DE69919196T2

DE69919196T2 - Verfahren zum screening von antibakteriellen mitteln

Info

Publication number: DE69919196T2
Application number: DE69919196T
Authority: DE
Inventors: Robert Anthony COATES; Yanmin Hu
Original assignee: Helperby Therapeutics Ltd
Current assignee: Helperby Therapeutics Ltd
Priority date: 1998-11-09
Filing date: 1999-11-09
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2019-11-10
Also published as: JP2002529103A; JP3737365B2; ES2229780T3; US20050019892A1; DE69919196D1; WO2000028074A1; DK1129212T3; US7892782B2; US20020031819A1; AU1061100A; US20090104651A1; ATE272717T1; PT1129212E; EP1129212B1; EP1129212A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolation von Subpopulationen von Bakterien, die sich in der stationären Phase befinden und Resistenz gegen herkömmliche antibakterielle Wirkstoffe zeigen, sowie die Verwendung solcher resistenter Subpopulationen in Screening-Verfahren zur Identifizierung neuer und verbesserter antibakterieller Wirkstoffe, auf dadurch identifizierte völlig neue antibakterielle Wirkstoffe, sowie die therapeutische Anwendung solcher antibakterieller Wirkstoffe.
Tuberkulose ist und bleibt auf der ganzen Welt eine ernstzunehmende Krankheit und es wird geschätzt, dass die durch Tuberkulose verursachten Todesfälle 7% der Gesamtzahl an Todesfällen betragen, die durch Infektionskrankheiten verursacht werden. Wie in der US-Patentschrift 5,700,925 diskutiert, entwickelt die große Mehrheit mit Mycobacterium tuberculosis infizierten Personen nicht die symptomatische Tuberkulose, zeigt aber eine positive Reaktion auf den Tuberculin-Hauttest. In auf diese Weise infizierten Wirten liegen manche Bakterien in einem ruhenden oder latenten Status vor, in dem sie im wesentlichen gegen antimikrobielle Arzneimittel resistent sind. Im Laufe einer Lebensdauer kann sich bei bis zu 10% der auf diese Weise infizierten, jedoch symptomfreien Personen Tuberkulose entwickeln, oft erst viele Jahre nach der primären Infektion, wenn die ruhenden Bazillen aktiviert werden und anfangen zu wachsen. Dies kann zu pulmonarer Tuberkulose und zu anderen Varianten der Krankheit führen. Zu den Faktoren, die die Aktivierung der ruhenden Organismen und die Manifestierung des Krankheitszustandes prädisponieren, gehören Armut, ärmliche Verhältnisse, Unterernährung, Immunschwäche oder Immununterdrückung.
Im allgemeinen ist bei der Behandlung von Tuberkulose die antimikrobielle Therapie, bei der antibakterielle Wirkstoffe wie z. B. Rifampicin, Isoniazid und/oder Pyrazinamid verwendet werden, verhältnismäßig erfolgreich zur Bekämpfung aktiv wachsender Bakterien. Eine solche Therapie ist jedoch ineffektiv zur Bekämpfung von Bakterien, die sich im Ruhezustand befinden oder die, nach Durchlaufen einer Wachstumsphase, wieder in eine Ruhephase eintreten. Dies verursacht Probleme insbesondere bei der klinischen Behandlung von Patienten, die unter Tuberkulose leiden oder diese übertragen, da die Resistenz der ruhenden Organismen eine chemotherapeutische Langzeitbehandlung notwendig macht. Eine solche Langzeitbehandlung, die typischerweise sechs Monate dauert, ist unbefriedigend, da sie teuer ist, zu wenig Zustimmung bei den Patienten führen kann und während der Therapie die Entwicklung und das Auftreten von antibiotika-resistenten Bakterienstämmen des anvisierten M. tuberculosis und darüber hinaus fördern kann.
Es wird angenommen, dass die meisten pathogenen Bakterien, wie z. B. Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus gordonii und E. coli ähnliche, im wesentlichen gegen antibakterielle Wirkstoffe resistente Subpopulatio nen besitzen, die während oder nach einer Chemotherapie als Herd für eine erneute Infektionen fungieren können. Diese persistenten Bakterien sind gewöhnlich während eines Rückfalls Arzneimittel-sensitiv, woraus hervorgeht, dass ihre Resistenz gegen Chemotherapie eher phänotypischen als genetischen Ursprungs ist.
Um zu untersuchen, ob der Stoffwechsel solcher persistenter Bakterien abgeschaltet wird, wobei keine Zellteilung stattfindet (d. h. Sporen-ähnlich ist) oder aktiv bleibt (d. h. so dass die Zellen Metabolismusmarker, wie z. B. mRNA enthalten), haben wir M. tuberculosis in einem in vitro Modell der stationären Phase beobachtet, das durch die Langzeitkultivierung der Organismen in einem mikroaerophilen Gradienten erhalten wurde, in dem die in der stationären Phase befindlichen Organismen überlebensfähig sind. Es konnte gezeigt werden, dass solche Bakterien in der stationären Phase gegen Rifampicin in der normalen minimalen, inhibitorischen Konzentration (Mic) von 0,1 μg/ml resistent sind (bemessen mit Bakterien einer Konzentration von 10⁶–10⁷ cfu/ml). Des weiteren wurde die Lebensfähigkeit von M. tuberculosis in vivo vor und nach der Behandlung mit Antituberkulose-Wirkstoffen untersucht. Lebensfähig persistente, nicht kultivierbare Bakterien, deren Ruhezustand aufgehoben wurde, wenn die Wirtstiere einer Steroidtherapie unterzogen wurden, waren nach der Behandlung mit antibakteriellen Stoffen vorhanden.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der unerwarteten und überraschenden Erkenntnis, dass zwar die Behandlung solcher Bakterien in der stationären Phase mit antibakteriellen Wirkstoffen wie z. B. Rifampicin in Konzentrationen, die weit über der minimalen inhibitorischen Konzentration liegen, die Anzahl der Kolonien pro Platte auf Null Kolonien bildende Einheiten (CFU's) reduziert, dass aber dennoch eine kleine Zahl persistierender Organismen übrig bleibt, die z. B. durch Auszählung von Verdünnungen des Mediums detektiert werden können. Diese resistenten Subpopulationen sind phänotypisch resistent gegen Rifampicin, da sie bei Wiederaufnahme ihres Wachstums bei normalen MIC-Konzentrationen empfindlich für Rifampicin werden.
Vergleichbare Studien, bei denen Modellsysteme mit E. coli und S. aureus in der stationären. Phase verwendet und mit Kanamycin bzw. Ampicillin behandelt wurden, lieferten ähnliche Ergebnisse.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt schafft die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren zur Herstellung phänotypisch antibiotika-resistenter Subpopulationen von Bakterien in der stationären Phase, das mindestens aus den folgenden Schritten besteht:

i) Anzucht einer bakteriellen Kultur bis zur stationären Phase; und
ii) die Behandlung besagter Kulturen der stationären Phase mit einem oder mehreren antibakteriellen Wirkstoffen in einer Konzentration und über eine Zeitspanne, die ausreichen, um wachsende Bakterien abzutöten, wodurch eine phänotypisch antibiotika-resistente Subpopulation selektiert wird.

Im vorliegenden Text bezieht sich der Begriff „phänotypisch antibiotika-resistente" Bakterien auf einen Teil der Bakterien in der stationären Phase, deren Stoffwechsel aktiv bleibt (was z. B. durch transkriptionelle Aktivität festgestellt wird), nachdem den Bakterien in der stationären Phase ein bestimmtes Antibiotikum (oder mehr als ein Antibiotikum) in einer hohen Dosis, nämlich mindestens zehnmal höher als die MIC verabreicht wurde. Diese Subpopulation ist jedoch empfindlich für die Behandlung mit dem Antibiotikum, wenn sie sich nicht in der stationären Phase befindet. Es sei darauf hingewiesen, dass eine Subpopulation von Bakterien, die gegen ein bestimmtes Antibiotikum resistent ist, von einer Subpopulation verschieden sein kann, die gegen ein anderes Antibiotikum resistent ist.
Im vorliegenden Text bezieht sich der Ausdruck „töten" auf einen Verlust der Lebensfähigkeit, was durch ein Fehlen von Stoffwechselaktivität festgestellt wird. Um diesen Effekt zu erzielen, wird der stationären Phase Antibiotikum über eine angemessene Zeitspanne und mit einer angemessenen Konzentration verabreicht. Geeigneterweise wird Antibiotikum in einer Konzentration der 10 bis 10⁴ × MIC angewandt, z. B. bei einer Konzentration von 25 bis 150 μg/ml (z. B. 50 bis 100 μg/ml), bei einer Bakterienkonzentration von 10⁵ bis 10⁹ Bakterien/ml (z. B. 10⁶ bis 10⁷ Bakterien/ml). Geeigneterweise werden die Bakterien mit dem antibakteriellen Wirkstoff bzw. den antibakteriellen Wirkstoffen für 1 bis 10 Tage behandelt, z. B. drei bis fünf Tage.
Die Beschaffenheit des angewandten antibakteriellen Wirkstoffs kann von den speziell zu untersuchenden Bakterien abhängen. Die Verwendung von antibakteriellen Wirkstoffen wie z. B. Rifampicin, welches auf die RNA-Polymerase wirkt, z. B. in Konzentrationen von 10²-, 10³- oder 10⁴-fachen des normalen MIC-Niveaus wurde als geeignet befunden. In einer repräsentativen Ausführungsform dieses Gesichtspunkt der Erfindung lieferte die Behandlung von M. tuberculosis in der stationären Phase bei einem Pegel von 10⁶ Bakterien/ml für einen Tag mit 100 μg/ml Rifampicin (MIC × 10³) eine phänotypisch resistente Subpopulation von 10² Bakterien/ml. Alternativ kann M. tuberculosis auch mit Pyrazinamid behandelt werden. In weiteren Ausführungsformen führt die Behandlung von E. coli oder S. aureus in der stationären Phase (≃10⁹ Bakterien/ml) mit 50 μg/ml Kanamycin oder 100 μg/ml Ampicillin für drei Tage zu einer phänotypisch resistenten Subpopulation von ≃10⁵ Bakterien/ml.
Die phänotypisch antibiotika-resistente Subpopulation kann für die persistierenden Bakterien repräsentativ angesehen werden, die in vivo metabolisch aktiv bleiben und zu einem Rückfall oder einem Ausbrechen der Krankheit führen können. Von besonderem Interesse sind deshalb antibiotika-resistente Populationen von Bakterien, bei denen in vivo Ruhezustände vorkommen wie z. B. Bakterien der Gattungen Staphylococcus, Escherichia; Hämophilus und Mycobacterium. Besonders bevorzugt werden Subpopulationen der Bakterien Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus gordonii und Mycobacterium tuberculosis.
In besonders zu bevorzugenden Ausführungsformen handelt es sich um die Bakterien Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli und Staphylococcus aureus, die mit Rifampicin bzw. Kanamycin bzw. Ampicillin behandelt wurden.
Solche phänotypisch antibiotika-resistenten Subpopulationen von Bakterien in der stationären Phase, die durch Behandlung der Bakterien in der stationären Phase mit einer ho hen Dosis eines antibakteriellen Wirkstoffes gewonnen werden können, stellen ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung dar.
Darauf basierend, dass die phänotypisch resistenten Subpopulationen der Erfindung das Verhalten ruhender Bakterien in vivo nachahmen, stellen sie ein wertvolles Werkzeug in Screening-Verfahren dar, die entworfen wurden, um potentielle, wertvolle, neue, antibakterielle Wirkstoffe zu identifizieren. Es sei darauf hingewiesen, dass antibakterielle Wirkstoffe, die gegen solche phänotypisch antibiotika-resistenten Subpopulationen aktiv wirken, ein hohes therapeutisches Potential bei der Behandlung von Krankheiten wie Tuberkulose haben können, bei denen ruhende Bakterien einen Herd für Reinfektionen darstellen.
Deshalb liefert die vorliegende Erfindung gemäß einem weiteren Gesichtspunkt ein Verfahren für die Bestimmung der antibakteriellen Aktivität einer Testverbindung oder eines Wirkstoffs oder für die Identifizierung oder Isolierung einer Verbindung oder eines Wirkstoffes, die bzw. der antibakterielle Wirkung gegen Bakterien in der stationären Phase besitzt, welches die folgenden Schritte umfasst:

i) Anzucht einer Bakterienkultur bis zur stationären Phase;
ii) Behandlung der besagten Kultur in der stationären Phase mit einem oder mehreren antibakteriellen Wirkstoffen in einer Konzentration und über eine Zeitspanne, die ausreicht, um wachsende Bakterien zu töten, wodurch eine phänotypisch antibiotika-resistente Subpopulation selektiert wird;
iii) die Inkubation einer Probe der besagten phänotypisch antibiotika-resistente Subpopulation mit einer oder mehreren Testverbindungen oder einem oder mehreren Wirkstoffen; und
iv) das Feststellen irgendeines antibakteriellen Effektes gegen besagte phänotypisch antibiotika-resistente Subpopulation und optional die Isolation einer Verbindung oder eines Wirkstoffs, die bzw. der antibakterielle Aktivität zeigt.

Solch ein Prozess ermöglicht ein schnelles Screening einer großen Anzahl von Verbindungen auf rasche und effiziente Weise. Die zu screenenden Verbindungen können dabei irgendwelche chemischen Verbindungen sein und können selbst bereits bekannt oder neu sein. Zu den Verbindungen, die besonders gut geeignete Kandidaten darstellen, gehören die Produkte der kombinatorischen Chemie, Phagendisplay-Bibliotheken, Naturprodukte, synthetische, semisynthetische oder natürliche Homologe, Analoge, Derivate und Vorläufer von bekannten antimikrobiellen Wirkstoffen oder andere Pharmazeutika. Solche Homologe, Analoge, Derivate und Vorläufer sind Gebilde, die mit natürlich vorkommenden antimikrobiellen Stoffen oder anderen Pharmazeutika verwandt oder von diesen abgeleitet sind, z. B. im Falle eines Proteins oder eines Peptids durch einzelne oder multiple Aminosäure-Austausche, Additionen und/oder Deletionen oder die Veränderung des Grads der Glycosylierung, oder, falls es sich bei dem antimikrobiellen Stoff um eine chemische Verbindung handelt, durch chemische Derivatisierung, z. B. Veresterung, Zufügen verschiedener Substituenten, Methylierung usw. Vorzugsweise haben die oben beschriebenen Modifikationen keinen Einfluss auf die grundlegende Funktion des Moleküls, sie behalten also z. B. die antimikrobielle Aktivität, obwohl das Ausmaß dieser Aktivität jedoch verändert werden kann.
Um den Test durchzuführen, werden geeigneterweise 1 bis 1000 μl, z. B. 50 bis 300 μl der hergestellten antibiotika-resistenten Bakterien (die vor der Benutzung gewaschen werden), die 10³ bis 10⁶ Bakterien/ml enthalten, zu der zu testenden Probe gegeben, z. B. 0,1 bis 100 μg, vorzugsweise 1 bis 20 μg. Dies wird zusammen, bei einer für Stoffwechselaktivität geeigneten Temperatur von vorzugsweise 37°C inkubiert. Antibakterielle Effekte werden dann zu einem oder zu mehreren Zeitpunkten bestimmt, die von einem Tag bis zu vier Wochen reichen können, vorzugsweise einmal wöchentlich für vier Wochen.
Der Ausdruck „bestimmen", so wie er in diesem Text in Bezug auf antibakterielle Effekte benutzt wird, beinhaltet sowohl eine quantitative Bestimmung im Sinne des Erhaltens eines absoluten Wertes für das Ausmaß der antibakteriellen Aktivität als auch das Erhalten einer semiquantitativen Bestimmung oder einer anderen Anzeige, z. B. eines Index oder eines Verhältnisses des Umfangs der antibakteriellen Aktivität in der Probe. Die Bestimmung beinhaltet die Identifikation der beiden positiven Effekte in Bezug auf die bakterielle Aktivität. Die Identifikation und wahlweise Isolation von Wirkstoffen oder Verbindungen, die antibakterielle Effekte zeigen, wird jedoch bevorzugt. Solche antibakteriellen Effekte können entweder bakterizider oder bakteriostatischer Art sein, wobei die erstere bevorzugt wird.
Das Vorhandensein einer bakteriellen Aktivität kann durch den Vergleich der Anzahl an Stoffwechsel-aktiven oder lebenden Bakterien in der zu untersuchenden Probe im Vergleich zu Kontrollproben festgestellt werden. Diese Bestimmung kann durch irgendeine angemessene Methode erreicht werden, die die Stoffwechselaktivität erkennt. So können z. B. transkriptionale oder translationale Aktivitäten in Bezug auf ein Gen oder mehrere Gene bestimmt werden, z. B. durch die Überwachung des Ausmaßes an Gentranskription oder, allgemeiner, z. B. durch die Überwachung des Einbaus bestimmter Basen oder Aminosäuren. Alternativ können andere Verfahren verwendet werden, z. B. kann die Fähigkeit zur Koloniebildung bestimmt werden, d. h. es können cfu-Zählungen nach der Wiederbelebung in Flüssigmedium durchgeführt werden, obwohl direktes Ausplatzieren auf festem Medium, ohne zwischenzeitliche Kultivierung in flüssigem Medium, möglicherweise keine cfu ergibt. Die Verbindungen von Interesse können wahlweise in verschiedenen Konzentrationen erneut gescreent werden, z. B. um ein MIC-Niveau festzulegen.
Als Verbindungen oder Wirkstoffe mit antibakterieller Aktivität werden solche bezeichnet, die bei der verwendeten Konzentration die Stoffwechselaktivität der phänotypisch antibiotika-resistenten Subpopulation nachteilig beeinflussen, vorzugsweise durch die Reduzierung der Stoffwechselaktivität auf weniger als 50%, noch besser auf weniger als 25%, z. B. weniger als 10% im Vergleich zu unbehandelten Kontrollproben.
Auf diese Weise identifizierte, in Frage kommende Verbindungen, die z. B. eine minimale inhibitorische Konzentration von 10 μg/ml oder weniger in Bezug auf die resistente Sub population aufweisen, vorzugsweise 1 μg/ml oder weniger, noch besser 0,1 μg/ml (bestimmt mit Bakterien einer Konzentration von 10⁶ bis 10⁷ cfu/ml), können dann weiteren Untersuchungen, Wirksamkeits- und Toxizitätstests usw. unterzogen werden.
Das Screening-Verfahren der Erfindung kann als Anwendungspaket durchgeführt werden, für die Bestimmung der antibakteriellen Aktivität einer zu untersuchenden Verbindung oder zur Identifizierung eines antibakteriellen Wirkstoffs und beinhaltet mindestens das folgende:

i) eine phänotypisch antibiotika-resistente Subpopulation von Bakterien in der stationären Phase, so wie sie in diesem Text definiert wurden.

Vorzugsweise enthält das Anwendungspaket auch geeignete Puffer und Lösungen (besonders für die Haltung der Bakterien, die z. B. geeignete antibakterielle Wirkstoffe enthalten) zur Bestimmung antibakterieller Effekte der zu untersuchenden Verbindung oder des zu untersuchenden Wirkstoffs durch Ermittlung der Stoffwechselaktivität der Bakterien. Zusätzlich kann das Anwendungspaket auch Mittel für die Standardisierung der Probennahme oder zu Vergleichszwecken enthalten.
Es ist von Vorteil, Verbindungen oder antibakterielle Wirkstoffe, die durch den oben erwähnten Prozess identifiziert oder isoliert wurden, in größerem Maßstab zur weiteren Untersuchung oder Verwendung herzustellen. Abhängig von der Beschaffenheit der zu untersuchenden Verbindungen kann dies durch die Verwendung synthetischer oder natürlicher Verfahren oder eine Kombination dieser beiden erreicht werden. Wenn die zu testende Verbindung z. B. ein Peptid ist, so kann dieses synthetisch durch Peptid-Synthese oder durch die Expression eines geeigneten DNA-Moleküls hergestellt werden. Somit wird gemäß einem bevorzugten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines Wirkstoffs mit antibakterieller Aktivität gegen Bakterien in der stationären Phase geschaffen, wobei der besagte Wirkstoff, der durch das in diesem Text beschriebene Verfahren identifiziert wurde, amplifiziert wird.
Neue chemische Verbindungen, die bakteriostatische oder bakterizide Effekte auf eine gegen antibakterielle Wirkstoffe resistente Subpopulation von Bakterien in der stationären Phase zeigen, z. B. eine gegen Rifampicin resistente Subpopulation von M. tuberculosis, eine gegen Kanamycin resistente Subpopulation von E. coli oder eine gegen Ampicillin resistente Subpopulation von S. aureus können mit den Methoden der Erfindung identifiziert und/oder aufbereitet werden.
Es wird angenommen, dass die Resistenz persistierender Bakterien gegen antibakterielle Wirkstoffe auf eine Reduktion der Zellwandpermeabilität und/oder die Verwendung von alternativen Sigmafaktoren (wie z. B. sigB) zurückzuführen sein kann. Neue antibakterielle Wirkstoffe, die die Erhöhung der Zellwandpermeabilität oder die Inhibierung der Verwendung alternativer Sigmafaktoren zur Folge haben, werden deshalb besonders bevorzugt.
Antibakterielle Wirkstoffe, die gemäß der Erfindung identifiziert wurden, finden besonders in der Behandlung von Krankheiten oder Funktionsstörungen Verwendung, bei denen ruhende Bakterien einen Herd darstellen, von dem symptomatische Krankheiten ausgehen oder erneut ausbrechen können. Insbesondere können Krankheiten, die von pathogenen Bakterien der Gattungen Staphylococcus, Escherichia, Haemophilus und Mycobacterium her rühren, ins Visier genommen werden. Antibakterielle Wirkstoffe, die gegen persistierende Bakterien aktiv werden, können während symptomatischer oder symptomfreier Stadien der Krankheit oder des Zustandes verwendet werden, in denen diese persistierenden Bakterien ruhen oder sich in einem nicht ruhenden Zustand befinden und können wahlweise auch in Verbindung mit anderen, gegen nicht ruhende Bakterien gerichteten Wirkstoffen verwendet werden. Der Begriff „nicht ruhende Bakterien", so wie er in diesem Text verwendet wird, bezieht sich auf Bakterien, die sich zur gegebenen Zeit in einem nicht ruhenden Zustand befinden, d. h. die aktiv wachsen, die sich zu einem anderen Zeitpunkt aber auch in einem ruhenden Zustand befinden können, jedoch nicht müssen.
Eine Zusammensetzung oder Zubereitung könnte hergestellt werden, die sowohl ein neues antimikrobielles Mittel, das mit dem Verfahren gemäß der Erfindung identifiziert und/oder zubereitet wurde, d. h. einen antibakteriellen Wirkstoff oder eine chemische Verbindung, so wie in diesem Text beschrieben, als auch ein pharmazeutisch akzeptables Lösungsmittel oder einen Arzneistoffträger umfasst.
Der Begriff „pharmazeutisch akzeptabel" bedeutet, dass der Inhaltsstoff sowohl mit anderen Inhaltsstoffen der Verbindungen kompatibel als auch für den Empfänger physiologisch akzeptabel sein muss.
Pharmazeutische Zusammensetzungen können nach konventionellen Verfahren unter Verwendung einfach erhältlicher Inhaltsstoffe gestaltet werden. Der aktive Inhaltsstoff kann folglich also wahlweise zusammen mit anderen aktiven Substanzen mit einem oder mit mehreren konventionellen Trägerstoffen, Verdünnungsmitteln und/oder Arzneistoffträgern, zusammengesetzt werden, um konventionelle galenische Präparate. wie z. B. Tabletten, Pillen, Puder, Pastillen, Medikamentensäckchen, Kapseln, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupe, Aerosole (als Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Heilsalben, weiche und harte Gelatinekapseln, Zäpfchen, sterile Injektionslösungen, steril abgepackte Puder und dergleichen herzustellen.
Beispiele für geeignete Trägerstoffe, Arzneistoffträger und Verdünnungsmittel sind Laktose, Dextrose, Saccharose, Sorbitol, Manitol, Stärken, Akaziengummi, Calciumphosphat, Alginate, Tragantgummi, Gelatine, Kalziumsilikat, mikrokristalline Zellulose, Polyvinylpyrrolidon, Zellulose, Wassersirup, Wasser, Wasser/Ethanol, Wasser/Glykol, Wasser/Polyethylenglycol, Propylenglycol, Methylzellulose, Methylhydroxybenzoate, Propylhydroxybenzoate, Talkum, Magnesiumstearat, Mineralöl oder fettige Substanzen, wie z. B. hartes Fett oder geeignete Mischungen hieraus.
Bei der klinischen Behandlung von Tuberkulose und anderen Krankheitszuständen, bei denen die Ansiedlung und die Existenz ruhender Bakterien problematisch ist, kann es von Vorteil sein, eine Kombination antibakterieller Wirkstoffe zu verabreichen, die sich jeweils gegen die unterschiedlichen Wachstumsphasen dieser Organismen richten. Demnach wäre es z. B. ein angemessener chemotherapeutischer Ansatz, zur Behandlung von Tuberkulose und ähnlichen Krankheiten, dem Patienten einen oder mehrere antibakterielle Wirkstoffe zu verabreichen, die sich gegen die wachsenden oder in der Log-Phase befindlichen Mikroorganismen richten, und einen oder mehrere antibakterielle Wirkstoffe gegen die ruhenden oder in der stationären Phase befindlichen Populationen.
Es können Zubereitungen hergestellt werden, die mindestens einen antibakteriellen Wirkstoff enthalten, der Aktivität gegen aktiv wachsende Bakterien besitzt, sowie mindestens einen antibakteriellen Wirkstoff oder eine chemische Verbindung (wie in diesem Text beschrieben), die aktiv gegen phänotypisch resistente Subpopulationen von besagten, in der stationären Phase befindlichen Bakterien besitzen. Solche Zubereitungen können als kombinierte Präparate für die gleichzeitige, separate oder sequentielle Verwendung in der Behandlung von bakteriellen Infektionen, wie z. B. Tuberkulose dargereicht werden.
Solche Zubereitungen können während symptomatischen oder symptomfreien Stadien der Krankheit appliziert werden, d. h. der antibakterielle Wirkstoff gegen die resistente Subpopulation muss nicht notwendigerweise verwendet werden, wenn sich diese Bakterien in der Ruhephase befinden, sondern er kann auch verwendet werden, wenn sie sich im aktiven Wachstum befinden.
Antibakterielle Wirkstoffe, die aktiv gegen aktiv wachsende Bakterien wirken, zeigen, wie zuvor in diesem Text beschrieben, antibakterielle Effekte gegen in der Log-Phase befindliche Bakterien.
Verbindungen oder Wirkstoffe, die z. B. durch das oben beschriebene Screening-Verfahren als effektiv gegen phänotypisch resistente Subpopulationen von Bakterien in der stationären Phase identifiziert wurden, oder Zusammensetzungen, die diese enthalten, können zur Behandlung bakterieller Infektionen verwendet werden. Üblicher weise handelt es sich bei den bakteriellen Infektionen, die in geeigneter Weise behandelt werden können, um solche, bei denen persistente Bakterien nach der Infektion selbst dann zurückbleiben würden, wenn der infizierte Makroorganismus symptomfrei ist, d. h. vor dem Beginn einer Krankheit oder nach deren Behandlung mit bekannten antibakteriellen Mitteln. Diese Bakterien können sich in der Ruhephase befinden und deshalb impliziert (oder könnte potentiell implizieren) die gemäß einem bevorzugten Gesichtspunkt zu behandelnde bakterielle Infektion ruhende Bakterien, insofern die Infektion durch eine Subpopulation von persistenten Bakterien typifiziert oder charakterisiert wird, die in symptomfreien Patienten in Abwesenheit von aktiv wachsenden Bakterien zurückbleiben, die also nach der Infektion in eine Ruhephase eintreten könnten.
Zusammensetzungen oder Wirkstoffe, die als effektiv gegen phänotypisch resistente Subpopulationen von Bakterien in der stationären Phase z. B. durch das oben beschriebene Screening-Verfahren identifiziert wurden, oder Zusammensetzungen, die diese enthalten, können bei der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung bakterieller Infektionen verwendet werden.
Alternativ betrachtet schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von Medikamenten zur Behandlung einer bakteriellen Infektion, wobei das Medikament einem Patienten verabreicht wird, der eine solche Therapie benötigt und beinhaltet eine wirksame Menge eines antibakteriellen Wirkstoffs oder einer Verbindung, der bzw. die gegen die stationäre Phase des Wachstums gerichtet ist, wahlweise in Anwesenheit von einem oder mehreren antibakteriellen Wirkstoffen, der bzw. die gegen die Wachstumsphase des besagten Organismus gerichtet sind.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem zu behandelndem Lebewesen um ein Säugetier, in besonders bevorzugter Weise um einen Menschen.
Wie oben erwähnt, kann die Verabreichung stattfinden, wenn das erkrankte Individuum Symptome zeigt, oder aber auch wenn es symptomfrei ist. Obwohl sich die antibakteriellen Wirkstoffe der Erfindung als wirksam gegen ruhende, persistente, d. h. in der stationären Phase des Wachstums befindliche Bakterien erweisen, können die Wirkstoffe dieser Erfindung auch verabreicht werden, wenn sich diese Bakterien im aktiven Wachstum befinden.
Die Verabreichung der Zusammensetzung kann über irgendeinen der konventionellen Wege, z. B. oral, rektal oder parenteral, z. B. durch intramuskuläre, subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Injektion stattfinden.
Der aktive Bestandteil von solchen Zusammensetzungen kann zwischen ungefähr 0,01% bis zu 99% des Gewichts der Zubereitung betragen, vorzugsweise zwischen ungefähr 0,1 bis 50%, z. B. 10%. Die genaue Dosierung des zu verabreichenden aktiven Bestandteils und die Länge der Durchführung der Behandlung werden, natürlich von einer Anzahl von Faktoren abhängen, einschließlich z. B. dem Alter und Gewicht des Patienten, dem speziellen, die Behandlung erforderlich machenden Zustand und seiner Ernsthaftigkeit sowie dem Weg der Verabreichung.
Gemäß jedem Gesichtspunkt der Erfindung können die Bakterien in der stationären Phase, die das Ziel für die antibakteriellen Wirkstoffe darstellen, pathogene Bakterien, wie z. B. Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus gordonii, Escherichia coli und, besonders vorteilhaft, Mycobacterium tuberculosis umfassen.
Die folgenden, nicht einschränkend zu verstehenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung. In der beigefügten Zeichnung zeigen:
1 Wachstumskurven für E. coli und S. aureus über einen Zeitraum von zehn Tagen;
2 zeigt die Lebensfähigkeit von E. coli nach der Behandlung mit 50 μg/ml Kanamycin während der stationären Phase und dem Wachstum in der Log-Phase;
3 zeigt die Lebensfähigkeit von S. aureus nach der Behandlung mit 100 μg/ml Ampicillin während der stationären Phase und dem Wachstum in der Log-Phase.
BEISPIEL 1
Wachstum von M. tuberculosis und Selektion auf eine phänotypisch, aber nicht genetisch gegen Rifampicin resistente Subpopulation von Zellen
M. tuberculosis H37Rv wurde in Middlebrook 7H9 Brühe, die 0,05% Tween^® 80 enthielt und der 10% ADC zugesetzt worden war, ohne Bewegung oder andere Störungen bis zu 100 Tagen gezüchtet, in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Wayne (1976) Amer. Rev. Resp. Dis. 114: 807–811. In den Fällen, in denen die Organismen in der stationären Phase lebensfähig waren, waren sie resistent gegen MIC-Dosen von 0,01 μg/ml Rifampicin.
60 10 ml Proben der Kulturen wurden mit Glasperlen für drei bis fünf Minuten verwirbelt und anschließend in einem Wasserbad-Sonicator für weniger als fünf Minuten beschallt. Sämtliche Kulturen wurden in einer sterilen 500 ml-Flasche mit Schraubdeckel vereinigt.
Vor der Zugabe von Rifampicin wurden wie im folgenden beschrieben Proben der Kultur entnommen, um Reinheit, Lebensfähigkeit und Stoffwechselaktivität zu kontrollieren.

1. 2 × 100 μl für CFU-Zählungen
2. 2 × 5 ml für Zählungen des Kulturmediums
3. 2 × 10 ml für [³H] Uridin-Zählungen
4. 2 × 5 ml für [³⁵S] Methionin-Zählungen
5. 10 ml zur RNA-Extraktion für RT-PCR
6. 10 ml zur Überprüfung der Abwesenheit von Arzneimitteln
7. 20 μl für Blut-Agar zur Kontrolle der Sterilität

Selektion und Detektion einer gegen Rifampicin resistenten Subpopulation
50 ml von 1000 μg/ml Rifampicin wurden zu 500 ml der oben beschriebenen Kultur gegeben, um eine Rifampicin-Endkonzentration von 100 μg/ml zu erhalten, und die Kultur wurde dann bei 37°C für fünf Tage inkubiert. Die Zellen wurden dann in sterilen 50 ml-Röhrchen geerntet, durch Zentrifugation bei 5000 g für 15 Minuten, anschließend zweimal in sterilem PBS gewaschen, das 0,05% Tween^® 80 und Selectitab^® Antibiotika enthielt (diese umfassen eine Kombination antibakterieller Wirkstoffe, die die meisten Bakterien außer M. tuberculosis abtöten und somit verhindern, dass M. tuberculosis von schneller wachsenden Bakterien überwuchert wird). Die Zellen wurden dann in 500 ml frischem 7H9 Medium re-suspendiert.
Die Sterilität der Kulturen wurde vor der Durchführung weiterer Experimente kontrolliert. 2 × 100 μl Proben der Kultur wurden doppelt auf Blut-Agar-Platten aufgetragen, die dann bei 37°C über Nacht inkubiert wurden. Die Zellsuspension wurde bei 4°C über Nacht aufbewahrt. Kontaminierte Kulturen sollten immer verworfen werden.
Es wurde festgestellt, dass diese Behandlung mit hohen Rifampicin-Dosen die Auszählungen der Platten auf null Kolonien bildende Einheiten reduzierte, aber gleichzeitig zu einer kleinen Zahl persistierender Organismen führte, die bei Zählungen in verdünntem Medium nachgewiesen werden konnten. Tabelle 1 zeigt ein typisches Beispiel einer solchen Selektion, bei der nach einem Tag Behandlung mit Rifampicin 10 von ursprünglich 10⁶ Bakterien/ml übrig blieben. Daraus scheint hervorzugehen, dass bei M. tuberculosis mindestens zwei Populationen von Organismen in stationären Phasen vorkommen: Die erste wird durch hohe Rifampicin-Dosen abgetötet und die zweite „persistiert" und ist phänotypisch resistent. Bei Wiederaufnahme des Wachstums wird die gegen Rifampicin resistente Subpopulation in der stationären Phase sensitiv gegen Rifampicin bei der normalen MIC-Dosis von 0,1 μg/ml.
BEISPIEL 2
Charakterisierung der gegen Rifampicin resistenten Subpopulation in vitro
Methoden
M. tuberculosis wurde in 7H9 Medium, das 0,05% Tween^® 80 enthielt und dem 10% ADS (Difco Laboratories) zugefügt worden waren, ohne Schütteln für 100 Tage gezüchtet. Rifampicin wurde der Kultur zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml für 5 Tage zugegeben. Die Lebensfähigkeit wurde in 1-Tages-Intervallen abgeschätzt. Die Zellen wurden gründlich gewaschen und 100 μl Proben von Zehnfach-Verdünnungen der Kulturen wurden dreifach auf Platten mit Middlebrook 7H11 Medium, dem OADC (Difco Laboratories) zugefügt worden war, aufgebracht. Kolonien bildende Einheiten (CFU's) wurden nach Inkubation der Platten für drei Wochen bei 37°C gezählt. Nährmedium-Zählungen wurden in Zehnfach-Verdünnungen, durch Zugabe von 1 ml der Probe zu 9 ml 7H9 Medium, durchgeführt. Die Lebensfähigkeit wurde durch Beobachtung des Wachstums in verdünnten Kulturen für sechs Wochen nach der Inkubation bei 37°C geschätzt.
Für die Aufnahme radioaktiven Uridins wurde zu jedem Zeitpunkt 10 ml der Kultur zweimal gewaschen, um das übrige Rifampicin zu entfernen, danach in 10 ml 7H9 Medium resuspendiert und anschließend für 20 Stunden mit 10 μCi/ml [³H]-Uridin inkubiert. Bei 5* wurde die Kultur nach der Inkubation mit Rifampicin nicht gewaschen und 10 μCi/ml [³H]-Uridin wurden zugegeben und die Kultur für weitere 20 Stunden in der Anwesenheit von Rifampicin inkubiert. Die RNA wurde durch in der Fachwelt bekannte Verfahren extrahiert. Die Aufnahme von [³H]-Uridin durch die RNA wurde als „counts per minute" von RNA, die mit trichloroacetischer Säure gefällt worden war, bestimmt. Die Ergebnisse wurden in drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten bestätigt.
Der Stoffwechselzustand der Bazillen vor und nach der Rifampicin-Behandlung wurde außerdem durch Untersuchung der zuvor extrahierten Gesamt-RNA bestimmt. RT-PCR wurde mit den folgenden Genen durchgeführt: rpoB, das für das Rifampicin-Ziel kodiert (RNA Polymerase Untereinheit B); 16 kDa Protein (α-Kristallin-Homologe); 16S rRNA und zwei Sigma 70 Homologe, sigA und sigB.
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1: Aufnahme von [³H]-Uridin durch M. tuberculosis nach der Zugabe von Rifampicin
Proben der gegen Rifampicin resistenten Subpopulation der Zellen wurden analysiert und die Zellpopulation weiter charakterisiert. Aufgrund der in der Population gemessenen transkriptionalen und translationalen Aktivität konnte gezeigt werden, dass die Population Stoffwechsel-aktiv ist. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Gene in der stationären Phase transkribiert werden. Nach einer Rifampicin-Behandlung für fünf Tage, die die cfu auf Null reduzierte, war die 16S rRNA unvermindert und die Transkripte von rpoB, 16K und SigB konnten immer noch nachgewiesen werden, wenn auch in reduziertem Ausmaß, wohingegen das Transkript von SigA nicht zu sehen war.
Auszählungen von Verdünnungen des Nährmediums von mit Rifampicin behandelten Kulturen (Tage 1 bis 5) ergaben Werte von 10² Bakterien/ml (Tabelle 1), woraus die Anwesenheit von Bakterien, die zum Wachstum fähig sind, hervorgeht. Trotz der Abnahme bei den Auszählungen von Verdünnungen des Nährmediums um 4 logarithmische Dekaden nach der Behandlung mit Rifampicin lag das RT-PCR-Signal von 16S, sigB, 16K und rpoB um mehrere logarithmische Dekaden über dem, was für solch geringe Anzahlen von positiv im Nährmedium überlebenden Bakterien zu erwarten wäre. Um die Menge der vorhandenen 16S rRNA quantifizieren zu können, wurde das rRNA-Niveau durch Northern-Blotting vor und nach der Behandlung mit Rifampicin gemessen (Daten nicht dargestellt). Densitometrische Untersuchungen ergaben, dass etwa die Hälfte der Signalintensität sieben Tage nach der Behandlung mit dem Antibiotikum sowohl in Organismen, die sich in der Log-Phase befanden, als auch in solchen in der stationären Phase noch vorhanden war. Dies lässt vermuten, dass rRNA in mit Rifampicin behandelten Kulturen sehr stabil vorliegt. Im Gegensatz dazu waren die mRNAs weit weniger stabil als rRNA. Die Halbwertszeiten der mRNAs von 16K und sigB wurden sowohl in Kulturen in der Log-Phase als auch in Kulturen, die über lange Zeit in der stationären Phase verblieben waren, gemessen und es konnte gezeigt werden, dass sie zwischen zwei und drei Minuten liegen. Es ist daher unwahrscheinlich, dass die Ergebnisse der RT-PCR auf mRNA zurückzuführen sind, die über lange Zeit stabil bleibt und aktive Transkription ist anzunehmen. Dies wurde untersucht, indem Organismen zunächst mit Rifampicin behandelt und diese Bakterien anschließend gleichzeitig mit Rifampicin und [³H]-Uridin inkubiert wurden. In der Anwesenheit von Rifampicin nahmen die Bakterien [³H]-Uridin auf, was auf aktive Transkription in persistierenden Bakterien hinweist, selbst in Anwesenheit einer hohen Rifampicin-Konzentration, und zeigt, dass die Bakterien aktiven Stoffwechsel betreiben.
Es konnte gezeigt werden, dass die Zellen sehr stark auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren. Wenn Rifampicin entfernt und durch reines Wachstumsmedium ersetzt wurde, stieg die Transkriptionsrate von drei untersuchten Genen (die 16K sigA und rpoB-Transkripte) nach zwölf Stunden um das Fünf- bis Zehnfache an. Die Aufnahme von radioaktivem Uridin stieg nach dem Entfernen von Rifampicin und der Inkubation mit reinem Medium ebenfalls etwa um das Fünffache an (Tabelle 1 – vgl. die Zählungen nach 5* und nach 5 Tagen). Daraus geht hervor, dass die Transkriptionsrate unter diesen Umständen rapide ansteigt. Die Daten schließen die Möglichkeit nicht aus, dass sich die Organismen in der Anwesenheit von frischem Medium replizieren, obwohl dies lediglich einen zweifachen Anstieg der Transkription innerhalb von zwölf Stunden erklären würde, da die Generationsdauer von M. tuberculosis in etwa zwanzig Stunden beträgt. Die Daten unterstützen die Hypothese, dass in diesem in vitro Modell arzneimittel-resistenter Bakterien in der stationären Phase eine Hauptpopulation von Bakterien existiert, die aktiv RNA transkribiert und auf ihre Umwelt reagiert, jedoch für Plattenkulturen negativ bleibt.
Um zwischen phänotypischer und genotypischer Resistenz zu unterscheiden, wurden die Bakterien nach der Rifampicin-Behandlung gründlich gewaschen und für sechs Wochen in flüssigen 7H9 Medium kultiviert. M. tuberculosis zeigte in vier voneinander unabhängigen Experimenten beständiges Wachstum. Diese Bakterien reagierten sensitiv auf 0,1 μg/ml Rifampicin und zeigten keine Rifampicin-Resistenz-Mutationen in rpoB, was durch RT-PCR und Hybridisierung mit Oligonucleotid-Sonden (Immunogenetics N. V., Niederlande; Daten nicht dargestellt) nachgewiesen wurde. Daraus geht hervor, dass die Resistenz in diesem Modell phänotypisch ist.
Es ist unwahrscheinlich, dass der Mechanismus der induzierten Resistenz von Mutationen oder von reduzierten Expressionsraten der rpoB mRNA (was zu einem reduzierten Pegel des Arzneimittelziels führen würde) abhängt, da die Transkription selbst in der Anwesenheit von Rifampicin fortgesetzt wird (Tabelle 1).
Charakterisierung der gegen antibakterielle Stoffe resistenten Subpopulation in vivo
Methoden
Die gegen antibakterielle Stoffe resistente Subpopulation wurde in vivo in Übereinstimmung mit dem Cornell-Modell der Keimruhe untersucht, in dem bei Mäusen chronische Tuberkulose durch Chemotherapie induziert wird. M. tuberculosis wurde in BALB/c-Mäusen gezüchtet, die 18 bis 20 g wogen und intravenös mit 2 × 10⁵ cfu eines aus Mäu sen gewonnenen, virulenten H37Rv-, Stammes von M. tuberculosis infiziert worden waren. Nach der Tötung und sterilen Autopsie zu den Zeitpunkten minus zwei Wochen und null Wochen (zwei Wochen nach der Infektion) wurden Milz und Lungen rasch entfernt; die Organe wurden sofort portionsweise in flüssigem N₂ eingefroren.
Cfu-Zählungen von Lebensfähigen M. tuberculosis wurden durchgeführt, nachdem Milz und Lungen in 5 ml Wasser in motorgetriebenen Polytetrafluorethylen/Glasmühlen zermahlen und Zählungen von seriellen Verdünnungen der Homogenate auf Platten mit selektivem 7H11 Medium (Difco, Detroit) angesetzt worden waren.
Die Behandlung wurde so dann für 14 Wochen mit 1000 mg Pyrazinamid/kg und 25 mg Isoniazid/kg Körpergewicht in Form einer Kügelchendiät durchgeführt, nachdem der „sterile Zustand" erreicht worden war. Eine Auswahl von Mäusen wurde auch zum Zeitpunkt sieben Wochen geopfert. Eine weitere Auswahl wurde dann zum Zeitpunkt 14 Wochen geopfert und die gesamten Organ-Homogenate wurden in selektivem Kirchner-Flüssigmedium (Lab M, Amersham) kultiviert. Die Selektivität des Wachstumsmediums für M. tuberculosis wurde durch die Zugabe von 200 U Polymyxin B/ml, 100 μg Carbenicillin/ml, 20 μg Trimethoprim/ml und 10 μg Amphotericin/ml erreicht. Die übrig gebliebene Auswahl an Mäusen wurde für die Dauer von weiteren acht Wochen einer Steroidtherapie unterzogen.
Ergebnisse
Die RT-PCR der RNA von Lungen, die vor der Behandlung entfernt worden waren, ließ Transkripte von rpoB, sigA, sigB, 16K und 16S rRNA erkennen. In signifikanter Weise wurde in Lungen von Tag 91 (13 Wochen) nach der Behandlung bakterielle mRNA von sigB und 16K gemessen und der Pegel von 16S rRNA war im Vergleich zum Pegel vor der Chemotherapie nicht reduziert. Es ist überraschend, nach 13 Wochen Chemotherapie überhaupt irgendwelche mRNA zu finden, da mRNA innerhalb weniger Stunden dezimiert wird. Da es uns aber nicht gelungen ist, die Halbwertszeit von mRNA in vivo oder die [³H]-Uridin-Aufnahme in die RNA zu messen, konnten wir nicht zwischen unstabilen und stabilen mRNAs unterscheiden. Trotzdem legen die Daten nahe, dass eine erhebliche Anzahl persistierender Bakterien am Tag 91 in den Lungen vorhanden ist, die stoffwechselaktiv sein können, da sie mRNA enthalten, jedoch nicht kultivierbar sind. Alle für die RT-PCR verwendeten Lungen erwiesen sich als Kultur-negativ.
Wie auch im in vitro Modell waren die sigA-Transkripte in Maus-Persistern nicht nachweisbar und dies kann am geringen Vorkommen dieser mRNA liegen, was zu Pegeln unterhalb der Nachweisgrenze führt oder es könnte an insensitiven Primern liegen. Die aktuellen Daten lassen eine Unterscheidung zwischen diesen Möglichkeiten nicht zu. Die sigF-Transkripte (Daten nicht dargestellt) wurden in den Cornell-Mäusen nachgewiesen, aber die Banden waren sehr schwach. Alle Kontrollen wurden durchgeführt, um sicherzustellen, dass alle RT-PCR-Produkte von mRNA stammten und nicht von kontaminierender genomischer DNA.
Zwei Wochen nach der Infektion, zum Zeitpunkt Null Wochen, lieferte eine Auswahl von vier Mäusen 2–5 × 10⁷ cfu/Lunge oder Milz. Vier weitere Mäuse wurden jeweils nach sieben und nach 14 Wochen geopfert. Von diesen acht Mäusen lieferten zwei positive Organkulturen, eine allein aus der Milz und eine aus den Lungen. Jedoch enthalten Mäuse in diesem „sterilen" Zustand große Mengen an M. tuberculosis-DNA, von der man annimmt, dass sie 10⁵ Bakterien/Organ entspricht. Nach der Behandlung der Mäuse mit Steroiden lieferten Milz und Lungen positive Kulturen, was auf eine Reaktivierung aus dem ruhenden, nicht kultivierbaren und arzneimittelinsensitiven Zustand hindeutet.
Ohne zu sehr an Theorien gebunden sein zu wollen, ist davon auszugehen, dass der Mechanismus der Resistenz der persistierenden Bakterien gegen antibakterielle Wirkstoffe möglicherweise auf einer Reduzierung der Zellwandpermeabilität (EDTA permeabilisiert die Zellwände von Persistern und erhöht die Effektivität von Rifampicin, Daten nicht dargestellt) und auf der Verwendung von alternativen Sigma-Faktoren (wie z. B. sigB) beruht, die Unempfindlichkeit gegen die durch Rifampicin vermittelte Inhibition der Transkription verleihen.
Beurteilung der Susceptibilität von Arzneimittelbibliotheken
Sterile beschriftete transparente 0,7 ml-Plastikröhrchen mit Schnappdeckeln werden verwendet, die 1 bis 20 μg der zu untersuchenden Verbindung enthalten. Die Verbindung wird in 0,25 ml sterilem Wasser oder einem anderen geeigneten Verdünnungsmittel gelöst. 0,25 ml der mit Rifampicin behandelten Kultur werden jedem Röhrchen zugegeben, in dem Gehäuse der Klasse I in einem Labor mit Sicherheitsbehältnissen der Kategorie III, wobei darauf geachtet wird, dass Kontaminationen vermieden werden. Die Röhrchen werden bei 37°C inkubiert. Die Wirksamkeit der Arzneimittel wird durch CFU-Zählungen untersucht, durch Zugabe von 2 × 50 μl jeder Probe zu 7H11 Agarplatten in doppelter Ausführung, inklusive zwei arzneimittelfreier Kontrollen, in Abständen von einer Woche. Möglicherweise wird eine Zehnfach-Verdünnungsreihe der Proben benötigt, die mit 7H9 Medium hergestellt wird, mit 0,05% Tween^® 80, aber ohne ADC und die verdünnten Proben werden so dann auf 7H11 Agar plattiert und die Konzentrationseffekte der zu untersuchenden Verbindungen bestimmt.
BEISPIEL 3
Selektion phänotypisch, aber nicht genotypisch resistenter Subpopulationen von E. coli und S. aureus unter Verwendung von Kanamycin bzw. Ampicillin
Anzucht von Escherichia coli und Staphylococcus aureus
Escherichia coli K12 und Staphylococcus aureus werden unter konstantem Schütteln bei 120 U/min für zehn Tage in 10 ml Nährstofflösung Nr. 2 (Oxoid) gezüchtet. Die Lebensfähigkeit der Bakterien wird anhand von Zählungen der Kolonie bildenden Einheiten in Intervallen von zwei Stunden während der ersten 24 Stunden und 12 bis 24 Stunden da nach abgeschätzt. Aus Zehnfach-Verdünnungsreihen der Kulturen des Experiments werden 100 μl Proben zu Dreifachplattierungen auf Nähr-Agarplatten (Oxoid) gegeben. Kolonie bildende Einheiten (CFU) werden nach Inkubation der Platten bei 37°C für 24 Stunden ausgezählt.
Selektion persistierender Bakterien durch Antibiotika
Ampicillin bzw. Kanamycin wird für drei Tage zu E. coli- bzw. S. aureus-Kulturen, die sich seit fünf Tagen in der stationären Phase befinden, gegeben, so dass eine Endkonzentration von 100 μg/ml bzw. 50 μg/ml entsteht. Nach drei Tagen der Behandlung mit Antibiotikum werden die Zellen dreimal mit sterilem destillierten Wasser gewaschen und dann in 10 ml frischer Nährlösung resuspendiert. Die Lebensfähigkeit wird anhand von CFU-Zählungen und Zählungen der verdünnten Nährstofflösung abgeschätzt. Zählungen der verdünnten Nährlösung werden in Zehnfach-Verdünnungsreihen mit Nährlösung durchgeführt, danach wird in dreifacher Ausführung 1 ml jeder Verdünnung zu 9 ml Nährlösung in einem 30 ml Universalröhrchen gegeben. Die Wachstumskurven für E. Coli und S. aureus über einen Zeitraum von 240 Stunden in der Abwesenheit von Antibiotika ist in 1 dargestellt. Der Effekt der Exposition von E. Coli und S. aureus gegen Antibiotika sowohl während der logarithmischen als auch der stationären Phase des Wachstums, ist in den 2 und 3 dargestellt. Die Behandlung der Kulturen während der stationären Phase führt zur Selektion einer gegen Antibiotika resistenten Subpopulation von Zellen.

Claims

Verfahren zur Zubereitung einer phänotypisch gegen Antibiotika resistenten Unterpopulation von Bakterien in der stationären Phase, das zumindest folgende Schritte umfasst: (i) Wachsenlassen einer Bakterienkultur bis zur stationären Phase, und (ii) Behandeln dieser Kultur in der stationären Phase mit einem oder mehreren antibakteriellen Wirkstoffen mit einer Konzentration und über einen Zeitraum, die ausreichen, um wachsende Bakterien zu töten, wodurch eine gegen das Antibiotikum phänotypisch resistente Subpopulation ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der antibakterielle Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die Rifampicin, Kanamycin, Ampicillin und Pyrazinamid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der antibakterielle Wirkstoff mit einer Konzentration von 25 bis 150 μg/ml verwendet wird, wobei Bakterien mit einer Konzentration von 10⁵ bis 10⁹ Bakterien/ml vorhanden sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Bakterien Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus gordonii oder Mycobacterium tuberculosis sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Bakterien Mycobacterium tuberculosis sind und der antibakterielle Wirkstoff Rifampicin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Bakterien Escherichia coli sind und der antibakterielle Wirkstoff Kanamycin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Bakterien Staphylococcus aureus sind und der antibakterielle Wirkstoff Ampicillin ist.
Phänotypisch gegen ein Antibiotikum resistente Subpopulation von Bakterien in der stationären Phase, die durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 erhalten worden ist.
Verfahren zur Bestätigung der antibakteriellen Aktivität einer Testverbindung oder eines Wirkstoffes oder zum Isolieren einer Verbindung oder eines Wirkstoffes, die bzw. der eine antibakterielle Wirksamkeit gegen Bakterien in der stationären Phase besitzt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (i) Zubereitung einer phänotypisch gegen Antibiotika resistenten Subpopulation von Bakterien in der stationären Phase nach dem Verfahren aus einem der Ansprüche 1 bis 7, (ii) Inkubieren einer Probe der phänotypisch resistenten Subpopulation mit einer oder mehreren Testverbindungen oder -wirkstoffen, und (iii) Bestätigen irgend eines antibakteriellen Effektes gegen die phänotypisch resistente Subpopulation.
Verfahren nach Anspruch 9, das weiterhin einen zusätzlichen Schritt umfasst, bei dem eine Verbindung oder ein Wirkstoff isoliert wird, die bzw. der eine antibakterielle Aktivität zeigt.
Verfahren nach Anspruch 10, das weiterhin den zusätzlichen Schritt umfasst, bei dem die identifizierte oder isolierte Verbindung bzw. der identifizierte oder isolierte Wirkstoff in größerem Maßstab produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, das weiterhin den Schritt umfasst, die isolierte Verbindung oder den isolierten Wirkstoff in einer Form vorzusehen, die für eine Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung als antibakterieller Wirkstoff geeignet ist.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die isolierte Verbindung oder der isolierte Wirkstoff mit einem pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträger oder Verdünnungsmittel zubereitet wird.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die isolierte Verbindung oder der isolierte Wirkstoff mit wenigstens einem antibakteriellen Wirkstoff zubereitet ist, wobei die sich ergebende Zubereitung als kombinierte Zubereitung für eine gleichzeitige, getrennte oder sequentielle Verwendung bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen dargeboten wird.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die bakterielle Infektion durch eine Subpopulation von persistenten Bakterien charakterisiert ist, die nach der Infektion in eine Ruhephase eintreten können.