DE69611793T2

DE69611793T2 - Ruhende zellpopulationen für den kern-transfer

Info

Publication number: DE69611793T2
Application number: DE69611793T
Authority: DE
Inventors: Henry Campbell; Ian Wilmut
Original assignee: Biotech & Biolog Scien Res; Minister of Agriculture Fisheries and Food UK; Roslin Institute Edinburgh
Current assignee: Biotech & Biolog Scien Res; Minister of Agriculture Fisheries and Food UK; Roslin Institute Edinburgh
Priority date: 1995-08-31
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2001-09-20
Anticipated expiration: 2016-08-31
Also published as: GB2318578A; HUP9900234A2; NZ337311A; NO980845L; AU716956B2; CN1769431A; KR100793220B1; ES2155197T3; NZ316149A; JP2000506722A; SG75155A1; EP1005789A3; GB2318578B; HK1090089A1; US7232938B2; DE69611793D1; AU716956C; US20050010966A1; CN100422317C; JP2006217913A

Description

Diese Erfindung betrifft die Schaffung nichtmenschlicher Tiere, welche, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, genetisch selektierte und/oder modifizierte nichtmenschliche Tiere einschließen.
Die Rekonstruktion nichtmenschlicher Säugetierembryos durch den Transfer eines Nucleus von einem Spenderembryo zu einer entkernten Oocyte oder einer Ein-Zellzygote ermöglicht die Schaffung genetisch identer Individuen. Dies bringt sowohl für die Forschung (d. h. als biologische Kontrollen) als auch bei kommerziellen Anwendungen (d. h. Vermehrung von genetisch wertvollem Viehbestand, Einheitlichkeit von Fleischprodukten, Tiermanagement) klare Vorteile mit sich. Ein Problem bei der Verwendung früher Embryonen als Kernspender besteht darin, daß die Anzahl von Nachkommen, welche aus einem einzigen Embryo erzeugt werden können, sowohl durch die Anzahl von Zellen (bei landwirtschaftlich genutzten Tierspezies werden zumeist Embryos im 32-64-Zellen-Stadium verwendet) als auch durch die Effizienz des Kerntransferprotokolls eingeschränkt wird.
Im Gegensatz zur Verwendung von Embryos als Kernspender, ist die Fähigkeit, durch Kerntransfer aus Zellen, welche in Kultur gehalten werden können, lebende Nachkommen zu produzieren, eine Zielsetzung, welche von Tierzüchtern seit einiger Zeit verfolgt wird. Die Fähigkeit, aus einer in Kultur gehaltenen Zellinie geklonte Nachkommen zu produzieren, würde verglichen mit der Verwendung früher Embryonen eine Reihe von Vorteilen bieten. Zu diesen gehören: Die Erzeugung einer großen Anzahl identischer Nachkommen über einen langen Zeitraum (in Kultur gehaltene Zellen können eingefroren und gelagert werden) und die Fähigkeit, Zellpopulationen des erforderlichen Genotyps (z. B. Geschlecht) vor der Embryorekonstruktion genetisch zu modifizieren und/oder zu selektieren. Ein möglicher Zelltyp zur Verwendung bei diesen Verfahren ist die Embryonalstammzelle (Es-Zelle). Es-Zellen wurden bei der Maus isoliert, jedoch liegen bislang keine Berichte über eine Entwicklung bis zur Vollreife nach deren Verwendung beim Kerntransfer vor. Gegenwärtig liegt ein einziger Bericht über Es-artige Zellen in Schweinen vor, welche zur Entwicklung nach der Injektion in die Blastocoelhöhle von in vivo erzeugten Blastocysten beigetragen haben vor (Wheeler, Reprod. Fertil. Dev. 6 563-568 (1994)), jedoch keine Berichte über Chimärismus bei anderen landwirtschaftlich genutzten Tierarten und keine Berichte über eine Entwicklung bis zur Vollreife nach dem Kerntransfer bei irgendwelchen Säugetierarten aus irgendeiner etablierten Zellinie.
Es gibt mehrere Alternativen zur Verwendung von Es-Zellinien; eine dieser besteht darin, andere Zellpopulationen zu suchen, welche in der Lage sind, die Entwicklung zu fördern, wenn sie für den Kerntransfer verwendet werden. Mehrere Berichte ließen darauf schließen, daß primordiale Keimzellen einen geeigneten Kandidaten darstellen; bislang wurde jedoch keine Entwicklung bis zur Vollreife bekanntgemacht. Aus frühen Embryonen etablierte Zellinien wurden vorgeschlagen, wenngleich für die Frühpassagezellen bei Schafen (Campbell et al., Therio 43 181 (1995)) nach ausgedehnter Kultur eine Entwicklung gemeldet wurde, wurde durch Verwendung herkömmlicher Kerntransferprotokolle (Campbell et al., J. Abstract Series (5) 31 (1995)) keine Entwicklung erzielt.
Um eine Entwicklung bis zur Vollreife nach Kerntransfer zu erzielen, muß die Entwicklungsuhr des transferierten Nucleus rückgesetzt werden. Damit dies eintritt, muß die Transcription angehalten und in einem entwicklungsmäßig geregelten Schema neu gestartet werden. Frühere Berichte haben gezeigt, daß Entwicklung bis zum Blastocystenstadium aus einer breiten Vielfalt von Zelltypen in Kühen, Schafen, Schweinen, Kaninchen und Mäusen erzielt werden kann. Allerdings wurde in keinem dieser Berichte eine Entwicklung bis zur Vollreife bekanntgemacht. Die Geburt lebender Lämmer nach dem Kerntransfer aus primären Zellinien (bis zu und einschließlich Passage 3), welche aus der Embryonalscheibe (ED) von Tag-9-Schafembryos etabliert wurden, wurde bereits bekanntgemacht (Campbell et al., Therio 43 181 (1995)). Allerdings wurde bei darauffolgender Kultur durch Verwendung herkömmlicher Kerntransferprotokolle keine Entwicklung bis zur Vollreife erzielt (bei Passage 6 und 11) (Campbell et al., J. Reprod. Fertil. Abstract Series (5) 31 (1995)). Diese Ergebnisse können auf vielerlei Arten interpretiert werden; erstens kann postuliert werden, daß jede der ED-derivierten Zellen, die während der frühen Kulturstadien gewonnen werden, in der Lage ist, die Entwicklung zu fördern. Allerdings ändern sich diese Zellen nach ausgedehnter Kultur während der Etablierung einer in Kultur gehaltenen Zellinie und sind demnach nicht in der Lage, die Entwicklung zu regeln, wenn sie als Kernspender für den Kerntransfer in den "Universalempfänger" verwendet werden, auf welchen in den oben genannten Dokumenten Bezug genommen wird. Alternativ dazu kann postuliert werden, daß während der frühen Kulturphase eine Subpopulation von Zellen die Fähigkeit behält, Entwicklung zu fördern, und daß dies die Produktion von lebenden Nachkommen nach dem Kerntransfer während dieser frühen Passagen erklären würde. Frühere Studien haben die Rolle der Zellzykluskoordinierung der Spenderkerns und des Empfängercytoplasmas bei der Entwicklung von Embryos unterstrichen, welche durch Kerntransfer rekonstruiert werden (Campbell et al., Biol. Reprod. 49 933-942 (1993) und Biol. Reprod. 50 1385-1393 (1994)).
Zwei mögliche alternative Strategien zu jener des Zurückgreifens auf das Isolieren einer Zellinie, welche für den Kerntransfer durch Verwendung veröffentlichter Kerntransferprotokolle totipotent ist, sind:
(1) bestehende Kerntransferverfahren zu modifizieren; oder
(2) das Chromatin der Spenderzelle vor dem Kerntransfer zu modifizieren.
Eine totipotente Zelle kann die Entwicklung eines gesamten Tieres lenken (beim Konstruieren von Embryos durch Kerntransfer von einer Spenderzelle in eine Empfängerzelle, beispielsweise eine entkernte Oocyte, ist es der Nucleus der Spenderzelle, welcher totipotent ist). Dies umfaßt das Lenken der Entwicklung extraembryonaler Abstammungslinien, d. h. der Plazenta. Bei dieser Definition sind eine befruchtete Zygote und bei einigen Spezies individuelle Blastomeren ebenfalls totipotent. Im Gegensatz dazu wurde ein pluripotenter oder multipotenter Zelltyp (d. h. ein Embryonalstammzelltyp) als einer definiert, welcher nach der Injektion in die Blastocoelhöhle alle Gewebe im Konzeptus/in der Nachkommenschaft bilden kann.
Bei beiden oben genannten Kerntransferstrategien (1) und (2) ist ein Verfahren erforderlich, welches das Neuprogrammieren der Genexpression des transferierten Kerns ermöglicht: ein derartiges Verfahren würde dann die Verwendung differenzierter oder teilweise differenzierter Zellen als Kernspender ermöglichen und deren inhärente Totipotenz "zum Vorschein bringen".
Es wurde nun erkannt, daß ruhende Zellen, das heißt Zellen, welche sich nicht aktiv mittels des Zellzyklus vermehren, vorteilhaft als Kernspender beim Rekonstituieren eines nichtmenschlichen tierischen Embryos verwendet werden können. Derartigen Embryos kann daraufhin gestattet werden, sich bis zur Vollreife zu entwickeln. Es hat den Anschein, daß Änderungen im Spenderkern, welche nach der Embryorekonstruktion beobachtet werden und für einen effizienten Kerntransfer erforderlich sind, in den Kernen von Zellen vor ihrer Verwendung als Kernspender induziert werden können, indem sie dazu gebracht werden, den ruhenden Zustand einzunehmen. Diese Tatsache wird bei der vorliegenden Erfindung genutzt.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Rekonstituieren eines nichtmenschlichen tierischen Embryos vorgesehen, wobei das Verfahren das Transferieren des Nucleus einer ruhenden diploiden Spenderzelle in eine passende Empfängerzelle umfaßt.
Im Prinzip kann die Erfindung auf alle nichtmenschlichen Tiere angewandt werden, einschließlich Vögel, beispielsweise Haushühner, Amphibienarten und Fischarten. In der Praxis werden jedoch gegenwärtig die größten kommerziell nutzbringenden Anwendungsmöglichkeiten für nichtmenschliche Tiere, insbesondere (nichtmenschliche) Säugetiere, vor allem Plazentasäugetiere, ins Auge gefaßt. Für Huftiere, insbesondere für wirtschaftlich bedeutende Huftiere wie Rinder, Schafe, Ziegen, Wasserbüffel, Kamele und Schweine, ist die Erfindung wahrscheinlich am nutzbringendsten, sowohl als Mittel zum Klonen von Tieren als auch als Mittel zur Schaffung transgener oder genetisch modifizierter Tiere. Es sollte auch festgehalten werden, daß die Erfindung wahrscheinlich auch für andere wirtschaftlich bedeutende Tierarten, beispielsweise für Pferde, Lamas, Nagetiere (z. B. Ratten oder Mäuse) und auf Kaninchen angewandt werden kann.
Die Erfindung kann gleichermaßen auf die Produktion von transgenen sowie von nichttransgenen Tieren angewandt werden. Transgene nichtmenschliche Tiere können aus genetisch veränderten Spenderzellen hergestellt werden. Das gesamte Verfahren weist eine Reihe von Vorteilen gegenüber herkömmlichen Verfahren zur Herstellung transgener (d. h. genetisch modifizierter) nichtmenschlicher Tiere auf, welche wie folgt zusammengefaßt werden können:
(1) es sind weniger Empfänger erforderlich;
(2) mehrfache syngene Gründer können durch Verwendung klonaler Spenderzellen erzeugt werden;
(3) subtile genetische Änderung durch Gentargeting ist gestattet;
(4) alle Tiere, die aus mittels der Erfindung hergestellten Embryos produziert werden, sollten die relevante genetische Modifikation durch die Keimbahn übertragen, zumal jedes Tier von einem einzigen Nucleus abstammt; im Gegensatz dazu erzeugt die Produktion transgener Tiere mittels Vorkern-Injektion oder Chimerismus nach Einschluß modifizierter Stammzellenpopulationen durch Blastocysteninjektion oder andere Verfahren einen Anteil von Mosaiktieren, bei welchen alle Zellen die Modifikation nicht enthalten und das resultierende Tier die Modifikation nicht über die Keimbahn übertragen kann; und
(5) Zellen können für den Ort genetischer Modifikation (z. B. Integration) vor der Erzeugung des gesamten Tieres selektiert werden.
Es sollte festgehalten werden, daß der Begriff "transgen" in bezug auf Tiere nicht derart verstanden werden sollte, daß dieser auf Tiere beschränkt ist, welche in ihrer Keimbahn ein oder mehrere Gene von anderen Spezies enthalten, wenngleich viele transgene Tiere ein derartiges Gen oder derartige Gene enthalten. Vielmehr bezieht sich der Begriff im weiteren Sinne auf jedwedes Tier, dessen Keimbahn Gegenstand technischer Intervention durch rekombinante DNA-Technik war. So ist beispielsweise ein nichtmenschliches Tier, in dessen Keimbahn ein endogenes Gen gelöscht, dupliziert, aktiviert oder modifiziert wurde, für die Zwecke dieser Erfindung genauso ein transgenes Tier wie ein nichtmenschliches Tier, dessen Keimbahn eine exogene DNA-Sequenz hinzugefügt wurde.
Bei Ausführungsformen der Erfindung, bei welchen das nichtmenschliche Tier transgen ist, ist der Spenderkern genetisch modifiziert. Der Spenderkern kann ein oder mehrere Transgene enthalten, und die genetische Modifikation kann vor dem Kerntransfer und der Embryorekonstituierung stattfinden. Wenngleich Mikroinjektion, analog zur Injektion in den männlichen oder weiblichen Vorkern einer Zygote, als Verfahren zur genetischen Modifikation verwendet werden kann, ist die Erfindung nicht auf jene Methodik beschränkt: Massentransformations- oder -transfektionsmethoden können ebenfalls verwendet werden, z. B. Elektroporation, virale Transfektion oder Lipofektion.
Beim Verfahren der oben beschriebenen Erfindung wird ein Kern von einer ruhenden Spenderzelle zur einer Empfängerzelle transferiert. Die Verwendung dieses Verfahrens ist nicht auf eine bestimmte Spenderzellenart beschränkt. Alle Zellen normalen Karyotyps, einschließlich embryonaler, fötaler und erwachsener somatischer Zellen, welche dazu gebracht werden können, den Ruhezustand einzunehmen oder in einem ruhenden Zustand in vivo vorliegen, können sich unter Verwendung dieser Technologie als totipotent erweisen. Demzufolge erwägt die Erfindung die Verwendung einer zumindest teilweise differenzierten Zelle, einschließlich einer vollständig differenzierten Zelle. Spenderzellen können, müssen jedoch nicht, in Kultur gehalten werden. In Kultur gehaltene primäre Rinderfibroblaste, eine embryoderivierte Schafzellinie (TNT4), eine schafbrustepithelzellenderivierte Zellinie (OME) von einem 6 Jahre alten erwachsenen Schaf, eine Fibroblastzellinie, welche aus fötalem Schafgewebe (BLWF1) gewonnen wurde, und eine epithelartige Zellinie, welche aus einem 9 Tage alten Schafembryo (SEC1) gewonnen wurde, werden weiter unten beispielhaft dargelegt. Eine Klasse für die Erfindung zweckdienlicher embryoderivierter Zellinien, welche die TNT4-Zellinie umfaßt, ist ebenfalls Gegenstand der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung Nr. PCT/GB95/02095, welche als WO96/07732 veröffentlicht wurde.
Um für die Erfindung zweckdienlich zu sein, sind Spenderzellen ruhend, was bedeutet, daß sie sich nicht mittels des Mitose-Zellzyklus aktiv vermehren. Der Mitose-Zellzyklus weist vier verschiedene Phasen auf, G1, S, G2 und M. Das Anfangsereignis im Zellzyklus, welches Start genannt wird, findet in der G1-Phase statt und weist eine einzigartige Funktion auf. Die Entscheidung oder Bindung, einen weiteren Zellzyklus zu durchlaufen, erfolgt bei Start. Sobald eine Zelle Start durchlaufen hat, läuft sie durch den Rest der G1- Phase, welche die Prä-DNA-Synthese-Phase ist. Das zweite Stadium, die S-Phase, ist jene Phase, in welcher die DNA-Synthese stattfindet. Nach dieser folgt die G2-Phase, bei welcher es sich um den Zeitraum zwischen DNA-Synthese und Mitose handelt. Die Mitose selbst erfolgt in der M-Phase. Ruhende Zellen (zu denen Zellen gehören, bei welchen der ruhende Zustand induziert wurde, sowie jene Zellen, die von Natur aus ruhend sind, beispielsweise bestimmte vollständig differenzierte Zellen) werden im allgemeinen als in keiner dieser vier Phasen des Zyklus befindlich betrachtet; sie werden für gewöhnlich als in einem G0-Zustand befindlich beschrieben, um anzuzeigen, daß sie für gewöhnlich den Zyklus nicht durchlaufen würden. Die Kerne von ruhenden G0-Zellen weisen einen diploiden DNA-Gehalt auf.
In Kultur gehaltene Zellen können mittels verschiedener Verfahren, einschließlich chemischer Behandlungen, Nährstoffentzug, Wachstumshemmung oder Manipulation der Genexpression, dazu veranlaßt werden, den ruhenden Zustand einzunehmen. Gegenwärtig wird die Reduktion von Serumpegeln im Kulturmedium mit Erfolg dazu verwendet, um sowohl in Schafals auch Rinder-Zellinien den Ruhezustand zu induzieren. Diesfalls verlassen die Zellen den Wachstumszyklus während der G1-Phase und werden, wie oben erläutert wird, im sogenannten G0-Stadium festgehalten. Derartige Zellen können mehrere Tage lang in diesem Zustand verharren (je nach Zelle eventuell länger), bis sie neu angereizt werden, wenn sie wieder in den Wachstumszyklus eintreten.
Ruhende Zellen, welche im G0-Zustand festgehalten werden, sind diploid. Der G0- Zustand ist jener Punkt im Zellzyklus, von welchem Zellen in der Lage sind, sich zu differenzieren. Nach dem Ruhezustand wurde eine Reihe von Stoffwechseländerungen beobachtet und diese umfassen: monophosphorylierte Histone, ciliierte Centriolen, Reduktion oder vollständiges Einstellen der gesamten Proteinsynthese, erhöhte Proteolyse, Abnahme der Transcription und erhöhter Umschlag von RNA, was zu einer Reduktion der gesamten Zell-RNA führt, Aufschließung von Polyribosomen, Anhäufung inaktiver 80S-Ribosomen und Chromatinkondensation (siehe Whitfield et al., Control of Animal Cell Proliferation, 1 331-365 (1985)).
Viele dieser Merkmale sind jene, welche nach dem Transfer eines Nucleus zu einer entkernten Oocyte auftreten müssen. Die Tatsache, daß der G0-Zustand mit Zelldifferenzierung in Zusammenhang steht, läßt darauf schließen, daß dies eine Kern/Chromatin-Struktur schaffen kann, welche entweder für das Neumodellieren und/oder Neuprogrammieren durch das Empfängerzellencytoplasma zugänglich ist. Auf diese Weise kann, da sich die Kernspenderzellen im ruhenden Zustand befinden, das Chromatin der Kerne der Spender vor der Embryorekonstituierung oder -rekonstruktion modifiziert werden, derart, daß die Kerne zu direkter Entwicklung befähigt sind. Dies unterscheidet sich von allen zuvor bekanntgemachten Verfahren des Kerntransfers insofern, als das Chromatin von Spenderzellen vor der Verwendung der Zellen als Kernspender modifiziert wird.
Die Empfängerzelle, zu welcher der Nucleus von der Spenderzelle transferiert wird, kann eine Oocyte oder eine andere geeignete Zelle sein.
Empfängerzellen in einer Vielfalt unterschiedlicher Entwicklungsstadien können verwendet werden, von Oocyten in Metaphase I bis Metaphase II, zu Zygoten und Zweizellen- Embryos. Jedes hat seine Vor- und Nachteile. Die Verwendung befruchteter Eier gewährleistet die effiziente Aktivierung, wohingegen bei Oocyten parthenogenetische Aktivierung erforderlich ist (siehe unten). Ein weiterer Mechanismus, welcher die Verwendung von Embryos im Spaltungsstadium bei einigen Spezies begünstigt, ist das Ausmaß, in welchem ein Neuprogrammieren der Genexpression erforderlich ist. Die Transcription wird bei Mäusen während des zweiten Zellzyklus eingeleitet, und zweidimensionale Elektrophorese enthüllt bis zum Blastocystenstadium keine größeren Änderungen des Wesens der synthetisiert werdenden Proteine (Howlett & Bolton, J. Embryol. Exp. Morphol. 87 175-206 (1985)). In den meisten Fällen sind die Empfängerzellen jedoch Oocyten.
Vorzugsweise ist der Empfänger entkernt. Während allgemein angenommen wurde, daß die Entkernung von Empfängeroocyten in Kerntransfervorgängen wesentlich ist, liegt keine veröffentlichte experimentelle Bestätigung für diese Ansicht vor: Das ursprüngliche Verfahren, welches für Huftiere beschrieben wurde, sah unter anderem das Spalten der Zelle in zwei Hälften vor, von denen eine mit großer Wahrscheinlichkeit entkernt sein würde (Willadsen, Nature 320 (6) 63-65 (1986)). Dieser Vorgang weist den Nachteil auf, daß die andere unbekannte Hälfte noch immer den Metaphasenapparat aufweist und daß die mengenmäßige Reduktion des Cytoplasmas das Schema der Differenzierung des neuen Embryos mutmaßlich beschleunigt (Eviskov et al., Development 109 322-328 (1990)).
Vor kurzer Zeit wurden im Bemühen, die Chromosomen mit einem Minimum an Cytoplasma zu entfernen, verschiedene Verfahren verwendet. Das Absaugen des ersten Polkörperchens und des benachbarten Cytoplasmas entfernte nachweislich den Metaphase-II- Apparat in 67% von Schafoocyten (Smith & Wilmut, Biol. Reprod. 40 1027-1035 (1989)). Nur mittels Verwendung von DNA-spezifischem Fluorochrom (Hoechst 33342) wurde ein Verfahren geschaffen, durch welches ein Entkernen mit minimaler Reduktion in cytoplasmischem Volumen gewährleistet würde (Tsunoda et al., J. Reprod. Fertil. 82 173 (1988)). Bei Nutzvieharten ist dies wahrscheinlich das zur Zeit routinemäßig verwendete Verfahren (Prather & First, J. Reprod. FertilJ Suppl. 41 125 (1990), Westhusin et al., Biol. Reprod. (Suppl.) 42 176 (1990)).
Es liegen nur äußerst wenige Berichte über nichtinvasive Methoden zur Entkernung bei Säugetieren vor, wohingegen bei Amphibien die Bestrahlung mit ultraviolettem Licht als routinemäßiges Verfahren verwendet wird (Gurdon, Q. J. Microsc. Soc. 101 299-311 (1960)). Es liegen keine detaillierten Berichte über die Verwendung dieser Lösung bei Säugetieren vor, wenngleich während der Verwendung von DNA-spezifischem Fluorochrom festgestellt wurde, daß ein Bestrahlen von Mausoocyten mit ultraviolettem Licht während eines länger als 30 Sekunden dauernden Zeitraums das Entwicklungspotential der Zelle reduzierte (Tsunoda et al., J. Reprod. Fertil. 82 173 (1988)).
Vorzugsweise sind Empfängerwirtszellen, zu welchen der Spenderzellkern transferiert wird, eine entkernte Metaphase-II-Oocyte, eine entkernte nichtaktivierte Oocyte oder eine entkernte präaktivierte Oocyte. Zumindest in Fällen, in denen der Empfänger eine entkernte Metaphase-II-Oocyte ist, kann die Aktivierung zum Zeitpunkt des Transfers erfolgen. Alternativ dazu kann zumindest in Fällen, in denen der Empfänger eine entkernte nichtaktivierte Metaphase-II-Oocyte ist, die Aktivierung hernach erfolgen. Wie oben beschrieben wird, kann die Entkernung körperlich erreicht werden, durch tatsächliches Entfernen des Kernes, des Vorkernes oder der Metaphasenplatte (je nach Empfängerzelle), oder fuinktionell, beispielsweise durch die Anwendung ultravioletter Strahlung oder eines anderen Entkernungseinflusses.
Drei geeignete Cytoplast(entkernte Oocyten)-Empfänger sind:
1. Der "MAGIC-Empfänger" (Metaphase Arrested G1/G0 Accetfng Cytoblast), welcher in unserer zum heutigen Tage eingereichten, gleichzeitig anhängigen PCT-Patentanmeldung Nr. PCT/GB96/02098 beschrieben wird (beansprucht Priorität von der GB 95 17779.6).
2. Der "GOAT" (G0/G1 Activation and Transfer) - eine MII(Metaphase-11)- Oocyte zum Zeitpunkt der Aktivierung (Campbell et al., Biol. Reprod. 49 933- 942 (1993)).
3. Der "Universal-Empfänger" (Campbell et al., Biol. Reprod. 649 933-942 (1993), Biol. Reprod. 50 1385-1393 (1994)).
Jeder dieser drei Empfänger würde zu normaler Ploidie führen, wenn Spenderkerne in G0 im rekonstruierten Embryo verwendet werden. Allerdings ließen jüngste Berichte darauf schließen, daß ein Teil der Kerne aus ruhenden Zellen nicht in der Lage ist, in die DNA- Synthesephase einzutreten, wenn sie in einem S-Phasen-Cytoplasma angeordnet werden, ohne einer Demontage der Kernhülle unterzogen zu werden (Leno & Munshi, J. Cell Biol. 127(1) 5-14 (1994)). Deshalb wird, wenngleich sich ein Anteil von Embryos entwickeln wird, wenn der "Universal-Empfänger" verwendet wird, postuliert, daß die Verwendung von MII-Oocyten, welche hohe Mengen von MPF (M-Phasen-Anregungsfaktor oder Reifungsanregungsfaktor) enthalten, als Cytoplastempfänger durch Verfahren 1 oder 2 zu einer größeren Häufigkeit von Entwicklung führen wird.
Sobald geeignete Spender- und Empfängerzellen gefunden wurden, ist es erforderlich, daß der Kern von ersterer zu letzterer transferiert wird. Am zweckmäßigsten ist es, den Kerntransfer mittels Fusion zu realisieren.
Drei bewährte Verfahren, welche zum Induzieren von Fusion verwendet wurden, sind:
(1) Behandeln von Zellen mit fusionsfördemden Chemikalien, beispielsweise Polyethylenglycol;
(2) die Verwendung von inaktiviertem Virus, beispielsweise Sendai-Virus; und
(3) die Verwendung elektrischer Stimulierung.
Zellen den fusionsfördernden Chemikalien wie Polyethylenglycol oder anderen Glycolen auszusetzen, ist ein Routineverfahren für die Fusion von somatischen Zellen, wurde jedoch in Zusammenhang mit Embryos nicht in großem Rahmen verwendet. Da Polyethylenglycol toxisch ist, ist es erforderlich, die Zellen einen möglichst kurzen Zeitraum lang damit in Kontakt zu bringen, und die Anforderung, die Chemikalie rasch entfernen zu können, setzt möglicherweise die Entfernung der Zona pellucida voraus (Kanka et al., Mol. Reprod. Dev. 29 110-116 (1991)). In Experimenten mit Mausembryos schafft inaktiviertes Sendai-Virus ein effizientes Mittel für die Fusion von Zellen aus Embryos im Spaltungsstadium (Graham, Wistar Inst. Symp. Monogr. 9 19 (1969)), mit dem zusätzlichen experimentellen Vorteil, daß die Aktivierung nicht induziert wird. Bei Huftieren wird Fusion gemeinhin durch dieselbe elektrische Stimulierung erreicht, welche verwendet wird, um parthogenetische Aktivierung zu induzieren (Willadsen, Nature 320 (6) 63-65 (1986), Prather et al., Biol. Reprod. 37 859-866 (1987)). Bei diesen Spezies induziert das Sendai- Virus eine Fusion in einem Teil von Fällen, ist jedoch für eine routinemäßige Anwendung nicht ausreichend zuverlässig (Willadsen, Nature 320 (6) 63-65 (1986)).
Während die Zell/Zell-Fusion ein bevorzugtes Verfahren zum Realisieren eines Kerntransfers ist, ist es nicht das einzige Verfahren, das verwendet werden kann. Andere geeignete Verfahren umfassen Mikroinjektion (Ritchie und Campbell, J. Reproduction and Fertility Abstract Series Nr. 15, S. 60).
Vor oder (vorzugsweise) nach dem Kerntransfer (oder in einigen Fällen zumindest gleichzeitig damit) ist es im allgemeinen erforderlich, die Empfängerzelle durch parthenogenetische Aktivierung zu Entwicklung zu stimulieren, zumindest wenn die Zelle eine Oocyte ist. Jüngste Experimente haben gezeigt, daß die Anforderungen für eine parthogenetische Aktivierung komplizierter als angenommen sind. Es war angenommen worden, daß die Aktivierung ein Alles-oder-Nichts-Phänomen sei und die große Anzahl von Behandlungen, welche in der Lage sind, die Bildung eines Vorkerns zu induzieren, allesamt eine "Aktivierung" bewirken würden. Allerdings ergab das Behandeln von Kaninchen-Oocyten mit wiederholten elektrischen Impulsen, daß nur die Auswahl einer geeigneten Reihe von Impulsen und Regelung des Ca²&spplus; in der Lage war, die Entwicklung von diploidisierten Oocyten bis zur Mitte der Trächtigkeit zu fördern (Ozil, Development 109 117-127 (1990)). Während der Befruchtung kommt es zu wiederholten, vorübergehenden Anstiegen der intrazellulären Calciumkonzentration (Cutbertson & Cobbold, Nature 316 541-542 (1985)), und es wird angenommen, daß elektrische Impulse analoge Anstiege der Calciumkonzentration verursachen. Es gibt Nachweise dafür, daß das Muster von vorübergehenden Calciumwerten je nach Spezies unterschiedlich ist, und es ist zu erwarten, daß das optimale Muster elektrischer Impulse auf ähnliche Weise schwankt. Bei Kaninchen beträgt der Zeitraum zwischen Impulsen ungefähr 4 Minuten (Ozil, Development 109 117-127 (1990)) und bei Mäusen 10 bis 20 Minuten (Cutbertson & Cobbold, Nature 316 541-542 (1985)), während für Kühe vorläufige Beobachtungen vorliegen, daß der Zeitraum ungefähr 20 bis 30 Minuten beträgt (Robl et al., in Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation (Seidel ed.), Colorado State University, 24-27 (1992)). Bei den meisten veröffentlichten Experimenten wurde die Aktivierung mit einem einzelnen elektrischen Impuls induziert, neue Beobachtungen lassen jedoch darauf schließen, daß der Teil von rekonstituierten Embryos, welche sich entwickeln, durch Behandlung mit mehreren Impulsen erhöht wird (Collas & Robl, Biol. Reprod. 43 877-884 (1990)). In jedem beliebigen individuellen Fall können routinemäßige Anpassungen vorgenommen werden, um die Anzahl von Impulsen, die Feldstärke und Dauer der Impulse und die Calciumkonzentration des Mediums zu optimieren.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen eines nichtmenschlichen Tieres vorgesehen, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Rekonstituieren eines nichtmenschlichen tierischen Embryos, wie oben beschrieben wird; und
(b) Bewirken, daß sich ein nichtmenschliches Tier aus dem Embryo bis zur Vollreife entwickelt; und
(c) wahlweises Züchten ausgehend von dem auf diese Weise hergestellten Tier.
Schritt (a) wurde oben im Detail beschrieben.
Der zweite Schritt, Schritt (b), im Verfahren dieses Aspekts der Erfindung dient dazu zu bewirken, daß sich ein nichtmenschliches Tier aus dem Embryo bis zur Vollreife entwickelt. Dies kann direkt oder indirekt erfolgen. Bei der direkten Entwicklung wird dem rekonstituierten Embryo aus Schritt (a) einfach gestattet, sich ohne weiteres Eingreifen über jenes hinaus, das eventuell erforderlich ist, um zu ermöglichen, daß die Entwicklung stattfindet, zu entwickeln. Bei der indirekten Entwicklung kann der Embryo jedoch weiter manipuliert werden, ehe es zu einer vollen Entwicklung kommt. Beispielsweise kann der Embryo gesplittet und die Zellen klonal expandiert werden, um die Ausbeute zu verbessern.
Alternativ oder zusätzlich dazu kann es möglich sein, mittels der vorliegenden Erfindung durch klonale Expansion von Spendern und/oder Verwendung des seriellen (Kern)Transfer-Verfahrens eine erhöhte Ausbeute lebensfähiger Embryos zu erreichen. Eine Einschränkung der gegenwärtig erreichten Blastocystenbildungsrate kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, daß ein Großteil der Embryos keine "Neuprogrammierung" durchführen (wenngleich eine akzeptable Anzahl dies tut). Falls dies der Fall ist, dann kann die Rate wie folgt gesteigert werden. Jeder Embryo, welcher sich selbst entwickelt, kann als ein Kernspender verwendet werden, beispielsweise im Morula- oder 32-64-Zellen-Stadium; alternativ dazu können innere Zellmassenzellen im Blastocystenstadium verwendet werden. Embryos, welche aus diesen nachfolgenden Transfers gewonnen werden, könnten selbst als potentielle Kernspender verwendet werden, um die Effizienz weiter zu steigern. Falls diese Embryos tatsächlich jene reflektieren, welche eine neuprogrammierte Genexpression aufweisen, und jene Kerne tatsächlich neuprogrammiert sind (was wahrscheinlich scheint), dann kann jeder sich entwickelnde Embryo durch die Effizienz des Kerntransferverfahrens auf diese Weise vermehrt werden. Der Grad der Steigerung, der wahrscheinlich erzielt wird, hängt vom Zelltyp ab. Bei Schafen ist es ohne weiteres möglich, Embryos im 55% Blastocystenstadium durch den Transfer einer einzigen Blastomere von einem 16-Zellen-Embryo zu einer präaktivierten "Universal-Empfänger"-Oocyte zu erhalten. Demnach ist es angemessen, die Hypothese aufzustellen, daß jeder aus einer einzigen Zelle entwickelte Embryo im 16-Zellen- Stadium acht herbeiführen könnte. Wenngleich diese Zahlenwerte nur einen ungefähren Anhaltspunkt darstellen, steht fest, daß in späteren Entwicklungsstadien das Ausmaß des Nutzens von der Effizienz des Verfahrens in jenem Stadium abhängen würde.
Es wird auch in Erwägung gezogen, daß eine neue Zellinie, welche als Quelle von Kernspenderzellen dienen soll, aus nichtmenschlichen tierischen Embryos, welche gemäß der vorhergehenden Beschreibung gebildet werden, oder den resultierenden Föten oder Erwachsenen erzeugt werden könnte.
In bestimmten Fällen, in denen Einschränkungen in der Entwicklung eines rekonstruierten Embryos bis zur Vollreife vorliegen könnten, kann es bevorzugt sein, ein chimäres nichtmenschliches Tier zu erzeugen, welches aus Zellen gebildet wird, die aus einem natürlich gebildeten Embryo und einem Embryo, welcher durch Kerntransfer rekonstruiert wird, gewonnen werden. Eine derartige Chimäre kann durch Verwenden eines Teiles von Zellen des natürlichen Embryos und eines Teiles der Zellen des rekonstruierten Embryos in jedem beliebigen Stadium bis zum Blastocystenstadium und Bilden eines neuen Embryos durch Zusammenschluß oder Injektion gebildet werden. Der Anteil von Zellen, kann im Verhältnis von 50 : 50 oder einem anderen geeigneten Verhältnis, um die Bildung eines sich bis zur Vollreife entwickelnden Embryos zu erreichen, vorliegen. Es wird vermutet, daß das Vorhandensein normaler Zellen unter diesen Umständen beim Retten des rekonstruierten Embryos mitwirkt und die erfolgreiche Entwicklung bis zur Vollreife und eine Lebendgeburt ermöglicht.
Abgesehen vom Thema ausbeuteverbessernder Zweckdienlichkeiten, kann der rekonstituierte Embryo in Kultur gehalten werden, in vivo oder in vitro, bis zur Blastocyste.
Die Erfahrung legt nahe, daß durch Kerntransfer erhaltene Embryos sich von normalen Embryos unterscheiden und mitunter von in-vivo-Kulturbedingungen profitieren oder diese sogar erfordern, welche sich von jenen unterscheiden, in welchen Embryos für gewöhnlich in Kultur gehalten werden (zumindest in vivo). Der Grund dafür ist nicht bekannt. Bei der routinemäßigen Vermehrung von Rinder-Embryos wurden rekonstituierte Embryos (viele davon zugleich) 5 bis 6 Tage lang in Schafeileitern in Kultur gehalten (wie von Willadsen, In Mammalian Egg Transfer (Adams, E. E., ed.) 185 CRC Press, Boca Raton, Florida (1982) beschrieben wird). Bei der Realisierung der vorliegenden Erfindung sollte der Embryo jedoch, um ihn zu schützen, vor dem Transfer vorzugsweise in einem Schutzmedium wie beispielsweise Agar-Agar eingebettet werden und daraufhin nach der Rückgewinnung aus dem temporären Empfänger aus dem Agar-Agar herausseziert werden. Die Funktion des Schutz-Agars oder eines anderen Mediums ist eine zweifache: erstens dient es als strukturelle Hilfe für den Embryo durch Zusammenhalten der Zona pellucida; und zweitens dient es als Barriere gegenüber Zellen des Immunsystems des Empfängertieres. Wenngleich dieser Lösungsansatz den Anteil an Embryos, welche Blastocysten bilden, erhöht, besteht hier der Nachteil, daß eine Reihe von Embryos verloren gehen könnte.
Bei der Verwendung von in vitro-Bedingungen sind jene, die für gewöhnlich im Stand der Technik verwendet werden, durchaus annehmbar.
Im Blastocystenstadium kann der Embryo auf die Eignung für Entwicklung bis zur Vollreife gescreent werden. Typischerweise wird dies in Fällen durchgeführt, in denen der Embryo transgen ist und Screening und Selektion auf stabile Integranten erfolgte. In diesem Stadium kann auch Screening auf nichttransgene genetische Marker erfolgen. Da allerdings das Verfahren der Erfindung das Screening von Spendern in einem früheren Stadium ermöglicht, wird dies im allgemeinen bevorzugt.
Nach dem Screening wird, falls Screening stattgefunden hat, ermöglicht, daß sich der Blastocystenembryo bis zur Vollreife entwickelt. Dies erfolgt im allgemeinen in vivo. Falls die Entwicklung bis zum Blastocystenstadium in vitro stattfand, dann erfolgt in diesem Stadium der Transfer in das Endempfängertier. Falls die Blastocystenentwicklung in vivo erfolgte, wenngleich im Prinzip ermöglicht werden kann, daß sich die Blastocyste im Prä- Blastocysten-Wirt bis zur Vollreife entwickelt, wird in der Praxis die Blastocyste für gewöhnlich aus dem (temporären) Prä-Blastocystenempfänger entfernt und nach Heraussezieren aus dem Schutzmedium zum (permanenten) Post-Blastocystenempfänger übertragen.
Im optionalen Schritt (c) dieses Aspekts der Erfindung können Tiere aus dem nichtmenschlichen Tier, welches durch die vorhergehenden Schritte hergestellt wurde, gezüchtet werden. Auf diese Weise kann ein Tier verwendet werden, um eine Herde oder Schar von Tieren mit der(den) gewünschten genetischen Eigenschaft(en) zu schaffen.
Nichtmenschliche Tiere, welche durch Transfer von Kernen aus einer Quelle genetisch identer Zellen hergestellt wurden, haben denselben Kern gemeinsam, sind jedoch nicht vollkommen ident, da sie von unterschiedlichen Oocyten herstammen. Die Bedeutung dieser unterschiedlichen Herkunft ist nicht klar, kann jedoch kommerzielle Merkmale beeinflussen. Jüngste Analysen der Mitochondrien-DNA von Milchkühen bei der Zuchtherde der Iowa State University ergaben im Zusammenhang mit der Milch- und Fortpflanzungsleistung (Freeman & Beitz, In Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation (Seidel, G.E.Jr., ed.) 17-20, Colorado State University, Colorado (1992)). Es muß noch bestätigt werden, daß ähnliche Wirkungen in der gesamten Viehpopulation auftreten, und es muß noch überlegt werden, ob es in bestimmten Situationen möglich oder erforderlich ist, die Selektion von Oocyten zu berücksichtigen. Im Bereich der Viehzucht kann die Fähigkeit, große Mengen von Embryos aus Spendern von hoher genetischer Qualität zu erzeugen, einen beträchtlichen potentiellen Wert beim Verbreiten von genetischer Verbesserung in der gesamten nationalen Herde aufweisen. Die größenmäßige Auslegung einer Anwendung wird von den Kosten jedes einzelnen Embryos und dem Anteil transferierter Embryos, welche in der Lage sind, sich bis zur Vollreife zu entwickeln, abhängen.
Durch Veranschaulichung und Zusammenfassung legt folgendes Schema nun ein typisches Verfahren dar, durch welches nichtmenschliche transgene und nichtmenschliche nichttransgene Tiere hergestellt werden können. Das Verfahren kann als sieben Schritte umfassend betrachtet werden:
(1) Selektion und Isolation geeigneter Spenderzellen, was eine Karyotyp-Bewertung, ein Herbeiführen des Ruhezustandes (Festhalten in G0) und/oder ein Herbeiführen von Entwicklung umfassen könnte;
(2) Anwendung geeigneter molekularbiologischer Methoden zur Erzeugung genetisch modifizierter Zellpopulationen. Zu derartigen Methoden können gehören: Genadditionen, Gen-Knockouts, Gen-Knockins und andere Genmodifikationen. Optional kann auch Transgenese mittels Transfektion mit geeigneten Konstrukten, mit oder ohne selektierbare Marker, verwendet werden;
(3) Optionales Screening und Selektieren modifizierter Zellpopulationen oder Klone für den erforderlichen Genotyp/Phänotyp (d. h. stabile Integranten);
(4) Herbeiführen des Ruhezustands in modifizierter Zellpopulation;
(5) Embryorekonstituierung durch Kerntransfer;
(6) Kultur, in vivo oder in vitro, bis zur Blastocyste;
(6a) Optionales Screening und Selektieren auf stabile Integranten - ist wegzulassen, falls es bereits bei (3) erfolgte - oder auf andere gewünschte Eigenschaften;
(7) falls erforderlich, Transfer zu Endempfänger.
Die bevorzugten Merkmale für jeden Aspekt der Erfindung entsprechen mutatis mutandis jeweils denjenigen für jeden anderen Aspekt.
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr durch Bezugnahme auf die beiliegenden Beispiele beschrieben, welche zu Zwecken der Veranschaulichung vorgesehen werden und nicht als die vorliegende Erfindung einschränkend ausgelegt werden dürfen.

BEISPIELE

Beispiel 1: Herbeiführen des Ruhezustands in Spenderzellen

Für verschiedene Verfahren wurde nachgewiesen, daß sie den Ruhezustand in Zelllinien, die in Kultur gehalten werden, herbeiführen, umfassend; Kontaktinhibition oder Serumstarvation (siehe Whitfield et al., Control of Animal Cell Proliferation, 1 331-365 (1985)). Es wird angenommen, daß das Verfahren zum Herbeiführen des Ruhezustands nicht von Bedeutung ist, wobei der wichtige Schritt darin besteht, daß die Zellen den Wachstumszyklus verlassen, in einem G0-Zustand mit einem diploiden DNA-Gehalt verharren und lebensfähig bleiben. In Beispiel 3 und 4 wurde Serumstarvation von primären Rinderfibroblasten, einer Rinder-Zellinie, welche aus der inneren Zellmasse von in vivo produzierten Tag-7 Blastocysten etabliert wurde, und einer embryoderivierten Schafzellinie (TNT4) verwendet, um den Ruhezustand herbeizuführen und die Zellen in der G0-Phase des Zellzyklus festzuhalten. Auf ähnliche Weise wurde Serumstarvation verwendet, um den Ruhezustand der in Beispiel 5 beschriebenen Spenderzellen herbeizuführen.

Beispiel 2: Isolation von Oocyten und Kerntransfer

Oocyten können durch (i) in vitro-Reifung von Schlachthausmaterial oder aus transvaginaler Follikelpunktion; (ii) in vivo-Reifung und chirurgische Gewinnung; oder (iii) jedwedes andere geeignete Verfahren gewonnen werden. Alle in vivo gereiften Oocyten sollten durch Spülen aus dem Eileiter in calciummagnesiumfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 1,0% fötales Kälberserum (FCS), geerntet werden. Oocyten, die in vitro gereift sind, werden geerntet und zu calcitunfreiem M2 (Whittingham and Wales Aust. J. Biol. Sci. 22 1065-1068 (1969)), welches 1,0% FCS enthält, transferiert. Die Oocyten werden von Cumulus-Zellen befreit und wie zuvor beschrieben entkernt (Campbell et al., Biol. Reprod. 49 933-942 (1993) und Biol. Reprod. 50 1385-1393 (1994)), mit der Ausnahme, daß calciumfreies Medium für alle Verfahren verwendet wird. Die Fusionsverfahren sind Modifikationen der zuvor bekanntgemachten (Campbell et al., 1993, 1994, am angegebenen Ort) und verhalten sich wie im zugehörigen Abschnitt weiter unten beschrieben ist, wobei der Nucleus alternativ dazu durch Injektion der Spenderzelle in die entkernte Oocyte eingeführt werden kann (Ritchie & Campbell, J. Reprod. Fertil. Abstract Series (5) 60 (1995)). Der zeitliche Ablauf dieser Ereignisse hängt von der Spezies ab, wobei die folgenden beiden Protokolle die Verwendung von in vivo gereiften Schaf- und in vitro gereiften Rinder-Oocyten umrißweise beschreiben.

Beispiel 3: Schafkerntransfer

3.1 Superstimulierung von Spendermutterschafen und Gewinnung von Oocyten

Schottische Blackface-Mutterschafe wurden 14 Tage lang mit Progestagenschwämmen synchronisiert (VeramixTM, Upjohn, GB) und mit einzelnen Injektionen mit 3,0mg/Tag (insgesamt 6,0mg) von follikelstimulierenden Schaihormon (FSH) (OvagenTM, Immuno-chemical Products Ltd., Neuseeland) an zwei aufeinanderfolgenden Tagen dazu gebracht, zu superovulieren. Die Ovulation wurde mit einer Smg Einzeldosis eines Gonadotropin-freisetzenden Hormonanalogs (GnRH ReceptalTM, Hoechst, GB) 24 Stunden nach der zweiten FSH-Injektion induziert.
Unbefruchtete Metaphase-II-Oocyten wurden durch Spülen aus dem Eileiter 24-29 Stunden nach der GnRH-Injektion unter Verwendung von Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung, welche 1,0% fötales Kälberserum (FCS) enthielt, das bis zum Gebrauch auf 37ºC gehalten wurde, rückgewonnen.

3.2 Oocytenmanipulation

Die rückgewonnenen Oocyten wurden auf 37ºC gehalten, in PBS, 1,0% FCS, gewaschen und zu calciumfreiem M2-Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum (FCS), auf 37ºC transferiert. Um die Chromosomen zu entfernen, wurden (Entkernungs-)Oocyten bei 37ºC 20 Minuten lang in calciumfreies M2 gegeben, welches 10% FCS, 7,5 p.g/ml Cytochalasin B (Sigma) und 5,0ug/ml Hoechst 33342 (Sigma) enthielt. Eine kleine Menge von Cytoplasma von direkt unter dem 1. Polkörperchen wurde daraufhin mittels einer 20uM-Glaspipette abgesaugt. Die Entkernung wurde durch Bestrahlen des abgesaugten Abschnittes von Cytoplasma mit UV-Licht und Prüfen auf die Gegenwart einer Metaphasenplatte bestätigt.

3.3 Embryorekonstruktion

Gruppen von 10-20 Oocyten wurden entkernt und in 20 ul-Tropfen von calciumfreiem M2-Medium bei 37ºC 5% CO&sub2; unter Mineralöl (SIGMA) gegeben. Jedes der folgenden drei Protokolle (a), (b) und (c) wurde zur Embryorekonstruktion verwendet.

(a) "MAGIC" (Metaphase Arrested G1/G0 Accepting Cytoplast)

Möglichst bald nach der Entkernung wurde eine einzelne Zelle in Kontakt mit der Oocyte gebracht, durch Verwendung einer Glaspipette, um die Zelle durch das zuvor in der Zona pellucida eingebrachte Loch zu transferieren. Das Cytoplast/Zellen-Couplet wurde daraufhin in die Fusionskammer in 200 ul von 0,3M Mannitol in destilliertem Wasser transferiert und händisch zwischen den Elektroden ausgerichtet. Ein 5 V-Wechselstromimpuls wurde 3 Sekunden lang angelegt; gefolgt von 3 1,25 kV/cm-Gleichstrom-Impulsen, 80usec lang. Die Couplets wurden daraufhin in calciumfreiem M2, 10% FCS, bei 37ºC gewaschen und in demselben Medium unter Öl bei 37ºC 5% CO&sub2; inkubiert. 30 Minuten vor der Aktivierung wurden die Couplets zu calciumfreiem M2-Medium, 10% FCS, welches 5mM Nocodazol enthielt, transferiert. Die Aktivierung wurde 32-34 Stunden nach der hCG-Injektion wie unten beschrieben induziert. Nach der Aktivierung wurden die rekonstruierten Zygoten in TC199-Medium (Gibco), 10% FCS, bei 37ºC 5% CO&sub2; weitere 3 Stunden lang inkubiert. Daraufhin wurden sie 3 Mal 5 Minuten lang bei 37ºC in demselben Medium ohne Nocodazol gewaschen und weitere 12-15 Stunden in Kultur gehalten, ehe sie zu temporären Empfänger-Mutterschafen transferiert wurden.

(b) "GOAT" (G0/G1-Aktivierung und -Transfer)

32-34 nach der hCG-Injektion wurde eine einzelne Zelle in Kontakt mit der entkernten Oocyte gebracht. Das Couplet wurde zur Fusionskammer (siehe unten) transferiert, in 200 ul von 0,3M Mannitol, 0,1mM MgSO&sub4;, 0,001mM CaCl, in destilliertem Wasser. Fusion und Aktivierung wurden durch Anlegen eines 5 Sekunden dauernden 3 V-Wechselstromimpulses gefolgt von 3 80usec dauernden 1,25 kV/cm-Gleichstromimpulsen induziert. Die Couplets wurden daraufhin in TC199, 10% FCS, enthaltend 7,5 ug/ml Cytochalasin B. gewaschen und in diesem Medium 1 Stunde lang bei 37ºC 5% CO&sub2; inkubiert. Die Couplets wurden daraufhin in TC199 10% FCS gewaschen und weitere 12-15 Stunden lang in TC199, 10% FCS, bei 37ºC 5% CO&sub2; in Kultur gehalten.

(c) "UNI VERSAL-EMPFÄNGER"

Entkernte Oocyten wurden (wie unten beschrieben) 32-34 Stunden nach der hCG- Injektion aktiviert und daraufhin in TC199, 10% FCS, bei 37ºC 5% CO&sub2; 4-6 Stunden lang in Kultur gehalten. Eine einzelne Zelle wurde daraufhin in Kontakt mit der Oocyte gebracht, und Fusion wurde herbeigeführt, wie unten beschrieben wird. Daraufhin wurden die Couplets in TC199, 10% FCS, 7,5ug Cytochalasin B, 1 Stunde lang bei 37ºC 5% CO&sub2; inkubiert. Dann wurden die Couplets gewaschen und in TC199, 10% FCS, bei 37ºC 5% CO&sub2; weitere 8- 11 Stunden in Kultur gehalten.

3.4 Fusion und Aktivierung

Zur Aktivierung wurden Oocyten zwischen zwei parallelen Elektroden in 200 ul von 0,3M Mannitol, 0,1mM MgSO&sub4;, 0,001mM CaCl, in destilliertem Wasser angeordnet (Willadsen, Nature 320 63-65 (1986)). Die Aktivierung wurde durch Anlegen eines 80 us langen Gleichstrom-Impulses von 1,25 kV/cm herbeigeführt. Zur Fusion wurden manipulierte Embryos auf ähnliche Weise behandelt, wobei zusätzlich die Kontaktfläche zwischen der entkernten Oocyte und der Zelle parallel zu den Elektroden angeordnet wurde. Die Fusion wurde durch Anlegen eines 3 V-Wechselstroms 5 Sekunden lang, gefolgt von 3 Gleichstrom- Impulsen von 1,25 kV/cm 80 us lang, herbeigeführt.

3.5 Embryokultur und -bewertung (alle Gruppen)

Nach der Kulturphase wurden fusionierte Couplets in 1% und 1,5% Agar-Agar (DIFCO) in PBS doppelt eingebettet und zum abgebundenen Eileiter unsynchronisierter Mutterschafe transferiert. Das Couplet wird in Agar-Agar eingebettet, um die Immunabstoßung des Embryos durch das Empfängermutterschaf zu verhindern oder zu reduzieren und das Zusammenhalten des Couplets zu unterstützen. Nach 6 Tagen wurden die Empfängermutterschafe getötet und die Embryos durch Spülen aus dem Eileiter mittels PBS, 10% FCS, rückgewonnen. Die Embryos wurden aus den Agarstücken mittels 2 Nadeln herausgeschnitten, und die Entwicklung wurde anhand von Mikroskopie bewertet. Alle Embryos, welche sich bis zum MorulafBlastocysten-Stadium entwickelt hatten, wurden sobald wie möglich zum Uterushorn synchronisierter Endempfänger-Mutterschafe transferiert.
In vitro-Verfahren können sich auch an Stelle eines temporären Empfänger-Mutterschafs eignen, um eine Entwicklung des Embryos bis zum Blastocysten-Stadium zu erreichen.

Beispiel 4: Rinder-Kerntransfer

4.1 Oocytenreifung in vitro

Eierstöcke wurden von einem lokalen Schlachthofbezogen und während des Transports zum Labor auf 28-32ºC gehalten. Cumulus-Oocyten-Komplexe (COCs) wurden aus Follikeln, deren Durchmesser 3-10mm betrug, anhand einer Injektionsnadel (1,2 mm Innendurchmesser) abgesaugt und in sterile Kunststoffuniversalbehälter gelegt. Die Universalbehälter wurden in eine gewärmte Kammer (35ºC) gestellt, und dem Follikularmaterial wurde ermöglicht, sich 10-15 Minuten lang zu setzen, ehe drei Viertel des Überstandes weggeschüttet wurden. Das verbleibende Follikularmaterial wurde mit einem gleichen Volumen von Präpariermedium (TCM199 mit Earles-Salzen (Gibco), 75,0mg/l Kanamycin, 30,0mM Hepes, pH 7,4, Osmolarität 280m0smol/kg H,0), ergänzt mit 10% Rinderserum, verdünnt, in eine 85mm-Petrischale transferiert und unter einem Präpariermikroskop nach COCs abgesucht. Komplexe mit zumindest 2-3 kompakten Lagen von Cumuluszellen wurden selektiert, drei Mal in Präpariermedium gewaschen und in Reifungsmedium (TC-Medium199, mit Earles-Salzen (Gibco), 75mg/l Kanamycin, 30,0mM Hepes, 7,69mM NaHCO&sub3; pH 7,8, Osmolarität 280m0smol/kg H,0), ergänzt mit 10% Rinderserum und 1 · 10&sup6; Granulosa- Zellen/ml, transferiert und bis zum Bedarf auf einem Schwingtisch bei 39ºC in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; in Luft in Kultur gehalten.

4.2 Oocyten-Manipulation

Gereifte Oocyten wurden 18 Stunden nach dem Beginn der Reifung von Cumuluszellen befreit. Die befreiten Oocyten wurden dann in calciumfreiem M2-Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum (FCS), gewaschen und in diesem Medium bei 37ºC gehalten. Um die Chromosomen zu entfernen, wurden (Entkernungs-)Oocyten bei 37ºC 20 Minuten lang in calciumfreies M2 gegeben, welches 10% FCS, 7,5ug/ml Cytochalasin B (Sigma) und 5,0ug/ml Hoechst 33342 (Sigma) enthielt. Eine kleine Menge von Cytoplasma von direkt unter dem 1. Polkörperchen wurde daraufhin mittels einer 20uM-Glaspipette abgesaugt. Die Entkernung wurde durch Bestrahlen des abgesaugten Abschnittes von Cytoplasma mit UV- Licht und Prüfen auf die Gegenwart einer Metaphasenplatte bestätigt.

4.3 Embryorekonstruktion

Daraufhin wurden entkernte Oocyten für jedes der folgenden drei Rekonstruktionsverfahren (a), (b) und (c) verwendet, wie unten im Detail beschrieben wird.

(a) "MAGIC") (Metaphase Arrested G1/G0 Accepting Cytoplast)

Möglichst bald nach der Entkernung wurden entkernte Oocyten in calciumfreiem M2, 10% FCS, bei 39ºC gehalten, eine einzelne Zelle wurde mit der Oocyte in Kontakt gebracht, durch Verwendung einer Glaspipette, um die Zelle durch das Loch, welches zuvor in die Zona pellucida eingebracht wurde, zu transferieren. Das Cytoplast/Zellen-Couplet wurde daraufhin in die Fusionskammer in 200 ul von 0,3M Mannitol in destilliertem Wasser transferiert. Das Couplet wurde händisch zwischen den Elektroden ausgerichtet. Ein 3 V-Wechselstromimpuls wurde 5 Sekunden lang angelegt, gefolgt von 3 Gleichstrom-Impulsen von 1,25 kV/cm, 8usec lang. Die Couplets wurde daraufhin in calciumfreiem M2, 10% FCS, bei 37ºC gewaschen und in demselben Medium unter Öl bei 37ºC 5% CO&sub2; inkubiert. 30 Minuten vor der Aktivierung wurden die Couplets zu calciumfreiem M2-Medium, 10% FCS, welches 5uM Nocodazol enthielt, transferiert. Die Aktivierung wurde wie unten beschrieben induziert, wobei nach der Aktivierung die rekonstruierten Zygoten in TC199-Medium, 10% FCS, bei 37ºC, 5% CO&sub2; weitere 3 Stunden lang inkubiert wurden. Daraufhin wurden sie 3 Mal 5 Minuten lang bei 37ºC in demselben Medium ohne Nocodazol gewaschen und weitere 12-15 Stunden lang in Kultur gehalten, ehe sie zu temporären Empfänger-Mutterschafen transferiert wurden (Mutterschafe stellen als temporärer Empfänger für den rekonstruierten Embryo eine weniger aufwendige Alternative dar).

(b) "GOAT" (G0/G1-Aktivierung und -Transfer)

Entkernte Oocyten wurden zum Reifungsmedium zurückgeführt. 30 oder 42 Stunden nach dem Beginn der Reifung wurde eine einzelne Zelle in Kontakt mit der entkernten Oocyte gebracht. Das Couplet wurde zur Fusionskammer (siehe unten) transferiert, in 20u1 von 0,3 Mannitol, 0,1mM MgSO&sub4;, 0,001mM CaCl&sub2; in destilliertem Wasser. Fusion und Aktivierung wurden durch Anlegen eines 5 Sekunden dauernden 3 V-Wechselstromimpulses, gefolgt von 3 80usec dauernden 1,25 kV/cm-Gleichstromimpulsen, induziert. Die Couplets wurden daraufhin in TC199, 10% FCS, gewaschen und bei 37ºC 5% CO&sub2; 15-20 Stunden (30hpm-Gruppe) oder 4-8 Stunden (42hpm-Gntppe) lang gewaschen [Die Abkürzung "hpm" wird standardmäßig für "Stunden nach der Reifung" verwendet].

(c) "UNIVERSAL-EMPFANGER"

Entkernte Oocyten wurden (wie unten beschrieben) 30 oder 42 Stunden nach Beginn der Reifung aktiviert und daraufhin in TC 199, 10% FCS, bei 37ºC 5% CO&sub2; 8-10 Stunden (30hpm-Gruppe) oder 4-6 Stunden (42hpm-Gruppe) lang in Kultur gehalten. Eine einzelne Zelle wurde daraufhin in Kontakt mit der Oocyte gebracht, und Fusion wurde herbeigeführt, wie unten beschrieben wird. Daraufhin wurden die Couplets in TC199, 10% FCS, weitere 12-16 Stunden (30hpm-Gruppe) oder 4-6 Stunden (42hpm-Gruppe) lang in Kultur gehalten.

4.4 Fusion und Aktivierung

Zur Aktivierung wurden Oocyten zwischen zwei parallelen Elektroden in 200 ul von 0,3M Mannitol, 0,1mM MgSO&sub4;, 0,001mM CaCI, in destilliertem Wasser angeordnet (Willadsen, Nature 320 63-65 (1986)). Die Aktivierung wurde durch Anlegen eines 80 us langen 1,25 kV/cm-Gleichstromimpulses herbeigeführt. Zur Fusion wurden manipulierte Embryos auf ähnliche Weise behandelt, wobei zusätzlich die Kontaktfläche zwischen der entkernten Oocyte und der Zelle parallel zu den Elektroden angeordnet wurde. Die Fusion wurde durch Anlegen eines 5 Sekunden langen 3 V-Wechselstroms, gefolgt von 3 80 us dauernden Gleichstromimpulsen mit 1,25 kV/cm, herbeigeführt.

4.5 Embryokultur und -bewertung (alle Gruppen)

Nach der Kulturphase wurden fusionierte Couplets in 1% und 1,5% Agar-Agar (DIFCO) in PBS doppelt eingebettet und zum abgebundenen Eileiter unsynchronisierter Mutterschafe transferiert (Mutterschafe stellen als temporärer Empfänger für den rekonstruierten Embryo eine weniger aufwendige Alternative dar). Das Couplet wird in Agar-Agar eingebettet, um die Immunabstoßung des Embryos durch das Empfängermutterschaf zu verhindern oder zu reduzieren und das Zusammenhalten des Couplets zu unterstützen. Nach 6 Tagen wurden Empfängermutterschafe getötet und die Embryos durch Spülen aus dem Eileiter mittels PBS, 10% FCS, wiedergewonnen. Die Embryos wurden aus den Agarstücken mittels 2 Nadeln herausgeschnitten, und die Entwicklung wurde anhand von Mikroskopie bewertet.
An Stelle eines temporären Empfänger-Mutterschafs können sich in vitro-Verfahren auch dazu eignen, eine Entwicklung des Embryos bis zum Blastocysten-Stadium zu erreichen.

Ergebnisse von Beispiel 3 (Schafzellen) und Beispiel 4 (Rinderzellen)

Die vorliegenden Methoden wurden auf die Embryorekonstruktion sowohl von Schafen als auch von Rindern angewandt. Derzeit wurden Embryos im Blastocystenstadium bei Rindern gewonnen; allerdings werden keine Transfers dieser Embryos zu Endempfängern durchgeführt. Bei Schafen wurden 7 Empfänger-Mutterschafe trächtig, was zur Geburt von 5 lebenden Lämmern (von denen 2 kurz nach der Geburt starben) führte. Die Resultate aus diesen Experimenten werden in den Tabellen 1-3 zusammengefaßt.
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Entwicklung bis zum Blastocystenstadium von Schafembryos, welche durch Verwendung ruhender TNT4-Zellpopulationen und 3 verschiedener Cytoplast-Empfänger rekonstruiert wurden. Rekonstruierte Embryos wurden im abgebundenen Eileiter eines temporären Empfänger-Mutterschafes bis Tag 7 nach der Rekonstruktion in Kultur gehalten. Die Resultate werden als Prozentsatz von Embryos im MorulalBlastocysten-Stadium bezogen auf die Gesamtanzahl rückgewonnener Embryos ausgedrückt. TABELLE 1
Tabelle 2 zeigt die Resultate des Herbeiführens der Trächtigkeit nach dem Transfer aller rekonstruierten Embryos im Morulaßlastocysten-Stadium zum Uterushorn synchronisierter Endempfänger-Blackface-Mutterschafe. Die Tabelle zeigt die Gesamtanzahl von Embryos von jeder Gruppe, welche übertragen wurden, und die Häufigkeit der Trächtigkeit bezogen auf Mutterschafe und Embryos (in der Mehrzahl der Fälle wurden 2 Embryos zu jedem Mutterschafübertragen). Eine einzige Doppelträchtigkeit wurde durch Verwendung des "MAGIC"-Cytoplasts etabliert. TABELLE 2
Tabelle 3 zeigt das Ergebnis der etablierten Trächtigkeiten nach dem Transfer von Embryos im Morulaßlastocysten-Stadium zu Endempfänger-Mutterschafen. TABELLE 3

Beispiel 5: Schafkerntransfer und Embryorekonstruktion durch Verwendung von OME-, BLWF1- und SEC1-Zellen

Kerntransfer wurde durch Verwendung von drei neuen Zelltypen durchgeführt, welche als OME, BLWFI und SEC1 bezeichnet werden. OME (Schafbrustepithel)-Zellen sind eine Epithelzellinie, welche aus einer Biopsie, die von der Brustdrüse eines erwachsenen 6 Jahre alten Fin-Dorset-Mutterschafes entnommen wurde, anhand des Verfahrens nach Finch et al. (Biochem. Soc. Trans. 24 3695 (1996) etabliert wurde. BLWF1(Black Welsh Fibroblast)-Zellen sind eine Fibroblastenzellinie, welche durch Sezieren und Kultur eines Tag-26 Black Welsh-Fötus erhalten wurde, welcher durch natürliche Paarung eines Black Welsh- Mutterschafs mit einem Black Welsh-Widder erhalten wurde. Das Verfahren des Isolierens primärer fötaler Fibroblasten entsprach dem von Roberson, E. J., in Teratocaricomas and embryonic stem cells: A practical approach, 71-112, IRL Press Oxford (1987). SEC1 (Schafembryonalzelle) sind eine epithelartige Zellinie, welche von einem Tag 9 Embryo stammt, welcher von einem superovulierten und mit einem Pol-Dorset-Widder gepaarten Pol-Dorset-Mutterschafgewonnen wurde. Die SEC1-Zellen unterscheiden sich von den TNT-Zellen, welche in der gleichzeitig anhängigen PCT-Anmeldung Nr. PCT/GB95/02095, veröffentlicht als WO 96/07732, beschrieben wurden, aus den folgenden Gründen. Erstens ist die Morphologie der Zellen der beiden Zellinien völlig unterschiedlich und zweitens waren die Verfahren, welche zum Isolieren der Zellinien verwendet wurden, unterschiedlich. Die SEC1-Zellinie wurde aus einem einzelnen Embryo etabliert, während die TNT-Zellinien aus Gruppen von Zellen stammen.
Alle Zellinien wurden karyotypisiert und wiesen eine modale Chromosomenanzahl von 54 (2n) auf. Vor der Verwendung als Kernspender zur Embryorekonstruktion wurde das Herbeiführen der Ruhezustandes nach der Reduktion der Serumpegel auf 0,5% wie zuvor beschrieben überwacht (Campbell et. at., Nature 380 64-66 (1996)). Die Herstellung der rekonstruierten Embryos erfolgte, wie oben in den vorhergehenden Beispielen beschrieben wurde.
Tabelle 4 zeigt eine Übersicht über die Entwicklung von Kerntransferembryos, welche aus verschiedenen Zelltypen rekonstruiert wurden. Die Tabelle zeigt die Anzahl rekonstruierter Embryos, Entwicklung bis zum Blastocystenstadium und Anzahl von Trächtigkeiten für jeden der drei Zelltypen. Alle Zellinien wurden vor ihrer Verwendung für die Embryorekonstruktion karyotypisiert. Diese Zellinien wiesen eine modale Anzahl von 54 Chromosomen auf. Ein bis drei Embryos im Blastocystenstadium wurden zu jedem synchronisierten Endempfänger-Mutterschaftransferiert. Rekonstruierte Embryos, welche in vitro in Kultur gehalten wurden, wurden in 1 Ogl (4 Embryos) Tropfen von SOFM (synthetisches Eileiterflüssigkeitsmedium), enthaltend 10% Humanserum, gegeben und in einer befeuchteten Atmosphäre von S% O&sub2;, 5% CO&sub2; und 90% N&sub2; bei 39ºC in Kultur gehalten. Die in Kultur gehaltenen Embryos wurden alle zwei Tage zu frischem Medium transferiert. SOFM- Medium wurde gemäß Gardner et al., Biology of Reproduction 50 390-400 (1994) und Thompson et al., Biology of Reproduction 53 1385-1391 (1995) hergestellt.
Tabelle 5 zeigt die Kennzeichnung der Empfänger-Mutterschafe, welche am 24. Juni 1996 trächtig blieben, den zur Embryorekonstruktion verwendeten Zelltyp und das Ergebnis der Trächtigkeit. Trächtigkeiten wurden durch den Transfer von 1 bis 3 Embryos im Morula/Blastocysten-Stadium (am Tag 7 nach der Rekonstruktion) zu synchronisierten Endempfänger-Mutterschafen herbeigeführt. Einzelheiten zu den rekonstruierten Anzahlen werden in Tabelle 4 dargestellt. Die Abkürzungen bedeuten: PD = Pol-Dorset, BW = Black Welsh, FD = Fin-Dorset, '* = bis zum Blastocystenstadium in vitro in Kultur gehaltener Embryo. TABELLE 4 TABELLE 5

Claims

1. Verfahren zum Rekonstituieren eines nichtmenschlichen tierischen Embryos, wobei das Verfahren das Transferieren des Nucleus einer ruhenden diploiden Spenderzelle in eine passende Empfängerzelle enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Tier ein Säugetier ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem das Säugetier eine Kuh oder ein Bulle, ein Schwein, eine Ziege, ein Schaf, ein Kamel oder ein Wasserbüffel ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem das Tier ein Nagetier ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem das Nagetier eine Maus oder eine Ratte ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei welchem der Nucleus der Spenderzelle genetisch modifiziert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem der Nucleus der Spenderzelle vor der Rekonstituierung des Embryos genetisch modifiziert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei welchem die Empfängerzelle eine Oocyte ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei welchem die Oocyte eine entkernte Oocyte ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei welchem die Spenderzelle eine differenzierte Zelle ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei welchem die Spenderzelle eine erwachsene somatische Zelle ist.

12. Verfahren nach einem der Anprüche 1 bis 9, bei welchem die Spenderzelle eine Embryonenzelle ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei welchem die Embryonenzelle von einem gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 hergestellten Embryo gewonnen wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei welchem die Spenderzelle eine fötale somatische Zelle ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei welchem der Embryo ein Embryo im Blastocystenstadium ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei welchem der Nucleus der ruhenden Spenderzelle durch Zellfusion in die Empfängerzelle tranferiert wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 S. bei welchem der Nucleus der ruhenden Spenderzelle mittels einer Mikroinjektion transferiert wird.

18. Verfahren zur Erzielung eines nichtmenschlichen Tieres, wobei das Verfahren umfaßt:

a) Rekonstituierung eines nichtmenschlichen Tierembryos gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche

b) Bewirken, daß sich der Embryo zu einem nichtmenschlichen Tier entwickelt; und

c) Gegebenenfalls Züchten aus dem so erzielten nichtmenschlichen Tier.

19. Verfahren nach Anspruch 18, bei welchem der nichtmenschliche Tierembryo weiters durch Splitten des Embryos vor dessen vollständiger Entwicklung behandelt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 18, bei welchem mehr als ein nichtmenschliches Tier aus dem Embryo erhalten wird.

21. Verfahren zur Herstellung einer Zelle oder einer Zellinie, wobei das Verfahren die Rekonstituierung eines nichtmenschlichen Tierembryos nach einem der Ansprüche 1 bis 17 und verbreiten der Zellen aus dem Embryo durch Klonen umfaßt, um eine Zelle oder eine Zellinie zu erhalten.