ES2111289T5 - Metodos y kits de diagnostico que emplean promotores de estres en mamiferos para determinar la toxicidad de un compuesto. - Google Patents
Metodos y kits de diagnostico que emplean promotores de estres en mamiferos para determinar la toxicidad de un compuesto.Info
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Abstract
EL INVENTO PROPORCIONA METODOS Y HERRAMIENTAS DE DIAGNOSTICO PARA IDENTIFICAR Y CARACTERIZAR COMPUESTOS TOXIXOS. ESTOS METODOS Y HERRAMIENTAS DE DIAGNOSTICO MIDEN NIVELES DE TRANSCRIPCION O TRASLACION DE GENES UNIDOS A PROMOTORES DE STRESS EUCAROTICOS INNATOS, ESPECIALMENTE LOS DE LOS MAMIFEROS. LAS HERRAMIENTAS Y METODOS DE ESTE INVENTO UTILIZAN AL MENOS UN PROMOTOR DE STRESS DE CADA UNO DE LOS SIGUIENTES GRUPOS: STRESS REDOX, STRESS DNA, STRESS PROTEINA, Y STRESS ENERGICO/IONICO. EL INVENTO TAMBIEN PROPORCIONA METODOS Y HERRAMIENTAS DE DIAGNOSTICO PARA IDENTIFICAR Y CARACTERIZAR COMPUESTOS QUE SON TOXICOS PARA ORGANOS ESPECIFICOS, TALES COMO LA PIEL O LOS OJOS, ASI COMO PARA CADA UNO DE LOS STRESSES INDIVIDUALES INDICADOS ANTES. LOS METODOS Y HERRAMIENTAS DE DIAGNOSTICO DE ESTE INVENTO PRODUCEN INFORMACION REFERENTE A LA ACCION DE UN COMPUESTO SOBRE UN NIVEL SUBCELULAR. ESTA INFORMACION PUEDE SER UTILIZADA PARA DISEÑAR ANTITOXINAS PARA COMPUESTOS HALLADOS PARA SER TOXICOS Y UN DISEÑO DE DROGA ACTIVA.
Description
Métodos y kits de diagnóstico que emplean
promotores de estrés en mamíferos para determinar la toxicidad de un
compuesto.
Esta invención proporciona métodos y kits de
diagnóstico, para identificar y caracterizar compuestos tóxicos.
Estos métodos y kits de diagnóstico miden los niveles de
transcripción o de traducción de genes unidos a promotores de estrés
eucariotas nativos, especialmente los de mamíferos. Los kits y los
métodos de esta invención utilizan al menos un promotor de estrés de
cada uno de los grupos siguientes: estrés redox, estrés de DNA,
estrés de proteína y estrés energético/iónico. La invención
proporciona también métodos y kits de diagnóstico para identificar y
caracterizar compuestos que son tóxicos para órganos específicos
tales como la piel y los ojos, así como para cada uno de los
estreses individuales indicados anteriormente. Los métodos y kits de
diagnóstico de esta invención proporcionan información relativa a la
acción de un compuesto en un nivel subcelular. Esta información
puede ser utilizada para diseñar antitoxinas contra compuestos que
se ha encontrado que son tóxicos, y en el diseño de fármacos
activos.
En los Estados Unidos se producen actualmente al
menos 55.000 productos químicos. Cada año se introducen en el
mercado más de 2.000 productos químicos nuevos. Muy pocos de estos
productos han sido estudiados con amplitud en relación con su
toxicidad aguda o crónica. Por ejemplo, menos de 1 por ciento de los
productos químicos comerciales han sido sometidos a una evaluación
completa de su riesgo sanitario.
La Agencia de Protección del Medio Ambiente
("EPA": Environmental Protection Agency)
tiene autoridad para requerir ensayos toxicológicos de un producto
químico antes de su producción comercial, pero raras veces se
recurre a esa autoridad. Menos del 10 por ciento de los nuevos
productos químicos son sometidos a una revisión detallada por la
EPA. Atentos al coste y al rápido acceso al mercado, la EPA utiliza
con frecuencia la toxicidad de compuestos homólogos ensayados con
anterioridad para calibrar la toxicidad de un nuevo producto
químico.
La toxicidad potencial de nuevos fármacos es
controlada por la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA:
Food and Drug Administration). Para una
Solicitud de Nuevo Fármaco (NDA: New Drug
Application), la FDA requiere típicamente una amplia serie de
ensayos de toxicidad, carcinogenicidad, mutagenicidad y
reproducción/fertilidad en al menos dos especies de animales vivos.
Se requiere que estos ensayos duren hasta un año. Un ensayo de
toxicidad de dos años en ratas cuesta aproximadamente 800.000
dólares [Casarett and Doull's Toxicology, 4th Ed., M. O.
Amdur et al., ed. Pergamon Press, Nueva York, p. 37
(1991)].
Aparte del coste, el ensayo con animales presenta
también inconvenientes en términos de tiempo, sufrimiento de los
animales y precisión. Los ensayos de toxicidad típicos se dividen en
tres estadios: agudo, a corto plazo y a largo plazo. Los ensayos
agudos, que determinan la LD_{50} de un compuesto (la dosis para
la cual muere el 50% de los animales), requieren de 60 a 100
animales y una serie de ensayos para determinar LD_{50}, curvas de
dosis-respuesta y para controlar los puntos finales
clínicos distintos de la muerte. Los ensayos a corto plazo implican
normalmente al menos a 24 perros y 90 ratas y duran de 90 días en
las ratas a 6-24 meses en los perros. En los ensayos
a corto plazo se miden frecuentemente el peso corporal, el consumo
de alimento y muestras de sangre, orina y tejidos. Además, los
animales muertos son sometidos a exámenes
post-mortem. Los ensayos a largo plazo son similares
a los ensayos a corto plazo, pero duran 2 años en ratas y hasta 7
años en perros o monos.
Los ensayos con animales son objeto de crítica
por parte de los activistas de los derechos de los animales y del
público en general, debido a los graves padecimientos a los que se
somete a los animales. Además, evidencias recientes ponen en
cuestión la precisión de los ensayos con animales. Por ejemplo,
variables tales como la dieta del animal pueden perjudicar a la
predecibilidad de los ensayos con animales para determinar
propiedades cancerígenas [P. H. Abelson, "Diet and Cancer in
Humans and Rodents", Science, 255, p. 141 (1992)]. Y ahora
se están evaluando de nuevo determinaciones anteriores acerca de la
toxicidad de la dioxina basadas en pruebas con cobayas [B. J.
Culliton, "US Government Orders New Look At Dioxin",
Nature, 352, p. 753 (1991); L. Roberts, "More Pieces in the
Dioxin Puzzle", Research News, October, 1991, p. 377]. Por
tanto, es evidente que existe una urgente necesidad de una
alternativa rápida, económica y fiable a los ensayos de toxicidad en
animales.
Se dispone de algunos ensayos alternativos a los
de corto plazo. Por ejemplo, el ensayo de Ames detecta cancerígenos
que producen reversión genética de cepas mutantes de Salmonella
typhimurium. Sin embargo, el ensayo de Ames no puede detectar
cancerígenos no mutágenos ni toxinas no cancerígenas. El sistema de
ensayo de cancerígenos en levaduras descrito en la patente de EE.UU.
nº 4.997.757 supera algunos de los inconvenientes del ensayo de Ames
pero sigue sin ser capaz de detectar toxinas no cancerígenas. Estos
dos ensayos están diseñados para detectar alteraciones y mutaciones
solamente a nivel del DNA. Por consiguiente, esos ensayos de la
técnica anterior no pueden detectar el daño directo a proteínas o
membranas lipídicas, ni inhibidores de la síntesis del DNA. Además,
esos ensayos de la técnica anterior no pueden proporcionar
información en cuanto a la cuantía en la que un mutágeno o una
toxina ejercen su acción.
El documento WO 90/10710 describe el uso de un
TNF, IL-1\alpha o IL-1\beta
fusionado a un gen reportero para detectar pirógenos bacterianos.
Sin embargo, el ensayo descrito está limitado en cuanto que detecta
solamente un estrés particular (pirógenos bacterianos) y no da
información cualitativa acerca de cómo ejerce su acción tóxica el
pirógeno.
En el documento
WO-A-94 01584 del solicitante, se
describe un sistema de ensayo que utiliza un gen reportero fusionado
a promotores de estrés bacterianos, para determinar y caracterizar
la toxicidad de un compuesto. Este ensayo puede detectar daños a
proteínas o membranas lipídicas y la inhibición de la síntesis de
DNA. Así, este ensayo proporciona la identificación de toxinas no
cancerígenas. Desgraciadamente, la correlación entre toxicidad
bacteriana y toxicidad a mamíferos y otros eucariotas superiores
tiene ciertas limitaciones y puede no ser una medida precisa de la
toxicidad en animales superiores.
Por consiguiente, sigue habiendo necesidad de un
ensayo que tenga simultáneamente las características de economía de
tiempo y coste del ensayo de estrés bacteriano, pero que esté basado
en una célula eucariota.
La firma solicitante ha satisfecho esta necesidad
proporcionando un kit de diagnóstico in vitro y un método de
ensayo que identifica y caracteriza el efecto celular y subcelular
de una toxina potencial sobre una célula animal. Estos kits y
métodos emplean los promotores de estrés nativos de células
eucariotas, preferentemente células de mamíferos, y miden el nivel
de transcripción o traducción de un gen que está operativamente
unido al mismo. Dependiendo de la elección de los promotores de
estrés usados, los kits y métodos de esta invención pueden ser
diseñados para identificar y caracterizar compuestos que son tóxicos
para el animal en su conjunto o para órganos específicos de ese
animal.
En una realización, los kits y métodos de esta
invención caracterizan la toxicidad de un compuesto determinado el
nivel de transcripción de varios genes de estrés presentes en una
célula eucariota. Estos kits y métodos emplean oligonucleótidos que
son complementarios u homólogos al menos respecto a una porción de
varios RNA mensajeros del gen de estrés para detectar la
transcripción de esos genes en la célula. En esta realización, una
célula individual es efectivamente un reactivo de diagnóstico in
vitro para determinar qué estrés concreto induce un compuesto
dado.
En otra realización, cada una de una diversidad
de células eucariotas similares aloja un promotor de estrés
diferente unido operativamente a un gen reportero. Exponiendo cada
célula separadamente a un compuesto y midiendo la expresión del
producto del gen reportero, puede caracterizarse la toxicidad de ese
compuesto.
Los kits y métodos de esta invención son
diseñados óptimamente para determinar la toxicidad de un compuesto
en cuestión de días, en vez de los meses o años que se precisan para
los ensayos con animales. Además, los kits de esta invención
consiguen estos resultados por una fracción del coste de los ensayos
con animales y sin sus objecionables consecuencias para los animales
vivos. Y los kits de diagnóstico y métodos de esta invención
proporcionan información directa acerca de la naturaleza de la
acción de una toxina sobre las células de los mamíferos, algo que no
conseguían hacer los ensayos a corto plazo de la técnica
anterior.
Por tanto, la presente invención se refiere a un
kit de diagnóstico para identificar y caracterizar un compuesto
tóxico, que comprende:
- (a)
- una célula de mamífero caracterizada por:
- (i)
- al menos un promotor que solamente responde a estrés redox;
- (ii)
- al menos un promotor que solamente responde a estrés de DNA;
- (iii)
- al menos un promotor que solamente responde a estrés de proteína; y
- (iv)
- al menos un promotor que solamente responde a estrés energético/iónico,
- estando unido operativamente cada uno de dichos promotores a un gen diferente que codifica un producto detectable diferente; y
- (b)
- al menos cuatro sondas oligonucleotídicas diferentes, siendo cada una de dichas sondas capaces de hibridarse con el transcrito de mRNA de uno de los genes diferente que está operativamente unido a dichos promotores, o con un cDNA monocatenario preparado a partir de dicho transcrito de mRNA,
- (i)
- siendo al menos una de dichas sondas oligonucleotídicas capaz de hibridarse con el transcrito de mRNA, o con un cDNA monocatenario preparado a partir de dicho transcrito de RNA, de uno de dichos genes que está unido operativamente a uno de dichos promotores que solo responde a estrés redox,
- (ii)
- siendo al menos una de dichas sondas oligonucleotídicas capaz de hibridarse con el transcrito de mRNA, o con un cDNA monocatenario preparado a partir de dicho transcrito de RNA, de uno de dichos genes que está unido operativamente a uno de dichos promotores que solo responde a estrés de DNA,
- (iii)
- siendo al menos una de dichas sondas oligonucleotídicas capaz de hibridarse con el transcrito de mRNA, o con un cDNA monocatenario preparado a partir de dicho transcrito de RNA, de uno de dichos genes que está unido operativamente a uno de dichos promotores que solo responde a estrés de proteína,
- (iv)
- siendo al menos una de dichas sondas oligonucleotídicas capaz de hibridarse con el transcrito de mRNA, o con un cDNA monocatenario preparado a partir de dicho transcrito de RNA, de uno de dichos genes que está unido operativamente a uno de dichos promotores que solo responde a estrés energético/iónico.
En una realización alternativa, la presente
invención se refiere a un kit de diagnóstico para identificar y
caracterizar un compuesto tóxico, que comprende al menos:
- (i)
- una primera célula de mamífero que aloja al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés redox;
- (ii)
- una segunda célula de mamífero que aloja al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés de DNA;
- (iii)
- una tercera célula de mamífero que aloja al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés de proteína; y
- (iv)
- una cuarta célula de mamífero que aloja al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés energético/iónico;
en donde cada uno de dichos
promotores o elementos de respuesta está unido operativamente a un
gen heterólogo que codifica un producto
detectable.
La presente invención también se refiere a un
método in vitro para determinar la toxicidad de un compuesto
para una célula de mamífero creando un perfil de inducción de
estreses, que comprende identificar y cuantificar separadamente cada
uno de los estrés redox, de DNA, de proteína y energético/iónico que
el compuesto causa a las células, comprendiendo el método las etapas
de:
- (a)
- cultivar separadamente una o más células de mamífero que, in toto, se caracterizan por:
- (i)
- al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés redox,
- (ii)
- al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés de DNA,
- (iii)
- al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés de proteína,
- (iv)
- al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés energético/iónico,
- estando cada uno de dichos promotores o elementos de respuesta unidos operativamente a un gen que codifica un producto detectable;
- (b)
- exponer cada uno de dichos uno o más cultivos de células a dicho compuesto;
- (c)
- cuantificar los productos detectables que corresponden al estrés redox, de DNA, de proteína y energético/iónico que el compuesto causa a la célula; y
- (d)
- crear el perfil de inducción del promotor de estrés a partir de los datos resultantes de la etapa (c) para dicho compuesto.
La Figura 1 representa la expresión relativa de
cloranfenicol-acetil-transferasa
bajo el control de diferentes promotores de estrés en presencia de
concentraciones variables de tetraclorodibenzo-p-dioxina
(TCDD).
La Figura 2 representa la expresión relativa de
cloranfenicol-acetil-transferasa
bajo el control de diferentes promotores de estrés en presencia de
concentraciones variables de
3-metil-colantreno
(3-MC).
La Figura 3 representa la expresión relativa de
cloranfenicol-acetil-transferasa
bajo el control de diferentes promotores de estrés en presencia de
concentraciones variables de benzo[a]pireno.
La Figura 4 representa la expresión relativa de
cloranfenicol-acetil-transferasa
bajo el control de diferentes promotores de estrés en presencia de
concentraciones variables de sulfato de cadmio.
La Figura 5 representa la expresión relativa de
cloranfenicol-acetil-transferasa
bajo el control de diferentes promotores de estrés en presencia de
concentraciones variables de dimetil-sulfóxido
(DMSO).
La Figura 6 representa la expresión relativa de
cloranfenicol-acetil-transferasa
bajo el control de diferentes promotores de estrés en presencia de
concentraciones variables de etanol.
La Figura 7 representa la expresión relativa de
cloranfenicol-acetil-transferasa
bajo el control de diferentes promotores de estrés en presencia de
concentraciones variables de hidrocloruro de metapirileno.
La Figura 8 representa la expresión relativa de
cloranfenicol-acetil-transferasa
bajo el control de diferentes promotores de estrés en presencia de
concentraciones variables de éster metílico del ácido
metanosulfónico (MMS).
La Figura 9 representa la expresión relativa de
cloranfenicol-acetil-transferasa
bajo el control de diferentes promotores de estrés en presencia de
concentraciones variables de arseniato sódico.
La Figura 10 representa la expresión relativa de
cloranfenicol-acetil-transferasa
bajo el control de diferentes promotores de estrés en presencia de
concentraciones variables de
12-acetato-13-miristato
de forbol (PMA).
La Figura 11 representa la expresión relativa de
cloranfenicol-acetil-transferasa
bajo el control de diferentes promotores de estrés en presencia de
concentraciones variables de ácido retinoico.
Como se usan en el presente texto, los términos
"estrés" y "toxicidad" se usan indistintamente y se
refieren al trastorno de la homeostasis bioquímica y biofísica de la
célula.
La expresión "estrés redox", como se usa a
lo largo de esta solicitud, se refiere a condiciones que se apartan
del estado normal del potencial de oxidación/reducción (redox) de la
célula. El estrés redox incluye niveles más altos de radicales de
superóxidos (tanto peróxido de hidrógeno como peróxidos orgánicos),
niveles más bajos de glutatión y cualquier otra condición que altere
el potencial redox de la célula, tal como la exposición a agentes
reductores fuertes, algunos hidrocarburos aromáticos, compuestos
electrófilos, aldehídos, tioles intracelulares, esteroides,
metil-colantreno, fenobarbital y CCl_{4}. La
expresión incluye también cualquier condición adicional que provoque
la proliferación de peroxi-
somas.
somas.
La expresión "estrés de DNA", como se usa en
el presente texto, se refiere a alteraciones en el ácido
desoxirribonucleico o en nucleótidos precursores. Por ejemplo, el
estrés de DNA incluye, pero no se limita a ellos, roturas de la
cadena de DNA, reticulación de la cadena de DNA, exposición a
agentes de interposición del DNA, superhelicidad tanto aumentada
como disminuida, daños al DNA por oxidación, alquilación del DNA,
oxidación de trifosfatos de nucleósido y alquilación de trifosfatos
de nucleósido. La expresión incluye también la inhibición de la
síntesis y replicación del DNA y la inhibición de la mitosis o la
meiosis. Y la expresión incluye condiciones causadas por exposición
a factores de crecimiento, interferones, promotores tumorales,
factor de necrosis tumoral, ésteres de forbol, fármacos citotóxicos
hidrófobos, agentes inflamatorios, mitógenos, cancerígenos, rayos X,
radiación UV y dimetilnitrosa-
minas.
minas.
"Estrés de proteínas", como se usa a lo
largo de la solicitud, se refiere a alteraciones en proteínas o
aminoácidos individuales e inhibición de funciones enzimáticas, así
como a perturbaciones del transporte intracelular de proteínas. La
expresión incluye, sin limitarse a ellas, desnaturalización de
proteínas, plegamientos en falso de las proteínas, quelación de
cofactores de proteínas, reticulación de proteínas, oxidación tanto
dependiente como independiente del oxígeno de enlaces inter- e
intra-catenarios, tales como los puentes disulfuro,
alquilación de proteínas, oxidación de aminoácidos individuales y
daños en las proteínas causados por la exposición a metales pesados,
tal como el cadmio, y calor.
El autor de la presente invención utiliza la
expresión "estrés energético/iónico" para abarcar las
condiciones que afectan a los niveles de ATP en la célula o
gradientes iónicos a través de una membrana celular. Ejemplos de
estrés energético son el metabolismo anaerobio forzado en presencia
de oxígeno, perturbaciones del transporte de electrones, exposición
a agentes de desacoplamiento, despolarización de membranas, choque
osmótico, exposición a iones tales como Ca^{+2}, exposición a
niveles elevados de cAMP y exposición a etanol.
La expresión "inducción de promotor de
estrés" se refiere a las condiciones que incrementan el nivel de
expresión de un gen unido operativamente a un promotor de estrés
nativo o a un promotor de estrés derivado por recombinación que
contiene un elemento de respuesta. La expresión "unión
operativa", "unido operativamente" o "unido
operablemente" se refiere a la situación del promotor relativa al
gen de forma que la transcripción del gen esté regulada por el
promotor. La expresión abarca ambas construcciones recombinantes,
así como la estructura de un promotor de origen natural y su gen
asociado.
La expresión "determinar y caracterizar la
toxicidad de un compuesto" incluye identificar un compuesto como
toxina y dilucidar su mecanismo de acción dentro de la célula.
La expresión "secuencias de ácidos
nucleicos", como se usa en esta solicitud, incluye RNA, cDNA
monocatenario o bicatenario, o porciones de los mismos, DNA genómico
monocatenario o bicatenario, o porciones de los mismos, u
oligonucleótidos sintéticos monocatenarios o bicatenarios.
Aunque cada gen es controlado por un único
promotor, los genes que responden a estreses idénticos contienen un
elemento de respuesta común dentro de sus promotores. En
consecuencia, el mismo elemento de respuesta es responsable de
inducir la expresión de una familia de genes al exponerse a un
cierto estrés. Cuando son aislados y unidos operativamente a un
promotor mínimo y un gen estructural, la construcción resultante
funciona igual que un promotor de estrés. Esto es particularmente
útil para diseccionar un promotor de estrés nativo que responde a
estreses múltiples en sus partes componentes.
Las células individuales responden a estímulos
tóxicos, en parte, activando genes específicos cuyos productos
proteicos destoxifican los estímulos o reparan los daños causados
por ellos. Las células eucariotas tienen un gran número de
respuestas genéticas y bioquímicas a los daños y al estrés. No menos
de 50 distintos genes de estrés de mamíferos han sido ya aislados y
caracterizados. Estos genes se inducen por una diversidad de
estreses químicos y físicos o daños celulares.
Entre los estreses químicos que inducen uno o más
de estos genes identificados están la exposición de la célula al
mercurio, metales pesados, nitróxidos, hidrocarburos aromáticos,
acidez, basicidad, agentes alquilantes, agentes peroxidantes,
agentes de reticulación, ionóforos, agentes con actividad redox,
compuestos electrófilos, agentes inflamatorios, fármacos citotóxicos
hidrófobos, etanol, esteroides, agentes de desacoplamiento,
promotores tumorales y factores celulares, tales como el factor de
necrosis tumoral, factores de crecimiento e interferones. Los
estreses físicos incluyen la exposición a radiación UV, al calor y a
los rayos X.
Ejemplos de daños celulares que inducen estos
genes identificados son la oxidación de los lípidos, proliferación
de peroxisomas, roturas de la cadena del DNA, alquilación del DNA,
reticulación del DNA, oxidación del DNA, desequilibrio osmótico,
oxidación de proteínas, plegamientos en falso de las proteínas,
alquilación de proteínas, depleción de ATP, permeabilización de la
membrana, depleción de glutatión y alteraciones en la transducción
de la señal. Se cree que existen muchos más genes de estrés. La
identificación y caracterización de estos genes de estrés
adicionales es muy deseable para entender los efectos que tienen
diversos estreses químicos sobre la célula.
La presente invención proporciona kits de
diagnóstico y métodos para determinar y caracterizar la toxicidad de
un compuesto en términos del tipo de daño que produce dentro de la
célula, es decir, daños al DNA, daños a las proteínas, daños por
fenómenos redox, daños por energía, daños por iones, etc. Según una
realización, cada kit de diagnóstico de esta invención comprende una
diversidad de células eucariotas, cada una de las cuales aloja al
menos un promotor o un elemento promotor que responde al estrés. La
diversidad de células, en conjunto, ha de comprender al menos un
promotor o un elemento promotor que responda a cada uno de los tipos
de estrés anteriormente mencionados, redox, DNA, proteína y
energía/iónico, unido operativamente a un gen que codifica un
producto detectable.
Según una realización, la diversidad de células
de este kit es en realidad una única línea celular en la que cada
célula contiene todos los diferentes tipos de promotores de estrés,
y en la que cada uno de estos promotores es activado al exponerse al
estrés apropiado. En esta realización, los genes unidos
operativamente a los promotores de estrés son, lo más
preferentemente, los genes de estrés nativos. De esta manera, no se
necesita realizar ninguna manipulación genética en las células antes
de llevar a cabo un ensayo. En esta realización preferida, los kits
comprenden además oligonucleótidos o diversos cDNA que, al menos,
son complementarios respecto a una porción de la cadena codificadora
o de la no codificadora de los genes bajo control de los promotores
de estrés específicos. Los oligonucleótidos se utilizan para
detectar y determinar cuantitativamente los transcritos de mRNA de
esos genes o los complementos de cDNA de los mismos, cualquiera de
los cuales pueden ser un producto detectable en esta
realización.
Se ha de observar que aunque todas las células
eucariotas contienen numerosos promotores de estrés en sus genomas,
algunos de esos promotores pueden ser o no activables al exponerlos
al estrés apropiado. Esto es especialmente cierto en eucariotas
superiores, tales como los mamíferos. Se prefieren en los kits de
esta invención las líneas celulares cuyos promotores de estrés sí
que responden a casi todos los estreses apropiados. Estas incluyen
tejido primario de hígado, corazón, pulmón, riñón, cerebro u otro
órgano de mamíferos, así como líneas celulares derivadas de
mamíferos establecidas a partir de estos tejidos, disponibles de la
American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Son más
preferidas las células HepG2, las células HeLa y las células
WIL-2. Las más preferidas son las células HepG2.
Los oligonucleótidos empleados en los kits de
diagnóstico y métodos de esta invención expuestos anteriormente se
eligen basándose en su capacidad para hibridarse específicamente,
bajo condiciones de rigurosidad relativamente elevada, con el
producto de transcripción del gen unido operativamente a los
diversos promotores de estrés o bien con su complemento (es decir,
un cDNA monocatenario transcrito inversamente a partir de ese mRNA).
La elección de la utilización de oligonucleótidos complementarios u
homólogos depende del método usado para detectar los productos de la
transcripción. Estos diversos métodos se describen más adelante en
esta solicitud.
Dado que se conocen las secuencias de DNA de
muchos genes de estrés de mamíferos, se construyen fácilmente
oligonucleótidos hibridables. Debe observarse que no se requiere un
100% de homología o complementariedad entre el oligonucleótido y el
mRNA del gen de estrés. Esto se debe a que puede diseñarse el
oligonucleótido basándose en la secuencia de un gen de estrés de una
especie diferente de la fuente de las células usadas en los kits y
métodos de esta invención.
Aunque se espera que genes de estrés similares
procedentes de especies de mamíferos distintas estén estrechamente
relacionados, lo más probable es que los transcritos a partir de
dichos genes no tengan secuencias de nucleótidos idénticas. En
consecuencia, los oligonucleótidos utilizados en los kits y métodos
de esta invención son preferentemente al menos un 95% homólogos o
complementarios. Preferentemente, los oligonucleótidos tienen una
longitud entre 20 y 500 pares de bases. Lo más preferentemente, los
oligonucleótidos tienen una longitud entre 50 y 100 pares de
bases.
Más preferentemente, los oligonucleótidos se
sintetizan usando un sintetizador de oligonucleótidos, seguido
opcionalmente por una reacción en cadena de polimerasa ("PCR").
En este procedimiento, se sintetiza un oligonucleótido que tiene una
secuencia idéntica a una porción de la cadena molde o bien de la
cadena no codificadora y dentro de la región de codificación de un
gen de estrés secuenciado conocido. Si se va a usar la PCR para
aumentar la cantidad de oligonucleótido, el oligonucleótido se
sintetiza con 6 a 12 nucleótidos adicionales en cada extremo. Esos
nucleótidos de más sirven de dianas para cebadores complementarios
en una reacción PCR. Preferentemente, los nucleótidos extra en cada
extremo son complementarios entre sí. Esto permite que un único
cebador cebe tanto el oligonucleótido original como el producto de
la PCR del mismo. Lo más preferentemente, los nucleótidos extra en
cada extremo son homohexámeros complementarios, es decir, AAAAAA en
un extremo y TTTTTT en el otro.
Durante la PCR, preferentemente se incluyen uno o
más nucleótidos marcados en la reacción de polimerasa.
Preferentemente el marcador es ^{32}P, biotina o un marcador
fluorescente. Esto tiene por resultado un producto marcado que puede
ser usado directamente para detectar el nivel de producto de
transcripción. La ventaja de esta técnica mixta de sintetizador de
oligonucleótidos/PCR es que en un sólo procedimiento pueden
producirse cantidades de microgramos de oligonucleótido marcado. Los
oligonucleótidos resultantes pueden ser biotinilados opcionalmente
después de la síntesis y la purificación.
Si el oligonucleótido se usa para detectar
transcritos inversos de cDNA del producto de transcripción, es
preferible que no estén marcados. En esta realización, se prefiere
que el marcador sea incorporado en el cDNA en vez de hacerlo en el
oligonucleótido.
El diseño de sondas de oligonucleótidos
apropiadas para ser usadas en los kits y métodos de esta invención
es relativamente directo. Evidentemente, han de tener una elevada
similitud de secuencias o complementariedad respecto del mRNA del
gen de estrés para el que han sido destinados a hibridarse. Los
oligonucleótidos de cualquier kit en particular deben tener también
aproximadamente la misma temperatura de fusión (T_{m}) para que
pueda utilizarse un sólo aparato de calentamiento (tal como un baño
de agua) cuando se lleva a cabo la hibridación y las subsiguientes
etapas de lavado. Preferentemente, los oligonucleótidos se diseñan
para que tengan una T_{m} superior a 70ºC en 0,2X SSC. Para
determinar las porciones de las regiones de codificación del gen de
estrés a emplear en el diseño de sondas de oligonucleótidos, se
puede utilizar un programa de ordenador disponible comercialmente,
tal como OLIGO (National Biosciences, Plymouth, MN).
De acuerdo con otra realización, cada una de la
diversidad de células eucariotas del kit de diagnóstico de esta
invención aloja un promotor de estrés o un elemento de respuesta al
estrés que está unido operativamente a un gen heterólogo que
codifica un producto detectable. En esta realización, es preferible
que el mismo gen heterólogo esté unido a los varios promotores de
estrés o elementos de respuesta del kit. De esta manera, solamente
se necesita realizar un único ensayo para detectar la inducción de
cualquiera de los promotores de estrés y elementos de respuesta al
estrés. También es preferible que cada célula del kit contenga
solamente un único promotor de estrés o construcción elemento de
respuesta/gen heterólogo. Así, la expresión del producto detectable
en cualquier célula dada del kit puede ser correlacionada
específicamente con la inducción de un solo promotor de estrés o
elemento de respuesta.
Los kits de diagnóstico y métodos de esta
invención emplean una diversidad de células eucariotas que, en
conjunto, comprenden promotores o elementos de respuesta que
responden a cada uno de los estreses redox, de DNA, de proteínas y
energético. Los promotores y elementos de respuesta preferidos de
esta invención, para su uso con células de mamíferos, se exponen a
continuación en la Tabla 1.
Preferentemente, los promotores o elementos de
respuesta que responden a estrés redox en los métodos y kits de esta
invención se eligen entre los promotores de los genes CYP1A1, GST
Ya, JUN, ALDH1 y HMO, y los elementos de respuesta XRE, NFkBRE,
PPRE, RARE, ERE y ThRE.
El gen CYP1A1 codifica el citocromo P450 1A1, una
enzima implicada en el metabolismo de hidrocarburos aromáticos
policíclicos tales como benzo(a)pireno. El gen es
inducible por hidrocarburos aromáticos, flavonas vegetales y también
por tetraclorodibenzo-p-dioxina
(TCDD), uno de los teratógenos y promotores tumorales más potentes
[L. A. Neuhold et al., Mol. Cell Biol., 9, pp.
2378-2386 (1989); Y. Fujii-Kuriyama
et al., The FASEB J., 6, pp. 706-710
(1992), D. W. Nebert et al., Env. Health Perpec., pp.
13-25 (1990); R. A. Dixon et al., Biol.
Rev., 61, pp. 239-241 (1986)]. La secuencia de
este gen se describe en K. Sogawa et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, pp. 8044-8048 (1986).
El gen GST Ya codifica la subunidad Ya de la
glutatión S-transferasa, un elemento de respuesta
xenobiótica único. La porción sensible al estrés redox del promotor
GST Ya es inducida intensamente por herbicidas electrófilos,
insecticidas e hidrocarburos aromáticos planos tales como
\beta-naftoflavona y
3-metilcolantreno [T. H. Rushmore et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 3826-3830
(1990)]. La secuencia de este gen se describe en T. H. Rushmore
et al., supra.
El oncogén JUN codifica c-jun que
participa en la formación del complejo AP-1, un
activador de la transcripción. Los estreses redox que activan al gen
JUN son los radicales superóxido y la radiación UVA. La secuencia de
este gen se describe en R. De Groot et al., EMBO J.,
10, pp. 2523-2532 (1991).
El gen ALDH 2 codifica la
aldehído-deshidrogenasa y es inducido por aldehídos
y proliferadores de peroxisomas [D. W. Nebert, Env. Health
Persp., 88, pp. 13-25 (1990)]. La secuencia de
ese gen se describe en L. C. Hsu et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 82, pp. 3771-3775 (1985).
El gen HMO codifica
hemo-oxigenasa. El promotor es inducido por los
siguientes estreses redox: estrés oxidativo, peróxido de hidrógeno y
arsenito sódico [S. T. Keyse y R. M. Tyrell, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 86, pp. 99-103 (1989)]. La secuencia
de este gen se describe en ese documento.
El XRE es un elemento de respuesta al estrés
redox. Responde a agentes xenobióticos tales como los hidrocarburos
aromáticos [T. H. Rushmore et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 87, pp. 3826-3830 (1990)]. La secuencia de
este elemento de respuesta se describe en ese documento.
NFkBRE es un elemento de respuesta al estrés
redox que codifica un factor de transcripción que es activado por
tioles intracelulares [R. Schreck et al., EMBO J., 10,
pp. 2247-2258 (1991); B. Nelson et al.,
Molec. Cell. Biol., 8, pp. 3526-3531 (1988)].
También responde a estrés de DNA. La secuencia de este elemento de
respuesta se describe en K. Leung y G. J. Nabel, Nature, 333,
pp. 776-778 (1988).
PPRE es el elemento de respuesta a la
proliferación de peroxisomas. Es un elemento que responde al estrés
redox que es inducido por proliferadores de peroxisomas [C. Dreyer
et al., Cell, 68, pp. 879-887 (1992)]. La
secuencia de este elemento de respuesta se describe en ese
documento.
RARE es el elemento de respuesta al ácido
retinoico. Es un elemento de respuesta sensible al estrés redox, que
responde a la hormona esteroide ácido retinoico y sus análogos [H.
de The et al., Nature, 343, pp. 177-180
(1990)].
ERE es el elemento de respuesta a estrógenos.
Responde al estrés redox que es inducido por compuestos estrógenos.
La secuencia de ERE se describe en V. Kumar et al., Cell, 55,
pp. 145-156 (1988).
ThRE es el elemento de respuesta a la hormona
tiroidea. Responde al estrés redox que es inducido por la hormona
tiroidea y sus análogos. La secuencia del ThRE se describe en M.
Beato, Cell, 56, pp. 335-344 (1989).
Otros promotores y elementos de respuesta que
responden al redox y pueden ser utilizados en los kits y métodos de
esta invención pueden ser elegidos entre los expuestos en la Tabla
2, más adelante. En la breve descripción de cada uno de estos genes
y elementos de respuesta que sigue, el documento que describe la
secuencia de DNA del gen concreto se indica entre corchetes.
UGT codifica una
UDP-glucuronosil-transferasa y su
respuesta redox es inducida por
3-metil-colantreno [T. Iyanagi et
al., J. Biol. Chem., 261, pp. 15607-14 (1986)].
CYP11B2 codifica un citocromo P450 cuya respuesta redox es inducida
por esteroides [T. Kawamoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89, pp. 1458-62 (1992)]. Cu.ZnSOD codifica
una superóxido-dismutasa que es inducida por la
formación de superóxidos catalizada por cobre y zinc [E. Danciger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp.
3619-23 (1986)]. El gen MnSOD codifica una
superóxido dismutasa que puede ser activada por el factor de
necrosis tumoral, interleuquina-2 y
lipopolisacáridos [M. K. St. Clair y J. C. Holland, Cancer
Res., 51, pp. 939-943 (1991)]. ADPRT codifica
una ribosil-transferasa y es inducido por estrés
oxidante. GP codifica glutatión-peroxidasa y su
respuesta redox es inducida por peróxidos [S. Chada,
Genomics, 6, pp. 268-71 (1990)]. FAOxasa
codifica (acilo graso)-CoA y es inducida por
proliferadores de peroxisomas [S. Miyazawa et al., J. Biol.
Chem., 262, pp. 8131-37 (1987)]. PBE codifica
una enzima bifuncional
peroxisomal-enoil-CoA-hidratasa/3-hidroxiacil-CoA-deshidrogenasa,
y es inducido por proliferadores de peroxisomas [J. K. Reddy et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp. 1747-51
(1986)]. PPAR codifica un receptor activado por proliferador de
peroxisomas y es inducido por proliferadores de peroxisomas [C.
Dreyer et al., Cell, 68, pp. 879-87 (1992)].
EH codifica una epóxido-hidrolasa que responde a
estrés redox causado por fenobarbital [R. K. Skoda et al., J.
Biol. Chem., 263, pp. 1549-54 (1988)]. CYP2B2
[J. S. Miles et al., Nucl. Acids Res., 16, pp.
5783-95 (1988)], CYP2E1 [J. E. Freeeman et al.,
Biochem. J., 28, pp. 689-95 (1992)] y CYP3A3
[N.K. Spurr et al., número de entrada GenBank X12387]
codifican tres diferentes citocromos P450s. Responden al estrés
redox provocado por fenobarbital (2B2), CCl_{4} (2E1) y
aflatoxina, ciclosporina, testosterona y nifedipina (3A3),
respectivamente. El gen P450b codifica el citocromo P450b, que es
inducido por fenobarbital [C. M. Giachelli et al., J. Biol.
Chem., 264, pp. 7046-7053 (1989)]. El gen P450d
codifica el citocromo P450d, que es inducido por hidrocarburos
aromáticos policíclicos, isosafrol y
3-amino-1-5H-pirido[4,3-b]indol
(Trp-P-2) [K. Sogawa et al., J.
Biol. Chem., 260, pp. 5026-5032 (1985)]. PPa
codifica una
poli(ADP-ribosa)-polimerasa y
tiene un componente sensible al estrés redox que responde a la
peroxidación de lípidos y al estrés oxidante [K. Uchida et al.,
Biochem. Biophys. Res. Comm., 148, pp. 617-622
(1987)]. PKC codifica la proteína-quinasa C y su
componente sensible al estrés redox es inducido por la peroxidación
de lípidos. ALDH1 codifica otra aldehído deshidrogenasa que es
inducida por aldehídos y proliferadores de peroxisomas [L. C. Hsu
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, pp.
3771-75 (1985)]. El gen NMO1 codifica la
NAD(P)H menadiona-oxidorreductasa y es
inducido por varios agentes xenobióticos incluyendo compuestos
aromáticos planos, colorantes azoicos y antioxidantes fenólicos [L.
V. Favreau y C. B. Pickett, J. Biol. Chem., 266, pp.
4556-4561 (1991)]. El gen GST2 codifica glutatión
S-transferasa-2 y responde a
estreses redox similares a los de GST Ya [P. G. Board et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp. 2377-81
(1987)]. El gen GAPDH codifica
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
[L. Ercolani et al., J. Biol. Chem., 263, pp.
15335-41 (1988)]. El gen NQO codifica
NAD(P)H quinona-oxidorreductasa y
responde a los mismos estreses redox que NMO [A. K. Jaiswal,
Biochemistry, 30, pp. 10647-53 (1991)].
Los promotores y elementos de respuesta que
responden a estrés de DNA que son útiles en los métodos y kits de
esta invención se eligen preferentemente entre los promotores de los
genes GST Ya, GADD45, JUN, FOS, XHF y GADD153, y los elementos de
respuesta TRE y p53RE.
El gen GST Ya se describió anteriormente. Su
componente sensible al estrés de DNA es inducido por DNA
alquilado.
El gen GADD45 codifica una proteína de detención
del crecimiento y que responde a los daños al DNA. El gen GADD45 es
inducido por la radiación UV, rayos X, y el agente de daños al DNA,
metanosulfonato de metilo (MMS). Este gen se describe en Q. Zhan
et al., Mol. Cell Biol., 13, pp. 4242-50
(1993).
\newpage
El gen JUN tienen un componente sensible al
estrés de DNA que es inducido por radiación UV, promotores tumorales
y factores de crecimiento.
El gen FOS codifica el oncogén
c-fos. Los componentes sensibles al estrés de DNA de
su promotor son inducidos por promotores tumorales y factores de
crecimiento [E. M. Haliday, EMBO J., 10, pp.
109-115 (1991)]. La secuencia de este gen se
describe en F. van Straaten et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 80, pp. 3183-3187 (1983).
El gen XHF codifica la colagenasa y es activado
por mitogénesis, agentes inflamatorios, radiación UV y también en
respuesta al promotor tumoral
12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato
(TPA). La secuencia de este gen se describe en P. Angel et al.,
Mol. Cell Biol., 7, pp. 2256-2266 (1987).
El gen GADD153 se expresa en respuesta a señales
de detención del crecimiento y agentes de daños al DNA [J. D. Luethy
y N. J. Holbrook, Cancer Res., pp. 5-10
(1992)]. La secuencia de este gen se describe en A.J. Fornace et
al., Mol. Cell Biol., 9, pp. 4196-4203
(1989).
TRE es el elemento de respuesta de TPA. Responde
al estrés de DNA inducido por ésteres de forbol. La secuencia de TRE
se describe en P. Angel et al., Cell, 55, pp.
875-85 (1988).
El p53RE es el elemento de respuesta de p53.
Responde al estrés de DNA y se induce por rayos X y MMS. La
secuencia del p53RE se describe en Q. Zahn et al., Mol. Cell
Biol., 13, pp. 4242-4250 (1993).
Otros promotores que responden al estrés de DNA y
son útiles en los métodos y kits de esta invención se exponen en la
Tabla 2, más adelante. En la breve descripción de cada uno de estos
genes que sigue, el documento que describe la secuencia de DNA del
gen en particular se indica entre corchetes.
El gen EGR-1 codifica un factor
de respuesta de crecimiento temprano y se induce por mitogénesis e
inhibidores de la fosfatasa [S. V. Suggs, Nucl. Acids Res.,
18, pp. 4283-89 (1990)]. El gen GAS 2,3 es un gen
que responde a la detención del crecimiento [C. Schneider et al.,
Cell, 54, pp. 787-793 (1988)]. El MGMT codifica
una
O-6-metilguanina-metiltransferasa
y se induce por DNA alquilado [K. Tano et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87, pp. 686-90 (1990)]. DNA Pol
codifica DNA polimerasa A y se induce por mitógenos. TK (que
codifica timidina-quinasa) [H. D. Bradshaw Jr. et
al., Mol. Cell Biol., 4, pp. 2316-20 (1984)],
DHFR (que codifica dihidrofolato-reductasa) [C.
Morandi, J. Mol. Biol., 156, pp. 583-607
(1982)] y PCNA (que codifica el antígeno nuclear de células
proliferantes) [D. Jaskulski et al., J. Biol. Chem., 263, pp.
10175-79 (1988)] se inducen cada uno de ellos por la
proliferación celular. PGHS codifica
prostaglandina-endoperoxidasa-sintetasa
y se induce por mitógenos [S.A. Kraemer et al., Arch. Biochem.
Biophys., 293, pp. 391-400 (1992)]. LOX codifica
una 5/12-lipoxigenasa y se activa por exposición al
factor de necrosis tumoral [P. A. Dixon et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85, pp. 416-20 (1988)]. ISG15, que es
un gen estimulado por interferón, se induce mediante á-interferón
[N. Reich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp.
6394-98 (1987)]. 2'-5' AS, que
codifica 2'-5' oligoadenilato sintetasa, se induce
por \beta-interferón [M. Walthelet et al.,
FEBS Lett., 196, pp. 113-20 (1986)]; EH, que
se discutió anteriormente, contiene un componentes sensible al
estrés de DNA que se activa por agentes carcinógenos. CYP2E1
contiene un elemento sensible al estrés de DNA que responde a la
dimetilnitrosoamina. TPO1 y TPO2 codifican topoisomerasas y se
inducen por roturas de la cadena de DNA y agentes que provocan
recombinación del promotor [P. D'arpa et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85, pp. 2543-47 (1988); M.
Tsai-Pflufelder et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 85, pp. 7177-81 (1988)]. PPa, que también
se discutió anteriormente, responde al estrés de DNA causado por
daños al DNA. DRA codifica HLA de clase II y es inducido por
interferón-gamma [A. J. Korman et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 79, pp. 6013-17 (1982); D.
A. Shackelford et al., Immunol. Rev., 66, pp.
133-187 (1982)]. El promotor MnSOD, que se describió
anteriormente, contiene también un elemento que responde al estrés
de DNA que se induce por el factor de necrosis tumoral. El gen
MDR-1 codifica una proteína que confiere resistencia
multi-fármacos y se induce principalmente por
fármacos citotóxicos hidrofóbos [J. A. Silverman et al.,
Gene, 106, pp. 229-236 (1991)]. El gen
beta-pol codifica la enzima de reparación del DNA,
DNA beta-polimerasa, y responde a
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG), hidrocloruro de mecloretamina (HN2), y
cis-platino(II) diamina dicloruro
(cis-Pt) [S. G. Widen et al., J. Biol. Chem.,
263, pp. 16992-98 (1988)]. El gen
estromelisina-1 codifica una proteína que se induce
por ésteres de forbol, tales como PMA [K. L. Sirum et al.,
Biochemistry, 28, pp. 8691-98 (1989)]. El gen
PCNA codifica al antígeno nuclear de células proliferantes, que se
induce por promotores tumorales [S. Travali et al., J. Biol.
Chem., 264, pp. 7466-72 (1989)].
Los promotores que responden al estrés de
proteínas, útiles en los métodos y kits de esta invención, se eligen
preferentemente entre GRP78, JUN, FOS, HSP70 y MTIIA.
El gen GPR78 codifica una proteína de 78 kDa que
es un importante componente del retículo endoplasmático. GRP78 se
induce por proteínas plegadas en falso y bloques de glicosilación
[S. K. Wooden et al., Mol. Cell Biol., 11, pp.
5612-23 (1991)]. La secuencia de este gen se
describe en E. Resendez et al., Moll. Cell Biol., 5, pp.
1212-19 (1985).
JUN y FOS, que se describieron anteriormente,
contienen elementos que responden al estrés de proteínas, que son
inducidos por el calor.
El gen HSP70 codifica la proteína de choque
térmico 70 y se induce por el calor, proteínas desnaturalizadas,
análogos de aminoácidos, metales pesados, anoxia e inhibidores del
metabolismo energético [D. D. Mosser et al., Moll. Cell
Biol., 8, pp. 4736-44 (1988)]. La secuencia de
este gen se describe en C. Hunt y R. I. Morimoto, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82, pp. 6455-59 (1985).
MT IIA, que codifica metalotionina IIA, se induce
por metales pesados y glucocorticoides [M. Karin et al.,
Nature, 299, pp. 797-802 (1982)]. La secuencia
de ese gen se describe en la referencia anterior.
Otros promotores que pueden ser empleados en los
kits y métodos de esta invención para detectar estrés de proteínas
pueden ser elegidos entre los promotores expuestos en la Tabla 2,
más adelante, que responden al estrés de proteínas. En la breve
descripción de cada uno de estos genes que sigue, el documento que
describe la secuencia de DNA del gen en particular viene indicado
entre corchetes.
MT 1A [R. I. Richards et al., Cell, 37,
pp. 262-72 (1984)] y MT III [R. D. Palmitter et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, pp. 6333-37
(1992)] codifican cada uno de ellos un gen de metalotioneína que es
inducido por el metal pesado cadmio. GP contiene un elemento que
responde al metal pesado selenio, que produce daños en las
proteínas.
Los promotores y elementos de respuesta
preferidos, que responden al estrés energético/iónico en los métodos
y kits de esta invención, son los promotores de los genes FOS y
GRP78 y el elemento de respuesta CRE.
FOS, que se describió anteriormente, contiene el
elemento de respuesta de cAMP ("CRE") [W. J. Roesler et al.,
J. Biol. Chem., 263, pp. 9063-9066 (1988)].
GRP78, que también se describió anteriormente,
contiene un elemento de respuesta al estrés energético/iónico, que
responde a ionóforos de calcio.
CRE es el elemento de respuesta de cAMP. Es un
elemento de respuesta sensible al estrés energético/iónico, que
responde al aumento de los niveles de cAMP [J. Roesler et al., J.
Biol. Chem., 263, pp. 9063-66 (1988)].
Otros promotores de estrés energético/iónico que
pueden ser empleados en los kits y métodos de esta invención se
exponen en la Tabla 2, más adelante. En la breve descripción de cada
uno de estos genes, que sigue, el documento que describe la
secuencia de DNA del gen en particular viene indicado entre
corchetes.
Dos genes del citocromo P450, CYP11B2 que se
induce por cAMP, y CYP2E1 que se induce por etanol, contienen
elementos de respuesta al estrés energético/iónico.
2'-5' AS contiene un elemento que responde al estrés
energético/iónico inducido por etanol. DBH, que codifica dopamina
\beta-hidrolasa [B. Grima, Nature, 326, pp.
707-11 (1987)] y TH, que codifica
tirosina-hidroxilasa [A. Lamouriux et al.,
EMBO J., 6, pp. 3921-37 (1987)] son inducidos
ambos por la despolarización de la membrana. ODC, que codifica
ornitina-descarboxilasa, se induce por choque
osmótico [N. J. Hickok et al., DNA, 6, pp.
179-87 (1987)]. G6PD codifica
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y
se induce por depleción del ATP. PKC contiene un elemento de
respuesta al estrés energético/iónico que se induce por agotamiento
de Na/K ATPasa. PVALB codifica parvalbúmina y se induce por iones
calcio [C. Lutum et al., GenBank nº de entrada X63070].
Estromelisina-1 contiene un elemento de respuesta al
estrés energético/iónico que se induce por ionóforos del calcio.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Dado que los elementos de respuesta pueden ser
aislados solamente a partir de los promotores que los contienen por
métodos de DNA recombinante, el uso de tales elementos en los kits y
métodos de esta invención está limitado a realizaciones que utilizan
construcciones promotor/gen heterólogo.
Para unir operativamente un elemento de respuesta
a un gen heterólogo, primero ha de ser ligado a un promotor mínimo.
Un promotor mínimo es uno que constitutivamente produce una
expresión básica de un gen unido operativamente al mismo. Promotores
mínimos preferidos son el promotor mínimo SV40, el promotor mínimo
TK o el promotor mínimo \beta-interferón. Estos
promotores mínimos son bien conocidos en la técnica. Esta
construcción promotor mínimo/elemento de respuesta se une después
operativamente al gen heterólogo por métodos de DNA recombinante
bien conocidos.
Muchos de los promotores anteriormente descritos,
o equivalentes funcionales de los mismos, están presentes en otros
eucariotas tales como nemátodos, levaduras, insectos, reptiles,
anfibios y plantas.
Por ejemplo, la levadura contiene un gen de la
metalotioneína, CUP, que responde al estrés de proteína inducido por
exposición a metales pesados [T. R. Butt et al., Gene,
27, pp. 23-33 (1984), T. R. Butt et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 3332-36
(1984)]. La levadura contiene también equivalentes de los genes
HSP70 y GRP 78 [E. A. Craig, en Stress Proteins In Biology And
Medicine, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, Nueva York, pp. 301-21 (1990); W. R.
Boorstein et al., J. Biol. Chem., 265, pp.
18912-21 (1990); y M. D. Rose et al., Cell,
57, pp. 1211-21 (1990)]. También han sido
secuenciadas alcohol-deshidrogenasas, una familia de
genes de levadura que son inducidos por alcohol, un estrés
energético/iónico [T. Young et al., Basic Life Sci.,
19, pp. 335-361 (1982)].
También han sido identificados y secuenciados en
levadura un gran número de genes de estrés de DNA. Estos incluyen
MAG, la metiladenina DNA glicosilasa, y MFT1, que responden al daño
por alquilación de DNA [W. Xiao et al., Mol. Cell
Biol., 13, pp. 7213-21 (1993)]; RAD51, RAD54,
RAD6, RAD23, RAD2, RAD18 y RAD7, todos los cuales responden a
roturas de la cadena de DNA [G. Basile et al., Mol. Cell
Biol., 12, pp. 3235-46 (1992); G. M. Cole et
al., Mol. Cell Biol., 9, pp. 3314-3326
(1989); K. Madura et al., Nucleic Acids Res., 18, pp.
771-78 (1990); Nucleic Acids Res., 18, pp.
4737-42 (1990); K. Madura et al., J.
Bacteriol., 166, pp. 914-23 (1990); J. S. Jones
et al., Nucleic Acids Res., 19, pp.
893-98 (1991); J. S. Jones et al., Nucleic
Acids Res., 18, pp. 3281-85 (1990)]; PHR1 que se
induce por agentes de daños del DNA [J. B. Sebastion et al.,
Mol. Cell Biol., 10, pp. 4630-37 (1990)];
RNR2 y RNR3, las ribonucleótido reductasas de levadura, que se
inducen por daño del DNA [S. J. Elledge et al., Mol. Cell
Biol., 9, pp. 5373-86 (1989); S. J. Elledge
et al., Gene Dev., 4, pp. 740-51
(1990); Z. Zhou et al., Genetics, 131, pp.
851-66 (1992)]; CDC9, la DNA ligasa de levadura [T.
A. Peterson et al., Mol. Cell Biol., 5, pp.
226-35 (1985)]; UBI4, otro gen que responde a daños
del DNA [J. M. Treger et al., Mol. Cell Biol., 8, pp.
1132-36 (1988)]; y DDR48, un gen que responde a
mutágenos [J. M. Treger et al., Mol. Cell Biol., 10,
pp. 3174-84 (1990)]. Además, también se han
identificado en levaduras otros genes de estrés de DNA [G. W.
Robinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp.
1842-46 (1986); S. W. Ruby et al., Mol.
Cell Biol., 5, pp. 75-84 (1985); E. C.
Friedberg, Microbiol. Rev., 52, pp. 70-102
(1988); T. McClanahan et al., Mol. Cell Biol., 4, pp.
2356-2363 (1984)].
La combinación apropiada de cualquiera o de todos
estos promotores, así como otros promotores de estrés de levaduras
conocidos, puede ser utilizada en los métodos y kits de esta
invención. Se entenderá que si se emplean promotores de estrés de
levadura, se prefieren hospedadores de levadura y han de
desarrollarse bajo condiciones apropiadas para tal hospedador. Tales
condiciones son bien conocidas en la técnica.
Los kits de diagnóstico y métodos de esta
invención se basan en la inducción de promotores de estrés
específicos o elementos de respuesta al estrés y la transcripción
y/o traducción de un gen unido operativamente a los mismos.
Para realizaciones de la invención que emplean un
gen heterólogo unido operativamente a un promotor de estrés o
elemento de respuesta de mamíferos, la elección del gen es
esencialmente ilimitada. Los únicos parámetros que se requieren son
(1) que se haya caracterizado una secuencia de DNA que codifica el
producto ensayable; y (2) que el producto del gen pueda ser
detectado. La suficiente caracterización incluye el conocimiento de
la secuencia de codificación completa, la disponibilidad de un clon
genómico o el conocimiento de un suficiente número de sitios de
restricción dentro de la secuencia de DNA genómico para permitir que
el gen sea manipulado para crear una unión operativa con el promotor
de estrés.
Los promotores de la mayor parte de los genes de
estrés de mamíferos son inducibles por más de un tipo de estrés.
Esto es porque tales promotores contienen dentro de su secuencia un
número de elementos de respuesta al estrés, cada uno de los cuales
responde a un tipo de estrés diferente. En realizaciones que
utilizan tales promotores de estreses múltiples, es esencial usar
también otro promotor que responda a solamente uno de los múltiples
estreses. Esto es cierto tanto si se usan sistemas nativos
promotor-gen como si se usan fusiones de promotor
recombinante-gen ensayable. Por ejemplo, el promotor
HMO y el promotor JUN son inducidos tanto por peróxidos como por
rayos UVA. Así, estos promotores responden al estrés redox y al
estrés de DNA. Un promotor NMO1, que responde solamente al estrés
oxidante, puede ser usado junto con un promotor HMO o JUN. Esta
combinación de promotores permite determinar si la inducción del
promotor de estrés múltiple fue debida a estrés redox o a luz UV. De
esta manera, la naturaleza del estrés causado por un compuesto puede
ser determinada con mayor precisión.
De acuerdo con otra realización de esta
invención, pueden aislarse elementos de respuesta individuales de un
promotor y unirse después operativamente a un promotor mínimo de
mamífero y a un gen que codifica un producto detectable. Así, la
expresión del producto detectable en presencia de un compuesto está
correlacionada con solamente un tipo particular de estrés.
En realizaciones que emplean un gen que codifica
un producto detectable, el producto ensayable es preferentemente
\beta-galactosidasa (codificada por el gen lacZ),
cloranfenicol-acetil-transferasa
(codificada por el gen CAT), galactosa-quinasa
(codificada por el gen galK), \beta-glucosidasa
(codificada por el gen gus), glutatión-transferasa,
hormona de crecimiento humana (codificada por el gen hGH) o
luciferasa de la luciérnaga (codificada por el gen lux). Lo más
preferentemente, se emplea el gen CAT.
Las fusiones de promotor de
estrés-producto ensayable alojadas por los
hospedadores empleados en algunos de los kits de diagnóstico y
métodos de esta invención, pueden prepararse usando técnicas
estándar de DNA recombinante que son bien conocidas en la técnica.
La elección de técnicas depende de lo que se sepa acerca del
promotor de estrés en particular que se va a usar.
Si un fragmento genómico que contiene un promotor
de estrés y su gen han sido aislados o clonados en un vector, el
promotor se retira por digestión con enzimas de restricción
apropiadas. Después se aísla el fragmento del promotor y se une
operativamente a un gen que codifica un producto ensayable en un
plásmido. El vector debe contener también un marcador, tal como Neo,
para identificar transfectantes estables. El cribado de una fusión
funcional se consigue exponiendo los transfectantes a un estrés que
se sabe que induce al promotor de estrés específico, y ensayando el
producto génico detectable.
Si se conoce la secuencia de nucleótidos del
promotor de estrés y su gen, puede emplearse la tecnología de la
reacción en cadena de polimerasa para producir fusiones de proteínas
ensayables. Específicamente, se sintetizan cebadores que son
complementarios a los extremos 5' y 3' de la porción de promotor de
estrés del gen, se hibridan esos cebadores con el DNA de mamífero
completo desnaturalizado, bajo condiciones apropiadas, y se realiza
la PCR. De esta manera pueden obtenerse cantidades clonables de
cualquier promotor de estrés secuenciado. Una vez que se ha obtenido
el DNA del promotor de estrés, se une operativamente a un DNA que
codifica una proteína ensayable en un vector apropiado, como se
describió antes. Tales métodos son bien conocidos en la técnica.
La construcción de fusiones operables de
elementos de respuesta al promotor de estrés con un gen que codifica
un producto detectable se lleva a cabo también mediante técnicas
estándar de DNA recombinante. Dado que los elementos de respuesta
son pequeños, el DNA que los codifica puede ser producido usando un
sintetizador de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos
correspondientes a las dos cadenas del elemento de respuesta se
sintetizan, se reasocian y se clonan en un plásmido que contiene un
gen reportero bajo control de un promotor mínimo. Alternativamente,
se puede dejar que se multimericen los oligonucleótidos bicatenarios
mediante autoligación, antes de la inserción en un vector. Las
múltiples copias del elemento de respuesta permiten una expresión
superior del producto detectable al inducir el estrés.
Las realizaciones de la presente invención que
emplean genes de estrés nativos como genes que codifican un producto
ensayable, no requieren manipulación genética antes de ensayar la
toxicidad.
La elección de la línea celular a usar en los
kits y métodos de esta invención depende del ensayo a usar para
determinar la toxicidad. Para aquellas realizaciones que utilizan
fusiones de promotor de estrés-gen de producto
ensayable, las células han de ser capaces de producir el producto de
expresión en forma ensayable. Además, esas células no deben producir
constitutivamente el producto ensayable a partir de otra copia del
gen en su genoma.
Para realizaciones que utilizan los genes de
estrés nativos de la célula, la elección de las células se basa en
la capacidad de esos genes para ser inducidos por el estrés. Las
células preferidas para realizaciones que no emplean promotores de
estrés mediados por receptores de la superficie de la célula son
HeLa, HepG2 y WIL-2. Para los kits y métodos que sí
emplean promotores de estrés mediados por receptores de la
superficie de la célula, la línea celular preferida es una línea
derivada del órgano de que se trate. Por ejemplo, si los kits y
métodos de estrés están destinados a identificar compuestos que
afectan a la piel, se prefiere una línea celular de queratinocitos o
fibroblastos de la piel, tal como SCC12 o sus derivados, tales como
C6C1. Para kits y métodos cuyo objetivo es identificar toxinas para
los ojos, lo más preferido es una línea celular córnea.
Cuando se utilizan fusiones de promotor de
estrés-producto ensayable, es preferible que cada
hospedador empleado en los kits y métodos de esta invención albergue
solamente una de tales fusiones. De esta manera, si un compuesto
induce la expresión del producto génico ensayable en cualquier
célula hospedadora en particular, puede identificarse
inequívocamente el tipo específico de estrés causado por el
compuesto.
Es sabido que algunos compuestos no son tóxicos
para los mamíferos en su forma nativa, pero se vuelven tóxicos
después de ser procesados por el hígado. Por consiguiente, de
acuerdo con otra realización de esta invención, el compuesto que va
a ser ensayado en los métodos y kits de esta invención es pretratado
con un extracto hepático S9. Los métodos para preparar un extracto
hepático S9 ("S9") se describen en S. Vennitt et al., en
Mutagenicity Testing - A Practical Approach, S. Vennitt et
al., ed., IRL Press, Oxford, Inglaterra, pp.
52-57 (1984). Generalmente, S9 es un homogeneizado
crudo de hígado de rata con partículas insolubles eliminadas
mediante centrifugación a baja velocidad, pero también puede
prepararse a partir de hígado humano o de otro mamífero. S9 se
incuba con el compuesto de ensayo en un tampón de potasio que
contiene NAD(P)H para imitar la biotransformación en
estadio I y estadio II de compuestos, realizada normalmente por el
hígado del mamífero, antes de realizar el ensayo de toxicidad. No
obstante, si se utilizan células de hígado de mamífero primarias en
los kits y métodos de esta invención, es innecesario el
pretratamiento con S9. Las células serán capaces de realizar la
biotransformación de estadio I y II de los compuestos, bajo las
condiciones de crecimiento del ensayo.
Alternativamente, las células utilizadas en los
kits y métodos de esta invención son co-cultivadas
con células capaces de realizar la biotransformación de estadio I y
II, preferentemente una línea celular hepática primaria. La
biotransformación del compuesto que se está ensayando es realizada,
en este caso, por esas otras células en vez de serlo por fracciones
enzimáticas derivadas de células hepáticas.
Antes de llevar a cabo un ensayo de un compuesto
de toxicidad desconocida usando los métodos y kits de esta
invención, han de obtenerse curvas de calibrado utilizando al menos
uno, y preferentemente al menos tres, compuestos que se sabe que
inducen cada promotor de estrés o elemento de respuesta específicos
que van a ser utilizados para cribar el compuesto desconocido.
Cada compuesto químico conocido debe ser ensayado
más preferentemente frente a todos los promotores, no sólo frente al
promotor que se sabe que induce. Y cada producto químico debe ser
ensayado en un margen de concentraciones suficientemente amplio para
proporcionar una curva de calibrado útil, preferentemente de 1
picomolar a 1 milimolar, así como para varios valores del
tiempo.
Una vez obtenidas las curvas de calibrado, se
genera una base de datos de ordenador que contiene dichas curvas.
Esta base de datos se usa después para comparar los perfiles
promotor de estrés-inducción de los compuestos a
ensayar con los de las toxinas conocidas usadas para obtener la
curva de calibrado. Así, los resultados para cualquier compuesto no
ensayado se expresan en términos de toxicidad relativa, comparada
con inductores de promotores de estrés conocidos.
Cada uno de los métodos de caracterización y
determinación de la toxicidad de esta invención comprende la primera
etapa de cultivar las células antes y después de la exposición a un
compuesto tóxico potencial. Las condiciones de cultivo variarán
dependiendo del tipo de célula utilizado. Lo más preferentemente, se
usan células hepáticas humanas inmortalizadas (HepG2). El desarrollo
de esas células se realiza bajo condiciones estándar de cultivo de
tejidos (medio mínimo esencial a 37ºC, 5% de CO_{2}). Las células
se desarrollan rutinariamente en matraces de 165 cm^{3} hasta que
llegan a una densidad de aproximadamente 5 x 10^{6}
células/mL.
Después de este desarrollo inicial, las células
son subcultivadas y expuestas al compuesto a ensayar. Un ensayo
típico emplea aproximadamente 2,75 x 10^{5} células/mL. Para los
ensayos iniciales de un compuesto, debe usarse una serie de
diluciones sucesivas 1:10 del compuesto. También debe prepararse
otra serie de diluciones del compuesto, que han sido
pre-incubadas con fracción S9, y añadirlas a una
segunda porción de cada cultivo. Una tercera porción de cada
cultivo, que sirve de testigo, no se expone al compuesto pero se la
trata de la misma manera que se describió antes.
Después se dejan todos los cultivos incubando a
la temperatura de crecimiento normal durante un periodo de tiempo
que oscila entre 5 minutos y 48 horas. Más preferentemente, la
exposición al compuesto tóxico o de ensayo es durante
aproximadamente 2 a 32 horas. Después de la exposición al compuesto
de ensayo, se mide el nivel de producto ensayable o los mRNA del gen
de estrés.
Si se emplea la realización que mide producto
ensayable, la determinación cuantitativa puede llevarse a cabo de
varias formas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, puede
utilizarse un sustrato colorimétrico si el producto de expresión es
una enzima. En la técnica son bien conocidos sustratos
colorimétricos apropiados para enzimas específicas.
Alternativamente, para detectar el producto de la expresión puede
usarse un ensayo que emplea anticuerpos específicos, tal como un RIA
o ELISA.
Dependiendo de la naturaleza del ensayo usado,
puede ser necesario ajustar las condiciones de tampón del cultivo
lisado o el sobrenadante. En consecuencia, puede añadirse tampón
adecuado al cultivo lisado o sobrenadante de forma que se obtengan
las condiciones óptimas para el ensayo en particular. Por ejemplo,
si el producto ensayable se va a detectar mediante un ensayo RIA o
ELISA, las condiciones del tampón han de ajustarse a un pH neutro
para permitir la máxima formación de complejo
anticuerpo-antígeno y para minimizar la unión de
anticuerpo no específica. Tales condiciones son bien conocidas en la
técnica y se ejemplifican mediante una condición de tampón final de
tampón de fosfato 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0. Si el producto
ensayable es una enzima y la detección se va a realizar mediante un
ensayo colorimétrico del sustrato, las condiciones del tampón han de
optimizarse para la máxima actividad enzimática y la mínima
segmentación no catalítica del sustrato. Estas condiciones son
convencionales y varían dependiendo de la enzima a ensayar.
En la realización más preferida de este aspecto
de la invención, el producto detectable es
cloranfenicol-acetil-transferasa
(CAT). Los ensayos para esta enzima son bien conocidos en la técnica
y se describen en J. Sambrook et al., "Molecular Cloning -
A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor
Laboratory Press, pp. 16.60-16.65 (1989). Esa
referencia describe también ensayos para
\beta-galactosidasa, otro producto ensayable útil
en los métodos y kits de esta invención (pp.
16.66-16.67).
En realizaciones que utilizan el nivel de
transcripción para determinar la inducción del gen de estrés, ha de
medirse el nivel de mRNA transcrito de genes operativamente unidos a
lo promotores de estrés utilizados en los kits y métodos de esta
invención ("mRNA del gen de estrés"). Esto requiere aislar el
RNA total o el mRNA de las células expuestas. Esto puede conseguirse
por cualquiera de las numerosas y bien conocidas tecnologías
existentes. También pueden utilizarse kits de aislamiento de mRNA o
RNA total disponibles comercialmente, tales como los que están
disponibles de Stratagene (La Jolla, CA). Preferentemente las
células son lisadas con isotiocianato de guanidinio (GTC). Después
se acidifica el lisado con tampón de acetato sódico (pH 5,2) y se
extraen los contaminantes con fenol. Después se precipita dos veces
el RNA con etanol, se seca y se redisuelve en agua.
Una vez que ha sido aislado el RNA, puede medirse
el nivel de mRNA de los genes de estrés de diversas formas, bien sea
directamente o indirectamente. En el método directo, se usan
oligonucleótidos que son complementarios al mRNA del gen de estrés.
En este método, el mRNA aislado de las células se aplica a papel de
nitrocelulosa o filtro de membrana de nilón en un aparato de mancha
en ranura. Después de diluir el RNA en el aparato con una solución
salina apropiada (preferentemente dos volúmenes de 20X SSC) y lavar
las ranuras, el papel de nitrocelulosa o filtro se cuece a 80ºC
durante 2 horas en una estufa bajo vacío, o bien se reticula por UV
para fijar el RNA. El RNA fijado a la nitrocelulosa se hibrida
después con sondas marcadas de oligonucleótidos que son
complementarias a los mRNA del gen de estrés, bajo las condiciones
de tampón y temperatura apropiadas.
Un método indirecto utiliza oligonucleótidos que
son homólogos a los mRNA del gen de estrés para la detección. Este
método mide la transcripción usando los mRNA del gen de estrés como
moldes para preparar cDNA monocatenario marcado, usando trancripción
inversa. Estos cDNA son después detectados y determinados
cuantitativamente por hibridación con oligonucleótidos
complementarios (o cDNA bicatenarios desnaturalizados) que están
unidos a un soporte sólido. Preferentemente, el soporte sólido es
una membrana cargada negativamente y los oligonucleótidos son
modificados por adicificación de un grupo amino o amidita cargada
positivamente en el extremo 3' antes de la unión a la membrana. Esta
modificación 3' permite al oligonucleótido unirse a la membrana
solamente a través de su extremo 3', permitiendo una hibridación más
eficaz que otros métodos de unión de DNA a un soporte sólido.
En cualquiera de los métodos, se usa también un
testigo que representa un "gen organizador (housekeeping
gene)" expresado constitutivamente, tal como
\beta-globina, \beta-tubulina,
\beta-actina o \gamma-actina,
que no es inducido por la muestra experimental específica. Esto
proporciona un testigo para el apropiado crecimiento y
funcionamiento de las células, así como el patrón de base sobre el
cual calcular la cantidad de inducción específica. Después de la
hibridación, se determina cuantitativamente la cantidad de
hibridación. La determinación cuantitativa se consigue por un método
que es consistente con el marcador en el oligonucleótido o cDNA. Si
se usa como marcador un isótopo radiactivo, los métodos de
determinación cuantitativa preferidos serían la exposición de la
membrana a película de rayos X, seguida por trazado de densitometría
o recuento de centelleo de líquido. Si se usa un marcador
fluorescente, se emplea un fluorómetro para la determinación
cuantitativa. De esta manera puede medirse el nivel de inducciones
de varios genes de estrés. Si se usa un marcador biotinilado, la
determinación cuantitativa se realiza usando estreptavidina
conjugada con una enzima que puede dar un producto colorimétrico
medible.
Se sabe que, aunque compuestos individuales
pueden no ser tóxicos, las combinaciones de compuestos no tóxicos sí
pueden ser tóxicas. Por consiguiente, se ha de entender que los kits
y métodos de esta invención pueden ser utilizados también para
determinar la toxicidad potencial de combinaciones de compuestos
conocidos y desconocidos (p. ej. interacciones de fármacos) de una
manera idéntica a la descrita anteriormente.
Finalmente, esta invención proporciona un método
para mejorar el diseño de fármaco activo. De acuerdo con esta
realización, un nuevo fármaco se ensaya primeramente con cualquiera
de los kits y métodos anteriormente descritos, y se determina su
toxicidad. La información proporcionada por tales métodos y kits
indica el mecanismo celular de la toxicidad del fármaco. La porción
de fármaco que presumiblemente produce el daño celular indicado en
concreto puede ser entonces modificada apropiadamente o eliminada,
dependiendo del papel que desempeñe esa porción en la actividad
farmacéutica del fármaco. El fármaco modificado resultante se vuelve
entonces a ensayar con los kits y métodos de esta invención para
determinar si su toxicidad ha sido reducida lo suficiente o
eliminada.
Para una mejor comprensión de la invención
descrita en el presente texto, se exponen los ejemplos que siguen.
Se ha de entender que estos ejemplos tienen solamente carácter
ilustrativo y en modo alguno han de ser considerados limitantes de
esta invención.
Algunas de las técnicas básicas de biología
molecular descritas a continuación no se exponen con detalle. Tales
técnicas son bien conocidas en este campo y se describen en
Molecular Cloning - A Laboratory Manual Second Edition, J.
Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Nueva York (1989).
La secuencia de nucleótidos de cada uno de los
genes de estrés descritos en el presente texto es conocida. En
consecuencia, el diseño de oligonucleótidos específicos es
simplemente cuestión de elegir la porción del gen a modelar. El
programa de ordenador OLIGO permite introducir la secuencia de
nucleótidos del gen que interesa y analizar la secuencia para
determinar la posición, longitud y composición de los
oligonucleótidos que se hibridan con la secuencia que interesa, a
concentraciones salinas y temperaturas seleccionadas por el usuario.
Usando este programa, se han diseñado los siguientes
oligonucleótidos complementarios específicos del gen de estrés para
ser usados en los kits y métodos de esta invención:
\vskip1.000000\baselineskip
Gen GADD 153: [SEO ID NO. 1]
\hskip0.5cm5'-AAAAAAACCCAGTCCAACTA
CAGACATGGCAGCTGAGTCCCTGCCATTCACCTTGGAGACGGTGTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen XHF1: [SEO ID NO. 2]
\hskip0.5cm5'-AAAAAAGGCCAGTATGCACAGC
TTTCCTCCACTGCTGCTGCTGCTGTTCTGGGGTGTGGTGTCTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen JUN: [SEO ID NO. 3]
\hskip0.5cm5'-AAAAAACCCCAAGATCCT
GAAACAGAGCATGACCCTGAACCTGGCCGACCCAGTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen MnSOD: [SEO ID NO. 4]
\hskip0.5cm5'-AAAAAACAACCTGAAC
GTCAACGAGGAGAAGTACCAGGAGGCGTTGGCCAAGGGAGATTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen HMO: [SEQ ID NO. 5]
\hskip0.5cm5'-AAAAAATAGAGCGTCCGCA
ACCCGACAGCATGCCCCAGGATTTGTCAGAGGCCCTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen GST Ya: [SEO ID NO. 6]
\hskip0.5cm5'-AAAAAAGGAGTTGGGAGCTG
AGTGGAGAAGAAGCCACGACTCTCGCTAGGTCAGTACTCTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen HSP7O: [SEO ID NO. 7]
\hskip0.5cm5'-AAAAAAGCCGCGGCAGTCG
GCATCGACCTGGGCACCACCTACTCCTGCGTGGGGGTGTTCCAATTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen MDR-1: [SEQ ID NO. 8]
\hskip0.5cm5'-AAAAAAATTACAGCAAGCC
TGGAACCTATAGCCCCTTTAACTTGAGCAGCATCATTTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen CYP 1A1: [SEQ ID NO. 9]
\hskip0.5cm5'-AAAAAACATTCAGGGAAGG
GTTGGGTAGGTAGCGAAGAATAGGGATGAAGTCAGCTTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen FOS: [SEQ ID NO. 10]
\hskip0.5cm5'-AAAAAAATGCTGGAGAAGG
AGTCTGCGGGTGAGTGGTAGTAAGAGAGGCTATCCCCTTTTTT-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Gen NMO1: [SEO ID NO. 11]
\hskip0.5cm5'-AAAAAAGGAATCTCATTTT
CTAGCTTTGATCTGGTTGTCAGTTGGGATGGACTTGCTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen ALDH2: [SEQ ID NO. 12]
\hskip0.5cm5'-AAAAAACCTCTTGCTTCCC
CGTGTTGATGTAGCCGAGGATCTTCTTAAACTGAGTTTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen DRA: [SEQ ID NO. 13]
\hskip0.5cm5'-AAAAAACAGTGGTCAATGTCA
CGTGGCTTCGAAATGGAAAACCTGTCACCACAGGATTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen MGMT: [SEO ID NO. 14]
\hskip0.5cm5'-AAAAAAGGATTGTGAAATG -3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen 2'-5' AS: [SEQ ID NO. 15]
\hskip0.5cm5'-AAAAAATTCTTACAATTTT
GGTACCAGTGCTTGACTAGGCGGATGAGGCTCTTGAGTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen DHFR: [SEQ ID NO. 16]
\hskip0.5cm5'-AAAAAAAGTCTTGCATGATCCTT
GTCACAAATAGTTTAAGATGGCCTGGGTGATTCTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen Cu.ZnSOD: [SEQ ID NO. 17]
\hskip0.5cm5'-AAAAAACCAGCACCCCGTCT
CCGCGACTACTTTATAGGCCAGACCTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen ALDHA1: [SEQ ID NO. 18]
\hskip0.5cm5'-AAAAAAAACCGTACTCTCC
CAGTTCTCTTCCATTTCCAGACATCTTGAATCCACCATTTTTT-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Gen TK: [SEQ ID NO. 19]
\hskip0.5cm5'-AAAAAAGAGTGTCTTTGGC
ATACTTGATCACCAGGCACTTGTACTGAGCAATCTGGTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen PVALB: [SEQ ID NO. 20]
\hskip0.5cm5'-CACCTTCTTC
ACATCATCCGCACTCTTTTTCTTCAGGCCGACCATTTTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen TH: [SEQ ID NO. 21]
\hskip0.5cm5'-AA.A.AAAGAAGCTCTCAGACAC
GAAGTAGACTGACTGGTACGTCTGGTCTTGGTAGGTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen EH: [SEQ ID NO. 22]
\hskip0.5cm5'-AAAAAATCTAGAATATAGG
CAGCCAGACCCACAGGAGAGTCATTCAGAGCAGAGCCTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen TOP1: [SEQ ID NO. 23]
\hskip0.5cm5'-AAAAAAGATAGCGCTCTTCTTC
CCACCATTTCCACTTCTGTTCCTCTTCTTTCTTCTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen TOP2: [SEQ ID NO. 24]
\hskip0.5cm5'-AAAAAAGCCTCTGCCAGTTTTTCTT
CAGTCATCTTCACAACAAATTTCACAGTGGTTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen MT 1A: [SEQ ID NO. 25]
\hskip0.5cm5'-AAAAAATCTCTTCCTTGCAG
GTGGCTCCTGCACCTGCACTGGCTCCTGCAAATGCAAAGAGTTTTTT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de los anteriores oligonucleótidos se
realizó como sigue. El oligonucleótido específico se sintetizó
usando un sintetizador de oligonucleótidos automático [Modelo 392,
Applied Biosystems, Foster City, CA].
También se han diseñado los siguientes
oligonucleótidos, que son homólogos de los mRNA del gen de estrés
indicado, basándose en la secuencia publicada de nucleótidos de los
diversos genes o los cDNA de los mismos:
\vskip1.000000\baselineskip
Gen ALDH1: [SEQ ID NO. 26]
\hskip0.5cm5'-AATTGCTATGGCGTGGTAAGTG
CCCAGTGCCCCTTTGGTGGATTCAAGAT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen CYP1A1: [SEQ ID NO. 27]
\hskip0.5cm5'-ATCTGAGTTCCTACCTGAACGGT
TTCTCACCCCTGATGGTGCTATCGACA-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen FOS: [SEQ ID NO. 28]
\hskip0.5cm5'-GTACTCCCAGCTGCACTGCT
TACACGTCTTCCTTCGTCTTCACCT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen GADD153: [SEQ ID NO. 29]
\hskip0.5cm5'-AGGAGAATGAAAGGAAAGTGGC
ACAGCTAGCTGAAGAGAATGAACGGCTC-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen GADD45: [SEQ ID NO. 30]
\hskip0.5cm5'-AGTCGCTACATGGATCAATGGGT
TCCAGTGATTAATCTCCCTGAACGGTG-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen GAPDH: [SEQ ID NO. 31]
\hskip0.5cm5'-GTGGTGGACCTGACCTGCCGTCT
AGAAAAACCTGCCAAATATGATGACAT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen GST2: [SEQ ID NO. 32]
\hskip0.5cm5'-CAGCCCAAGGAAGCCTCCCATGG
ATGAGAAATCTTTAGAAGAAGCAAGGA-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen HMO: [SEQ ID NO. 33]
\hskip0.5cm5'-CTTACACTCAGCTTTCTGGTGGCG
ACAGTTGCTGTAGGGCTTTA-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen HSP70: [SEQ ID NO. 34]
\hskip0.5cm5'-AGAAGGACGAGTTTGAGCACAAG
AGGAAGGAGCTGGAGCAGGTGT-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen JUN: [SEQ ID NO. 35]
\hskip0.5cm5'-GCTCAGGGAACAGGTGGCACAGC
TTAAACAGAAAGTCATGAACCACGTTA-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen MDR1: [SEQ ID NO. 36]
\hskip0.5cm5'-GAAAGGCATCTATTTTTCAATGGT
CAGTGTCCAGGCTGGAACAAAGCGCC-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen MT1A: [SEQ ID NO. 37]
\hskip0.5cm5'-GCACTGGCTCCTGCAAATGCAAA
GAGTGCAAATGCAACTCCTGCAAG-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen MTIIA: [SEQ ID NO. 38]
\hskip0.5cm5'-CCCAGGGCTGCATCTGCAAAG
GGGCGTCGGACAAG-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen NMO: [SEQ ID NO. 39]
\hskip0.5cm5'-ACCACTGTATTTTGCTCCAAGCAGC
CTCTTTGACCTAAACTTCCAGGCAG-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen PCNA: [SEQ ID NO. 40]
\hskip0.5cm5'-ACAAAAGCCACTCCACTCTCTTCA
ACGGTGACACTCAGTATGTCTGCAGA-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen NQO: [SEQ ID NO. 41]
\hskip0.5cm5'-TTGCTCTCGACAGTATCCACAAT
AGCTGACGGCTGGGTGTTTCAGTTTGA-3';
\vskip1.000000\baselineskip
También se han diseñado los siguientes
oligonucleótidos de control que son homólogos a transcritos de gen
organizador:
\vskip1.000000\baselineskip
Gen ACTG (gamma-actina): [SEO ID
NO. 42]
\hskip0.5cm5'-ACCTTCCAGCA
GATGTGGATTAGCAAGCAGGAGTACGACGAGTCG-3';
\vskip1.000000\baselineskip
Gen ETUB (beta-tubulina): [SEQ ID
NO. 43]
\hskip0.5cm5'-TTGAGTGG
ATCCCCAACAATGTGAAAACGGCTGTCTGTGACATCCCACCT-3';
Estos oligonucleótidos fueron modificados cada
uno de ellos en su extremo 3' mediante la adición de un grupo amino,
de forma que pudiesen unirse a una membrana cargada negativamente
solamente a través de su extremo 3'. Tales oligonucleótidos fueron
sintetizados por encargo por Operon Technologies, Inc., Alameda,
CA.
Del mismo modo pueden diseñarse sondas de
oligonucleótidos complementarios y homólogos para cualquiera de los
otros mRNA de genes de estrés que pueden ser empleados en esta
invención, usando el programa informático descrito
anteriormente.
(Ejemplo de
referencia)
Se desea saber si el compuesto desconocido
"X" es tóxico y, si lo es, qué tipo de daños produce en las
células de mamíferos.
Se desarrollan células HepG2 en frascos de 165
cm^{3} que contienen medio esencial mínimo (Gibco/BRL,
Gaithersburg, MD) hasta que llegan a una densidad de aproximadamente
8 x 10^{6} células/mL. Las células son después subcultivadas
diluyéndolas a 5 x 10^{6} células/mL y puestas en placa a razón de
10 mL/placa. Varias placas de cada subcultivo se exponen a una
concentración diferente de compuesto X (1 pM a 1 mM, en una serie de
diluciones 1 a 10). El RNA mensajero se aísla de los subcultivos al
cabo de 2, 4, 8, 16 y 32 horas, como se describe más adelante.
Se retira el medio de las monocapas de células
mediante aspiración, y las células se lavan dos veces con solución
salina fría tamponada con fosfato. Después se añaden 2 mL de
solución salina fría tamponada con fosfato a la monocapa y se usa
una varilla de vidrio con punta de goma para raspar el lisado a
tubos de polipropileno desechables de 15 mL. El RNA total se aisló
usando reactivo RNAzol B (Biotecx Laboratories, Houston, TX),
siguiendo las instrucciones del fabricante. El sedimento de RNA se
seca y se redisuelve en 10 \muL de agua. Un rendimiento de RNA
normal es aproximadamente 100-200 \mug por
placa.
Después el RNA de cada dos placas de replicado se
aplica a 20 ranuras diferentes en un aparato de mancha en ranura
(slot blot) como sigue. Antes de usarlo, el aparato de mancha
en ranura se limpia en NaOH 0,1 N. Un trozo de papel de
nitrocelulosa o de filtro de membrana de nilón (tamaño de poros 0,45
\mum) se humedece brevemente en agua y después se empapa en 20X
SSC durante 1 hora a temperatura ambiente. Después se pone el filtro
en el aparato. La muestra de RNA de cada placa se mezcla con 20
\muL de formamida al 100%, 7 \muL de formaldehído al 37% y 2
\muL de 20X SSC, se incuba a 68ºC durante 15 minutos y después se
enfría súbitamente en hielo.
Se aplican veinte mg de RNA a cada ranura del
aparato, junto con dos volúmenes de 20X SSC. Después de drenar la
solución a través del filtro, las ranuras se aclaran dos veces con 1
mL de 10 X SSC. Después se seca el filtro y se cuece a 80ºC durante
2 horas en una estufa bajo vacío. Después se corta el filtro en
tiras de forma que muestras expuestas a diferentes concentraciones
de X durante periodos de tiempo variables puedan hibridarse con
sondas específicas del gen de estrés individuales. Se usa una tira
para cada sonda distinta.
La hibridación de las tiras con sondas de
oligonucleótidos individuales se lleva a cabo bajo condiciones bien
conocidas para la hibridación de RNA-DNA. La
temperatura y la concentración salina para hibridar varias sondas
con el RNA dependerá de la naturaleza del oligonucleótido. Estas
condiciones pueden calcularse usando fórmulas bien conocidas. Se
usan sondas para los genes siguientes:
estrés redox solamente: CYP1A1, NMO1, ALDH2;
estrés de DNA solamente: XHF, DRA, GADD153 y
MDR-1;
estrés de proteína solamente: HSP70, MT 1A;
estrés redox y DNA: GST Ya, HMA y MnSOD;
estrés redox, DNA y proteína: JUN;
estrés DNA, proteína y energético/iónico:
FOS.
Después de la hibridación, las tiras se lavan y
se secan, y se determinan cuantitativamente los niveles de mRNA de
una de estas dos maneras. En un método, las tiras se exponen a
película de rayos X y la hibridación se determina cuantitativamente
por densitometría. Alternativamente, las tiras se ponen en ranuras
individuales y se someten a recuento de centelleo. En realidad
pueden llevarse a cabo ambos métodos si se realiza en primer lugar
el primero de ellos.
Se reticularon separadamente oligonucleótidos
homólogos a los mRNA de los siguientes genes de estrés y
organizador, con membranas Biodyne C (Pall Corporation, East Hills,
Nueva York) usando esencialmente el método descrito en Y. Zhand
et al., Nucleic Acids Res., 19, pp.
3929-33 (1991):
estrés redox solamente: CYP1A1, ALDH1;
estrés de DNA solamente: GADD153;
estrés de proteína solamente: HSP70;
estrés redox y de proteína: MTIIA;
estrés redox y DNA: HMO;
estrés redox, DNA y proteína: JUN;
estrés DNA, proteína y energético/iónico:
FOS;
testigo: \gamma-actina.
La membrana Biodyne C se aclaró primero
brevemente con HCl 0,1N. Después, se trató la membrana durante 15
minutos con EDC
[1-etil-3-(3-dimetilaminopropilcarbodiimida)]
al 20% (p/v) recién preparada. Después se aclaró la membrana con
H_{2}O y se puso en un aparato de mancha en punto
(Dot-Blot) de 96 pocillos. Se aplicaron
después los oligonucleótidos modificados con amino, en NaHCO_{3}
0,5 M (pH 8,4) a la membrana en pocillos individuales usando vacío
durante 15 minutos. El volumen total por pocillo no debe exceder de
3 \muL. Cada oligonucleótido individual fue aplicado en cuatro
pocillos adyacentes.
Después de aplicar los oligonucleótidos, se lavó
la membrana con 1 x TBS/0,1% Tween® 20, y después se sofocó
cualquier grupo activo que pudiese quedar en la membrana mediante
tratamiento con NaOH 0,1 M durante 10 minutos. Se lavó después la
membrana con dH_{2}O, se secó al aire y la membrana seca se guardó
en una bolsa de plástico herméticamente cerrada.
Se desarrollan células HepG2 en medio mínimo
esencial en discos de cultivo de células de 100 mm, hasta no más de
un 80% de confluencia. Los cultivos se exponen después a varias
concentraciones de compuesto X y se incuban a 37ºC durante el tiempo
que se desee. Después de separar los medios por aspiración, las
células se lavan tres veces con 10 mL de una solución salina
tamponada con fosfato a temperatura ambiente. Después se añaden 5 mL
de la solución salina tamponada con fosfato al disco de cultivo de
células, y las células se raspan del disco con una varilla de vidrio
con punta de goma y se ponen en un tubo de centrífuga de 15 mL.
Después se cuentan las células con un hemacitómetro y se sedimentan
en una centrífuga. La solución salina tamponada con fosfato se
separa vertiéndola.
Si se desea el aislamiento del RNA total, se usa
RNAzol B (Biotecx Laboratories, Inc., Houston, TX), siguiendo las
instrucciones del fabricante. Si solamente se desea mRNA, se usa el
kit de Aislamiento de RNA Mensajero (Stratagene Inc., La Jolla, CA)
siguiendo las instrucciones del fabricante.
El RNA total (50 \mug) o el mRNA (2 \mug)
aislados por los procedimientos descritos anteriormente se someten
después a transcripción inversa usando SUPERSCRIPT II (transcriptasa
inversa) (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) y el protocolo que sigue.
Se añade el RNA a un tubo de microcentrífuga con
DEPC H_{2}O y cebador de oligo-dT. La cantidad de
DEPC H_{2}O añadida a la mezcla de reacción se determina después
de determinarse los volúmenes de los otros reactivos. El cebador de
oligo-dT (0,5 \mug/\muL) se añade de forma que
el volumen sea el 10% del volumen final total. La mezcla de reacción
se calienta a 70ºC durante 10 minutos y después se enfría
rápidamente sobre hielo. Los componentes que siguen se añaden por el
orden que indica: 5x tampón para la primera cadena SUPERSCRIPT (20%
del volumen total); DTT 0,1 M (10% del volumen total); SUPERSCRIPT
II (5% del volumen total). La mezcla de reacción se centrifuga
brevemente y después se mezcla mediante pipeteo repetido. La mezcla
se incuba a 37ºC durante 1 hora. Después se añaden 2 \muL de RNAsa
A (10 mg/mL) a la mezcla de reacción y se mezcla mediante pipeteo.
Después se incuba la mezcla de reacción a 37ºC durante otra hora. Al
final de la incubación, se añade ddH_{2}O hasta un volumen final
de 450 \muL. El cDNA se precipita añadiendo 50 \muL de acetato
sódico 3M, seguidos por 1 mL de etanol al 100%. Después se
centrifuga la mezcla durante 30 minutos en una microcentrífuga a
12.000 x g. El sobrenadante se elimina y se resuspende el cDNA en
100 \muL de ddH_{2}O. Se separan después 2 \muL del cDNA
resuspendido y se leen en un contador de centelleo. Se requiere un
total de 1.000.000 cpm para la hibridación.
El cDNA puede ser marcado radiactivamente usando
\alpha-^{32}P dCTP (100 \muCi) en la reacción,
o bien se marca químicamente empleando
digoxigenina-dUTP, usando el kit GENIUS 1
(Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN).
Si mediante el procedimiento anterior se obtiene
una cantidad insuficiente de cDNA de gen de estrés, puede usarse PCR
para amplificación. La transcripción inversa se lleva a cabo como se
describió anteriormente, excepto que no se incorpora marcador en el
cDNA. En la reacción de PCR se usan cebadores basados en las
secuencias de codificación 5' y 3' publicadas, de los genes de
estrés deseados. La amplificación de todos los cDNA de genes de
estrés se lleva a cabo en el mismo tubo de reacción.
El cDNA total se diluye 1:10 con dH_{2}O y se
usan 10 \muL para la reacción de PCR. Después se añaden los
componentes que siguen para producir la concentración final
indicada: tampón 1x TAQ (Boehringer Mannheim Biochemical); 300
\muM cada dNTP; 25 pmol cada cebador PCR; 2 unidades de de TAQ
polimerasa (Boehringer Mannheim Biochemical); dH_{2}O hasta un
volumen de reacción total de 50 \muL. La mezcla se agita mediante
pipeteo, seguido por una segunda centrifugación. Se ponen dos gotas
de aceite mineral ligero en la parte superior de la mezcla de
reacción. Después se ajusta la PCR realizada durante 30 ciclos de 1
minuto a 95ºC; 2 minutos a T_{m} + 2ºC; 3 minutos a 72ºC (10
minutos durante el último ciclo). Los productos de la PCR se marcan
con ^{32}P que ha sido incorporado en cebadores anidados mediante
una reacción con quinasa en una reacción PCR de un ciclo.
Un cebador anidado es un cebador basado en una
secuencia de nucleótidos específica del estrés situada dentro de las
secuencias sobre las que se basaron los cebadores para PCR. Estos
cebadores se sintetizan usando un sintetizador de oligonucleótidos o
se adquieren de un proveedor. Los cebadores anidados se marcan
mezclando 1,2 \muL (0,5 \mug/\muL) de cebador anidado con 1,0
\muL de tampón 10x de quinasa (0,5 M Tris, pH 8,2, MgCl_{2} 0,1
M, DTT 50 mM); 5,0 \muL de \alpha-^{32}P ATP;
1,0 \muL de polinucleótido quinasa y 1,8 \muL de dH_{2}O. La
reacción se mezcla pipeteando y se incuba a 37ºC durante 1 hora. La
reacción se termina mediante incubación a 70ºC durante 10 minutos,
seguida por una rápida centrifugación y enfriamiento sobre hielo.
Después se añaden 90 \muL de dH_{2}O, seguidos por 100 \muL de
fenol/cloroformo (1:1). La mezcla se agita bien y se centrifuga
durante 10 minutos, y la fase acuosa se pasa después a un nuevo
tubo. Después se precipitan los cebadores marcados, añadiendo 10
\muL de acetato sódico 3M, 1 \muL de tRNA 10 mg/mL, y 400 \muL
de etanol al 100%, y poniéndolo sobre hielo durante 10 minutos.
Después se centrifuga la mezcla durante 30 minutos a temperatura
ambiente. El sedimento se lava con etanol al 80%, se centrifuga
durante 5 segundos y se seca. El sedimento se resuspende con 4
\muL de dH_{2}O, 0,5 \muL de tampón 10x TAQ y 0,5 \muL de
enzima TAQ.
Después se añaden 5 \muL de los cebadores
anidados marcados a la fase acuosa de la mezcla de PCR anteriormente
descrita, bajo el aceite mineral, y se realiza un ciclo de PCR
adicional calentando a 95ºC durante 2 minutos, enfriando a T_{m} +
2ºC (del cebador marcado) durante 2 minutos, y calentando a 72ºC
durante 10 minutos.
Después se retiraan 50 \muL de la fase acuosa a
un nuevo tubo, se añaden 50 \muL de dH_{2}O, 100 \muL de
fenol/cloroformo, se mezcla bien y se centrifuga durante 10 minutos.
La fase acuosa se recupera en un tubo nuevo. Los cebadores no
incorporados se eliminan usando una columna rotatoria.
La membrana que contiene los oligonucleótidos
reticulados se humedece en 15 mL de tampón RAPID HYB (Amersham,
Arlington Heights, IL) sujetando un extremo de la membrana con un
par de tenacillas y sumergiendo la membrana lentamente. Después se
pre-hibrida la membrana pasándola a una bolsa
Seal-a-Meal, se añaden los 15
mL de tampón RAPID HYB de la etapa de humectación, y se cierra
herméticamente la bolsa. Después se sumerge en un baño de vaivén con
agua a 68ºC durante 1 hora. El cDNA marcado (15.000.000 cpm) se
diluye en 1 mL de RAPID HYB y se hierve durante 10 minutos y a
continuación se enfría rápidamente sobre hielo.
Después de la prehibridación, el RAPID HYB se
retira y se reemplaza por 14 mL de RAPID HYB nuevo, precalentado a
65ºC. Después se añade a la bolsa el cDNA marcado y se vuelve a
cerrar herméticamente el extremo. Después se sumerge la bolsa en un
baño de vaivén con agua a 68ºC durante la noche. Después de la
hibridación, se retira la membrana de la bolsa y se pone en una
bandeja que contiene tampón de baja rigurosidad (2x SSC/0,1% SDS)
durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después se pasa la
membrana a tampón de alta rigurosidad (0,2x SSC/0,1% SDS;
precalentado a 45ºC) y se agita durante 30 minutos a 45ºC. Después
se retira la membrana del lavado de alta rigurosidad, se pone en un
trozo de filtro Whatman 3MM y se expone a película de rayos X a
-70ºC durante la noche, con una pantalla de intensificación. Después
del revelado, se corta la autorradiografía para adaptarla a un
soporte de placa de microtítulo de 96 pocillos, y se pone de forma
que los puntos radiactivos estén alineados con los orificios del
soporte. Después se lee la autorradiografía a 600 nm para la
determinación cuantitativa.
Los resultados para los dos ensayos anteriormente
descritos se comparan después con una base de datos de patrones
preparados usando los promotores anteriores y toxinas conocidas.
Correlacionando resultados para X con compuestos conocidos, puede
crearse un perfil de toxicidad. Por ejemplo, si X indujo los mismos
genes de estrés que TCDD a concentraciones similares, esto indicaría
que X es tóxico para animales completos a concentraciones similares
que TCDD.
Se preparó una fusión de promotor
XHF-CAT de la forma siguiente. Se sintetizaron dos
oligonucleótidos basándose en la secuencia publicada del promotor
XHF (colagenasa) [P. Angel et al., Mol. Cell Biol., 7,
pp. 2256-66 (1987)]. Uno correspondía a las
posiciones -520 a -501 aguas arriba del cebador del sitio de
comienzo de la transcripción. [SEQ ID NO. 44]:
5'-TACCAGGCAGCTTAACAAAG-3'. El otro
correspondía a las posiciones +53 a +73 aguas abajo del sitio de
comienzo de la transcripción. [SEQ ID NO. 45]:
5'-ACTGGCCTTTGTCTTCTTTC-3'. Los
oligonucleótidos fueron sintetizados por Operon Technologies
(Alameda, CA). Los oligonucleótidos se disolvieron en agua a una
concentración final de 500 pmoles/mL.
Para la amplificación del promotor XHF, se
mezclaron 0,1 \mug de DNA genómico Raji (genoteca humana), 20
pmoles de cada uno de los dos cebadores anteriores, 5 \muL de
tampón 10X [KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8,3,
MgCl_{2} 15 mM, 0,1% gelatina], 5 \muL de 2,0 mM de cada dNTP y
1 unidad de AMPLITAQ (Taq polimerasa) (Perkin-Elmer,
Norwalk, CT). Se añadió agua hasta un volumen total de 50 \muL y
se realizó la PCR.
La reacción PCR se llevó a cabo a 94ºC durante 2
minutos, seguido por 30 ciclos de: 10 segundos a 56ºC, 30 segundos a
71ºC y 10 segundos a 94ºC. La reacción PCR se completó incubando la
mezcla a 56ºC durante 1,5 minutos, seguido por 71ºC durante 4
minutos. El producto de reacción fue después sometido a
electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,0% y la secuencia
amplificada se escindió del gel y se purificó. El fragmento aislado
después se trató con quinasa y se ligaron los extremos romos en el
vector pBLCAT3 descrito en B. Luckow et al., Nucl. Acids
Res., 15, p. 5490 (1987), cuya descripción se incorpora al
presente texto como referencia.
Pueden prepararse igualmente otras fusiones
promotor de estrés-CAT usando cualquiera de las
secuencias de nucleótidos publicadas, anteriormente citadas, de las
varias regiones del promotor del gen de estrés para diseñar
cebadores de oligonucleótidos apropiados para PCR. Se prepararon
fusiones de CAT con los siguientes promotores de estrés para su uso
en los kits y métodos de esta invención: XHF, CYP1A1, GST Ya, MTIIA,
FOS, HSP70, GADD45, GADD153 y JUN.
Se construyó una fusión de elemento de respuesta
xenobiótico XRE-CAT de la forma que sigue. En primer
lugar se obtuvieron oligonucleótidos correspondientes a ambas
cadenas del XRE, sintetizado por un proveedor independiente (Operon
Technologies, Inc., Alameda, CA). La secuencia de XRE se describe en
M. Denison et al., J. Biol. Chem., 263, pp.
17221-24 (1988). Los oligonucleótidos fueron
sintetizados con extremos compatibles con BamHI
colgan-
tes.
tes.
Los oligonucleótidos se disolvieron en agua a una
concentración final de 500 pmoles/mL. Después se mezclaron 50 \mug
de cada oligonucleótido en una solución que contenía NaCl 500 mM,
Tris-HCl 50 mM, H 7,8, EDTA 1 mM, y se hirvió
durante 5 minutos. Después se incubó la solución durante la noche a
68ºC para permitir la reasociación de las cadenas entre sí. Los
oligos bicatenarios se sometieron después a electroforesis sobre un
gel de 12% de poliacrilamida y se purificaron escindiendo la banda y
electroeluyendo el DNA.
Los elementos de respuesta purificados fueron
después quinasados y clonados en el sitio BamHI de pBLCAT2 [M.
Denison et al., J. Biol. Chem., 263, pp.
17221-24 (1988)], precisamente aguas arriba del
promotor mínimo tk.
Pueden prepararse del mismo modo otras fusiones
de elemento de respuesta-CAT usando cualquiera de
las secuencias de nucleótidos publicadas, anteriormente citadas, de
los diversos elementos de respuesta para diseñar cebadores de
oligonucleótidos apropiados para PCR. Se prepararon fusiones de CAT
con los elementos de respuesta siguientes, para su uso en los kits y
métodos de esta invención: XRE, NFkB, CRE, p53RE y RARE.
Aproximadamente 5 x 10^{4} células de cada una
de las 14 cepas transformadas descritas en los Ejemplos 3 y 4
anteriores fueron puestas en placas separadamente en una fila de 12
pocillos en una de dos placas de 96 pocillos. Una línea celular
hepática humana no transformada fue puesta en placa en los pocillos
de la última fila de la segunda placa para determinar la viablidad
de las células. Las células se desarrollaron en medio esencial
mínimo completo al 10% (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) a 37ºC, 5% de
CO_{2}, hasta alcanzar un 90% de confluencia.
Se ensayaron cinco de seis concentraciones
diferentes de los diversos productos químicos expuestos en la Tabla
3 que sigue, disueltos en el disolvente apropiado, por
triplicado.
Las diversas concentraciones se obtuvieron
llevando a cabo una serie de diluciones. Para TCDD, se retiraron
primero 20 \muL de medio de cada pocillo de las columnas 3 a 10 y
10 \muL de las columnas 11 y 12 de las placas de 96 pocillos. Se
pusieron 10 \muL de una solución 200 \muM de producto químico de
ensayo en cada pocillo en las columnas 11 y 12. El líquido de estos
pocillos se mezcló bien con una pipeta multicanal usando puntas de
pipeta distintas para cada fila, y después se pasaron 20 \muL de
los pocillos de la columna 12 a la columna 10. El líquido de la
columna 10 se mezcló y después se pasaron 20 \muL a la columna 8,
y se repitió el procedimiento para las columnas numeradas pares
bajando hasta la columna 4. Se llevó a cabo el mismo procedimiento
para las columnas numeradas impares partiendo de la columna 11 y
terminando con la columna 3. Las columnas 1 y 2 de cada fila
representan testigos sin tratar. Después se incubaron las placas a
37ºC, 5% de CO_{2}, durante la noche.
Al final de la incubación, el medio se aspiró
suavemente de todos los pocillos, excepto de la fila de viabilidad
de las células en la segunda placa. Las células de todas las filas
menos la última se lavaron dos veces con 200 \muL de solución
salina tamponada con fosfato. Después del lavado, se añadieron 100
\muL de Tampón para Lisis Celular (Mops 5 mM, NaCl 2,5 mM,
MgCl_{2} 0,38 mM, Triton X-100 al 0,25%, pH a 6,5
usando NaOH) a cada pocillo y se incubaron 30 minutos a temperatura
ambiente. Después se combinaron los lisados de los pocillos que
contenían concentraciones duplicadas de producto químico pasando los
100 \muL de lisado de la columna 12 a la columna 11, de la columna
10 a la columna 9, y así sucesivamente.
Se ensayó la proteína total de cada pocillo de la
forma siguiente. En dos placas de 96 pocillos nuevas se añadieron
190 \muL de 1X Reactivo de Ensayo de Proteínas
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) a cada pocillo
de la columna 1 a la 7. Se pasaron 10 \muL de lisado celular de
los pocillos de la columna 1 de la placa de ensayo de toxina a la
columna 2 de la placa de ensayo de proteína, de la columna 3 de la
placa de ensayo de toxina a la columna 3 de la placa de ensayo de
proteína, de la columna 5 de la placa de ensayo de toxina a la
columna 4 de la placa de ensayo de proteína, y así sucesivamente.
Después se incubaron las placas durante 15 minutos a temperatura
ambiente y se leyó la absorbancia de cada pocillo a una densidad
óptica (DO) DO_{600}.
El ensayo de CAT se realizó usando un kit de CAT
ELISA (5 Prime-3 Prime, Inc., Boulder, CO) y
siguiendo las instrucciones del fabricante. Se usaron 190 \muL de
cada lisado celular de las placas de ensayo de toxina para
determinar la actividad de CAT. Se dejó que el ensayo CAT procediese
durante tres horas y media a temperatura ambiente. La actividad de
CAT se midió usando un anticuerpo anti-CAT
biotinilado, seguido por una fosfatasa alcalina conjugada con
estreptavidina y, finalmente, el sustrato colorimétrico fosfato de
p-nitrofenilo. Se midió el desarrollo de color a
DO_{405}.
Se calculó la inducción de plegamiento usando la
fórmula siguiente:
\frac{DO_{405}
\ (muestra \ de \ ensayo)/DO_{600} \ (muestra \ de \
ensayo)}{DO_{405} \ (testigo)/DO_{600} \
(testigo)}
Los resultados de cada uno de estos experimentos
se muestran gráficamente en las Figuras 1 a 11.
Aunque en el texto anterior se han presentado
varias realizaciones de esta invención, es evidente que puede
alterarse la construcción básica de los autores para proporcionar
otras realizaciones que utilizan los kits de diagnóstico, los
procedimientos y los productos de la presente invención. Por tanto,
se entenderá que el alcance de esta invención ha de definirse por
medio de las reivindicaciones anexas al presente texto y no a través
de las realizaciones específicas que se han presentado aquí a título
de ejemplo.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: XenometirX, Inc. (todos los Estados excepto EE.UU.)
\hskip3.9cm2860 Wilderness Place
\hskip3.9cmSuite 150
\hskip3.9cmBoulder, Colorado 80301
\hskip3.9cmEstados Unidos
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Farr, Spencer B (solamente EE.UU.)
\hskip3.9cm2852 Kalmia Avenue
\hskip3.9cmNo. 184
\hskip3.9cmBoulder, Colorado 80301
\hskip3.9cmEstados Unidos
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Todd, Marque D (solamente EE.UU.)
\hskip3.9cm8200 North Sheridan Boulevard
\hskip3.9cmNo. 904
\hskip3.9cmWestminster, Colorado 80003
\hskip3.9cmEstados Unidos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODOS Y KITS PARA DIAGNOSTICO QUE UTILIZAN PROMOTORES DE ESTRÉS EUCARIOTAS PARA DETERMINAR LA TOXICIDAD DE UN COMPUESTO.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 45
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A) DESTINATARIO: James F. Haley, Jr.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B) CALLE: 1251 Avenue of the Americas
\vskip0.500000\baselineskip
- (C) CIUDAD: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (D) ESTADO: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (E) PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F) CP: 10020
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A) TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B) ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D) SOFTWARE: PatentIn Emisión nº1.0, versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A) NUMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B) FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C) CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 08/008.896
\vskip0.500000\baselineskip
- (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 21 de enero de 1993
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A) NOMBRE: Marks, Andrew S
\vskip0.500000\baselineskip
- (B) NUMERO DE REGISTRO: 33.259
\vskip0.500000\baselineskip
- (C) NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: X-1 CIP
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A) TELÉFONO: (212) 596-9000
\vskip0.500000\baselineskip
- (B) TELEFAX: (212) 596-9090
\vskip0.500000\baselineskip
- (C) TELEX: 14-8367
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 59 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAAACCCC AAGATCCTGA AACAGAGCAT GACCCTGAAC CTGGCCGACC CAGTTTTTT
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:4
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAAATAGA GCGTCCGCAA CCCGACAGCA TGCCCCAGGA TTTGTCAGAG GCCCTTTTTT
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A
- ) LONGITUD: 65 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:7
\vskip0.800000\baselineskip
- (xii)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:8
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:9
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:11
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:13
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:13
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:14
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D) TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:14
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:15
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:16
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:17
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- D) TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:18
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:19
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:20
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:21
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:22
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:23
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:24
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:25
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 67 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:26
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTGCTATG GCGTGGTAAG TGCCCAGTGC CCCTITGGTG GATTCAAGAT
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:27
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTGAGTTC CTACCTGAAC GGTTTCTCAC CCCTGATGGT GCTATCGACA
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTACTCCCAG CTGCACTGCT TACACGTCTT CCTTCGTCTT CACCT
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:29
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGAGAATGA AAGGAAAGTG GCACAGCTAG CTGAAGAGAA TGAACGGCTC
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:30
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTCGCTACA TGGATCAATG GGTTCCAGTG ATTAATCTCC CTGAACGGTG
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:31
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGTGGACC TGACCTGCCG TCTAGAAAAA CCTGCCAAAT ATGATGACAT
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:32
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCCCAAGG AAGCCTCCCA TGGATGAGAA ATCTTTAGAA AAGCAAGGA
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:33
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTACACTCA GCTTTCTGGT GGCGACAGTT GCTGTAGGGC TTTA
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:34
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAAGGACGA GTTTGAGCAC AAGAGGAAGG AGCTGGAGCA GGTGT
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:35
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTCAGGGAA CAGGTGGCAC AGCTTAAACA GAAAGTCATG AACCACGTTA
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:36
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAAGGCATC TATTTTTCAA TGGTCAGTGT CCAGGCTGGA ACAAAGCGCC
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:37
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCACTGGCTC CTGCAAATGC AAAGAGTGCA AATGCAACTC CTGCAAG
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:38
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCAGGGCTG CATCTGCAAA GGGGCGTCGG ACAAG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:39
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCACTGTAT TTTGCTCCAA GCAGCCTCTT TGACCTAAAC TTCCAGGCAG
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:40
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAAAAGCCA CTCCACTCTC TTCAACGGTG ACACTCAGTA TGTCTGCAGA
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:41
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGCTCTCGA CAGTATCCAC AATAGCTGAC GGCTGGGTGT TTCAGTTTGA
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:42
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:42
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCTTCCAGC AGATGTGGAT TAGCAAGCAG GAGTACGACG AGTCG
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:43
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGAGTGGAT CCCCAACAAT GTGAAAACGG CTGTCTGTGA CATCCCACCT
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:44
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACCAGGCAG CTTAACAAAG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO:45
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTGGCCTTT GTCTTCTTTC
\hfill20
Claims (13)
1. Un kit de diagnóstico para identificar y
caracterizar un compuesto tóxico, que comprende:
- (a)
- una célula de mamífero caracterizada por:
- (i)
- al menos un promotor que solamente responde a estrés redox;
- (ii)
- al menos un promotor que solamente responde a estrés de DNA;
- (iii)
- al menos un promotor que solamente responde a estrés de proteína; y
- (iv)
- al menos un promotor que solamente responde a estrés energético/iónico,
- estando unido operativamente cada uno de dichos promotores a un gen diferente que codifica un producto detectable diferente; y
- (b)
- al menos cuatro sondas oligonucleotídicas diferentes, siendo cada una de dichas sondas capaces de hibridarse con el transcrito de uno de los genes diferentes que está operativamente unido a dichos promotores, o con un cDNA monocatenario preparado a partir de dicho transcrito de mRNA,
- (i)
- siendo al menos una de dichas sondas oligonucleotídicas capaz de hibridarse con el transcrito de mRNA, o con un cDNA monocatenario preparado a partir de dicho transcrito de RNA, de uno de dichos genes que está unido operativamente a uno de dichos promotores que solo responde a estrés redox,
- (ii)
- siendo al menos una de dichas sondas oligonucleotídicas capaz de hibridarse con el transcrito de mRNA, o con un cDNA monocatenario preparado a partir de dicho transcrito de RNA, de uno de dichos genes que está unido operativamente a uno de dichos promotores que solo responde a estrés de DNA,
- (iii)
- siendo al menos una de dichas sondas oligonucleotídicas capaz de hibridarse con el transcrito de mRNA, o con un cDNA monocatenario preparado a partir de dicho transcrito de RNA, de uno de dichos genes que está unido operativamente a uno de dichos promotores que solo responde a estrés de proteína,
- (iv)
- siendo al menos una de dichas sondas oligonucleotídicas capaz de hibridarse con el transcrito de mRNA, o con un cDNA monocatenario preparado a partir de dicho transcrito de RNA, de uno de dichos genes que está unido operativamente a uno de dichos promotores que solo responde a estrés energético/iónico.
2. Un kit de diagnóstico para identificar y
caracterizar un compuesto tóxico, que comprende:
- (i)
- una primera célula de mamífero que aloja al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés redox;
- (ii)
- una segunda célula de mamífero que aloja al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés de DNA;
- (iii)
- una tercera célula de mamífero que aloja al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés de proteína; y
- (iv)
- una cuarta célula de mamífero que aloja al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés energético/iónico
en donde cada uno de dichos
promotores o elementos de respuesta está unido operativamente a un
gen heterólogo que codifica un producto
detectable.
3. Un método in vitro para determinar la
toxicidad de un compuesto para una célula de mamífero creando un
perfil de inducción de estreses, que comprende identificar y
cuantificar separadamente cada uno de los estrés redox, de DNA, de
proteína y energético/iónico que el compuesto causa a las células,
comprendiendo el método las etapas de:
- (a)
- cultivar separadamente una o más células de mamífero que, in toto, se caracterizan por:
- (i)
- al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés redox,
- (ii)
- al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés de DNA,
- (iii)
- al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés de proteína,
- (iv)
- al menos un promotor o elemento de respuesta que solamente responde a estrés energético/iónico,
- estando cada uno de dichos promotores o elementos de respuesta unidos operativamente a un gen que codifica un producto detectable;
- (b)
- exponer cada uno de dichos uno o más cultivos de células a dicho compuesto;
- (c)
- cuantificar los productos detectables que corresponden al estrés redox, de DNA, de proteína y energético/iónico que el compuesto causa a la célula; y
- (d)
- crear el perfil de inducción del promotor de estrés a partir de los datos resultantes de la etapa (c) para dicho compuesto.
4. El kit o método de diagnóstico según una
cualquiera las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula de
mamífero es una célula HepG2.
5. El kit de diagnóstico según la reivindicación
1 ó 2, o el método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que
dicho promotor o elemento de respuesta que responde a un estrés
redox se selecciona de CYP1A1, XRE, PPRE, NMO1, ALDH2, UGT,
Cu.ZnSOD, ADPRT, FAOxasa, PBE, PPAR, CYP2B2, CYP3A3 o ARE.
6. El kit de diagnóstico según la reivindicación
1 ó 2, o el método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que
dicho promotor o elemento de respuesta que responde a un estrés de
DNA se selecciona de XHF, GADD153, TRE, p53RE, DRA,
MDR-1, EGR-1, GAS 2,3, MGMT, DNA
Pol, DHFR, TK, PCNA, PGHS, LOX, ISG15, TPO1, TPO2 o PCNA.
7. El kit de diagnóstico según la reivindicación
1 ó 2, o el método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que
dicho promotor o elemento de respuesta que responde a un estrés de
proteína se selecciona de HSP70, MT1A, o MT III.
8. El kit de diagnóstico según la reivindicación
1 ó 2, o el método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que
dicho promotor o elemento de respuesta que responde a un estrés
energético/iónico se selecciona de CRE, TH, DBH, ODC, G6PD o
PVALB.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 8, en donde cada uno de dichos promotores o
elementos de respuesta está en la misma célula y en el que
cuantificar el producto detectable comprende las etapas de:
- (a)
- aislar mRNA de dicho cultivo expuesto a dicho compuesto; y
- (b)
- cuantificar la cantidad de mRNA transcrito de cada gen que está unido operativamente a cada uno de dichos promotores de estrés o elementos de respuesta de dicho cultivo.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 3 a 8, en donde cada uno de dichos genes que
codifica un producto detectable es heterólogo para cada uno de
dichos promotores o elementos de respuesta y en el que cada uno de
dichos promotores o elementos de respuesta está alojado en una
célula diferente.
11. El kit de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 2, o el método de acuerdo con la reivindicación 10,
en donde cada uno de dichos promotores o elementos de respuesta está
unido operativamente a un gen que codifica el mismo producto
detectable heterólogo.
12. El kit de diagnóstico o el método de acuerdo
con la reivindicación 11, en donde dicho producto heterólogo
detectable es CAT.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 3 a 12, que comprende la etapa adicional de
incubar dicho compuesto con un extracto de hígado S9 antes de
exponer dicho uno o más cultivos de células a dicho compuesto.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US889693A | 1993-01-21 | 1993-01-21 | |
| US8896 | 2001-12-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2111289T3 ES2111289T3 (es) | 1998-03-01 |
| ES2111289T5 true ES2111289T5 (es) | 2005-07-16 |
Family
ID=21734317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES94907826T Expired - Lifetime ES2111289T5 (es) | 1993-01-21 | 1994-01-21 | Metodos y kits de diagnostico que emplean promotores de estres en mamiferos para determinar la toxicidad de un compuesto. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5811231A (es) |
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