JP6355555B2 - Ｗｎｔ／ｂ−カテニンシグナル伝達経路に関する遺伝子発現シグネチャーおよびその使用 - Google Patents

Ｗｎｔ／ｂ−カテニンシグナル伝達経路に関する遺伝子発現シグネチャーおよびその使用 Download PDF

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Description

関連出願の開示
本出願は、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｆｏｒ Ｗｎｔ／Ｂ−Ｃａｔｅｎｉｎ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎｄ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ（ＷＮＴ／Ｂ−カテニンシグナル伝達経路に関する遺伝子発現シグネチャーおよびその使用）」の名称で、２０１１年４月１日に出願の、米国仮特許出願第６１／４７０，９１９号（代理人明細書番号７４７０８．０１００００）の優先権を主張し、添付の書類を含むその全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
２０１２年３月３０日に作成された、名称「７４７０８ｏ０１０００２．ｔｘｔ」、大きさが１４，２７４バイトの配列表ファイルも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、新規マーカーセット、１６種類の遺伝子またはその一部を含むマイクロアレイ、および１６種類の遺伝子またはその一部を含む発現シグネチャー、ならびに、細胞試料または対象中のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の調節状態の決定におけるその使用に関する。細胞試料または対象中のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の調節状態は、これら遺伝子のうちの１つまたは複数の発現レベルに基づいてアッセイすることができる。より具体的には、本発明は、試料中のＷｎｔ／β−カテニン経路の調節解除状態を評価する；Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の調節が解除されているかまたは調節されているかで、細胞試料を分類する；ある薬剤が試料中のＷｎｔβ−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートするか否かを決定する；Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤に対する対象の反応を予測する；治療を対象に割り当てる；およびＷｎｔ／β−カテニン経路のシグナル伝達を調節するように設計された治療の薬力学的な効果を評価する、ためのバイオマーカーとしておよび遺伝子シグネチャーとして使用することが可能な遺伝子のセットを提供する。本発明では、提供したバイオマーカーの発現を、好ましくは、ＳＹＢＲグリーンを使ったＲＴ−ＰＣＲと解析されたデータから決定し、サポートベクターマシン法を使って対照試料と比較する。
Ｗｎｔ受容体が活性化されると、以下の３つの別のシグナル伝達カスケードが活性化する（Ｈｕｅｌｓｋｅｎ ａｎｄ Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ， ２００１， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． １１ ：５４７−５５３）： １）Ｗｎｔ／Ｃａ２＋経路。これは、プロテインキナーゼＣおよびＣａ２＋カルモジュリン依存性プロテインキナーゼΠの活性化を誘導する；２）細胞骨格経路。これは細胞骨格の組織と構成、および平らな細胞の極性を調節する、ならびに３）標準的なＷｎｔ経路。これは原腫瘍性タンパク質であるβ−カテニンの細胞内レベルを制御する。「Ｗｎｔ／β−カテニン」経路または「β−カテニン」経路としても知られている標準的な経路は、この３つのＷｎｔ経路のうち、最も研究され、最も理解が進んでいる経路である（Ｃｌｅｖｅｒｓ， ２００６， Ｃｅｌｌ １２７：４６９−４８０）。
Ｗｎｔ／β−カテニン経路において鍵となるタンパク質が、原腫瘍性タンパク質のβ−カテニンであり、これは、２つの異なる細胞内プールを切り替えることができる。Ｗｎｔシグナルがない場合、β−カテニンは、膜に固定されているＥ−カドヘリンの細胞質ドメインに結合し、そこでアルファ−カドヘリンと共に、細胞骨格タンパク質であるアクチンへの架橋を形成する。サイトゾル中でのβ−カテニンレベルは、いわゆる分解複合体によって低く保たれている。分解複合体は、活性型のセリン−スレオニンキナーゼであるグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ３ｂ）、他のいくつかのサイトゾルタンパク質、例えば癌抑制タンパク質のＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ、腺腫様多発結腸ポリープ）およびＡｘｉｎ／Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎから形成されている。ＧＳＫ３ｂによるβ−カテニンのリン酸化は、ｂ−ＴｒＣＰ（β−トランスデューシンリピート含有タンパク質）を介したそれ自体のユビキチン化およびプロテアソーム分解機構によるその分解を誘導する。Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性化によって、Ｗｎｔの受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）とその共受容体であるＬＲＰ５／６（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質）とのヘテロ二量体化が開始される。次いで、活性型カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）によるＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）の過剰なリン酸化が起こり、ＧＳＫ３ｂの阻害が引き起こされる（Ｗｉｌｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７， ＥＭＢＯ Ｊ． １６：３０８９−３０９６）。その結果、破壊複合体が分解され、β−カテニンがリン酸化状態でなくなり、そして、サイトゾルおよび核でのβ−カテニンレベルが上昇する。核のβ−カテニンはＴ−細胞因子／リンパエンハンサー因子（ＴＣＦ／Ｌｅｆ）と相互作用し、コリプレッサーに置き換わる（Ｓｔａａｌ ｅｔ ａｌ．， ２００２， ＥＭＢＯ Ｒｅｐ． ３：６３−６８）。β−カテニン／ＴＣＦ複合体は多種の標的遺伝子の転写を活性化する。
Ｗｎｔ標的遺伝子の産物によって、細胞周期キナーゼの調節、細胞接着、ホルモンのシグナル伝達、および転写調節などの多様な生化学的機能が説明される。生化学的機能が複数あることとその多様性は、細胞周期の進行や増殖の活性化、アポトーシスの阻害、胚発生の調節、細胞分化、細胞成長、および細胞移動などの、多種多様なＷｎｔ／b−カテニン経路の生物学的な効果を反映している（Ｖｌａｄ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ２０：７９５−８０２にまとめられている）。β−カテニン／ＴＣＦ複合体の標的遺伝子の多くが同定されており、Ｗｎｔホームページ（ｈｔｔｐ ：／／ｗｗｗ． ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｒｎｕｓ ｓｅ／ｗｎｔｗｉｎｄｏｗ．ｈｔｍｌ）で見ることができる。
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、成体組織の自己再生に関係している。Ｗｎｔ／β−カテニンカスケードは、腸上皮での前駆細胞区画の確立に必要とされる場合がある（Ｋｏｒｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １９：１−５）。また、Ｗｎｔタンパク質は腸陰窩底部でのパネート細胞の最終分化を促進する（Ｖａｎ Ｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ ４３５：９５９−９６３）。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、毛包の確立に必要である（ｖａｎ Ｇｅｎｄｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：２６９１−２７０３）。毛包でのＷｎｔ／β−カテニンシグナルは毛包幹細胞（バルジ）を活性化し、毛髪の細胞系への進入をうながし、そしてそれらの細胞を一過性増殖マトリックスのコンパートメントに補充する（Ｌｏｗｒｙ ｅｔ ａｌ．， ２００５， １９：１５９６−１６１１； Ｈｕｅｌｓｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１， １０５：５３３−５４５）。Ｗｎｔ／β−カテニン経路はまた、造血幹細胞および造血前駆細胞、ならびに骨の恒常性に重要な調節因子である（Ｃｌｅｖｅｒｓ， ２００６， Ｃｅｌｌ ４６９−４８０にまとめられている）。
さらに、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は癌にも関連がある。生殖系列ＡＰＣの変異は、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）の遺伝的要因である（Ｋｉｎｚｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｎｉｓｈｉｓｈｏ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。散発性直腸結腸癌の大部分では、ＡＰＣアレルの両方が失われており、ＡＰＣが消失した結果、β−カテニンが不適切に安定化される（Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。これらの突然変異がβ−カテニンシグナル伝達を活性化し、細胞分化を阻害し、細胞増殖を亢進して、最終的に前癌状態の腸ポリープを形成する（Ｇｒｅｇｏｒｉｅｆｆ ａｎｄ Ｃｌｅｖｅｒｓ， ２００５， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １９：８７７−８９０； Ｌｏｇａｎ ａｎｄ Ｎｕｓｓｅ， ２００４， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２０：７８１−８１０）。ＡＰＣが変異していない、珍しい結腸直腸癌の例では、Ａｘｉｎ２が変異しているか（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、またはβ−カテニンに、そのＮ末端のＳｅｒ／Ｔｈｒ破壊モチーフが除かれるような活性化点変異がある（Ｍｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。活性化Ｗｎｔ／β−カテニン経路の突然変異には、腸癌があるがこれには限定されない。機能喪失型のＡｘｉｎ変異は肝細胞癌でも見つかっており、β−カテニンの発癌性のある突然変異は、様々な固形癌で生じている（Ｒｅｙａ ａｎｄ Ｃｌｅｖｅｒｓ， ２００５にまとめられている）。Ｗｎｔ／β−カテニンカスケードの変異性活性化は、毛包の腫瘍にも関連している可能性がある（Ｃｌｅｖｅｒｓ， ２００６， Ｃｅｌｌ ４６９−４８０にまとめられている）。また、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の不活化突然変異も、ＬＥＦｌの突然変異を有するヒトの脂腺癌において確認されている（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ， ２００６）。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、癌幹細胞の調節にも伴われる。（Ｍａｌａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８， ４５２：６５０−６５３；総説、Ｆｏｄｄｅ ａｎｄ Ｂｒａｂｌｅｔｚ， ２００７， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９：１５０−１５８）。
現在の分子医学において中心となっている目標は、治療に最も反応しやすい患者小集団を同定することである。認可されている実験的な治療が多数あること（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ３：３０３−３０９）、現行の治療の多くに対する反応率の低さ、および初回の治療周期で至適治療を使用することが臨床上重要であること（Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ， ２００５， Ｃｕｒｒ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ５： １０３−１１０）から、この概念は、特に癌に関して重要なものである。加えて、現在市場に出回っている細胞毒物に関連する、治療指数の低さや重篤な毒性プロファイルから、反応を正確に予測することが早急に必要とされている。最近の研究から、細胞毒物を使った化学療法に対する反応と関連する遺伝子発現シグネチャーが同定されているが（Ｆｏｌｇｕｅｒｉａ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １１ ：７４３４−７４４３； Ａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ， ２００４， ２２：２２８４−２２９３； Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｌａｎｃｅｔ ３６２：３６２−３６９； Ｒｏｕｚｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０２： ８３１５−８３２０）、これらの実験例（および文献からの他の例）はまだ確認されておらず、臨床業務に未だ大きな影響を及ぼしていない。標準的な技術プラットフォームがないことや臨床試料の収集にまつわる難しさなどの技術的な問題に加えて、無数の細胞内プロセスが細胞毒性をもつ化学療法により影響を受けることから、これらの薬剤に対する反応の、実用的かつ強固な遺伝子発現予測因子の同定が妨げられている可能性がある。１つの例外としては、微小管関連タンパク質のＴａｕのｍＲＮＡ発現の低さが、パクリタキセルに対する改善された反応の予測因子であるという、マイクロアレイを使った最近の発見が挙げられ得る（Ｒｏｕｚｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，上記）。
細胞毒性をもつ化学療法の制限をゆるめるために、腫瘍学における最近の創薬方法は、腫瘍の増殖や生存に重要な、特定の細胞のシグナル伝達経路をモジュレートすることに焦点を当てている（Ｈａｈｎ ａｎｄ Ｗｅｍｂｅｒｇ， ２００２， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ２：３３１−３４１； Ｈａｎａｈａｎ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， ２０００， Ｃｅｌｌ １００：５７−７０； Ｔｒｏｓｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １０２８：１９２−２０１）。癌細胞では、これらの経路の調節が解除され、その結果、異常なシグナル伝達、アポトーシスの阻害、転移の増加、および細胞増殖の増加が生じる（Ａｄｊｅｉ ａｎｄ Ｈｉｌｄａｌｇｏ， ２００５， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２３：５３８６−５４０３にまとめられている）。成長や増殖を制御するために、正常な細胞では複数のシグナル伝達経路が正しく調和しているが、腫瘍は、１つまたは２つの経路の活性化（「腫瘍遺伝子活性化」）に、大きく依存しているようである。異常なＷｎｔ／β−カテニン経路シグナル伝達によって癌が引き起こされる可能性があり、また、この経路中の遺伝的欠損のいくつかが、腫瘍の促進および進行に寄与している可能性がある（Ｐｏｌａｋｉｓ， ２０００， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４： ８３７−１８５１にまとめられている）。Ｗｎｔ／β−カテニン経路の過剰な活性化が、いくつかのヒト癌、例えば、結腸直腸癌（Ｍｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５： １７８７−１７９０）、黒色腫（Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１７９０−１７９２）、肝芽腫（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：２６９−２７３）、髄芽腫（Ｚｕｒａｗｅｌ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：８９６−８９９）、前立腺癌（Ｖｏｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：２５２０−２５２３）、ならびに子宮および卵巣の類内膜腺癌（Ｓｃｈｌｏｓｓｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｍｏｄ． Ｐａｔｈｏｌ． １３： １０６６−１０７１； Ｍｉｒａｂｅｌｌｉ−Ｐｒｉｍｄａｈｌ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：３３４６−３３５１； Ｓａｅｇｕｓａ ａｎｄ Ｏｋａｙａｓｕ， ２００１， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １９４：５９−６７； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１ ：８２４７−８２５５）で、最も頻繁に見られるシグナル伝達異常のうちの１つである。また、乳房の異形成癌でも、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性化がよく見られる（Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １４：４０３８−４０４４）。これらの異常なシグナル伝達経路の構成要素が、新規抗癌治療にとって、魅力的で選択的な標的を表している。加えて、論理的には、特定の経路が「主導」している腫瘍に罹患している患者は、その特定の経路の構成要素を標的とした治療に反応するだろうと考えられるので、標的治療に関する応答者を同定する方が、細胞毒物に対する応答者を同定するよりも達成しやすいだろう。そのため、どの腫瘍でどの経路が活性化されているかを同定し、この情報を治療の決定の指針とする、ということが重要である。これを可能とする方法の１つは、経路の活性化状態の指標となる遺伝子発現プロファイルを同定することである。
経路の構成要素の多くが、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を、複数のポイントで活性化、変更、または阻害する可能性があり、あるいは、他の経路とのクロストークに関係している可能性がある。特徴がよく分かっている、ごく少数の経路の構成要素について試験することで経路の活性を測定すると、他の重要な経路媒介因子を逃す恐れがある。経路の活性化が多数の生体機能や疾患に関与していると仮定すると、経路上の複数の構成要素が活性化されることによって、同じ遺伝子発現シグネチャーが引き出される可能性があるため、経路の活性化を、遺伝子発現シグネチャーを利用して読み取る方が、経路活性の単一の指標に基づいて読み取るよりもより適切であろう。加えて、複数の遺伝子からの発現データを統合することにより、経路活性を定量的に評価することが可能になると考えられる。細胞試料、腫瘍を含むがこれには限定されない、を分類するのに遺伝子発現シグネチャーを利用することに加えて、経路の活性化状態を評価することで、経路の活性化に関する遺伝子発現シグネチャーは、バイオマーカーとして使用することもできるだろう。バイオマーカーとしては、薬力学的なバイオマーカー、つまり治療後の患者の腫瘍または抹消組織での経路の阻害をモニタリングする；反応予測バイオマーカー、つまり特定の経路の活性が高レベルである腫瘍を患っている患者を、その経路を標的とした阻害剤で患者を治療する前に予め同定する；および初期効果のバイオマーカー、つまり効力を初期に読み取る、が考えられる。経路活性の遺伝子発現シグネチャーは、経路のシグナル伝達をモジュレートする薬剤のスクリーニングに使用してもよい。
２０１０年７月１日に公開された、Ａｒｔｈｕｒらによる出願であって、メルクに譲渡された、最近の米国特許出願第２０１００１６９０２５号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｆｏｒ Ｗｎｔ／Ｂ−Ｃａｔｅｎｉｎ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙ（ＷＮＴ／Ｂ−カテニンシグナル伝達経路に関する方法および遺伝子発現シグネチャー）」は、その発現がＷｎｔ／β−カテニンシグナルの伝達および制御に関連すると思われる遺伝子のセットを開示することを主旨としている。しかしながら、この特許出願は、本発明の遺伝子とは全く重複していない、別個の３８種類の遺伝子に関するものである。Ｗｎｔ／β−カテニンの推定シグネチャーを同定するのに発明者らは異なる種類の試料および方法を使用したため、出願人らは、彼らの理論によって拘束されることを望まない。特に彼らは、β−カテニンのｓｉＲＮＡを導入した、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達が恒常的に活性な細胞株（ＤＬＤ１、ＳＷ４８０およびＳＷ６２０）を使用した。以下に詳細に開示するように、本発明者らは、代わりに、特異的リガンド（Ｗｎｔ３ａ）刺激を使用して、およびＬｉＣｌ処理またはβ−カテニンｓｉＲＮＡ処理でＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の状態を変化させた細胞株を利用した。
加えて、彼らはＷｎｔ／β−カテニンシグネチャー遺伝子の抽出および確認に別の数学的手法を使った。彼らは、モンテ・カルロ法を使ってバイオマーカー遺伝子のセットの意義を算出した。この方法では、１個だけ取り出す方法（ｌｅａｖｉｎｇ ｏｎｅ ｏｕｔ法）および生存モデルによって、マーカーセットは確認され得る。分類（パターン認識）法の例としては、プロファイルの類似性；人工神経回路網；サポートベクターマシン（ＳＶＭ）；ロジスティック回帰、線形または二次の判別分析、決定木、クラスタリング、主要成分分析、および最近傍法が挙げられる。メルク社とは対照的に、本発明者らは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）法によって、本明細書で開示した特異なＷｎｔ／β−カテニン遺伝子シグネチャーを抽出した。
さらに、メルク社の特許出願の実施例では、彼らも同様に早い時点（２４ｈ）でｓｉＲＮＡを使用し、結腸癌試料と正常試料の遺伝子発現を比較した。一方本発明では、Ｗｎｔ３ａおよびＬｉＣｌで刺激した細胞株、またはｗｎｔ／β−カテニンｓｉＲＮＡで阻害した細胞株を使って、遺伝子シグネチャーを同定した。
図１には、実験の全体像を図示する模式図を示す。この実験により、経路のシグナル伝達をモジュレートする薬剤のスクリーニングおよび／または細胞試料中のＷｎｔ／β−カテニン経路活性の調節状態のアッセイに用いることが可能な固有の遺伝子シグネチャープロファイルが同定された。 図２Ａ〜Ｃでは、２９３Ｈ細胞に、β−カテニン（ＣＴＮＮＢ１）を標的とするｓｉＲＮＡを４８時間導入し、最後１２時間の培養時に時間Ｗｎｔ３ａを添加した実験の結果を図示する。パネルＡ：Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性化を、活性型β−カテニンタンパク質レベルの上昇によって確認したパネルＢ：Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性化を、標的遺伝子のアップレギュレーションによって確認した。パネルＣ：全ゲノムマイクロアレイ解析により、示した６４種類のＷｎｔ／β−カテニン応答遺伝子を同定した。 図３Ａは、Ｗｎｔ／β−カテニン経路シグネチャーの同定に使用した、２０個の試料の訓練データのセットにおける、ＣＴＮＮＢ１（β−カテニンをコードしている遺伝子）の発現の変化を示している。実験では、１２個の試料をＷｎｔ３ａまたはＬｉＣｌのいずれかで刺激し、８個の試料にβ−カテニン（ＣＴＮＮＢ１）を標的とするｓｉＲＮＡを導入した。パネルＡ：標的とするｓｉＲＮＡを導入した７個の試料を示す。 図３Ｂは、Ｗｎｔ／β−カテニン経路シグネチャーの同定に使用した、２０個の試料の訓練データのセットにおける、ＣＴＮＮＢ１（β−カテニンをコードしている遺伝子）の発現の変化を示している。実験では、１２個の試料をＷｎｔ３ａまたはＬｉＣｌのいずれかで刺激し、８個の試料にβ−カテニン（ＣＴＮＮＢ１）を標的とするｓｉＲＮＡを導入した。パネルＢ：Ｗｎｔ３ａまたはＬｉＣｌのいずれかで刺激した１１個の試料を示す。 図４Ａ〜Ｂは、１６種類のＷｎｔ／β−カテニン遺伝子シグネチャーのクロス確認の結果を含む。パネルＡ：これらの実験では、２０個の試料での１６種類のＷｎｔ／β−カテニン遺伝子シグネチャーを、サポートベクターマシン分類法を使ったクロス確認によって確認した。この図から分かるように、１６種類の遺伝子シグネチャーは、２０個の試料の調節状態を、クロス確認において正しく予測した。。パネルＢ：２０個の試料全体の、１６種類のシグネチャー遺伝子のＰＣＲによる発現データを示すヒートマップも示す。 図５Ａは、６４種類のＷｎｔ／β−カテニン応答遺伝子の、リアルタイムＰＣＲを用いた確認に使用した全プライマーの配列情報を含んでいる。 図５Ｂは、６４種類のＷｎｔ／β−カテニン応答遺伝子の、リアルタイムＰＣＲを用いた確認に使用した全プライマーの配列情報を含んでいる。 図６は、Ｗｎｔ／β−カテニン応答遺伝子の遺伝子発現プロファイリングおよび同定の結果を示している。Ｗｎｔ３およびｓｉＲＮＡの処理により、それらの発現が一貫して影響を受けたことから、６４種類の遺伝子を、Ｗｎｔ／β−カテニン応答遺伝子として同定した。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
本発明を詳細に開示する前に以下の定義を提供する。別段の定義が無い限り、本明細書では、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で使用する場合、本明細書に記載の遺伝子のうちの１つまたは複数に相補的なオリゴヌクレオチド配列とは、ストリンジェント条件下で、前記遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部分にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを指す。そのようなハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは通常、前記遺伝子と、ヌクレオチドレベルで少なくとも約７５％の配列同一性、好ましくは約８０％または８５％配列の同一性、より好ましくは約９０％または９５％またはそれ以上の配列同一性を前記遺伝子に対して示す。
「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との相補的なハイブリダイゼーションを指し、かつ、標的ポリヌクレオチド配列の望ましい検出を達成するためにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを下げることで調整することができる小数のミスマッチを包含する。
「と特異的にハイブリダイズしている」という句は、特定のヌクレオチド配列が、複雑な（例えば細胞全体の）ＤＮＡまたはＲＮＡ混合物中に存在する場合に、分子がストリンジェント条件下で、実質的にその特定のヌクレオチド配列に、またはその特定のヌクレオチド配列だけに結合する、二本鎖になる、またはハイブリダイズすることを指す。
「バイオマーカー」は、特定の条件の間で発現またはレベルが変化する任意の遺伝子、タンパク質、またはその遺伝子由来のＥＳＴを意味する。遺伝子の発現と特定の条件との間に関係性がある場合、その遺伝子はその条件に対するバイオマーカーである。
「バイオマーカー由来ポリヌクレオチド」は、バイオマーカー遺伝子から転写されたＲＮＡ、バイオマーカー遺伝子から製造した任意のｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ、およびバイオマーカー遺伝子に由来する任意の核酸、例えば、バイオマーカー遺伝子に対応する遺伝子に由来する配列を有する合成核酸、を意味する。
ある遺伝子マーカーの発現が、ある条件、表現型、遺伝子型または臨床的特徴と、偶然に予想されるよりも十分に大きな、相関または反相関がある場合、この遺伝子マーカーはこの条件、表現型、遺伝子型または臨床的特徴に関する「情報を提供する」。
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、当該分野において理解されるのと同じ意味を有する。しかしながら、用語「遺伝子」が、遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）および／またはイントロン配列を含む場合があることは、当業者には明かである。また、当然のことながら、遺伝子の定義が、タンパク質をコードせず、機能をもったＲＮＡ分子、例えばｔＲＮＡをコードしている核酸を参照することも含む。分かりやすくするために、用語「遺伝子」は通常、タンパク質をコードしている核酸の一部分を指す。この用語は場合によって、制御配列を包含してもよい。この定義は、「遺伝子」という用語のタンパク質をコードしていない発現単位への適用を排除することを意図するものではないが、分かりやすくするために、多くの場合、この用語は、本明細書では、タンパク質をコードしている核酸を指す。いくつかの例では、遺伝子は、転写に伴われる制御配列、またはメッセージの産物もしくは組成物を含む。他の態様において遺伝子は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする、転写された配列を含む。本明細書に記載の用語を踏まえて、「単離された遺伝子」は、転写された核酸、調節配列、コードしている配列などの、他のそのような配列、例えば他の天然に存在する遺伝子、調節配列、ポリペプチドまたはペプチドをコードしている配列などから、実質的に単離された配列を含んでいてもよい。この点において、用語「遺伝子」は、単純化するために、転写されるヌクレオチド配列を含む核酸、およびその相補鎖を指すのに用いられる。具体的な態様では、転写されたヌクレオチド配列は、少なくとも１つの機能性タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドをコードしている単位を含む。当業者には当然であるが、この実用本位の用語「遺伝子」には、ゲノム配列、ＲＮＡもしくはｃＤＮＡ配列の両方、またはより小さい改変した核酸セグメント、例えば、遺伝子の転写されない部分の核酸セグメント（遺伝子の転写されない、プロモーターまたはエンハンサー領域などを含むがこれらには限定されない）が含まれる。より小さい改変した遺伝子核酸セグメントは、核酸操作技術の使用、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、突然変異体および／またはそのようなものを表すか、あるいはそれらを表すのに適用され得る。コード領域の５’に位置する配列で、かつ、ｍＲＮＡに存在する配列を、５’非翻訳配列（「５’ＵＴＲ」）と呼ぶ。コード領域の３’またはその下流に位置し、ｍＲＮＡに存在する配列を、３’非翻訳配列、または「３’ＵＴＲ」と呼ぶ。
「シグネチャー」は、発現パターンの差を指す。これは、ｃＲＮＡ産物をマイクロアレイ解析に使用した場合に、発現が検出される、固有のプローブの数として表すことができる。また、発現がリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで検出される個々の遺伝子の数としても表すことができる。シグネチャーは、特定のセットのバイオマーカーで例示することもできる。
「類似性の値」は、比較される２つのものの類似性の程度を示す数である。例えば、類似性の値は、特定の表現型に関連のあるバイオマーカーを使用して得られた細胞試料の発現プロファイルと、そのテンプレートに特異的な対照との間の、全体的な類似性を示す数となり得る（例えば、調節解除されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路状態という表現型をもつ、「調節解除されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路」テンプレートに対する類似性になる）。類似性の値は、類似性の測定基準、例えば相関係数で、または類別確率として表してもよく、あるいは単に、細胞試料の発現プロファイルと基準となるテンプレートの間の発現レベルの差、または発現レベルの差の集計として表してもよい。
本明細書で使用する場合、「発現レベルの測定」、「発現レベルの取得」、および「発現レベルの決定」などの用語は、遺伝子の発現レベル、例えば遺伝子の転写量、またはある遺伝子によってコードされているタンパク質を定量する方法、ならびに目的の遺伝子が少しでも発現しているか否かを決定する方法を含む。従って、発現量の定量を必ずしも提供する必要のない、「ある」または「ない」の結果を示すアッセイは、「発現を測定する」アッセイであり、この用語が本明細書では使用される。あるいは、測定されたまたは得られた発現レベルは、任意の定量的な値、例えば、対照の遺伝子または別の試料での同じ遺伝子と比較した、発現倍率の変化、上昇したかまたは低下したか、あるいは発現のログ比、またはそれらの任意の可視的な表現、例えば、検出された遺伝子の発現量を色の彩度で示す「ヒートマップ」などで表してもよい。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の調節が解除されている腫瘍細胞での発現に差があると同定した遺伝子を様々な核酸またはタンパク質の検出アッセイに用いて、指定された試料中のある遺伝子または複数の遺伝子の発現レベルを検出または定量することができる。ある遺伝子の発現レベルを検出する方法の例としては、ノザンブロット法、ドットブロット法もしくはスロットブロット法、レポーター遺伝子マトリックス（例えば、米国特許第５，５６９，５８８号を参照のこと）、ヌクレアーゼプロテクション法、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイを使ったプロファイリング、ディファレンシャルディスプレイ、２次元ゲル電気泳動、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ、ＩＣＡＴ、酵素アッセイ、抗体アッセイ、ＭＮＡザイムを使った検出方法（米国仮特許出願第６１／４７０，９１９号、米国特許出願第２０１１／０１４３３３８号；同第２００７／０２３１８１０号；国際公開第２００８／１２２０８４号パンフレット；同第２００７／０４１７７４号；およびＭｏｋａｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． ２０１０ Ｊａｎｕａｒｙ ２７； １３２（３）： １０５１−１０５９を参照のこと。これらはそれぞれその全体が、参照することにより組み込まれる）などが挙げられるがこれらには限定されない。必要に応じて、発現レベルを検出する遺伝子を増幅してもよい。増幅方法は、例えば、以下の方法の１つまたは複数の方法を含んでいてもよい：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ＬＡＭＰ法（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＣＡ法（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、自家持続配列複製法（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、３ＳＲ）、ＮＡＳＢＡ法（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）。好ましい態様では、遺伝子発現は、好ましくはＳＹＢＲグリーンを使用したＲＴ−ＰＣＲで検出される。
「患者」は、ヒトまたは、好ましくは哺乳動物である非ヒト動物のいずれかを意味する場合がある。
本明細書で使用する場合、「対象」は、生物、またはそれに由来する細胞試料、組織試料もしくは臓器試料、例えば、培養した細胞株、生検、血液試料、もしくは細胞を含む液体試料などの試料を指す。多くの場合、対象またはそれに由来する試料は、複数の細胞型を含んでいる。一態様において試料は、例えば、腫瘍細胞と正常細胞の混合物を含む。一態様において試料は、少なくとも１０％、１５％、２０％、以降順に、９０％、または９５％の腫瘍細胞を含む。生物は動物であってよく、動物には例えば、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ニワトリ、ネコ、イヌなどが含まれるがこれらには限定されず、一般的には、ヒトなどの哺乳動物である。
本明細書で使用する場合、「経路」という用語は、産物の生産または活性を生じる連続的に起こる２つ以上の分子の相互作用に伴われる、一連のシステムの構成要素を意味することを意図している。経路は、様々な産物または活性を生じることができ、これらの産物または活性には、例えば、分子間相互作用、核酸もしくはポリペプチドの発現の変化、２つ以上の分子による複合体の形成もしくは分解、代謝産物の蓄積もしくは破壊、酵素の活性化もしくは不活性化、または結合活性が含まれ得る。従って、用語「経路」には、様々な種類の経路、例えば、生化学的経路、遺伝子発現経路、および調節経路などが含まれる。同様に、経路は、これらの例示した種類の経路の組み合わせであってもよい。
「Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路」または「b−カテニンシグナル伝達経路」としても知られている「Ｗｎｔシグナル伝達経路」は、Ｗｎｔ受容体が活性化したことによって活性化される細胞内シグナル伝達経路のうちの１つであり、原腫瘍性タンパク質であるｂ−カテニンの細胞内レベルを制御する、標準的なＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路を指す。Ｗｎｔリガンド（Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６を含むがこれらには限定されない）との結合によって、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性化されると、Ｗｎｔ受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄがその共受容体ＬＲＰ５／６（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質）とヘテロ二量体化する。次いで、活性化されたカゼインキナーゼ２がＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄを過剰にリン酸化し、サイトゾル中のｂ−カテニンレベルを調節する破壊複合体（ＡＰＣとＡｘｉｎ／Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎを含む）の構成要素であるＧＳＫ３ｂの阻害を引き起こす。ＧＳＫ３ｂによるβ−カテニンのリン酸化によって、ｂ−ＴｒＣＰを介したそのユビキチン化とプロテアソーム分解機構によるその分解が生じる。ＧＳＫ３ｂの阻害することによって破壊複合体が分解して、ｂ−カテニンがリン酸化された状態でなくなり、サイトゾルおよび核でのｂ−カテニンレベルが上昇する。核のｂ−カテニンはＴ−細胞因子／リンパエンハンサー因子（ＴＣＦ／Ｌｅｆ）と相互作用し、コリプレッサーと置き換わる。ｂ−カテニン／ＴＣＦ複合体は、多種多様な標的遺伝子の転写を活性化する（Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達カスケードの総説であるＣｌｅｖｅｒｓ， ２００６， Ｃｅｌｌ １２７：４６９−４８０も参照のこと）。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路には、本出願の表に列挙した遺伝子、およびそれらによってコードされているタンパク質が含まれるがこれらには限定されない。
「Ｗｎｔ／β−カテニン剤」、「Ｗｎｔ剤」、または「ｂ−カテニン剤」は、標準的なＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬物または薬剤を指す。Ｗｎｔ／b−カテニン経路阻害剤は、標準的なＷｎｔ／b−カテニン経路のシグナル伝達を阻害する。そのような薬剤の分子標的には、ｂ−カテニン、ＴＣＦ４、ＡＰＣ、ａｘｉｎ、ＧＳＫ３ｂ、および本明細書で列挙した遺伝子のうちのいずれもが含まれ得る。そのような薬剤は当該分野において既知であり、それらには、チアゾリジンジオン（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ．２００８年６月２７日、印刷に先行してインターネット上で出版）；ＰＫＦ１１５−５８４（Ｄｏｇｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ｄｏｉ： １０．１２１０／ｊｃ．２００８−０２４７；ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド（Ｙａｍａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ３１ ：９１６−９２０）；ＦＨ５３５（Ｈａｎｄｅｌｉ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ， ２００８， Ｍｏｌ． Ｃｎａｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ７：５２１−５２９）；サルディナク（ｓｕｌｄｉｎａｃ）（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５８３：２６−３１）；シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤のセレコキシブ（Ｔｕｙｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｃｎａｃｅｒ Ｒｅｓ． ６８：１２１３−１２２０）；逆向きターン模倣化合物（米国特許第７，２３２，８２２号）；ｂ−カテニン阻害化合物１（国際公開第２００５０２１０２５号パンフレット）；フシコクシン類似体（国際公開第２００７０６２２４３号パンフレット）；およびＦＺＤ１０モジュレーター（国際公開第２００８０６１０２０号パンフレット）が含まれるがこれらには限定されない。
本明細書において使用される場合、「調節解除されたＷｎｔ／β−カテニン経路」という用語は、過剰に活性化されたまたは活性化が不足しているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路を意味する。ある試料（例えば腫瘍試料）中のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が、正常な（調節されている）試料のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２００％、５００％、１０００％高く、活性化／シグナル伝達されている場合、そのＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路は過剰に活性化している。ある試料（例えば腫瘍試料）中のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が、正常な（調節されている）試料のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％低く活性化／シグナル伝達されている場合、そのＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の活性化の度合は不足している。Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節されている正常な試料は、隣接した正常な組織に由来するものであっても、Ｗｎｔ／b−カテニンのシグナル伝達調節が解除されていない他の腫瘍試料に由来するものであっても、または試料プールであってもよい。あるいは、試料間のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路状態の比較は、薬物または薬剤で、あるいは媒体で処理した同一の試料間で行ってもよい。活性化状態の変化の原因は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路に含まれる１つまたは複数の遺伝子における変異（例えば、点変異、欠失、または増幅）、転写調節の変化（例えば、メチル化、リン酸化、またはアセチル化の変化）、またはタンパク質調節（例えば、翻訳または翻訳後の制御機構）の変化である可能性がある。
本明細書で使用する場合、「発癌性経路」という用語は、過剰に活性化している場合、または活性が不足している場合に、癌の発症または進行に寄与する経路を意味する。一態様において発癌性経路とは、腫瘍遺伝子または腫瘍抑制性遺伝子を含む経路である。
本発明に関わる用語「治療」とその様々な文法形式での「治療」は、疾患状態の有害な効果、疾患の進行、疾患の原因物質（例えば細菌またはウイルス）、または他の異常な状態を予防する（つまり化学的予防）、治癒する、反転させる、緩和する、軽減する、最小限に抑える、抑制する、または停止させることを指す。例えば治療は、疾患のある症状（つまり、症状の全てである必要はない）を緩和させること、または疾患の進行を弱めることを含み得る。
本明細書で使用する場合「癌の治療」とは、癌の進行（癌の転移を含む）を部分的にまたは全体的に阻害する、遅らせるまたは予防すること；癌の再発（癌の転移を含む）を阻害する、遅らせるまたは予防すること；または哺乳動物、例えばヒトの癌の発症または発達を予防すること（化学的予防）を指す。加えて、本発明の方法を実施して癌を患っているヒト患者を治療してもよい。しかしながら、この方法は、他の哺乳動物の癌の治療にも有効であるだろう。
本明細書で使用する場合、「治療上有効量」という用語は、癌に必要な治療計画における治療量が適切である認めることを意図している。これには、複数の治療薬を使用する、例えば、それらの量の合計が望まれる生体反応を達成する第一の治療と第二の治療の量の合計などの、併用療法が含まれる。望まれる生体反応とは、癌の進行（癌の転移を含む）の部分的なまたは全体的な阻害、遅延、または予防；癌の再発（癌の転移を含む）の阻害、遅延、または予防；哺乳動物、例えばヒトの癌発生の発症の予防（化学的予防）である。
「分類結果、予測結果、または効力結果を表示するまたは出力する」とは、任意のメディア、例えば口頭、書面、視覚ディスプレイなどのコンピューターが読み込み可能なメディアまたはコンピューターシステムを使用している利用者に、試料の分類または予測に基づく遺伝子発現の結果が、送られることを意味する。結果の出力とは、利用者または接続されている外部の要素、例えばコンピューターシステムもしくはコンピューターメモリに出力することだけには限定されず、内部の要素、例えばコンピューターが読み込み可能なメディアに出力することも含み得ることは当業者には明かである。コンピューターが読み込み可能なメディアには、ハードドライブ、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＤＡＴが含まれ得るがこれらには限定されない。コンピューターが読み込み可能なメディアには、データ伝送のための搬送波または他の波形は含まれない。本明細書に開示したおよび特許請求の範囲に含まれる様々な分類方法は、必須ではないが、コンピューターに実装することが可能であること、および、例えば表示工程または出力工程は、例えばヒトに口頭でまたは書面（例えば手書き）で伝えることができることも、当業者には明かである。
上述したように、本発明では、細胞試料または対象のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の調節状態を評価するのに細胞試料中でのその発現レベルを使用することができる新しい遺伝子のセット、すなわち、遺伝子シグネチャーを同定する。これは、細胞毒物を使用した化学療法には限界があり、現在の腫瘍学における創薬が腫瘍の成長および進行に重要な特定の細胞内シグナル伝達経路を標的とするように設計されていることから有用である。そのような標的薬剤の開発には、経路の活性状態を監視するための特異的なバイオマーカーが必要である。経路成分中の１つまたは少数の表示成分の発現を検出することに依存したより従来型の方法と比較して、複数の遺伝子の発現に基づいた方法では、複数の遺伝子の発現の変化に及ぼす経路調節の下流効果の機能として、経路の変化を測定する。これら下流遺伝子の発現の変化によって、経路の構成要素の上流のいずれかの変化に関連した全ての変化を捕捉できる可能性がある。
Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、結腸直腸癌、黒色腫、乳癌および肝細胞癌を含むいくつかのヒトの癌において、最も頻繁に変化が見られる経路のうちの１つであり、そのため、癌研究者が最も関心をもっている経路である。Ｗｎｔ／β−カテニン経路が活性化すると、下流で様々な生物学的な効果が生じ、また、この機能面での多様性は遺伝子発現の変化を反映するものである。２９３Ｈ細胞をＷｎｔ３ａで刺激し、β−カテニンをｓｉＲＮＡを介してノックダウンし、その後、遺伝子発現をプロファイリングすることで、発明者らは、Ｗｎｔ３ａに応答して発現がアップレギュレートし、その亢進した発現レベルが、β−カテニンｓｉＲＮＡでの処理により低下する、６４種類の遺伝子を同定した。これら６４種類のＷｎｔ／β−カテニン応答遺伝子を、Ｗｎｔ３ａおよびＬｉＣＩで刺激したおよび／またはβ−カテニンｓｉＲＮＡで阻害した１６種類の細胞株のパネルに由来する２０個の試料を使ったリアルタイムＰＣＲでさらに評価した。ＮＳＣ法（ｎｅａｒｅｓｔ ｓｈｒｕｎｋｅｎ ｃｅｎｔｒｏｉｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ ｍｅｔｈｏｄ）を使い、Ｗｎｔ／β−カテニン経路調節に関する特異的パネルとして１６種類の遺伝子を同定した。サポートベクターマシン法を用いたクロス確認過程において、この１６遺伝子のシグネチャーは、これら２０個の試料でのＷｎｔ／β−カテニン経路の状態を１００％の精度で予測した。そのため発明者らは、それらの発現を、細胞内のＷｎｔ／β−カテニン経路活性の調節状態を監視するのにアッセイすることができる（好ましくはＲＴ−ＰＣＲによって）特異的な１６種類の遺伝子のセットを含む、新規遺伝子発現シグネチャー、およびこの重要なシグナル伝達経路のモジュレーションを伴う関連用途を同定したことを検証した。
具体的には、発明者らは、ＣＡＬＭ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＨＳＹ１、ＣＸＡＤＲ、ＦＡＭ４４Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ａ、ＬＥＦ１、ＭＴＰ１８、ＭＹＣ、ＮＡＶ２、ＳＫＰ２、ＰＲＭＴ６の１３種類の遺伝子が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路が活性化した後にアップレギュレートされるということを発見した。
加えて、発明者らは、別の３種類の遺伝子、つまりＣＹＰ４Ｖ２、ＭＴ１ＡおよびＭＴＳＳ１が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路が活性化した後にダウンレギュレートされることを発見した。
実験項で詳細に開示するように、この遺伝子発現シグネチャーは、特定の経路を操作したことに対して応答している細胞株から、マイクロアレイ解析によって引き出された。これまでのいくつかの研究では、別種の細胞株とリアルタイムＰＣＲのプラットフォームを使用して、彼らのシグネチャー遺伝子を検証している。そのため、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性化との相関がある固有の遺伝子発現シグネチャーを抽出し、実証したことによって、発明者らは、この経路が影響を受けている細胞および試料を同定・確認するための経路遺伝子の発現シグネチャーに関する、リアルタイムＰＣＲのプラットフォームを使用した、新規かつ改良されたワークフローを提供する。
このように決定されたため、本発明の遺伝子発現シグネチャーは、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性の調節状態を正確に反映しており、Ｗｎｔシグナル伝達をモジュレートする化合物のスクリーニングや、悪性腫瘍でのように、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達が異常となっている細胞の同定などの様々なアッセイにおいて有用なはずである。
上で議論したように、また、実験項で詳細に説明するように、本発明者らは、マイクロアレイ解析により、このシグネチャー遺伝子のセットを、Ｗｎｔ３ａおよびβ−カテニンを標的としているｓｉＲＮＡで処理した２９３Ｈ細胞から、最初に同定した６４種類のＷｎｔ／β−カテニン応答遺伝子のリストから同定した。２０個の試料を使った訓練実験のセットから、リアルタイムＰＣＲでＷｎｔ／β−カテニン応答遺伝子を確認し、サポートベクターマシン法で１６種類のＷｎｔ／β−カテニンシグネチャー遺伝子を同定した。
その後、リアルタイムＰＣＲを使ったクロス確認によって、これら２０個の試料中のこの１６遺伝子のシグネチャーの精度と予測値を確認した。この場合、１２個の試料をＷｎｔ３ａまたはＬｉＣｌで刺激し、残りの細胞にはβ−カテニンｓｉＲＮＡを導入した。以下および実験項で参照する図に示すように、これら２０個の試料において、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性の調節状態を予測した場合、この１６遺伝子のシグネチャーの精度は１００％であった。そのため、１６遺伝子シグネチャーおよびこのシグネチャーを構成する遺伝子は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性の調節状態をモニタリングするためのバイオマーカーとして使用することができる。
好ましい態様では、これらの１６遺伝子の発現は、試料から、マイクロアレイおよび／またはＲＴ−ＰＣＲによって決定され得る。特に好ましい態様では、これらの１６遺伝子の発現を、ＳＹＢＲグリーンを使ったリアルタイムＰＣＲによって決定し、ΔΔＣｔ法によって遺伝子発現データを解析し、そして、サポートベクターマシン法によって経路活性を決定してもよい。
これらの方法では、これら１６遺伝子のうちの１つまたは複数の発現プロファイルを対照試料（正常なＷｎｔ／β−カテニン経路活性を有する細胞）と比較することによって、細胞試料の調節状態を決定してもよい。本発明に従って調節状態を評価することができる、アッセイされた細胞試料は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性が望ましくアッセイされる、任意の細胞または細胞試料を含み得る。これらには、例えば、悪性腫瘍の可能性がある細胞、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性に影響を及ぼす可能性のある化学療法を受けた患者から得た細胞、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の調節解除状態が望ましく評価される試料中の細胞；Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が調節解除されているかまたは調節されているかで分類される細胞試料；ある薬剤がＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートするか否かを決定する試料中の細胞試料などが含まれる。加えて、本シグネチャーおよびそれらに含まれるバイオマーカーを使用して、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤に対する対象の反応を予測すること、対象へ治療を割り当てること、および、Ｗｎｔ／β−カテニン経路シグナル伝達を調節するように設計された治療の薬力学的効果を評価することができる。
本発明が、細胞試料中の種々の遺伝子によって発現のレベルを比較することに依存しているため、本発明の実施には概して、標的となる細胞試料と対照の相対的な調節状態を決定するための対照試料と処理試料が必要とされる。標的となる細胞試料は例えば、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の調節状態に影響を及ぼす可能性のある様々な方法、例えばｓｉＲＮＡとの接触、薬剤処理などによって操作された細胞であってよく、対照は、その操作に適した対照となる。対照細胞は例えば、標的細胞試料と同じように扱われる（培養条件、時間、賦形剤、媒体）が、特定の被検操作薬、例えば化学療法薬への曝露のない細胞である。
本発明では、標的ポリヌクレオチド分子は主に、癌を患っている患者に由来する試料または腫瘍細胞株、および対応する正常／対照組織または細胞株のそれぞれから抽出される。試料は、初代細胞株または、動物もしくは患者から採取した細胞のエクスビボ培養であってもよい。試料は、臨床上許容可能ないかなる方法によって回収してもよいが、バイオマーカーに由来するポリヌクレオチド（つまりＲＮＡ）が保存されるように回収しなければならない。ｍＲＮＡまたはそれらに由来する核酸（すなわちｃＤＮＡまたは増幅したＤＮＡ）は好ましくは、標準または対照のポリヌクレオチド分子とは区別できるように標識され、また、両方が同時にまたはそれぞれ独立して、上述したいくつかもしくは全てのバイオマーカー、またはバイオマーカーのセットもしくはバイオマーカーの一部分を含むマイクロアレイにハイブリダイズする。あるいは、ｍＲＮＡまたはそれに由来する核酸を、標準または対照のポリヌクレオチド分子と同じ標識で標識して、特定のプローブに対するそれぞれのハイブリダイゼーション強度を比較してもよい。試料は、例えば、腫瘍生検、細針吸引生検、もしくは毛包、または血液、血漿、血清、リンパ液、腹水、胆液、尿などの体液試料など、臨床と関連のあるいかなる組織試料を含んでいてもよい。試料はヒトから採取しても、あるいは、獣医学との関連では、例えば、反芻動物、ウマ、ブタもしくはヒツジ、またはネコやイヌなどのペットを含む、非ヒト動物から採取してもよい。加えて、試料を凍結させ、またはホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した（ＦＦＰＥ）組織試料としてもよい。
トータルＲＮＡおよびポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの調製方法は良く知られており、基本的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）」Ｖｏｌｓ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（１９８９））およびＡｕｓｕｂｅｌらの「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ２」Ｃｕｒｒｅｎｔ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４））に記載されている。
ＲＮＡを、細胞の溶解させる工程と溶解物に含まれるタンパク質を変性させる工程を含む手法によって、真核細胞から単離してもよい。目的の細胞には、野生型細胞（つまり非腫瘍性）、薬剤に曝露した野生型細胞、腫瘍細胞もしくは腫瘍に由来する細胞、改変した細胞、正常な細胞株または腫瘍細胞株の細胞、および薬剤に曝露した改変細胞が含まれる。
ＤＮＡを除去するためにさらに別の工程を行ってもよい。細胞の溶解は、非イオン性の界面活性剤を使用し、その後微量遠心分離によって核を、従って細胞内ＤＮＡの大部分を除去することで達成することができる。一態様では、グアニジンチオシアネートで細胞を溶解し、その後、ＣｓＣｌ沈殿することでＲＮＡをＤＮＡから分離することで、多種多様な目的の細胞からＲＮＡを抽出する（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−５２９９ （１９７９））。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、ｏｌｉｇｏ−ｄＴセルロースを使って選択する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第二版），Ｖｏｌｓ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照のこと）。あるいは、有機溶媒、例えば、温めたフェノールまたはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを使った抽出によって、ＲＮＡをＤＮＡから分離することができる。必要に応じて、ＲＮａｓｅ阻害剤を溶解緩衝液に加えてもよい。同様に、特定の細胞型については、このプロトコールにタンパク質の変性消化工程を加えることが望ましい場合がある。
用途の多くには、他の細胞内ＲＮＡ、例えばトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）よりもｍＲＮＡを優先的に濃縮することが望ましい。大部分のｍＲＮＡはその３’末端にポリ（Ａ）尾部を有する。このことによって、ｍＲＮＡをアフィニティクロマトグラフィー、例えば、セルロースまたはセファデックスなどの固相担体に結合したオリゴ（ｄＴ）またはポリ（Ｕ）を使ったアフィニティークロマトグラフィーによって濃縮することが可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４） を参照のこと）。結合したら、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）／ＳＤＳ（０．１％）を使って、アフィニティーカラムからポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを溶出する。
ＲＮＡ試料は、それぞれのｍＲＮＡ分子が異なるヌクレオチド配列を有する、複数種のｍＲＮＡ分子を含む場合がある。具体的な態様では、ＲＮＡ試料中に含まれるｍＲＮＡ分子は、少なくとも１００種類のヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、ＲＮＡ試料中に含まれるｍＲＮＡ分子は、バイオマーカー遺伝子のそれぞれに対応するｍＲＮＡ分子を含む。別の具体的な態様では、ＲＮＡ試料は哺乳類のＲＮＡ試料である。
具体的な態様では、細胞由来のトータルＲＮＡまたはｍＲＮＡが本発明の方法に使用される。ＲＮＡの供給源は、植物または動物、ヒト、哺乳動物、霊長類、非ヒト動物、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリ、酵母、真核生物、原核生物などの細胞であってよい。具体的な態様では、本発明の方法は、１×１０６個以下の細胞由来のトータルｍＲＮＡまたはトータルＲＮＡを含む試料を使用する。別の態様では、タンパク質レベルでの発現解析に使用するために、当該分野で知られている方法によって、前述した提供源からタンパク質を単離することができる。
非ヒト核酸をアッセイする場合には、好ましくは、本明細書で開示したバイオマーカー配列のホモログに対するプローブを使用することができる。
本発明の好ましい態様では、Ｗｎｔ／β−カテニン経路シグネチャーに含まれる全１６遺伝子の対照試料に対する発現レベルに基づいて、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の調節状態を決定する。しかしながら、これら１６の遺伝子またはバイオマーカーの一部、つまり、これらの遺伝子のうちの少なくとも２つ、これらの遺伝子のうちの少なくとも３つ、これらの遺伝子のうちの少なくとも４つ、これらの遺伝子のうちの少なくとも６つ、これらの遺伝子のうちの少なくとも７つ、以降同様に、またはこれらの１６遺伝子の全ての任意の組み合わせの発現をアッセイすることによって、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の調節状態を決定してもよいということもまた、想定される。さらに、別の遺伝子がＷｎｔ／β−カテニン経路の調節状態に影響を及ぼすまたは相関のある場合に、その発現をさらにアッセイすることは、本発明の範囲に含まれる。
そのため、本発明の一側面は、それらの発現がＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の調節解除と相関している、１６種類１セットのバイオマーカーを提供する。これらのバイオマーカーが、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の調節状態に応じて対象を分類する、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする化合物に対する対象の反応を予測する、治療薬がＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路に及ぼす薬力学的な効果を測定するのに有用であることを同定した。
本発明の別の側面は、診断の場で腫瘍型を区別するために、または治療薬への反応を予測するために、これらのバイオマーカーまたはこれらを含むマイクロアレイの使用方法を提供する。
さらに本発明の他の側面は、薬力学的バイオマーカーとして、すなわち、薬力学的なバイオマーカー、つまり治療後の患者の腫瘍または抹消組織での経路の阻害をモニタリングする；反応予測バイオマーカー、つまり特定の経路の活性が高レベルである腫瘍を患っている患者を、その経路を標的とした阻害剤で患者を治療する前に予め同定する；および初期効果のバイオマーカー、つまり効力を初期に読み取るバイオマーカーとして、これらバイオマーカーまたはこれらを含むマイクロアレイを使用する方法を提供する。本発明の一態様では、１６種類１セットのバイオマーカーを、２つの相反する「アーム」、Ｗｎｔ／b−カテニン経路を介したシグナル伝達の上昇に伴って、アップレギュレートされる１３種類の遺伝子である「上方」アーム、およびシグナル伝達の上昇に伴ってダウンレギュレートされる３種類の遺伝子である「下方」アームに分けてもよい。
本発明の一層さらに別の側面は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路調節状態によって対象を区別する、つまり、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節されている患者と調節が解除されている患者を区別することができる、１６種類１セットのバイオマーカーまたはこれを含むマイクロアレイを提供する。これらのバイオマーカーを本明細書で列挙する。本発明はさらに、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の調節が解除されている対象と調節されている対象を区別することができる、１６種類１セットの遺伝子の一部、あるいは、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の調節が解除されている対象と調節されている対象を区別することができるバイオマーカーの一部を提供する。また本発明は、上述のバイオマーカーを使用して、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の調節が解除されている対象と調節されている対象を区別する方法も提供する。
別の態様では、本発明は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路剤に対する対象の反応を予測するために使用することができる、１６種類１セットの１６バイオマーカーまたはそれらを含むマイクロアレイを提供する。より具体的な態様では、本発明は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤に対する対象の反応を予測するために使用することができる、開示した、１６種類１セットのバイオマーカーの一部を提供する。別の態様では、本発明は、癌を患っている対象を治療するためのＷｎｔ／b−カテニン経路剤の選択に使用することができる、１６種類１セットのバイオマーカーを提供する。より具体的な態様では、本発明は、癌を患っている対象を治療するためのＷｎｔ／b−カテニン経路剤の選択に使用することができる、１６種類１セットのバイオマーカーの一部を提供する。あるいは、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路剤に対する対象の反応を予測するために、または癌を患っている対象を治療するためのＷｎｔ／b−カテニン経路剤を選択するために、これらバイオマーカーの一部を使用することができる。
別の態様では、本発明は、ある薬剤が、対象のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路に薬力学的な効果を及ぼすか否かを決定するのに使用することができる、１６種類１セットの遺伝的バイオマーカーまたはそれらを含むマイクロアレイを提供する。提供するバイオマーカーを使用して、前記薬剤で治療した後の患者の、様々な時点でのＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の阻害をモニタリングしてもよい。より具体的な態様では、本発明は、ある薬剤がＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路に及ぼす薬力学的な活性をモニタリングするのに使用することができる、開示した１６種類１セットのバイオマーカーの一部を提供する。
対象のバイオマーカーは単独で使用しても、あるいはセットには含まれないバイオマーカーと組み合わせて使用してもよい。例えば、Ｗｎｔ／b−カテニン経路の調節状態を区別するバイオマーカーを、成長因子のシグナル伝達経路の調節状態を区別するバイオマーカーと組み合わせて使用してもよい。本明細書で提供するバイオマーカーのセットはいずれも、癌に関する、または任意の他の臨床条件もしくは生理学的な条件に関する他のバイオマーカーと組み合わせて使用してもよい。
好ましい態様において記載したように、１６種類全ての遺伝子の発現値をリアルタイムＰＣＲでアッセイし、Ｗｎｔ経路の調節状態を決定する。精度を保証するために、これらの１６種類の遺伝子と合わせて、対照の遺伝子（つまり、１つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子、例えば、５つのハウスキーピング遺伝子）の発現値を、細胞試料と処理試料の双方について測定し、ΔΔＣｔを計算する。これら１６種類の遺伝子のこのΔΔＣｔ値をその後、２０個の試料（経路活性の観点からみると、８個は負に調節されており、１２個は正に調節されている）を含む、訓練実験のデータのプールに含まれている１６種類の遺伝子のΔΔＣｔ値と比較する。例示となる態様では、サポートベクターマシン法を使って、特定の標的となる細胞試料の調節状態を決定する。
本発明はさらに、対象の遺伝子発現アッセイ法を実施するキットおよびキットの構成要素を提供する。好ましい例示的な態様では、このキットは、これら１６種類の遺伝子のうちの１つもしくは複数、好ましくはこれら１６種類の遺伝子全てもしくはその大部分に相当する配列を含む、Ｗｎｔシグナル伝達ＰＣＲアレイ製品を含むものである。これらに関しては、出願企業のキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）は、本明細書で報告した１６遺伝子のシグネチャーに含まれている４種類の遺伝子を含むＷｎｔ ＰＣＲアレイを既に有している。好ましい態様では、この既存のＷｎｔ ＰＣＲアレイを、残りの１２種類のシグネチャー遺伝子を組み入れることで修正する。そのため、この製品は、物理的な構成要素に関して見れば、既存のＷｎｔ ＰＣＲアレイと同じようなものになるが、ただし、１２種類の新しい遺伝子を含む。本発明はさらに、好ましくは、遺伝子の発現データを解析するための、ウェブを利用したシステムを含む場合がある。
好ましいＰＣＲアレイを使った実験を行った後、使用者は標的試料と対照試料の調節状態を決定する。好ましい態様では、使用者は、市販のキアゲンのウェブを利用した解析ツールもしくは均等物を使用して、比較および解析を行う。このウェブを利用した解析ツールおよびデータ解析は、現在、キアゲンの既存のＷｎｔ ＰＣＲアレイを使って実施されている。本発明の関連では、このツールはさらに、適切な対照試料と比較した、特定の処理試料の相対的な調節状態の評価に使用される数値（指数、確率または類似の指標）を使用者に提供する。その結果、このキットの構成要素およびプロトコールは、解析が増える（１６種類の遺伝子の発現レベルに基づく、経路の調節状態）以外は、現在市販されているＷｎｔＰＣＲアレイと同じようなものになる。
本発明の利用方法
診断的／試料の分類方法
本発明は、患者または対象由来の試料を解析し、対象の試料を分子レベルで、つまり、試料のＷｎｔ／b−カテニン経路が調節解除されているかまたは調節されているかを決定または分類するための、バイオマーカーのセットの使用方法を提供する。試料は、腫瘍に由来するものであっても腫瘍に由来するものでなくてもよい。患者は、実際に癌に罹患している必要はない。本質的には、患者もしくは患者から採取した試料中の特定のバイオマーカー遺伝子の発現を、標準または対照と比較する。例えば、２つの癌に関連する条件、ＸとＹを仮定する。条件Ｘに関する患者のＷｎｔ／b−カテニン経路バイオマーカーの発現レベルを、対照におけるバイオマーカー由来ポリヌクレオチドのレベル、つまり、条件Ｘを有する試料によって提示される発現レベルと比較する。この場合、患者の試料におけるマーカーの発現が、対照の発現との間に実質的に（すなわち統計的に）差があれば、患者は条件Ｘを有していない。今回の例では、選択肢は二項（つまり試料はＸまたはＹ）なので、加えて、試料が条件Ｙを有していると言える。無論、条件Ｙを表している対照との比較を行ってもよい。好ましくは、それぞれの対照が陽性対照と陰性対照の両方として機能するように、２つを同時に実施する。従って特徴的な結果は、対照によって表される、発現レベル由来の表示可能な差（つまりマーカー由来のＲＮＡもしくはそれに由来するポリヌクレオチドの量）あるいは、有意差なしとなり得る。従って、一態様では、腫瘍に関連する患者の特定の状態を決定する方法は、以下の工程を含むものとなる。（１）患者由来の標的ポリヌクレオチドを標識し、上述したバイオマーカーのセットまたはバイオマーカーの一部を含むマイクロアレイにハイブリダイズさせる工程、（２）標的分子とは異なる標識で標識した標準または対照のポリヌクレオチド分子をマイクロアレイにハイブリダイズさせる工程、および（３）標的と標準もしくは対照の間の、患者の癌に関連する状態を決定する転写レベルの差、または転写の欠損を決定する工程。より具体的な態様では、標準または対照の分子は、健常人から採取した試料のプールまたは癌患者から採取した試料のプールからの、バイオマーカー由来ポリヌクレオチドを含む。好ましい態様では、標準または対照は、正常組織または、特定の臨床指標（つまり腫瘍性または非腫瘍性；Ｗｎｔ／b−カテニン経路が調節されているまたは調節解除されている）を有する癌組織から採取した臨床試料によって示されるバイオマーカーの発現レベルを模倣するように設計された、人工的に合成したバイオマーカー由来ポリヌクレオチドのプールである。別の具体的な態様では、対照分子は、正常な細胞株または腫瘍細胞株に由来するプールを含む。
本発明は、Ｗｎｔ／b−カテニン経路の調節が解除されている腫瘍型を、Ｗｎｔ／b−カテニン経路が調節されているものから区別するのに有用なバイオマーカーのセットまたはそれらを含むマイクロアレイを提供する。従って、上述した方法の一態様では、患者から採取した試料の、本明細書で提供した１６種類のバイオマーカーによって表されるポリヌクレオチド（つまり、ｍＲＮＡまたはそれらに由来するポリヌクレオチド）のレベルを、対照の同じバイオマーカーの発現レベルと比較する。ある化合物がＷｎｔシグナル伝達に影響を及ぼすか否かを同定することが目的の場合、対照には、同じ方法によって処理されたが、化合物による処理を行っていない試料が含まれ得る。
あるいは、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の調節が解除されている腫瘍試料およびＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節されている腫瘍試料の両方に対する比較であってよく、また、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の調節が解除されているいくつかの腫瘍試料およびＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節されているいくつかの腫瘍試料それぞれからのポリヌクレオチドプールに対する比較であってもよい。患者のバイオマーカーの発現が、調節解除されている対照に最も似ているか、または相関しており、かつ、調節されている対照とは似ていないまたは相関がない場合、この患者が、調節が解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路を有していると分類する。プールが、純粋な調節が解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の腫瘍試料、または純粋な調節されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の腫瘍試料ではない場合、例えば、散発性のプールを使用する場合、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の状態が分かっている患者を使った実験の組をプールに対してハイブリダイズさせ、調節解除された群と調節されている群に関する発現テンプレートを定義することができる。Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の状態が分かっていないそれぞれの患者を同じプールにハイブリダイズさせ、発現プロファイルをテンプレートと比較して、患者のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の状態を決定する。好ましい方法で記載したように、バイオマーカーの発現は、ＲＴ−ＰＣＲを使って実施される。
別の具体的な態様では、この方法は、以下の工程を含む。（ｉ）第一の発現プロファイルとＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路のテンプレートとの間の類似性の値を計算する工程、すなわち、前記第一の発現プロファイルと前記調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路テンプレートとの間の第一の類似性の値、および前記第一の発現プロファイルと調節されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路のテンプレートとの間の第二の類似性の値を計算する工程であって、前記第一の発現プロファイルは細胞試料中の第一の複数の遺伝子の発現レベルを含み、前記調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路テンプレートは前記第一の複数の遺伝子の発現レベル（前記Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路に含まれ、活性が異常になっている構成要素のうちの少なくとも１つまたは複数を有する複数の細胞試料中の対応する遺伝子の発現レベルの平均である）を含み、前記調節されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路テンプレートは前記第一の複数の遺伝子の発現レベル（前記Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路に含まれ、活性が異常になっている構成要素のうちの少なくとも１つまたは複数を有していない、複数の細胞試料中の対応する遺伝子の発現レベルの平均である）を含み、および前記第一の複数の遺伝子は、本明細書で挙げたバイオマーカーに対応する遺伝子のうちの少なくとも５種類から構成されている、工程；
（ｉｉ）前記第一の発現プロファイルが、前記調節されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路のテンプレートに対してよりも、前記調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路のテンプレートに対して高い類似性を示す、あるいは前記調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路のテンプレートに対してより高い類似性を示す場合に、前記細胞試料を、前記調節解除されたＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路を有していると分類する工程、すなわち、前記第一の発現プロファイルが、前記調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路のテンプレートに対してよりも、前記調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路のテンプレートに対して低い類似性を示す場合、または前記調節されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路のテンプレートに対してより高い類似性を示す場合に、前記細胞試料を、前記調節されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路を有すると分類する工程であって、前記第一の発現プロファイルが、前記調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路のテンプレートに対する類似性が予め設定しておいた閾値より高い場合に、前記調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路のテンプレートに対して高い類似性を示すか、あるいは、前記調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路のテンプレートに対する類似性が前記予め設定しておいた閾値よりも低い場合に、前記調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路のテンプレートに対して低い類似性を示す、工程、および
（ｉｉｉ）使用者の情報伝達装置、コンピューターで読み取り可能な保存メディア、またはローカルコンピューターシステムもしくは遠隔計算機システムに、前記分類する工程（ｉｉ）で生成した分類を表示または出力する工程。
別の具体的な態様では、対象から採取した試料を、バイオマーカーのセットを使ってＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の調節状態によって分類してもよい。試料は、腫瘍に由来するものであっても腫瘍に由来するものでなくてもよい。従って、上述した方法の一態様では、患者から採取した試料の、本明細書で提供したバイオマーカーによって表されるポリヌクレオチド（つまり、ｍＲＮＡまたはそれらに由来するポリヌクレオチド）のレベルを、対照の同じバイオマーカーの発現レベルと比較し、ここで対照には、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節解除されている試料からの、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節されている試料からの、またはその両方からの、バイオマーカー由来ポリヌクレオチドが含まれる。比較は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節解除されている試料と調節されている試料の両方に対するものであってよく、また、比較をＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の調節が解除されているいくつかの腫瘍試料およびＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節されているいくつかの腫瘍試料それぞれからのポリヌクレオチドプールに対するものであってもよい。比較は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節解除されている試料と調節されている試料の混合プール、または未知の試料に対して行うこともできる。
上述した態様では、バイオマーカーの全て（つまり、全１６種類のバイオマーカー）を使用することができる。他の態様では、１６種類のバイオマーカーの一部を使用してもよく、またはバイオマーカーの「上方」および「下方」アームの一部を使ってもよい。
別の態様では、発現プロファイルとは、対象由来の試料の前記複数の遺伝子の測定値の、対照試料の前記複数の遺伝子の測定値に対する差を含む、発現プロファイルの差である。測定値の差は、ｘｄｅｖ、対数（比）、誤差重み付き対数（比）、または平均値減算対数（強度）であってよい（例えば、２０００年７月６日に公開された、国際公開第００／３９３３９号パンフレット、２００４年８月５日に公開された、国際公開第２００４／０６５５４５号パンフレットを参照のこと。これらそれぞれの全文は参照することにより本明細書に組み入れられる）。当該分野で知られているいずれかの方法を使用する複数の方法によって、試料または患者のバイオマーカーの発現プロファイルと対照の発現プロファイルとの類似性を評価することができる。例えば、Ｄａｉらは、乳癌の患者を分類するのに有用な、遺伝子発現のテンプレートと対応するバイオマーカージェネットを算出する、いくつかの異なる方法を説明している（米国特許第７，１７１，３１１号；国際公開第２００２／１０３３２０号パンフレット；同第２００５／０８６８９１号；同第２００６０１５３１２号；同第２００６／０８４２７２号）。同様に、Ｌｉｎｓｌｅｙら（米国特許第２００３／０１０４４２６号）およびＲａｄｉｓｈら（米国特許第２００７０１５４９３１号）は、慢性骨髄性白血病患者の分類に有用な、遺伝子バイオマーカーのセットおよび遺伝子発現テンプレートの算出方法を開示している。最も単純な例では、発現の差のデータをプリントアウトしたものを使い、プロファイルは目視で比較することができる。あるいは、類似性を数学的に算出することもできる。
一態様において類似性は、患者すなわち試料のプロファイルとテンプレートの間の相関係数によって表される。一態様では、相関閾値を超える相関係数は高い類似性を示し、閾値を下回る相関係数は低い類似性を示す。いくつかの態様では、相関閾値を、０．３、０．４、０．５、または０．６に設定する。別の態様では、患者すなわち試料のプロファイルとテンプレートとの間の類似性は、試料のプロファイルとテンプレートとの距離で表される。一態様では、所与の値よりも短い距離は高い類似性を、所与の値よりも長い距離は低い類似性を示す。
従って、より具体的な態様では、特定の腫瘍に関連した患者の状態を決定する上記方法は、（１）患者由来の標識した標的ポリヌクレオチドを、上記マーカーセットのうちの１つを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせる工程、（２）標的分子とは別の標識を付けた標準または対照のポリヌクレオチド分子をマイクロアレイにハイブリダイズさせる工程、（３）２チャンネル（患者と対照）の転写レベルの比（または差）を決定する、または患者の転写レベルを単純化する工程、および（４）（３）で得られた結果を予め設定しておいたテンプレートと比較する工程を含み、ここで前記決定は、当該分野において既知の方法のいずれによっても達成され、生じた差、または差がないことによって、患者の腫瘍に関連した状態が決定される。この方法では、１６種類のバイオマーカーの全てを使用してもよい。しかしながら、１６種類のバイオマーカーの一部、または「上方」（アップレギュレートされる１３種類の遺伝子）または「下方」（ダウンレギュレートされる３種類の遺伝子）も使用することができる。
一層さらに別の態様では、試料のシグネチャースコアは、１６種類全てのバイオマーカーまたはこれらバイオマーカーの一部（「アーム」にかかわらず）の発現レベルの平均として定義される（例えば平均対数（比））。試料のシグネチャースコアが予め設定しておいた閾値よりも大きい場合、試料のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路は調節解除されていると見なされる。予め設定しておいた閾値は０であってよく、または試料の集合すなわち、標準または対照として使用した蓄えておいた試料のシグネチャースコアの平均、中央値、もしくはパーセンタイルであってもよい。
バイオマーカーの使用方法は、特定の腫瘍型、例えば結腸癌を、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節解除されているか調節されているかで区別するまたは分類することには限定されない。バイオマーカーを、異常なＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達を伴っている可能性のある、任意の癌種に由来する細胞試料を分類するのに使用してもよい。黒色腫、肝細胞癌、骨肉腫などの様々な癌、および多くの腫瘍（子宮、卵巣、肺、胃、および腎臓）で、Ｗｎｔ／b−カテニン経路のシグナル伝達の異常が見出されている（Ｌｕｕ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｃｕｒｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ４：６５３−６７１； Ｒｅｙａ ａｎｄ Ｃｌｅｖｅｒｓ， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ ４３４：８４３−８５０； Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ５：６９１−７０１）。
バイオマーカーの使用方法は、癌に関連した状態について、細胞試料をＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節解除されているまたは調節されているかを区別するまたは分類することに限らず、異常なＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達が機能している、またはＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達活性のレベルが要求される、様々な表現型または条件にも応用することができる。例えば、バイオマーカーは、骨および間接障害、例えば、これらには限定されないが、骨粗鬆症、関節リウマチ、硬結性骨化症、ヴァンブッヘム症候群、骨粗鬆症、偽性グリオーマ症候群の細胞試料を分類するのに有用な可能性がある。これまでに、骨や間接の形成および再生にＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が関係していることが分かっている（Ｂｏｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４６：１５１３−１５２１； Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｃｅｌｌ １０７：５１３−５２３； Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ７０：１１−１９； Ｄｉａｎａ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １３：１５６−１６３； Ｂａｒｏｎ ａｎｄ Ｒａｗａｄｉ，２００７， Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． １４８：２６３５−２６４３； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ， ２００７， Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ− ２２：１９１３−１９２３）。Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達が、糖尿病の発症（Ｊｉｎ， ２００８， Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．印刷に先行してインターネット上で出版、 ２００８年８月１２日）；網膜の発達と疾患（Ｌａｄ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．印刷に先行してインターネット上で出版、２００８年８月８日）；神経変性疾患（Ｃａｒａｃｉ ｅｔ ａｌ， ２００８， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．，印刷に先行してインターネット上で出版、２００８年４月２２日）にも関与してきた。
治療に対する反応を予測する方法と治療を割り当てる方法
本発明は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤を使った治療に応答することが予測される患者から採取した試料と、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤を使った治療に応答すると予測されない患者から採取した試料を区別するのに有用な、バイオマーカーのセットを提供する。従って、本発明はさらに、癌を患っている患者が、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤を使った治療への応答者として予測されるか否かを決定するための、これらバイオマーカーの使用方法を提供する。一態様において本発明は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤に対する癌患者の反応を予測するための方法を提供し、この方法は、（１）患者から採取した試料における１６種類のバイオマーカーの発現レベルを、標準または対照における同じバイオマーカーの発現レベル、これはＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達の調節が解除されている試料で見られるレベルを表す、と比較する工程、および（２）患者由来の試料におけるバイオマーカー関連ポリヌクレオチドのレベルが、対照のレベルと有意に異なるか否かを決定する工程を含み、ここで実質的な差が見られなければ、この患者はＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤を使った治療に応答すると予測され、実質的な差が見られる場合には、この患者はＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤を使った治療には応答しないと予測される。標準または対照のレベルが、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節されている試料からのものであってもよいことは、当業者には明らかである。より具体的な態様では、両方の対照を実験に用いる。プールが純粋な「Ｗｎｔ／b−カテニンが調節されている」または純粋な「Ｗｎｔ／b−カテニンが調節解除されている」ものでない場合、応答の状態が分かっている患者の実験組をプールに対してハイブリダイズさせ、応答すると予測される患者の群と応答すると予測されない患者の群に関する発現テンプレートを定義してもよい。アウトカムが分かっていないそれぞれの患者を同じプールにハイブリダイズさせ、得られる発現プロファイルをテンプレートと比較して、そのアウトカムを予測する。
腫瘍のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の調節解除状態は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤を使った薬剤に対する応答者である対象を示し得る。そのため、本発明は、癌患者の治療計画を決定するまたは割り当てる方法を提供し、この方法は、１６種類のバイオマーカーまたはその一部の発現レベルが、調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の状態または調節されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の状態を示している試料中のこれらバイオマーカーのレベルと相関があるか否かを決定する工程、および治療計画を決定するまたは割り当てる工程を含み、発現が調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の状態のパターンと相関していれば、この腫瘍は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤を使って治療される。
診断的バイオマーカーとしては、この方法は好ましくは、１６種類のバイオマーカーの全てを使用することができる。しかしながら、１６種類のバイオマーカーの一部を使用してもよい。
試料は、上述した診断的バイオマーカーの場合と実質的に同じように、「応答すると予測される患者」または「応答すると予測されない患者」のいずれかに分類される。この場合、テンプレートを生成し、これに対して、試料中のバイオマーカーの発現レベルを比較する。
別の態様では、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路に及ぼす薬剤の効果を測定するための上述の方法は、好ましくは、ＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲによって１６種類のバイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定した後に決定され、かつ、データ解析には、ΔΔＣｔ法が用いられる。各試料中のハウスキーピング遺伝子のＣｔ値の平均を、その試料に関するハウスキーピング遺伝子のＣｔ値として計算する。同じ試料の個々のアッセイのＣｔ値からハウスキーピングＣｔ値を引くことで、ΔＣｔを計算する。さらに、各アッセイの対照試料のΔＣｔ値を、対応する処理試料のΔＣｔ値から引くことで、ΔΔＣｔ値を導き出す。その後、この１６遺伝子のΔΔＣｔ値を、２０個の試料（経路活性の観点からみると、８個は負に調節されており、１２個は正に調節されている）を含む訓練実験のプールに含まれている１６遺伝子のΔΔＣｔ値と比較する。試料のΔΔＣｔ値の解析には、好ましくはサポートベクターマシン法を使用し、その発現を用いて、試料のＷｎｔ／β−カテニン経路活性の調節状態を評価する。
バイオマーカーの使用方法は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤に対する反応を、癌に関連する条件について予測するだけでなく、遺伝子の発現が機能している様々な表現型または条件、臨床または実験に応用することができる。２つ異常の表現型に対応するバイオマーカーのセットが同定された場合、このバイオマーカーのセットを使用して、これらの表現型を区別することができる。例えば、表現型は、病態の診断および／または予後であっても、または癌や他の病状、または他の生理学的条件に関連する表現型であっても、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路以外の経路をモジュレートする薬剤に対する反応の予測であってもよく、ここで発現レベルのデータは、その特定の生理学的条件または病状と相関のある遺伝子のセットから導かれる。
バイオマーカーの使用方法は、特定の癌種、例えば結腸癌に関して、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤に対する反応を予測することには限定されない。バイオマーカーを使用して、異常なＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達が関与しているいかなる癌腫においても、薬剤に対する反応を予測することができる。黒色腫、肝細胞癌、骨肉腫などの様々な癌、および多くの腫瘍（子宮、卵巣、肺、胃、および腎臓）で、Ｗｎｔ／b−カテニン経路のシグナル伝達の異常が見出されている（Ｌｕｕ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｃｕｒｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ４：６５３−６７１； Ｒｅｙａ ａｎｄ Ｃｌｅｖｅｒｓ， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ ４３４：８４３−８５０； Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ５：６９１−７０１）。
バイオマーカーの使用方法は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤に対する反応を、癌に関連する条件について予測することに限らず、異常なＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達が機能している、または一定のレベルのＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達活性が要求される、様々な表現型または条件にも応用することができる。例えば、バイオマーカーは、骨および間接障害、例えば、これらには限定されないが、骨粗鬆症、関節リウマチ、硬結性骨化症、ヴァンブッヘム症候群、骨粗鬆症、偽性グリオーマ症候群に罹患している対象のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤への反応を予測するのに有用な可能性がある。Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路はこれまでも、骨や間接の形成および再生に関与してきた（Ｂｏｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４６：１５１３−１５２１； Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｃｅｌｌ １０７：５１３−５２３； Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ７０：１１−１９； Ｄｉａｒｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １３： １５６−１６３； Ｂａｒｏｎ ａｎｄ Ｒａｗａｄｉ， ２００７， Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． １４８：２６３５−２６４３； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ． ２２： １９１３−１９２３）。Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達は、糖尿病の発症（Ｊｉｎ， ２００８， Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．印刷に先行してインターネット上で出版、 ２００８年８月１２日）；網膜の発達と疾患（Ｌａｄ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．印刷に先行してインターネット上で出版、２００８年８月８日）；神経変性疾患（Ｃａｒａｃｉ ｅｔ ａｌ， ２００８， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．，印刷に先行してインターネット上で出版、２００８年４月２２日）にも関与してきた。
薬剤がＷｎｔ／b−カテニン方法シグナル伝達経路をモジュレートするか否かを決定する方法
本発明は、対象のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路を変更するまたはモジュレートすると予測される薬剤を同定または評価するのに有用なバイオマーカーのセット、およびこのバイオマーカーを使用して、対象のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路を変更するまたはモジュレートすると予測される薬剤を同定または評価する方法を提供する。「Ｗｎｔ／ｂ−カテニンシグナル伝達経路」は、Ｗｎｔリガンド（Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６を含むがこれらには限定されない）が、共受容体のＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ５／６複合体に結合することによって開始する。Ｆｒｉｚｚｌｅｄは、ｂ−カテニンとＧＳＫ３ｂの上流で機能する細胞質タンパク質であるＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄと相互作用し、破壊複合体の不活性化を引き起こす。破壊複合体が不活性化されると、安定化したｂ−カテニンが、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリー転写因子を調節する場である核に輸送され、ｂ−カテニンは、増殖に関与する遺伝子（ｃ−ＭｙｃおよびサイクリンＤｌ）や経路のフィードバック調節に関与する遺伝子（Ａｘｉｎ−２およびＬＥＦ１）を含む、多くの遺伝子を発現させる。この利用法では、特段の記載のない限り、「Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路」は、当然のことながら、原腫瘍性タンパク質であるｂ−カテニンの細胞内レベルを制御する、標準的なＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路を介したシグナル伝達を指す。
Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路に影響を与える薬剤としては、低分子化合物；タンパク質またはペプチド（抗体を含む）；ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ分子；または、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の中で機能する、またはＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路と相互作用する他のシグナル伝達経路、例えばＮｏｔｃｈ経路の中で機能する、１つまたは複数の遺伝子またはタンパク質をモジュレートする、他の薬剤のいずれもが挙げられる。
「Ｗｎｔ／b−カテニン経路剤」とは、標準的なＷｎｔ／b−カテニン経路のシグナル伝達をモジュレートする薬剤を指す。Ｗｎｔ／b−カテニン経路阻害剤は、標準的なＷｎｔ／b−カテニン経路のシグナル伝達を阻害する。そのような薬剤の分子標的としては、β−カテニン、ＴＣＦ４、ＡＰＣ、ａｘｉｎ、およびＧＳＫ３ｂが挙げられ得る。そのような薬剤は、当該分野において既知であり、これらの薬剤には、：チアゾリジンジオン（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ．，２００８年６月２７日、印刷に先行してインターネット上で出版）；ＰＦ１１５−５８４（Ｄｏｇｈｒａａｎ ｅｔ ａｌ， ２００８， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． １０．１２１０／ｊｃ．２００８−０２４７）；ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド（Ｙａｍａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ３１：９１６−９２０）；ＦＨ５３５（Ｈａｎｄｅｌｉ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ， ２００８， Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ７：５２１−５２９）；サルディナク（ｓｕｌｄｉｎａｃ）（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ， ２００８， Ｆｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５８３：２６−３１）；シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤のセレコキシブ（Ｔｕｙｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６８：１２１３−１２２０）；逆向きターン模倣化合物（米国特許第７，２３２，８２２号）；ｂ−カテニン阻害化合物１（国際公開第２００５０２１０２５号パンフレット）；フシコクシン類似体（国際公開第２００７０６２２４３号パンフレット））；およびＦＺＤ１０モジュレーター（公開第２００８０６１０２０号）が含まれるが、これらには限定されない。
一態様では、効果を測定する、すなわちその薬剤がＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートするか否かを決定する方法は、（１）薬剤で処理した試料での１６種類のバイオマーカーの発現レベルを、標準または対照での同じバイオマーカーの発現レベル、これは媒体で処理した試料で見られるレベルを表す、と比較する工程、および（２）処理試料でのバイオマーカー関連ポリヌクレオチドのレベルが、媒体で処理した対照のレベルと有意に異なるか否かを決定する工程を含み、ここで実質的な差が見られなければ、この薬剤はＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートしないと予測され、実質的な差が見られる場合には、この薬剤はＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートすると予測される。
別の態様では、薬剤がＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路に及ぼす効果を測定するための上述の方法は、好ましくは、リアルタイムＰＣＲ（例えばＳＹＢＲグリーンを用いて）によって１６種類のバイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定した後に決定され、かつ、データ解析には、ΔΔＣｔ法が用いられる。各試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ値の平均を、その試料に関するハウスキーピング遺伝子のＣｔ値として計算する。同じ試料のハウスキーピングＣｔ値を、個々のアッセイのＣｔ値から引くことで、ΔＣｔを計算する。さらに、各アッセイの対照試料のΔＣｔ値を、対応する処理試料のΔＣｔ値から引くことで、ΔΔＣｔ値を導き出す。その後、この１６遺伝子のΔΔＣｔ値を、２０個の試料（経路活性の観点からみると、８個は負に調節されており、１２個は正に調節されている）を含む訓練実験のプールに含まれている１６遺伝子のΔΔＣｔ値と比較する。試料のΔΔＣｔ値の解析には、好ましくはサポートベクターマシン法を使用し、その発現を用いて、試料のＷｎｔ／β−カテニン経路活性の調節状態を評価する。
バイオマーカーの使用方法は、ある薬剤がＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートするか否かを、癌に関連する条件について決定することに限らず、遺伝子の発現が機能している、様々な表現型または条件、臨床または実験に応用することができる。２つ以上の表現型に対応するバイオマーカーのセットが同定された場合、このバイオマーカーのセットを使用して、これらの表現型を区別することができる。例えば、表現型は、病態の診断および／または予後であっても、または癌や他の病状、または他の生理学的条件に関連する表現型であっても、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路以外の経路をモジュレートする薬剤に対する反応の予測であってもよく、ここで発現レベルのデータは、特定の生理学的条件または病状と相関のある遺伝子のセットから導かれる。
バイオマーカーの使用方法は、ある薬剤がＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートするか否かを、特定の癌種、例えば結腸癌に関して決定することには限定されない。バイオマーカーを使用して、異常なＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達が関与している、いかなる癌腫についても、ある薬剤がＷｎｔ／b−カテニンをモジュレートするか否かを決定することができる。異常なＷｎｔ／b−カテニン経路シグナル伝達は、黒色腫、肝細胞癌、骨肉腫などの様々な癌、および多くの腫瘍（子宮、卵巣、肺、胃、および腎臓）で見つかっている（Ｌｕｕ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｃｕｒｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ４：６５３−６７１； Ｒｅｙａ ａｎｄ Ｃｌｅｖｅｒｓ， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ ４３４：８４３−８５０； Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ５：６９１−７０１）。
バイオマーカーの使用方法は、ある薬剤がＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートするか否かを、癌に関連する条件について決定することには限定されず、異常なＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達が機能している、または一定のレベルのＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達活性が要求される、様々な表現型または条件に関する薬剤にも応用することができる。例えば、バイオマーカーは、骨および間接障害、例えば、これらには限定されないが、骨粗鬆症、関節リウマチ、硬結性骨化症、ヴァンブッヘム症候群、骨粗鬆症、偽性グリオーマ症候群の治療に関して、薬剤がＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートするか否かを決定するのに有用である。Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路はこれまでも、骨や間接の形成および再生に関与してきた（Ｂｏｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４６：１５１３−１５２１； Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｃｅｌｌ １０７：５１３−５２３； Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ７０：１１−１９； Ｄｉａｉｘａ ｅｔ ａｌ， ２００７， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １３：１５６−１６３； Ｂａｒｏｎ ａｎｄ Ｒａｗａｄｉ， ２００７， Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． １４８：２６３５−２６４３； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ， ２００７， Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ． ２２：１９１３−１９２３）。Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達は、糖尿病の発症（Ｊｉｎ， ２００８， Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．印刷に先行してインターネット上で出版、 ２００８年８月１２日）；網膜の発達と疾患（Ｌａｄ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．印刷に先行してインターネット上で出版、２００８年８月８日）；神経変性疾患（Ｃａｒａｃｉ ｅｔ ａｌ， ２００８， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．，印刷に先行してインターネット上で出版、２００８年４月２２日）にも関与している。
薬剤の薬力学的効果を測定する方法
本発明は、薬剤がＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路に及ぼす薬力学的効果を測定するのに有用なバイオマーカーのセットを提供する。提供するバイオマーカーを使用して、前記薬剤で治療した後の患者または試料の、様々な時点でのＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路のモジュレーションをモニタリングしてもよい。従って、本発明はさらに、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤の効果の早期評価としての、これらバイオマーカーの使用方法を提供する。一態様において本発明は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤の、患者または試料における薬力学的効果を測定する方法を提供し、この方法は、（１）薬剤で処理した試料での１６種類のバイオマーカーの発現レベルを、標準または対照での同じバイオマーカーの発現レベル、これは媒体で処理した試料で見られるレベルを表す、と比較する工程、および（２）処理試料でのバイオマーカー関連ポリヌクレオチドのレベルが、媒体で処理した対照のレベルと有意に異なるか否かを決定する工程を含み、ここで実質的な差が見られなければ、この薬剤はＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路に対する薬力学的効果をもたないと予測され、実質的な差が見られる場合には、この薬剤はＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路に対する薬力学的効果をもつと予測される。別の具体的な態様において本発明は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路に及ぼす薬剤の薬力学活性をモニタリングするのに使用することができる、１６種類のセットから抽出した少なくとも５種類または１０種類のバイオマーカーを含む、セットの一部を提供する。
別の態様では、薬剤がＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路に及ぼす効果を測定するための上述の方法は、好ましくは、リアルタイムＰＣＲ（例えばＳＹＢＲグリーン検出を用いて）によって１６種類のバイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定した後に決定され、かつ、データ解析には、ΔΔＣｔ法が用いられる。各試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ値の平均を、その試料に関するハウスキーピング遺伝子のＣｔ値として計算する。同じ試料のハウスキーピングＣｔ値を、個々のアッセイのＣｔ値から引くことで、ΔＣｔを計算する。さらに、各アッセイの対照試料のΔＣｔ値を、対応する処理試料のΔＣｔ値から引くことで、ΔΔＣｔ値を導き出す。その後、この１６遺伝子のΔΔＣｔ値を、２０個の試料（経路活性の観点からみると、８個は負に調節されており、１２個は正に調節されている）を含む訓練実験のプールに含まれている１６遺伝子のΔΔＣｔ値と比較する。試料のΔΔＣｔ値の解析には、好ましくはサポートベクターマシン法を使用し、その発現を用いて、試料のＷｎｔ／β−カテニン経路活性の調節状態を評価する。
発現レベルの差に対する感度の向上
本明細書で開示のバイオマーカーを使用する場合、また、実際には、第一の表現型をもつ患者または対象を第二の表現型を有する患者または対象から区別するために任意のセットのバイオマーカーを使用する場合、試料中の各バイオマーカーの絶対的な発現を対照と比較することができる。例えば対照は、患者または対象のプールでの各バイオマーカーそれぞれの発現レベルの平均である場合がある。しかしながら、比較の感度を向上させるためには、好ましくは、発現レベルの値をいくつかの方法で変換する。
例えば、発現レベルが決定される全てのマーカーの発現レベルの平均を使って、または対照遺伝子のセットの発現レベルの平均を使って、各バイオマーカーの発現レベルを正規化することができる。従って一態様では、バイオマーカーは、マイクロアレイ上のプローブによって表され、各バイオマーカーの発現レベルは、マイクロアレイに表されている、いかなる非バイオマーカー遺伝子をも含む、全ての遺伝子の発現レベルの平均または中央値によって正規化される。具体的な態様では、正規化は、マイクロアレイ上に搭載されている全ての遺伝子の発現レベルの中央値または平均で割ることによって行われる。別の態様では、バイオマーカーの発現レベルは、対照バイオマーカーのセットの発現レベルの平均または中央値を使って正規化される。具体的な態様では、対照のバイオマーカーは、ハウスキーピング遺伝子のセットを含む。別の具体的な態様では、正規化は、対照遺伝子の発現レベルの中央値または平均で割ることによって行われる。
個々のバイオマーカーの発現レベルを試料プール中の同じバイオマーカーの発現と比較する場合、バイオマーカーを利用したアッセイの感度もまた向上するだろう。好ましくは、試料プール中の各バイオマーカー遺伝子の発現レベルの平均または中央値に対して比較する。そのような比較は例えば、試料中の各バイオマーカーの発現レベルを各バイオマーカーのプールの発現レベルの平均または中央値で割ることによって行ってもよい。これは、プール全体における試料およびマーカー中のバイオマーカー間の、相対的な発現の差を目立たせる効果をもち、その結果、比較の感度が向上し、絶対的な発現レベルだけを使用する場合よりも、意味のある結果が生成される傾向にある。発現レベルのデータは、利用し易い方法のいずれによっても変換することができる。好ましくは、全ての発現レベルのデータを対数変換し、その後、平均または中央値を導き出す。
プールに対する比較の実施には、２種類の方法を用いることができる。第一に、試料中のマーカーの発現レベルを、プール中のそれらマーカーの発現レベルに対して比較することができる。この場合には、試料由来の核酸とプール由来の核酸を、単一の実験中にハイブリダイズさせる。そのような方法では、比較ごとに新しい核酸のプールを生成することが必要であるか、または比較の回数が限られており、その結果、利用可能な核酸の量による制限を受ける。あるいは、および好ましくは、プール中の発現レベルは、正規化および／または変換されていてもいなくても、コンピューターもしくはコンピューターで読み取り可能なメディアに保存され、試料に由来する個々の発現レベルのデータ（つまり、単一チャネルデータ）に対する比較に使用される。
従って、本発明は、少なくとも２種類の異なる表現型のうちの１種類を有する第一の細胞または生物を区別する、以下の方法を提供し、ここで異なる表現型は、第一の表現型と第二の表現型を含む。第一の細胞または生物由来の第一の試料中の、複数の遺伝子それぞれの発現レベルを、前記少なくとも２種類の表現型をそれぞれ示している異なる細胞または生物を含んでいる複数の細胞または生物由来のプール試料中に含まれている、前記各遺伝子の発現レベルとそれぞれ比較し、第一の比較値を得る。次に、第一の比較値を第二の比較値と比較する。ここで前記第二の比較値は、前記第一の表現型を特徴とする細胞または生物由来の試料に含まれる各前記遺伝子の発現レベルと、プール試料に含まれる各前記遺伝子の発現レベルをそれぞれ比較する工程を含む方法によって導き出されるものである。次いで、第一の比較値を第三の比較値と比較する。ここで前記第三の比較値は、第二の表現型を特徴とする細胞または生物由来の試料に含まれる各遺伝子の発現レベルと、プール試料に含まれる各遺伝子の発現レベルをそれぞれ比較する工程を含む方法によって導き出されるものである。必要に応じて、第一の比較値をさらに別の比較値それぞれと比較することもでき、この場合、さらに別の比較値はそれぞれ、前記第一の表現型や第二の表現型とは異なるが、少なくとも２種類の異なる表現型に含まれる表現型を特徴とする細胞または生物由来に含まれている各前記遺伝子の発現レベルと、前記プール試料に含まれている各前記遺伝子の発現レベルをそれぞれ比較する工程を含む方法によって導き出されるものである。最後に、前記第二、第三、および、もしあれば、１つ以上のさらに別の比較値のどれに前記第一の比較値が最も近いかを決定し、ここで第一の細胞または生物は、前記第一の比較値と最も近似した前記比較値を導き出すのに使用した細胞または生物の表現型を有していると判断される。
この方法の具体的な態様では、比較値は、前記遺伝子それぞれの、発現レベルの各割合である。別の具体的な態様では、プール試料に含まれている各遺伝子の発現レベルそれぞれを正規化し、その後、任意の比較工程に使用する。より具体的な態様では、発現レベルの正規化は、各遺伝子の発現レベルの中央値または平均で割ることによって、または前記細胞または生物由来のプール試料に含まれている１種類以上のハウスキーピング遺伝子の発現レベルの平均または中央値で割ることによって行われる。別の具体的な態様では、正規化した発現レベルを対数変換し、対数変換したものを試料に含まれる各遺伝子の発現レベルの対数から引く工程を含む比較工程に、正規化した発現レベルを使用する。別の具体的な態様では、２つ以上の異なる表現型は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の異なる調節状態である。さらに別の具体的な態様では、２種類以上の異なる表現型は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤を使った治療への異なる反応の予測である。一層さらに別の具体的な態様では、プール試料に含まれている各遺伝子のそれぞれの発現レベル、または第一の表現型、第二の表現型、もしくは前記第一および第二の表現型とは別の前記表現型を特徴とする細胞または生物由来の試料に含まれている各前記遺伝子の前記発現レベルはそれぞれ、コンピューターまたはコンピューターで読み取り可能なメディアに保存される。
別の具体的な態様では、２種類の表現型は、調節解除されているか、またはＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の状態である。別の具体的な態様では、２種類の表現型は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路剤への予測される応答者の状態であり、さらに別の具体的な態様では、２種類の表現型は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路に対する薬剤の薬力学的効果の有無である。
別の具体的な態様では、試料に含まれている各遺伝子の発現と、２種類以上の表現型のうちの１種類だけを表しているプールに含まれている同じ遺伝子の発現とを比較する。Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の状態と相関のある遺伝子については、例えば、試料に含まれる、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の調節状態関連遺伝子の発現レベルと、「調節が解除されている」試料のプール（調節されている状態と調節解除されている状態のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路を有する、患者由来の試料を含む試料のプールとは対照的な）に含まれている同じ遺伝子の発現レベルの平均とを比較することができる。従ってこの方法では、予後相関遺伝子の発現レベルが、平均的な「調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路」の発現プロファイル（すなわち、「Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節解除されている状態」の患者由来の試料のプールに含まれる、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の状態と相関のある遺伝子の発現レベル）に対して選択した相関係数を超える場合、試料のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路は調節解除されている状態だと分類される。発現レベルと「調節解除されているＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路」発現プロファイルとの相関がより小さい（すなわち、その相関係数が選択した係数を越えなかい）患者または対象は、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節されている状態であると分類される。
無論、数学的な試料プールに対する特定の比較を行うことなく、単一チャネルのデータを使用してもよい。例えば、試料に含まれる少なくとも５種類のマーカーの発現の、第一の表現型のテンプレートと第二の表現型のテンプレートに含まれている同じマーカーの発現に対する類似性を算出することで、第一の表現型かまたは第二の表現型を有するとして試料を分類することができる。この場合、第一の表現型と第二の表現型は関係しており、マーカーには第一の表現型または第二の表現型との相関があり、類似性は、（ａ）試料に由来する核酸を蛍光色素分子で標識し、蛍光標識した核酸のプールを得る工程、（ｂ）前記蛍光標識した核酸を、ハイブリダイゼーションが起こる条件下でマイクロアレイに接触させ、マイクロアレイ上の複数の離れている位置で、前記条件下で前記マイクロアレイに結合した前記蛍光標識した核酸から放出される蛍光シグナルを検出する工程、および（ｃ）患者の試料に含まれるマーカー遺伝子の発現の第一のテンプレートおよび第二のテンプレートに対する類似性を決定する工程から算出され、前記発現が第一のテンプレートにより近似している場合、この試料は第一の表現型を有すると分類され、前記発現が第二のテンプレートにより近似している場合には、この試料は第二の表現型を有すると分類される。
発現プロファイルを分類する方法
好ましい態様では、本発明の方法は、試料のＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の調節状態を予測するため、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤への反応を予測するため、対象を治療に割り当てるため、および／または薬剤の薬力学的効果を測定するために、分類器を使用する。分類器は、バイオマーカーのプロファイルを含む入力を受信し、および患者がどの患者小集団に属しているかを示すデータを含む出力を提供する、適切なパターン認識法のいずれに基づくものであってもよい。訓練対象の集団から得られた訓練データを使って分類器を準備してもよい。通常、訓練データには、訓練集団に含まれているそれぞれの対象についての、患者から採取した適切な試料に含まれる複数の遺伝子のそれぞれの遺伝子産物の測定値およびアウトカム情報、つまり、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の状態が調節解除されているかまたは調節されているかの情報などの、訓練マーカーのプロファイルが含まれている。
好ましい態様では、分類器は、以下に示す分類（パターン認識）法、例えば、プロファイルの類似性；人工神経回路網；サポートベクターマシン（ＳＶＭ）；ロジスティック回帰、線形または二次の判別分析、決定木、クラスタリング、主要成分分析、最近傍法、ＮＳＣ（ｎｅａｒｅｓｔ ｓｈｒｕｎｋｅｎ ｃｅｎｔｒｏｉｄ）法に基づくものであってよい。このような分類器は、訓練集団を用い、以下の関連する項で説明した方法を使って、準備することができる。
バイオマーカーのプロファイルは、対象由来の細胞試料に含まれている複数の遺伝子産物を、当該分野で知られている方法を使って、例えば以下に記載する方法で、測定することによって得ることができる。
本発明との関連では、様々な既知の統計的なパターン認識法を使用することができる。そのような方法のいずれかに基づく分類器は、訓練患者のバイオマーカープロファイルやＷｎｔ／b−カテニン経路のシグナル伝達状態に関するデータを利用して構築することができる。次に、そのような分類器を使用し、患者のバイオマーカープロファイルに基づいて、患者のＷｎｔ／b−カテニン経路のシグナル伝達状態を評価することができる。この方法を、訓練患者のバイオマーカープロファイルおよびＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の調節に関するデータを使用して、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路の異なる調節状態を区別するバイオマーカーの同定に使用することもできる。
プロファイルマッチング
対象由来の適切な試料で得られたバイオマーカープロファイルと、特定の表現型の状態を表すバイオマーカープロファイルとを比較することによって、対象を分類することができる。そのようなマーカープロファイルは、「テンプレートプロファイル」または「テンプレート」とも呼ばれる。それらのテンプレートプロファイルに対する類似性の度合によって、対象の表現型が評価される。対象のマーカープロファイルとテンプレートプロファイルの類似性の度合が、予め設定しておいた閾値を超える場合、対象はそのテンプレートによって表されている分類に割り当てられる。例えば、対象のアウトカムに関する予測を、対象のバイオマーカープロファイルと、所与の表現型またはアウトカムに対応する予め設定しておいたテンプレートプロファイル、例えば、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節解除されている状態の腫瘍に罹患している、複数の対象に含まれているバイオマーカーのレベルを表す複数のバイオマーカーの測定値を含む、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路テンプレートのプロファイルと比較することで評価することができる。
一態様において類似性は、対象のプロファイルとテンプレートとの間の相関係数によって表される。一態様では、相関閾値を超える相関係数は高い類似性を示し、閾値を下回る相関係数は低い類似性を示す。
人工神経回路網
いくつかの態様では、神経回路網が使用される。本発明の選択したセットの分子マーカーについて、神経回路網を構築することができる。神経回路網は、二段階回帰、すなわち分類モデルである。神経回路網は、重み層によって出力層に接続されている入力層（および偏り）を含む層構造になっている。回帰用には、出力層は通常、１つだけである。しかしながら、神経回路網は断続のない様式で、複数の量的な反応を扱うことができる。多層構造の神経回路網には、入力装置（入力層）、隠れ装置（隠れ層）、および出力装置（出力層）が含まれる。さらに、入力装置以外のそれぞれの装置に接続された、単一の偏り装置がある。神経回路網については、Ｄｕｄａ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＨａｓｔｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
サポートベクターマシン
本発明のいくつかの態様では，本発明に記載のマーカー遺伝子の発現プロファイルを使用して対象を分類するのに、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）が使われる。ＳＶＭの基本的な説明は、例えば、 Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ ａｎｄ Ｓｈａｗｅ−Ｔａｙｌｏｒ， ２０００， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｂａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， “Ａ ｔｒａｉｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｍａｒｇｉｎ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒｓ， ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ５ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＡＣＭ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｈｅｏｒｙ， ＡＣＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， Ｐａ．， ｐｐ． １４２−１５２； Ｖａｐｎｉｋ， １９９８， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｈｅｏｒｙ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｄｕｄａ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．； Ｈａｓｔｉｅ， ２００１， Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎ．Ｙ．； ａｎｄ Ｆｕｒｅｙ ｅｔ ａｌ， ２０００， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６， ９０６−９１４で見られる。生物学的な用途におけるＳＶＭの応用については、Ｊａａｋｋｏｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ７ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＡＡＡＩ Ｐｒｅｓｓ， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， Ｃａｌｉｆ． （１９９９）； Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９７（ｌ）：２６２−６７ （２０００）； Ｚｉｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １６（９）：７９９−８０７ （２０００）； Ｆｕｒｅｙ ｅｔ ａｌ．； Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １６（１０）：９０６−９１４ （２０００）に記載されている。
いくつかの態様では、分類器は、回帰モデル、好ましくはロジスティック回帰モデルに基づくものである。そのような回帰モデルには、本発明の選択したセットの分子バイオマーカーに含まれる、それぞれの分子マーカーに関する係数が含まれている。そのような態様では、回帰モデルについての係数は、例えば、最尤法を使用して算出される。特定の態様では、２種類の分類または表現型の群、例えば、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節解除されているまたは調節されている、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤を使った治療への反応があるまたは反応がない分類または表現型の群から得られた分子バイオマーカーのデータが使用され、また、従属的な変数は、分子マーカーの特徴に関するデータを得た患者の表現型の状態である。本発明のいくつかの態様では、多項（多分割）の反応を扱うロジスティック回帰モデルの一般論を提供する。そのような態様を用いれば、生物を１つまたは３つまたはそれ以上の分類に、例えば、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路剤を使った治療への反応が、良い、普通、および悪いと判断することができる。そのような回帰モデルは、分類の全対応を同時に参照する多項論理モデルを使用し、１つの分類における反応のオッズを、別の分類における反応のオッズの代わりに説明するものである。モデルによって、分類の特定の対応（Ｊ−ｌ）に関するロジットが指定されれば、残りは予測可能である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｇｒｅｓｔｉ， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９６， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第８章を参照のこと。
判別分析
線形判別分析（ＬＤＡ）は、特定の目的特性に基づいて、対象を２つの分類のうちの１つに分類しようとするものである。言い換えれば、ＬＤＡは、実験で測定される目的の属性が、目的の類別を予測できるか否かを試験するものである。ＬＤＡは通常、連続した独立変数と、二項の制限のない従属変数を必要とする。本発明では、訓練集団の一部から構成されている小集団にわたる、本発明の選択したセットの分子マーカーの発現値が、必須の連続した独立変数として機能する。訓練集団のそれぞれのメンバーの臨床群分類が、二項の制限のない従属変数として機能する。
ＬＤＡは、グループ分けの情報を使用して、群間の分散と群内の分散の非を最大にする、変数の一次結合を求めるものである。必然的に、ＬＤＡによって使用される線形加重は、訓練セット全体にわたる分子バイオマーカーが、どうやって２群（例えば、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節解除されている群とＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節されている状態の群）に分離するかおよび、この遺伝子の発現が、他の遺伝子の発現とどのように相関しているかに依存する。いくつかの態様では、本発明で記載の遺伝子と組み合わせて、Ｋ遺伝子によって、訓練試料に含まれるＮメンバーのデータマトリクスにＬＤＡを適用する。次いで、訓練集団の各メンバーの線形判別をプロットする。理想的には、第一の小集団を構成している訓練集団に含まれているこれらメンバー（例えばＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節解除されている状態のこれらの対象）は、線形判別値（例えば、負）の第一の範囲に集合し、第二の小集団を構成している訓練集団に含まれているこれらメンバー（例えばＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節されている状態のこれらの対象）は、判別値の第二の範囲（例えば、正）に集合する。ＬＤＡは、集合の判別値の距離がより大きい場合に、より有効であると考えられている。線形判別分析に関するより多くの情報については、Ｄｕｄａ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｌｉｅ； ａｎｄ Ｈａｓｔｉｅ， ２００１， Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎ．Ｙ．； Ｖｅｎａｂｌｅｓ ＆ Ｒｉｐｌｅｙ， １９９７， Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｗｉｔｈ ｓ−ｐｌｕｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎ．Ｙ．を参照のこと。二次判別分析（ＱＤＡ）でも、ＬＤＡと同じ入力指標が必要とされ、同じ結果が得られる。ＱＤＡは、一次方程式の代わりに二次方程式を使って結果を生成する。ＬＤＡおよびＱＤＡは交換可能であり、どちらかを使うかは好みおよび／または解析を支持するソフトウェアの入手可能性の問題である。ロジスティック回帰でも、ＬＤＡやＱＤＡの同じ入力指標が必要とされ、同じ結果が得られる。
決定木
本発明のいくつかの態様では、本発明の選択したセットの分子バイオマーカーの発現を利用して対象を分類するのに決定木を使用する。決定木のアルゴリズムは、教師あり学習のアルゴリズムの類に属するものである。決定木の目的は、実際の観察データから、分類器（木）を作ることである。この木を使用して、決定木を作るのに使ったものではない、未知の例を分類することができる。
決定木は、訓練データから導き出される。ある例は、別の属性に関する値とその例がどのクラスに属しているかに関する値を含んでいる。一態様において訓練データは、本発明で記載した遺伝子の組み合わせの、訓練集団全体にわたる発現データである。
クラスタリング
いくつかの態様では、本発明の選択したセットの分子マーカーの発現値を使用して、訓練セットをクラスタリングする。例えば、本発明の遺伝子のうちの１つで説明される１０種類の遺伝子バイオマーカーが使用される場合を考えてみる。訓練集団の各メンバーｍは、１０種類のバイオマーカーそれぞれに関する発現値を有することになる。訓練集団中のあるメンバーｍのそのような値が、ベクトルを定義する：訓練集団に含まれていて、訓練群全体にわたって同じような発現パターンを示すメンバーは、あるクラスターに集まる傾向にある。ベクトルによって訓練集団中に見られた特徴群があるクラスターに集められる場合、本発明の遺伝子の特定の組み合わせが、本発明のこの側面では優れた分類器であると見なされる。例えば、訓練集団が予後の良好な患者または予後不良の患者を含む場合、クラスタリング分類器はこの集団を、Ｗｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節解除されている状態であるかまたはＷｎｔ／b−カテニンシグナル伝達経路が調節されている状態であるかのどちらかを表している２つの群に集める。
クラスタリングについては、Ｄｕｄａ ａｎｄ Ｈａｒｔ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｅｎｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， １９７３， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの２１１−２５６ ページに記載されている。Ｄｕｄａの６．７項に記載されているように、クラスタリングの問題は、データセット中の自然分類を発見することの１つであると言われている。自然分類を同定するには、２つの課題を扱う。まず、２個の試料間の類似性（または非類似性）を測定するための方法を決定する。この計量（類似性の尺度）を使って、片方のクラスターに入った試料同士が、他のクラスターに入った試料に対してよりも、互いにより近いということを確認する。次に、類似性の尺度を使用して、データをクラスターに分類する機構を決定する。
類似性の尺度はＤｕｄａの６．７項で議論されている。そこでは、クラスタリング解析を開始するための一方法は、距離関数を定義し、データセット中の試料の全対応間の距離の行列を算出することであると明示されている。距離が類似性の尺度として優れている場合、同じクラスターに入っている試料間の距離は、異なるクラスターに入っている試料同士の距離よりも有意に小さくなる。しかしながら、Ｄｕｄａの２１５ページに記載されているように、クラスタリングでは、距離計量を使用する必要はない。例えば、非計量的な類似度関数ｓ（ｘ，ｘ’）を使用して、２つのベクター、ｘとｘ１を比較することができる。通常、ｓ（ｘ，ｘ’）は対称式であり、ｘとｘ’が少しでも「類似」している場合には、その値は大きい。非計量的な類似度関数ｓ（ｘ，ｘ’）の一例が、Ｄｕｄａの２１６ページに記載されている。
データセットに含まれている点間の「類似性」または「非類似性」を測定するための方法が選択されたら、クラスタリングには、データの任意の分割のクラスタリングの質を測定する、基準関数が必要となる。データをクラスターに集めるには、基準関数を極値にするデータセットの分割が使用される。Ｄｕｄａの２１７ページを参照のこと。基準関数ついては、Ｄｕｄａの６．８項で議論されている。最近になって、Ｄｕｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，第二版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋが出版され、クラスタリングについては、５３７〜５６３ページでより詳細に説明されている。クラスタリング技法についての情報はさらに、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｒｏｕｓｓｅｅｕｗ， １９９０， Ｆｉｎｄｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｄａｔａ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．； Ｅｖｅｒｉｔｔ， １９９３， Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ（第三版）， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．； ａｎｄ Ｂａｃｋｅｒ， １９９５， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， Ｕｐｐｅｒ Ｓａｄｄｌｅ Ｒｉｖｅｒ， Ｎ．Ｊ．でも見ることができる。本発明で使用可能なクラスタリング技法の具体例としては、階層的クラスタリング（最近傍アルゴリズムを使用する集塊性クラスタリング、最遠隣アルゴリズム、平均連結アルゴリズム、重心アルゴリズム又は２乗和アルゴリズム）、ｋ平均クラスタリング、ファジーｋ平均クラスタリングアルゴリズム及びＪａｒｖｉｓ−Ｐａｔｒｉｃｋクラスタリングが挙げられるがこれらには限定されない。
主成分分析
主成分分析（ＰＣＡ）は、遺伝子発現のデータを解析するために提供された。主成分分析は、データを、その特徴を要約する新しい変数のセット（主成分）に変換することで、データセットの次元の数を減少させるための、従来からある技法である。例えば、 Ｊｏｌｌｉｆｆｅ， １９８６， Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎ．Ｙ．を参照のこと。主成分（ＰＣ）には相関がなく、かつ、ｋ番目のＰＣがＰＣ間でｋ番目に大きい分散を有するように並べられる。ｋ番目のＰＣとは、データポイントの射影の変動を最大にし、最初のｋ−１番目のＰＣに直交する方向として解釈することができる。最初のいくつかのＰＣは、データセットの変動の多くを捕捉する。対照的に、最後いくつかのＰＣは、データに残留する「ノイズ」だけを捕捉すると想定されることが多い。
また、ＰＣＡは、本発明の分類器を作製するために使用することもできる。このようなアプローチでは、本発明の選択バイオマーカーについてのベクトルを、クラスタリングについて上で記述したのと同じ方法で構築することができる。実際に、ベクトルのセットは、それぞれのベクトルが訓練集団の特定のメンバーからの選択遺伝子についての発現値を表す場合に、行列とみなすことができる。いくつかの態様では、この行列は、単量体の定性的な二進法記述のＦｒｅｅ−Ｗｉｌｓｏｎ法で表され（Ｋｕｂｉｎｙｉ， １９９０， ３Ｄ ＱＳＡＲ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ ｔｈｅｏｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐｐ ５８９−６３８）、ＰＣＡを使用して最大圧縮空間に分散させ、その結果第一の主成分（ＰＣ）が、可能性がある分散情報の最大量を収集し、第二の主成分（ＰＣ）が、全ての分散情報の２番目に大きな量を収集し、行列の全ての分散情報を占めてしまうまで収集する。
次いで、各々のベクトル（それぞれのベクトルが、訓練集団のメンバーを表す場合）をプロットする。多くの異なる型のプロットが可能である。いくつかの態様では、一次元プロットが作製される。この一次元プロットでは、訓練集団のメンバーのそれぞれからの第一の主成分についての値をプロットする。この形態のプロットでは、第一群のメンバーは第一の主成分値の第一の範囲にクラスターとして集まり、第二群のメンバーは、第一の主成分値域の第二の範囲にクラスターとして集まることが期待される。
一例では、訓練集団は２つの分類群を含む。第一の主成分は、分類結果が分かっている訓練集団のデータセット全体にわたる、本発明の選択遺伝子についての分子バイオマーカーの発現値を使って算出される。次いで、訓練セットのそれぞれのメンバーを、第一の主成分に関する値の関数としてプロットする。この例では、第一の主成分が陽性の訓練集団に含まれるメンバーが一方に分類され、第一の主成分が陰性の訓練集団に含まれるメンバーが他方に分類される。いくつかの態様では、訓練集団のメンバーを、複数の主成分に対してプロットする。例えば、いくつかの態様では、訓練集団のメンバーは、第一次元が第一の主成分であり、第二次元が第二の主成分である二次元プロットでプロットされる。このような二次元プロットでは、訓練集団を構成する小集団それぞれのメンバーは、別々の群にクラスタリングするであろうことが予想される。例えば、二次元プロット中の第一クラスターのメンバーは、第一の分類群に含まれる対象を表し、二次元プロット中の第二のクラスターのメンバーは、第二の分類群に入る対象などを示す。
いくつかの態様では、訓練集団のメンバーを複数の主成分に対してプロットし、訓練集団のメンバーが、それぞれが訓練集団中で見られる小集団を個別に表す群にクラスタリングされるかどうかを決定する。いくつかの態様では、Ｒ ｍｖａパッケージ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， １９７３， Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７３； Ｇｏｒｄｏｎ， Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ， ＣＲＣ， １９９９）を使用して、主成分分析を実施する。主成分分析については、Ｄｕｄａ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．でさらに説明されている。
最近傍分類器解析
最近傍分類器はメモリーベースの手法であり、それを当てはめるモデルを必要としない。クエリ点をｘ０と仮定すると、ｘ０への距離が最も短いｋ訓練位置ｘ（ｒ），ｒ，．．．ｋを同定し、次いで位置ｘ０を、ｋの最近傍を使用して分類する。結合は、ランダムに破壊することができる。いくつかの態様では、特徴空間におけるユークリッド距離を使用して、距離を以下の式から決定する。
最近傍アルゴリズムを使用する場合は通常、線形識別式を算出するために使用する発現データを、平均が０、分散が１になるように標準化する。本発明では、訓練集団のメンバーを、訓練セットと試験セットに無作為に分ける。例えば、一態様では、訓練集団のメンバーの２／３を訓練セットに配置し、訓練集団のメンバーの１／３を試験セットに配置する。本発明の分子バイオマーカーの選択したセットのプロファイルは、試験セットのメンバーがプロットされている特徴空間を表す。次に、試訓練セットが試験セットのメンバーを正しく特徴づける能力を算出する。いくつかの態様では、本発明のバイオマーカーの所与の組み合わせに対し、最近傍計算を複数回行う。計算のそれぞれの繰り返しにおいて、訓練集団のメンバーを訓練セット及び試験セットに無作為に割り当てる。次いで、遺伝子の組み合わせの質を、このような最近傍計算のそれぞれの繰り返しの平均として得る。最近傍法は、等しくない事前分類（ｕｎｅｑｕａｌ ｃｌａｓｓ ｐｒｉｏｒｓ）、差動的誤分類コスト及び特徴選択の問題を扱うように改良することができる。これらの改良の多くは、近傍に対するある種の加重投票を伴う。最近傍分析の詳細については、Ｄｕｄａ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ； ａｎｄ Ｈａｓｔｉｅ， ２００１， Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
進化論的手法
生物の進化過程がきっかけとなり、分類器設計の進化論的手法では、最適な分類器の確率論的な探索が用いられている。概観を示すと、そのような手法ではまず、本発明の遺伝子産物の測定値から、複数の分類器つまり集団を生成する。分類器はそれぞれ少しずつ違う。次に、訓練集団全体にわたる発現データによって、分類器に得点を付ける。生物の進化との類似性を踏まえて、得られた（スカラー量の）点数は、適応度と呼ばれることがある。点数によって分類器を順位付けし、最も良い分類器（分類器全体のうちの一部）を保持する。これは、ここでも生物学的な用語に則って、自然選択とよばれる。分類器は次世代、つまり子または子孫で、確率論的に変化する。いくつかの子孫分類器は、前世代の親よりも高い点数をもち、いくつかはより低い点数をもつ。そして、過程全体が、その後の世代について繰り返される：分類器に点数が付けられ、最も良いものが保持され、無作為に変化してさらに別の世代を生じるなど。一つには順位付けのせいで、各世代は、平均して前の世代の点数よりも僅かに高い点数を有する。ある世代の中の最もよい単一の分類器が、所望される基準値を超える点数を有する場合、その過程は修了する。進化論的手法についてのより詳細な情報は、例えば、 Ｄｕｄａ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．で見ることができる。
バギング法、ブースティング法及び無作為部分空間法
バギング法、ブースティング法および無作為部分空間法は、弱い分類器を改良するために使用することができる複合技術である。これらの技術は、決定木に関して設計され、通常適用される。また、Ｓｋｕｒｉｃｈｉｎａ ａｎｄ Ｄｕｉｎは、このような技術が線形判別分析にも有用である可能性を示唆する証拠を提供している。
バギング法では、無作為で独立したブートストラップの繰り返しを生成している訓練セットを作成し、これらそれぞれについて分類器を構築し、そして最終決定では、これらを単純多数決によって集合させる。例えば、 Ｂｒｅｉｍａｎ， １９９６， Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ２４， １２３−１４０；およびＥｆｒｏｎ ＆ Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３を参照のこと。
ブースティング法では、それまでの分類結果に基づく重みを付けたバージョンの訓練セットについて、分類器を構築する。最初、全ての目的は等しい重みを有し、このデータセットについて、第一の分類器を構築する。次に、分類器の性能に応じて重みを変える。誤って分類された目的（データセット中の分子バイオマーカー）はより大きい重みを付けられ、再度重み付けを行った訓練セットについて、次の分類器が押し上げられる。このようにして、訓練セット及び分類器の数列を得て、これを最終決定では単純多数決又は加重多数投票によって組み合わせる。例えば、 Ｆｒｅｕｎｄ ＆ Ｓｃｈａｐｉｒｅ，「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｂｏｏｓｔｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ １３ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， １９９６， １４８−１５６を参照のこと。
いくつかの態様では、修正したＦｒｅｕｎｄ ａｎｄ Ｓｃｈａｐｉｒｅの方法（１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５， ｐｐ． １１９−１３９）を使用する。例えば、いくつかの態様では、 Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｐａｃ． Ｓｙｍｐ． Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ． ６， ５２−６３のノンパラメトリックスコアリング（ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｓｃｏｒｉｎｇ）法などの技術を利用して、特徴の事前選択を実施する。特徴の事前選択は、次元の数の低下という形態であり、この場合、分類器同士を最もよく区別する遺伝子が、分類器で使用するのに選択される。そのため、Ｆｒｅｕｎｄ ａｎｄ Ｓｃｈａｐｉｒｅのブースティング法よりも、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ａｎｎ Ｓｔａｔ ２８， ３３７−４０７によって導入されたＬｏｇｉｔＢｏｏｓｔ法が使用される。いくつかの態様では、 Ｂｅｎ−Ｄｏｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７， ５５９−５８３のブースティング法や他の分類法が本発明では使用される。いくつかの態様では、 Ｆｒｅｕｎｄ ａｎｄ Ｓｃｈａｐｉｒｅ， １９９７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５， １１９−１３９のブースティング法や他の分類法が使用される。
無作為部分空間法では、データ特徴空間の無作為な部分に分類器を構築する。これらの分類器は一般的に、最終決定では単純多数決によって組み合わせられる。例えば、Ｈｏの「Ｔｈｅ Ｒａｎｄｏｍ ｓｕｂｓｐａｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｄｅｃｉｓｉｏｎ ｆｏｒｅｓｔｓ」ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｐａｔｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ， １９９８； ２０（８）： ８３２−８４４を参照のこと。
他のアルゴリズム
上述したパターン分類および統計学的な手法は単に、分類に関するモデルの構築に使用可能なモデルの型の例にすぎない。さらに、上述した手法を組み合わせて使用することも可能である。いくつかの組み合わせ、例えば決定木とブースティング法を組み合わせて使用することについて説明した。しかしながら、他の多くの組み合わせも可能である。加えて、当該分野における他の技術、例えば射影追跡や加重投票を使用して分類器を構築することもできる。
実験項で議論するように、対象バイオマーカー遺伝子の発現は、好ましくはＳＹＢＲグリーンを使ったリアルタイムＰＣＲの後で決定し、データ解析にはΔΔＣｔ法を使用する。各試料中のハウスキーピング遺伝子のＣｔ値の平均を、その試料に関するハウスキーピング遺伝子のＣｔ値として計算する。同じ試料の個々のアッセイのＣｔ値からハウスキーピングＣｔ値を引くことで、ΔＣｔを計算する。さらに、各アッセイの対照試料のΔＣｔ値を、対応する処理試料のΔＣｔ値から引くことで、ΔΔＣｔ値を導き出す。試料のΔΔＣｔ値の解析には、好ましくはサポートベクターマシン法を使用し、その発現を用いて、試料のＷｎｔ／β−カテニン経路活性の調節状態を評価する。
本発明のＷＮＴ／β−カテニンシグナル伝達（１６）遺伝子シグネチャーの同定に用いた実験方法
遺伝子発現のプロファイリングを使ったＷｎｔ／β−カテニン応答遺伝子の同定
図１に、対象の遺伝子シグネチャーの同定に用いたプロトコールを模式的に図示する。ここで示すように、ヒト胎児腎臓２９３Ｈ細胞を、１ウェル当たりの細胞密度が１０５個になるように、２ｍｌの成長培地と共に６−ウェルプレートにプレーティングした。プレーティングした細胞を、細胞培養用インキュベーター中３７℃で、５％のＣＯ２を供給しながらインキュベートした。プレーティングして２４時間後、細胞をｓｉＲＮＡで、具体的にはβ−カテニンを標的とするｓｉＲＮＡか、または標的をもたないｓｉＲＮＡ（対照）で形質転換した。各ウェル用に、６μｌのＳｕｒｅＦＥＣＴ形質転換試薬（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ａ ＱＩＡＧＥＮ ｃｏｍｐａｎｙ）を２００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈した。希釈した形質転換試薬を２０ｎＭのβ−カテニンを標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖Ｄ（ＧＴＴＣＣＧＡＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＡ（配列番号６５））（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ａ ＱＩＡＧＥＮ Ｃｏｍｐａｎｙ）または標的をもたない対照ｓｉＲＮＡ（ＡＣＡＣＴＡＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣ（配列番号６６））（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ａ ＱＩＡＧＥＮ ｏｗｎｅｄ ｃｏｍｐａｎｙ）のいずれかと混合した。室温で２０分間インキュベートした後、形質転換混合物を、２ｍｌの成長培地と共に６−ウェルプレートに入っている２９３Ｈ細胞に加えた。形質転換の２４時間後、形質転換混合物の入った培地を、各ウェル当たり１ｍｌの血清を含まない培地と交換し、細胞を血清を含まない培地中で１２時間インキュベートした。血清飢餓の１２時間後、これらの細胞を、４００ｎｇ／ｍｌのマウス組換えＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または対照であるＰＢＳのいずれかを含む、１ｍｌの血清を含まない培地で置き換えた。
１２時間のＷｎｔ３ａ処理の終了時に、実験プロトコールの項に記載する細胞溶解とウェスタンブロットのプロトコールに従って、活性型β−カテニンのタンパク質レベルをウェスタンブロットで確認するために、細胞を５０μｌの改変ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１％のＩＧＥＰＡＬ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１％のＳＤＳ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤）中で溶解した。マウス抗活性型β−カテニン（１：１０００）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使って活性型β−カテニンのレベルを検出した。全β−カテニンおよび対照のＧＡＰＤＨレベルの検出には、マウス抗β−カテニン（１：２０００）（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂ）およびウサギ抗ＧＡＰＤＨ（１：２０００）（Ｓｉｇｍａ）を使用した。Ｗｎｔ３ａ処理の効果は、Ｗｎｔ３ａを処理した試料での活性型β−カテニンのタンパク質レベルが、未処理試料よりも上昇することによって示された（図２Ａに含まれる結果を参照のこと）。
ＲＮＡ抽出用には、細胞を、各ウェル当たり２００μｌのＧ６緩衝液（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ａ ＱＩＡＧＥＮ ｃｏｍｐａｎｙ）中で溶解した。溶解物をさらに、ＲＴ２ｑ ＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、実験プロトコールの項で説明したプロトコールに従って処理し、ＲＮＡを単離した。単離工程の最後で、スピンカラムに３０μｌのＲＮａｓｅを含まない水を加え、ＲＮＡをカラムから溶出した。ＲＮＡの濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で測定し、このＲＮＡをその後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲまたはマイクロアレイでの遺伝子発現プロファイリング解析用に処理した。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用し、Ｗｎｔ／β−カテニン標的遺伝子およびβ−カテニンそれ自体、それぞれのｍＲＮＡの発現レベルを測定することで、Ｗｎｔ３ａ処理とβ−カテニンｓｉＲＮＡノックダウンの効果を確認した。１μｇのトータルＲＮＡを、ＲＴ２ ＥＺ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ａ ＱＩＡＧＥＮ ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して、実験プロトコールの項で説明したプロトコールに従って、逆転写した。２０μｌのｃＤＮＡ反応液を、リアルタイムＰＣＲ解析ように、１００μｌの水で希釈した。各リアルタイムＰＣＲ反応混合液に、１μｌのｃＤＮＡと、１μｌのプライマー混合物（１０μΜ、フォワードプライマーとリバースプライマーを混合したもの）、１２．５μのリアルタイムＰＣＲマスターミックス（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ａ ＱＩＡＧＥＮ ｃｏｍｐａｎｙ）および１０．５μｌの水を混合し、全量を２５μｌとした。ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＦＲＡ−１、ＡＸＩＮ２およびＳＯＸ９について使用したプライマー配列は以下の表の通りである。
反応混合液は、１ウェル当たり１０μｌずつ、３８４−ウェルのリアルタイムＰＣＲ用プレートの２つのウェルに加えた。ＰＣＲプレートを、光学用接着フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で密閉し、および２分間、２０００ｒｐｍで遠心した。リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ ７９００リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使い、９５℃で１０分間、次いで９５℃１５秒、６０℃１分を４０サイクルのＰＣＲプログラムによって行い、その後融解曲線分析を行った。Ｗｎｔ３ａ処理の効果を、Ｗｎｔ３ａ処理試料における、Ｗｎｔ／β−カテニン標的遺伝子、例えばβ−カテニン（ＣＴＮＮＢ１）、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１およびＡＸＩＮ２の、未処理試料と比較した場合のアップレギュレーションによって確認した（図２Ｂを参照のこと）。β−カテニンのｓｉＲＮＡによるノックダウンは、β−カテニンのｍＲＮＡの発現レベルの低下によって確認した（図２Ｂを参照のこと）。
Ｗｎｔ３ａ処理とβ−カテニンｓｉＲＮＡノックダウンを確認した後、ＲＮＡ試料を全ゲノムマイクロアレイ遺伝子プロファイリング解析用に処理した。１２個の試料を三重複で、４つの処理群にわけた。処理群はそれぞれ、ｓｉなし（標的指向化されていないｓｉＲＮＡを導入）−ｗｎｔなし（ｗｎｔによる処理を行わない）、ｓｉなし−ｗｎｔ（ｗｎｔによる処理を行う）、ｓｉＣＴＮＮＢ１（ＣＴＮＮＢ１を標的とするｓｉＲＮＡを導入）−ｗｎｔなし、およびｓｉＣＴＮＮＢ１−ｗｎｔとした。３００ｎｇのトータルＲＮＡを増幅し、Ｔａｒｇｅｔ Ａｍｐ Ｎａｎｏ−ｇＢｉｏｔｉｎ−ａＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、製造業者によるプロトコールに従って標識した。
増幅試薬、標識試薬および反応指標を以下に示す。
ファーストストランドｃＤＮＡ合成
６５℃で５分間インキュベートし、氷上で１分間冷やし、短時間遠心する。
各反応液に２μｌずつ加え、おだやかに混合し、５０oCで３０分間インキュベートする。
セカンドストランドｃＤＮＡ合成
各反応液に５μｌずつ加え、おだやかに混合し、６５oCで１０分間インキュベートし、短時間遠心する。８０oCで３分間インキュベートし、短時間遠心した後、氷上で冷却する。
ビオチン−ａＲＮＡのインビトロ転写
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを室温まで温め、他の試薬を室温で融解する。
各反応液に２０μｌずつ加え、おだやかに混合し、４２oCで４時間インキュベートする（４時間を越えないようにする）。各反応液に２μｌのＲｎａｓｅを含まないＤｎａｓｅＩを加え、おだやかに混合し、３７oCで１５分間インキュベートする。
ビオチン−ａＲＮＡの精製（ＳＡＢｉｏ ｃＲＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ）
スピンカラムにａＲＮＡを結合させる
ａ．反応液を全量（３２μｌ）、１．５ｍｌチューブに移す。
ｂ．１１２μｌの融解&結合緩衝液（Ｇ６）を各反応液に加え、ピペット操作で２〜３回混合する。
ｃ．１１２μの室温の１００％ＥＴＯＨを加え、ピペット操作で５〜６回混合する。
ｄ．すぐにスピンカラムに負荷する。
ｅ．８０００ｇで３０秒遠心。
ｆ．フロースルーを捨て、回収のためにカラムを戻す。
スピンカラムの洗浄
ａ．４００〜５００μの洗浄緩衝液（Ｇ１７＋ＥＴＯＨ）の各スピンカラムに加える。
ｂ．８０００ｇで３０秒間遠心する。
ｃ．フロースルーを捨て、カラムをコレクションチューブに戻す。
ｄ．２００μｌの洗浄緩衝液（Ｇ１７＋ＥＴＯＨ）を各スピンカラムに加える。
ｅ．１１０００ｇで１分間遠心する。
ｆ．フロースルーを捨て、カラムをコレクションチューブに戻す。
ｇ．１１０００ｇで２分間遠心する（前回の遠心時の位置から１８０度回転させる）。
スピンカラムからのａＲＮＡの溶出
ａ．スピンカラムを新しい溶出チューブに移す。
ｂ．４０μｌ（４０μｇ以下の場合、４０μｇを越える場合は８０μｌ）のＨ２Ｏをカラムに加える。
ｃ．室温に２分間置く。
ｄ．８０００ｇで１分間遠心する。
ｅ．ａＲＮＡを−８０oCで保存する。
標識したアンチセンスＲＮＡの濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で測定した。合計で７５０ｎｇの標識したアンチセンスＲＮＡを、実験プロトコールの項で説明したように製造業者によるプロトコールに従って、ＩｌｌｕｍｉｎａヒトＨＴ−１２ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の１２枚のサンプルチップにハイブリダイズさせた（Ｉｌｌｕｍｉｎａ全ゲノム遺伝子発現ダイレクトハイブリダイゼーションアッセイ）。
ハイブリダイズさせたＢｅａｄＣｈｉｐを洗浄し、ｉＳｃａｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使い、製造業者の標準的なプロトコールに従ってスキャンした。イメージファイルをＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で処理して、バックグランドの補正と正規化を行った。試料プローブの発現ファイルを、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）でさらに解析するために、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇの形式でエクスポートした。発現データをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇで、その指針となる手順に従って解析し、指針となる手順に従った解析中の群間の倍率変化および統計分析を算出した。
これらのプロトコールを実施した後、同定したＷｎｔ／β−カテニン応答遺伝子から、β−カテニンｓｉＲＮＡの非存在下で、Ｗｎｔ３ａで処理した試料とｗｎｔ３ａで処理した試料とを比較した場合に、その発現レベルがＷｎｔ３ａによる刺激によって有意に（調節したＰ値＜＝０．０５）変化した遺伝子を選択した。また、これらのＷｎｔ３ａで刺激された遺伝子に及ぼすβ−カテニンｓｉＲＮＡの効果に基づき、つまり、Ｗｎｔ３ａで刺激された発現が、ｓｉＲＮＡを導入後、少なくとも１／１．３に低下した遺伝子をさらに選択した。Ｗｎｔ３ａ処理とｓｉＲＮＡ処理との間でその発現の変化の方向性が一貫していない遺伝子を除去した後、６４種類の遺伝子をＷｎｔ／β−カテニン応答遺伝子として選択した。
このデータは、図６に示すエクセルのワークシート中に含まれている。
Ｗｎｔ／β−カテニン遺伝子発現シグネチャーの同定
これら６４種類のＷｎｔ／β−カテニン応答遺伝子をリアルタイムＰＣＲで確認するために、ＳＹＢＲグリーンを利用したリアルタイムＰＣＲアッセイを個々の遺伝子それぞれについて設計した。図５Ａ〜Ｂに、全プライマーの配列情報を含めた。
これら６４種類の遺伝子の発現を試験するために、２０個の試料を使用した。β−カテニンｓｉＲＮＡで処理したヒト結腸癌ＨＣＴ１１６、および構成的に活性型のβ−カテニンを保持しているＳＷ４８０細胞、ならびにＷｎｔ３ａ処理存在下でβ−カテニンｓｉＲＮＡを導入した２９３Ｈ細胞（マイクロアレイ実験で使用した試料と同じ試料）を含む８個の試料では、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性は負に調節されていた。一方、Ｗｎｔ３ａで刺激した１０個の試料と、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性を活性化させることが知られている化合物のＬｉＣｌ（Ｓｉｇｍａ）で処理した２個の試料を含む１２個の試料では、それらのＷｎｔ／β−カテニン経路の活性は正に調節されていた。
β−カテニンｓｉＲＮＡを、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、２９３Ｈ、Ｕ３７３ＭＧ、ＭＣＦ７、ＨＴ２９、ＬｎｃａｐおよびＨｅｐＧ２細胞にリバーストランスフェクションした。６ウェルプレートのそれぞれのウェルにつき、６μｌのＳｕｒｅＦＥＣＴ形質転換試薬（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ａ ＱＩＡＧＥＮ Ｃｏｍｐａｎｙ）を２００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈した。希釈した形質転換試薬を４０ｎＭのβ−カテニン標的ｓｉＲＮＡ二本鎖Ａ（ＧＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣＴＡＴＧＧＡ（配列番号７９））または標的指向化されていない対照のｓｉＲＮＡ（ＡＣＡＣＴＡＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣ（配列番号８０））（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ａ ＱＩＡＧＥＮ Ｃｏｍｐａｎｙ）のいずれかと混合した。β−カテニンｓｉＲＮＡまたは非標的ｓｉＲＮＡの形質転換マスターミックスをそれぞれ４ウェル分準備した。室温で２０分間インキュベートした後、２００μｌの形質転換混合液を、８枚の６ウェルプレートに加えた。６ウェルプレートはそれぞれ、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、２９３Ｈ、Ｕ３７３ＭＧ、ＭＣＦ７、ＨＴ２９、ＬｎｃａｐおよびＨｅｐＧ２などの細胞株用である。それぞれのプレートの内、２つのウェルにはβ−カテニンｓｉＲＮＡ混合液を、もう２つのウェルには非標的ｓｉＲＮＡ混合液を加えた。これら２種類２つずつのウェルはそれぞれ、タンパク質抽出およびＲＮＡ単離用に準備した。２０分間のインキュベート時間の間に、別の細胞株をトリプシンで処理し、プレートから洗浄し、その後８ｍｌの培地（１０％のＦＢＳを添加したＭｅＣｏｙの５Ａ培地）中に再懸濁して、細胞数を血球計算板を使って計測した。
細胞を培地で希釈し、１ｍｌ当たり６×１０４個の濃度とした。各ウェルにつき、２ｍｌの細胞（１．２×１０５個）を、６−ウェルプレートの２００μｌの形質転換混合液の上にプレーティングし、プレートをよく混合した。細胞培養プレートをインキュベーターに戻し、７２時間３７℃で５％ＣＯ２を供給しながらインキュベートした。７２時間インキュベートした後、細胞を、タンパク質溶解抽出用に５０μｌの改変ＲＴＰＡ緩衝液で溶解するか、あるいはＲＮＡの単離用に２００μｌの溶解Ｇ６緩衝液で溶解した。タンパク質の抽出とウェスタンブロットは、実験プロトコールの項のウェスタンブロットのプロトコールに従って、マウス抗活性型β−カテニン（１：１０００）とマウス抗β−カテニン（１：２０００）抗体を使って行った。活性型β−カテニンおよび全β−カテニン両方のβ−カテニンタンパク質レベルの減少によって、β−カテニンｓｉＲＮＡの効果を確認した（図３Ａを参照のこと）。ＲＮＡは、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＲＴ２ ｑＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使い、実験プロトコールの項で説明したように製造業者によるプロトコールに従って単離した。
Ｗｎｔ３ａ処理によって正に調節される１０個の試料を得るために、１０種類の異なる細胞株を、２×１０５細胞／ウェル／２ｍｌの密度で６−ウェルプレートにプレーティングした。プレーティングの２４時間後、通常の培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、各ウェル当たり１ｍｌの血清を含まない培地で置き換えることで、細胞を血清を含まない培地に入れ替えた。血清を含まない培地に入れて１２時間後、細胞を４００ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａを入れたまたは入れていない、血清を含まない培地で置き換え、さらに１２時間インキュベートした。この時、同じように調製したウェルを２つ用意した。１２時間のインキュベーションの終了時に、細胞をタンパク質溶解抽出用に５０μｌの改変ＲＴＰＡ緩衝液で、またはＲＮＡの単離用に２００μｌのＧ６溶解緩衝液で溶解した。タンパク質の抽出とウェスタンブロットは、マウス抗活性型β−カテニン（１：１０００）を使ったウェスタンブロットのプロトコールに従って行った。活性型β−カテニンタンパク質レベルの上昇によって、Ｗｎｔ３ａの効果を確認した（図３Ｂを参照のこと）。ＲＮＡは、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＲＴ２ ｑＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使い、実験プロトコールの項で説明したように製造業者によるプロトコールに従って単離した。
ＬｉＣｌ処理を用いた正の調節には、２９３ＨおよびＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞を２×１０５細胞／ウェル／２ｍｌの密度で６−ウェルプレートにプレーティングし、プレーティングの２４時間後に血清を含まない培地に入れ替えた。血清を含まない培地中で１２時間インキュベートした後、２０μΜのＬｉＣｌを入れたまたは入れていない、血清を含まない培地中で細胞を処理した。処理の終了時点で、細胞を２００μｌのＧ６溶解緩衝液で溶解し、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＲＴ２ ｑＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、実験プロトコールの項で説明した、製造業者によるプロトコールに従って、ＲＮＡを単離した。タンパク質の抽出とウェスタンブロットは、マウス抗活性型β−カテニン抗体（１：１０００）を使ったウェスタンブロットのプロトコールに従って行った。ＬｉＣｌの効果を、活性型β−カテニンタンパク質レベルの上昇によって確認した（図３Ｂを参照のこと）。ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＲＴ２ ｑＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、実験プロトコールの項で説明した製造業者によるプロトコールに従って、ＲＮＡを単離した。
上述した３つの陰性試料および８つの陽性試料について、６４Ｗｎｔ／β−カテニン応答遺伝子をＳＹＢＲグリーンを利用したリアルタイムＰＣＲで確認するために、１μｇのトータルＲＮＡを、ＲＴ２ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ａ ＱＩＡＧＥＮ ｃｏｍｐａｎｙ）を使い、実験プロトコール項の製造業者によるプロトコールに従って、逆転写した。２０μｌの逆転写反応液を２００μｌの水で希釈した。各リアルタイムＰＣＲ反応液に、１μｌの希釈したｃＤＮＡと、５μｌのＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス、および各反応液が指定された最終量である１０μｌになるように、４μｌの水とを混合した。リアルタイムＰＣＲ９０反応分のマスターミックスを各試料ごとに調製し、３８４−ウェルプレートの各ウェルに１０μｌずつ加えた。各試料につき、７２種類の異なるＰＣＲアッセイ（６４種類のＷｎｔ／β−カテニン応答遺伝子と８種類のハウスキーピング遺伝子）に対応する７２反応を７２のウェルに入れ、３８４−ウェルプレートにはそれぞれ、４個の試料の反応を負荷した（７２×４ウェル）。３８４−ウェルプレートを、ＡＢＩ ７９００リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使ったＳＹＢＲグリーンを利用したリアルタイムＰＣＲプログラムにかけた。プログラムは、９５℃で１０分、次いで９５℃で１５秒と６０℃で１分を４０サイクルとし、その後融解曲線解析を行った。
リアルタイムＰＣＲの後、ΔΔＣｔ統計分析法を使用して、データを解析した。各試料中の８種類のハウスキーピング遺伝子のＣｔ値の平均を、その試料に関するハウスキーピング遺伝子のＣｔ値として計算した。同じ試料の個々のアッセイのＣｔ値からハウスキーピングＣｔ値を引くことで、ΔＣｔを計算した。さらに、各アッセイの対照試料のΔＣｔ値を、対応する処理試料のΔＣｔ値から引くことで、ΔΔＣｔ値を導き出した。ＮＳＣ分類器方法（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２００２ Ｍａｙ １４；９９（１０）：６５６７−７２）を使用して、８種類の陰性試料と１２種類の陽性試料のΔΔＣｔ値を解析した。陽性試料と陰性試料を区別する遺伝子発現シグネチャーとして、１６種類の遺伝子を同定した（図４B）。これら１６種類の遺伝子とその受入番号を以下の表に挙げる。
サポートベクターマシン分類法を使ったクロス確認により、これら２０個の試料について、得られた１６遺伝子シグネチャーの有用性を確認した。記載した方法を使った場合、２０試料のうちの２０個が、この１６遺伝子シグネチャーで正しく分類された（図４Ａを参照のこと）。
実験プロトコール
細胞培養および化学薬品
培地は全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、それぞれの細胞株はＡＴＣＣから購入した。２９３Ｈ、ＨｅｐＧ２、Ｕ３７３ＭＧ、Ｕ１０５ＭＧ、ＭＤＡ−ＭＢ４１５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＤＭＥＭ培地に１０％のＦＢＳ、１ｍＭのナトリウムピルビン酸塩および非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたものの中で培養した。ＣＣＤ１０７９ＳＫ、ＢＪ、ＩＭＲ９０、ＭＣＦ７細胞は、１０％ＦＢＳを添加したＭＥＭ培地で培養した。Ｌｎｃａｐ細胞は、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０およびＳＫ−ＢＲ−３は、１０％ＦＢＳを添加したＭｃＣｏｙの５Ａ改変培地で培養した。細胞は全て、細胞培養インキュベーター中３７℃で、５％ＣＯ２を供給しながら培養した。実験で使用した化学薬品は全て、他の供給源からのものであることが示されない限り、Ｓｉｇｍａからのものを使用した。
細胞の溶解およびウェスタンブロットのプロトコール
実験処理の終了時点で、細胞を改変ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１％のＩＧＥＰＡＬ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１％のＳＤＳ、並びにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤）（化学薬品は全てＳｉｇｍａから）中で溶解した。６−ウェルプレートの各ウェルの細胞培地を吸引し、１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。５０μｌの改変ＲＩＰＡ緩衝液をそれぞれのウェルに加え、細胞をウェルから掻き取って改変ＲＴＰＡ緩衝液に溶解した。細胞溶解物を１．５ｍｌの微量遠心管に移し、氷上で３０分間インキュベートした。１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した後、上清を新しい１．５ｍｌチューブに移し、タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイを使って、製造業者の標準的なプロトコール（Ｐｉｅｒｃｅ）に従って測定した。細胞溶解物を３０μｌのＨ２０で希釈してタンパク質濃度を２μｇ／μｌとし、３０μｌの２×ＳＤＳ試料緩衝液（ＢｉｏＲＡＤ）と混合して最終濃度を１μｇ／μｌとした。希釈した溶解物を７０℃で１０分間加熱してタンパク質を変性させた。加熱後、溶解物を１５０００ｒｐｍで１分間遠心し、成形済みの４〜１２％ ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｍｉｎｉゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、１ウェル当たり１５μｌの溶解物を負荷した。ゲルを、１５０Ｖの定電圧で１．５時間泳動し、その後、製造業者によるプロトコールに従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３０Ｖの定電圧で、２時間、ニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜をウェスタンブロット洗浄緩衝液（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を添加した１×ＰＢＳ）に溶解した５％ミルク中で１時間、室温でブロッキングした。それぞれの膜に、マウス抗活性型β−カテニン一次抗体（１：１０００）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗β−カテニン一次抗体（１：２０００）（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂ）およびウサギ抗ＧＡＰＤＨ一次抗体（１：２０００）（ＡＢｃａｍ）を加え、さらに４℃で一晩インキュベートした。翌日、膜を４℃から取り出し、室温でさらに３０分間インキュベートし、その後ウェスタンブロット洗浄緩衝液で３回、それぞれ５分間ずつ洗浄した。膜にヤギ抗マウス二次抗体（１：４０００）およびヤギ抗ウサギ二次抗体（１：４０００）（Ｓｉｇｍａ）を加えて１時間室温でインキュベートした。膜をウェスタンブロット洗浄緩衝液で３回、５分間ずつ洗浄した。膜状のタンパク質のバンドを検出するために、混合しておいたウェスタンブロット基質（０．７５ｍｌの過酸化水素溶液と０．７５ｍｌのｌｕｍｉｎｏｌエンハンサー溶液を混合したもの）（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）をそれぞれの膜に加え、膜全体を覆うように、室温で１分インキュベートした。膜を、Ｆｕｊｉ画像化装置ＬＡＳ−３０００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）で２分間、化学発光用フィルターを使って露光した。Ｗｎｔ３ａの効果は、未処理試料と比較した場合に、Ｗｎｔ３ａで処理した試料では、活性型β−カテニンのタンパク質レベルが上昇することによって示された。β−カテニンｓｉＲＮＡの効果は、標的指向化されてないｓｉＲＮＡを導入した試料と比較して、β−カテニンｓｉＲＮＡを導入した試料では、活性型β−カテニンと全β−カテニンのタンパク質レベルが低下することによって示された。
ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＲＴ２ ｑＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使ったトータルＲＮＡ単離のプロトコール
６−ウェルプレート中で生育させた細胞をＲＮＡ単離用に回収するために、細胞培地を除去し、２００μｌの溶解緩衝液Ｇ６をそれぞれのウェルに加えた。細胞をプレートから掻き取り、溶解物を１．５ｍｌの微量遠心管に移し、その後すぐにＲＮＡを単離するか、−８０℃で保存して、後からＲＮＡを単離した。ＲＮＡを単離するため、１容量（２００μｌ）の７０％エタノールを溶解物に加え、ピペット操作で６回混合した。混合した試料を２ｍｌのコレクションチューブ中に入れたスピンカラムに加えて１１，０００×ｇで１分間遠心した。カラムに３５０μｌの脱塩緩衝液Ｇ１５を加え、１１，０００×ｇで１分間遠心することで洗浄した。１００μｌのＤＮＡｓｅ処理溶液（１０μｌのＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅを９０μｌのＤＮａｓｅ反応緩衝液と混合したもの）をそれぞれのスピンカラムに加え、室温で１５分間インキュベートした。予洗浄緩衝液（Ｇ１６、２００μｌ）をスピンカラムに加え、１１，０００×ｇで１分間遠心した。洗浄緩衝液Ｇ１７（６００μｌ）をスピンカラムに加え、１１，０００×ｇで１分間遠心して、スピンカラムの膜を洗浄した。新たに２５０μｌの緩衝液Ｇ１７をこのスピンカラムに加え、１１，０００×ｇで３分間遠心してスピンカラムの膜を洗浄した。スピンカラムを新しい１．５ｍｌのコレクションチューブに入れ、３０μｌのＲＮａｓｅを含まない水をスピンカラムの膜に直接加えた。スピンカラムを室温に２分間置き、１１，０００×ｇで１分間遠心してＲＮＡを溶出した。
ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用したトータルＲＮＡの単離
６−ウェルプレート中で生育させた細胞をＲＮＡ単離用に回収するために、細胞培地を除去し、２００μｌのＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ緩衝液をそれぞれのウェルに加えた。細胞をプレートから掻き取り、溶解物を１．５ｍｌの微量遠心管に移し、その後すぐにＲＮＡを単離するか、−８０℃で保存して、後からＲＮＡを単離した。ＲＮＡを単離するため、均一化した溶解物を、２ｍｌのコレクションチューブに入れたｇＤＮＡ Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒスピンカラムに移した。≧８０００×ｇ（≧１０，０００ｒｐｍ）で３０秒間遠心する。カラムを捨て、フロースルーを取っておく。１容量（２００μｌ）の７０％エタノールをフロースルーに加え、ピペット操作で６回混合した。混合した試料を、２ｍｌのコレクションチューブに入れたＲＮｅａｓｙスピンカラムに加え、≧８０００×ｇ（≧１０，０００ｒｐｍ）で１分遠心した。カラムに７００μｌの緩衝液ＲＷｌを入れて≧８０００×ｇ（≧１０，０００ｒｐｍ）で１分遠心することによって洗浄した。緩衝液ＲＰＥ（５００μｌ）をＲＮｅａｓｙスピンカラムに加え、≧８０００×ｇ（≧１０，０００ｒｐｍ）で１分遠心することによって、スピンカラムの膜を洗浄した。さらに５００μｌの緩衝液ＲＰＥをＲＮｅａｓｙスピンカラムに加え、≧８０００×ｇ（≧１０，０００ｒｐｍ）で２分遠心することによって、スピンカラムの膜を洗浄した。ＲＮｅａｓｙスピンカラムを新しい２ｍｌのコレクションチューブに入れ、最大速度で１分間遠心した。ＲＮｅａｓｙスピンカラムを新しい１．５ｍｌのコレクションチューブに移し、３０μｌのＲＮａｓｅを含まない水をスピンカラムの膜に直接加えた。スピンカラムを室温に２分間置き、≧８０００×ｇ（≧１０，０００ｒｐｍ）で１分間遠心して、ＲＮＡを溶出した。
ＲＴ２ ＥＺ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、 ａ ＱＩＡＧＥＮ ｃｏｍｐａｎｙ）を使用した、逆転写のプロトコール
３００〜１０００ｎｇのトータルＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＨ２Ｏで８μｌに希釈し、６μｌのＧＥ２（ゲノムＤＮＡ除去）緩衝液と混合した。反応液を３７℃で５分間インキュベートし、すぐに氷上に１分間置いた。６μｌのＢＣ５（ＲＴマスターミックス）を、それぞれ１４μ１のゲノムＤＮＡ除去混合液に加え、最終容量を２０μｌとした。反応液を４２℃で正確に１５分間インキュベートし、すぐに９５℃で５分間加熱することによって反応を停止させた。３７℃、４２℃および９５℃でのインキュベーションは、サーマルサークラーであるＧｅｎＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。反応を終了したものは、リアルタイムＰＣＲにすぐに使用する場合には氷中に置き、長期間保存する場合には−２０℃に置いた。
ＲＴ２ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、 ａ ＱＩＡＧＥＮ ｃｏｍｐａｎｙ）を使用した逆転写のプロトコール
３００〜１０００ｎｇのトータルＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＨ２Ｏで８μｌに希釈し、２μｌのＧＥ（ゲノムＤＮＡ除去）緩衝液と混合した。反応液を４２℃で５分間インキュベートし、すぐに氷上に１分間置いた。１０μｌのＲＴカクテル（４μｌのＢＣ３、１μｌのＰ２、２μｌのＲＥ３および３μｌのＨ２Ｏ）を、それぞれ１０μ１のゲノムＤＮＡ除去混合液に加え、最終容量を２０μｌとした。反応液を４２℃で正確に１５分間インキュベートし、すぐに９５℃で５分間加熱することによって反応を停止させた。４２℃および９５℃でのインキュベーションは、サーマルサークラーであるＧｅｎＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。反応を終了したものは、リアルタイムＰＣＲにすぐに使用する場合には氷中に置き、長期間保存する場合には−２０℃に置いた。
ＩｌｌｕｍｉｎａヒトＨＴ−１２ ＢｅａｄＣｈｉｐのプロトコール
以下に示すように、再懸濁したｃＲＮＡ試料をＢｅａｄＣｈｉｐ上に分配し、Ｉｌｌｕｍｉｎａハイブリダイゼーションオーブン中で１６〜２４時間インキュベートし、試料をＢｅａｄＣｈｉｐにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、ＨＹＢ（１０μｌ）、ＨＣＢ（４００μｌ）、およびｃＲＮＡ（７５０ｎｇ／５μｌ；この容量にするためにＲＮａｓｅを含まない水を加えるか、あるいは試料を乾燥させた）を使用して行った。オーブン（回転振とう台を備えている）は予め５８℃に加熱しておいた。試料を室温（およそ２２°Ｃ）に１０分間置いて、ｃＲＮＡを再懸濁させた。ＨＹＢのチューブとＨＣＢのチューブを５８℃のオーブン中に１０分間置いて、保存中に沈殿する可能性のある塩を全て溶解させた。塩が溶け残っていた場合には、さらに１０分間、５８℃でインキュベートした。室温まで冷却した後、ＨＹＢのチューブとＨＣＢのチューブは、使用する前にしっかりと混合した。１０μｌのＨＹＢを各ｃＲＮＡ試料に加えた。ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｙｂチャンバーのガスケットをＢｅａｄＣｈｉｐ Ｈｙｂチャンバーに設置した。２００μｌのＨＣＢを、調製済みのＢｅａｄＣｈｉｐの隣にある、湿潤緩衝液貯蔵容器に分配した。Ｈｙｂチャンバーを蓋で密閉し、ＢｅａｄＣｈｉｐをＨｙｂチャンバーに負荷するまで、実験台の上に室温で保存した。全てのＢｅａｄＣｈｉｐを包装から取り出した。ＢｅａｄＣｈｉｐをカバーシールのつまみをピンセットでつまむか、あるいは粉末のない手袋でつかむかして持ち、ＢｅａｄＣｈｉｐのバーコードがＨｙｂチャンバーのインサート上のバーコード記号と整列するように、Ｈｙｂチャンバーのインサートに滑り込ませた。アッセイ試料を予め６５℃で５分間加熱しておき、短時間ボルテックスし、その後短時間遠心して、液体をチューブの底に集めた。使用する前に室温まで冷却した。室温まで冷めたらすぐに試料をピペッティングした。ＢｅａｄＣｈｉｐの入ったＨｙｂチャンバーのインサートを、Ｈｙｂチャンバーに乗せた。アッセイ試料（１５μｌ）を各アレイのラージサンプルポートに分配した。Ｈｙｂチャンバーのインサートが外れないように注意して、蓋でＨｙｂチャンバーを密閉し、回転振とう台の速度を５にし、５８℃で１６〜２０時間インキュベートした。一晩ハイブリダイゼーションした後、ＢｅａｄＣｈｉｐを取り出して、高温洗浄用緩衝液（５００ｍｌ）、洗浄用Ｅ１ＢＣ（２Ｌ）、ブロッキング用Ｅｌ緩衝液（６ｍｌ／チップ）、ストレプトアビジン−Ｃｙ３ストック（１ｍｇ／ｍｌの濃度でＲＮａｓｅを含まない水に溶解したもの。チップ１枚当たり２μｌ）、および１００％エタノール（２５０ｍｌ）で洗浄し、染色した。１×の高温洗浄用緩衝液は、５０ｍｌの１０×ストックを４５０ｍｌのＲＮａｓｅを含まない水に加えることで調製した。水浴のインサートをヒートブロックに入れ、調製した５００ｍｌの１×高温洗浄用緩衝液を加えた。ヒートブロックの温度を５５℃に設定し、高温洗浄用緩衝液をその温度まで予熱した。ヒートブロックの蓋を閉めて一晩放置した。翌日、６ｍｌのＥ１ＢＣ緩衝液を２ＬのＲＮａｓｅを含まない水に加えて、洗浄用のＥ１ＢＣ溶液を調製した。ブロッキング用Ｅｌ緩衝液（４ｍｌ／チップ）を室温に予熱した。ブロッキング用Ｅ１緩衝液（２ｍｌ／チップ）をストレプトアビジン−Ｃｙ３（チップ１枚当たり、１ｍｇ／ｍｌストックを２μｌ）と共に調製した。チップ全ての分を１本の円錐チューブの中で調製し、検出工程まで暗所で保存した。１Ｌの希釈した洗浄用Ｅ１ＢＣ緩衝液をパイレックスの３１４０型ビーカーに入れた。Ｈｙｂチャンバーをオーブンから取り出し、ばらばらにした（全部を一度に）。以下の工程で説明するように、全てのＢｅａｄＣｈｉｐを第一チャンバー内で処理した。その後第二チャンバーをオーブンから取り出し、そのＢｅａｄＣｈｉｐを処理した。同様に全てのチャンバーを処理した。粉末が付いていない手袋をした手でＢｅａｄＣｈｉｐを全てＨｙｂチャンバーから出し、表面が上になるようにして、ビーカーの底に沈め、ＢｅａｄＣｈｉｐ全体が緩衝液中に沈んでいるように注意しながら、カバーシールを第一のＢｅａｄＣｈｉｐから取った。ピンセットを使うかまたは粉末の付いていない手袋をした手で、カバーシールを取ったそれぞれのＢｅａｄＣｈｉｐを、２５０ｍｌの洗浄用Ｅ１ＢＣ溶液の入った染色皿に沈められているスライドラックに移した。２５０ｍｌの洗浄用Ｅ１ＢＣ溶液は、後の１回目の室温洗浄で再利用するので取っておく。スライドラックの取っ手をつかんで、ラックを、高温洗浄用の高温洗浄用緩衝液が入ったＨｙｂｅｘ Ｗａｔｅｒｂａｔｈインサートに移した。Ｈｙｂｅｘの蓋を閉め、試料を静止状態で１０分間インキュベートした。高温洗浄緩衝液の１０分間のインキュベーションが完了したらすぐに、シールをはがす工程で使用した洗浄用Ｅ１ＢＣを入れた染色皿にスライドラックを戻し、ラックごと短時間撹拌し、その後、回転振とう器を使用して、溶液が皿から飛び散らない最も早い速度で、５分間振とうした。次いでラックを、２５０ｍｌの１００％エタノール（エタノールのビンから出した新しいエタノールを使用した）の入ったきれいな染色皿に移し、ラックの取っ手をつかんで短時間撹拌し、その後、回転振とう器で１０分間振とうした。ラックを、新しい２５０ｍｌの洗浄用Ｅ１ＢＣ溶液の入ったきれいな染色皿に移し、ラックの取っ手をつかんで短時間撹拌し、回転振とう器で２分間振とうした。４ｍｌのブロッキング用Ｅ１緩衝液を洗浄トレイにピペットで入れ、表面が上になるようにＢｅａｄＣｈｉｐを、振とう台の上に乗せたＢｅａｄＣｈｉｐ洗浄トレイに移し、中速で１０分間振とうした。２ｍｌのブロッキング用Ｅ１緩衝液にストレプトアビジン−Ｃｙ３を加えたものを、新しい洗浄トレイにピペットで加え、表面が上になるようにＢｅａｄＣｈｉｐを振とう台の上に乗せたＢｅａｄＣｈｉｐ洗浄トレイに移し、蓋をトレイの上に乗せ、中速で１０分間振とうした。２５０ｍｌの洗浄用Ｅ１ＢＣ溶液をきれいな染色皿に入れ、ＢｅａｄＣｈｉｐを染色皿に沈めたスライドラックに移し、ラックごと短時間撹拌し、その後、回転振とう器上で５分間、室温で振とうした。遠心機にプレートホルダーとペーパータオル、およびバランス用のラックを準備し、速度を２７５ｒｆｃ（相対遠心力）に設定した。ＢｅａｄＣｈｉｐのラックを、室温で４分間遠心した。スライドラックを１つだけ処理した場合には、遠心機の釣り合いを取るために、ＢｅａｄＣｈｉｐを２つのラックに入れるか、あるいは使用したＢｅａｄＣｈｉｐと同じ数のＢｅａｄＣｈｉｐを入れた別のラックを使用した。乾燥させたチップをスライドボックスに入れ、スキャンするまで保存した。
実験データ
上述した実験のデータは、図２Ａ〜Ｃ、３Ａ〜Ｂおよび４Ａ〜Ｂに含まれている。
本発明を詳細に説明してきたが、本発明は、特許請求の範囲に基づいてさらに説明される。

Claims (28)

  1. ＣＡＬＭ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＨＳＹ１、ＣＸＡＤＲ、ＣＹＰ４Ｖ２、ＦＡＭ４４Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ａ、ＬＥＦ１、ＭＴＰ１８、ＭＹＣ、ＮＡＶ２、ＳＫＰ２、ＰＲＭＴ６、ＭＴＳＳ１およびＭＴ１Ａまたはそれらのオルソログもしくは変異体からなる群より選択される、少なくとも５種類の遺伝子を増幅して、これを検出するための核酸を含む、細胞試料または対象におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の調節状態を検出するための試料の増幅解析を実施するための組成物。
  2. 前記増幅された遺伝子が、ＮＭ＿００６８８８．４、ＮＭ＿０５３０５６．２、ＮＭ＿００１７５９．３、ＮＭ＿０１４９１８．３、ＮＭ＿００１３３８．４、ＮＭ＿２０７３５２．３、ＮＭ＿１３８３６９．２、ＮＭ＿０２５０１５．２、ＮＭ＿０１６２６９．４、ＮＭ＿０１６４９８．４、ＮＭ＿００２４６７．４、ＮＭ＿１４５１１７．４、ＮＭ＿００５９８３．３、ＮＭ＿０１８１３７．２、ＮＭ＿０１４７５１．４、およびＮＭ＿００５９４６．２からなる群より選択される受託番号で登録された核酸配列を有する遺伝子と少なくとも９０％同一である、請求項１の組成物。
  3. ＣＡＬＭ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＨＳＹ１、ＣＸＡＤＲ、ＣＹＰ４Ｖ２、ＦＡＭ４４Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ａ、ＬＥＦ１、ＭＴＰ１８、ＭＹＣ、ＮＡＶ２、ＳＫＰ２、ＰＲＭＴ６、ＭＴＳＳ１およびＭＴ１Ａからなる群より選択される、少なくとも１０種類の遺伝子を増幅して、これを検出するための核酸を含む、請求項１の組成物。
  4. １〜１０種類のハウスキーピング遺伝子を増幅して、これを検出するための核酸をさらに含む、請求項１の組成物。
  5. ＣＡＬＭ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＨＳＹ１、ＣＸＡＤＲ、ＣＹＰ４Ｖ２、ＦＡＭ４４Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ａ、ＬＥＦ１、ＭＴＰ１８、ＭＹＣ、ＮＡＶ２、ＳＫＰ２、ＰＲＭＴ６、ＭＴＳＳ１およびＭＴ１Ａからなる群より選択される少なくとも１０〜１５種類の遺伝子を増幅して、これを検出するための核酸を含む、請求項１の組成物。
  6. ＣＡＬＭ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＨＳＹ１、ＣＸＡＤＲ、ＣＹＰ４Ｖ２、ＦＡＭ４４Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ａ、ＬＥＦ１、ＭＴＰ１８、ＭＹＣ、ＮＡＶ２、ＳＫＰ２、ＰＲＭＴ６、ＭＴＳＳ１およびＭＴ１Ａからなる群より選択される、１６種類全ての遺伝子を増幅して、これを検出するための核酸を含む、請求項１の組成物。
  7. リアルタイムＰＣＲ増幅を実施するための、請求項１の組成物。
  8. ＳＹＢＲＴＭグリーン法による検出を伴うリアルタイムＰＣＲ増幅を実施するための、請求項１の組成物。
  9. ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ＬＡＭＰ法（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＣＡ法（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、自家持続配列複製法（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、３ＳＲ）、ＮＡＳＢＡ法（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む方法によって増幅を実施するための、請求項１の組成物。
  10. ＳＹＢＲＴＭグリーン法またはＭＮＡザイム法によって検出を実施するための、請求項１の組成物。
  11. 細胞試料または対象におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の調節状態を決定するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用であって、前記遺伝子をin vitroで増幅、検出および発現を定量することを含む前記使用。
  12. 前記増幅を行った後、遺伝子発現の定量から得られるデータをウェブを利用した解析ツールで解析する、請求項１１の使用。
  13. 前記ウェブを利用した解析ツールが、細胞試料または対象におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の調節状態を示す数を提供する、請求項１２の使用。
  14. 細胞試料または対象中のＣＡＬＭ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＨＳＹ１、ＣＸＡＤＲ、ＣＹＰ４Ｖ２、ＦＡＭ４４Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ａ、ＬＥＦ１、ＭＴＰ１８、ＭＹＣ、ＮＡＶ２、ＳＫＰ２、ＰＲＭＴ６、ＭＴＳＳ１およびＭＴ１Ａからなる群より選択される、少なくとも５種類の遺伝子の発現レベルを、対照細胞試料からの同じ遺伝子の発現に対して検出・定量および比較する工程、およびこの比較に基づいて細胞試料または対象におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の調節状態を決定する工程を含む、細胞試料または対象におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の調節状態を決定するためのin vitro方法。
  15. 遺伝子の発現レベルをリアルタイム増幅によって検出および定量する、請求項１４の方法。
  16. 前記遺伝子の発現レベルを検出および定量する方法がＳＹＢＲＴＭグリーンを利用したリアルタイムＰＣＲを含む、請求項１４の方法。
  17. 前記遺伝子の発現レベルをサポートベクターマシン法によって解析する、請求項１４の方法。
  18. 細胞試料または対象における請求項１４記載の全１６種類の遺伝子と対象細胞試料の発現レベルにおけるΔΔＣｔを計算し、およびそのΔΔＣｔ値を、負に調節されているおよび正に調節されているＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達活性をもつ試料を含むデータプール中のこれら１６種類の遺伝子のΔΔＣｔ値と比較する、請求項１４の方法。
  19. 細胞試料または対象が、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達をモジュレートする化合物による治療を受ける可能性のある患者から得られる細胞試料であり、かつ、請求項１４の方法が細胞試料中のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達活性の調節状態を決定するのに使用される、請求項１４の方法。
  20. 細胞試料または対象が、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達をモジュレートする化合物による治療を受けた患者から得られる細胞試料であり、かつ、請求項１４の方法が、患者から得られる細胞中のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達活性に及ぼす前記化合物による治療の効果を示すためのデータの提供に使用される、請求項１４の方法。
  21. 試料におけるＷｎｔ／β−カテニン経路の調節解除状態を評価するために使用される、請求項１４の方法。
  22. Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が調節解除されているか、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が調節されているかで細胞試料を分類するために使用される、請求項１４の方法。
  23. 薬剤が試料における前記Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートするか否かを決定するために使用される、請求項１４の方法。
  24. Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤に対する、細胞試料を得た対象の細胞中におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の反応を予測するために使用される、請求項１４の方法。
  25. 対象に治療を割り当てるためのデータの提供に使用される、請求項２４の方法。
  26. Ｗｎｔ／β−カテニン経路シグナル伝達を調節するために設計された治療の細胞試料または対象における薬力学的効果を評価するためのデータの提供に使用される、請求項１４の方法。
  27. Ｗｎｔ／β−カテニン経路の調節解除によって特徴付けられる癌を同定するためのデータの提供に使用される、請求項１４の方法。
  28. 前記癌が、結腸直腸癌、黒色腫、乳癌および肝細胞腫から選択される、請求項２７の方法。
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