DE69406772T2

DE69406772T2 - Verfahren und diagnostische kits unter verwendung von säuger-stresspromotoren zur bestimmung der toxizität einer verbindung

Info

Publication number: DE69406772T2
Application number: DE69406772T
Authority: DE
Inventors: Spencer B Farr; Marque D Todd
Original assignee: Harvard College; Xenometrix Inc
Current assignee: Harvard College; Xenometrix Inc
Priority date: 1993-01-21
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 1998-03-12
Anticipated expiration: 2014-01-22
Also published as: EP0680517B1; DE69406772T3; JPH09503121A; CA2154265A1; ES2111289T3; DK0680517T4; EP0680517A1; JP3509100B2; AU692434B2; WO1994017208A1; CA2154265C; ATE160178T1; US5811231A; GR3026129T3; US20030219714A1; EP0680517B2; DE69406772D1; AU6124394A; DK0680517T3; HK1004920A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die Erfmdung stellt Verfahren und diagnostische Kits zur Identifizierung und Charakterisierung von toxischen Verbindungen bereit. Diese Verfahren und diagnostischen Kits messen die Transkriptions- oder Translationsrate von Genen, die mit nativen eukaryontischen Streßpromotoren, besonders von Säugern, verbunden sind. In den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren wird mindestens ein Streßpromotor von jeder der nachstehenden Kategorien verwendet: Redoxstreß, DNA-Streß, Proteinstreß und Energie-/Ionenstreß. Die Erfindung stellt ferner Verfahren und diagnostische Kits zur Identifizierung und Charakterisierung von Verbindungen bereit, die für bestimmte Organe wie Haut und Auge toxisch sind, sowie für die vorstehend beschriebenen einzelnen Stressarten. Die erfindungsgemäßen Verfahren und diagnostischen Kits liefern Informationen über die Wirkung einer Verbindung auf subzellulärer Ebene. Diese Information kann zur Entwicklung von Antitoxinen gegen nachweisbar toxische Verbindungen und zur Entwicklung von aktiven Arzneimitteln verwendet werden.

Hintergrund der Erfindung

Mindestens 55 000 Chemikalien werden gegenwärtig in den Vereinigten Staaten produziert. Mehr als 2 000 neue Chemikalien werden jedes Jahr auf dem Markt eingeführt. Sehr wenige dieser Chemikalien wurden umfassend auf eine akute oder chronische Toxizität getestet. Beispielsweise wurden weniger als 1 Prozent der im Handel erhältlichen Chemikalien einer vollständigen Gesundheitsrisikobewertung unterzogen.
Die Environmental Protection Agency ("EPA") hat das Recht, toxikologische Tests einer Chemikalie vor der kommerziellen Produktion zu verlangen, von diesem Recht wird jedoch selten Gebrauch gemacht. Weniger als 10 Prozent der neuen Chemikalien werden durch das EPA genau geprüft. Aufgrund der Kosten und einer schnellen Markteinführung verwendet das EPA häufig die Toxizität von zuvor getesteten homologen Verbindungen zur Bewertung der Toxizität einer neuen Chemikalie.
Die potentielle Toxizität von neuen Arzneimitteln wird durch die Food and Drug Administration ("FDA") überwacht. Für eine New Drug Application (NDA) verlangt die FDA üblicherweise zahlreiche Toxizitäts-, Carcinogenitäts-, Mutagenitäts- und Reproduktions-/Fertilitätstests an mindestens zwei Arten von lebenden Tieren. Diese Tests sollen bis zu einem Jahr dauern. Ein zweijahriger Toxizitätstest bei Ratten kostet etwa $800 000 [Casarett and Doull's Toxicology 4. Ausgabe, M. O. Amdur et al., Hrsg., Pergamon Press, New York, S. 37 (1991)].
Neben den Kosten zeigen Tierversuche auch Nachteile in bezug auf Dauer, Leid der Tiere und Genauigkeit. Übliche Toxizitätstests werden in drei Stadien eingeteilt: akute, kurzzeitige und langzeitige Tests. Fur akute Tests, die die LD&sub5;&sub0; einer Verbindung (die für 50% der Testtiere tödliche Dosis) ermitteln, werden etwa 60 bis 100 Tiere benötigt, und es wird eine Testreihe zur Ermittlung der LD&sub5;&sub0; und der Dosis- Wirkungskurven und zur Überwachung der klinischen Endpunkte, die nicht der Tod sind, durchgeführt. Kurzzeittests erfordern üblicherweise mindestens 24 Hunde und 90 Ratten und dauern von 90 Tage bei Ratten bis 6 bis 24 Monate bei Hunden. Körpergewicht, Nahrungsverwertung und Blut-, Urin- und Gewebeproben werden häufig in Kurzzeittests untersucht. Ferner werden tote Tiere "post-mortem" untersucht. Langzeittests ähneln Kurzzeittests, dauern jedoch 2 Jahre bei Ratten und bis zu 7 Jahre bei Hunden oder Affen.
Tierversuche gerieten in die Kritik von Tierschutzaktivisten und der breiten Öffentlichkeit, da den Tieren schlimmes Leid zugefügt wird. Ferner gibt es seit kurzem Beweise, die die Exaktheit von Tierversuchen in Frage stellen. Beispielsweise können Variable wie die Tiernahrung die Aussagefähigkeit von Tierversuchen bei der Ermittlung von carcinogenen Eigenschaften beeinträchtigen [P. H. Abelson, "Diet and Cancer in Humans and Rodents" Science 255 (1992), 141]. Frühere Untersuchungen von Dioxin-Toxizität auf der Basis von Meerschweinchentests werden nun erneut bewertet [B. J. Culliton, "US Government Orders New Look At Dioxin", Nature 352 (1991), 753, und L. Roberts, "More Pieces in the Dioxin Puzzle" Research News (Oktober 1991), 377]. Es ist daher offensichtlich, daß es einen dringenden Bedarf nach einer schnellen, kostengünstigen und verläßlichen Alternative für Toxizitätstests bei Tieren gibt.
Mehrere alternative Kurzzeittests sind verfügbar. Der Ames-Test weist beispielsweise Carcinogene nach, die eine genetische Reversion von mutanten Salmonella typhimurium-Stämmen bewirken. Der Ames-Test kann weder nicht-mutagene Carcinogene noch nicht-carcinogene Toxine nachweisen. Das im United States-Patent 4,997,757 beschriebene Hefe-Carcinogen-Testsystem überwindet einige der Nachteile des Ames-Tests, kann jedoch keine nicht-carcinogenen Toxine nachweisen. Beide Tests sind für den Nachweis von Veränderungen und Mutationen auf DNA-Ebene entwickelt worden. Daher können diese bisherigen Tests weder eine direkte Schädigung von Proteinen oder Lipidmembranen noch Inhibitoren der DNA-Synthese nachweisen. Ferner erlauben diese bisherigen Tests keine Aussage über den Wirkungsmechanismus eines Mutagens oder Toxins.
WO 90/10710 offenbart die Verwendung von TNF, IL-1α oder IL-1β, die an ein Reportergen füsioniert sind, zum Nachweis von bakteriellen Pyrogenen. Der beschriebene Test weist jedoch die Einschränkung auf, daß er nur einen bestimmten Streß (bakterielle Pyrogene) nachweist und keine qualitative Aussage über den Mechanismus der toxischen Wirkung des Pyrogens zuläßt.
Im Dokument WO-A-9401584 wird ein Testsystem offenbart, daß zur Ermittlung und Charakterisierung der Toxizität einer Verbindung ein an bakterielle Streßpromotoren füsioniertes Reportergen verwendet. Dieser Test kann eine Schädigung von Proteinen oder Lipidmembranen und eine Inhibition der DNA-Synthese nachweisen. Durch diesen Test können daher nicht-carcinogene Toxine nachgewiesen werden. Unglücklicherweise weist die Korrelation zwischen der Toxizität für Bakterien und der Toxizität für Säuger und andere höhere Eukaryonten bestimmte Einschränkungen auf und muß kein genaues Maß der Toxizität für höhere Tiere sein.
Daher bleibt ein Bedarf an einem Test, der die Zeit- und Kosteneinsparungsmerkmale des bakteriellen Streßtests aufweist, jedoch auf einer eukaryontischen Zelle beruht.

Zusammenfassung der Erfindung

Der Anmelder erfüllt dieses Bedürfnis durch Bereitstellung eines In vitro- Diagnose-Kits und -Testverfahrens, die die zelluläre und subzelluläre Wirkung eines potentiellen Toxins auf eine tierische Zelle identifizieren und charakterisieren. Diese Kits und Verfahren verwenden die nativen Streßpromotoren von eukaryontischen Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, und messen die Transkriptions- oder Translationsrate eines mit ihnen funktionell verbundenen Gens. Je nach Wahl der verwendeten Streßpromotoren können die erfindungsgemäßen Kits und Verfahren so entwickelt werden, daß sie Verbindungen, die für das ganze Tier oder für spezifische Organe dieses Tiers toxisch sind, identifizieren und charakterisieren.
In einer Ausführungsform charakterisieren die erfindungsgemäßen Kits und Verfahren die Toxizität einer Verbindung durch Ermittlung der Transkriptionsrate von verschiedenen in einer eukaryontischen Zelle vorhandenen Streßgenen. Diese Kits und Verfahren verwenden Oligonucleotide, die mindestens zu einem Teil von verschiedenen Streßgen-Messenger-RNAs komplementär oder homolog sind, für den Nachweis der Transkription dieser Gene in der Zelle. In dieser Ausführungsform ist eine einzelne Zelle effektiv ein In vivo-Diagnosereagens, mit dem festgestellt wird, welchen spezifischen Streß eine bestimmte Verbindung induziert.
In einer anderen Ausführungsform enthält jede Zelle einer Vielzahl von ähnlichen eukaryontischen Zellen einen anderen mit einem Reportergen funktionell verbundenen Streßpromotor. Durch getrennte Exposition jeder Zelle gegen eine Verbindung und Messung der Expression des Reportergenprodukts kann die Toxizität dieser Verbindung charakterisiert werden.
Die erfindungsgemäßen Kits und Verfahren werden optimal entwickelt, so daß sie die Toxizität einer Verbindung in Tagen statt in den für Tierversuche erforderlichen Monaten oder Jahren ermitteln. Ferner werden diese Ergebnisse mit den erfindungsgemäßen Kits bei einen Bruchteil der Kosten von Tierversuchen und ohne die unerwünschten Konsequenzen für lebende Tiere erhalten. Die erfindungsgemäßen diagnostischen Kits und Verfahren liefern direkte Informationen über die Wirkungsweise des Toxins auf Säugerzellen -- im Gegensatz zu auf dem Fachgebiet bekannten Kurzzeittests.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt die relative Expression der Chloramphenicolacetyltransferase unter der Kontrolle von verschiedenen Streßpromotoren in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen von Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD).
Figur 2 zeigt die relative Expression der Chloramphenicolacetyltransferase unter der Kontrolle von verschiedenen Streßpromotoren in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen von 3-Methylcholanthren (3-MC).
Figur 3 zeigt die relative Expression der Chloramphenicolacetyltransferase unter der Kontrolle von verschiedenen Streßpromotoren in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen von Benzo[a]pyren.
Figur 4 zeigt die relative Expression der Chloramphenicolacetyltransferase unter der Kontrolle von verschiedenen Streßpromotoren in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen von Cadmiumsulfat.
Figur 5 zeigt die relative Expression der Chloramphenicolacetyltransferase unter der Kontrolle von verschiedenen Streßpromotoren in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen von Dimethylsulfoxid (DMSO).
Figur 6 zeigt die relative Expression der Chloramphenicolacetyltransferase unter der Kontrolle von verschiedenen Streßpromotoren in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen von Ethanol.
Figur 7 zeigt die relative Expression der Chloramphenicolacetyltransferase unter der Kontrolle von verschiedenen Streßpromotoren in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen von Methapyrilenhydrochlorid.
Figur 8 zeigt die relative Expression der Chloramphenicolacetyltransferase unter der Kontrolle von verschiedenen Streßpromotoren in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen von Methylmethansulfonsäure (MMS).
Figur 9 zeigt die relative Expression der Chloramphenicolacetyltransferase unter der Kontrolle von verschiedenen Streßpromotoren in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen von Natriumarsenat.
Figur 10 zeigt die relative Expression der Chloramphenicolacetyltransferase unter der Kontrolle von verschiedenen Streßpromotoren in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen von Phorbol-12-acetat-13-myristat (PMA).
Figur 11 zeigt die relative Expression der Chloramphenicolacetyltransferase unter der Kontrolle von verschiedenen Streßpromotoren in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen von Retinsäure.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Wie hier verwendet, werden die Begriffe "Streß" und "Toxizität" austauschbar verwendet und bezeichnen die Störung der biochemischen und biophysikalischen Homöostasie der Zelle.
Der Begriff "Redoxstreß", wie hier in der Anmeldung verwendet, meint Bedingungen, die vom normalen Reduktions/Oxidationspotential ("Redox ")-Zustand der Zelle abweichen. Redoxstreß schließt erhöhte Mengen von Superoxid-Radikalen, erhöhte Mengen von Peroxiden -- sowohl Wasserstoffperoxid als auch organische Peroxide --, verringerte Mengen von Glutathion und alle anderen das Redoxpotential der Zelle verändernden Bedingungen wie die Exposition gegen starke Reduktionsmittel, einige aromatische Kohlenwasserstoffe, elektrophile Verbindungen, Aldehyde, intrazelluläre Thiole, Steroide, Methylcholanthren, Phenobarbital und CCl&sub4; ein. Der Begriff schließt alle weiteren eine Proliferation von Peroxisomen bewirkenden Bedingungen ein.
Der Begriff "DNA-Streß", wie durchgehend in der Anmeldung verwendet, meint Veränderungen der Desoxyribonucleinsäure oder der Vorläufernucleotide. DNA- Streß schließt beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung darauf, DNA-Strangbrüche, eine DNA-Strangvernetzung, Exposition gegen in DNA interkalierende Stoffe, sowohl eine stärker als auch eine geringer ausgeprägte Superhelixbildung, eine oxidative DNA- Schädigung, DNA-Alkylierung, Oxidation von Nucleosidtriphosphaten und Alkylierung von Nucleosidtriphosphaten ein. Der Begriff schließt ferner eine Inhibition der DNA- Synthese und -Replikation und eine Inhibition von Mitose oder Meiose ein. Der Begriff schließt ferner Bedingungen ein, die durch Exposition gegen Wachstumsfaktoren, Interferone, Tumorpromotoren, Tumornekrosefaktor, Phorbolester, hydrophobe cytotoxische Wirkstoffe, entzündungsverursachende Stoffe, Mitogene, Carcinogene, Röntgenstrahlen, UV-Strahlung und Dimethylnitrosamine bewirkt werden.
Der Begriff "Proteinstreß", wie er durchgehend in der Anmeldung verwendet wird, meint Veränderungen von Proteinen oder einzelnen Aminosäuren und eine Inhibition von Enzymfunktionen sowie Störungen des intrazellulären Proteintransports. Der Begriff schließt, jedoch ohne Beschränkung darauf, eine Denaturierung von Proteinen, Fehlfaltung von Proteinen, Chelatbildung von Proteincofaktoren, Vernetzung von Proteinen, sowohl eine Sauerstoff-abhängige als auch -unabhängige Oxidation von inter- und intra-Ketten-Bindungen wie Disulfidbindungen, Alkylierung von Proteinen, Oxidation von einzelnen Aminosäuren und eine durch Exposition gegen Schwermetalle wie Cadmium und Hitze verursachte Proteinschädigung ein.
Der Begriff "Energie-/Ionenstreß" meint Bedingungen, die die ATP-Mengen in der Zelle oder die Ionengradienten über eine Zellmembran beeinflussen. Beispiele für Energiestreß sind ein erzwungener anaerober Metabolismus in Gegenwart von Sauerstoff, Störungen des Elektronentransports, Exposition gegen Entkupplungsmittel, Membrandepolarisation, osmotischer Schock, Exposition gegen Ionen wie Ca²&spplus;, Exposition gegen große Mengen von cAMP und Exposition gegen Ethanol.
Der Begriff "Zelloberflächenrezeptor-vermittelter Streß" meint die Bedingungen, die die Transkriptionsrate von Genen verändern, deren Expression durch Interaktion eines Zelloberflächenrezeptors mit einem Liganden reguliert wird. Beispiele für einen solchen Streß sind die Exposition der Haut, Augen oder Schleimhäute gegen Reizstoffe, Allergene oder Entzündungen bewirkende Stoffe.
Der Begriff "Streßpromotorinduktion" meint Bedingungen, die die Expressionsrate eines Gens erhöhen, das mit einem nativen Streßpromotor oder einem rekombinant erhältlichen, ein Response-Element enthaltenden Streßpromotor funktionell verbunden ist. Der Begriff "funktionelle Verbindung", "funktionell verbunden" oder "operabel verbunden" meint die Positionierung des Promotors relativ zum Gen, so daß die Transkription des Gens durch den Promotor reguliert wird. Der Begriff umfaßt sowohl rekombinante Konstrukte sowie die Struktur eines natürlich vorkommenden Promotors und seines assoziierten Gens.
Der Begriff "Bestimmung und Charakterisierung der Toxizität einer Verbindung" schließt die Identifizierung einer Verbindung als Toxin und die Aufklärung ihres Wirkungsmechanismus innerhalb der Zelle ein.
Der Begriff "Nucleinsäuresequenzen", wie in der Anmeldung verwendet, schließt RNA, einzel- oder doppelsträngige cDNA oder Teile davon, einzel- oder doppelsträngige genomische DNA oder Teile davon oder einzel- oder doppelsträngige synthetische Oligonucleotide ein.
Wahrend jedes Gen durch einen einzigen Promotor kontrolliert wird, enthalten Gene, die auf identische Stressarten antworten, ein gemeinsames Response-Element innerhalb ihrer Promotoren. Daher ist das gleiche Response-Element fur die Induktion der Expression einer Genfamilie nach der Exposition gegen einen bestimmten Streß verantwortlich. Bei der Isolierung und funktionellen Verbindung mit einem Minimalpromotor und einem Strukturgen funktioniert das erhaltene Konstrukt wie ein Streßpromotor. Dies ist beim Zerlegen eines auf mehrere Stressarten antwortenden nativen Streßpromotors in seine Bestandteile besonders nützlich.
Einzelne Zellen antworten auf toxische Stimuli teilweise durch Aktivierung von spezifischen Genen, deren Proteinprodukte die Stimuli entgiften oder durch sie verursachten Schaden reparieren. Eukaryontische Zellen besitzen eine große Zahl von genetischen und biochemischen Antworten auf eine Schädigung oder Streß. Mindestens 50 verschiedene Säuger-Streßgene wurden bereits isoliert und charakterisiert. Diese Gene werden durch eine Vielzahl von chemischen und physikalischen Stressarten oder zellulären Schäden induziert.
Zu den chemischen Stressarten, die ein oder mehrere dieser identifizierten Gene induzieren, gehört die Exposition der Zelle gegen Quecksilber, Schwermetalle, Nitroxide, aromatische Kohlenwasserstoffe, Säuren, Basen, Alkylierungsmittel, Peroxidierungsmittel, Vernetzungsmittel, Ionophore, redoxaktive Mittel, elektrophile Verbindungen, zu Entzündungen führende Mittel, hydrophobe cytotoxische Wirkstoffe, Ethanol, Steroide, Entkupplungsmittel, Tumorpromotoren und zelluläre Faktoren wie der Tumornekrosefaktor, Wachstumsfaktoren und Interferon. Physikalische Stressarten schließen eine Exposition gegen UV-Strahlung, Hitze oder Röntgenstrahlen ein.
Beispiele für einen zellulären Schaden, der diese identifizierten Gene induziert, sind die Lipidoxidation, Peroxisomenproliferation, DNA-Strangbrüche, DNA- Alkylierung, DNA-Vernetzung, DNA-Oxidation, osmotisches Ungleichgewicht, Proteinoxidation, Fehlfaltung von Proteinen, Proteinalkylierung, ATP-Mangel, Membranpermeabilisierung, Glutathionmangel und Veränderungen der Signaltransduktion. Es wird angenommen, daß es noch viel mehr Streßgene gibt. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser anderen Streßgene ist für das Verständnis der Wirkung von verschiedenen chemischen Stressarten auf die Zelle sehr wünschenswert.
Die vorliegende Erfindung stellt diagnostische Kits und Verfahren zur Ermittlung und Charakterisierung der Toxizität einer Verbindung in bezug auf die Art des in der Zelle verursachten Schadens, d. h. DNA-Schädigung, Proteinschädigung, Redoxschaden, Energieschaden, ionischer Schaden etc., bereit. Gemäß einer Ausführungsform umfaßt jeder erfindungsgemäße diagnostische Kit eine Reihe von eukaryontischen Zellen, von denen jede mindestens einen Promotor oder ein Promotorelement, der (das) auf Streß antwortet, enthält. Das Spektrum von Zellen, in toto, muß mindestens einen Promotor oder ein Promotorelement, der (das) auf jeden der vorstehend beschriebenen Streßarten antwortet -- Redox-, DNA-, Protein- und Energie- /Ionenstreß -- und mit einem ein nachweisbares Produkt codierenden Gen funktionell verbunden ist.
Gemäß einer Ausführungsform ist das Spektrum von Zellen in diesem Kit sogar eine einzelne Zellinie, in der jede Zelle alle verschiedenen Streßpromotorarten enthält und jeder dieser Promotoren nach einer Exposition gegen den geeigneten Streß aktiviert wird. In dieser Ausführungsform sind die mit den Streßpromotoren funktionell verbundenen Gene am meisten bevorzugt die nativen Streßgene. In dieser Weise muß keine genetische Manipulation der Zellen vor der Durchführung eines Tests erfolgen. In dieser bevorzugten Ausführungsform umfassen die Kits ferner Oligonucleotide oder cDNAs, die mindestens zu einem Teil des codierenden oder nicht-codierenden Strangs der Gene unter der Kontrolle der spezifischen Streßpromotoren komplementär sind. Die Oligonucleotide werden zum Nachweis und zur Quantifizierung der mRNA-Transkripte dieser Gene oder der cDNA-Komplemente davon verwendet, wobei eines davon das nachweisbare Produkt in dieser Ausführungsform sein kann.
Es sollte beachtet werden, daß, obwohl alle eukaryontischen Zellen zahlreiche Streßpromotoren in ihrem Genom enthalten, einige dieser Promotoren nach einer Exposition gegen den geeigneten Streß aktivierbar oder nicht aktivierbar sein können.
Dies gilt besonders fur höhere Eukaryonten wie Säuger. Die Zellinien, deren Streßpromotoren auffast alle geeigneten Stressarten antworten, werden in den erfindungsgemäßen Kits bevorzugt. Diese schließen primäres Gewebe von Leber, Herz, Lunge, Niere, Gehirn oder einem anderen Organ von Säugern sowie von Säugern stammende Zellinien ein, die aus diesen von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) erhältlichen Geweben etabliert wurden. Stärker bevorzugt sind HepG2-Zellen, HeLa-Zellen und WIL-2-Zellen. Am meisten bevorzugt sind HepG2- Zellen.
Die in den vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen diagnostischen Kits und Verfahren verwendeten Oligonucleotide werden nach ihrer Fähigkeit zur spezifischen Hybridisierung unter Bedingungen einer relativ hohen Stringenz an entweder das Transkriptionsprodukt des mit den verschiedenen Streßpromotoren funktionell verbundenen Gens oder sein Komplement (d. h. eine von dieser mRNA durch reverse Transkription erhaltene einzelsträngige cDNA) ausgewählt. Die Wahl der Verwendung von komplementären oder homologen Oligonucleotiden hängt von dem zum Nachweis der Transkriptionsprodukte verwendeten Verfahren ab. Diese verschiedenen Verfahren werden nachstehend in der Anmeldung beschrieben.
Da die DNA-Sequenzen von vielen Säuger-Streßgenen bekannt ist, können hybridisierende Oligonucleotide leicht hergestellt werden. Es sollte beachtet werden, daß eine 100%ige Homologie oder Komplementarität zwischen dem Oligonucleotid und der Streßgen-mRNA nicht erforderlich ist. Dies ist so, da das Oligonucleotid auf der Basis der Sequenz eines Streßgens von einer Art, die sich von der Quelle der in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren verwendeten Zellen unterscheidet, entwickelt werden kann.
Während erwartet wird, daß ähnliche Streßgene von verschiedenen Säugerarten eng verwandt sind, weisen die Transkripte dieser Gene höchst wahrscheinlich keine identischen Nucleotidsequenzen auf. Daher sind die in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren verwendeten Oligonucleotide vorzugsweise zu mindestens 95% homolog oder komplementär. Die Oligonucleotide sind vorzugsweise zwischen 20 und 500 Basenpaare lang. Am meisten bevorzugt sind die Oligonucleotide mit einer Länge zwischen 50 und 100 Basenpaaren.
Stärker bevorzugt werden die Oligonucleotide unter Verwendung eines Oligonucleotid-Synthesegeräts synthetisiert, und gegebenenfalls wird anschließend eine Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. In diesem Verfahren wird ein Oligonucleotid mit einer Sequenz, die entweder mit einem Teil des Matrizenstrangs oder des nicht-codierenden Strangs identisch ist und innerhalb des codierenden Bereichs eines bekannten sequenzierten Streßgens liegt, synthetisiert. Bei Verwendung der PCR zur Erhöhung der Menge an Oligonucleotid wird das Oligonucleotid mit zusätzlichen 6 bis 12 Nucleotiden an jedem Ende synthetisiert. Diese zusätzlichen Nucleotide dienen als Ziele für komplementäre Primer in einer PCR-Reaktion. Vorzugsweise sind die zusätzlichen Nucleotide an jedem Ende zueinander komplementär. Daher kann ein einziger Primer sowohl am ursprünglichen Oligonucleotid als auch am PCR-Produkt davon als Primer dienen. Die zusätzlichen Nucleotide an jedem Ende sind am meisten bevorzugt komplementäre Homohexamere, d. h. AAAAAA an einem Ende und TTTTTT am anderen Ende.
Während der PCR werden vorzugsweise ein oder mehrere markierte Nucleotide in die Polymerasereaktion eingeschlossen. Vorzugsweise ist der Marker ³²P, Biotin oder ein fluoreszierender Marker. So wird ein markiertes Produkt erhalten, das direkt zum Nachweis der Menge an Transkriptionsprodukt verwendet werden kann. Der Vorteil dieses gemischten Oligonucleotid-Synthesegerätlpcr-Verfahrens ist, daß Mikrogrammengen von markiertem Oligonucleotid in einem einzigen Verfahren produziert werden können. Die erhaltenen Oligonucleotide können gegebenenfalls nach der Synthese und Reinigung biotinyliert werden.
Bei der Verwendung des Oligonucleotids zum Nachweis von reversen cDNA- Transkripten des Transkriptionsprodukts wird es vorgezogen, keinen Marker zu verwenden. In dieser Ausführungsform wird es vorgezogen, daß der Marker in die cDNA statt in das Oligonucleotid eingeschlossen wird.
Die Entwicklung von geeigneten Oligonucleotidsonden zur Verwendung in den erfindungsgemaßen Kits und Verfahren ist relativ einfach. Natürlich sollen sie eine hohe Sequenzähnlichkeit oder -komplementarität mit oder zu der Streßgen-mRNA, mit der sie hybridisieren sollen, aufweisen. Die Oligonucleotide in jedem einzelnen Kit sollten auch etwa die gleiche Schmelztemperatur (Tm) aufweisen, so daß eine einzige Erwärmungsvorrichtung (wie ein Wasserbad) bei der Durchführung der Hybridisierungs- und anschließenden Waschschritte verwendet werden kann. Die Oligonucleotide sollen vorzugsweise einen Tm von mehr als 70ºC in 0,2 x SSC aufweisen. Zur Ermittlung, welche Teile der codierenden Bereiche des Streßgens zur Entwicklung von Oligonucleotidsonden verwendet werden können, kann ein im Handel erhältliches Computerprogramm wie OLIGO (National Biosciences, Plymouth, MN) verwendet werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthält jede Zelle eines Spektrums von eukaryontischen Zellen im erfindungsgemäßen diagnostischen Kit einen Streßpromotor oder ein Streß-Response-Element, der (das) mit einem ein nachweisbares Produkt codierenden heterologen Gen funktionell verbunden ist. In dieser Ausführungsform wird die Verbindung des gleichen heterologen Gens mit verschiedenen Streßpromotoren oder Response-Elementen im Kit vorgezogen. So muß nur ein einziger Test zum Nachweis der Induktion von jedem beliebigen der Streßpromotoren und Streß- Response-Elemente durchgeführt werden. Es wird ferner bevorzugt, daß jede Zelle im Kit nur ein einziges Konstrukt aus einem Streßpromotor oder Response-Element mit einem heterologen Gen enthält. Daher kann die Expression des nachweisbaren Produkts in jeder beliebigen gegebenen Zelle in dem Kit mit der Induktion eines einzelnen Streßpromotors oder Response-Elements spezifisch in Zusammenhang gebracht werden.
Die erfindungsgemäßen diagnostischen Kits und Verfahren verwenden ein Spektrum von eukaryontischen Zellen, die in toto Promotoren und Response-Elemente umfassen, die sowohl auf Redoxstreß, DNA-Streß, Proteinstreß als auch Energiestreß antworten. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Promotoren und Response-Elemente zur Verwendung bei Säugerzellen sind nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Bevorzugte Säuger-Streßpromotoren
Die Promotoren oder Response-Elemente, die in den erfindungsgemäßen Verfahren und Kits auf Redoxstreß antworten, werden vorzugsweise von den Promotoren der CYP1A1-, GST Ya-, JUN-, ALDH1- und HMO-Gene und den XRE-, NFkBRE-, PPRE-, RARE, ERE- und ThRE-Response-Elementen ausgewählt.
Das CYP1A1-Gen codiert Cytochrom P450 1A1, ein Enzym, das am Metabolismus von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen wie Benzo(a)pyren beteiligt ist. Das Gen kann durch aromatische Kohlenwasserstoffe, Pflanzen-Flavone und auch durch Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD), einem der potentesten Teratogene und Tumorpromotoren, induziert werden [L. A. Neuhold et al., Mol. Cell. Biol. 9 (1989), 2378-2386, Y. Fujii-Kuriyama et al., The FASEB J. 6 (1992), 706-710, D. W. Nebert et al., Env. Health Perspec. (1990), 13-25, R. A. Dixon et al., Biol. Rev. 61 (1986), 239-241). Die Sequenz dieses Gens wird von K. Sogawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986), 8044-8048, beschrieben.
Das GST Ya-Gen codiert die Glutathion S-Transferase-Ya-Untereinheit, einem einmaligen xenobiotischen Response-Element. Der Redoxstreß-empfindliche Teil des GST-Ya-Promotors wird durch elektrophile Herbizide, Insektizide und planare aromatische Kohlenwasserstoffe wie β-Naphthoflavon und 3-Methylcholanthren stark induziert [T. H. Rushmore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 3826-3830]. Die Sequenz dieses Gens wird von T. H. Rushmore et al., a.a.O., beschrieben.
Das JUN-Oncogen codiert c-jun, das an der Bildung des AP-1-Komplexes - einem transkriptionellen Aktivator - beteiligt ist. Die das JUN-Gen aktivierenden Redoxstressarten sind Superoxidradikale und UVA-Strahlung. Die Sequenz dieses Gens wird von R. De Groot et al., EMBO J. 10 (1991), 2523-2532, beschrieben.
Das ALDH 2-Gen codiert die Aldehyddehydrogenase und wird durch Aldehyde und Peroxisomen-Proliferatoren induziert [D. W. Nebert, Env. Health Persp. 88 (1990), 13-25). Die Sequenz dieses Gens wird von L. C. Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 3771-3775, beschrieben.
Das HMO-Gen codiert die Hämoxygenase. Der Promotor wird durch die nachstehenden Redoxstressarten induziert: oxidativer Streß, Wasserstoffperoxid und Natriumarsenit [S. T. Keyse und R. M. Tyrell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 99-103). Die Sequenz dieses Gens wird in diesem Dokument beschrieben.
Das XRE ist ein Redoxstreß-Response-Element. Es antwortet auf Xenobiotika wie aromatische Kohlenwasserstoffe [T. H. Rushmore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 3826-3830). Die Sequenz dieses Response-Elements wird in diesem Dokument beschrieben.
NFkBRE ist ein Redoxstreß-Response-Element, das einen durch intrazelluläre Thiole aktivierten Transkriptionsfaktor codiert [R. Schreck et al., EMBO J. 10 (1991), 2247-2258, und B. Nelson et al., Molec. Cell. Biol. 8 (1988), 3526-3531]. Es antwortet auch auf DNA-Streß. Die Sequenz dieses Response-Elements wird von K. Leung und G. J. Nabel, Nature 333 (1988), 776-778, beschrieben.
PPRE ist das Peroxisomen-Proliferations-Response-Element. Es ist ein Redoxstreß-Response-Element, das durch Peroxisomen-Proliferatoren induziert wird [C. Dreyer et al., Cell 68 (1992), 879-887]. Die Sequenz dieses Response-Elements wird in diesem Dokument beschrieben.
RARE ist das Retinsäure-Response-Element. Es ist ein Redoxstreß-empfindliches Response-Element, das auf das Steroidhormon Retinsäure und seine Analogen antwortet [H. de The et al., Nature 343 (1990), 177-180].
ERE ist das Östrogen-Response-Element. Es antwortet auf Redoxstreß, der durch Östrogenverbindungen induziert wird. Die Sequenz des ERE wird von V. Kumar et al., Cell 55 (1988), 145-156, beschrieben.
THRE ist das Thyroidhormon-Response-Element. Es antwortet auf Redoxstreß, der durch Thyroidhormone und seine Analoge induziert wird. Die Sequenz des THRE wird von M. Beato, Cell 56 (1989), 335-344, beschrieben.
Weitere Promotoren und Response-Elemente, die auf Redoxstreß antworten und in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren verwendet werden können, können aus der nachstehenden Tabelle 2 ausgewählt werden. In der nachstehenden kurzen Beschreibung jedes dieser Gene und Response-Elemente ist das die DNA-Sequenz des jeweiligen Gens beschreibende Dokument in Klammem angegeben.
UGT codiert eine UDP-Glucuronosyltransferase und seine Redoxantwort wird durch 3-Methylcholanthren induziert [T. Iyanagi et al., J. Biol. Chem. 261(1986), 15607-14]. CYP11B2 codiert ein Cytochrom P450, dessen Redoxantwort durch Steroide induziert wird [T. Kawamoto et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992), 1458-62]. Cu.ZnSOD codiert eine Superoxid-Dismutase, die durch Kupfer- und Zink-katalysierte Superoxid-Bildung induziert wird [E. Danciger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 3619-23]. Das MnSOD-Gen codiert eine Superoxid-Dismutase, das durch den Tumor-Nekrosefaktor, Interleukin-2 und Lipopolysaccharide aktiviert werden kann [M. K. St. Clair und J. C. Holland, Cancer Res. 51 (1991), 939-943]. ADPRT codiert eine Ribosyltransferase und wird durch oxidativen Stress induziert. GP codiert die Glutathionperoxidase und seine Redoxantwort wird durch Peroxide induziert [S. Chada, Genomies 6 (1990), 268-711. FAOxase codiert die Fettsäure-Acyl-CoA-Oxidase und wird durch Peroxisomen-Proliferatoren induziert [S. Miyazawa et al., J. Biol. Chem. 262 (1987), 8131-37]. PBE codiert ein bifunktionelles peroxisomales Enoyl-CoA- Hydratase/3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase-Enzym und wird durch Peroxisomen- Proliferatoren induziert [J. K. Reddy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 1747-51]. PPAR codiert einen durch Peroxisomen-Proliferatoren aktivierten Rezeptor und wird durch Peroxisomen-Proliferatoren induziert [C. Dreyer et al., Cell 68 (1992), 879-87]. EH codiert eine Epoxidhydrolase, die auf durch Phenobarbital verursachten Redoxstreß antwortet. [R. K. Skoda et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 1549-54]. CYP2B2 [J. S. Miles et al., Nucl. Acids Res., 16 (1988), 5783-95], CYP2E1 [J. E. Freeman et al., Biochem. J. 28 (1992), 689-95] und CYP3A3 [N. K. Spurr et al., GenBank-Hinterlegungsnummer X12387] codieren drei verschiedene Cytochrom P450- Enzyme. Sie antworten auf Redoxstreß, der durch Phenobarbital (2B2), CCl&sub4; (2E1) bzw. Aflatoxin, Cyclosporin, Testosteron und Nifedipin (3A3) bewirkt wird. Das P450b-Gen codiert das Cytochrom P450b, das durch Phenobarbital induziert wird [C. M. Giachelli et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 7046-7053]. Das P450d-Gen codiert Cytochrom P450d, das durch polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe, Isosafrol und 3-Amino-1-5H-pyrido[4,3-b]indol (Trp-P-2) induziert wird [K. Sogawa et al., J. Biol. Chem. 260 (1985), 5026-5032]. PPA codiert eine poly(ADP-Ribose)-Polymerase und weist einen Redoxstreß-empfindlichen Bestandteil auf, der auf eine Lipidperoxidation und oxidativen Streß antwortet [K. Uchida et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 148 (1987), 617-22]. PKC codiert die Proteinkinase C und ihr Redoxstreßempfindlicher Bestandteil wird durch Lipid-Peroxidation induziert. ALDH1 codiert eine weitere Aldehyddehydrogenase, die durch Aldehyde und Peroxisomen-Proliferatoren induziert wird [L. C. Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 3771-75]. Das NMO1-Gen codiert die NAD(P)H-Menadionoxidoreductase und wird durch verschiedene Xenobiotika wie planare aromatische Verbindungen, Azofarbstoffe und phenolische Antioxidantien induziert [L. V. Favreau und C. B. Pickett, J. Biol. Chem. 266 (1991), 4556-4561]. Das GST2-Gen codiert die Glutathion S-Transferase-2 und antwortet auf ähnliche Redoxstressarten wie GST Ya [P. G. Board et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2377-81]. Das GAPDH-Gen codiert die Glycerinaldehyd-3- Phosphat-Dehydrogenase [L. Ercolani et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 15335-41]. Das NQO-Gen codiert die NAD(P)H-Chinon-Oxidoreductase und antwortet auf die gleichen Redoxstressarten wie NMO [A. K. Jaiswal, Biochemistry 30 (1991), 10647-53].
Die auf DNA-Streß antwortenden Promotoren und Response-Elemente, die in den erfindungsgemäßen Verfahren und Kits verwendet werden können, werden vorzugsweise von den Promotoren der GST Ya-, GADD45-, JUN-, FOS-, XHF- und GADD153-Gene und den TRE- und p53RE-Response-Elementen ausgewählt.
Das GST Ya-Gen wird vorstehend beschrieben. Sein DNA-Streß-empfindlicher Bestandteil wird durch alkylierte DNA induziert.
Das GADD45-Gen codiert ein Wachstumsstillstands- und auf eine DNA- Schädigung antwortendes Response-Protein. Das GADD45-Gen wird durch UV- Strahlen, Röntgenstrahlen und das DNA-schädigende Mittel Methylmethansulfonat (MMS) induziert. Dieses Gen wird von Q. Zhan et al., Mol. Cell Biol. 13 (1993), 4242-50, beschrieben.
Das JUN-Gen weist einen DNA-Streß-empfindlichen Bestandteil auf, der durch UVA-Strahlen, Tumorpromotoren und Wachstumsfaktoren induziert wird.
Das FOS-Gen codiert das Onkogen c-fos. Die DNA-Streß-empfindlichen Bestandteile seines Promotors werden durch Tumorpromotoren und Wachstumsfaktoren induziert [E. M. Haliday, EMBO J. 10 (1991), 109-115]. Die Sequenz dieses Gens wird von F. van Straaten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 3183-3187, beschrieben.
Das XHF-Gen codiert die Collagenase und wird durch Mitogenese, zu Entzündungen führende Mittel, UV-Strahlen und ferner als Antwort auf den Tumorpromotor 12-O-Tetradecanoyl-phorbol-13-acetat (TPA) aktiviert. Die Sequenz dieses Gens wird von P. Angel et al., Mol. Cell Biol. 7 (1987), 2256-2266, beschrieben.
Das GADD153-Gen wird als Antwort auf Wachtums-blockierende Signale und DNA-schädigende Mittel exprimiert [J. D. Luethy und N. J. Holbroock, Cancer Res. 52 (1992), 5-10]. Die Sequenz dieses Gens wird von A. J. Fornace et al., Mol. Cell Biol. 9 (1989), 4196-4203, beschrieben.
TRE ist das TPA-Response-Element. Es antwortet auf durch Phorbolester induzierten DNA-Streß. Die Sequenz von TRE wird von P. Angel et al., Cell 55 (1988), 875-85, beschrieben.
p53RE ist das p53-Response-Blement. Es antwortet auch auf DNA-Streß und wird durch Röntgenstrahlen und MMS induziert. Die Sequenz des p53RE wird von Q. Zahn et al., Mol. Cell Biol. 13 (1993), 4242-4250, beschrieben.
Weitere Promotoren, die auf DNA-Streß antworten und in den erfindungsgemäßen Verfahren und Kits verwendet werden können, sind nachstehend in Tabelle 2 aufgelistet. In der folgenden kurzen Beschreibung aller dieser Gene wird das die DNA- Sequenz des bestimmten Gens beschreibende Dokument in Klammern angegeben.
Das EGR-1-Gen codiert einen frühen Wachstums-Response-Faktor und wird durch Mitogenese und Phosphatase-Inhibitoren induziert [S. V. Suggs, Nucl. Acids Res. 18 (1990), 4283-89]. Das GAS 2,3-Gen ist ein auf Wachstumsstillstand antwortendes Gen [C. Schneider et al., Cell 54 (1988), 787-793]. Das MGMT codiert eine O-6- Methylguaninmethyltransferase und wird durch alkylierte DNA induziert [K. Tano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 686-90]. DNA-Pol codiert die DNA- Polymerase A und wird durch Mitogene induziert. TK (das die Thymidinkinase codiert) [H. D. Bradshaw Jr. et al., Mol. Cell Biol. 4 (1984), 2316-20], DHFR (das die Dihydrofolatreduktase codiert) [C. Morandi, J. Mol. Biol. 156 (1982), 583-607] und PCNA (das das Kernantigen von proliferienden Zellen codiert) [D. Jaskulski et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 10175-79] werden jeweils durch Zellproliferation induziert. PGHS codiert die Prostaglandin-Endoperoxidasesynthase und wird durch Mitogene induziert [S. A. Kraemer et al., Arch. Biochem. Biophys. 293 (1992), 391-400]. LOX codiert eine 5/12-Lipoxygenase und wird durch Exposition gegen den Tumornekrosefaktor aktiviert [P. A. Dixon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 416-20]. ISG15, das ein Interferon-stimuliertes Gen ist, wird durch α-Interferon induziert [N. Reich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 6394-98]. 2'-5' AS, das die 2'-5'-Oligoadenylatsynthetase codiert, wird durch β-Interferon induziert [M. Waithelet et al., FEBS Lett. 196 (1986), 113-20]; das vorstehend beschriebene EH enthält einen DNA-Streß-empfindlichen Bestandteil, der durch Carcinogene aktiviert wird. CYP2E1 enthält ein auf Dimethylnitrosamin antwortendes DNA-Streß-empfindliches Element. TPO1 und TPO2 codieren Topoisomerasen und werden durch DNA- Strangbrüche und Stoffe, die eine Promotorrekombination bewirken, induziert [P. D'arpa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 2543-47, und M. Tsai-Pflufelder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 7177-81]. Das vorstehend ebenfalls beschriebene PPA antwortet auf durch einen DNA-Schaden verursachten DNA-Streß. DRA codiert HLA Klasse II-Antigene und wird durch Interferon gamma induziert [A. J. Korman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 6013-17, und D. A. Shackelford et al., Immunol. Rev. 66 (1982), 133-187]. Der vorstehend beschriebene MnSOD- Promotor enthält ferner ein auf DNA-Streß antwortendes Element, das durch den Tumor-Nekrose-Faktor induziert wird. Das MDR-1-Gen codiert ein Protein, das eine Resistenz gegen mehrere Wirkstoffe verleiht und im wesentlichen durch hydrophobe cytotoxische Wirkstoffe induziert wird [J. A. Silverman et al., Gene 106 (1991), 229- 236]. Das beta-pol-Gen codiert das DNA-Reparaturenzym DNA-Polymerase-beta und antwortet auf N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), Mechlorethaminhydrochlond (HN2) und cis-Platinum(II)diamindichlorid (cis-Pt) [S. G. Widen et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 16992-98]. Das Stromelysin-1-Gen codiert ein Protein, das durch Phorbolester wie PMA induziert wird [K. L. Simm et al., Biochemistry 28 (1989), 8691-98]. Das PCNA-Gen codiert das Kernantigen von proliferierenden Zellen, das durch Tumorpromotoren induziert wird [S. Travali et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 7466-72].
Auf Proteinstreß antwortende Promotoren, die in den erfindungsgemäßen Verfahren und Kits verwendet werden können, werden vorzugsweise von GRP78, JUN, FOS, HSP70 und MTIIA ausgewählt.
Das GRP78-Gen codiert ein 78 kD-Protein, das ein Hauptbestandteil des endoplasmatischen Retikulums ist. GRP78 wird durch falsch gefaltete Proteine und die Glykosylierungshindernisse induziert [S. K. Wooden et al., Mol. Cell Biol. 11 (1991), 5612-23). Die Sequenz dieses Gens wird von E. Resendez et al., Mol. Cell Biol. 5 (1985), 1212-19, beschrieben.
Die vorstehend beschriebenen JUN- und FOS-Gene enthalten beide auf Proteinstreß antwortende Elemente, die durch Hitze induziert werden.
Das HSP70-Gen codiert das Hitzeschockprotein 70 und wird durch Hitze, denaturierte Proteine, Aminosäureanaloge, Schwermetalle, Anoxien und Inhibitoren des Energie-Metabolismus induziert [D. D. Mosser et al., Mol. Cell Biol. 8 (1988), 4736- 44]. Die Sequenz dieses Gens wird von C. Hunt und R. I. Morimoto, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 6455-59, beschrieben.
MT IIA, das Metallothionin IIA codiert, wird durch Schwermetalle und Glucocorticoide induziert [M. Karin et al., Nature 299 (1982), 797-802). Die Sequenz dieses Gens wird im vorstehenden Dokument beschrieben.
Weitere Promotoren, die in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren zum Nachweis von Proteinstreß verwendet werden können, können von den nachstehend in Tabelle 2 aufgeführten Promotoren, die auf Proteinstreß antworten, ausgewählt werden.
In der nachstehenden kurzen Beschreibung jedes dieser Gene wird das die DNA-Sequenz der jeweiligen Gene beschreibende Dokument in Klammem angegeben.
MT 1A und [R. I. Richards et al., Cell 37 (1984), 263-72] und MT III [R. D. Palmitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 6333-37] codieren jeweils ein Metallothionin-Gen, das durch das Schwermetall Cadmium induziert wird. GP enthält ein Element, das auf das Protein-schädigende Schwermetall Selen antwortet.
Die bevorzugten auf Energie-/Ionenstreß antwortenden Promotoren und Response-Elemente in den erfindungsgemäßen Verfahren und Kits sind die Promotoren der FOS- und GRP78-Gene und des CRE-Response-Elements.
Das vorstehend beschriebene FOS-Gen enthält das cAMP-Response-Element ("CRE") [W. J. Roesler et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 9063-9066].
Das ebenfalls vorstehend beschriebene GRP78-Gen enthält ein Energie- /Ionenstreß-Response-Element, das auf Calciumionophore antwortet.
CRE ist das cAMP-Response-Element. Es ist ein Energie-/Ionenstreß-empfindliches Response-Element, das auf erhöhte cAMP-Mengen antwortet [J. Roesler et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 9063-66].
Weitere in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren verwendbare Energie- /Ionenstreß-Promotoren sind nachstehend in Tabelle 2 aufgelistet. In der folgenden kurzen Beschreibung von jedem dieser Gene wird das die DNA-Sequenz des jeweiligen Gens beschreibende Dokument in Klammem angegeben.
Zwei Cytochrom P450-Gene -- CYP1182, das durch cAMP induziert wird, und CYP2E1, das durch Ethanol induziert wird, -- enthalten Energie-/Ionenstreß- Response-Elemente. 2'-5' AS enthält ein Element, das auf durch Ethanol induzierten Energie-/Ionenstreß antwortet. Sowohl DBH, das die Dopamin-β-Hydroxylase codiert [B. Grima, Nature 326 (1987), 707-11], als auch TH, das die Tyrosinhydroxylase codiert [A. Lamouroux et al., EMBO J. 6 (1987), 3921-37], werden durch Membrandepolarisation induziert. ODC, das die Ornithindecarboxylase codiert, wird durch osmotischen Schock induziert [N. J. Hickok et al., DNA 6 (1987), 179-87]. G6PD codiert die Glucose-6-Phosphatdehydrogenase und wird durch ATP-Mangel induziert. PKC enthält ein Energie-/Ionenstreß-Response-Element, das durch Na/K-ATPase- Mangel induziert wird. PVALB codiert Parvalbumin und wird durch Calciumionen induziert [C. Lutum et al., Genbank-Hinterlegungsnummer X63070]. Stromelysin-1 enthält ein auf Energie-/Ionenstreß-Response-Element, das durch Calcium-Ionophore induziert wird. Tabelle 2 Weitere Säuger-Streßpromotoren Tabelle 2 (Fortsetzung)
Da Response-Elemente nur von Promotoren, die sie aufgrund rekombinanter DNA-Verfahren enthalten, isoliert werden können, ist die Verwendung dieser Elemente in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren auf Promotor-heterologe Genkonstrukte verwendende Ausfuhrungsformen beschränkt.
Zur funktionellen Verbindung mit einem heterologen Gen muß ein Response- Element zunächst mit einem Minimaipromotor ligiert werden. Ein Minimalpromotor bewirkt eine basale konstitutive Expression eines mit ihm funktionell verbundenen Gens. Bevorzugte Minimalpromotoren sind die SV40-, TK- oder β-Interferon- Minimalpromotoren. Diese Minimalpromotoren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Dieses Minimalpromotor/Response-Element-Konstrukt wird anschließend mit dem heterologen Gen durch gut bekannte DNA-Rekombinationsverfahren funktionell verbunden.
Viele der vorstehend beschriebenen Promotoren oder funktionellen Äquivalente davon sind in anderen Eukaryonten wie Nematoden, Hefe, Insekten, Reptilien, Amphibien und Pflanzen vorhanden.
Hefe enthält beispielsweise das Metallothioningen CUP, das auf durch Exposition gegen Schwermetalle induzierten Proteinstreß antwortet [T. R. Butt et al., Gene 27 (1984), 23-33, und T. R. Butt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 3332-36]. Hefe enthält ferner Äquivalente der Gene HSP70 und GRP 78 [E. A. Craig, Stress Proteins In Biology And Medicine, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1990), 301-21, W. R. Boorstein et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 18912-21, und M. D. Rose et al., Cell 57 (1990), 1211-21]. Alkoholdehydrogenasen, eine Familie von Hefegenen, die durch Alkohol, einem Energie-/Ionenstreß, induziert werden, wurden ebenfalls sequenziert [T. Young et al., Basic Life Sci. 19 (1982), 335-361].
Ferner wurde eine große Zahl von DNA-Streßgenen in Hefe identifiziert und sequenziert. Diese schließen MAG, die Methyladenin-DNA-Glycosylase, und MGTI, die auf eine Schädigung durch DNA-Alkylierung antworten [W. Xiao et al., Mol. Cell Biol. 13 (1993), 7213-21]; RAD51, RAD54, RAD6, RAD23, RAD2, RAD18 und RAD7, die alle auf DNA-Strangbrüche antworten, [G. Basile et al., Mol. Cell Biol. 12 (1992), 3235-46, G. M. Cole et al., Mol. Cell Biol. 9 (1989), 3314-3326, K. Madura et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990), 771-78, Nucleic Acids Res. 18 (1990), 4737-42, K. Madura et al., J. Bacteriol. 166 (1990), 914-23, J. S. Jones et al., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 893-98, J. S. Jones et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990), 3281-85]; das durch DNA-schädigende Stoffe induzierte PHR1 [J. B. Sebastion et al., Mol. Cell Biol. 10 (1990), 4630-37]; die durch eine Schädigung der DNA induzierten Hefe- Ribonucleotid-Reduktasen RNR2 und RNR3 [S. J. Elledge et al., Mol. Cell Biol. 9 (1989), 5373-86, S. J. Elledge et al., Gene Dev. 4 (1990), 740-51, Z. Zhou et al., Genetics 131 (1992), 851-66]; die Hefe-DNA-Ligase CDC9 [T. A. Peterson et al., Mol. Cell Biol. 5 (1985), 226-35]; UBI4, ein weiteres auf eine DNA-Schädigung antwortendes Gen [J. M. Treger et al., Mol. Cell Biol. 8 (1988), 1132-36]; und DDR48, ein auf Mutagene antwortendes Gen [J. M. Treger et al., Mol. Cell Biol. 10 (1990), 3174-84], ein. Ferner wurden mehrere weitere DNA-Streßgene ebenfalls in Hefe identifiziert [G. W. Robinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 1842-46, S. W. Ruby et al., Mol. Cell Biol. 5 (1985), 75-84, E. C. Friedberg, Microbiol. Rev. 52 (1988), 70-102, und T. McClanahan et al., Mol. Cell Biol. 4 (1984), 2356-2363].
Die geeignete Kombination von einem von oder allen diesen Promotoren sowie von weiteren bekannten Hefe-Streßpromotoren kann in den erfindungsgemäßen Verfahren und Kits verwendet werden. Es ist selbstverständlich, daß bei der Verwendung von Hefe-Streßpromotoren Hefe-Wirte bevorzugt sind und unter fur diesen Wirt geeigneten Bedingungen gezüchtet werden müssen. Diese Bedingungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die am meisten bevorzugten Kits und Verfahren, die Oligonucleotide zum Nachweis der Toxizität verwenden, enthalten die folgenden Streßpromotoren: ALDH1, CYP1A1, FOS, GADD153, HMO, HSP70, JUN und MTIIA. Die am meisten bevorzugten Kits und Verfahren, die die Reportergen-Expression zum Nachweis der Toxizität verwenden, enthalten die folgenden Streßpromotoren und Response-Elemente: CYP1A1, GST Ya, GADD45, FOS, XHF, HSP70, MT IIA, GADD153, CRE, XRE, NFkBRE, RARE und p53RE.
Gemäß einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform verwenden die diagnostischen Kits und Verfahren ferner mindestens einen Zelloberflächenrezeptorvermittelten Streßpromotor. Diese Kits und Verfahren sind besonders zur Ermittlung und Charakterisierung der Toxizität einer Verbindung bei äußeren Organen wie Haut, Augen oder Schleimhäute nützlich. Die Verwendung von Zelloberflächenrezeptor-vermittelten Streßpromotoren ermöglicht den Nachweis von Verbindungen, die eine lokale Reizung oder Entzündung dieser äußeren Organe bewirken können.
Reizstoffe und zu Entzündungen führende Mittel können eine histologisch nicht nachweisbare sublethale Zellverletzung verursachen. Diese Toxine wären für ein Tier als Ganzes im klassischen Sinn nicht toxisch und können daher durch Verfahren wie dem Experiment mit lebenden Tieren nicht nachgewiesen werden. Die Verwendung von Zelloberflächenrezeptor-vermittelten Streßpromotoren in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren ermöglicht den Nachweis und die Charakterisierung dieser lokalen Reizstoffe oder zu Entzündungen führende Mittel sowie die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen den beiden auf einem subzellulären Niveau -- was Versuche am Tier als Ganzes nicht erreichen können.
Die bevorzugten Zelloberflächenrezeptor-vermittelten Streßpromotoren zur Verwendung in diesen Kits werden von den Promotoren der IL-1-alpha-, G-CSF-, GM- CSF-, TNF-alpha-, IL-3-, IL-6-, IL-8-, ICAM-1- und Stromelysin-1-Gene ausgewählt.
Das Interleukin (IL)-1-alpha-Gen codiert ein Cytokin, das durch Mitogene, Lipopolysaccharide (LPS), PMA, Siliciumdioxid, weitere Cytokine und UVB- Bestrahlung induziert wird [T. A. Luger et al., J. Invest. Dermatol. 95 (1990), 1005- 1045]. Die Sequenz dieses Gens wird von Y. Furutani et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 3167-79, beschrieben.
Das Gen des Granulocyten-Kolonie-stimulierenden Faktors (G-CSF) produziert ein Protein, das durch Endotoxin, Interferone und PMA induziert wird [T. A. Luger et al., J. Invest. Dermatol. 95 (1990), 1005-1045]. Die Sequenz dieses Gens wird von S. Nagata et al., EMBO J. 5 (1986), 575-581, beschrieben.
Das Gen des Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF) codiert ein Protein, das als Antwort auf die gleichen Stimuh wie für G-CSF produziert wird [T. A. Luger et al., a.a.O.). Die Sequenz dieses Gens wird von S. Miyatake et al., EMBO J. 4 (1985), 2561-2568, beschrieben.
Das Gen des Tumor-Nekrose-Faktors (TNF) alpha codiert ein Protein, das durch IL-1-alpha und IFN-gamma induziert wird [B. J. Nickoloff et al., J. Invest. Dermatol. 94 (1990), 151S-157S]. Die Sequenz dieses Gens wird von D. Semon et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987), 9083-9084, beschrieben.
Das IL-3-Gen codiert ein gleichnamiges Produkt und wird durch Interferon (IFN)-gamma, PMA und UVB-Strahlen induziert [T. A. Luger et al., a.a.O.]. Die Sequenz dieses Gens wird von D. R. Cohen et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986), 3641- 58, beschrieben.
Das IL-6-Gen produziert ein Protein, das als Antwort auf andere Cytokine, bakterielle Toxine, Viren, Tumorpromotoren und Natriumlaurylsulfat exprimiert wird [T. Hunziker et al., Brit. J. Dermatol. 127 (1992), 254-57, und T. A. Luger et al., J. Invest. Dermatol. 95 (1990), 1005-1045]. Die Sequenz dieses Gens wird von K. Yasukawa et al., EMBO J. 6 (1987), 2939-45, beschrieben.
Das IL-8-Gen wird durch die Cytokine IL-1-alpha, den Tumor-Nekrose- Faktor (TNF-alpha) und IFN-gamma sowie durch LPS und Tumorpromotoren induziert [I. C. Oliveira et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 9049-53]. Die Sequenz dieses Gens wird von N. Mukaida et al., J. Immunol. 143 (1989), 1366-71, beschrieben.
Das Gen für das intrazelluläre Adhäsionsmolekul (ICAM)-1 codiert ein Protein, das durch Cytokine, LPS, Hydrocortison und PMA induziert wird [S. W. Caughman et al., J. Invest. Dermatol. 98 (1992), 615-655]. Die Sequenz dieses Gens wird von B. G. Stade et al., Immunobiology 181(1990), 851-56, beschrieben.
Das Stromelysin-1-Gen enthält ein Zelloberflächenrezeptor-vermitteltes Streßelement, das durch den epidermalen Wachstumsfaktor induziert wird.
Weitere in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren verwendbaren Zelloberflächenrezeptor-vermittelten Streßpromotoren schließen die Promotoren der IL- 1-beta-, TGF-alpha-, IL-10- und M-CSF-Gene ein sowie die Promotoren der Gene, die den die Expression jedes der vorstehend beschriebenen Gene regulierenden Zelloberflächenrezeptor codieren. In der nachstehenden kurzen Beschreibung jedes dieser Gene wird das die DNA-Sequenz des jeweiligen Gens beschreibende Dokument in Klammem angegeben.
Das IL-1-beta-Gen wird durch die gleichen Wirkstoffe induziert wie das IL-1- alpha-Gen [J. J. Huang et al., J. Immunol. 140 (1988), 3838-43]. Das Gen für den transformierenden Wachstumsfaktor(TGF)-alpha codiert ein Protein, das durch sich selbst sowie durch IFN-gamma induziert wird [F. Iris et al., Nature Genetics 3 (1993), 137-45]. IL-10 wird durch Kontaktallergene wie Trinitrochlorbenzol (TNCB) und Haptene induziert [J. M. Kim et al., J. Immunol. 148 (1992), 3618-23]. Die anderen Zelloberflächenrezeptor-vermittelten Streßgene wurden ebenfalls in der Fachwissenschaft beschrieben.
Die erfindungsgemäßen diagnostischen Kits und Verfahren beruhen auf der Induktion von spezifischen Streßpromotoren oder Streß-Response-Elementen und der Transkription und/oder Translation eines damit funktionell verbundenen Gens.
Fur erfindungsgemäße Ausfuhrungsformen, die ein heterologes Gen verwenden, das mit einem Säuger-Streßpromotor oder Streß-Response-Element funktionell verbunden ist, gibt es für die Wahl des Gens im wesentlichen keine Einschränkung. Die einzigen erforderlichen Parameter sind (1), daß eine das nachweisbare Produkt codierende DNA-Sequenz charakterisiert wurde, und (2) daß das Produkt des Gens nachgewiesen werden kann. Eine ausreichende Charakterisierung schließt die Kenntnis der vollständigen codierenden Sequenz, Verfügbarkeit eines genomischen Clons oder Kenntnis einer ausreichenden Zahl von Restriktionsstellen in der genomischen DNA- Sequenz ein, so daß das Gen manipuliert werden kann, um eine funktionelle Verbindung mit dem Streßpromotor zu erzeugen.
Die Promotoren der meisten Säuger-Streßgene können durch mehr als eine Art von Streß induziert werden. Dies ist so, da diese Promotoren in ihrer Sequenz eine Reihe von Streß-Response-Elementen enthalten, von denen jedes auf eine andere Art von Streß antwortet. Für Ausführungsformen, die diese multiplen Streßpromotoren verwenden, wird vorzugsweise auch ein anderer nur auf einen der multiplen Stressarten antwortender Promotor verwendet. Dies trifft zu, ungeachtet der Verwendung von nativen Promotorgensystemen oder von rekombinanten Fusionen aus Promotor und nachweisbarem Gen. Der HMO-Promotor und der JUN-Promotor werden beispielsweise sowohl durch Peroxide als auch UVA-Strahlen induziert. Daher antworten diese Promotoren sowohl auf Redoxstreß als auch auf DNA-Streß. Ein NMOL-Promotor, der nur auf oxidativen Streß antwortet, kann zusammen mit einem HMO- oder JUN- Promotor verwendet werden. Durch diese Kombination von Promotoren kann ermittelt werden, ob die Induktion des multiplen Streßpromotors durch Redoxstreß oder UVA- Licht bewirkt wird. So kann die Natur des durch eine Verbindung bewirkten Stresses genauer ermittelt werden.
Gemäß einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform können einzelne Response-Elemente eines Promotors isoliert und anschließend mit einem Säuger- Minimalpromotor und einem ein nachweisbares Produkt codierenden Gen funktionell verbunden werden. So wird die Expression des nachweisbaren Produkts in Gegenwart einer Verbindung mit nur einer bestimmten Art von Streß in Zusammenhang gebracht.
In Ausführungsformen, die ein ein nachweisbares Produkt codierendes Gen verwenden, ist das nachweisbare Produkt vorzugsweise β-Galactosidase (vom lacZ-Gen codiert), Chloramphenicolacetyltransferase (vom CAT-Gen codiert), Galactokinase (vom galK-Gen codiert), β-Glucosidase (vom gus-Gen codiert), Glutathiontransferase, menschliches Wachstumshormon (vom hGH-Gen codiert) oder Glühwürmchen- Luciferase (vom lux-Gen codiert). Am meisten bevorzugt wird das CAT-Gen verwendet.
Die im Wirt enthaltenen Fusionen aus Streßpromotor und nachweisbarem Produkt, die in bestimmten erfindungsgemäßen diagnostischen Kits und Verfahren verwendet werden, können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannten Standard-DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Die Wahl der Verfahren hängt davon ab, was über den bestimmten im Stamm zu verwendenden Streßpromotor bekannt ist.
Wenn ein genomisches Fragment, das einen Streßpromotor und sein Gen enthält, isoliert oder in einen Vektor doniert wurde, wird der Promotor durch Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen entfernt. Das Promotorfragment wird anschließend isoliert und mit einem ein nachweisbares Produkt codierenden Gen in einem Plasmid funktionell verbunden. Der Vektor muß ferner einen Marker wie Neo zur Identifizierung von stabilen Transfektanten enthalten. Das Durchmustern auf eine funktionelle Fusion erfolgt durch Exposition von Transfektanten gegen einen Streß, der bekanntermaßen den spezifischen Streßpromotor induziert, und durch Testen auf das nachweisbare Genprodukt.
Wenn die Nucleotidsequenz des Streßpromotors und seines Gens bekannt ist, kann das Polymerasekettenreaktionsverfahren zur Herstellung von nachweisbaren Proteinfusionen verwendet werden. Genauer gesagt werden Primer synthetisiert, die zu den 5'- und 3'-Enden des Streßpromotor-Teils des Gens komplementär sind, diese Primer mit denaturierter, vollständiger Säuger-DNA unter geeigneten Bedingungen hybridisiert und die PCR durchgefuhrt. So können donierbare Mengen jedes sequenzierten Streßpromotors erhalten werden. Nach Erhalt wird die Streßpromotor-DNA mit einer ein nachweisbares Protein codierenden DNA in einem geeigneten Vektor funktionell verbunden, wie vorstehend beschrieben. Diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die Konstruktion von operablen Fusionen von Streßpromotor-Response Elementen an ein ein nachweisbares Produkt codierendes Gen wird auch durch Standard-DNA-Rekombinationsverfahren durchgeführt. Da Response-Elemente klein sind, kann die sie codierende DNA unter Verwendung eines Oligonucleotid synthesegeräts produziert werden. Beiden Strängen des Response-Elements entsprechende Oligonucleotide werden synthetisiert, miteinander aneliert und in ein Plasmid cloniert, das ein Reportergen unter der Kontrolle eines Minimalpromotors enthält. Alternativ können die doppelsträngigen Oligonucleotide durch Selbstligierung vor der Insertion in einen Vektor multimerisiert werden. Die multiplen Kopien des Response-Elements ermöglichen eine höhere Expression des nachweisbaren Produkts nach der Streßinduktion.
Erfindungsgemäße Ausführungsformen, die native Streßgene wie die ein nachweisbares Produkt codierenden Gene verwenden, müssen vor dem Toxizitätstest nicht genetisch manipuliert werden.
Die Wahl der in den effindungsgemäßen Kits und Verfahren verwendeten Zellinie hängt von dem zur Ermittlung der Toxizität verwendeten Test ab. Für die Ausfuhrungsformen, die Fusionen aus Streßpromotor und nachweisbarem Produktgen verwenden, müssen die Zellen das Expressionsprodukt in nachweisbarer Form produzieren können. Diese Zellen dürfen ferner das nachweisbare Produkt nicht von einer anderen Kopie des Gens in ihrem Genom konstitutiv produzieren.
Für Ausführungsformen, die die nativen Streßgene der Zellen verwenden, beruht die Wahl von Zellen auf der Fähigkeit dieser Gene, durch Streß induziert zu werden. Bevorzugte Zellen für Ausführungsformen, die keine Zelloberflächenrezeptor-vermittelten Streßpromotoren verwenden, sind HeLa-, HepG2- und WIL-2-Zellen. Für die Kits und Verfahren, die Zelloberflächenrezeptor-vermittelte Streßpromotoren verwenden, wird eine von dem interessierenden Organ stammende Zellinie bevorzugt. Wenn beispielsweise die Streß-Kits und -Verfahren Haut-angreifende Verbindungen identifizieren sollen, sind eine Haut-Fibroblasten- oder Keratinocyten-Zellinie wie SCC 12 oder ihre Derivate wie C6C1 bevorzugt. Für Kits und Verfahren, in denen Augentoxine identifiziert werden sollen, ist eine Hornhautzellinie am meisten bevorzugt.
Bei der Verwendung von Fusionen aus Streßpromotor und nachweisbarem Produkt wird es vorgezogen, daß jeder Wirt, der in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren verwendet wird, nur eine solche Fusion enthält. Wenn daher eine Verbindung die Expression des nachweisbaren Genprodukts in einer bestimmten Wirtszelle induziert, kann die durch die Verbindung bewirkte spezifische Art von Streß zweifelsfrei identifiziert werden.
Es ist bekannt, daß einige Verbindungen in ihrer nativen Form für Säuger nicht toxisch sind, jedoch nach Umwandlung durch die Leber toxisch werden. Daher muß gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform die in den erfindungsgemäßen Verfahren und Kits zu testende Verbindung mit einem S9-Leberextrakt vorbehandelt werden. Verfahren zur Herstellung eines S9-Leberextrakts ("S9") werden von S. Vennitt et al., in Mutagenicity Testing - A Practical Approach, S. Vennitt et al., (Hrsg.), IRL Press, Oxford, England, S. 52-57 (1984), beschrieben. S9 ist üblicherweise ein Rohhomogenat von Rattenleber mit durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit entfernten unlöslichen Partikeln, es kann jedoch auch von einer menschlichen oder einer anderen Säugerieber hergestellt werden. S9 wird mit der Testverbindung in einem NAD(P)H enthaltenden Kaliumpuffer inkubiert zur Nachahmung von Stadium I und II der Biotransformation von Verbindungen, die normalerweise durch die Säugerleber vor der Durchführung des Toxizitätstests durchgeführt wird. Wenn jedoch primäre Säuger-Leberzellen in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren verwendet werden, ist die S9-Vorbehandlung nicht erforderlich. Die Zellen können Stadium I und II der Biotransformation von Verbindungen unter Testwachstumsbedingungen durchführen.
Alternativ erfolgt die Züchtung der in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren verwendeten Zellen gemeinsam mit Zellen, die Stadium I und II der Biotransformation durchführen können, vorzugsweise mit einer primären Leberzellinie. Die Biotransformation der getesteten Verbindung wird in diesem Fall durch diese anderen Zellen statt durch von Leberzellen stammenden Enzymfraktionen durchgeführt.
Vor der Durchführung eines Tests auf eine Verbindung von unbekannter Toxizität unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Kits müssen Eichkurven unter Verwendung von mindestens einer und vorzugsweise mindestens drei Verbindungen erzeugt werden, von denen bekannt ist, daß sie jeden spezifischen Streßpromotor oder jedes spezifische Response-Element, das (der) zum Durchmustern der unbekannten Verbindung verwendet wird, induzieren.
Jede bekannte Chemikahe muß stärker bevorzugt gegen alle Promotoren, nicht nur gegen den Promotor, den sie bekanntermaßen induziert, getestet werden. Und jede Chemikalie muß zur Bereitstellung einer geeigneten Eichkurve über einen ausreichend weiten Konzentrationsbereich, vorzugsweise 1 picomolar bis 1 millimolar, sowie zu mehreren Zeitpunkten getestet werden.
Nach der Erstellung der Eichkurven wird eine diese Kurven enthaltende Computer-Datenbank angelegt. Diese Datenbank wird anschließend verwendet, um die Streßpromotorinduktionsprofile der zu testenden Verbindungen mit denen der zur Erstellung der Eichkurve verwendeten bekannten Toxine zu vergleichen. Daher werden die Ergebnisse für jede nicht-getestete Verbindung als relative Toxizität im Vergleich zu bekannten Induktoren von Streßpromotoren ausgedrückt.
Alle erfindungsgemäßen Charakterisierungs- und Toxizitätsbestimmungs verfahren umfassen als ersten Schritt die Züchtung der Zellen sowohl vor als auch nach der Exposition gegen eine potentielle toxische Verbindung. Die Kulturbedingungen variieren je nach verwendetem Zelltyp. Am meisten bevorzugt werden unsterbliche menschliche Leberzellen (HepG2) verwendet. Die Züchtung dieser Zellen wird unter Standardgewebekulturbedingungen -- essentielles Minimalmedium bei 37ºC und 5% CO&sub2; -- durchgeführt. Die Zellen werden üblicherweise in 165 cm²-Kolben bis zum Erreichen einer Dichte von etwa 5 x 10&sup6; Zellen/ml gezüchtet.
Nach dieser anfänglichen Züchtung werden die Zellen subkultiviert und gegen die zu testende Verbindung exponiert. Ein typischer Test verwendet etwa 2,75 x 10&sup5; Zellenlml. Für anfängliche Tests auf eine Verbindung muß eine Reihe von 10fach- Verdünnungen der Verbindung verwendet werden. Eine weitere Reihe von Verdünnungen der Verbindung, die mit der S9-Fraktion vorinkubiert wurden, müssen auch hergestellt und einem zweiten Teil jeder Kultur zugesetzt werden. Ein dritter Teil jeder Kultur, der als Kontrolle dient, wird nicht gegen die Verbindung exponiert, jedoch sonst in der gleichen Weise wie nachstehend beschrieben behandelt.
Alle Kulturen läßt man anschließend bei normaler Wachstumstemperatur über einen Zeitraum von 5 Minuten bis 48 Stunden inkubieren. Stärker bevorzugt ist die Exposition gegen die toxische Verbindung oder Testverbindung etwa 2 bis 32 Stunden. Nach der Exposition gegen die Testverbindung wird die Menge des nachweisbaren Produkts oder der Streßgen-mRNAs gemessen.
Bei Verwendung der das nachweisbare Produkt messenden Ausführungsform kann die Quantifizierung mit mehreren auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein kolorimetrisches Substrat verwendet werden, wenn das Expressionsprodukt ein Enzym ist. Geeignete kolorimetrische Substrate für bestimmte Enzyme sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Alternativ kann ein spezifische Antikörper verwendender Test wie der RIA oder ELISA zum Nachweis des Expressionsprodukts verwendet werden.
Je nach der Art des verwendeten Tests müssen die Pufferbedingungen der lysierten Kultur oder des Überstands gegebenenfalls eingestellt werden. Dementsprechend kann ein geeigneter Puffer der lysierten Kultur oder dem Überstand zugesetzt werden, so daß optimale Bedingungen für den jeweiligen Test erhalten werden. Wenn beispielsweise das nachzuweisende Produkt durch einen RIA- oder ELISA-Test nachgewiesen werden soll, müssen die Pufferbedingungen auf einen neutralen pH-Wert eingestellt werden, um eine maximale Antikörper-Antigen-Komplex-Bildung zu ermöglichen und die nicht-spezifische Antikörperbindung zu minimieren. Diese Bedingungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und bestehen beispielsweise letztendlich aus einem Puffer, der 50 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl und einen pH-Wert von 7,0 aufweist. Wenn das nachzuweisende Produkt ein Enzym ist und der Nachweis durch einen kolorimetrischen Substrattest erreicht werden soll, müssen die Pufferbedingungen für eine maximale Enzymaktivität und eine minimale nicht-katalytische Spaltung des Substrats optimiert werden. Diese Bedingungen sind üblich und variieren je nach dem zu testenden Enzym.
In der am meisten bevorzugten Ausfuhrungsform dieses erfindungsgemäßen Gesichtspunkts ist das nachzuweisende Produkt die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT). Tests auf dieses Enzym sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden von J. Sambrook et al., "Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), 16.60-16.65, beschrieben. Dieses Dokument beschreibt ferner Tests auf die β-Galactosidase, einem weiteren nachzuweisenden Produkt, das in den erfindungsgemäßen Verfahren und Kits verwendet werden kann (S. 16.66-16.67).
In Ausfuhrungsformen, die zur Ermittlung der Streßgeninduktion die Transkriptionsrate verwenden, müssen die mRNA-Mengen, die von Genen transkribiert werden, die mit den in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren verwendeten Streßpromotoren funktionell verbunden sind, gemessen werden ("Streßgen-mRNA"). Dies erfordert, daß die gesamte RNA oder mRNA von exponierten Zellen isoliert wird. Dies kann durch jedes der zahlreichen und gut-bekannten Verfahren erreicht werden. Im Handel erhältliche mRNA- oder Gesamt-RNA-Isolations-Kits, wie sie von Stratagene [La Jolla, CA] erhältlich sind, können ebenfalls verwendet werden. Vorzugsweise werden die Zellen mit Guanidiniumisothiocyanat (GTC) lysiert. Das Lysat wird anschließend mit Natriumacetatpuffer (pH 5,2) angesäuert und die Verunreinigungen mit Phenol extrahiert. Die RNA wird anschließend zweimal mit Ethanol ausgefällt, getrocknet und in Wasser erneut gelöst.
Nach der Isolierung der RNA kann die Streßgen-mRNA-Menge durch zahlreiche Verfahren entweder direkt oder indirekt gemessen werden. Im direkten Verfahren werden zu Streßgen-mRNA komplementäre Oligonucleotide verwendet. In diesem Verfahren wird die aus den Zellen isolierte mRNA auf Nitrocellulosepapier oder Nylonmembranfilter in einem "Slot-Blot"-Gerät aufgetragen. Nach der Verdünnung der RNA in dem Gerät mit einer geeigneten Salzlösung (vorzugsweise zwei Volumina von 20 x SSC) und Waschen der "Schlitze" wird das Nitrocellulosepapier oder -filter entweder 2 Stunden bei 80ºC in einem Vakuumofen gebacken oder durch UV-Strahlen vernetzt, um die RNA zu fixieren. Die an die Nitrocellulose fixierte RNA wird anschließend mit markierten, zu den Streßgen-mRNAs komplementären Oligonucleotidsonden unter geeigneten Puffer- und Temperaturbedingungen hybridisiert.
Ein indirektes Verfahren verwendet zum Nachweis Streßgen-mRNA-homologe Oligonucleotide. Dieses Verfahren mißt die Transkription unter Verwendung der Streßgen-mRNAs als Matrizen zur Herstellung von markierter einzelsträngiger cDNA durch reverse Transkription. Diese cDNAs werden anschließend nachgewiesen und durch Hybridisierung mit an einen festen Träger gebundenen komplementären Oligonucleotiden (oder denaturierten doppelsträngigen cDNAs) quantitativ bestimmt. Der feste Träger ist vorzugsweise eine negativ geladene Membran, und die Oligonucleotide werden vor der Bindung an die Membran durch Anfügen eines positiv geladenen Amidits oder einer positiv geladenen Aminogruppe am 3'-Ende modifiziert. Durch diese 3'-terminale Modifikation kann das Oligonucleotid nur über sein 3'-Ende an die Membran binden, was eine effizientere Hybridisierung als andere Verfahren der Bindung von DNA an einen festen Träger ermöglicht.
In jedem Verfahren wird auch eine Kontrolle verwendet, die ein nicht durch die spezifische experimentelle Probe induziertes konstitutiv exprimiertes "Housekeeping- Gen" wie β-Globin, β-Tubulin, β-Actin oder γ-Actin exprimiert. Dies liefert eine Kontrolle für richtiges Wachstum und Funktionieren der Zellen sowie den Hintergrundstandard, auf dem das Ausmaß der spezifischen Induktion berechnet wird. Nach der Hybridisierung wird die Menge der Hybridisierung quantitativ bestimmt. Die quantitative Bestimmung wird durch ein Verfahren erreicht, das mit dem Marker des Oligonucleotids oder der cDNA übereinstimmt. Bei Verwendung eines Radioisotops als Marker sind die Exponierung der Membran gegen einen Röntgenfilm mit einer anschließenden densitometrischen Aufzeichnung oder Flüssigszintillationszählung die bevorzugten quantitativen Bestimmungsverfahren. Bei Verwendung eines fluoreszierenden Markers wird zur quantitativen Bestimmung ein Fluorometer verwendet. So kann das Maß von verschiedenen Streßgeninduktionen gemessen werden. Bei Verwendung eines biotinylierten Markers wird die quantitative Bestimmung unter Verwendung von Streptavidin erreicht, das mit einem Enzym konjugiert ist, durch das ein meßbares kolorimetrisches Produkt erhalten werden kann.
Es ist bekannt, daß während einzelne Verbindungen nicht toxisch sein müssen, Kombinationen von nicht-toxischen Verbindungen toxisch sein können. Daher ist es klar, daß die erfindungsgemäßen Kits und Verfahren auch zur Ermittlung der potentiellen Toxizität von Kombinationen von bekannten und unbekannten Verbindungen (z. B. Arzneimittelinteraktionen), so wie vorstehend beschrieben, verwendet werden können.
Die Erfindung stellt ferner Streß-spezifische diagnostische Kits und Verfahren bereit. Die Erfindung stellt beispielsweise Redoxstreß-Kits und -Verfahren; DNA-Streß- Kits und -Verfahren; Proteinstreß-Kits und -Verfahren; Energie-/Ionenstreß-Kits und Verfahren und Rezeptor-vermittelte Streß-Kits und -Verfahren bereit. Die Wahl der Promotoren zur Verwendung in diesen Streß-spezifischen Kits können aus allen vorstehend in den Tabellen 1 und 2 aufgeführten geeigneten Promotoren hergestellt werden. Diese Kits verwenden vorzugsweise mindestens 3 und stärker bevorzugt mindestens 8 Promotoren, die auf unterschiedliche Untergruppen von Streß innerhalb der größeren Gruppe antworten. Am stärksten bevorzugt verwenden diese spezifischen Kits und Verfahren mindestens 12 auf geeigneten Streß antwortende Promotoren dieser Tabellen. Diese Kits und Verfahren ermöglichen eine genauere und spezifischere Analyse der durch eine Verbindung bewirkten Stressarten.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Antitoxins für eine durch die erfindungsgemäßen Verfahren als toxisch ermittelte Verbindung bereit. Wie vorstehend beschrieben, wird nach der Erstellung eines Streßpromotorinduktionsprofils für eine unbekannte Verbindung dieses Profil mit Profilen von bekannten Verbindungen in einer Batenbank vergleichen. Ein potentielles Antitoxin für die unbekannte Verbindung ist ein bekanntes Gegenmittel für eine Verbindung, die ein ähnliches Streßpromotor-Induktionsprofil aufweist.
Zur Untersuchung der Wirksamkeit dieses Antitoxins wird der Streßpromotortest nur unter Verwendung der Wirte, die die durch die unbekannte Verbindung induzierten Streßpromotoren enthalten, wiederholt. Alle Wirte werden mit verschiedenen konzentrationen des mutmaßlichen Antitoxins von der Zugabe einer induzierenden Konzentration der unbekannten Verbindung vorinkubiert. Wenn die Vorinkubation mit dem mutmaßlichen Antitoxin die Wirkung der unbekannten Verbindung verringert oder beseitigt, wird ein solches Antitoxin wahrscheinlich wirksam sein.
Schließlich stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der Entwicklung von Arzneimitteln bereit. Gemäß dieser Ausführungsform wird eines neues Arzneimittel zunächst mit allen vorstehend beschriebenen Kits und Verfahren getestet und seine Toxizität ermittelt. Die von diesen Verfahren und Kits geleiferte Information zeigt den zellulären Mechanismus der Arzneimittel-Toxitität. Der Teil des Arzneimittels, der wahrscheinlich die bestimmte angegebene Zellschädigung bewirkt, kann anschließend je nach der Rolle, die der Teil für die pharmazeutische Aktivität des Arzneimittels spielt, geeignet modifiziert oder eliminiert werden. Das erhaltene modifizierte Arzneimittel wird anschließend mit den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren erneut getestet, um festzustellen, ob seine Toxizität ausreichend reduziert oder beseitigt wurde. Durch dieses Verfahren verbesserte und modifizierte Arzneimittel sind ebenfalls im Schutzbereich der Erfindung.
Zum besseren Verständnis der hier beschriebenen Erfindung werden die nachstehenden Beispiele vorgebracht. Es ist selbstverständlich, daß diese Beispiele die Erfindung erläutern und nicht so ausgelegt werden sollen, daß sie diese Erfindung in irgendeiner Weise enschränken.
Bestimmte der nachstehend beschriebenen grundlegenden molekulurbiologischen Verfahren werden nicht genauer beschrieben. Diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden in der Offenbarung Molecular Cloning - A Laboratory Manual Second Edition, J. Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben.

Beispiel 1

Entwicklung und Synthese von Streßgen-spezifischen Oligonucleotidsonden

Die Nucleotidsequenz von jedem der hier beschriebenen Streßgene ist bekannt. Daher hängt die Entwicklung von spezifischen Oligonucleotiden einfach von der Wahl des zu modifizierenden Teils des Gens ab. Das Computerprogramm OLIGO ermöglicht die Eingabe der Nucleotidsequenz des interessierenden Gens und die Analyse der Sequenz zur Ermittlung von Position, Länge und Zusammensetzung von Oligonucleotiden, die mit der interessierenden Sequenz bei vom Anwender gewählten Salzkonzentrationen und Temperaturen hybridisieren. Unter Verwendung dieses Programms wurden die nachstehenden Streßgen-spezifischen komplementären Oligonucleotide zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren entwickelt:
Die Synthese der vorstehenden Oligonucleotide wurde, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt. Das spezifische Oligonucleotid wurde unter Verwendung eines automatisierten Oligonucleotidsynthesegeräts [Model 392, Applied Biosystems, Foster City, CA] synthetisiert.
Es wurden ferner die nachstehenden Oligonucleotide, die zu den angegebenen Streßgen-mRNAs homolog sind, auf der Basis der beschriebenen Nucleotidsequenz der verschiedenen Gene oder cDNAs davon entwickelt:
Es wurden ferner die folgenden Kontrolloligonucleotide entwickelt, die zu den "Housekeeping"-Gentranskripten homolog sind: (gamma-Actin) (beta-Tubulin)
Diese Oligonucleotide wurden jeweils an ihrem 3'-Ende durch Anfügen einer Aminogruppe modifiziert, so daß sie an eine negativ geladene Membran nur über ihr 3'- Ende binden konnten. Diese Oligonucleotide wurden auf Bestellung von Operon Technologies, Inc., Alameda, CA, synthetisiert.
Komplementäre und homologe Oligonucleotidsonden fur alle anderen Streßgen-mRNAs, die in dieser Erfindung verwendet werden können, können unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Software in ähnlicher Weise entwickelt werden.

Beispiel 2

Toxizitätstest einer unbekannten Verbindung unter Verwendung von radioaktiv markierten Oligonucleotidsonden

I. Direkte quantitative Bestimmung der Streßgen-mRNA durch Hybridisierung mit Oligonucleotidsonden

Es ist wünschenswert zu wissen, ob die unbekannte Verbindung "X" toxisch ist, und wenn es so ist, welche Art von Schädigung sie bei Säugerzellen bewirkt.
HepG2-Zellen werden in 165 cm²-Kolben, die ein minimales essentielles Medium (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) enthalten, bis zu einer Dichte von etwa 8 x 10&sup6; Zellen/ml gezüchtet. Die Zellen werden anschließend durch Verdünnen auf 5 x 10&sup6; Zellenlml subkultiviert und mit 10 ml/Platte plattiert. Mehrere Platten von jeder Subkultur werden gegen eine unterschiedliche Konzentration der Verbindung X (1 pM bis 1 mM in einer Reihe von lofachen Verdünnungen) exponiert. Die Messenger-RNA wird aus den Subkulturen nach 2, 4, 8, 16 und 32 Stunden, wie nachstehend beschrieben, isoliert.
Das Medium wird durch Absaugen von den einzelligen Schichten entfernt, und die Zellen werden zweimal mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen Anschließend werden 2 ml kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung der einzelligen Schicht zugesetzt und ein "Gummipolizist" zum Auskratzen des Lysats in 15 ml Polypropylen-Einwegröhrchen verwendet. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des RNAzol B-Reagenzes (Biotecx Laboratories, Houston, TX) nach der Anleitung des Herstellers isoliert. Das RNA-Pellet wird getrocknet und in 10 µl Wasser erneut gelöst. Eine normale Ausbeute von RNA ist etwa 100 bis 200 µg/Platte.
Die RNA von allen Replika-Platten wird anschließend auf die 20 verschiedenen "Schlitze" eines Slot-Blot-Geräts, wie nachstehend beschrieben, aufgetragen. Das Slot-Blot-Gerät wird vor der Verwendung in 0,1 N NaOH gereinigt. Ein Stück Nitrocellulosepapier oder Nylonmembranfilter (0,45 µm Porengröße) wird kurz mit Wasser angefeuchtet und anschließend in 20 x SSC 1 Stunde bei Raumtemperatur eingeweicht. Das Filter wird anschließend in das Gerät gegeben. Die RNA-Probe von jeder Platte wird mit 20 µl 100% Formamid, 7 µl 37% Formaldehyd und 2 µl 20 x SSC vermischt, 15 Minuten bei 68ºC inkubiert und anschließend auf Eis gekühlt.
20 µg RNA wird in jeden "Schlitz" des Geräts zusammen mit zwei Volumina 20 x SSC gegeben. Nach dem Durchtritt der Lösung durch das Filter werden die "Schlitze" zweimal mit 1 ml 10 x SSC gespült. Das Filter wird anschließend getrocknet und 2 Stunden bei 80ºC in einem Vakuumofen gebacken. Das Filter wird anschließend in Streifen geschnitten, so daß Proben, die gegen verschiedene Konzentrationen von X über verschiedene Zeiträume exponiert wurden, mit einzelnen Streßgen-spezifischen Sonden hybridisiert werden können. Ein Streifen wird für jede einzelne Sonde verwendet.
Die Hybridisierung der Streifen mit den einzelnen Oligonucleotidsonden wird unter gut bekannten Bedingungen für die RNA-DNA-Hybridisierung durchgeführt. Die Temperatur und die Salzkonzentration zur Hybridisierung mehrerer Sonden mit der RNA hängen von der Natur des Oligonucleotids ab. Diese Bedingungen können unter Verwendung von gut bekannten Formeln berechnet werden. Sonden für die nachstehenden Gene werden verwendet:
Nur Redoxstreß: CYP1A1, NMO1 und ALDH2;
Nur DNA-Streß: XHF, DRA, GADD153 und MDR-1;
Nur Proteinstreß: HSP70 und MT 1A;
Redox- und DNA-Streß: GST Ya, HMO und MnSOD;
Redox-, DNA- und Proteinstreß: JUN;
DNA-, Protein- und Energie-Ilonenstreß: FOS.
Nach der Hybridisierung werden die Streifen gewaschen, getrocknet und die mRNA-Mengen auf einem von zwei Wegen quantitativ bestimmt. In einem Verfahren werden die Streifen gegen einen Röntgenfilm exponiert und die Hybridisierung wird durch Densitometrie quantitativ bestimmt. Alternativ werden die Streifen in einzelne "Schlitze" gegeben, und es wird eine Szintillationszahlung durchgeführt. Tatsächlich können beide Verfahren durchgeführt werden, wenn das erstere zuerst durchgeführt wird.

II. Indirekte quantitative Bestimmung der Streßgen-mRNA durch Hybridisierung von cDNA mit Oligonucleotidsonden

A. Vernetzung von Oligonucleotiden mit einer negativ geladenen Membran

Getrennt davon wurden zu den mRNAs der folgenden Streß- und "Housekeeping"-Gene homologe Oligonucleotide mit Biodyne C-Membranen (Pall Corporation, East Hills, New York) im wesentlichen unter Verwendung des von Y. Zhand et al., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 3929-33, beschriebenen Verfahrens vernetzt:
Nur Redoxstreß: CYPLAL und ALDHL;
Nur DNA-Streß: GADDLS3;
Nur Proteinstreß: HSP70;
Redox- und Proteinstreß: MTIIA;
Redox- und DNA-Streß: HMO;
Redox-, DNA- und Proteinstreß: JUN;
DNA-, Protein- und Energie-/Ionenstreß: FOS;
Kontrolle: γ-Actin.
Die Biodyne C-Membran wurde zunächst kurz mit 0,1 N HCl gespült. Anschließend wurde die Membran 15 Minuten mit frisch hergestellter 20% (Gew./Vol.) EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropylcarbodiimid) behandelt. Die Membran wurde anschließend mit H&sub2;O gespült und auf ein 96 Vertiefungen aufweisendes Dot-Blot-Gerät gegeben. Die mit Aminogruppen modifizierten Oligonucleotide wurden anschließend in 0,5 M NaHCO&sub3; (pH 8,4) auf die Membran in separaten Vertiefungen unter Verwendung von Vakuum 15 min. aufgetragen. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung sollte 3 µl nicht übersteigen. Jedes einzelne Oligonucleotid wurde in vier benachbarte Vertiefungen gegeben.
Nach dem Auftragen der Oligonucleotide wurde die Membran mit 1 x TBS/0,1% Tween -20 gespült und anschließend alle verbliebenen aktiven Gruppen auf der Membran durch Behandlung mit 0,1 N NaOH 10 min. gelöscht. Anschließend wurde die Membran mit dH&sub2;O gespült, an der Luft getrocknet und die getrocknete Membran in einem versiegelten Plastikbeutel aufbewahrt.

B. Behandlung von Zellen und Isolierung von RNA

HepG2-Zellen werden in essentiellem Minimalmedium in 100 mm- Zellkulturschalen bis zu einer Konfluenz von höchstens 80% gezüchtet. Die Kulturen werden anschließend gegen verschiedene Konzentrationen der Verbindung X exponiert und bei 37ºC über den gewünschten Zeitraum inkubiert. Nach dem Absaugen der Medien werden die Zellen dreimal mit 10 ml einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung bei Raumtemperatur gewaschen. 5 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung werden anschließend der Zellkulturschale zugesetzt und die Zellen mit einem "Gummipolizisten" von der Schale abgekratzt und in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen gegeben. Die Zellen werden mit einem Hämocytometer gezählt und in einer Zentrifuge pelletiert. Die phosphatgepufferte Kochsalzlösung wird abgegossen.
Wenn die Isolierung von Gesamt-RNA gewünscht wird, wird RNAzol B (Biotecx Laboratories, Inc., Houston, TX) gemäß der Anleitung des Herstellers verwendet. Wenn nur mRNA gewünscht wird, wird der Messenger RNA Isolation Kit (Stratagene Inc., La Jolla, CA) gemäß der Anleitung des Herstellers verwendet.

3. Reverse Transkription und gegebenenfalls eine PCR mit Streß-spezifischen cDNAs

Die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren isolierte Gesamt-RNA (50 µg) oder mRNA (2 µg) wird anschließend unter Verwendung von SUPERSCRIPT II (reverse Transkriptase) (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) und dem nachstehend beschriebenen Protokoll revers transkribiert.
Die RNA wird mit DEPC-H&sub2;O und Oligo-dT-Primer in ein Microzentrifugenröhrchen gegeben. Die dem Reaktionsgemisch zugesetzte Menge DEPC- H&sub2;O wird nach der Ermittlung der Volumina der anderen Reagenzien bestimmt. Der Oligo-dT-Primer (0,5 µg/µl) wird so zugesetzt, daß das Volumen 10% des gesamten Endvolumens ist. Das Reaktionsgemisch wird 10 min. auf 70ºC erhitzt und anschließend auf Eis schnell abgekuhlt. Die nachstehend beschriebenen Bestandteile werden in der folgenden Reihenfolge zugesetzt: 5 x SUPERSCRIPT-Erststrangpuffer (20% des Gesamtvolumens); 0,1 M DTT (10% des Gesamtvolumens); 10 mM dNTP-Gemisch (5 % des Gesamtvolumens) und SUPERSCRIPT II (5 % des Gesamtvolumens). Das Reaktionsgemisch wird kurz zentrifugiert und anschließend durch wiederholtes Pipettieren vermischt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. 2 µl RNAse A (10 mg/ml) werden anschließend dem Reaktionsgemisch zugesetzt und durch Pipettieren vermischt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend eine weitere Stunde bei 37ºC inkubiert. Am Ende der Inkubation wird dddH&sub2;O zu einem Endvolumen von 450 µl zugesetzt. Die cDNA wird durch Zugabe von 50 µl 3 M Natriumacetat und anschließend von 1 ml 100% Ethanol ausgefällt. Das Gemisch wird anschließend 30 Minuten in einer Microzentrifuge bei 12 000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die cDNA in 100 µl ddH&sub2;O resuspendiert. 2 µl der resuspendierten cDNA werden anschließend entfernt und in einem Szintillationszähler gemessen. Insgesamt 1 000 000 CpM werden zur Hybridisierung benötigt.
Die cDNA kann entweder unter Verwendung von α-³²P-dCTP (100 µCi) in der Reaktion radioaktiv markiert werden oder unter Verwendung von DigoxigenindUTP unter Verwendung des GENIUS 1-Kits (Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN) chemisch markiert werden.
Wenn eine unzureichende Menge Streßgen-cDNA durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten wird, kann die PCR zur Amplifikation verwendet werden. Die reverse Transkription wird, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, ausgenommen daß kein Marker in die cDNA eingeschlossen wird. Die Primer, die auf den veröffentlichten codierenden 5'- und 3'-Sequenzen des gewünschten Streßgens beruhen, werden in der PCR-Reaktion verwendet. Die Amplifikation aller StreßgencDNAs wird im gleichen Reaktionsröhrchen durchgeführt.
Die gesamte cDNA wird 1:10 mit dH&sub2;O verdünnt, und 10 µl werden für die PCR-Reaktion verwendet. Die nachstehenden Bestandteile werden anschließend zugesetzt, um die angegebene Endkonzentration zu erhalten: 1 x TAQ-Puffer (Boehringer Mannheim Biochemical); jeweils 300 µM von jedem der dNTPS; jeweils 25 pmol von jedem der PCR-Primer; 2,5 Einheiten TAQ-Polymerase (Boehringer Mannheim Biochemical) und dH&sub2;O bis zu einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 µl. Das Gemisch wird durch Pipettieren vermischt, wonach eine zweite Zentrifugation folgt. Zwei Tropfen von leichtem Mineralöl werden oben auf das Reaktionsgemisch gegeben. Die PCR wird anschließend über 30 Zyklen von 1 Minute bei 95ºC, 2 Minuten bei Tm + 2ºC und 3 Minuten bei 72ºC (10 Minuten während des letzten Zyklus) durchgeführt. Die PCR-Produkte werden mit ³²P, das in innere (nested) Primer über eine Kinasereaktion in einer PCR-Reaktion mit 1 Zyklus eingeschlossen wird, markiert.
Ein innerer Primer ist ein Primer, der auf einer Streß-spezifischen Nucleotidsequenz basiert, die innerhalb der Sequenzen liegt, auf denen die Primer für die PCR beruhen. Diese Primer werden unter Verwendung eines Oligonucleotid- Synthesegeräts synthetisiert oder von einem Händler erworben. Die inneren Primer werden durch Vermischen von 1,2 µl (0,5 µg/µl) von innerem Primer mit 1,0 µl 10 x Kinasepuffer (0,5 M Tris, pH 8,2, 0,1 M MgCl&sub2; und 50 mM DTT), 5,0 µl α-³²P ATP, 1,0 µl Polynucleotidkinase und 1,8 µl dH&sub2;O markiert. Das Reaktionsgemisch wird durch Pipettieren vermischt und 1 Stunde bei 37 ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch 10-minütige Inkubation bei 70ºC beendet, wonach eine schnelle Zentrifugation und Kühlen auf Eis folgen. 90 µl dH&sub2;O werden anschließend zugesetzt, wonach 100 µl Phenol/Chloroform (1:1) zugegeben werden. Das Gemisch wird gut vermischt, 10 Minuten zentrifugiert und die wäßrige Phase anschließend in ein neues Röhrchen transferiert. Anschließend werden die markierten Primer durch Zugabe von 10 µl 3 M Natriumacetat, 1 µl 10 mg/ml TRNA und 400 µl 100% Ethanol ausgefällt und 10 Minuten auf Eis gegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Pellet wird mit 80% Ethanol gewaschen, 5 Sekunden zentrifugiert und getrocknet. Das Pellet wird mit 4 µl dH&sub2;O, 0,5 µl 10 x TAQ-Puffer und 0,5 µl TAQ- Enzym resuspendiert.
Anschließend werden 5 µl der markierten inneren Primer zur wäßrigen Phase des vorstehend beschriebenen PCR-Gemisches unter dem Mineralöl zugesetzt und ein weiterer Zyklus der PCR durch 2-minütiges Erhitzen auf 95 ºC, 2-minütiges Abkühlen auf Tm + 2ºC (markierter Primer) und 10-minütiges Erhitzen auf 72ºC durchgeführt.
Anschließend werden 50 ijl wäßrige Phase in ein neues Röhrchen transferiert, 50 µl dH&sub2;O und 100 µl Phenol/Chloroform zugesetzt, gut vermischt und 10 Minuten zentrifugiert. Die wäßrige Phase wird gewonnen und in ein frisches Röhrchen gegeben. Nicht eingeschlossene Primer werden unter Verwendung einer Spinsäule entfernt.

4. Hybridisierung

Die die vernetzten Oligonucleotide enthaltende Membran wird in 15 ml RAPID HYB-Puffer (Amersham, Arlington Heights, IL) angefeuchtet, indem ein Ende der Membran mit einer Pinzette gehalten und die Membran langsam eingetaucht wird. Die Membran wird anschließend vorhybridisiert, indem sie in einen "Seal-a-Meal"- Beutel überführt wird, die 15 ml RAPID HYB-Puffer aus dem Anfeuchtungsschritt zugesetzt werden und der Beutel versiegelt wird. Er wird anschließend 1 Stunde in ein Schüttelwasserbad von 68ºC eingetaucht. Die markierte cDNA (15 000 000 CpM) wird in 1 ml RAPID HYB verdünnt, 10 Minuten gekocht und anschließend auf Eis schnell abgekühlt.
Nach der Vorhybridisierung wird der RAPID HYB-Puffer entfernt und durch 14 ml auf 65ºC vorerhitzten frischen RAPID HYB-Puffer ersetzt. Die markierte cDNA wird anschließend dem Beutel zugesetzt und das Ende erneut versiegelt. Der Beutel wird anschließend über Nacht in ein Schüttelwasserbad von 68ºC eingetaucht. Nach der Hybridisierung wird die Membran aus dem Beutel entfernt und 20 Minuten bei Raumtemperatur in eine einen Puffer von geringer Stringenz (2 x SSC/0,1% SDS) enthaltende Schale gegeben. Die Membran wird anschließend in einen Puffer von hoher Stringenz (0,2 x SSC/0,1 % SDS; auf 45ºC vorerhitzt) transferiert und 30 Minuten bei 45ºC geschüttelt. Die Membran wird anschließend aus dem Puffer von hoher Stringenz entfernt, auf ein Stück Whatman 3MM-Filter gegeben und gegen einen Röntgenfllm über Nacht bei -70ºC mit einem Verstärkerschirm exponiert. Nach der Entwicklung wird das Autoradiogramm so geschnitten, daß es in eine Halterung von einer 96 Vertiefungen aufweisenden Mikrotiterplatte paßt, und so befestigt, daß die Anordnung der radioaktiven Flecken nach den Löchern in der Halterung ausgerichtet ist. Das Autoradiogramm wird anschließend bei 600 nm zur quantitativen Bestimmung gelesen.
Die Ergebnisse der beiden vorstehend beschriebenen Tests werden anschließend mit einer Datenbank aus Standards verglichen, die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Promotoren und bekannten Toxine hergestellt wurden. Durch Korrelieren der Ergebnisse für X mit bekannten Verbindungen kann ein Toxizitätsprofil erstellt werden. Wenn X beispielsweise die gleichen Streßgene wie TCDD bei ähnlichen Konzentrationen induziert, zeigt dies, daß X für alle Tiere bei ähnlichen Konzentrationen wie TCDD toxisch ist.

Beispiel 3

Konstruktion von Streßpromotor-CAT-Fusionen

Eine XHF-Promotor-CAT-Fusion wurde, wie nachstehend beschrieben, hergestellt. Zwei Oligonucleotide wurden auf der Basis der veröffentlichten Sequenz des XHF (Kollagenase)-Promotors synthetisiert [P. Angel et al., Mol. Cell Biol. 7 (1987), 2256-66]. Eines entsprach den Positionen -520 bis -501 stromaufwärts vom Primer der Transkriptionsstartstelle. No. 44]: 5'-TACCAGGCAGCTTAACAAAG-3'. Das andere entsprach den Positionen +53 bis +73 stromabwärts der Transkriptionsstartstelle. [SEQ ID No. 45]: 5'-ACTGGCCTTTGTCTTCTTTC-3'. Die Oligonucleotide wurden von Operon Technologies (Alameda, CA) synthetisiert. Die Oligonucleotide wurden in Wasser zu einer Endkonzentration von 500 pmol/ml gelöst.
Zur Amplifikation des XHF-Promotors wurden 0,1 µg von Raji (menschliche Genombank) genomischer DNA, 20 pmol von jedem der beiden vorstehend beschriebenen Primer, 5 µl 10 x-Puffer [500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl&sub2; und 0,1 % Gelatine], 5 µl 2,0 mM von jedem dNTP und 1 Einheit AMPLITAQ (Taq- Polymerase) (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) vermischt. Es wurde Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 50 µl zugesetzt und die PCR durchgeführt.
Die PCR-Reaktion wurde 2 Minuten bei 94ºC mit anschließenden 30 Zyklen von 10 Sekunden bei 56ºC, 30 Sekunden bei 71ºC und 10 Sekunden bei 94ºC durchgefuhit. Die PCR-Reaktion wurde durch Inkubation des Gemisches 1,5 Minuten bei 56ºC und anschließend 4 Minuten bei 71 ºC beendet. Mit dem Reaktionsprodukt wurde anschließend auf einem 1,0% Agarosegel eine Elektrophorese durchgefuhrt und die amplifizierte Sequenz aus dem Gel ausgeschnitten und gereinigt. Das isolierte Fragment wurde anschließend mit einer Kinase behandelt und mit glatten Enden in den pBLCAT3- Vektor ligiert, der von B. Luckow et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 5490, beschrieben wurde, wobei dessen Beschreibung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Weitere Streßpromotor-CAT-Fusionen können in ähnlicher Weise unter Verwendung aller vorstehend beschriebenen veröffentlichten Nucleotidsequenzen der verschiedenen Streßgen-Promotorregionen hergestellt werden, um geeignete Oligonucleotidprimer fur die PCR zu entwickeln. CAT-Fusionen mit den folgenden Streßpromotoren wurden zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren hergestellt: XHF, CYP1A1, GST Ya, MTIIA, FOS, HSP70, GADD45, GADD153 und JUN.

Beispiel 4

Konstruktion einer Response-Element-CAT-Fusion

Eine xenobiotische Response-Element XRE-CAT-Fusion wurde, wie nachstehend beschrieben, konstruiert. Zunächst wurden die Oligonucleotide, die beiden Strängen des XRE entsprachen, von einem unabhängigen Vertragspartner (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA) synthetisiert. Die Sequenz des XRE wird von M. Denison et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 17221-24, beschrieben. Die Oligonucleotide wurden mit überstehenden BamHI-kompatiblen Enden synthetisiert.
Die Oligonucleotide wurden in Wasser zu einer Endkonzentration von 500 pmollml gelöst. Anschließend wurden 50 µg jedes Oligonucleotids zusammen in einer 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, und 1 mM EDTA enthaltenden Lösung vermischt und 5 Minuten gekocht. Anschließend wurde die Lösung über Nacht bei 68ºC inkubiert, damit die Stränge miteinander anelieren konnten. Die doppelsträngigen Oligos wurden anschließend auf einem 12% Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen und durch Ausschneiden der Bande und Elektroelution der DNA gereinigt.
Die gereinigten Response-Elemente wurden anschließend mit Kinase behandelt und in die BamHI-Stelle von pBLCAT2 [M. Denison et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 17221-24] genau stromaufwärts des tk-Minimalpromotors cloniert.
Weitere Response-Element-CAT-Fusionen können in ähnlicher Weise unter Verwendung aller vorstehend beschriebenen veröffentlichten Nucleotidsequenzen der verschiedenen Response-Elemente hergestellt werden, um geeignete Oligonucleotidprimer fur die PCR zu entwickeln. CAT-Fusionen mit den folgenden Response- Elementen wurden zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Kits und Verfahren hergestellt: XRE, NFkB, CRE, p53RE und RARE.

Beispiel 5

Test von Toxinen unter Verwendung von Streßpromotor-CAT-Fusionen

Etwa 5 x 10&sup4; Zellen von jedem der vorstehend in den Beispielen 3 und 4 beschriebenen 14 transformierten Stämme wurden separat in einer Reihe von 12 Vertiefungen in einer von zwei 96 Vertiefungen aufweisenden Platten plattiert. Eine nicht-transformierte menschliche Leberzellinie wurde in den Vertiefungen der letzten Reihe der zweiten Platte plattiert, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu ermitteln. Die Zellen wurden in 10% komplettem minimalem essentiellem Medium (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) bei 37ºC und 5% CO&sub2; bis zum Erreichen einer Konfluenz von 90% gezüchtet.
Es wurden fünf oder sechs verschiedene Konzentrationen der nachstehend in Tabelle 3 aufgeführten verschiedenen Chemikalien, die im geeigneten Lösungsmittel gelöst waren, in dreifacher Ausführung getestet. Tabelle 3 Testverbindungen
Die verschiedenen Konzentrationen wurden durch Herstellung einer Verdünnungsreihe erhalten. Für TCDD wurden zunächst 20 µl Medium von jeder Vertiefung der Spalten 3 bis 10 und 10 µl von den Spalten 11 und 12 der 96 Vertiefungen aufweisenden Platten entnommen. 10 µl einer 200 µm Lösung der Testchemikalie wurden in jede Vertiefung der Spalten 11 und 12 gegeben. Die Flüssigkeit in diesen Vertiefungen wurde mit einem Multikanal-Pipetman unter Verwendung von separaten Pipettenspitzen fur jede Spalte gut vermischt und 20 µl wurden anschließend von den Vertiefungen der Spalte 12 in die Spalte 10 transferiert. Die Flüssigkeit in Spalte 10 wurde vermischt, anschließend wurden 20 µl in Spalte 8 transferiert und das Verfahren bei den geradzahligen Spalten bis zur Spalte 4 wiederholt. Das gleiche Verfahren wurde bei den ungeradzahligen Spalten beginnend mit Spalte 11 und endend mit Spalte 3 durchgeführt. Die Spalten 1 und 2 von jeder Reihe repräsentieren unbehandelte Kontrollen. Die Platten wurden anschließend über Nacht bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert.
Am Ende der Inkubation wurden die Medien vorsichtig aus allen Vertiefungen abgesaugt, ausgenommen der Reihe auf der zweiten Platte, die die Lebensfähigkeit der Zellen anzeigte. Die Zellen in allen außer der letzten Reihe wurden zweimal mit 200 µl phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Waschen wurden 100 µl Zellysepuffer (5 mM Mops, 2,5 mM NaCl, 0,38 mM MgCl&sub2;, 0,25% Triton X-100, pH 6,5 unter Verwendung von NaOH) jeder Vertiefung zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Lysate der Vertiefungen, die doppelte Konzentrationen der Chemikalie enthielten, kombiniert, indem 100 µl Lysat der Spalte 12 in die Spalte 11, der Spalte 10 in die Spalte 9 und so weiter transferiert wurden.
Das Gesamtprotein in jeder Vertiefung wurde, wie nachstehend beschrieben, getestet. Zu zwei frischen 96 Vertiefungen aufweisenden Platten wurden 190 µl 1 x Proteintestreagenz (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) zu jeder Vertiefung der Spalten 1 bis 7 zugesetzt. 10 µl Zellysat wurden aus den Vertiefungen in Spalte 1 der Toxintestplatte in die Spalte 2 der Proteintestplatte, von Spalte 3 der Toxintestplatte in die Spalte 3 der Proteintestplatte, von der Spalte 5 der Toxintestplatte in Spalte 4 der Proteintestplatte und so weiter transferiert. Die Platten wurden anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und anschließend wurde die Absorption von jeder Vertiefung bei OD&sub6;&sub0;&sub0; gemessen.
Der CAT-Test wurde unter Verwendung eines CAT ELISA-Kits (5 Prime - 3 Prime, Inc., Boulder, CO) und gemäß den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. 190 µl jedes Zellysats der Toxintestplatten wurden zur Ermittlung der CAT-Aktivität verwendet. Der CAT-Test konnte dreieinhalb Stunden bei Raumtemperatur ablaufen. Die CAT-Aktivität wurde unter Verwendung eines biotinylierten anti-CAT-Antikörpers, gefolgt von einer Streptavidin-konjugierten alkalischen Phosphatase und schließlich dem kolorimetrischen Substrat p-Nitrophenylphosphat gemessen. Die Farbentwicklung wurde bei OD&sub4;&sub0;&sub5; gemessen.
Das Vielfache der Induktion wurde unter Verwendung der nachstehenden Formel berechnet:
OD&sub4;&sub0;&sub5; (Testprobe)/OD&sub6;&sub0;&sub0; (Testprobe)
OD&sub4;&sub0;&sub5; (Kontrolle)/OD&sub6;&sub0;&sub0; (Kontrolle)
Die Ergebnisse aller Experimente sind in den Figuren 1 bis 11 graphisch dargestellt.

Beispiel 6

Identifizierung von Antitoxinen

Nach der Feststellung, daß eine unbekannte Verbindung ein Toxin ist, da sie einen oder mehrere Säuger-Streßpromotoren induziert, kann das gleiche Verfahren zur Identifizierung eines potentiellen Antitoxins verwendet werden.
Es wird gezeigt, daß eine unbekannte Verbindung den HMO-Promotor und den GADD153-Promotor in jedem der hier beschriebenen Tests induziert. Dies zeigt, daß die Verbindung oxidativen Streß und eine DNA-Schädigung bewirkt. Eine Möglichkeit ist, daß die Verbindung die Bildung von Wasserstoffperoxid in ausreichend hohen Mengen bewirkt, was zu DNA-Strangbrüchen führt. Von der Ascorbinsäure ist bekannt, daß sie die Zahl der Wasserstoffperoxid-induzierten DNA-Strangbrüche reduziert und daher ein potentielles Antitoxin für diese unbekannte Verbindung ist.
HepG2-Zellen werden, wie in Beispiel 2 beschrieben, gezüchtet. Die Zellen werden anschließend mit verschiedenen Verdünnungen von Ascorbinsäure 30 Minuten inkubiert. Die Zellen werden anschließend gegen die Konzentration der unbekannten Verbindung exponiert, von der zuvor festgestellt wurde, daß sie die HMO- und GADD153-Promotoren optimal induziert. Der Test auf eine Promotorinduktion (und gleichzeitige Streßgenexpression) wird anschließend, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt. Wenn die Ascorbinsäure-behandelten Zellen eine geringere Menge von HMO- oder GADD153-mRNA-Transkripten als Kontrollzellen produzieren, wird sie als Antitoxin angesehen.
Obwohl hier vorstehend eine Reihe von erfindungsgemäßen Ausführungsformen präsentiert wurden, ist es offensichtlich, daß die grundlegende Konstruktion verändert werden kann, um weitere die erfindungsgemäßen diagnostischen Kits, Verfahren und Produkte verwendenden Ausführungsformen bereitzustellen. Daher ist zu beachten, daß der erfindungsgemäße Schutzbereich durch die hier angefügten Ansprüche und nicht durch die hier vorstehend als Beispiel präsentierten spezifischen Ausführungsformen definiert ist.

Sequenzprotokoll

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder: XenometirX, Inc. (alle Staaten außer USA)
2860 Wilderness Place
Suite 150
Boulder, Colorado 80301
Vereinigte Staaten von Amerika
(i) Anmelder: Farr, Spencer B (nur USA)
2852 Kalmia Avenue
Boulder, Colorado 80301
Vereinigte Staaten von Amerika
(i) Anmelder: Todd, Marque D (nur USA)
8200 North Sheridan Boulevard
Nr.904
Westminster, Colorado 80003
Vereinigte Staaten von Amerika
(ii) Titel der Erfindung: Verfahren und diagnostische Kits unter Verwendung von Säuger-Streßpromotoren zur Bestimmung der Toxizität einer Verbindung
(iii) Zahl der Sequenzen: 45
(iv) Korespondenzadresse:
(A) Empfänger: James F. Haley, Jr.
(B) Straße: 1251 Avenue of the Americas
(C) Stadt: New York
(D) Staat: New York
(E) Land: Vereinigte Staaten von Amerika
(F) ZIP: 10020
(v) Computer-lesbare Form:
(A) Mediumtyp: Floppy-Disk
(B) Computer: IBM PC-kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release #1,0, Version #1.25
(vi) Aktuelle Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer:
(B) Einreichungsdatum:
(C) Klassifikation:
(vii) Bisherige Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: US 08/008,896
(B) Einreichungsdatum: 21.Jan.1993
(viii) Anwaltslagenten-Information:
(A) Name: Marks, Andrew S
(B) Registrierungsnummer: 33,259
(C) Referenz-/Aktennummer: X-1 CIP
(ix) Telekommunikationsinformation:
(A) Telefon: (212) 596-9000
(B) Telefax: (212) 596-9090
(C) Telex: 14-8367
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(C) Strangform: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekultyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(xi) Sequenzbeschreibung: [SEQ ID No: 33]
(2) Information zu [SEQ ID No: 34]
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 45 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekultyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(xi) Sequenzbeschreibung: [SEQ ID No: 34]
(2) Information zu [SEQ ID No: 35]
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 50 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(xi) Sequenzbeschreibung: [SEQ ID No: 35]
(2) Information zu [SEQ ID No: 36]
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 50 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(xi) Sequenzbeschreibung: [SEQ ID No: 36]
(2) Information zu [SEQ ID No: 37]
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 47 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekultyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(xi) Sequenzbeschreibung: [SEQ ID No: 37]
(2) Information zu [SEQ ID No: 38]
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 35 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekultyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(xi) Sequenzbeschreibung: [SEQ ID No: 38]
(2) Information zu [SEQ ID No: 39]
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 50 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(xi) Sequenzbeschreibung: [SEQ ID No: 39]
(2) Information zu [SEQ ID No: 40]
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 50 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(xi) Sequenzbeschreibung: [SEQ ID No: 40]
(2) Information zu [SEQ ID No: 41]
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 50 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekultyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(xi) Sequenzbeschreibung: [SEQ ID No: 41]
(2) Information zu [SEQ ID No: 42]
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 45 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekultyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(xi) Sequenzbeschreibung: [SEQ ID No: 42]
(2) Information zu [SEQ ID No: 43]
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 50 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(xi) Sequenzbeschreibung: [SEQ ID No: 43]
(2) Information zu [SEQ ID No: 44]
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 20 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekultyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(xi) Sequenzbeschreibung: [SEQ ID No: 44]
(2) Information zu [SEQ ID No: 45]
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 20 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekultyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(xi) Sequenzbeschreibung: ID No: [SEQ ID No: 45]

Claims

1. Diagnostischer Kit zur Identifizierung und Charakterisierung einer toxischen Verbindung, umfassend

(a) eine eukaryotische Zelle, gekennzeichnet durch:

(i) mindestens einen Promotor der auf Redoxstreß reagiert;

(ii) mindestens einen Promotor, der auf DNA-Streß reagiert;

(iii) mindestens einen Promotor, der auf Proteinstreß reagiert; und

(iv) mindestens einen Promotor der auf Energie- /Ionenstreß reagiert,

wobei die Promotoren mit unterschiedlichen Genen funktionell verbunden sind, die unterschiedliche nachweisbare Produkte codieren; und

(b) mindestens vier verschiedene Nucleinsäuresequenzen, wobei jede der Nucleinsäuresequenzen in der Lage ist, mit dem mRNA-Transkript eines der anderen Gene zu hybridisieren, das funktionell mit den Promotoren verbunden ist, oder mit einer einzelsträngigen cDNA, die von diesem mRNA-Transkript hergestellt worden ist,

wobei die Identifizierung und Charakterisierung der toxischen Verbindung durch die Erzeugung eines Streßinduktionsprof ils für die Verbindung erreicht wird.

2. Diagnostischer Kit zur Identifizierung und Charakterisierung einer toxischen Verbindung, umfassend:

(a) eine eukaryotische Zelle, gekennzeichnet durch mindestens vier verschiedene Promotoren, die auf eine einzige Kategorie von Streß reagieren, ausgewählt aus Redoxstreß, DNA-Streß, Proteinstreß oder Energie-/Ionenstreß; oder eine Säugerzelle, gekennzeichnet durch mindestens drei verschiedene Promotoren, die auf Zelloberflächenrezeptorstreß reagieren; wobei jeder der Promotoren mit einem Gen funktionell verbunden ist, das ein anderes nachweisbares Produkt codiert; und

(b) die gleiche Anzahl unterschiedlicher Nucleinsäuresequenzen wie unterschiedliche Promotoren in dem Kit vorhanden sind, wobei die Nucleinsäuresequenzen in der Lage sind, mit dem mRNA-Transkript eines der anderen Gene zu hybridisieren, das funktionell mit jedem der Promotoren verbunden ist; oder zu einer einzelsträngigen cDNA, die von diesem mRNA-Transkript hergestellt wurde,

wobei die Identifizierung und Charakterisierung der toxischen Verbindung durch die Erzeugung eines Streßinduktionsprofils für die Verbindung erreicht wird.

3. Diagnostischer Kit zur Identifizierung und Charakterisierung einer toxischen Verbindung, mindestens umfassend:

(a) eine erste eukaryotische Zelle, die mindestens einen Promotor oder ein Response-Element trägt, der (das) auf Redoxstreß reagiert;

(b) eine zweite eukaryotische Zelle, die mindestens einen Promotor oder ein Response-Element trägt, der (das) auf DNA-Streß reagiert;

(c) eine dritte eukaryotische Zelle, die mindestens einen Promotor oder ein Response-Element trägt, der (das) auf Proteinstreß reagiert; und

(d) eine vierte eukaryotische Zelle, die mindestens einen Promotor oder ein Response-Element trägt, der (das) auf Energie-/Ionenstreß reagiert;

wobei jeder der Promotoren oder Response-Elemente funktionell mit einem heterologen Gen verbunden ist, das ein nachweisbares Produkt codiert,

4. Diagnostischer Kit zur Identifizierung und Charakterisierung einer toxischen Verbindung, umfassend:

(a) mindestens 4 verschiedene eukaryotische Zellen, die jeweils einen unterschiedlichen Promotor oder Response-Element tragen, der (das) auf eine einzige Kategorie von Streß reagiert, ausgewählt aus Redoxstreß, DNA-Streß, Proteinstreß oder Energie-/Ionenstreß, oder

(b) mindestens 3 verschiedene Säugerzellen, die jeweils einen unterschiedlichen Promotor oder ein Response Element tragen, der (das) auf Zelloberflächenrezeptors treß reagiert;

wobei jeder der Promotoren funktionell mit einem heterologen Gen verbunden ist, das ein nachweisbares Produkt codiert,

5. Verfahren zur Bestimmung der Toxizität einer Verbindung, umfassend die Schritte:

(a) getrennte Züchtung einer oder mehrerer eukaryotischer Zellen, die insgesamt gekennzeichnet sind durch:

(i) mindestens einen Promotor oder ein Response- Element, der (das) auf Redoxstreß reagiert;

(ii) mindestens einen Promotor oder ein Response- Element, der (das) auf DNA-Streß reagiert;

(iii) mindestens einen Promotor oder ein Response- Element, der (das) auf Proteinstreß reagiert; und

(iv) mindestens einen Promotor oder ein Response- Element, der (das) auf Energie-/Ionenstreß reagiert,

wobei jeder der Promotoren oder Response-Elemente mit einem Gen funktionell verbunden ist, das ein nachweisbares Produkt codiert;

(b) Aussetzen jeder der einen oder mehreren Zellkulturen der Verbindung;

(c) Quantifizierung des nachweisbaren Produkts in jeder der Kulturen, und

(d) Erzeugung eines Streßinduktionsprofils für die Verbindung.

6. Verfahren zur Bestimmung der Toxizität einer Verbindung, umfassend die Schritte:

(a) getrennte Züchtung:

(i) einer oder mehrerer eukaryotischer Zellen, die insgesamt gekennzeichnet sind durch mindestens 4 verschiedene Promotoren oder Response-Elemente, die auf eine einzige Kategorie von Streß reagieren, ausgewählt aus Redoxstreß, DNA-Streß, Proteinstreß oder Energie-/Ionenstreß; oder

(ii) einer oder mehrerer Säugerzellen, die insgesamt gekennzeichnet sind durch mindestens 3 verschiedene Promotoren oder Response-Elemente, die auf Zelloberflächenrezeptorstreß reagieren,

wobei jeder der Promotoren oder Response-Elemente funktionell mit einem Gen verbunden ist, das ein nachweisbares Produkt codiert;

(b) Aussetzen jeder der einen oder mehreren Zellkulturen der Verbindung;

(c) Quantifizierung des nachweisbaren Produkts in jeder der Kulturen; und

(d) Erzeugung eines Streßinduktionsprofils für die Verbindung.

7. Diagnostischer Kit nach Anspruch 2 oder 4, oder Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Promotoren oder Response- Elemente auf Redoxstreß reagieren.

8. Diagnostischer Kit nach Anspruch 2 oder 4, oder Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Promotoren oder Response- Elemente auf DNA-Streß reagieren.

9. Diagnostischer Kit nach Anspruch 2 oder 4, oder Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Promotoren oder Response- Elemente auf Proteinstreß reagieren.

10. Diagnostischer Kit nach Anspruch 2 oder 4, oder Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Promotoren oder Response- Elemente auf Energie-/Ionenstreß reagieren.

11. Diagnostischer Kit nach Anspruch 2 oder 4, oder Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Promotoren oder Response Elemente auf Zelloberflächenrezeptorstreß reagieren

12. Diagnostischer Kit nach Anspruch 1 oder 3, oder Verfahren nach Anspruch 5, wobei der diagnostische Kit oder das Verfahren zusätzlich gekennzeichnet ist durch mindestens eine Säugerzelle, die einen Promotor umfaßt, der auf Zelloberflächenrezeptor-vermittelten Streß reagiert, wobei der Promotor funktionell mit einem Gen verbunden ist, das ein nachweisbares Produkt codiert.

13. Diagnostischer Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 7 bis 10 oder 12, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10 oder 12, wobei jede der eukaryotischen Zellen eine Säugerzelle ist.

14. Diagnostischer Kit nach Anspruch 11 oder 13, oder Verfahren nach Anspruch 11 oder 13, wobei die Säugerzelle eine HepG2-Zelle ist.

15. Diagnostischer Kit nach Anspruch 11 oder 12, oder Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Säugerzelle, die einen Promotor umfaßt, der auf Zelloberflächenrezeptor-vermittelten Streß reagiert, eine Zelle ist, die von der Haut oder vom Auge stammt.

16. Diagnostischer Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 7, 12 oder 13 bis 15, insoweit die Ansprüche 13 bis 15 abhängig sind von den Ansprüchen 1 bis 4, 7 oder 12, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, 12 oder 13 bis 15, insoweit die Ansprüche 13 bis 15 abhängig sind von den Ansprüchen 5 bis 7 oder 12, wobei der Promotor oder das Response-Element, (der) das auf Redoxstreß rea giert, ausgewählt ist aus CYP1A1, GST Ya, JUN, XRE, NFkBRE, RARE, ThRE, PPRE, ERE, NMOl, ALDH1, ALDH2, HMO, MnSOD, UGT, CYP11B2, Cu.ZnSOD, ADPRT, GP, FAOxase, PBE, PPAR, EH, CYP2B2, CYP2E1, CYP3A3, P450b, P450d, PPa, PKC, GST2, GAPDH, NQO oder ARE.

17. Diagnostischer Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 8, 12 oder 13 bis 15, insoweit die Ansprüche 13 bis 15 abhängig sind von den Ansprüchen 1 bis 4, 8 oder 12, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 6, 8, 12 oder 13 bis 15, insoweit die Ansprüche 13 bis 15 abhängig sind von den Ansprüchen 5, 6, 8 oder 12, wobei der Promotor oder das Response-Element, der (das) auf DNA-Streß reagiert, ausgewählt ist aus GST Ya, GADD45, JUN, FOS, XHF, GADD153, TRE, p53RE, HMO, DRA, MnSOD, MDR-1, EGR-1, GAS 2,3, MGMT, DNA Pol, beta-pol, DHFR, TK, PCNA, PGHS, LOX, ISG15, 2'-5' AS, EH, CYP2E1, TPO1, TPO2, PCNA oder PPa.

18. Diagnostischer Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 9, 12 oder 13 bis 15, insoweit die Ansprüche 13 bis 15 ab hängig sind von den Ansprüchen 1 bis 4, 9 oder 12, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 6, 9, 12 oder 13 bis 15, insoweit die Ansprüche 13 bis 15 abhängig sind von den Ansprüchen 5, 6, 9 oder 12, wobei der Promotor oder das Response-Element, der (das) auf Proteinstreß reagiert, ausgewählt ist aus GRP78, JUN, FOS, HSP70, MT 1A, MT IIA, MT III oder GP.

19. Diagnostischer Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 10, 12 oder 13 bis 15, insoweit die Ansprüche 13 bis 15 abhängig sind von den Ansprüchen 1 bis 4, 10 oder 12, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 6, 10, 12 oder 13 bis 15, insoweit die Ansprüche 13 bis 15 abhängig sind von den Ansprüchen 5, 6, 10 oder 12, wobei der Promotor, der auf Energie-/Ionenstreß reagiert, ausgewählt ist aus GRP78, FOS, CRE, CYP11B2, 2'-5' AS, TH, DBH, ODC, CYP2E1, G6PD, PKC oder PVALB.

20. Diagnostischer Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 11, 12 oder 13 bis 15, insoweit die Ansprüche 13 bis 15 abhängig sind von den Ansprüchen 1 bis 4, 11 oder 12, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 6, 11, 12 oder 13 bis 15, insoweit die Ansprüche 13 bis 15 abhängig sind von den Ansprüchen 5, 6, 11 oder 12, wobei der Promotor, der auf Zelloberflächenrezeptor-vermittelten Streß reagiert, ausgewählt ist aus IL-1 alpha, G-CSF, GM-CSF, TNF alpha, IL-3, IL-8, IL-6, ICAM-1, IL-10 und M-CSF.

21. Diagnostischer Kit nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 5, wobei:

(a) die Promotoren ALDHL, CYP1A1, FOS, GADD153, HMO, HSP70, JUN und MT IIA umfassen; und

(b) die eukaryotische Zelle eine HepG2-Zelle ist.

22 Diagnostischer Kit nach Anspruch 3, oder Verfahren nach Anspruch 5, wobei:

(a) die Promotoren oder Response-Elemente CYP1A1, GST Ya, GADD45, FOS, XHF, HSP70, MT IIA, GADD153, CRE, XRE, NFkBRE, RARE und p53RE umfassen; und

(b) die eukaryotischen Zellen HepG2-Zellen sind.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 22, wobei jeder der Promotoren oder Response-Elemente in der gleichen Zelle ist und wobei die Quantifizierung des nachweisbaren Produkts die Schritte umfaßt:

(a) Isolierung von mRNA aus der Kultur, die der Verbindung ausgesetzt wurde; und

(b) Quantifizierung der Menge an mRNA, die in der Kultur von jedem Gen transkribiert wurde, das funktionell mit jedem der Streßpromotoren oder Response-Elemente verbunden ist.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 22, wobei die Gene, die ein nachweisbares Produkt codieren, heterolog zu jedem der Promotoren oder Response-Elemente sind, und wobei jeder der Promotoren oder Response-Elemente von einer anderen Zelle getragen wird.

25. Diagnostischer Kit nach einem der Ansprüche 3, 4 oder 7 20 bis 22, insoweit Ansprüche 7 bis 22 abhängig sind von Anspruch 3 oder 4, oder Verfahren nach Anspruch 24, wobei jeder der Promotoren oder Response-Elemente funktionell mit einem Gen verbunden ist, das das gleiche heterologe nachweisbare Produkt codiert.

26. Diagnostischer Kit nach Anspruch 25 oder Verfahren nach Anspruch 24, wobei das heterologe nachweisbare Produkt CAT ist.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 26, umfassend den zusätzlichen Schritt der Inkubation der Verbindung mit einem 59-Leberextrakt, bevor eine oder mehrere Zellkulturen der Verbindung ausgesetzt werden.

28. Verfahren zur Identifizierung eines Antitoxins zu einer neuen toxischen Verbindung, umfassend die Schritte:

1(a) Bestimmung der Art des Stresses, der durch die neue toxische Verbindung verursacht wird, unter Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 5 bis

(b) Identifizierung einer bekannten toxischen Verbindung, die in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 27, einen Streß verursacht, der ähnlich ist zu dem, der durch die toxische Verbindung verursacht wird; und

(c) Wiederholung des Verfahrens, das zur Bestimmung der Art des Stresses benutzt wurde, der durch die neue toxische Verbindung verursacht wird, gemäß Schritt (a) mit dem zusätzlichen Schritt der Behandlung der in diesem Verfahren benutzten eukaryotischen Zellen mit einem Antitoxin zu der bekannten toxischen Verbindung, die in Schritt (b) identifiziert wurde.

29. Verfahren zur Verminderung der Toxizität eines Wirkstoffs, umfassend die Schritte:

(a) Bestimmung der Art des Stresses, die durch den Wirkstoff verursacht wird, unter Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 5 bis 27; und

(b) Modifizierung des Wirkstoffs, um den Teil zu verändem oder zu beseitigen, von dem man annimmt, daß er den festgestellten Streß verursacht.

30. Verfahren nach Anspruch 29, weiterhin umfassend, nach Schritt (b) den zusätzlichen Schritt:

(c) Wiederholung des Verfahrens, das zur Bestimmung der Art des Stresses benutzt wurde, der durch den Wirkstoff verursacht wird, gemäß Schritt (a) unter Verwendung des modifizierten Wirkstoffs gemäß Schritt (b).

31. Modifizierter Wirkstoff, der durch das Verfahren nach Anspruch 29 oder 30 hergestellt wird.