遺伝子
では、状況が異なる：時間０において、遺伝子の操作されたプロモーターは、培
地中の炭素源を変えることによって、オンの状態(ＧＡＬ１プロモーターの高発
現のため、このレベルは、通常、本来のプロモーターよりも高い)からオフの状
態に切り替えられる。この時点から、新たなｍＲＮＡは転写されず、ｍＲＮＡの
消失後は、新たなＥｒｇ１１タンパクが合成されない。Ｅｒｇ１１ｐの濃度は、
新たな娘細胞への酵素の希釈およびＥｒｇ１１ｐの消失により低下している。閾
値を下回るとすぐに、Ｅｒｇ１１ｐは律速となる、すなわち、その系は、不変の
親株(ｗｔ)と比較して生長が低下していることが分かる。このことは、培地の最
終的な光学密度がより低くなることによって反映される。阻害剤フルコナゾール
の存在は、不活性になる活性Ｅｒｇ１１ｐ分子を定量する。その結果、閾値をよ
り短時間で下回り、新たなＥｒｇ１１ｐは全く合成され得ない。野生型細胞と比
較すると、このことは、高感受性(同じ薬物濃度で、生長の低下がより大きい)と
して理解される。単純に、このことを、律速状態が起こる前の細胞分裂の量の減
少として説明できる。
【００２７】 標的および化合物の評価のために、高感受性は、ある薬物−標的の組み合わせ
に特異的でなければならない。それゆえ、その方法は、もう一つの無関係な既知
の薬物−標的の組み合わせで試験され、確認された：ＡＵＲ１は、イノシトール
ホスホリル−セラミド(inositolphosphoryl-ceramide)(IPC)シンターゼをコード
し、これは真菌のスフィンゴ脂質生合成経路に必須の酵素である(Nagiec et al,
J. Biol. Chem., 1997, 272, 15, 9809-9817)。その酵素は、ナノモーラー以下
で天然物オーレオバシジンＡによって阻害され、その薬物の抗菌作用につながる
。ＥＲＧ１１のように、ＡＵＲ１をプロモーターの置換に付し、得られた酵母系
は、親(ｗｔ)、ＧＡＬ１−ＥＲＧ１１およびＧＡＬ１−ＡＵＲ１であった。それ
らを、フルコナゾールおよびオーレオバシジンＡの両方の薬物に対するそれらの
感受性に関して試験した。我々の理論によって予測されたように、両方のＧＡＬ
１駆動系は、同種の薬物に対して顕著な高感受性反応を示す(図３および４参照)
。注目すべきことに、交差反応はない、すなわち、ＧＡＬ１−ＥＲＧ１１ではオ
ーレオバシジンＡに対する感受性は増大せず、ＧＡＬ１−ＡＵＲ１でもフルコナ
ゾールに対する感受性は増大しない。このことは我々の理論を確認し、薬物およ
び標的発見手法としての記載された方法の適用可能性および利用性を証明する。
【００２８】 当然、ある経路における一つの酵素の阻害剤に対する高感受性反応が、経路全
体の阻害剤にまで拡張され得ることになる。これは、一つの酵素が次の基質を提
供するという生化学的カスケード反応において、酵素が直線的に配置されている
ことによる。基質の供給の減少は、酵素レベルの減少と共に共同的に作用し得る
。それゆえ、いくつかの生合成段階を通して、通常であればＥｒｇ１ｐ(スクア
レンエポキシダーゼで、ステロール生合成経路のもう一つの酵素である)によっ
て供給される基質の消失により、実質上の律速酵素Ｅｒｇ１１ｐ(スイッチオフ
後)の活性が低下する。ここで、Ｅｒｇ１ｐは、テルビナフィンによって阻害さ
れる。このような経路特異的高感受性は、スイッチオフ遺伝子と同じ経路に(類
別化されていない)遺伝子を類別化することを可能にする。これを調べるために
、我々はＥｒｇ１ｐを試験した。この酵素は抗菌剤のテルビナフィンによって阻
害されるが、Ｅｒｇ１１ｐは阻害されないことが判明している。図５に示される
ように、ＧＡＬ１−ＥＲＧ１１は、テルビナフィンに対して、ＧＡＬ１−ＥＲＧ
１と同じぐらい高感受性であり、仮定された交差経路高感受性を提供する。この
経路特異的分析手法は、(作用機序が未知の)新規阻害剤の分類化に極めて有用で
ある。
【００２９】 特にS.cerevisiaeに関して例示したが、本発明は細菌のように遺伝学的に操作
可能な生物すべてに適用可能であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本来のプロモーターをオン／オフが明確できっちりとした
スイッチ；ここではＧＡＬ１と置換することによって、遺伝子、Ｇｅｎ１の調節
可能な対立遺伝子の発生を示す。
【図２】 図２は、野生型(ｗｔ)およびＧＡＬ１−ＥＲＧ１１系におけるＥｒ
ｇ１１ｐの活性を示し、時間と共に触媒活性がどれほど減少するか、阻害剤の濃
度がどれほど増加するかを説明する。培養物を時間０においてガラクトースから
グルコースへと移すと、Ｅｒｇ１１ｐ(ラノステロールＣ−１４−デメチラーゼ)
の新たな合成が停止する。フルコナゾールの濃度は、野生型(ｗｔ)の系が全部は
阻害されないものである。； ：フルコナゾールなし、.....：フルコナゾー
ルあり；閾値は、Ｅｒｇ１１ｐ活性が生長の律速となる値である。
【図３】 図３は、フルコナゾールの存在下、野生型(JK9-3da, Kunz et al.
Cell, 73, pp585-596(1993))、ＧＡＬ１−ＥＲＧ１１およびＧＡＬ１−ＡＵＲ１
(Longtine et al. Yeast, 14, pp953-961(1998)に記載されたように産生した)系
を示す。
【図４】 図４は、オーレオバシジンＡ(aureobasidin Ａ)の存在下、ｗｔ、
ＧＡＬ１−ＥＲＧ１１、およびＧＡＬ１−ＡＵＲ１系の生長を示す。
【図５】 図５は、テルビナフィンの存在下、ｗｔ、ＧＡＬ１−ＥＲＧ１１、
およびＧＡＬ１−ＡＵＲ１系の生長を示す。
【図６】 図６は、S.cerevisiaeにおけるプロモーターの置換のためのプロト
コールを示す(実質上、Longtine et al. Yeast, 14, pp953-961(1998)に記載さ
れたように)。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 CA02 DA12 FA02 4B063 QA01 QA06 QQ06 QQ07 QQ26 QQ61 QR06 QR41 QR75 QR76 QX01

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 異種性の、調節可能なプロモーターの制御のもとで遺伝子が発現している生存
    能力のある細胞を提供すること、 プロモーターを介して遺伝子の発現をスイッチオフすること、 細胞を被験化合物と接触させること、および 遺伝子産物の機能に対する調節効果を検定すること、 を含む、必須遺伝子の遺伝子産物の機能を調節する化合物を同定する方法。
  2. 【請求項２】 生存能力のある細胞が定常期初期へと生長している請求項１
    に記載の方法。
  3. 【請求項３】 遺伝子が細菌の遺伝子である請求項１または２に記載の方法
    。
  4. 【請求項４】 遺伝子が真菌の遺伝子である請求項１または２に記載の方法
    。
  5. 【請求項５】 調節効果を光学密度測定法によって検定する請求項１から４
    のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 １より多い必須遺伝子の遺伝子産物に対する化合物を試験す
    るために、請求項１から５のいずれかに記載の方法を使用することを含む、薬物
    スクリーニング方法。
  7. 【請求項７】 化合物を２０より多い必須遺伝子の遺伝子産物に対して試験
    する請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 代謝経路中における遺伝子が、異種性の、調節可能なプロモーターの制御のも
    とで発現している生存能力のある細胞を提供すること、 プロモーターを介して遺伝子の発現をスイッチオフすること、 他種の細胞を異なる被験化合物と接触させること、次いで 生存能力のある細胞の生長に対する調節効果を検定し、比較すること を含む、薬物代謝産物高感受性を同定する方法。
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