DE60225722T2

DE60225722T2 - Verfahren zur identifizierung eines neuen ziels zur verwendung bei der entwicklung von gegen tuberkulose wirksamen therapeutischen modalitäten und arzneistoffen

Info

Publication number: DE60225722T2
Application number: DE60225722T
Authority: DE
Inventors: Jaya Sivaswami Tyagi; Vandana Kapur
Original assignee: DIRECTOR ALL INDIA Institute OF; Director all India Institute of Medical Science New Delhi; Secretary Department of Biotechnology New Delhi; Secretary Department of Biotechnology
Current assignee: DIRECTOR ALL INDIA Institute OF; Director all India Institute of Medical Science New Delhi; Secretary Department of Biotechnology New Delhi; Secretary Department of Biotechnology
Priority date: 2002-02-08
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2009-04-09
Anticipated expiration: 2022-02-09
Also published as: DE60225722D1; GB2398302A; JP4229238B2; US7332340B2; US20050214754A1; GB2398302B; EP1472339A1; JP2005516615A; GB0412285D0; EP1472339B1; WO2003066838A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifizierung eines neuen Ziels zum Gebrauch für die Entwicklung von therapeutischen Modalitäten und Medikamenten, die wirksam sind gegen Tuberkulose. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Identifizierung eines neuen und neuartigen Ziels für die Entwicklung von therapeutischen Modalitäten umfassend Anti-Tuberkulose-Medikamente mit speziellem Bezug zu der Anwesenheit von Mykobakterien mit Persistenz bei Hypoxie.
Tuberkulose ist der häufigste Todesgrund von einem einzigen infektiösen Erreger, der mehr als 3 Millionen Leute pro Jahr weltweit tötet. Im Jahr 1998 betrug die geschätzte Anzahl von TB-Fällen in Indien 2.078.076 unter denen 935.134 Fälle wahrscheinlich infektiös waren. Die Konsequenz einer Infektion ist offensichtlich die Folge eines stetigen Wechselspiels zwischen dem Erreger und der Immunabwehr des Wirtes. In den meisten Fällen wird vom infizierten Individuum eine wirksame Immunantwort ausgelöst, die in Granulombildung gipfelt um den infizierten Herd und in einer Beendigung des Fortschreitens der Krankheit. Es wird vorhergesagt, dass die Umgebung innerhalb von Granulomen hypoxisch ist. Klinische Studien deuten an, dass die Bakterien innerhalb dieser Granulome nicht abgetötet werden, sondern stattdessen in einem schlafenden Zustand verbleiben. Dies wird als latente Infektion bezeichnet. Ca. 10% der latenten Infektionen werden wieder aktiv, resultierend in einer aktiven infektiösen Krankheit Monate bis Jahre später nach der ersten Infektion. Die große Zahl von latent infizierten Individuen stellt ein Haupthindernis bei der Reduzierung des Auftretens von Tuberkulose und der Rate der M. tuberculosis- Übertragung dar. Die Anpassung von M. tuberculosis während des Verlaufs der Infektion und Krankheit wird wahrscheinlich durch präzise genetische Bahnen, welche durch spezielle physiologische Bedingungen und Umweltbedingungen innerhalb des Wirtsgewebes verändert werden, bewirkt.
Es gibt einen dringenden Bedarf, diese Bahnen zu verstehen, um neuartige und direktere Strategien für die Prävention, Kontrolle und Behandlung der Tuberkulose zu entwickeln. Konventionelle Medikamente zielen auf Bahnen ab, die für das bakterielle Wachstum und deren Teilung, beispielsweise Zellwandbiosynthese und DNA-Replikation, erforderlich sind. Es wird angenommen, dass deren geringe Wirksamkeit gegen langsam wachsende oder nicht wachsende Bakterien ein wichtiger Grund ist, warum die derzeit benutzten Kuren solange benötigen, um die Infektion gänzlich auszurotten.
Es wird vorhergesagt, dass die devR-devS Gene, bezeichnet als Rv3133c und entsprechend Rv3132c gemäß der Kommentierung des M. tuberculosis Genoms, einen Regulator DevR für das Ansprechverhalten verschlüsselt enthalten und einen entsprechenden Histidinkinase-Sensor DevS. Dieses genetische System wurde früher in unserem Labor identifiziert durch subtraktive Hybridisierung unter Benutzung von RNS von ansteckenden und nicht ansteckenden Stämmen von M. tuberculosis (Bezug Nr. 1). Hier beschreiben wir das Verfahren zur Identifizierung dieses Systems als ein neues und neuartiges Ziel für die Entwicklung von therapeutischen Modalitäten umfassend Anti-Tuberkulose Medikamente mit speziellem Bezug zu der Anwesenheit von Mykobakterien mit Persistenz bei Hypoxie.
Deshalb ist das Hauptziel der Erfindung das Ziel zu identifizieren, welches verantwortlich ist für das Wiederauftreten bzw. die Reaktivierung der Krankheit bei dem Patienten oder welches dem Organismus ermöglicht, sich an die Hypoxie anzupassen.
Ein anderes Ziel dieser Erfindung ist das Ziel zu identifzieren, welches verantwortlich ist für das Wiederauftreten bzw. die Reaktivierung der Krankheit oder welches dem Organismus ermöglicht, sich an die Hypoxie anzupassen und therapeutische Modalitäten und Anti-Tuberkulose Medikamente zu entwickeln.
Gemäß dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung eines neuartigen Ziels zum Gebrauch für die Entwicklung von therapeutischen Modalitäten und Medikamenten, die wirksam gegen Tuberkulose sind, zur Verfügung gestellt, umfassend:

I. Unterbrechung des devR-Gens, das sich in einem ungefähr 3,3 kb ecoRI-HindIII Einschub eines Plasmids pJT53.34 mit Kanamyzinresistenz (KmR) Kassette befindet,
II. Konstruktion von pJQ200SkdevR::kan aus dem unterbrochenen devR-Gen,
III. Einführung des genannten Plasmids in M. tuberculosis H37Rv durch Elektroporierung,
IV. Auswählen eines einzelnen Crossover-Transformants indikativ für eine Plasmidintergration auf Middle Brook 7H10 Agar-Platten, welche 20 μg/ml Kanamyzin enthalten,
V. Analysieren derselbigen durch Polymerase Kettenreaktion (Polymerase chain reaction – PCR) auf die Anwesenheit von devR, Km^R und Saccharoseresistenz (SacB) Gensequenzen,
VI. Unterziehung der genannten Sequenzen dem Schritt der Southern-Analyse mit der devR-Probe, der devS-Probe und der Kanamyzinresistenz Genprobe, um so M. tuberculosis Dup devR zu bestimmen, der den Wildtyp enthält und die unterbrochenen Kopien des devR Lokus,
VII. Anzüchten von M. tuberculosis Dup devR in Middle Brook 7H9 Medium, das Kanamyzin mit 20 μg/ml und 2% Sacharose für 7 Tage enthält,
VIII. Ausbringen des genannten gewachsenen M. tuberculosis Dup devR-Stammes auf eine Vielzahl von Platten, die ein mittleres Middle Brook 7H10 Medium aufweisen, das 20 μg/ml Kanamyzin und 2% Saccharose darin enthält, um so kanamyzinresistente Transformanten zu erhalten,
IX. Unterziehung des besagten gewachsenen M. tuberculosis devR dem Schritt der Southern-Hybridisierung gefolgt von einem Polymerase Kettenreaktionsprozess zur Bestätigung des besagten allelischen Austauschs,
X. Unterziehung der besagten Transformanten dem Schritt der Polymerase Kettenreaktionsanalyse für das devR::kan unterbrochene Gen,
XI. Unterziehung des besagten devR::kan unterbrochenen Gens dem Schritt des Western Blottings und der Immuno-Elektronenmikroskopie zur Bestätigung der funktionellen Unterbrechung des genannten Gens,
XII. Auswertung der Entwicklungsfähigkeit des Wachstums des Stammes von M. tuberculosis devR Mutanten unter Bedingungen von Sauerstoffbegrenzung für devR und devS Genexpressionen,
XIII. Auswertung des Wachstums und der Entwicklungsfähigkeit des genannten Stammes von M. tuberculosis devR Mutanten unter Bedingung von Sauerstoffbegrenzung unter aeroben Bedingungen für die devR und devS Genexpressionen,
XIV. Unterziehung des besagten gewachsenen Stammes dem Schritt einer RT-PCR-Analyse auf Transkriptionen, die von dem Rv3134c-devR-devS Operon erhalten wurden,
XV. Abtasten der besagten Transkriptionen durch Benutzung des Ultra-Violet-Produkts Gel-Dokumentationssystem und Unterziehung derselben dem Schritt der densitometrischen Analyse unter Benutzung einer Computersoftware,
XVI. Testen von M. tuberculosis devR-Mutationsstamm auf Virulenz in Meerschweinchen.

Das Verfahren zur Identifizierung eines neuartigen Ziels zum Gebrauch für die Entwicklung von therapeutischen Modalitäten und Medikamenten, die wirksam gegen Tuberkulose sind, wird hier im Details beschrieben mit der Hilfe der begleitenden Zeichnungen, wobei:
1 zeigt die Konstruktion eines devR Mutantenstammes von M. tuberculosis

a) Southern-Hybridisierungsanalyse von rekombinanten M. tuberculosis-Stämmen
b) PCR-Analyse eines repräsentativen devR Mutantenklons.

2 zeigt

a) eine Western Blot Analyse von devR Mutant M. tuberculosis
b) eine Immuno-Elektronenmikroskopie von devR Mutant M. tuberculosis
c) eine in vitro morphologische Analyse von dem devR Mutant und H37Rv Stämmen von M. tuberculosis.

3 zeigt eine Expressionsanalyse von Rv3134c-devR-devS Operon bei Wildtyp- und Mutationsstämmen von M. tuberculosis.
4 zeigt Eigenschaften von Leber- und Lungengranulomen von Meerschweinchen, die mit devR Mutanten- und H37Rv-Stämmen von M. tuberculosis infiziert wurden.
Gemäß dem Verfahren dieser Erfindung wird das devR Gen von M. tuberculosis unterbrochen durch allelischen Austausch mit Hilfe von Standardtechnologien. Kurz gesagt wird das devR Gen, welches sich in einem ungefähr 3.3 kb EcoRI-HindIII Einschub des Plasmids pJT53.34 befindet, unterbrochen mit einem Kanamyzin Resistenz(Km^(R))gen an einem einzigen PpuMI Ort. Das unterbrochene devR Allel wird exzidiert als ein ApaI-BamHI-Fragment und geklont an die entsprechenden Orte des Plasmids pJQ200SK, welches pJQ200SkdevR::kan aufbaut. Dieses Plasmid wird in M. tuberculosis H37Rv durch Elektroporierung eingeführt. Einzelne Crossover Transformanten, die indikativ für eine Plasmidintegration sind, werden ausgewählt auf Middle Brook 7H10 Agarplatten, welche 20 μg/ml Kanamyzin enthalten, und durch Polymerase Kettenreaktion auf Anwesenheit von devR, Km^R und Saccharose (sacB) Gensequenzen untersucht. 25 Km^R Kolonien werden analysiert und nur 6 davon sind durch PCR positiv auf Km^R, was eine hohe Frequenz von spontanten Km^R (ungefähr 75%) bedeutet. Alle sechs Kolonien sind positiv auf sacB PCR, was die Beteiligung eines einzelnen Überführungsereignisses in der Generation von Km^R Kolonien anzeigt. Drei (von Sechs) sind positiv durch PCR für den Wildtyp devR (513-bp) und die devR::kan Produkte (1.8-kb), was darauf hindeutet, dass die Integration der durch Plasmid übertragenden devR::kan Kopie in das M. tuberculosis Chromosom aufgetreten ist. PCR-Proben, welche chromosom flankierende Primer zusammen mit Km^R gen-spezifischen Primern benutzen, deuten darauf hin, dass die Plasmidintegration in der Nähe des devR oder devS Lokus in einem Klon aufgetreten war. Bei Anwendung der Southern Hybridisierung mit der devR-Probe werden zwei Signale von 3.8 kb und ungefähr 9.5 kb erhalten im Gegensatz zu einem einzelnen Hybridisierungssignal von 3.8 kb, welches in dem Ausgangsstamm erhalten wurde. Identische Resultate werden bei Benutzung des devS Gens als Probe erhalten (1A). Die Hybridisierung mit der Km^R Genprobe hoben das ungefähr 9.5 kb Fragment hervor, welches das Rückgrat des Überträgers bildet, resultierend von einem einzelnen Crossover Rekombinationsereignis links von den Km^R Gen in dem devR oder devS Lokus. Der Merodiploidstamm beinhaltend den Wildtypus und die unterbrochenen Kopien des devR Lokus wird als M. tuberculosis Dup devR (1A) bezeichnet.
Das allelische Austauschereignis wird in einem zweiten Schritt ausgewählt durch Anzüchten von M. tuberculosis Dup devR auf einem Middle Brook 7H9 Medium, welches Kanamyzin (20 μg/ml) und 2% Sacharose enthält für 7 Tage. Fortlaufende Lösungen werden ausplattiert auf 7H10 Medium, welches Kanamyzin (20 μg/ml) und 2% Sacharose enthält. Insgesamt werden 87 Km^R und Saccharose resistente (Suc^R) Transformanten erhalten; 31 von diesen sind negativ auf PCR für das Wildtyp devR Gen, 18 davon sind positiv auf PCR für das devR::kan unterbrochene Gen. Sacharoseresistenz entstand durch eines von 2 Ereignissen; das sacB Gen geht entweder verloren als Ergebnis der Auflösung (64%) oder weist kumulierte Mutationen auf, einhergehend mit dem Verlust der Funktionsfähigkeit (36%). Der allelische Austausch wird durch Southern-Hybridisierung bestätigt. Kurz gesagt werden 16 (von 18) Km^R-Suc^R Transformanten mit devR und devS Genproben untersucht. Ein zweifaches Crossover Ereignis trat bei 15 Klonen auf, welches zu der Anwesenheit von einer devR::kan Kopie (5.1 kb Hybridisierungssignal) führte anstelle des Wildtyp devR Gens (3.8 kb Signal), wobei die Mutanten eine Tafeldifferenzgröße von 1.3 kb aufweisen entsprechend der Km^R Kassette, welche in den devR Lokus eingeschoben wurde. Die Hybridisierung mit der Km^R Genprobe bestätigte die Beibehaltung der Km^R Kassette-unterbrochenen devR Genkopie bei dem Chromosom. Das Fehlen der Hybridisierung bei der sacB Probe begründete, dass das Gen verschwunden war während der Auflösung der Tandem Duplizierung (nicht gezeigt). Ein typischer Klon ist in 1A gezeigt. Ein devR Knock-out Klon wird zufällig für die weitere Charakterisierung gewählt. Der Genersatz wird ebenso durch PCR (1B) bestätigt.
Die funktionelle Unterbrechung des devR Gens in dem Mutanten wird durch Western Blotting und Immuno-Elektronenmikroskopie unter Benutzung von Standardverfahren bestätigt. Mit Ultraschall bestrahlte logarithmische Phasenkulturen von M. tuberculosis H37Rv, des devR Mutanten und E. Koli unterliegen denaturierender Polyacrylamid-Gel-Elektroporese, und Proteine, die zu der Nitrozellulosemembran übertragen werden und mit einem polyclonalen Anti-DevR Antikörper untersucht werden, verdünnt 1:1000 und gezüchtet in Ratten gegenüber dem DevR Protein von M. tuberculosis. Die Immunoreaktivität wird durch Meerrettich-Peroxidase-konjungiertes Affen Anti-Ratten Immunoglobulin G und 3,3'-diamino-Benzidinsubstrat ermittelt. Das devR Protein wird sichtbar gemacht in M. tuberculosis H37Rv und im rekombinanten E. Coli Überexpressions DevR-Protein veranschaulicht, aber nicht in dem Mutantenstamm (2A). Durch Immuno-Elektronenmikroskopie tritt die DevR Kennzeichnung auf der Oberfläche auf und in dem Cytosol von Wildtyp-Organismen (25 +/–2.4 Gold Grains pro Bakterie) aber nicht in dem Mutantenstamm (2 +/–0,88 Gold Grains pro Bazille, 2B).
Die Morphologie des Mutanten- und dem Ausgangsbazillus wird durch Rasterelektronenmikroskopie verglichen. Mutantenbaktieren der logarithmischen Phase sind länger in der Größe (Durchschnitt 4–6 μm) im Vergleich zu dem Wildtyp-Bakterien (Durchschnitt 2–4 μm, 2c). Die Wachstumskurven des devR Mutanten- und des Ausgangsstamms, welche in dreifacher Ausfertigung unter aeroben Bedingungen in 7H9 kultiviert werden, enthaltend 10% Albumindextrose und 0,05% Tween 80, werden verglichen. Der Durchschnitt a₅₉₀ erhöhte sich von 0,054 am ersten Tag zu 1,41 am Tag 28 mit Wildtypkulturen und von 0,048 am ersten Tag zu 1,9 am Tag 28 für die Mutantenkulturen. Die Unterschiede von a₅₉₀ bei verschiedenen Zeitpunkten für den Mutanten- und Ausgangsstamm sind statistisch nicht signifikant (durch Wilcoxon Rang-Summen-Test) so dass es nahe liegt, dass die devR Mutation keinen signifikanten Einfluss auf das Wachstum von M. tuberculosis unter aeroben Bedingungen hat.
Der Effekt von Sauerstoffbegrenzung auf die Expressionen von devR und devS Genen von M. tuberculosis, welche früher als cotranskribiert in M. tuberculosis gezeigt wurden, wurde abgeschätzt. Die Benutzung eines In-vitro-Modells von M. tuberculosis im Ruhezustand, in dem die Kulturen angezüchtet wurden in Dubos Tween Albumin ohne Bewegung und langsam absteigend zu dem Boden des Kulturgefäßes, bei dem die niedrige Sauerstoffkonzentration das Wachstum beschränkt. Nach ca. 30 Tagen treten die Bakterien in eine stationäre/nicht reproduzierende Wachstumsphase ein. Während dieser Zeitspanne wuchs das Wildtypbakterium ca. 18 fach. Die Wildtyporganismen passten sich dem graduellen Sauerstoffmangel ohne einen feststellbaren Verlust an Lebensfähigkeit an. Das Mutantenbakterium wuchs nur ca. 5fach innerhalb der 30 Tageszeitspanne. Am Ende des Experimentes betrug die Lebensfähigkeit des Mutantenstammes cirka 25% der des Ausgangsstammes. Aerobe Schüttelkulturen von M. tuberculosis Ausgangs- und Mutantenstämmen werden gleichzeitig aufgezüchtet zur logarithmischen Phase (A₅₉₀ circa 0,4). Die RNS wird von der logarithmischen Phase isoliert, wobei 30-Tage und 40-Tage Kulturen ohne Bewegung unter Benutzung des Rneasy Minikits (Qiagen, Deutschland) und RT-PCR Analyse angewendet werden für Kopien, die von dem Rv3134c-devR-devS Operon (Rv3134c ist das erste Gen in diesem Operon) abstammen. Die Gele werden unter Benutzung des UVP Gel Dokumentationssystems überprüft und eine densitometrische Analyse wird unter Benutzung der Labworks^TM Analyse Software (Ultra-Violet-Produkt, USA) durchgeführt. Die Expression von devR, devS und Rv3134 c Genen ist hochreguliert auf circa 3- bis 4-fach in Wildtypkulturen unter hypoxischen Bedingungen. Eine Hochregulation wird ebenso beobachtet in dem Mutantenstamm, außer dass der Basislevel der Expression von dem Rv3134c- und dem devR-Gen circa 2,5-fach niedriger ist als der der bei dem Wildtyp-Stamm beobachtet wird. Wie erwartet werden Transkripte von dem Wildtyp devR-Gen nicht in dem Mutantenstamm festgestellt (3). Es wird angenommen, dass die Expression und Hochregulation von dem devS-Gen in dem Mutantenstamm aufgrund von Transkription stromaufwärts herrührt, da die Expression von der Km^R-Kassette (innerhalb des devR Gens) ebenso hochreguliert ist unter ähnlichen Bedingungen (Daten sind nicht gezeigt).
Das Verfahren zur Identifizierung eines neuartigen Ziels zum Gebrauch für die Entwicklung von therapeutischen Modalitäten und Anti-Tuberkulose-Medikamenten wird hier im Detail beschrieben.
Der Effekt der devR-Mutation bei in vivo Wachstum und die Fähigkeit Krankheiten in Meerschweinchen zu verursachen wird wie beschrieben ermittelt. Albinos, zufällig gezüchteten Meerschweinchen (5 Tiere pro Gruppe) wird subkutan 0,1 ml von wachstumsfähigen Bakterien in phosphatgepuffertem Salin (M. tuberculosis H37Rv × 10⁶ CFU und devR Mutant 3,2 × 10⁷ CFU) injiziert. Die Meerschweinchen wurden 47 Tage nach der Infektion getötet. Ein Tier (H37Rv Gruppe) welches vor dem Tötungstag einen Tod starb, der nicht auf Tuberkulose basiert, wurde von der Analyse ausgeschlossen. Die Menge an sichtbarer Tuberkulose bei den internen Organen wurde direkt nach der Tötung wie beschrieben bewertet. Ein starker Befall der Lungen, Leber, Milz und Lymphknoten wurde beobachtet bei den Meerschweinchen, welche mit M. tuberculosis H37Rv infiziert wurden. Die sichtbaren Bewertungen reichten von 43 bis 93 (Durchschnitt 77) und von 23 bis 48 (Durchschnitt 38,4) für Meerschweinchen, welche mit dem Ausgangs- und dem Mutantenstamm entsprechend infiziert wurden, wobei der Unterschied signifikant war (p < 0,05, Tabelle 1). Die Leber ist das am meisten betroffene Organ und eine starke Invasion mit zahlreichen großen Tuberkeln und Nekrosegebieten wurde in den Meerschweinchen beobachtet, welche mit dem Ausgangsstamm infiziert wurden. Milz und Lungen zeigten eine moderate Invasion mit zahlreichen kleinen Tuberkeln. Eine beträchtlich kleinere Anzahl von sichtbaren Läsionen wurde in den Organen der Meerschweinchen, welche mit dem Mutantenstamm (Tabelle 1) infiziert wurden, beobachtet. Die Milzen werden homogenisiert und mehrere Lösungen hintereinander werden auf LJ-Schrägen ausplattiert. Insgesamt 7,09 +/–0,83 Log₁₀ cfu werden von den Milzen der Tiere isoliert, welche mit dem Ausgangsstamm infiziert waren gegenüber 4,4 +/–1,21 Log₁₀ cfu, welche aus den Milzen der Tiere erhalten wurden, welche mit dem Mutantenstamm infiziert wurden, wobei der Unterschied signifikant ist (p < 0,05, Tabelle 1).
5 μm Abschnitte hintereinander von Leber- und Lungen Autopsie-Proben werden einer semiquantitativen Auswertung der histologischen Merkmale unterzogen wie vorher beschrieben (Organaufbau, der Prozentbereich, welcher durch die Granulome in dem Bereich eingenommen wird und der Prozentsatz der Hauptzellkomponenten innerhalb der Granulome). Leberschnitte von 3 der 5 Meerschweinchen, welche mit dem Mutantenstamm infiziert wurden, wiesen normalen Aufbau auf und zeigten keine Granulome oder die Anwesenheit von entzündlichen Zell-Infiltraten. In den verbliebenen zwei Tieren, welche mit dem Mutantenstamm infiziert wurden, wurden minimale, gut aufgebaute, nicht nekrotische epitheliode Zellgranulome beobachtet. Leberschnitte von allen vier Meerschweinchen, welche mit dem mit dem Ausgangsstamm infiziert wurden, zeigten die Anwesenheit von gut ausgestalteten Granulomen, die aus Epithelioid-Zellen und Lymphozyten bestehen. Andere Zelltypen gibt es nicht. In einem Tier ist das Granulom ausgedehnt (65%) und wird von der teilweisen Zerstörung der Organstruktur begleitet (4). Verglichen mit der Leber wurde eine sehr viel größere Mitleidenschaft der Lunge beobachtet. Der Lungenaufbau in allen Meerschweinchen, welche mit dem Mutantenstamm infiziert wurden, ist normal. Obwohl alle Tiere die Anwesenheit von Granulomen zeigten, war diese minimal und bestand sowohl aus Lymphozyten als auch Makrophagen. Riesige Zellen oder andere Zellen oder Nekrose wurden in keiner der Lungen beobachtet. Bei den Tieren, die mit dem Ausgangsstamm infiziert wurden, war eine Lunge von einem Meerschweinchen vollständig zerstört und bei den verbliebenen drei teilweise beschädigt. Das Granulom reichte von 40 bis 85% und variierte zwischen überwiegend lymphozytisch bis hauptsächlich histiozytisch (4).
Sieben Wochen nach der Infektion wurde signifikant weniger Organsymptomatik beobachtet und eine fast tausendfache niedrigere Bakterienbelastung wurde bei den Meerschweinchen wieder erlangt, welche mit dem Mutantenstamm infiziert wurden verglichen mit denen, die mit dem Ausgangsstamm infiziert wurden. Das Übergewicht der Epitheloid-Zellen gegenüber den Makrophagen und Lymphozyten in der Leber verglichen mit der Lunge deutet auf eine gute Immunantwort hin und eine fortgeschrittenere Auflösung der Granulome bei den vorangegangenen.
Somit ist beobachtet worden, dass das DevR-DevS-Zweikomponentensystem die Virulenz von M. tuberculosis beeinflusst und eine Schlüsselverbindung zur Regelung sein könnte zwischen der Sauerstoffbegrenzung und der Aktivierung und Aufrechterhaltung der angepassten Antwort bezüglich der Hypoxie. Es wird angenommen, dass mykobakterielle Anpassung an eine anaerobe Mikroumgebung ein Mittel für die Tuberkelbazillen zur Verfügung stellt, um auf unbestimmte Zeit in einem schlafenden/stationären phasenweise andauernden Zustand innerhalb von entzündlichen und nekrotischen Läsionen, beispielsweise Granulomen, zu bleiben. Somit kann dieses genetische System als wesentliches Ziel dienen für die Entwicklung von neuen und neuartigen Medikamenten für die Behandlung von Tuberkulose, insbesondere unter der Bedingung der Persistenz.

Claims

Verfahren zur Identifizierung eines neuen Ziels zum Gebrauch für die Entwicklung von therapeutischen Modalitäten und Medikamenten, die wirksam sind gegen Tuberkulose enthaltend die folgenden Schritte: I. Unterbrechung des devR- Gens (Rv3133c), das in einem ~ 3,3 kb EcoRI-HindIII Einschubs eines Plasmids pJT53.34 angeordnet ist, II. Konstruktion von pJQ200SkdevR::kan aus dem unterbrochenen devR-Gen, III. Einführung des genannten Plasmids in M. tuberculosis H37Rv, IV. auswählen eines einzelnen Crossover-Transformants indikativ für eine Plasmid-Integration auf Middle Brook 7H10 Agar Platten, die Kanamycin enthalten, V. analysieren derselbigen durch Polymerase-Kettenreationen (polymerase chain reaction – PCR) auf die Anwesenheit von devR Km^R und Sucrose Resistenz (SacB) Gensequenzen, VI. die genannten Sequenzen dem Schritt der Southern Analyse zu unterziehen, mit jeder der devR-Probe, devS-Probe und Km^R-Gen-Proben, um so M. tuberkulosis Dup devR zu bestimmen, die Wildarten enthalten und die unterbrochenen Kopien des devR-Locus, VII. anzüchten von M. tuberkulosis Dup devR in Middle Brook 7H9 Medium, das Kanamycin und Sucrose enthält, VIII. ausbringen der genannten gewachsenen M. tuberculosis Dup devR-Ketten in eine Vielzahl von Platten, die ein 7H10 Medium haben, das Kanamycin und Sucrose darin enthält, um so Kanamycin resistente Transformanten zu erhalten, um so devR-Mutationsketten von M. tuberculosis zu erhalten, IX. die genannten gewachsenen M. tuberculosis devR Mutanten dem Schritt einer Southern Hybridisation zu unterziehen gefolgt durch Polymerase-Kettenreaktions-Prozesse für die Bestätigung des Ersatzes von wildartigen devR Allelen mit unterbrochenen devR Allelen, X. die genannten M. tuberculosis devR Transformanten dem Schritt aussetzen der Polymerase-Kettenreaktions-Analyse auf devR kan unterbrochene Gene, XI. die genannten devR kan unterbrochenen Gene dem Schritt des Western-Blottings zu unterziehen und immuno elektronischer Mikroskopie zur Bestätigung der funktionellen Unterbrechung der genannten Gene, XII. Auswertung der Wachstumslebensfähigkeit der Ketten von M. tubverculosis devR Mutanten unter Bedingungen von Sauerstoffbegrenzung für devR- und devS-Genausdrücke, XIII. Auswertung der Wachstumslebensfähigkeit der genannten Ketten von M. tuberculosis devR Mutanten unter Bedingung von Sauerstoffbegrenzung in aeroben Bedingungen für devR- und devS-Genausdrücke, XIV. die genannten gewachsenen Ketten dem Schritt einer RT-PCR Analyse unterziehen auf Transkriptionen, die erhalten wurden von dem Rv3134c-devR-devS Operon, XV. scannen der genannten Transkriptionen durch Benutzung eines Ultraviolettdurchleuchters und einer Gel-Dokumentation sowie dieselben dem Schritt der densitometrischen Analyse zu unterziehen durch Gebrauch einer Computersoftware, XVI. testen von M. tuberculosis devR Mutationsketten auf Virilität in nichtmenschlichen Tieren.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Testen auf Virilität durchgeführt wird an Meerschweinchen und umfasst: (a) histopathologische Analyse der infizierten Organe des Meerschweinchens infiziert mit devR Mutanten und wildartigen Ketten von M. tuberculosis, und (b) rückgewinnen von M. tuberculosis aus der MHz von infizierten Tieren und Quantifizierung der Bakterienlast.
Das Verfahren gemäß Ansprüchen 1 oder 2, wobei das genannte devR Allele unterbrochen wird durch ein Kanamycinresistenz-(Km^R)-Gen an einer einzigen PpuMI Stelle.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das devR Allele herausgetrennt wird als ein ApaI-BamHI-Fragment und geklont wird in korrespondierenden Stellen des Plasmids pJQ200SK, um so pJQ200SKdevR::kan zu bilden.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Plasmid eingeführt wird in M. tuberculosis H37Rv durch Elektroporation.
Eine devR-Mutationskette von M. tuberculosis, bei der das wildartige devR Gen unterbrochen wird mit einem antibiotischen Resistenz-Gen.
Eine devR-Mutationskette für M. tuberculosis, erhalten durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
Eine devR Mutationskette für M. tuberculosis, zu erhalten durch ein Verfahren enthaltend die folgenden Schritte: I. Unterbrechung des wildartigen devR Gens (Rv3133c), das an einem a 3 kb EcoRI-HindIII Einschub eines Plasmid pJT53.34 angeordnet ist, mit einem antibiotischen-Resistenz-Gen an einer PpuMI Stelle, II. heraustrennen der unterbrochenen devR Allele als ein ApaI-BamHI Fragment und klonen desselben in die entsprechenden Stellen eines Plasmids pJQ200SK, III. einführen des Plasmids, das in Schritt II erhalten wurde, in ein wildartiges M. tuberculosis H37Rv, IV. auswählen eines einzelnen Crossover-Transformants indikativ für eine Plasmidintegration, V. kultivieren des einzelnen Crossover-Transformants, der in Schritt IV gewählt wurde, und auswählen von doppelten Crossover-Transformants, die nicht in der Lage sind, den wildartigen devR Typ auszudrücken, wodurch ein devR Mutationsstrang von M. tuberculosis erhalten wird.
Die devR-Mutationskette gemäß Anspruch 6 oder 8, bei der das antibiotische Resistenz-Gen ein Kanamycin-Resistenz-Gen ist.
Die devR-Mutationskette gemäß Anspruch 8, wobei das erhaltene Plasmid in Schritt II bestimmt wird als pJQ200SKdevR::kan.
Die devR-Mutationskette gemäß Anspruch 8 oder 10, bei der Schritt 3 bewirkt wird durch Elektroporation.
Die devR-Mutationskette gemäß einem der Ansprüche 7 bis 11, mit einem Abmessungsinkrement von 1,3 kb entsprechend der Km^R-Kassette, die in den devR Locus statt des wildartigen devR Gens eingeführt wurde, das ein 3.8 kb Signal hat.
Die devR-Mutationskette gemäß einem der Ansprüche 6 bis 12, dass 7 Wochen nach der Infektion bei Tieren eine fast tausendfach niedrigere Bakterienlast aufweist verglichen mit der Elternkette.