JP2005535285A - 分子肝毒性モデリング - Google Patents
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Abstract
Description
[0002] 本明細書と同時に提出されるコンパクトディスクの配列表はその全体として関連付けにより本明細書中に取り入れられる。4部の配列表(4枚のコンパクトディスクのそれぞれに1部)が提供される。コピー1、コピー2及びコピー3は同一である。コピー1、コピー2及びコピー3はCRFとも同一である。配列表の電子的複製物はそれぞれが2003年1月30日に作製され、ファイルサイズは5795KBである。ファイル名は下記の通りである:コピー1−gl5038us01.txt;コピー2−gl5038us01.txt;コピー3−gl5038us01.txt;及びCRF−gl5089us01.txt。
[0003] 細胞又は生物体に対する、化合物、薬剤又は環境汚染物質の有毒な影響力を評価する方法の必要性により、生物学的モニターとして生物体を利用する手法の開発につながってきた。これらの系統の最も単純であり、そして最も便利なものは、酵母やバクテリアのような単細胞の微生物を利用する、というのは、それらが最も簡単に維持され、そして操作されるからである。また、単細胞のスクリーニング系は、細胞に対する試験化合物の効果をモニターするために、たびたび表現型の簡単に検知できる変化を使用する。しかしながら、単細胞の生物は、それらがより高等な生物で見られる範囲、又はレベルで生体内変換を実行する能力を有しないので、複雑な多細胞の動物に対する多くの化合物の潜在的な効果を評価するための適当なモデルではない。
[0005] 本発明は、既知の毒(毒性物質)−特に、肝臓毒−に曝された組織若しくは細胞における、曝されない組織若しくは細胞と比較しての遺伝子発現の全体的な変化の解明、ならびに毒に曝すことにより、発現量に差のある個々の遺伝子の同定に基づく。
[0009] 多くの生物学的機能は、転写(例えば、開始の制御、RNA前駆体の供給、RNAプロセッシング等を通して)及び/又は翻訳制御を通して、様々な遺伝子の発現を変化させることによって達成される。例えば、細胞周期、細胞分化及び細胞死のような基本的生物学的プロセスは、遺伝子群の発現レベルにおける変化によって、しばしば特徴づけられる。
[0013] 毒性を予測する遺伝子発現の変化を評価及び識別するために、本発明者らは、十分に特徴付けられた毒性を持つ選択された化合物を用いた研究を実施して、生体内での曝露中に変化した遺伝子発現を分類整理した。本研究では、アセトアミノフェン、2−アセチルアミノフルオレン(2−AAF)、アシクロビル、ANIT、AY−25329、BI肝毒素、クロロホルム、ビカルタミド、四塩化炭素、クロロホルム、CI−1000、クロフィブラート、コルヒチン、CPA、ジクロフェナク、ジフルニサル、ジメチルニトロサミン(DMN)、ダイオキシン、17α−エチニルエストラジオール、ゲムフィブロジル、ヒドラジン、インドメタシン、LPS、メナジオン、フェノバルビタール、タクリン、チオアセタミド、バルプロ酸、Wy−14643、及びジロートンを既知の肝臓毒として選択した。
[0084] 表1〜5WWWで提供される遺伝子のポートフォリオ及びサブセットと同様に、遺伝子及び遺伝子発現情報を用いて、試験化合物又は未知化合物の肝毒性を含む、少なくとも1つの毒作用を予測する。本明細書で使用する場合、少なくとも1つの毒作用には、細胞又は生物の生理的状態の有害な変化が含まれるが、これに限定はされない。その応答は、特定の病理学的状態(例えば、組織壊死)と関連するかもしれないが、そうあることを要求されない。したがって、毒作用は、分子及び細胞レベルでの作用を含む。本明細書で使用される、肝毒性とは作用であり、そして、肝壊死、肝炎、脂肪肝(肝臓の脂肪変性)、発癌、胆汁鬱帯、肝肥大、炎症及びペルオキシソーム増殖の病理学的状態を含むが、これらには限られない。
[0095] 上述のように、化合物に曝された組織若しくは細胞試料の生理的状態の予測又は同定のための診断マーカーとして、或いは化合物又は薬剤の毒作用を同定するか、予測するのに表1〜5WWWに提供されたような遺伝子や遺伝子発現情報、又はそれらの発現情報を備える遺伝子のポートフォリオを使用することができる。例えば、末梢血液細胞の試料のような組織試料又は他の簡単に得ることができる若干の組織試料を上記の方法のいずれかによってアッセイでき、そして、表1〜5WWWからの1又は複数の遺伝子の発現レベルが本明細書に記載される毒に曝された組織若しくは細胞で見出される発現レベルと比較できる。これらの方法は、細胞での生理的状態の診断をもたらし、ある化合物(例えば、新しいか未知の化合物又は薬剤)の潜在的な毒性を確認するために使用することができる。利用できる配列又は他の情報と同様に、発現データの比較は、研究者又は診断者が行ってもよいし、下記のようにコンピュータやデータベースの助けを借りてもなし得る。
[0097] 上述のように、医薬、候補薬、毒、汚染物質などに最初に曝された後に見出されるような毒性進行をモニターするためのマーカーとして、表1〜5WWWに提供される遺伝子や遺伝子発現情報を使用することもできる。例えば、組織試料又は細胞試料を上記の方法のいずれによってアッセイでき、そして、表1〜5WWWの1又は複数の遺伝子の発現レベルが本明細書に記載される肝臓毒に曝された組織若しくは細胞で見出される発現レベルと比較できる。利用できる配列又は他の情報と同様に、発現データの比較は、研究者又は診断者が行ってもよいし、下記のようにコンピュータやデータベースの助けを借りてもなし得る。
[0098] 本発明によれば、表1〜5WWWで同定された遺伝子を、マーカー又は薬標的として使用して、細胞又は組織試料に対する、候補薬、化学物質又は他の薬剤の効果を評価することができる。遺伝子をその発現や活性を調節する薬剤をスクリーニングするための薬標的として使用することもできる。様々な様式で、候補薬又は薬剤は、所定の1又は複数のマーカーの転写・発現を刺激する能力、或いは1又は複数のマーカーの転写・発現をダウンレギュレート又は妨げる能力をスクリーニングできる。本発明によれば、薬が誘導するマーカーの数を見て、そしてそれらを比較することによって、薬の効果の特異性を比較することもできる。より特異的な薬は、より少ない転写標的を持つ。2つの薬のために同定されたマーカーの類似したセットは、効果の類似性を示すかもしれない。
[0110] 既知の肝臓毒(表1〜5WWW)に曝されると、差次的に発現されると同定した遺伝子を様々な核酸検出アッセイで使用して、与えられた試料中、1又は複数の遺伝子の発現レベルを検出又は定量できる。表1〜5WWWに記載した遺伝子は、その差次的な発現が細胞又は組織での毒性に関連する、1つ以上の追加の遺伝子と組合せても使用されるかもしれない。好ましい実施の形態では、表1〜5WWW中の遺伝子は、先願の関連出願である60/222,040、60/244,880、60/290,029、60/290,645、60/292,336、60/295,798、60/297,457、60/298,884、60/303,459、60/331,273、60/364,045、60/364,055、60/436,643、09/917,800及び10/060,087に記載される遺伝子の1つ以上と組合せられるかもしれない。これらすべては、関連付けによって本明細書に取り入れられる。
[0130] 配列設計の莫大な数が本発明の実施に適切であることを当業者は理解するであろう。高密度アレイは、興味ある配列に特異的にハイブリダイズする数多くの試験プローブを典型的に含む。プローブは、表及び付随する代表的な配列表において同定されている遺伝子のいかなる領域から作製してもよい。表中の遺伝子参照がESTである例では、その配列から、又は配列データベース(例えば、本明細書に記載されたもの)のどれかで入手可能であろう対応する全長転写物の他の領域から、プローブは設計されてもよい。与えられた1又は複数の遺伝子のためのプローブを作製する方法については、WO99/32660を参照。それに加えて、利用できるソフトウェアならなんでも用いて特定のプローブ配列を作成することができるが、これは例えば、Molecular Biology Insights、オリンパス光学工業(株)及びBiosoft Internationalから入手可能なソフトウェアを含む。好ましい実施の形態では、そのアレイはまた、1個若しくはそれ以上の対照プローブを含む。
[0138] 細胞又は組織試料は、インビトロ又はインビボで試験薬剤に曝される。培養細胞又は組織が使用されるとき、適当な哺乳動物の細胞抽出物(例えば、肝臓抽出物)を、試験薬剤と共に加え、毒性を示すのに生体内変換を要するかもしれない薬剤を評価してもよい。好ましい様式では、すでに薬物代謝酵素の適切な補体を発現している動物又はヒト肝細胞の初代単離株(primary isolate)が、哺乳類の肝臓抽出物の添加なしで、試験薬剤に曝される。
[0143] 合成のステップの最小数で、オリゴヌクレオチドの高密度アレイを作成する方法は、知られている。オリゴヌクレオチド類似体のアレイは、様々な方法で単一又は複数の固体基質上に合成することができ、これらは限定されないが、光指向された化学的カップリング及び機械的に指向されたカップリングを含む(Pirrung(米国特許第5,143,854号)を参照)。
[0146] 核酸ハイブリダイゼーションは、相補的な塩基対形成を通してプローブとその相補的な標的とが安定した混成二本鎖を形成することができる条件下、プローブと標的核酸とを接触させることを単に含む。WO99/32660を参照。混成二本鎖を形成しない核酸は、その後、洗い流されて、ハイブリダイズした核酸が検出されるのにまかせる(典型的には、付着した検出可能なラベルの検出を通して)。核酸を含んだ緩衝液の温度を上昇させるか、又はその塩濃度を減少させることによって、核酸が変性すると一般に認められている。低いストリンジェンシー条件下では(例えば、低温及び/又は高塩濃度)、アニールした配列が完全に相補的でない場合でも、混成二本鎖(例えば、DNA:DNA、RNA:RNA又はRNA:DNA)が形成される。このように、ハイブリダイゼーションの特異性は、低いストリンジェンシーで減少する。逆に、より高いストリンジェンシー(例えば、より高温及び/又は低塩濃度)では、うまくゆくハイブリダイゼーションは、より少ないミスマッチしか許容しない。ハイブリダイゼーション条件を選択して、いかなる程度のストリンジェンシーをも提供できると当業者は認識するであろう。
[0149] ハイブリダイズした核酸は、試料核酸に付けられた1つ以上のラベルを検出することによって典型的に検出される。ラベルは、当業者に周知である数多い手段のいずれによって取り込まれてもよい。WO99/32660を参照。
[0150] 本発明には、配列情報(例えば、表1〜5WWWの遺伝子の配列情報)と同様に、様々な標準的毒に曝された組織又は細胞からの遺伝子発現情報(例えば、本明細書に記載のもの、表5A〜5WWWを参照)を含んでいる関連あるデータベースが含まれる。データベースは、与えられた配列又は組織試料に関連する情報をも含むかもしれないが、これは例えば、配列情報と関連する遺伝子についての記載的な情報(表1を参照)や組織試料の臨床状態又はその試料が由来する動物に関する記載的な情報である。データベースは、例えば配列データベースと遺伝子発現データベースというような異なる部分を含むようになっているかもしれない。そのようなデータベースの配置と構築のための方法及びそのようなデータベースがセーブされるコンピュータ読み取り可能な媒体は、広く利用できる。例えば、その全体が関連付けにより本明細書に取り入れられている、米国特許5,953,727号を参照されたい。
[0155] 本発明は、異なる組合せで、高密度のオリゴヌクレオチドアレイ、アレイと使用する試薬、表の遺伝子によってコードされるタンパク質試薬、シグナル検出とアレイ−プロセッシング機器、遺伝子発現データベース及び上記の解析・データベース管理ソフトウェアを組合せたキットをさらに含む。例えば、前記キットを用いて、試験化合物の毒性反応を予測し、モデリングし、肝臓疾患の状態の進行をモニターし、新しい薬標的としての見込みを示す遺伝子を同定し、そして上記で議論したように既知及び新しく設計された薬をスクリーニングすることができる。
[0160] 肝臓毒である2−アセチルアミノフルオレン(2−AAF)、BI肝毒素、クロロホルム、ジメチルニトロサミン(DMN)、ゲムフィブロジル、メナジオン、チオアセタミド、アシクロビル、AY−25329、ビカルタミド、クロフィブラート、コルヒチン、ジフルニサル、ダイオキシン、ヒドラジン、フェノバルビタール、バルプロ酸、ジロートン及びLPSを、表6に示した投与希釈剤、プロトコルや投与計画を用いて、様々な時間点において、雄性SD系ラットに投与した。肝臓毒であるANIT、アセトアミノフェン、四塩化炭素、クロロホルム、CPA、ジクロフェナク、17α−エチニルエストラジオール、インドメタシン、タクリン及びWy−14643を、当該技術分野で既に記載され、そして上で議論した関連出願に記載されているような投与希釈剤、プロトコルや投与計画を用いて、様々な時間点において、雄性SD系ラットに投与した。
[0162] 1.臨床観察 毎日2回、死亡率と瀕死性をチェックする。
[0167] 1.頻度 死体解剖の前に。
(終結犠牲)
[0171] 各肝臓毒に対して表6に示したサンプリング時間において、上記の関連出願で既に記載したように、ラットを計量し、身体検査して、断頭によって犠牲にし、失血させた。犠牲の約5分以内に動物を死体解剖した。頭蓋帽を開くのに使用した骨切断機を除いては、別々の滅菌した、使い捨ての機器を各々の動物のために使用した。その骨切断機は、動物と動物の間に殺菌剤溶液に浸した。
[0174] 新しくかつ滅菌した使い捨て機器を使用して組織を収集した。組織又はバイアルを取り扱うときは、手袋をいつでも着用した。すべての組織は、動物の死のおよそ7分以内に回収して、凍結した。肝臓切片は、動物の死のおよそ2分以内に凍結した。安楽死の時間、肝臓切片及び腎臓の凍結の暫定的な時間点、及び死体解剖完了の時を記録した。組織を約−80℃で保存するか、又は10%中性緩衝ホルマリンに保存した。
(肝臓)
[0175] 1.内側右葉 液体窒素で瞬時に凍結し、そして−80℃で保存した。
[0178] 2つの心房の部分及び2つの心室の部分を含んでいる矢状横断面を10%NBFに保存した。残っている心臓を液体窒素で凍結して、−80℃で保存した。
[0179] 1.左: 半分に切開した。半分を10%NBFに保存して、そして残っている半分を液体窒素中で凍結して、−80℃で保存した。
[0181] 各精巣の矢状横断面を10%NBFに保存した。残っている精巣を液体窒素中、一緒に凍結して、−80℃で保存した。
[0182] 大脳半球及び間脳の横断面を10%NBFに保存し、そして脳の残りを液体窒素中で凍結して−80℃で保存した。
[0183] シリンジ及び新しい冷やしたRPMI(大腿当り1mLのRPMI×3回洗浄)を用いて各大腿から骨髄を2つの別々の15mLのコニカルバイアルに流した。バイアルは、右大腿及び左大腿の試料を区別できるように標識してあった。回収後、バイアルをゆっくりと数回ひっくり返し、塗れた氷の上に保持した。
1.実験における規格化されていない発現値のすべてから、最大値側の2%及び最小値側の2%の値を除く。すなわち、実験により、10,000個の実験値が得られた場合、それらの値を順に並べ、最小値側の200個及び最大値側の200個を除く。
2.残った値の平均値に等しい調整平均を計算する。
3.調整係数SF=100/(調整平均)を計算する。
[0191] Xiがグループ1の試料、i=1・・・nにわたる、与えられた遺伝子のAveDiff値を表わすとする。
f(z) = ((1/sY*exp(−.5*((z−mY)/sY)2)) / (((1/sY)*exp(−.5*((z−mY)/sY)2))+((1/sX)*exp(−.5*((z−mX)/sX)2)))の数値を求める。
[0199] 試料が、主成分分析(PCA)を用いてそれぞれの実験を個々に調べて、どの処置が観測可能な応答を有するかを明らかにすることによって毒性応答群及び毒性非応答群へのグループ分けのために選択された。それらの毒性応答状態及び毒性非応答状態の信頼度が明らかにされた群のみが、一般的な毒性モデルを組み立てる際に含められた。
[0202] 上記実施例1及び2で述べたように、マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション実験から収集したデータをLDA及びPCAによって解析した。表5A、5C、5D、5E、5F、5G、5I、5K、5L、5M、5N、5O、5Q、5S、5T、5U、5V、5W、5X、5Z、5BB、5DD、5FF、5GG、5HH、5II、5JJ、5LL、5MM、5NN、5PP、5RR、5SS、5TT、5UU、5VV、5WW、5XX、5ZZ、5BBB、5DDD、5EEE、5FFF、5GGG、5HHH、5III、5KKK、5LLL、5MMM、5NNN、5OOO、5PPP、5RRR、5SSS、5TTT、5UUU及び5VVV中の遺伝子は、化合物の肝毒性を予測するためのマーカーのコアセットを構成する。表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ、及び5WWWの遺伝子は、本発明の方法でまた使用されるマーカーの代替セットを構成するが、表5A、5C、5D、5E、5F、5G、5I、5K、5L、5M、5N、5O、5Q、5S、5T、5U、5V、5W、5X、5Z、5BB、5DD、5FF、5GG、5HH、5II、5JJ、5LL、5MM、5NN、5PP、5RR、5SS、5TT、5UU、5VV、5WW、5XX、5ZZ、5BBB、5DDD、5EEE、5FFF、5GGG、5HHH、5III、5KKK、5LLL、5MMM、5NNN、5OOO、5PPP、5RRR、5SSS、5TTT、5UUU及び5VVVのコアマーカーセットは、該マーカーセットが追加の予測遺伝子を含有するために、本発明のある実施形態で望ましいことがある。表1−5WWWの各遺伝子断片は、LDAスコアを割当てられ、コアセット中のこれらの遺伝子断片は、最高のLDAスコアを持つ遺伝子断片である。表5A−5WWWの遺伝子断片は、80%を超える真陽性結果及び5%未満の偽陽性結果を与えることが判定された。毒素処置を伴う、及び伴わない、これらの遺伝子の発現データから作成された遺伝子発現プロファイルは、その毒素特性が調査されていない化合物のアッセイにおいて、対照として使用できる。試験化合物曝露及び試験化合物非曝露動物によるデータと、表5A−5WWWのデータとの、又はコア遺伝子セット対照からのデータとの比較は、試験化合物への曝露時の毒性効果又は非毒性効果の予測を可能にする。それゆえ表1の、実施例1で述べたよりも小さい遺伝子セットによって、コア遺伝子セットを用いて曝露後の毒性特性が未知である化合物の生物学的効果を調査し、本化合物の肝臓組織における毒性を予測することができる。
[0203] 上記のモデリング方法は、遺伝子の発現を組合せて試料毒性を予測する、広いアプローチを提供する。1つの方法は、各変数を個々に使用しそれらを重み付けするが、その他の方法は、変数を複合性の測定として組み合わせ、組み合わせ後にそれらに加重を加えて新しい変数にする。1つの方法は、単純な投票方法(voting method)で加重値を提供しないか、集団として、区別的に、又は無作為なアプローチを用いる、監督された或いは監督されなかった方法で加重値を決定する。遺伝子のすべて又は選ばれた組み合わせを、分類のための未知試料と、順序づけた、集団として、又は区別的に、監督されているか、監督されていないクラスタリングアルゴリズムと組み合わせることができる。未知試料を分類するために相関行列のどんな形でも用いることができる。グループ分布と判別スコアの広がり単独で、当業者に個別遺伝子の判別能力を超えうる正確さをもって上記のモデルタイプのすべてを作成することを可能にする十分な情報を提供できる。個別に又はデータタイプを変換した後に組み合わせて用いることができる方法のいくつかの例には、以下のものが含まれるが、これらには限定されない。すなわち、判別分析、多重判別分析、ロジスティック回帰、多重回帰分析、線形回帰分析、共同解析、正準相関、階層的なクラスタ解析、k−meanクラスタ解析、自己編成マップ、多次元尺度解析、構造方程式モデリング、サポートベクトルマシン決定境界、ファクター解析、ニューラルネットワーク、ベイシアン分類及びリサンプリング方法である。
[0204] 既知の毒性学的反応、観察された臨床化学及び病理学測定に基づく、個々の病理学的クラスへ、或いはある化合物(表1〜5WWW)の範囲内で観察される毒性の早期又は後期に、試料を分類した。1つのモデルにおいて個々の判別スコアに基づく上位10、25、50、100個の遺伝子を使用して、遺伝子の組み合わせが個々の遺伝子に比べてより良い予測を提供することを確実にした。上記で説明したように、どのような順序で、或いは順序づけて、集団として、区別的に、又は無作為なアプローチによって、選択されるとき、このリストからの2個若しくはそれ以上の遺伝子のすべての組み合わせは、潜在的に個々の遺伝子に比べてより良い予測を提供することができた。それに加えて、これらの遺伝子を他の遺伝子と組み合わせることは、より良い予測能力を提供することができたが、この予測能力の大部分は、本明細書にリストされた遺伝子から来るだろう。
Claims (65)
- 化合物の少なくとも1つの毒作用を予測する方法であって、
(a)当該化合物に曝された組織又は細胞試料の遺伝子発現プロファイルを作成すること、及び
(b)当該遺伝子発現プロファイルを表1〜5のデータ又は情報の少なくとも一部を含むデータベースと比較すること
を含む方法。 - 前記組織又は細胞試料から作成された前記遺伝子発現プロファイルが少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを含んでいる、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子の発現レベルが表1〜5の毒性平均及び/又は非毒性平均の値と比較される、請求項2に記載の方法。
- 前記発現レベルが比較の前に規格化される、請求項3に記載の方法。
- 前記データベースが表1〜5のデータ又は情報の実質的にすべてを含む、請求項4に記載の方法
- 前記組織又は細胞試料が肝臓組織又は肝臓細胞試料である、請求項1に記載の方法。
- 化合物の少なくとも1つの毒作用を予測する方法であって、
(a)当該化合物に曝された組織又は細胞試料において、表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の2個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、
ここで、表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の遺伝子の差次的発現が少なくとも1つの毒作用を示唆している、方法。 - 化合物の毒作用の進行を予測する方法であって、
(a)当該化合物に曝された組織又は細胞試料において、表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の2個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、
ここで、表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の遺伝子の差次的発現が毒性の進行を示唆している、方法。 - 化合物の肝毒性を予測する方法であって、
(a)当該化合物に曝された組織又は細胞試料において、表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の2個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、
ここで、表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の遺伝子の差次的発現が肝毒性を示唆している、方法。 - 毒性反応の発症又は進行を調節する薬剤を同定する方法であって、
(a)細胞を当該薬剤及び既知の毒に曝すこと、及び
(b)表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の2個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、
ここで、表1〜3の中の遺伝子の差次的発現が毒性を示唆している、方法。 - 細胞中で化合物が調節する細胞経路を予測する方法であって、
(a)当該化合物に曝された組織又は細胞において、表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の2個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、
ここで、表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の遺伝子の差次的発現が少なくとも1つの細胞経路の調節と関連している、方法。 - 少なくとも3個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも4個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも5個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも6個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも7個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも8個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも9個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも10個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記作用が、発癌、胆汁鬱帯、肝炎、肝肥大、炎症、肝壊死、脂肪肝及びペルオキシソーム増殖からなる群から選択される、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記肝毒性が、発癌、胆汁鬱帯、肝炎、肝肥大、炎症、肝壊死、脂肪肝及びペルオキシソーム増殖からなる群から選択される少なくとも1つの肝臓疾患の病理と関連している、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞経路が、アセトアミノフェン、2−アセチルアミノフルオレン(2−AAF)、アシクロビル、ANIT、AY−25329、BI肝毒素、クロロホルム、ビカルタミド、四塩化炭素、クロロホルム、CI−1000、クロフィブラート、コルヒチン、CPA、ジクロフェナク、ジフルニサル、ジメチルニトロサミン(DMN)、ダイオキシン、17α−エチニルエストラジオール、ゲムフィブロジル、ヒドラジン、インドメタシン、LPS、メナジオン、フェノバルビタール、タクリン、チオアセタミド、バルプロ酸、Wy−14643及びジロートンからなる群から選択される毒によって調節される、請求項11に記載の方法。
- 各プローブが表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を含む、少なくとも2個のプローブのセット。
- 前記セットが少なくとも3個の遺伝子にハイブリダイズするプローブを含む、請求項23に記載のプローブのセット。
- 前記セットが少なくとも5個の遺伝子にハイブリダイズするプローブを含む、請求項23に記載のプローブのセット。
- 前記セットが少なくとも7個の遺伝子にハイブリダイズするプローブを含む、請求項23に記載のプローブのセット。
- 前記セットが少なくとも10個の遺伝子にハイブリダイズするプローブを含む、請求項23に記載のプローブのセット。
- 前記プローブが固体支持体に取り付けられている、請求項23〜27のいずれか1項に記載のプローブのセット。
- 前記固体支持体が、膜、ガラス支持体及びシリコン支持体からなる群から選択される、請求項28に記載のプローブのセット。
- 各プローブが表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を含む、少なくとも2個のプローブを含む固体支持体。
- 前記固体支持体が、1平方センチメートル当たり、少なくとも10個の異なるオリゴヌクレオチドを分離した位置に含むアレイである、請求項30記載の固体支持体。
- 前記固体支持体が、1平方センチメートル当たり、少なくとも約100個の異なるオリゴヌクレオチドを分離した位置に含むアレイである、請求項31記載の固体支持体。
- 前記固体支持体が、1平方センチメートル当たり、少なくとも約1,000個の異なるオリゴヌクレオチドを分離した位置に含むアレイである、請求項31記載の固体支持体。
- 前記固体支持体が、1平方センチメートル当たり、少なくとも約10,000個の異なるオリゴヌクレオチドを分離した位置に含むアレイである、請求項31記載の固体支持体。
- (a)肝臓毒に曝された組織又は細胞試料において、表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の少なくとも2個の遺伝子を含む遺伝子セットの発現レベルを同定する情報を含むデータベース、及び
(b)前記情報を見るためのユーザーインターフェース
を含むコンピューターシステム。 - 前記データベースが前記遺伝子の配列情報をさらに含む、請求項35に記載のコンピューターシステム。
- 前記データベースが肝臓毒に曝される前の組織又は細胞試料における前記遺伝子セットの発現レベルを同定する情報をさらに含む、請求項35に記載のコンピューターシステム。
- 前記データベースが少なくとも第二の肝臓毒に曝された組織又は細胞試料における前記遺伝子セットの発現レベルを同定する情報をさらに含む、請求項35に記載のコンピューターシステム。
- 請求項35〜38のいずれか1項に記載のコンピューターシステムであって、外部データベースからの記述的な情報を含む記録をさらに含み、当該情報は前記遺伝子を当該外部データベースの記録に関連する、コンピューターシステム。
- 前記外部データベースがGenBankである、請求項39に記載のコンピューターシステム。
- 組織又は細胞試料における表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の少なくとも1個の遺伝子の発現レベルを同定する情報を提示するために、請求項35〜38のいずれか1項に記載のコンピューターシステムを用いる方法であって、
(a)試験薬剤に曝された組織又は細胞試料における、表1〜3の中の少なくとも1個の遺伝子の発現レベルを、データベース中の遺伝子の発現レベルと比較すること
を含む方法。 - 少なくとも2個の遺伝子の発現レベルが比較される、請求項41に記載の方法。
- 少なくとも5個の遺伝子の発現レベルが比較される、請求項41に記載の方法。
- 少なくとも10個の遺伝子の発現レベルが比較される、請求項41に記載の方法。
- 組織又は細胞試料における少なくとも1個の遺伝子の発現レベルを、毒に曝されたときの発現レベルと比較して表示するステップを更に含む、請求項41に記載の方法。
- 前記既知の毒が肝臓毒である、請求項10に記載の方法。
- 前記肝臓毒が、アセトアミノフェン、2−アセチルアミノフルオレン(2−AAF)、アシクロビル、ANIT、AY−25329、BI肝毒素、クロロホルム、ビカルタミド、四塩化炭素、クロロホルム、CI−1000、クロフィブラート、コルヒチン、CPA、ジクロフェナク、ジフルニサル、ジメチルニトロサミン(DMN)、ダイオキシン、17α−エチニルエストラジオール、ゲムフィブロジル、ヒドラジン、インドメタシン、LPS、メナジオン、フェノバルビタール、タクリン、チオアセタミド、バルプロ酸、Wy−14643及びジロートンからなる群から選択される、請求項43に記載の方法。
- 表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の遺伝子のほぼすべてが検出される、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの少なくとも1つの表の中のすべての遺伝子が検出される、請求項48記載の方法。
- 前記遺伝子の遺伝子発現情報と共にパッケージされた、請求項30〜34のいずれか1項に記載の少なくとも1個の固体支持体を含むキット。
- 前記遺伝子発現情報が、肝臓毒に曝された組織又は細胞試料における遺伝子発現情報を含む、請求項50に記載のキット。
- 前記遺伝子発現情報が電子フォーマットである、請求項51のキット。
- 化合物への曝露がインビボ又はインビトロである、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現レベルが増幅アッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイによって検出される、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増幅アッセイが定量的又は半定量的PCRである、請求項54に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーションアッセイが、ノーザンブロット、ドットブロット、スロットブロット、ヌクレアーゼ保護及びマイクロアレイアッセイからなる群から選択される、請求項54に記載の方法。
- 表5B、5H、5J、5P、5R、5Y、5AA、5CC、5EE、5KK、5OO、5QQ、5YY、5AAA、5CCC、5JJJ、5QQQ及び5WWWの中の遺伝子によってコードされるタンパク質の少なくとも1つの活性を調節する薬剤を同定する方法であって、
(a)当該タンパク質を当該薬剤に曝すこと、及び
(b)当該タンパク質の少なくとも1つの活性をアッセイすること
を含む方法。 - 前記薬剤が前記タンパク質を発現している細胞に曝される、請求項57に記載の方法。
- 前記細胞が既知の毒に曝される、請求項58に記載の方法。
- 前記毒が前記タンパク質の発現を調節する、請求項59に記載の方法。
- 前記遺伝子の発現レベルが表5A〜5WWWの毒性平均及び/又は非毒性平均の値と比較される、請求項1に記載の方法。
- 前記発現レベルが比較の前に規格化される、請求項61に記載の方法。
- 前記組織又は細胞試料が肝臓組織又は肝臓細胞試料である、請求項62に記載の方法。
- (a)肝臓毒に曝された組織又は細胞試料において、表5A、5C、5D、5E、5F、5G、5I、5K、5L、5M、5N、5O、5Q、5S、5T、5U、5V、5W、5X、5Z、5BB、5DD、5FF、5GG、5HH、5II、5JJ、5LL、5MM、5NN、5PP、5RR、5SS、5TT、5UU、5VV、5WW、5XX、5ZZ、5BBB、5DDD、5EEE、5FFF、5GGG、5HHH、5III、5KKK、5LLL、5MMM、5NNN、5OOO、5PPP、5RRR、5SSS、5TTT、5UUU及び5VVVの中の実質的にすべての遺伝子を含む遺伝子セットの発現レベルを同定する情報を含むデータベース、及び
(b)前記情報を見るためのユーザーインターフェース
を含むコンピューターシステム。 - 表5A、5C、5D、5E、5F、5G、5I、5K、5L、5M、5N、5O、5Q、5S、5T、5U、5V、5W、5X、5Z、5BB、5DD、5FF、5GG、5HH、5II、5JJ、5LL、5MM、5NN、5PP、5RR、5SS、5TT、5UU、5VV、5WW、5XX、5ZZ、5BBB、5DDD、5EEE、5FFF、5GGG、5HHH、5III、5KKK、5LLL、5MMM、5NNN、5OOO、5PPP、5RRR、5SSS、5TTT、5UUU及び5VVVの中の実質的にすべての遺伝子に、個々に特異的にハイブリダイズするプローブを含むアレイ。
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