CZ60898A3 - Populace buněk v klidovém stavu pro přenos jádra - Google Patents
Populace buněk v klidovém stavu pro přenos jádra Download PDFInfo
- Publication number
- CZ60898A3 CZ60898A3 CZ98608A CZ60898A CZ60898A3 CZ 60898 A3 CZ60898 A3 CZ 60898A3 CZ 98608 A CZ98608 A CZ 98608A CZ 60898 A CZ60898 A CZ 60898A CZ 60898 A3 CZ60898 A3 CZ 60898A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cell
- embryo
- animal
- cells
- donor
- Prior art date
Links
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 76
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 177
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 78
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 64
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 64
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 42
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 40
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 17
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 2
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 claims 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 claims 2
- 235000009430 Thespesia populnea Nutrition 0.000 claims 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 claims 1
- 244000309464 bull Species 0.000 claims 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 abstract description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 56
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 40
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 37
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 34
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 33
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 30
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 30
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 30
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 20
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 16
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 11
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 10
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 9
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 6
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 6
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 6
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 4
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 4
- KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N Nocodazole Chemical compound C1=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=CC=C1C(=O)C1=CC=CS1 KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 4
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 4
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 4
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 4
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 229950006344 nocodazole Drugs 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 4
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 3
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 3
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 3
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 3
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 2
- NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N GnRH Chemical compound C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000011961 Maturation-Promoting Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010075942 Maturation-Promoting Factor Proteins 0.000 description 2
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 2
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000625 blastula Anatomy 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 2
- 244000144980 herd Species 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 2
- 238000010449 nuclear transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241001550206 Colla Species 0.000 description 1
- 101100298295 Drosophila melanogaster flfl gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 241000289695 Eutheria Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 208000035752 Live birth Diseases 0.000 description 1
- 230000027311 M phase Effects 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- WAHQVRCNDCHDIB-QZYSPNBYSA-N [(3s,8r,9s,10r,13s,14s,17r)-17-acetyl-17-acetyloxy-6,10,13-trimethyl-1,2,3,8,9,11,12,14,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-3-yl] 3-cyclopentylpropanoate Chemical compound O([C@@H]1C=C2C(C)=C[C@H]3[C@@H]4CC[C@]([C@]4(CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)(OC(=O)C)C(C)=O)C(=O)CCC1CCCC1 WAHQVRCNDCHDIB-QZYSPNBYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000004718 centriole Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000010428 chromatin condensation Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 210000001647 gastrula Anatomy 0.000 description 1
- 238000012246 gene addition Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical class C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000027291 mitotic cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 230000001776 parthenogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
- C12N15/8771—Bovine embryos
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
- C12N15/8773—Ovine embryos
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
Description
(57) Anotace:
Způsob rekonstituce zvířecího embrya zahrnuje přenos jádra z dárcovské buňky v klidovém stavu do vhodné přijímací buňky.Dárcovské buňky jsou v klidovém stavu v tom smyslu, že byl způsoben jejich přechod z buněčného cyklu růstu a dělení ve fázi G1 a jejich uzavření ve fázi G0. Přenos jádra může nastat buněčnou fúzí. Rekonstituované embryo může dát vznik jednomu nebo více zvířatům. Vynález je použitelný pro produkci transgenních zvířat stejně tak jako pro produkci netransgenních zvířat s velkou genetickou hodnotou.
JUDr. Miloš Všetečka advokát
120 00 Praha 2, Hálkova 2 ·· 4444 4« 44 44 44 — »1 «- ·· · ·«·· • · · · · · · ···· « * · · · · ··· ···· · ·· ···· ·· ··
Populace buněk v klidovém stavu pro přenos jádra
Oblast techniky
Tento vynález se týká vytváření zvířat, která zahrnují, aniž by tím byly omezeny, geneticky vybraná a/nebo modifikovaná zvířata.
Dosavadní stav techniky
Rekonstrukce savčích embryí přenosem jádra z dárcovského embrya do enukleovaného oocytu nebo do jednobuněčné zygoty dovoluje vytváření geneticky identických individuí. To představuje jasnou výhodu jak pro výzkum (jako biologické kontrolní vzorky), tak i pro komerční aplikace (multiplikace geneticky cenného dobytka, uniformita produkce masa, řízení chovu zvířat). Problém spojený s použitím embryí v počátečních fázích jako dárců jádra spočívá v tom, že potomstvo, které může být produkováno z jednoho embrya je omezeno jak počtem buněk (u hospodářských druhů zvířat jsou nejčastěji používána embrya ve fázi o 32-64 buňkách), tak i účinností protokolu přenosu jádra.
V kontrastu s použitím embryí jako dárců jádra je cílem, který byl hledán po jistou dobu pěstiteli dobytka, schopnost produkovat živé potomstvo přenosem jádra z buněk, které mohou být uchovávány v kultuře. Možnost produkovat klonované potomstvo z kultivované buněčné linie by měla řadu výhod ve • · · A
- 2 • · · · « Α A A
AAA * · · · · ·· A · · · · · ·
A A AA A A A AAAA A
A A · · · 9 9 9
AAAA A AA AtAA AA ®A srovnání s použitím embryí v rané fázi vývoje. Mezi tyto výhody patří: produkce velkého množství identického potomstva po dlouhou dobu (kultivované buňky mohou být zmrazený a uchovávány) a možnost geneticky modifikovat a/nebo provádět selekci buněčných populací požadovaného genotypu (například pohlaví) před rekonstrukcí embrya. Jeden z potenciálních buněčných typů pro použití v těchto procedurách jsou buňky typu Embryonic Stem (Embryonální Kmen) (ES) . ES buňky byly izolovány z myši, avšak dosud neexistuje žádná výzkumná zpráva o úplném vývoji zvířete, následujícím po použití ES buněk pro přenos jádra. V současné době je k disposici jediná zpráva o buňkách podobných ES buňkám u prasete, které přispěly k vývoji po injekci do blastulové dutiny u in vivo produkovaných blastocyst (Wheeler, Reprod. Fertil. Dev., 6, 563-568 (1994)), ale žádné výzkumné zprávy o chimérismu u jiných druhů hospodářských zvířat ani zprávy o úplném vývoji následujícím po přenosu jádra u kteréhokoli savčího druhu z jakékoli vytvořené buněčné linie.
Existuje několik alternativ k použití ES buněčných linií; jedna z nich je hledat další buněčné populace, které jsou schopny vyvolat vývoj, jestliže jsou používány při přenosu jádra. Několik výzkumných zpráv navrhlo, že „Primordial Germ Celíš by mohly být vhodným kandidátem; žádná zpráva o ukončeném vývoji embrya však nebyla publikována. Byly také navrženy buněčné linie, pocházející z raných embryí; i když byl popsán vývoj z ranných stádií buněk u ovce (Campbell a kol., Therio, 43, 181 (1995)) do pozdní kultury, žádného vývoje nebylo dosaženo použitím konvenčních protokolů • · · · · · • ·
- 3 přenosu jádra (Campbell a kol., J. Abstract Seríes (5 31(1995)).
Aby bylo dosaženo ukončeného vývoje po přenosu jádra, musí být vynulovány vývojové hodiny přeneseného jádra. Aby toho bylo dosaženo, transkripce musí být zastavena a potom znovu nastartována vývojově regulovaným způsobem. Předchozí výzkumné zprávy ukázaly, že vývoje do blastocystové etapy může být dosaženo u širokého spektra buněčných typů u krávy, ovce, prasete, králíka a myši. V těchto zprávách však nebyl popsán dokončený vývoj embrya. Bylo již popsáno narození živého jehněte, následující po přenosu jádra z primární buněčné linie (až po stádium 3 včetně), které byly získány z embryonálního disku (ED) devítidenních ovčích embryí (Campbell a kol., Therio, 43, 181 (1995)). Nicméně na následovně kultuře nebyl získán žádný ukončený vývoj použitím konvenčních protokolů přenosu jádra (Campbell a kol., J. Abstract Series (5) 31(1995)). Tyto výsledky mohou být interpretovány řadou způsobů; předně je možno postulovat, že všechny z buněk, odvozených z ED a získaných v průběhu ranných stadií kultury jsou schopny vyvolat vývoj. V déletrvající kultuře během vytvoření kultivované buněčné linie se tyto buňky změní a jsou tedy neschopné řídit vývoj, pokud jsou použity jako dárci jádra pro přenos jádra, popsaný výše, do buněk Universal Recipient. Alternativně může být postulováno, že v průběhu rané kultivační etapy si subpopulace buněk uchovávají schopnost vyvolat vývoj a že by to vysvětlovalo produkci živého potomstva po provedení přenosu jádra v průběhu těchto raných etap. Předchozí studie zdůrazňovaly roli koordinace buněčného cyklu dárcovského jádra a přijímající cytoplasmy ve vývoji embryí, ·· ····
• 4 rekonstruovaných přenosem jádra (Campbell a kol., Biol. Reprod. , 49, 933-942 (1993) a Biol. Reprod. , 50, 13851393)).
Dvě možné strategie, založené na isolaci buněčných linií, které jsou totipotentní pro přenos jádra využitím publikovaných protokolů přenosu jádra jsou:
(1) modifikovat existující procedury přenosu jádra; nebo (2) modifikovat chromatin dárcovské buňky před přenosem j ádra.
Totipotentní buňky mohou řídit vývoj celého zvířete (pokud je konstruováno přenosem jádra z dárcovské buňky do přijímající buňky, jako je enukleovaný oocyt, je to jádro dárcovské buňky, které je totipotentní). To zahrnuje směrování vývoje extra-embryoních linií, například placenty. V této definici je oplodněná zygota a u některých druhů individuální blastomery také totipotentní. Na rozdíl od toho pluripotentní nebo multipotentní typy buněk (například buňky embryonálního kmene) byly definovány jako typy buněk, které mohou vytvářet všechny tkáně zárodku/potomka po injekci do blastulové dutiny.
U obou strategií jaderného přenosu (1) a (2) naznačených výše je potřebná metoda, která by dovolila přeprogramování genu exprese přeneseného jádra: takováto metoda by dovolila použití diferencovaných nebo částečně diferencovaných buněk jako dárců jádra a vysvětlila by jejich inherentní totipotenci. Nyní bylo zjištěno, že buňky v klidovém stavu, neboli buňky, u nichž nedochází k aktivní proliferaci
• · prostřednictvím buněčného cyklu, mohou být výhodně použity jako dárci jádra při rekonstituci zvířecího embrya. Takové embryo potom může být ponecháno dokončit úplně svůj vývoj. Zdá se že změny v dárcovském jádru, které byly pozorovány po rekonstrukci embrya a které jsou požadovány pro účinný přenos jádra, mohou být indukovány v jádru buňky před jejím použitím jako dárce jádra způsobením přechodu buněk do klidového stavu. Tento fakt je využíván v předkládané přihlášce vynálezu.
Podstata vynálezu
První předmět vynálezu se týká způsobu rekonstituce zvířecího embrya, který zahrnuje přenos jádra dárce v klidovém stavu do vhodné přijímající buňky.
Vynález je v principu aplikovatelný na všechna zvířata, v to počítaje ptáky, jako je domestikovaná drůbež, dále druhy obojživelníků a ryb. V praxi však je v současné době spatřována oblast největší komerční využitelnosti vynálezu v aplikaci na zvířata, jiná než člověk, speciálně na savce, jiné než člověk, obzvláště placentální savce. Nejpravděpodobnější využití vynálezu se zdá být možné u kopytníků, především u ekonomicky významných kopytníků jako je kráva, ovce, kozy, bůvol, velbloudi a prasata a to jak jako prostředek pro klonování zvířat, tak i jako prostředek pro vytváření transgenních zvířat. Je nutné uvést, že použití vynálezu je pravděpodobné i v případě dalších ekonomicky významných zvířat, jako jsou například koně, lamy • · ··· ·
·* ·· ···· · · · · * · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · · • · · · ·· ·· ·· nebo hlodavci, například krysy nebo myši nebo králíci.
Vynález je také možno aplikovat při produkci transgenních stejně tak jako netransgenních zvířat. Transgenní zvířata mohou být produkována z geneticky změněných dárcovgkých buněk. Celá procedura má celou řadu výhod ve srovnání s konvenční procedurou transgenních (to jest geneticky modifikovaných) zvířat, které mohou být přehledně sumarizovány následujícím způsobem:
(1) je potřeba menšího počtu příjemců, (2) vícenásobní syngeničtí členové zakládající generace mohou být vytvořeni použitím klonových dárcovských buněk, (3) je umožněna drobná genetická změna genovým cílením, (4) všechna zvířata produkovaná podle tohoto vynálezu by měla přenášet odpovídající genetickou modifikaci zárodečnou linií, neboť každé zvíře je odvozeno z jediného jádra; na rozdíl od toho produkce transgenních zvířat prvojadernou injekcí nebo chimérismem po inklusi modifikovaného kmene buněčné populace blastocytovou injekcí produkuje část mozaikových zvířat, u nichž ne všechny buňky obsahují modifikaci a nemusí přenášet modifikaci zárodečnou linií; a (5) pro místo genetické modifikace (například integrace) mohou být buňky selektovány před vytvořením celého zvířete.
Je třeba uvést, že výraz transgenní ve vztahu ke zvířeti nesmí být chápán jako omezující ve smyslu popisu zvířat obsahujících v jejich zárodečné linii jeden nebo více genů • · · · 0 0 0 0 • · · 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 · · · 0 0 0 0 • · 0 0 0 0 0 0000 0 0 0 000 000 0000 0 00 0000 00 00 jiného druhu, ačkoliv mnoho transgenních zvířat skutečně obsahuje takový gen nebo geny. Uvedený výraz je třeba chápat širším způsobem jako vztahující se k jakémukoli zvířeti, jehož zárodečná linie byla podrobena technickému zákroku pomocí rekombinantní DNA technologie. Tak například zvíře, v jehož zárodečné linii byl vynechán, duplikován, aktivován nebo modifikován endogenní gen je transgenním zvířetem ve smyslu předkládaného vynálezu stejně tak jako zvíře, jehož zárodečná linie obsahuje přidanou exogenní DNA sekvenci.
V provedení předkládaného vynálezu, ve kterém se jedná o transgenní zvíře, je dárcovské jádro geneticky modifikováno. Dárcovské jádro může obsahovat jeden nebo více transgenů a genetická modifikace může být provedena před přenosem jádra a rekonstitucí embrya. Ačkoliv . může být jako metoda genetické modifikace použita mikroinjekce, která je analogická injekci do samčího nebo samičího prvojádra zygoty, vynález není omezen na tuto metodologii; mohou být použity také hromadné transformační nebo transfekční techniky, například elektroporace, virální transfekce nebo lipofekce.
Ve způsobu podle předkládaného vynálezu, který byl popsán výše, je jádro přeneseno z dárcovské buňky v klidovém stavu do přijímající buňky. Použití tohoto způsobu není omezeno na konkrétní typ dárcovské buňky. Všechny buňky normálního karyotypu, v to počítaje embryonální, zárodečné a dospělé somatické buňky, které mohou být převedeny do klidového stavu nebo existovat v klidovém stavu in vivo se mohou ukázat jako totipotentní použitím této technologie. Vynález se proto týká použití alespoň částečně diferencované buňky, • · · · 4 4 • · 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 • 4 4 4444 4
4 4 4 4
4444 44 44 v to počítaje i úplně diferencované buňky. Dárcovské buňky mohou, ale nemusí být v kultuře. Kultivované hovězí fibroblasty, z embrya odvozené ovčí buněčné linie (TNT4), buňky odvozené z ovčích epiteliálních buněk prsních žláz (OME) z 6 let staré dospělé ovce, fibroblastové buněčné linie odvozené ze zárodečné ovčí tkáně (BLWF1) a buněčné linie podobné epiteliálním buňkám odvozené od devítidenního ovčího embrya (SECI) jsou uvedeny dále v příkladové části. Třída buněčných linií, odvozených od embryí, které jsou použitelné ve způsobu podle předkládaného vynálezu, zahrnující TNT4 buněčné linie, je předmětem současně podávané PCT patentové přihlášky č. PCT/GB95/02095, publikované jako WO96/07732.
Aby mohly být použity podle vynálezu, dárcovské buňky jsou v klidovém stavu, což znamená, že nejsou aktivně proliferující prostřednictvím mitotického buněčného cyklu. Buněčný cyklus mitotické buňky má čtyři různé fáze, označené G, S, G2 a M. Počáteční událost v buněčném cyklu, nazývaná start, nastává v G1 fázi a má jednoznačně určenou funkci. Rozhodnutí nebo úmysl podstoupit další buněčný cykl je provedeno v okamžiku start. Jakmile buňka prošla etapou start, prochází zbytkem G1 fáze, což je fáze před syntézou DNA. Druhá fáze, nazývaná fáze S, je ta, ve které dochází k syntéze DNA. Ta je následována fází G2, což je časový interval mezi syntézou DNA a mitózou. K samotné mitóze dochází ve fázi M. Buňky v klidovém stavu (mezi něž patří jak buňky, u nichž byl klidový stav indukován, tak i buňky které se nacházejí v klidovém stavu přirozeně, j.ako jsou některé plně diferencované buňky) jsou obecně považovány za buňky, které nejsou v žádné ze čtyř fází buněčného cyklu; obvykle jsou • 4 4 9 4 4 4 · • · 4 «444 444« · «4 4 444«
4 9« 4 4 · «««« 4
4 44« «44
4994 4 99 9999 49 49 popisovány jako buňky ve stavu GO, což znamená, že nebudou normálně postupovat buněčným cyklem. Jádro GO buňky v klidovém stavu má diploidní DNA obsah.
Kultivované buňky mohou být indukovány k vstupu do klidového stavu různými metodami, které zahrnují chemické působení, nutriční deprivaci, inhibici růstu nebo manipulaci genové exprese. V současné době je pro indukci klidového stavu u ovčích a hovězích buněčných linií úspěšně používána redukce úrovní séra v kultivačním médiu. V této situaci buňky vystoupí z buněčného růstového cyklu v průběhu fáze G1 a zastaví se, jak bylo vysvětleno výše, v takzvané fázi GO. Takové buňky mohou zůstat v této fázi po několik dní (popřípadě i déle v závislosti na buňkách), dokud nedojde k opětovné stimulaci, která způsobí jejich opětný vstup do buněčného cyklu.
Buňky v klidovém stavu, uzavřené ve fázi GO, jsou diploidní. GO fáze je bod v buněčném cyklu, ve kterém jsou buňky schopny diferenciace. V klidovém stavu byla popsána řada metabolických změn, které zahrnují: monofosforylované histony, ciliované centrioly, redukce nebo úplné zastavení všech proteinových syntéz, zvýšená proteolýza, pokles transkripce a zvýšená přeměna RNA, která vede k poklesu celkové RNA buňky, disagregace polyribosomů, akumulace neaktivních 80S ribosomů a kondenzace chromatinu (viz Whitfield a kol., Control of Animal Cell Proliferation, 1, 331-365 (1985)) .
Mnoho z těchto událostí jsou ty, které by měly nastat po přenosu jádra do enukleovaného oocytů. Fakt, že stav GO je •9 9999
99 99 99
9 9 9 9 9 9 9999
- 1 η _ ·· ♦· 9 99··
-Τ V · · 99« 999999 9
9 999 999
9999 9 99 9999 99 99 asociován s buněčnou diferenciací naznačuje, že to může poskytovat strukturu jádra a chromatinu, která je více přístupná k přemodelování a/nebo přeprogramování cytoplasmop přijímající buňky. Tímto způsobem, to jest tím, že dárcovské buňky jádra jsou v klidovém stavu, může být chromatin jádra dárce modifikován před rekonstitucí nebo rekonstrukcí tak, že jádro je schopno přímého vývoje. Tento postup se odlišuje od všech dříve popsaných metod přenosu jádra v tom, že chromatin dárcovské buňky je modifikován před použitím buňky jako dárce jádra.
Přijímající buňka, do které je přeneseno jádro z dárcovské buňky, může být oocyt nebo jiná vhodná buňka.
Přijímající buňky mohou být v řadě různých vývojových etap, od oocytů v metafázi I až po oocyty v metafázi II, přes zygoty k dvoubuněčným embryím. Každá z těchto etap má své výhody a nevýhody. Použití oplodněných vajíček zajišťuje účinnou aktivaci, zatímco parthenogenetická aktivace je vyžadována u oocytů (viz níže). Jiný mechanismus, který může favorizovat použití embryí ve stádiu štěpení u některých druhů je rozsah, do kterého je požadováno přeprogramování exprese genu. Transkripce je inicializována v průběhu druhého buněčného cyklu u myši a dvoudimenzionální elektroforézou nebyly zjištěny žádné velké změny v povaze syntetizovaných proteinů až do blastocystové etapy (Howlett a Bolton, J. Embryol. Exp. Morphol., 87, 175-206 (1985)). Ve většině případů však jsou přijímající buňky oocyty.
Příjemce je výhodně enukleován. I když se obecně předpokládá, že enukleace přijímajícího oocytu v průběhu
-11• 000 0
00 00 00
00 0 0 00 * * *0 0 000*
0 0 0 0 0 0 *00 0 0 0 0 000 000 0000 0 00 0000 *0 00 přenosu jádra je podstatná, neexistuje žádné publikované potvrzení tohoto úsudku. Původní procedura, popsaná pro kopytníky zahrnuje rozštěpení buňky na dvě části, přičemž jedna z nich je pravděpodobně enukleovaná (Willadsen, Nátuře, 320 (6), 63-65 (1986)). Nevýhodou této procedury je, že druhá neznámá část má stále metafázový aparát a že se předpokládá, že snížení objemu cytoplasmy vede k akceleraci způsobu diferenciace nových embryí (Eviskov a kol., Development, 109, 322-328 (1990)).
Později byly použity jiné procedury ve snaze odstranit chromosomy spolu s minimálním množstvím cytoplasmy. Bylo zjištěno, že aspirace (odsátí) prvního polárního tělíska a sousedící cytoplasmy odstraní aparát metafáze II u 67 % ovčích oocytů (Smith a Wilmut, Biol. Reprod., 40, 1027-1035 (1989)). Pouze použití DNA-specifického fluorochromu (Hoechst 33342) byla metoda, která dovolila enukleaci, která zaručila minimální snížení cytoplasmatického objemu (Tsunoda a kol., J. Reprod. Fertil., 82, 173 (1988)). U dobytka je to pravděpodobně v současné době rutinně používaná metoda (Prather a First, J. Reprod. Fertil. Suppl., 41, 125 (1990), Westhusin a kol., Biol. Reprod. (Suppl.), 42, 176 (1990)).
Bylo velmi málo zpráv, popisujících neinvazivní přístup k enukleaci u savců, zatímco u obojživelníků je ozařování uf trafialovým světlem používáno jako rutinní procedura (Gurdon, Q. Microsc. Soc., 101, 299-311 (1960)). Neexistují detailní zprávy o použití tohoto přístupu u savců, ačkoliv v průběhu použití DNA specifického fluorochromu bylo pozorováno, že vystavení myších.oocytů ultrafialovému světlu po více než 30 sekund redukuje vývojový potenciál buňky
-12·· ···· ·· ·· ·· ·· ·· 9 9999 9999 • · 99 9 49·· • · ·· 9 9 · ···· 9 • 9 999 9 · ·
9··· 4 49 ···· ·· ·· (Tsunoda a kol., J. Reprod. Fertil., 82, 173 (1988)).
Přijímající hostitelské buňky, do nichž je přeneseno jádro dárcovské buňky, je výhodně enukleovaný oocyt v metafázi II, enukleovaný neaktivovaný oocyt nebo enukleovaný preaktivovaný oocyt. Přinejmenším v případě, kdy příjemce je enukleovaný oocyt v metafázi II, aktivace může nastat v okamžiku transferu. Alternativně, přinejmenším pokud příjemce je enukleovaný neaktivovaný oocyt v metafázi II, může dojít k aktivaci následovně. Jak je popsáno výše, enukleace může být dosaženo fyzicky, aktuálním odstraněním jádra, prvojádra nebo metafázové destičky (v závislosti na přijímající buňce) nebo funkčně, jako je použití ultrafialového záření nebo jiný enukleující vliv.
Tři vhodné cytoplasty (enukleované oocyty), použitelné jako příjemci, jsou:
1. MAGIC příjemce (Metaphase Arrested G1/G0 acceptlng Cytoplast), popsaný v současně podávané PCT patentové přihlášce č. PCT/GB96/02098, podávané současně a nárokující prioritu BG 951779.6.
2. GOAT oocyt (G0/G1 Activation and Transfer) oocyt v metafázi II v okamžiku aktivace (Campbell a kol., Biol. Reprod., 49, 933-942 (1993)).
Universal Recepient (Campbell a kol., Biol. Reprod., 50, 1385-1393 (1994)) .
Všechny tři tyto příjemci dosáhnou normální ploiditu, pokud
9 9 • 9 ·
9 9 · 9
-1399 9999 používají dárcovská jádra v GO v rekonstruovaném embryu. Výzkumné zprávy však naznačují, že jisté množství jader z buněk v klidovém stavu není schopno vstoupit do fáze syntézy DNA, pokud jsou umístěna do cytoplasmy v S-fázi, aniž by podstoupila rozklad obalu jádra (Leno a Munshi, J. Cell Biol., 127 (1), 5-14 (1994)). Proto i když se část embryí vyvine, pokud je používán Universal Recepient, je postulováno, že použití oocytů v metafázi II, obsahujících vysoké úrovně MPF (faktor vyvolávající fázi M nebo zrání vyvolávající faktor - M-phase promoting factor nebo maturation promoting factor), jako cytoplastových příjemců buď v metodě 1 nebo 2 vede k . větší frekvenci dosažení vývoj e.
Jakmile byly připraveny vhodná dárcovská buňka a vhodná přijímající buňka, je nutné, aby bylo jádro dárcovské buňky přeneseno do přijímající buňky. Přenos jádra je nejvýhodněji dosažen fúzí. V okamžiku fúze nesmí existovat aktivace.
Existují tři uznávané metody, které jsou používány pro indukci fúze:
(1) vystavení buněk chemické látce, vyvolávající fúzi, jako je například polyethylenglykol;
(2) použití inaktivovaného viru, jako je například Sendai virus;
(3) použití elektrické stimulace.
Vystavení buněk chemické látce, vyvolávající fúzi, jako je polyethylenglykol nebo jiné glykoly je rutinní procedura pro
4 44 4 4
-1444 44 44 44 • 4 4 4444 4444
4 44 4 4444
4 44 4 4 4 4444 4 · 444 444
4444 4 44 4444 44 44 fúzi somatických buněk, ale nebyla široce používána u embryí. Jelikož polyethylenglykol je toxický, je nutné buňky vystavit jeho působení po minimální možný čas a nutnost být schopen odstranit rychle chemickou látku může způsobit, že se odstraní zóna pellucida (Kaňka a kol., Mol. Reprod. Dev., 29, 110-116 (1991)). Při experimentech s myšími embryi se ukázalo, že inaktivovaný Sendai virus je účinný prostředek pro fúzi buněk embryí ve stavu štěpení (Graham, Wistar Inst. Symp. Monogr. , 9, 19 (1969)) a tato metoda přináší další experimentální výhodu, spočívající v tom, že není indukována aktivace. U kopytníků je fúze obvykle dosahována stejnou elektrickou simulací, jaká je používána k indukci parthogenní aktivace (Willandsen, Nátuře, 320 (6), 63-65 (1986)), Prather a kol., Biol. Reprod., 37, 859-866 (1987)). U těchto druhů Sendai virus indukuje fúzi v části případů, ale není dostatečně spolehlivý pro rutinní aplikaci (Willandsen, Nátuře, 320 (6), 63-65 (1986)).
I když fúze buňka-buňka je výhodným způsobem ovlivnění přenosu jádra, není to jediná metoda, která může být použita. Jiné použitelné techniky zahrnují mikroinjekci (Ritchie a Campbell, J. Reproductíon and Fertility Abstracts, Series No.15, str. 60).
Před nebo (výhodně) po přenosu jádra (nebo, alespoň v některých případech, současně s ním) je obecně nutné stimulovat přijímající buňku' k vývoji parthenogenickou aktivací, alespoň v případě, kdy buňky jsou oocyty. Nedávno provedené experimenty ukazují, že požadavky na parthenogenní aktivaci jsou komplikovanější, než bylo původně předpokládáno. Předpokládalo se, že aktivace je jev typu ·· 4444 44 «4 • 4
· 4 4 4
4444 4 44 4444
4
I 4 » 4
4 všechno nebo nic a že všechna z velkého počtu působení, které jsou schopna indukovat vytváření prvojádra skutečně způsobí aktivaci. Vystavení králičích oocytů působení opakovaných elektrických pulsů však ukázalo, že pouze volba vhodné série pulsů a řízení množství iontů Ca2+ je schopno vyvolat vývoj diplodizovaných oocytů do střední gastruly (Ožil, Development, 109, 117-127 (1990)). V průběhu oplodnění dochází k přechodným vzrůstům koncentrace mezibuněčného vápníku (Cutbertson a Cobbold, Nátuře, 316, 541-542 (1985)) a předpokládá se, že elektrické pulsy způsobují podobný vzrůst koncentrace vápníku. Existují důkazy, že průběh přechodných vzrůstů koncentrace vápníku se mění v závislosti na živočišném druhu a očekává se, že optimální průběh elektrických pulsů se mění podobným způsobem. Interval mezi pulsy u králíka je přibližně 4 minuty (Ožil, Development, 109, 117-127 (1990)) a u myši 10 až 20 minut (Cutbertson a Cobbold, Nátuře, 316, 541-542 (1985)), zatímco existují předběžná pozorování, ukazující, že u krávy je tento interval přibližně 20 až 30 minut (Robi a kol., Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation (Seidel, ed.), Colorado State University, 24-27 (1992)). U většiny publikovaných experimentů byla aktivace indukována jediným elektrickým pulsem, ale nová pozorování naznačují, že počet rekonstituovaných embryí, která se vyvinou, se zvýší vystavením více pulsům (Collas a Robi, Biol. Reprod., 43, 877-884 (1990)). V každém individuálním případě mohou být provedeny rutinní úpravy pro optimalizaci počtu pulsů, intenzity pole a trvání pulsů a vápníkové koncentrace v médiu.
Druhý předmět předkládaného vynálezu se týká ·· flfl·· ·· ·· ·· ··
rekonstituovaného zvířecího embrya, které bylo získáno výše uvedeným způsobem.
Třetí předmět vynálezu se týká způsobu vytvoření zvířete, který sestává z následujících kroků:
(a) rekonstituce zvířecího embrya výše uvedeným způsobem a (b) způsobením vývoje uvedeného zvířete z embrya a (c) popřípadě rozmnožováním takto vzniklého zvířete.
Krok (a) byl detailně popsán výše.
Druhý krok, označený (b) , způsobu podle tohoto předmětu vynálezu znamená způsobit vývoj zvířete z embrya do dospělé formy. Toho může být dosaženo přímou nebo nepřímou cestou. Při přímém vývoji je rekonstituované embryo z kroku (a) jednoduše ponecháno vyvíjet se bez jakékoli intervence s výjimkou těch, které mohou být nutné k tomu aby k vývoji zvířete došlo. Při nepřímém způsobu však může docházet k další manipulaci s embryem předtím, než je jeho úplný vývoj dokončen. Embryo může být například, rozštěpeno a buňky mohou být klonově pomnoženy, aby bylo dosaženo zvýšeného výtěžku.
Alternativně nebo dodatečně může být pro dosažení zvýšeného výtěžku životaschopných embryí pomocí předkládaného vynálezu použito klonální expanze dárců a/nebo použití procesu sériového přenosu (jader). Omezení v současnosti dosaženého počtu vytváření blastocyst může spočívat v tom, že u většiny embryí nedochází k přeprogramování (ačkoliv k němu dochází u přijatelného počtu embryí). Pokud nastává tento případ, může být výtěžek zvýšen následujícím způsobem. Každé embryo,
-1700 9IÍ99
0 • 00 0 «0 0 0 0 0
0 0
0 0 0*0
0000 «0 « 0 0 0
0 00 * 0000 0
0 0
0 0 0 které se samo vyvine může být použito jako dárce jádra, například v etapě moruly nebo v etapě, kdy je jeho velikost 32-64 buněk; alternativně mohou být buňky vnitřní buněčné masy použity v blastocystové etapě. Embrya odvozená z těchto následných přenosů mohou sama být použita jako potenciální dárci jádra pro zvýšení účinnosti způsobu. Jestliže tato embrya skutečně jsou ta, u kterých dochází k expresi přeprogramovaného genu a tato embrya jsou skutečně přeprogramována (což se zdá pravděpodobné), pak každé vyvíjející se embryo může být tímto způsobem znásobeno účinností procesu přenosu jádra. Stupeň zesílení, jehož je pravděpodobné dosáhnout, je závislý na typu buněk. U ovce je snadno možné dosáhnout 55% embryí v blastocystové etapě přenosem jediné blastomery z 16 buněčného embrya na preaktivovaný oocyt, který je univerzální příjemce. Je tedy možno uvažovat o tom, že každé embryo vyvinuté z jediné buňky může dát vzniknout osmi v 16 buněčném stádiu. I když jsou tato čísla pouze hrubý odhad, je zřejmé, že v pozdějších vývojových stádiích bude zlepšení způsobu záviset na účinnosti procesu v tomto stádiu.
Vynález se také týká toho, že nové buněčné linie, které jsou použitelné jako zdroj dárcovských buněk jader, mohou být vytvořeny z embryí, vytvořených podle předchozího popisu nebo z výsledných zárodků nebo dospělých zvířat.
V některých případech, kdy může dojít k omezením úplného vývoje rekonstruovaného embrya, může být výhodné vytvořit chimérické zvíře, tvořené buňkami, odvozenými z přirozeně vytvořeného embrya a embrya rekonstruovaného přenosem jádra. Taková chimérická zvířata mohou být vytvořena pomocí části • ·
-18• · • · 0
0 • 0 «
···» buněk přirozeného embrya a části buněk rekonstruovaného embrya v libovolné etapě až do etapy blastocysty a vytvořit nové embryo agregací nebo injekcí. Množství buněk může být v poměru 50:50 nebo v jiném vhodném poměru, aby se dosáhlo vytvoření embrya, které podstoupí úplný vývoj. Přítomnost normálních buněk v takovémto případě se považuje za faktor, který pomáhá záchraně rekonstruovaného embrya a dovoluje úspěšný úplný vývoj a živý porod.
Bez ohledu na možná opatření pro zvýšení výtěžku může být rekonstituované embryo kultivováno in vivo nebo in vitro do etapy blastocysty.
Zkušenost ukazuje, že embrya získaná přenosem jádra se odlišují od normálních embryí a někdy jim prospívají nebo jsou dokonce nutné kultivační podmínky in vivo jiné než jsou podmínky u embryí, které jsou normálně kultivovány (přinejmenším in vivo). Důvod tohoto jevu není znám. Při rutinní multiplikaci hovězích embryí byla rekonstituovaná embrya (větší množství najednou) kultivována v ovčích vejcovodech po 5 až 6 dní (jak popsal Willadsen, v Mammalian Egg Transfer (Adams, E.E., ed.), 185, CRC Press, Boča Raton, Florida (1982)). Při postupu podle předkládaného vynálezu však ve snaze chránit embryo je žádoucí je vložit do ochranného média jako je agar před přenosem a potom disektovat z agaru po získání z přechodného příjemce. Funkce ochranného média jako je agar je dvojí: předně působí jako strukturální pomoc embryu tím, že udržuje jeho zóna pellucida pohromadě; a za druhé působí jako bariéra pro buňky imunitního systému přijímajícího zvířete. I když tento přístup zvyšuje počet embryí, které vytvoří blastocysty, • · • ·
-194 4 · · ····· • · · 4 · * · · · · · «
4 »4 4444 4» 44 • 444 4 nevýhodou je, že řada embryí může být ztracena.
Pokud jsou použity podmínky in vitro, pak postupy běžně používané podle stavu techniky jsou dobře přijatelné.
V blastocystovém stádiu může být embryo zkoumáno s ohledem na jeho schopnost dospět. Typicky bude tento postup použit, pokud se jedná o transgenní embryo a bude prováděno zkoumání a selekce stabilních integrantů. V této etapě může být také prováděn výběr podle netransgenních markérů. Jelikož však způsob podle vynálezu dovoluje výběr dárců v časnější etapě, bude tímto způsobem výhodně postupováno.
Po výběru embryí, pokud byl prováděn, bude blastocystové embryo ponecháno, aby dospělo. To bude obecně prováděno in vivo. Jestliže k vývoji do etapy blastocysty došlo in vitro, dojde v této etapě k přenosu do . konečného zvířecího příjemce. Jestliže k vývoji do etapy blastocysty došlo in vivo, pak i když v principu je možno ponechat blastocystu dokončit její vývoj v pre-blastocystovém příjemci, běžně je blastocysta vyjmuta z (dočasného) pre-blastocystového příjemce a po disekci z ochranného média je umístěna do (trvalého) post-blastocystového příjemce.
V případném kroku (c) vynálezu mohou být předcházejících kroků vytvořit stádo zvířat, podle tohoto předmětu předkládaného zvířata získaná způsobem podle množena. Tímto způsobem je možno která mají požadovanou genetickou charakteristiku nebo charakteristiky.
Zvířata produkovaná přenosem jádra ze zdroje geneticky • 9 • ·
-20• 9
identických buněk sdílejí totéž jádro, ale nejsou striktně identické, neboť jsou odvozeny z různých oocytu. Význam tohoto různého původu není jasný, ale může ovlivnit komerční znaky. Nedávno provedené analýzy mitochondriální DNA u dojnic na chovném stádu Iowa State University odhalily souvislost s dojivostí a reprodukční schopností (Freeman a Beitz, v Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation (Seidel, G.E., Jr. ed.), 17-20, Colorado
State University, Colorado (1992)). Je třeba ale potvrdit, že k podobným efektům dochází v populaci dobytka a uvážit, zda je možné nebo nutné ve specifických situacích provádět selekci oocytů. V oblasti pěstování dobytka může mít schopnost produkovat velké množství embryí od dárců s velkou genetickou hodnotou velkou potenciální hodnotu pro rozšíření genetických zlepšení v celostátním měřítku. Rozsah aplikace bude záviset na ceně každého embrya a počtu přenesených embryí, která jsou schopna dokončit úplně svůj vývoj.
Pro ilustraci a jako shrnutí podává následující schéma typický způsob, kterým mohou být připravena transgenní a netransgenní zvířata. Na způsob je možno pohlížet jako na proces, zahrnující sedm kroků:
(1) selekce a isolace vhodných dárcovských buněk, což může zahrnovat určení karyotypu, indukci klidového stavu (uzavření v GO) a/nebo indukci vývoje;
(2) aplikace vhodných molekulárně biologických technik pro produkci populace geneticky modifikovaných buněk. Takové techniky mohou zahrnovat přidání genu, vyloučení genu, vložení genu a.další genové modifikace. Popřípadě může být také použita transgeneze pomocí transfekce • · • ·· ·
• · · • * • · * • * • · · · * vhodnými konstruktory s nebo bez selektovatelných markérů;
(3) případné prohledávání a selekce populací modifikovaných buněk nebo klonů na požadované genotypy/fenotypy (na stabilní integranty);
(4) indukce klidového stavu populací modifikovaných buněk;
(5) rekonstituce embrya přenosem jádra;
(6) kultivace, in vivo nebo in vitro do etapy blastocysty; (6a) případné prohledávání a selekce na stabilní integranty
- vynecháno, pokud byl prováděn krok 3 - nebo na další požadované vlastnosti;
(7) přenos, je-li to třeba, do konečného příjemce.
Čtvrtý předmět vynálezu se týká zvířete, připraveného výše uvedeným způsobem.
Výhodné rysy kteréhokoliv předmětu vynálezu představují i výhodné rysy ostatních předmětů vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Vynález nyní bude popsán s odvoláním na uvedené příklady provedení vynálezu, které jsou podány za účelem ilustrace předmětu vynálezu, ale nepředstavují omezení jeho rozsahu.
Příklad 1: Indukce klidového stavu dárcovské' buňky
Byly ukázány různé metody indukce klidového stavu kultivované buněčné linie, které zahrnují kontaktní inhibici • · • · • ·
-22• t ♦ · · ···· < ** A · ·♦ ·· nebo sérové hladovění (přehled viz Whitfield a kol., Control of Animal Cell Proliferation, 1, 331-365 (1985)). Způsob indukce klidového stavu není považován za podstatný, důležitý krok je, aby buňky vystoupily z růstového cyklu, zastavily se ve stavu GO s diploidním obsahem DNA a zůstaly životaschopné. V příkladech 3 a 4 bylo použito sérové hladovění hovězích primárních fibroblasů, hovězích buněčných linií získaných z vnitrobuněčné hmoty v den 7 in vivo produkovaných blastocyst a ovčích buněčných linií odvozených z embrya (TNT4) pro indukci klidového stavu a zastavení buněk ve fázi GO buněčného cyklu. Sérové hladovění bylo také použito podobným způsobem pro indukci klidového stavu dárcovských buněk, popsaných v příkladu 5.
Příklad 2: Isolace oocytů a přenos jádra
Oocyty mohou být získány (i) in vitro zráním materiálu z jatek nebo (ii) in vivo zráním a chirurgickým vyjmutím nebo (iii) jakýmkoliv jiným vhodným způsobem. Všechny oocyty, které zrály in vivo, by měly být získány vypláchnutím z vejcovodu fyziologickým roztokem, pufrovaným fosforečnanem (PBS) a prostým vápníku a hořčíku, obsahujícím 0,1 % fetálního telecího séra (FCS). Oocyty, které zrály in vitro, jsou odebrány a přeneseny do vápníku prostého roztoku M2 (Whittingham a Wales, Aust. J. Biol. Sci., 22, 1065-1068 (1969)), obsahujícího 1,0 % FCS. Oocyty jsou zbaveny kumulárních buněk a enukleovány výše popsaným způsobem (Campbell a kol., Biol. Reprod., 49, 933-942 (1993) a Biol. Reprod., 50, 1385-1393 (1994)) se změnou, že je pro všechny procedury použito vápníku prosté médium. Procedury fúze jsou modifikacemi již popsaných procedur (Campbell a kol., 1993, • · 0 0 ·
-2300 0 0
00 0 0 00 0 • 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0000 0 0 0 0 0 0 0 0« «000 * · · ·
1994, citováno výše) a probíhají tak, jak je popsáno dále, alternativně mohou být jádra vložena injekcí do dárcovské buňky v enukleovaném oocytu (Ritchie a Campbell, J. Reprod. Fertil. Abstract Series (5) 60 (1995)). Časování těchto událostí je závislé na druhu a následující dvě procedury podávají náčrt použití ovčích oocytů, které zrály in vivo a hovězích oocytů, které zrály in vitro.
Příklad 3: Přenos jádra u ovce
3.1 Superstimulace dárcovských ovčích samic a získání oocytů
Ovčí samice Scottish Blackface byly synchronizovány progestagenovými tampóny po 14 dní (Veramix™, Upjohn, UK) a indukovány k superovulaci injekcí jednoduché dávky 3,0 mg/den (celkově 6,0 mg) ovčího folikulárně stimulujícího hormonu (FSH) (Ovagen™, Immuno-chemical products Ltd, Nový Zéland) ve dvou po sobě jdoucích dnech. Ovulace byla indukována jednoduchou dávkou 8 mg gonadotropín uvolňujícího hormonového analogu (GnRH Receptal™, Hoechst, UK) 24 hodin po druhé injekci FSH.
Neoplodněné oocyty v metafázi II byly odebrány vypláchnutím z vejcovodu 24 až 29 hodin po injekci GnRH použitím Dulbeccova fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem s obsahem 1,0 % fetálního telecího séra (FCS), udržovaného až do použití při teplotě 37 °C.
3.2 Zpracování oocytů
Získané oocyty byly uchovávány při teplotě 37 °C, promývány
-24« · * • · «
• 9
99 9 ·
9 9
9 9
9999 v PBS s 1,0 % FCS a přeneseny do média M2 neobsahujícího vápník a obsahujícího 10 % fetálního telecího séra (FCS) při teplotě 37 °C. K odebrání chromosomů (enukleaci) byly oocyty umístěny do média M2 neobsahujícího vápník a obsahujícího 10 % FCS, 7,5 μς/ml cytochalasinu B (Sigma) a 5,0 μς/ml Hoechst 33342 (Sigma) při teplotě 37 °C po dobu 20 minut. Malé množství cytoplasmy z místa přímo pod prvním polárním tělískem bylo odsáto použitím 20 μΜ skleněné pipety. Enukleace byla potvrzena vystavením odsáté části cytoplasmy UV záření a kontrolou přítomnosti metafázové. destičky.
3.3 Rekonstrukce embrya
Skupiny 10 až 20 oocytů byly enukleovány a umístěny do 200 μΐ kapek M2 média, neobsahujícího vápník, při teplotě 37 °C a 5 % CO2 pod minerálním olejem (Sigma) . Pro rekonstrukci embrya byl použit každý z následujících tří protokolů (a), (b) a (c).
(a) „MAGIC (Metaphase Arrested G1/G0 Accepting Cytoplast)
Co nejdříve po enukleaci byla jedna buňka uvedena v kontakt s oocytem použitím skleněné pipety k přenesení buňky otvorem, vytvořeným předtím v zóna pellucida. Dvojice cytoplast/buňka byla potom přenesena do fúzovací komory v 200 μΐ 0,3 M mannitolu v destilované vodě a ručně uvedena do správné polohy mezi elektrody. Byl aplikován střídavý elektrický puls 5 V po 3 vteřiny, následovaný 3 stejnosměrnými pulsy 1,25 kV/cm po 80 μΞ. Dvojice potom byla promývána v médiu M2, neobsahujícím vápník a s obsahem 10 % • · · » · · • » <9 • * 4 « · 9 · ·' ► 4 9 9 9 ««tet' ··«»»· • 9 9 9 • * 9 · 9
9 9 • 4 « ·
FCS při teplotě 37 °C a inkubována v témže médiu pod olejem při teplotě 37 °C a 5 % C02. 30 minut před aktivací byla dvojice přenesena do média M2, neobsahujícího vápník a s obsahem 10 % FCS a 5 μΜ nocodazolu. Aktivace byla indukována v hodině 32-34 po injekci hCG, jak je popsáno níže. Po aktivaci byly rekonstruované zygoty inkubovány v médiu TC199 (Gibco) s 10 % FCS při teplotě 37 °C a 5 % CO2 po další 3 hodiny. Potom byly promývány třikrát po pět minut při teplotě 37 °C v témže médiu bez nocodazolu a kultivovány po dalších 12-15 hodin před přenosem do ovčích samic, které sloužily jako dočasný příjemce.
(b) „GOAT (G0/G1 Aktivation and Transfer) až 34 hodin po hCG injekci byla jedna buňka uvedena do kontaktu s enukleovaným oocytem. Dvojice byla potom přenesena do fúzovací komory (viz níže) v 200 μΐ 0,3 M mannitolu, 0,1 mM MgSO4, 0,001 mM CaCl2 v destilované vodě. Fúze a aktivace byly indukovány aplikací střídavého elektrického pulsu 3 V po 5 vteřin, následovaného 3 stejnosměrnými pulsy 1,25 kV/cm po 80 με. Dvojice potom byly promývána v médiu TC199 s obsahem 10 % FCS a 7,5 μς/ιηΐ cytochalasinu B a inkubovány v témže médiu po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C a 5 % CO2. Dvojice potom byly promývány v TC199 s obsahem 10 % FCS a kultivovány po dalších 12-15 hodin v médiu TC199 s obsahem 10 % FCS při teplotě 37 °C a 5 % CO2.
(c) „Dniversal Recipient
Enukleované oocyty byly aktivovány (jak je popsáno níže) 32 • · • 9 9· · ·
až 34 hodin po hCG injekci a potom kultivovány v médiu TC199 s obsahem 10 % FCS při teplotě 37 °C a 5 % CO2. Jedna buňka byla potom uvedena v kontakt s oocytem a fúze byla indukována výše popsaným způsobem. Dvojice potom byly inkubovány v médiu TC199 s obsahem 10 % FCS a 7,5 μς/ml cytochalasinu B po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C a 5 % CO2. Dvojice potom byly a kultivovány po dalších 8-11 hodin v médiu TC199 s obsahem 10 % FCS při teplotě 37 °C a 5 % CO2.
3.4 Fúze a aktivace
Pro aktivaci byly oocyty umístěny mezi dvě paralelní elektrody v 200 μΐ 0,3M mannitolu, 0,1 MgSO4, 0,01 mM CaCl2 v destilované vodě (Willadsen, Nátuře, 320, 63-65 (1986)).
Aktivace byla indukována aplikací, jednoho stejnosměrného elektrického pulsu 1,25 kV/cm po dobu 80 με. Pro fúzi bylo na zpracovávaná embrya působeno stejným způsobem s tím, že navíc byl mezi enukleovaný oocyt a buňku umístěn kontaktní povrch, rovnoběžný s elektrodami. Fúze byla indukována aplikací střídavého elektrického pulsu 3 V po 5 vteřin, po kterém následovaly tři stejnosměrné pulsy 1,25 kV/cm po dobu 80 μβ.
3.5 Kultivace a pozorování embrya
Po uplynutí kultivační doby byly spojené dvojice dvojitě vloženy v 1 % a 1,2 % agaru (DIFCO) v PBS a přeneseny do podvázaného vejcovodu v nesynchronizované ovčí samici. Dvojice byla vložena do agaru, aby se předešlo nebo snížilo
-27• * •« «9 * * · ·
9 · » β · <
« » 9 · · * « · 9 ·«··
9 · · 1 » · « · « 9 · · ·· nebezpečí imunitního odmítnutí embrya přijímající ovcí a aby napomáhalo spojení dvojice. Po 6 dnech byla přijímající ovčí odebráno vypláchnutím z 10 % FCS. Embrya byla použitím dvou jehel a samice poražena a ombryo bylo vejcovodu pomocí PBS s obsahem disektována z agarových tyčinek dosažený vývoj byl stanoven pod mikroskopem. Všechna embrya, která se vyvinula do stádia morula/blastocysta byla co nejdříve přenesena do děložního rohu synchronizované konečné přijímající ovce.
K dosažení vývoje embrya do blastocystového stádia mohou také být namísto přechodné přijímající ovce použity in vitro techniky.
Příklad 4: Přenos jádra u hovězího dobytka
4.1 In vitro zrání oocytů
Vaječníky, které byly získány na místních jatkách, byly při transportu do laboratoře udržovány při teplotě 28 - 32 °C.' Z hypodermickou jehlou komplexy oocytárních sterilních plastových folikulů o průměru 3-10 mm byly (vnitřní průměr 1,2 mm) odsáty vyklenutí (cumulus) a umístěny do univerzálních zásobníků. Univerzální zásobníky byly umístěny do vyhřívané komory (35 °C) a folikulární materiál byl ponechán sedimentovat po 10 - 15 minut a pak byly odlity tři čtvrtiny supernatantu. Zbývající folikulární materiál byl zředěn stejným objemem disekčního média (TCM 199 s Earlovou solí (Gibco) , 75,0 mg/1 kanamycinu, 30,0 mM Hepes, pH 7,4, osmolarita 280 mOsmol/kg H2O), doplněného 10 % hovězím sérem, přenesen na 85 mm Petriho misku a pod disekčním
28« » » · fl mikroskopem byly vyhledávány komplexy oocytárních vyklenutí. Byly vybrány komplexy s alespoň 2-3 kompaktními vrstvami buněk, promývány třikrát v disekčním médiu a přeneseny do maturačního média (TC médium 199 s Earlovou solí (Gibco), 75,0 mg/1 kanamycinu, 30,0 mM Hepes, 7,69 mM NaHCO3, pH 7,8, osmolarita 280 mOsmol/kg H2O), doplněného 10 % hovězím sérem a 1 x 106 buněk membrána granulosa/ml a kultivovány na kmitačce při teplotě 39 °C a v atmosféře 5 % oxidu uhličitého ve vzduchu.
4.2 Zpracování oocytů
Zralé oocyty byly zbaveny kumulárních buněk 18 hodin po začátku zrání. Takto zpracované oocyty potom byly promývány v médiu M2 neobsahujícím vápník a obsahujícím 10 % fetálního telecího séra (FCS) a udržovány v tomto médiu při teplotě 37 °C. K odebrání chromosomů (enukleaci) byly oocyty umístěny do média M2 neobsahujícího vápník a obsahujícího 10 % FCS,
7,5 μρ/ml cytochalasinu B (Sigma) a 5,0 μg/ml Hoechst 33342 (Sigma) při teplotě 37 °C po dobu 20 minut. Malé množství cytoplasmy z místa přímo pod prvním polárním tělískem bylo odsáto použitím 20 μΜ skleněné pipety. Enukleace byla potvrzena vystavením odsáté části cytoplasmy UV záření a kontrole přítomnosti metafázové destičky.
4.3 Rekonstrukce embrya
Enukleované oocyty potom byly použity v každém z následujících tří protokolů (a), (b) a (c) popsaných dále.
(a) „MAGIC (Metaphase Arrested G1/G0 Accepting Cytoplast) • ·
-299 9 · 9 · · * • 9 · 9 * » · · · 9 · • 9 · · · »·9· 9 99 9··9 • · · · • 9 9 · • 9 9 9
9 9 9 9
9 9 · «9
Enukleované oocyty byly udržovány v médiu M2 neobsahujícím vápník a obsahujícím 10 % FCS při teplotě 39 °C; co nejdříve po enukleaci byla jedna buňka uvedena v kontakt s oocytem použitím skleněné pipety k přenesení buňky otvorem, vytvořeným předtím v zóna pellucida. Dvojice cytoplast/buňka byla potom přenesena do fúzovací komory v 200 μΐ 0,3 M mannitolu v destilované vodě. Dvojice byla ručně uvedena do správné polohy mezi elektrody. Byl aplikován střídavý elektrický puls 3 V po 5 vteřiny, následovaný třemi stejnosměrnými pulsy 1,25 kV/cm po 80 με. Dvojice potom byla promývána v médiu M2, neobsahujícím vápník a s obsahem 10 % FCS při teplotě 37 °C a inkubována v témže médiu pod olejem při teplotě 37 °C a 5 % CO2. 30 minut před aktivací byla dvojice přenesena do média M2, neobsahujícího vápník a s obsahem 10 % FCS a 5 μΜ nocodazolu. Aktivace byla indukována jak je popsáno níže, po aktivaci byly rekonstruované zygoty inkubovány v médiu TC199 (Gibco) s 10 % FCS při teplotě 37 °C a 5 % CO2 po další 3 hodiny. Potom byly promývány třikrát po pět minut při teplotě 37 °C v témže médiu bez nocodazolu a kultivovány po dalších 12-15 hodin před přenosem do ovčích samic, které sloužily jako dočasný příjemce (ovce představují méně nákladnou alternativu jako dočasný příjemce pro rekonstruované embryo).
(b) „GOAT (G0/G1 Aktivation and Transfer)
Enukleované oocyty byly navráceny do maturačního média. 30 a 42 hodin po počátku zrání byla jedna buňka uvedena do kontaktu s enukleovaným oocytem. Dvojice byla potom přenesena do fúzovací komory (viz níže) v 200 μΐ 0,3 M •4 4444
4 mannitolu, 0,1 mM MgSO4, 0,001 mM CaCl2 v destilované vodě. Fúze a aktivace byly indukovány aplikací střídavého elektrického pulsu 3 V po 5 vteřin, následovaného třemi stejnosměrnými pulsy 1,25 kV/cm po 80 με. Dvojice potom byly promývána v médiu TC199 s obsahem 10 % FCS a inkubovány při teplotě 37 °C a 5 % CO2 po 15-20 hodin (skupina 30 hpm) nebo nebo 4-8 hodin (skupina 42 hpm). (Zkratka „hpm standardně označuje „hodiny po začátku zrání (maturace).
(c) „Universal Recipient
Enukleované oocyty byly aktivovány (jak je popsáno níže) 32 až 34 hodin po začátku zrání a potom kultivovány v médiu TC199 s obsahem 10 % FCS při teplotě^.37 °C a 5 % C02 po 8-10 hodin (skupina 30 hpm) nebo 4-6 hodin (skupina 42 hpm) . Jedna buňka byla potom uvedena v kontakt s oocytem a fúze byla indukována výše popsaným způsobem. Dvojice potom byly inkubovány v médiu TC199 s obsahem 10 % FCS při teplotě 37 °C a 5 % C02 po dalších 12-16 hodin (skupina 30 hpm) nebo 4-6 hodin (skupina 42 hpm).
4.4 Fúze a aktivace
Pro aktivaci byly oocyty umístěny mezi dvě paralelní elektrody v 200 μΐ 0,3M mannitolu, 0,1 MgSO4, 0,01 mM CaCl2 v destilované vodě (Willadsen, Nátuře, 320, 63-65 (1986)).
Aktivace byla indukována aplikací jednoho stejnosměrného elektrického pulsu 1,25 kV/cm po dobu 80 με. Pro fúzi bylo na zpracovávaná embrya působeno stejným způsobem s tím, že navíc byl mezi enukleovaný oocyt a buňku umístěn kontaktní povrch, rovnoběžný ·s elektrodami. Fúze byla indukována
-31·· ·*·· • · » «··· »»»· ♦ « · · · · · ·· • · · · ♦ ♦ »·«·»· » · ··» ··· ···· * ·♦<«·· ·· »· aplikací střídavého elektrického pulsu 3 V po 5. vteřin, po kterém následovaly tři stejnosměrné pulsy 1,25 kV/cm po dobu 80 ps.
4.5 Kultivace a pozorování embrya (všechny skupiny)
Po uplynutí kultivační doby byly spojené dvojice dvojitě vloženy v 1 % a 1,2 % agaru (DIFCO) v PBS a přeneseny do podvázaného vejcovodu v nesynchronizované ovčí samici (ovce jsou méně nákladnou alternativou jako přechodný příjemce pro rekonstruované embryo). Dvojice byla vložena do agaru, aby se předešlo nebo snížilo nebezpečí imunitního odmítnutí embrya přijímající ovcí a aby se napomáhalo spojení dvojice. Po 6 dnech byla přijímající ovčí samice poražena a embryo bylo odebráno vypláchnutím z vejcovodu pomocí PBS s obsahem 10 % FCS. Embrya byla disektována z agarových tyčinek použitím dvou jehel a dosažený vývoj byl stanoven pod mikroskopem.
K dosažení vývoje embrya do blastocystového stádia mohou také být namísto přechodné přijímající ovce použity in vitro techniky.
Výsledky příkladu 3 (ovčí buňky) a příkladu 4 (hovězí buňky)
Nové techniky byly aplikovány jak na ovčí, tak i na hovězí rekonstruovaná embrya. V současné době byla u hovězího dobytka získána embrya v blastocystové etapě; nebyl však proveden žádný přenos těchto embryí do konečných příjemců. U ovcí se 7 přijímajících ovcí stalo těhotnými, což vedlo k narození 5 živých jehňat (z nichž dvě zamřela krátce po • 0
-32• •Μ ♦ 0 · · • · » • · 0 · • · 0 • · 0 0 0 0 ► · « 0 » 0 0 0
0 0 0 *
0 9
0· 0 0 narození). Výsledky těchto experimentů jsou přehledně uvedeny v Tabulkách 1-3.
populací TNT4 cytopiasrnatických
Tabulka 1 ukazuje výsledky vývoje do blastocystové etapy u ovčích embryí, rekonstruovaných s použitím buněčných v klidovém stavu a tří různých příjemců. Rekonstruovaná embrya byla kultivována v podvázaném vejcovodu dočasného příjemce - ovčí samice - až do dne 7 po rekonstrukci. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento embryí ve stádiu morula/blastocysta ve poměru k celkovému počtu získaných embryí.
Tabulka 1
| Datum přenosu jádra | Číslo stádia | počet dvojic v etapě morula, blastocysta/ počet všech získaných dvojic | ||
| „GOAT | „MAGIC | „UNIVERSAL | ||
| 17.1.95 | 6 | 6/32 | 4/28 | |
| 19.1.95 | 7 | 1/26 | 1/10 | |
| 31.1.95 | 13 | 0/2 | 2/14 | |
| 02.2.95 | 13 | 0/11 | 0/14 | |
| 07.2.95 | 11. | 1/9 | 0/9 | |
| 09.2.95 | 11 | 9/29 | 1/2 | |
| 14.2.95 | 12 | 6/45 | ||
| 16.2.95 | 13 | 3/13 | ||
| Celkově | 16/98 (16,3%) | 10/78 (12,8%) | 8/68 (11,7%) |
0 ····
-330000 • 0 • 0 0 ·
9 ·
0 0 0
0 0
9 «000
00 0 0 0 0 * 0 0
000 0 ·
0 9 ·0
Tabulka 2 ukazuje výsledky indukce těhotenství následující po přenosu všech rekonstruovaných embryí v stapě morula/blastocysta do děložního rohu synchronisovaných přijímajících ovčích samic rasy blackface. Tabulka ukazuje celkový počet embryí z každé skupiny přenosů a frekvenci těhotenství vyjádřenou počtem ovcí a embryí (ve většině případů byla do každé ovce přenesena 2 embrya. Jediné dvojité těhotenství bylo dosaženo použitím cytoplastu „MAGIC.
Tabulka 2
| Číslo stádia | „MAGIC | „GOAT | „UNIVERSAL |
| P6 | 4 | 6 | 0 |
| P7 | 1 | 1 | 0 |
| Pil | 2 | 9 | 00 |
| P12 | 0 | 0 | 6 |
| P13 | 3 | 0 | 2 |
| Celkově mor/bl | 10 | 16 | 8 |
| Celkově ovcí | 6 | 9 | 4 |
| Těhotných ovcí % | 1 (16,7) | 5 (55,5) | 1 (25,0) |
| Počet zárodků/ | 2/10 | 5/16 | 1/8 |
| celkově přeneseno (%) | (20,0) | (31,25) | (12,5) |
Tabulka 3 ukazuje výsledek těhotenství, dosažených přenosem embryí v etapě morula/blastocysta do konečných přijímajících ovčích samic.
-34·· ···· • » 9 • · • 9 • 9
9999 9 • 9 ·· * 9 · 9
9 9
9 9 9
9 9 *9 «99«
99 • 9 9 ·
9 99
9999 9
9 9
99
Tabulka 3
| Ovce | Metoda | Stádium | Výsledek |
| 4E486 | GOAT | 6 | živá ovce |
| 4E302 | GOAT | 7 | zárodek zemřel (zhruba 130 dní) |
| 4E210 | GOAT | 11 | živá ovce |
| 4E286 | GOAT | 11 | živá ovce (zemřela krátce po narození) |
| 4E453 | GOAT | 11 | zárodek zemřel (zhruba 80 dní) |
| 4E294 | UNIVERSAL | 11 | živá ovce |
| 4E272 | MAGIC | 13 | živá ovce (zemřela krátce po narození) |
Příklad 5: Přenos jádra u ovce a rekonstrukce embrya, s použitím buněk OME, BLWF1 a SECI
Přenos jádra byl proveden použitím tří nových typů buněk, označených OME, BLWF1 a SECI. OME (ovine mammary epithelial) buňky jsou představovány epiteliální buněčnou linií získanou z biopsie, odebrané z prsní žlázy dospělé 6 roků staré ovčí samice Fin-Dorset procedurou podle Fine a kol., (Biochem. Soc. Trans. 24, 369S (1996)). BLWF1 (Black Welsh Fibroblast) buňky jsou představovány fibroblastovou buněčnou linií získanou disekcí a kultivací 26 denního zárodku Black Welsh, získaného přirozeným spojením samice Black Welsh a samce
9 9 44 9
9
9999
9 99
999 9
Black Welsh. Způsob isolace primárních fetálních fibroblastů je podle Robertson, E.J., v Teraatocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach, 71-112, IRL Press Oxford (1987). SECI (Sheep Embryonic Cell) jsou buněčné linie epiteliálního typu, odvozené od 9 denního embrya, získaného ze superovulované samice Pol-Dorset, spářené se samcem PolDorset. Buňky SECI jsou odlišné od TNT buněk, popsaných v současně podávané PCT přihlášce PCT/GB95/02095, publikované jako WO 96/07732 z následující důvodů. Předně je morfologie buněk obou dvou buněčných linií zcela odlišná a za druhé byly odlišné způsoby isolace těchto buněčných linií. Buněčná linie SECI byla vytvořena z jediného embrya, zatímco buněčná linie TNT byla odvozena ze skupiny buněk.
Všechny buněčné linie byly karyotypovány a bylo prokázáno modální chromosomové číslo 54 (2n). Před použitím jako dárci jádra pro rekonstrukci embrya byla výše popsaným způsobem monitorována indukce klidového stavu, následujícího po redukci sérové úrovně na 0,5 % (Campbell a kol., Nátuře, 380, 64-66 (1996)) . Příprava rekonstruovaných embryí byla popsána výše v předchozích příkladech.
Tabulka 4 podává přehled vývoje embryí získaných přenosem jádra a rekonstruovaných z různých buněčných typů. Tabulka ukazuje počet rekonstruovaných embryí, vývoj do blastocystové etapy a počet těhotenství pro všechny tři buněčné typy. Všechny buněčné linie byly před jejich použitím pro embryonální rekonstrukcí karyotypovány. Tyto buněčné linie měly modální číslo 54 chromosomů. Jedno až tři embrya v blastocystové etapě byly přeneseny do každé ze synchronisovaných přijímajícíh ovčích samic. Rekonstruovaná ·· 4 44 4
-364444 4
444· embrya, která byla kultivována in vitro, byla umístěna do 10 μΐ (4 embrya) kapek SOFM (Synthetic Oviduct Fluid Medium) obsahujících 10 atmosféře 5 lidského séra a kultivována ve zvlhčené O2, 5 % CO2 a 90 % N2 při teplotě 39 °C.
Kultivovaná embrya byla přenesena do čerstvého média každé dva dny. SOFM médium bylo připraveno podle Gardner a kol., Biology of Reproduction, 50, 390-400 (1994) a Thompson a kol., Biology of Reproduction, 53, 1385-1391 (1995).
Tabulka 5 ukazuje identifikaci přijímajících ovčích samic, které zůstaly těhotné 24. června 1996, buněčné typy použité pro rekonstrukci embryí a očekávané datum porodu. Těhotenství byla vytvořena přenosem 1 až 3 embryí ve stádiu morula/blastocysta (ve dnu 7 po rekonstrukci) do synchronisovaných konečných přijímajících ovčích samic. Detaily rokonstruovaných počtů jsou ukázány v Tabulce 4. Označení jsou: PD = Pol-Dorset, BW = Black Welsh, FD = FinDorset, stádia.
= embryo kultivované, in vitro do blastocystového
Zastupuj e:
Dr. Miloš Všetečka v.r.
• 4 ·· 4444
Γη ι
Tabulka
| Počet t hotenství/ ÍD< počet přijímajících i ovcí (%) | 1/13 (7,7) | 4/10 (40,0) 1/6 (16,6) | 14/27 (51,8) 1/5 (20,0) |
| Počet t hotenství/ (l>< počet blastocyst (%) | 1/29 (3,4) | 4/34 (11,8) 1/6 (16,6) | 14/72 (19,5) 1/15 (6,6) |
| Φ P ě · w P Ch Φ >i Φ <t ρ o -—· >O P £ 0 oP o φ P P — pu o co i> g Φ P Λ | 29 (11,7) | 34 (27,4) 13 (54,2) | 90 (39,0) 36 (39,0) |
| Počet dvoj ic získaných z vejcovodu (%) | 247 (89,2) | Γ~~ kO co CxJ P | 231 (85,3) |
| Počet dvojic přenesených do vejcovodů ( ultivace in řt vitro) | 277 | P CM rr P | 271 (92) |
| Počet fúzovaných dvojic (%) | 277 (63,8) | Γ P CO <N r- P | 385 (82,8) |
| Počet použitých cytoplastů | 387 | 203 | <o |
| k £θ 2 P a >1 | OME | BLWF1 | SECI |
LO (ΰ Λ! ι—I oj
Η • 4
4
4
4 4 4
4 4 4 • · ·
4 4
4 4
4444 ··
4 4 <
• · ··
444 4 <
4 4
| Chov | Q CU | Q £4 | α | α | aa | £ CQ | BW | s CQ | FD | ||
| Λ | |||||||||||
| > | ο φ m φ (0 | Φ Φ | |||||||||
| P | 0 | υ | φ | Φ | Φ | Φ | Φ | 2 | |||
| co | φ | φ | φ. | φ | Φ | φ | Φ | Ό | |||
| £ | m | m | m | ΤΤ1 | τη | τη | τη | O | m φ | ||
| φ | φ | Φ | φ | φ | Φ | φ | Φ | P | |||
| P | C0 | C0 | ω | (0 | C0 | (0 | CO | 0 | |||
| o | —' | -— | '—- | *—’ | —' | a | |||||
| Λ >φ | >φ | >φ | >φ £ | >φ | >φ | >φ | >φ | >φ | •H | >φ | |
| Ρ | £ | £ | £ | £ | £ | £ | £ | r | |||
| η | X | φ , | χ | χ | X | X | X | íí | |||
| φ | φ | Φ | Φ | φ | φ | Φ | φ. | ||||
| φ | 3 | j | j | j | j | j | j | j | í | ||
| 0 | Ό | P | j | ||||||||
| φ | 'Φ | 'φ | Χφ | -φ | Χφ | Χφ | χφ | 'Φ »> | |||
| ι— | > | > | 4J | > | > | > | > | > | m | ||
| CO | Ρ | Ή | •Η | •Η | •Η | Η | •H | '£ | |||
| '>Ί > | >Ν | >Ν | m | >Ν | >Ν | >Ν | >Ν | >N | >N | ||
| φ | |||||||||||
| •Η | |||||||||||
| £ | |||||||||||
| Η | |||||||||||
| Ρ 'Φ £ >Φ | t—1 α ω ω | ι—1 U ω ω | ,—ι α ω ω | «—1 Ο ω ω | ι—1 ο ω OT | X tu S XI ω | X X 12 X ω | X X s X CQ | ω s o | ||
| >φ | |||||||||||
| £ | |||||||||||
| £ | |||||||||||
| CQ | |||||||||||
| Ί | |||||||||||
| υ | |||||||||||
| ί | |||||||||||
| £ | |||||||||||
| m | |||||||||||
| 1 | |||||||||||
| Ρ | |||||||||||
| .1? | Φ Φ > | Γ | Ρ | σ\ | Ρ | σ\ | CO | σ> | X | ||
| Οι | CT) | ΓΟ | Oh | ΟχΙ | ΓΟ | Οχ] | kO | Γ- | |||
| φ υ φ | ι—1 | ω LO | r—1 | ΓΏ | 1θ | Ρ | CO | c—1 | |||
| ω | ω | S | ω | ω | Ch | w | ω | ||||
| LO | LO | O | LO | LO | LO | IX | X | ||||
| ρ: | |||||||||||
| •Η | |||||||||||
| Ρ | |||||||||||
| Η | |||||||||||
| Ρ | |||||||||||
| £ | |||||||||||
| Φ | |||||||||||
| Ό | |||||||||||
| Ρ |
Claims (20)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob rekonstituce zvířecího embrya, vyznačující se tím, že zahrnuje přenos jádra dárcovské buňky v klidovém stavu do vhodné přijímající buňky.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zvíře je kopytník.
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že zvíře je kráva nebo býk, prase, koza, ovce, velbloud nebo buvol.
- 4. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že jádro dárcovské buňky je geneticky modifikováno.
- 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že dárcovská buňky je geneticky modifikována před rekonstitucí embrya.
- 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že přijímající buňka je oocyt.
- 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že přijímající oocyt je enukleovaný.
- 8. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že dárcovská buňka je dospělá somatická buňka.
- 9. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že dárcovská buňka je embryonální somatická buňka.00 99tiJUDr. Miloš Všetečka advokát120 00 Praha 2, Hálkova 2- 39 ·· ·· 00 ·· • 0 0 0000 0000 ·· 0 0 ·····0 « «0 0 · · 000« 0 • · 000 000 0000 0 00 0000 00 «0
- 10. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že dárcovská buňka je fetální somatická buňka.
- 11. Způsob přípravy zvířete, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:(a) rekonstituce zvířecího embrya způsobem podle kteréhokoli z předcházejících nároků;(b) způsobením vývoje uvedeného zvířete z embrya; a (c) popřípadě rozmnožováním takto vzniklého zvířete.
- 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že zvířecí embryo je dále manipulováno před dokončením jeho úplného vývoj e.
- 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že z embrya je odvozeno více než jedno zvíře.
- 14. Rekonstituované zvířecí embryo, získané přenosem jádra dárcovské buňky v klidovém stavu do vhodné přijímající buňky.
- 15. Rekonstituované embryo podle dárcovská buňka je dospělá somatická nároku buňka.14, ve kterém
- 16. Rekonstituované embryo podle nároku 14, dárcovská buňka je embryonální somatická buňka.ve kterém
- 17. Rekonstituované embryo podle ' nároku 14, ve kterém dárcovská buňka je fetální somatická buňka.• 9JUDr. Miloš Všetečka advokát120 00 Praha 2, Hálkova 299 9999 • · · • 9 • 99 9999 9 999 99 • · ·9 9 99 9 9 99 9 999 9999 • ·9 99 • 99 9 99 9 99 9 9 9
- 18. Zvíře připravené způsobem podle kteréhokoli z nároků 1 až 13.
- 19. Zvíře připravené z rekonstituovaného zvířecího embrya podle kteréhokoli z nároků 14 až 17.
- 20. Buněčná linie nebo buňka, odvozená z rekonstituovaného zvířecího embrya podle kteréhokoli z nároků 14 až 17.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9517780.4A GB9517780D0 (en) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | Biological manipulation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ60898A3 true CZ60898A3 (cs) | 1998-07-15 |
Family
ID=10779998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ98608A CZ60898A3 (cs) | 1995-08-31 | 1996-08-30 | Populace buněk v klidovém stavu pro přenos jádra |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6147276A (cs) |
| EP (3) | EP0930009A1 (cs) |
| JP (2) | JP4081613B2 (cs) |
| KR (4) | KR100533476B1 (cs) |
| CN (3) | CN100422317C (cs) |
| AT (1) | ATE199115T1 (cs) |
| AU (1) | AU716956C (cs) |
| BR (1) | BR9610034B1 (cs) |
| CA (1) | CA2229568C (cs) |
| CZ (1) | CZ60898A3 (cs) |
| DE (1) | DE69611793T2 (cs) |
| DK (1) | DK0849990T3 (cs) |
| ES (1) | ES2155197T3 (cs) |
| GB (2) | GB9517780D0 (cs) |
| HK (2) | HK1004938A1 (cs) |
| HU (1) | HUP9900234A3 (cs) |
| IL (1) | IL123298A0 (cs) |
| NO (1) | NO980845L (cs) |
| NZ (3) | NZ316149A (cs) |
| PL (1) | PL325331A1 (cs) |
| SG (1) | SG75155A1 (cs) |
| SI (1) | SI0849990T1 (cs) |
| WO (1) | WO1997007669A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA967390B (cs) |
Families Citing this family (225)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5480772A (en) | 1993-02-03 | 1996-01-02 | Brandeis University | In vitro activation of a nucleus |
| GB9517780D0 (en) * | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| GB9517779D0 (en) * | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| US7332648B2 (en) | 1995-08-31 | 2008-02-19 | Roslin Institute | Unactivated oocytes in nuclear transfer to produce cultured inner cell mass cells and ungulates |
| US6077697A (en) * | 1996-04-10 | 2000-06-20 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US6025155A (en) * | 1996-04-10 | 2000-02-15 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US7696404B2 (en) | 1996-08-19 | 2010-04-13 | Advanced Cell Technology, Inc. | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation and methods for enhancing embryonic development by genetic alteration of donor cells or by tissue culture conditions |
| US6271436B1 (en) | 1996-10-11 | 2001-08-07 | The Texas A & M University System | Cells and methods for the generation of transgenic pigs |
| US6235969B1 (en) * | 1997-01-10 | 2001-05-22 | University Of Massachusetts | Cloning pigs using donor nuclei from non-quiescent differentiated cells |
| US20090092588A1 (en) * | 1997-01-10 | 2009-04-09 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloned ungulate embryos and animals, use of cells, tissues and organs thereof for transplantation therapies including parkinson's disease |
| US5945577A (en) * | 1997-01-10 | 1999-08-31 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
| US6215041B1 (en) * | 1997-01-10 | 2001-04-10 | University Of Mmassachusetts | Cloning using donor nuclei from a non-quiesecent somatic cells |
| GB9703550D0 (en) * | 1997-02-20 | 1997-04-09 | Ppl Therapeutics Scotland Ltd | Cell mediated transgenesis |
| US6011197A (en) | 1997-03-06 | 2000-01-04 | Infigen, Inc. | Method of cloning bovines using reprogrammed non-embryonic bovine cells |
| DE69840439D1 (de) | 1997-04-24 | 2009-02-26 | Univ Washington | Zielgerichtete genveraenderung mit parvoviralen vektoren |
| US6921814B2 (en) | 1997-06-19 | 2005-07-26 | The General Hospital Corporation | Torsin, torsin-related genes and methods of detecting neuronal disease |
| CA2294472C (en) | 1997-06-19 | 2010-06-15 | The General Hospital Corporation | Torsin, torsin genes, and methods of use |
| CA2294916A1 (en) * | 1997-07-03 | 1999-01-14 | University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from non-serum starved, differentiated cells |
| AU8587598A (en) * | 1997-07-26 | 1999-02-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Trans-species nuclear transfer |
| WO1999009817A1 (en) * | 1997-08-22 | 1999-03-04 | Biotechnology And Biological Sciences Research Council | Use of mariner transposan in the production of transgenic animals |
| AU1581899A (en) * | 1997-10-28 | 1999-05-17 | Biotransplant Incorporated | Nuclear transfer for production of transgenic animal embryo |
| EP0972017B1 (de) * | 1998-01-16 | 2004-10-06 | Agrobiogen GmbH | Effizienter kerntransfer mit fetalen fibroblasten |
| US6331659B1 (en) * | 1998-01-21 | 2001-12-18 | University Of Hawaii | Cumulus cells as nuclear donors |
| JP2002511234A (ja) * | 1998-03-16 | 2002-04-16 | リレグ ピーティーワイ リミテッド | ブタの核移植 |
| AUPP294898A0 (en) * | 1998-04-15 | 1998-05-07 | Monash University | Method of nuclear transfer |
| GB9808325D0 (en) * | 1998-04-20 | 1998-06-17 | Ltr Ciz Di Associazione Italia | Source of nuclei for nuclear transfer |
| GB9809178D0 (en) * | 1998-04-29 | 1998-07-01 | Univ Edinburgh | Nuclear reprogramming of somatic cells |
| AU6218899A (en) * | 1998-10-12 | 2000-05-01 | Geron Bio-Med Limited | Porcine oocytes with improved developmental competence |
| JP4523165B2 (ja) * | 1998-11-02 | 2010-08-11 | トラスティーズ オブ タフツ カレッジ | トランスジェニックおよびクローン哺乳動物 |
| US6781030B1 (en) | 1998-11-02 | 2004-08-24 | Trustee Of Tufts College, Ballou Hall | Methods for cloning mammals using telophase oocytes |
| US6580017B1 (en) | 1998-11-02 | 2003-06-17 | Genzyme Transgenics Corporation | Methods of reconstructed goat embryo transfer |
| EP1375654A3 (en) * | 1998-11-02 | 2008-01-16 | GTC Biotherapeutics, Inc. | Transgenic and cloned mammals |
| AU2003204830B2 (en) * | 1998-11-02 | 2007-08-30 | Gtc Biotherapeutics, Inc. | Transgenic and cloned mammals |
| WO2000030436A1 (en) | 1998-11-19 | 2000-06-02 | Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd. | Stabilisation of milk from transgenic animals |
| US6700037B2 (en) | 1998-11-24 | 2004-03-02 | Infigen, Inc. | Method of cloning porcine animals |
| US6258998B1 (en) | 1998-11-24 | 2001-07-10 | Infigen, Inc. | Method of cloning porcine animals |
| NZ550899A (en) * | 1999-01-13 | 2008-07-31 | Revivicor Inc | Double nuclear transfer method and the production of a non human animal thereby |
| GB9903804D0 (en) * | 1999-02-20 | 1999-04-14 | Univ Sheffield | Pluripotential cells-2 |
| GB9903805D0 (en) * | 1999-02-20 | 1999-04-14 | Univ Sheffield | Pluripotential cells-1 |
| EP2301947A3 (en) | 1999-02-26 | 2011-11-23 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Secreted proteins and uses thereof |
| US20020012660A1 (en) * | 1999-03-04 | 2002-01-31 | Alan Colman | Method of preparing a somatic cells for nuclear transfer |
| ATE452973T1 (de) * | 1999-03-04 | 2010-01-15 | Revivicor Inc | Genetische veränderung von somatischen zellen und deren verwendungen |
| EP1179053A1 (en) * | 1999-04-28 | 2002-02-13 | Universite De Montreal | Telophase enucleated oocytes for nuclear transfer |
| AU4389699A (en) * | 1999-06-04 | 2000-12-28 | Istituto Zootecnico E Caseario Per La Sardegna | Process for reconstructing a non-human animal embryo by nuclear transfer and preparing the animal therefrom, and embryos and animals obtained thereby |
| WO2001000855A1 (en) | 1999-06-23 | 2001-01-04 | Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd. | Fusion proteins incorporating lysozyme |
| IL147179A0 (en) * | 1999-06-30 | 2002-08-14 | Advanced Cell Tech Inc | Cytoplasmic transfer to de-differentiate recipient cells |
| EP1117763A4 (en) * | 1999-06-30 | 2004-12-01 | Hwang Woo Suk | METHOD FOR PRODUCING CLONED TIGERS BY MEANS OF INTERSPEZIES CORE TRANSPLANTING TECHNOLOGY |
| EP1109891A4 (en) | 1999-06-30 | 2004-11-17 | Hwang Woo Suk | PROCESS FOR PRODUCING CLONE COWS |
| US7291714B1 (en) | 1999-06-30 | 2007-11-06 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Glycoprotein VI and uses thereof |
| EP1109890A4 (en) * | 1999-06-30 | 2004-12-29 | Hwang Woo Suk | METHOD FOR PRODUCING CLONED, HUMAN EMBRYOS BY MEANS OF INTERSPEZIES CORE TRANSPLANTING TECHNOLOGY. |
| MXPA02001877A (es) | 1999-08-23 | 2002-08-20 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Pd-1, un receptor para b7-4, y usos del mismo. |
| WO2002064799A2 (en) | 1999-09-28 | 2002-08-22 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Optimized messenger rna |
| EP2275559A3 (en) | 1999-09-28 | 2011-03-23 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Optimized messenger RNA |
| AU783143B2 (en) * | 1999-09-30 | 2005-09-29 | Gtc Biotherapeutics, Inc. | Methods of producing cloned and transgenic mammals |
| US7820878B2 (en) * | 1999-11-19 | 2010-10-26 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins |
| US7074983B2 (en) * | 1999-11-19 | 2006-07-11 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transgenic bovine comprising human immunoglobulin loci and producing human immunoglobulin |
| US7414170B2 (en) * | 1999-11-19 | 2008-08-19 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transgenic bovines capable of human antibody production |
| KR100417566B1 (ko) * | 1999-11-19 | 2004-02-05 | 한국생명공학연구원 | 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법 |
| WO2001035735A1 (en) * | 1999-11-19 | 2001-05-25 | Hematech, Llc | Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins |
| US6635802B1 (en) * | 2000-01-10 | 2003-10-21 | The Texas A&M University System | Nuclear transfer using cells cultured in serum starvation media containing apoptosis inhibitors |
| GB0001401D0 (en) * | 2000-01-22 | 2000-03-08 | Univ Edinburgh | Methods for amplifying genetic material and use thereof |
| US6906238B2 (en) | 2000-03-15 | 2005-06-14 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Effective nuclear reprogramming in mammals using CDK2 inhibitors |
| US20040033600A1 (en) | 2001-03-21 | 2004-02-19 | Palli Subba Reddy | Ecdysone receptor-based inducible gene expression system |
| GB2360522A (en) | 2000-03-24 | 2001-09-26 | Geron Corp | A strategy for maintaining pregnancy |
| AU2001261650A1 (en) * | 2000-05-15 | 2001-11-26 | Geron Corporation | Ovine tissue for xenotransplantation |
| EP1290227B1 (en) | 2000-06-05 | 2009-08-12 | Genetics Institute, LLC | Compositions, kits, and methods for identification and modulation of type i diabetes |
| AU2001273096B8 (en) | 2000-06-28 | 2005-10-13 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | PD-L2 molecules: novel PD-1 ligands and uses therefor |
| WO2002009510A2 (en) * | 2000-08-01 | 2002-02-07 | Xy Genetics, Llc | Methods of selecting and cloning animals |
| NZ524523A (en) | 2000-08-03 | 2006-02-24 | Therapeutic Human Polyclonals | Production of humanized antibodies in transgenic animals |
| US6677500B2 (en) | 2000-08-15 | 2004-01-13 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Ungulates expressing exogenous IGF-I in their milk |
| WO2002019811A2 (en) * | 2000-09-06 | 2002-03-14 | Nexia Biotechnologies, Inc. | Generation of transgenic animals using nuclear transfer and oocytes at the germinal vesicle stage |
| US20040029825A1 (en) * | 2001-10-03 | 2004-02-12 | Davies Christopher J | Methods of minimizing immunological rejection of a nuclear transfer fetus |
| US8105825B2 (en) * | 2000-10-03 | 2012-01-31 | Intrexon Corporation | Multiple inducible gene regulation system |
| FR2814642B1 (fr) | 2000-10-03 | 2005-07-01 | Ass Pour Le Dev De La Rech En | Souris transgenique pour la recombinaison ciblee mediee par la cre-er modifiee |
| BR0115715A (pt) | 2000-11-28 | 2004-02-03 | Wyeth Corp | Análise de expressão de ácidos nucleìcos e polipeptìdeos úteis na diagnose e tratamento de câncer da próstata |
| EP2295606A1 (en) | 2000-11-28 | 2011-03-16 | Wyeth LLC | Expression analysis of KIAA nucleic acids and polypeptides useful in the diagnosis and treatment of prostate cancer |
| US7491534B2 (en) | 2000-12-22 | 2009-02-17 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Methods for altering cell fate to generate T-cells specific for an antigen of interest |
| US20020142397A1 (en) | 2000-12-22 | 2002-10-03 | Philippe Collas | Methods for altering cell fate |
| ATE466089T1 (de) | 2000-12-22 | 2010-05-15 | Agronomique Inst Nat Rech | Positionsunabhängige und gewebespezifische expression eines transgens in der milch eines transgen-tieres |
| AU2002232858B2 (en) * | 2000-12-22 | 2007-01-11 | Sab, Llc | Methods for cloning mammals using reprogrammed donor chromatin or donor cells |
| EP1860199B1 (en) | 2001-01-12 | 2014-03-05 | Exelixis, Inc. | Modulating insulin receptor signaling |
| MXPA03006751A (es) | 2001-01-30 | 2005-04-08 | Amy K Rebholtz | Metodos para el manejo de recipientes para embriones. |
| WO2002062131A2 (en) * | 2001-02-02 | 2002-08-15 | Infigen, Inc. | Method of cloning transgenic mammalian animals using pseudonuclei |
| US7531326B2 (en) * | 2001-02-20 | 2009-05-12 | Intrexon Corporation | Chimeric retinoid X receptors and their use in a novel ecdysone receptor-based inducible gene expression system |
| CA2438832A1 (en) | 2001-02-23 | 2002-09-06 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Transgenic knockouts of bace-1 |
| JP2002262716A (ja) * | 2001-03-07 | 2002-09-17 | National Agricultural Research Organization | 株化細胞を用いて家畜個体を作出する方法 |
| WO2002072762A2 (en) * | 2001-03-08 | 2002-09-19 | Advanced Cell Technology, Inc. | Use of rna interference for the creation of lineage specific es and other undifferentiated cells and production of differentiated cells in vitro by co-culture |
| AUPR363701A0 (en) | 2001-03-09 | 2001-04-05 | Garelag Pty Ltd | Method for the production of nuclear transfer embryos |
| US8981061B2 (en) | 2001-03-20 | 2015-03-17 | Novo Nordisk A/S | Receptor TREM (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof |
| US7126039B2 (en) * | 2001-03-21 | 2006-10-24 | Geron Corporation | Animal tissue with carbohydrate antigens compatible for human transplantation |
| AU2002242854A1 (en) * | 2001-03-21 | 2002-10-03 | Geron Corporation | Use of telomerase reverse transcriptase to create homozygous knockout animals |
| MXPA03008959A (es) | 2001-04-02 | 2004-10-15 | Wyeth Corp | Pd-1, un receptor para b7-4 y sus usos. |
| WO2002078449A2 (en) * | 2001-04-02 | 2002-10-10 | Advanced Cell Technology, Inc. | Method for facilitating the production of differentiated cell types and tissues from embryonic and adult pluripotent and multipotent cells |
| JP2005501518A (ja) | 2001-04-16 | 2005-01-20 | ワイス・ホールディングズ・コーポレイション | ポリペプチド抗原をコードしている新規ストレプトコッカスニューモニアエオープンリーディングフレームおよびその使用 |
| US20030092174A1 (en) * | 2001-05-14 | 2003-05-15 | Monika Liljedahl | Tissues or organs for use in xenotransplantation |
| US20030153044A1 (en) * | 2001-05-14 | 2003-08-14 | Monika Liljedahl | Tissues or organs for use in xenotransplantation |
| AU2002326353A1 (en) * | 2001-07-09 | 2003-01-29 | Alexion Pharmaceuticals Inc. | Cloned non-human mammals from contact inhibited donor cells |
| EP1900815B1 (en) | 2001-07-12 | 2016-09-07 | University of Massachusetts | In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing |
| ES2566561T3 (es) | 2001-07-12 | 2016-04-13 | University Of Massachusetts | Producción in vivo de ARN pequeños de interferencia que median el silenciamiento génico |
| US20030051264A1 (en) * | 2001-07-31 | 2003-03-13 | Monika Liljedahl | Genetically modified cows having reduced susceptibility to mad cow disease |
| US20030211603A1 (en) * | 2001-08-14 | 2003-11-13 | Earp David J. | Reprogramming cells for enhanced differentiation capacity using pluripotent stem cells |
| AU2002352558A1 (en) | 2001-11-09 | 2003-05-26 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Pgc-1beta, a novel pgc-1 homologue and uses therefor |
| US20030134422A1 (en) * | 2002-01-16 | 2003-07-17 | Sayre Chauncey Bigelow | Stem cell maturation for all tissue lines |
| US20050090004A1 (en) * | 2003-01-16 | 2005-04-28 | Sayre Chauncey B. | Stem cell maturation for all tissue lines |
| US20050170506A1 (en) * | 2002-01-16 | 2005-08-04 | Primegen Biotech Llc | Therapeutic reprogramming, hybrid stem cells and maturation |
| AU2003251286B2 (en) * | 2002-01-23 | 2007-08-16 | The University Of Utah Research Foundation | Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases |
| KR100502695B1 (ko) * | 2002-02-28 | 2005-07-25 | 한국생명공학연구원 | 형질전환 효율이 향상된 복제수정란의 대량 생산 방법 |
| US20030232410A1 (en) * | 2002-03-21 | 2003-12-18 | Monika Liljedahl | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
| GB0207299D0 (en) * | 2002-03-28 | 2002-05-08 | Franks Christopher R | Stem cell therapy |
| AU2003230725A1 (en) * | 2002-04-01 | 2003-10-20 | Gtc Biotherapeutics, Inc. | A method for selecting cell lines to be used for nuclear transfer in mammalian species |
| US20030207448A1 (en) * | 2002-05-06 | 2003-11-06 | Revera Gregory Henry | Methodologies for the creation of pluripotent or multipotent human stem cells without creating or destroying a human embryo |
| GB0211904D0 (en) * | 2002-05-23 | 2002-07-03 | Medical Res Council | Nuclear transfer |
| US7410797B2 (en) * | 2002-06-11 | 2008-08-12 | Ogle Roy C | Meningeal-derived stem cells |
| US7612250B2 (en) * | 2002-07-29 | 2009-11-03 | Trustees Of Tufts College | Nuclear transfer embryo formation method |
| JP2006514823A (ja) | 2002-08-20 | 2006-05-18 | ミレニアム ファーマスーティカルズ インク | 子宮頸癌の同定、評価、予防および治療を行うための組成物、キットおよび方法 |
| CA2497913C (en) * | 2002-09-05 | 2014-06-03 | California Institute Of Technology | Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting |
| CA2501752A1 (en) | 2002-10-10 | 2004-04-22 | Wyeth | Compositions, organisms and methodologies employing a novel human kinase |
| US20040077077A1 (en) * | 2002-10-18 | 2004-04-22 | Xiangzhong Yang | Novel methods for the production of cloned mammals, mammals cloned according to the methods, and methods of use of same |
| US7208306B2 (en) | 2002-10-24 | 2007-04-24 | Wyeth | Compositions employing a novel human protein phosphatase |
| JP2006505291A (ja) | 2002-11-08 | 2006-02-16 | ヘマテック，エルエルシー | プリオンタンパク質活性が低減されたトランスジェニック有蹄動物及びその用途 |
| CA2505416A1 (en) | 2002-11-21 | 2004-06-10 | Wyeth | Methods for diagnosing rcc and other solid tumors |
| AU2003290664A1 (en) | 2002-11-27 | 2004-06-23 | Wei Liu | Compositions, organisms and methodologies employing a novel human kinase |
| EP1578192A4 (en) * | 2002-12-10 | 2006-03-29 | Gtc Biotherapeutics Inc | METHOD AND SYSTEM FOR USING SOMATIC CELL CELL NUCLEAR TRANSFER EMBRYOS AS CELL DONORS FOR ADDITIONAL NUCLEAR TRANSFER |
| EP2474632B1 (en) | 2002-12-20 | 2015-08-12 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction, methods of detection and uses thereof |
| CA2511907A1 (en) | 2003-01-06 | 2004-07-22 | Wyeth | Compositions and methods for diagnosing and treating colon cancers |
| FR2855183B1 (fr) | 2003-05-23 | 2005-08-12 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede de clonage du rat par transfert nucleaire |
| DK1633767T3 (en) | 2003-06-02 | 2019-03-25 | Univ Massachusetts | METHODS AND COMPOSITIONS FOR MANAGING THE EFFECT OF RNA SILENCING |
| US8309704B2 (en) | 2003-06-02 | 2012-11-13 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNAi |
| US20120196370A1 (en) | 2010-12-03 | 2012-08-02 | Fyodor Urnov | Methods and compositions for targeted genomic deletion |
| US8409861B2 (en) * | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
| US11311574B2 (en) | 2003-08-08 | 2022-04-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| US7888121B2 (en) * | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| CA2535897A1 (en) | 2003-08-14 | 2005-02-24 | Exelixis, Inc. | Sulfs as modifiers of the beta catenin pathway and methods of use |
| CN1964986A (zh) | 2003-10-07 | 2007-05-16 | 千年药品公司 | 用于鉴定、评价、预防和治疗卵巢癌的核酸分子和蛋白质 |
| EP1681988B1 (en) | 2003-11-12 | 2015-04-08 | The Children's Hospital Medical Center | Method for diagnosis and treatment of pulmonary disorders |
| EP1711622A2 (en) | 2003-11-26 | 2006-10-18 | Applera Corporation | Genetic polymorphisms associated with cardiovascular disorders and drug response, methods of detection and uses thereof |
| US7972854B2 (en) | 2004-02-05 | 2011-07-05 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| JP2007533328A (ja) | 2004-04-22 | 2007-11-22 | キリンホールディングス株式会社 | トランスジェニック動物及びその用途 |
| JP5236286B2 (ja) | 2004-05-07 | 2013-07-17 | セレラ コーポレーション | 肝線維症に関連する遺伝的多型、その検出方法および使用 |
| JP2006081542A (ja) * | 2004-08-18 | 2006-03-30 | Institute Of Physical & Chemical Research | クローン哺乳動物の作成方法 |
| JP2008517931A (ja) | 2004-10-22 | 2008-05-29 | ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド | 脂質関連疾患および障害を処置するための、ＰＧＣ−１βを調節するための方法および組成物 |
| GB0426146D0 (en) | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Bioxell Spa | Therapeutic peptides and method |
| CN1274829C (zh) | 2004-12-10 | 2006-09-13 | 四川大学华西医院 | 抗eb病毒所致肿瘤多肽及其应用与制备方法 |
| EP2113572B1 (en) | 2005-03-11 | 2012-12-05 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with coronary heart disease, methods of detection and uses thereof |
| US20060286666A1 (en) * | 2005-06-17 | 2006-12-21 | Kang Ji Y | Methods and apparatuses for culturing stem cell using biomaterial shell |
| CA2612479A1 (en) * | 2005-06-29 | 2007-05-10 | Cameron Malcolm Lang Clokie | Production of bone morphogenic proteins (bmps) in transgenic mammals |
| KR100733012B1 (ko) | 2005-07-26 | 2007-06-28 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 복제된 개과 동물 및 이의 생산 방법 |
| AU2006292827B2 (en) | 2005-08-09 | 2013-02-14 | Revivicor, Inc. | Transgenic ungulates expressing CTLA4-IG and uses thereof |
| JP2009507835A (ja) | 2005-09-09 | 2009-02-26 | ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ | 抗体、アゴニストおよびアンタゴニストを用いてニューリチン遺伝子をターゲティングすることによる調節性ｔ細胞およびｄｃの機能の操作 |
| AU2006292224B2 (en) | 2005-09-19 | 2013-08-01 | Histogenics Corporation | Cell-support matrix and a method for preparation thereof |
| US7799530B2 (en) | 2005-09-23 | 2010-09-21 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with cardiovascular disorders and drug response, methods of detection and uses thereof |
| US7695911B2 (en) | 2005-10-26 | 2010-04-13 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with Alzheimer's Disease, methods of detection and uses thereof |
| WO2007124019A2 (en) | 2006-04-21 | 2007-11-01 | Gtc Biotherapeutics, Inc. | Methods and products related to the transfer of molecules from blood to the mammary gland |
| PE20081216A1 (es) | 2006-09-01 | 2008-09-04 | Therapeutic Human Polyclonals Inc | Expresion mejorada de la inmunoglobulina humana o humanizada en animales transgenicos no humanos |
| EP2636754B1 (en) | 2006-09-11 | 2015-03-04 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with psoriasis, methods of detection and uses thereof |
| WO2008051511A2 (en) | 2006-10-20 | 2008-05-02 | Applera Corporation | Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis, methods of detection and uses thereof |
| KR101398220B1 (ko) * | 2006-10-30 | 2014-05-22 | 건국대학교 산학협력단 | 형질전환 배아 생성방법 |
| WO2008085891A1 (en) * | 2007-01-05 | 2008-07-17 | Worcester Polytechnic Institute | Oocyte spindle-associated factors improve somatic cell cloning |
| KR100829426B1 (ko) | 2007-01-17 | 2008-05-15 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 복제개의 생산 방법 |
| US20080222745A1 (en) * | 2007-03-07 | 2008-09-11 | Utah State University | Colcemid-Treatment of Oocytes to enhance Nuclear Transfer Cloning |
| KR100868245B1 (ko) | 2007-05-29 | 2008-11-11 | 강원대학교산학협력단 | 데메콜친 처리에 의한 효율적인 복제 동물의 생산방법 |
| EP2214708A4 (en) | 2007-10-26 | 2011-01-12 | Centocor Ortho Biotech Inc | VECTORS, HOST CELLS, METHODS OF PRODUCTION AND USES |
| US8039212B2 (en) | 2007-11-05 | 2011-10-18 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with liver fibrosis, methods of detection and uses thereof |
| WO2009088189A2 (ko) | 2008-01-04 | 2009-07-16 | Seoul National University Industry Foundation | 형질전환된 복제개의 생산방법 |
| US20090221620A1 (en) | 2008-02-20 | 2009-09-03 | Celera Corporation | Gentic polymorphisms associated with stroke, methods of detection and uses thereof |
| JP5670755B2 (ja) | 2008-03-12 | 2015-02-18 | ザ ロックフェラー ユニバーシティ | 翻訳プロファイリング及び分子表現型解析のための方法及び組成物 |
| US8288094B2 (en) | 2008-04-09 | 2012-10-16 | Institut Pasteur | APOBEC3 mediated DNA editing |
| EP2987498B1 (en) | 2008-05-02 | 2017-07-05 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Treatment of bleeding with low half-life fibrinogen |
| CN102144027B (zh) * | 2008-07-07 | 2016-04-06 | 宝生物工程株式会社 | 生产多能干细胞的方法 |
| EP2878680B1 (en) | 2008-07-09 | 2016-06-08 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof |
| US9181315B2 (en) | 2009-01-08 | 2015-11-10 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for induced brown fat differentiation |
| EP2421980A2 (en) | 2009-04-23 | 2012-02-29 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for cancer |
| EP2267153A1 (en) | 2009-05-26 | 2010-12-29 | Université Claude Bernard Lyon 1 | Identification of netrin-1 receptor unc5c gene mutation in solid cancers |
| WO2011002988A1 (en) | 2009-07-01 | 2011-01-06 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for severe combined immunodeficiency (scid) |
| WO2011011678A2 (en) | 2009-07-24 | 2011-01-27 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for cytokine-cytokine signaling pathways |
| EP2460016A2 (en) | 2009-07-30 | 2012-06-06 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for pharmacokinetics |
| US20110035816A1 (en) | 2009-08-05 | 2011-02-10 | Ostertag Eric M | Genetically Modified Rat Models for Drug Metabolism |
| WO2011022634A2 (en) | 2009-08-20 | 2011-02-24 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for pain |
| US9420770B2 (en) | 2009-12-01 | 2016-08-23 | Indiana University Research & Technology Corporation | Methods of modulating thrombocytopenia and modified transgenic pigs |
| AU2011207210A1 (en) | 2010-01-22 | 2012-08-16 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions,kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of metabolic disorders |
| TWI518325B (zh) | 2010-02-04 | 2016-01-21 | 自治醫科大學 | 對ａｌｋ抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療 |
| US10745467B2 (en) | 2010-03-26 | 2020-08-18 | The Trustees Of Dartmouth College | VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders |
| US20150231215A1 (en) | 2012-06-22 | 2015-08-20 | Randolph J. Noelle | VISTA Antagonist and Methods of Use |
| CN107098958B (zh) | 2010-03-26 | 2021-11-05 | 达特茅斯大学理事会 | Vista调节性t细胞介体蛋白、vista结合剂及其用途 |
| US8383793B2 (en) | 2010-04-15 | 2013-02-26 | St. Jude Children's Research Hospital | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cancer resistant to anaplastic lymphoma kinase (ALK) kinase inhibitors |
| US20110269735A1 (en) | 2010-04-19 | 2011-11-03 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with statin response and cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof |
| EP2603581B1 (en) | 2010-08-11 | 2019-07-17 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Cocultures of cumulus cells and embryos during in vitro fertilization procedures |
| US20120108651A1 (en) | 2010-11-02 | 2012-05-03 | Leiden University Medical Center (LUMC) Acting on Behalf of Academic Hospital Leiden (AZL) | Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis and statin response, methods of detection and uses thereof |
| US8748178B2 (en) | 2010-11-23 | 2014-06-10 | The New York Stem Cell Foundation | Method for producing pluripotent stem cells |
| ES2680636T3 (es) | 2011-02-14 | 2018-09-10 | Revivicor Inc. | Cerdos genéticamente modificados para xenotrasplante de xenoinjertos vascularizados y derivados de los mismos |
| WO2012129198A1 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for obesity and diabetes |
| KR102627319B1 (ko) | 2011-05-16 | 2024-01-23 | 더 큐레이터스 오브 더 유니버시티 오브 미주리 | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 내성 동물 |
| US10093705B2 (en) | 2011-09-13 | 2018-10-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for brown fat induction and activity using FNDC5 |
| CN102391989A (zh) * | 2011-10-12 | 2012-03-28 | 扬州大学 | 转基因动物重组产物精确分析检验方法 |
| LT2814844T (lt) | 2012-02-15 | 2017-10-25 | Novo Nordisk A/S | Antikūnai, kurie jungiasi ir blokuoja ekspresuotą ant mieloidinių ląstelių inicijuojantį receptorių 1 (trem-1) |
| RS57827B1 (sr) | 2012-02-15 | 2018-12-31 | Novo Nordisk As | Antitela koja vezuju protein 1 prepoznavanja peptidoglikana |
| US9550830B2 (en) | 2012-02-15 | 2017-01-24 | Novo Nordisk A/S | Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1) |
| US9890215B2 (en) | 2012-06-22 | 2018-02-13 | King's College London | Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer |
| EP2864352B1 (en) | 2012-06-22 | 2018-08-08 | The Trustees Of Dartmouth College | Novel vista-ig constructs and the use of vista-ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders |
| CA2884704C (en) | 2012-09-07 | 2023-04-04 | Randolph J. Noelle | Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer |
| US20140115728A1 (en) | 2012-10-24 | 2014-04-24 | A. Joseph Tector | Double knockout (gt/cmah-ko) pigs, organs and tissues |
| EP2956003A2 (en) | 2013-02-13 | 2015-12-23 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Proteins with modified glycosylation and methods of production thereof |
| EP2956480B1 (en) | 2013-02-13 | 2019-09-04 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Highly galactosylated anti-tnf-alpha antibodies and uses thereof |
| US20160102319A1 (en) | 2013-04-30 | 2016-04-14 | Konkuk University Industrial Cooperation Corp. | Cmp-acetylneuraminic acid hydroxylase targeting vector, transgenic animal for xenotransplantation introduced with the vector, and method of manufacturing the same |
| US11014987B2 (en) | 2013-12-24 | 2021-05-25 | Janssen Pharmaceutics Nv | Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same |
| MX369173B (es) | 2013-12-24 | 2019-10-30 | Janssen Pharmaceutica Nv | Anticuerpos y fragmentos anti-vista. |
| EP3094736A4 (en) | 2014-01-14 | 2017-10-25 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of melanoma using pd-l1 isoforms |
| CN107073109B (zh) | 2014-06-11 | 2021-08-06 | 凯西·A·格林 | Vista激动剂和拮抗剂抑制或增强体液免疫的用途 |
| MX2017000484A (es) | 2014-07-17 | 2017-05-01 | Novo Nordisk As | Mutagenesis dirigida al sitio anticuerpos receptor desencadenante expresado en las celulas mieloides de tipo 1 (trem-1) para reducir la viscosidad. |
| US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
| WO2016090347A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Immunext, Inc. | Identification of vsig8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/vsig8 modulators |
| US9913461B2 (en) | 2014-12-09 | 2018-03-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mouse whose genome comprises a humanized CD274 gene |
| CN104823921A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-08-12 | 蒙汉勤 | 一种用于人体烧伤皮肤移植及医学实验的小型香猪的饲养技术 |
| BR112017027870A2 (pt) | 2015-06-24 | 2018-08-28 | Janssen Pharmaceutica Nv | anticorpos e fragmentos anti-vista |
| CN109475107A (zh) | 2015-08-06 | 2019-03-15 | 密苏里大学管理者 | 具有修饰的cd163基因的抗病原体动物 |
| AU2016343978A1 (en) | 2015-10-29 | 2018-05-17 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for identification, assessment, prevention, and treatment of metabolic disorders using PM20D1 and N-lipidated amino acids |
| BR112018016461A2 (pt) | 2016-02-12 | 2019-10-01 | Janssen Pharmaceutica Nv | anticorpos e fragmentos anti-vista, usos dos mesmos e métodos de identificação dos mesmos |
| MX2018012469A (es) | 2016-04-15 | 2019-07-04 | Immunext Inc | Anticuerpos vista antihumanos y uso de los mismos. |
| EA202092302A1 (ru) | 2018-04-02 | 2021-02-02 | Бристол-Майерс Сквибб Компани | Антитела к trem-1 и их применения |
| AU2019247490A1 (en) | 2018-04-06 | 2020-10-22 | Children's Medical Center Corporation | Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting |
| US11160260B2 (en) | 2018-04-17 | 2021-11-02 | The Curators Of The University Of Missouri | Methods for protecting porcine fetuses from infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US11548938B2 (en) | 2018-08-21 | 2023-01-10 | Quidel Corporation | DbpA antibodies and uses thereof |
| JP2023507083A (ja) | 2019-12-19 | 2023-02-21 | クイデル コーポレーション | モノクローナル抗体融合物 |
| JP2023551404A (ja) | 2020-11-20 | 2023-12-08 | レビビコア， インコーポレイテッド | 異種間移植のための成長ホルモン受容体ノックアウトを有する多重トランスジェニックブタ |
| US20230255185A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-08-17 | Revivicor, Inc. | Multitransgenic pigs comprising ten genetic modifications for xenotransplantation |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR890003947B1 (ko) * | 1985-12-11 | 1989-10-13 | 가부시기가이샤 시마즈세이사구쇼 | 세포융합장치 |
| US5057420A (en) * | 1987-06-05 | 1991-10-15 | Granada Biosciences, Inc. | Bovine nuclear transplantation |
| GB8714426D0 (en) * | 1987-06-19 | 1987-07-22 | Agricultural & Food Res | Culture technique |
| CA2059199A1 (en) * | 1992-01-10 | 1993-07-11 | Steen Willadsen | Method for producing mature reconstituted mammalian eggs by nuclear transplantation |
| GB2265909B (en) * | 1992-04-01 | 1996-03-20 | Inst Of Animal Physiology And | Fusion of donor nucleus with recipient cytoplast in the absence of calcium ion |
| WO1994006422A1 (en) * | 1992-09-22 | 1994-03-31 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Use of taxol for treating lymphomas and breast cancer |
| CA2092258A1 (en) * | 1992-12-30 | 1994-07-01 | Steven L. Stice | Synchronized donor cells for bovine nuclear transfer |
| US5496720A (en) * | 1993-02-10 | 1996-03-05 | Susko-Parrish; Joan L. | Parthenogenic oocyte activation |
| US5523226A (en) * | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
| EP0711158B2 (en) * | 1993-07-29 | 2008-07-23 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Method of treating atherosclerosis or restenosis using microtubule stabilizing agent |
| AU1439295A (en) * | 1993-12-17 | 1995-07-03 | Abs Global, Inc. | Ungulate preblastocyst derived embryonic stem cells and use thereof to produce cloned transgenic and chimeric ungulates |
| WO1995017500A1 (en) * | 1993-12-23 | 1995-06-29 | Abs Global, Inc. | Embryonic stem cells as nuclear donors and nuclear transfer techniques to produce chimeric and transgenic animals |
| GB9417831D0 (en) * | 1994-09-05 | 1994-10-26 | Biotech & Biolog Scien Res | Biological manipulation |
| US7332648B2 (en) * | 1995-08-31 | 2008-02-19 | Roslin Institute | Unactivated oocytes in nuclear transfer to produce cultured inner cell mass cells and ungulates |
| GB9517779D0 (en) * | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| GB9517780D0 (en) * | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| US6235969B1 (en) * | 1997-01-10 | 2001-05-22 | University Of Massachusetts | Cloning pigs using donor nuclei from non-quiescent differentiated cells |
| US6215041B1 (en) * | 1997-01-10 | 2001-04-10 | University Of Mmassachusetts | Cloning using donor nuclei from a non-quiesecent somatic cells |
| US5945577A (en) * | 1997-01-10 | 1999-08-31 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
| US6011197A (en) * | 1997-03-06 | 2000-01-04 | Infigen, Inc. | Method of cloning bovines using reprogrammed non-embryonic bovine cells |
| AU8587598A (en) * | 1997-07-26 | 1999-02-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Trans-species nuclear transfer |
| US6225243B1 (en) * | 1998-08-03 | 2001-05-01 | Bba Nonwovens Simpsonville, Inc. | Elastic nonwoven fabric prepared from bi-component filaments |
| AU6218899A (en) * | 1998-10-12 | 2000-05-01 | Geron Bio-Med Limited | Porcine oocytes with improved developmental competence |
| US20050156424A1 (en) * | 2000-02-29 | 2005-07-21 | Thyssenkrupp Presta Ag | Steering column and manufacturing method thereof |
-
1995
- 1995-08-31 GB GBGB9517780.4A patent/GB9517780D0/en active Pending
-
1996
- 1996-08-30 HU HU9900234A patent/HUP9900234A3/hu unknown
- 1996-08-30 KR KR1019980701381A patent/KR100533476B1/ko active IP Right Review Request
- 1996-08-30 PL PL96325331A patent/PL325331A1/xx unknown
- 1996-08-30 KR KR1020057014692A patent/KR100793220B1/ko active IP Right Review Request
- 1996-08-30 CN CNB2005101163327A patent/CN100422317C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 BR BRPI9610034-6A patent/BR9610034B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 EP EP98203752A patent/EP0930009A1/en not_active Withdrawn
- 1996-08-30 AU AU68310/96A patent/AU716956C/en not_active Expired
- 1996-08-30 EP EP99204105A patent/EP1005789A3/en not_active Withdrawn
- 1996-08-30 ZA ZA9607390A patent/ZA967390B/xx unknown
- 1996-08-30 WO PCT/GB1996/002099 patent/WO1997007669A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-08-30 CZ CZ98608A patent/CZ60898A3/cs unknown
- 1996-08-30 KR KR1020077007530A patent/KR20070047848A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-08-30 ES ES96928587T patent/ES2155197T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 CN CNB961978910A patent/CN1230533C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 NZ NZ316149A patent/NZ316149A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 CN CNA2005101163312A patent/CN1769431A/zh active Pending
- 1996-08-30 AT AT96928587T patent/ATE199115T1/de active
- 1996-08-30 DE DE69611793T patent/DE69611793T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 DK DK96928587T patent/DK0849990T3/da active
- 1996-08-30 EP EP96928587A patent/EP0849990B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 GB GB9802915A patent/GB2318578B/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 SI SI9630282T patent/SI0849990T1/xx unknown
- 1996-08-30 IL IL12329896A patent/IL123298A0/xx unknown
- 1996-08-30 JP JP50999697A patent/JP4081613B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-30 SG SG1999000937A patent/SG75155A1/en unknown
- 1996-08-30 KR KR1020067006297A patent/KR20060053008A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-08-30 CA CA2229568A patent/CA2229568C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 NZ NZ337311A patent/NZ337311A/en not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-02-19 US US08/802,282 patent/US6147276A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-02-27 NO NO980845A patent/NO980845L/no unknown
- 1998-05-13 HK HK98104138A patent/HK1004938A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-02-19 NZ NZ334288A patent/NZ334288A/en not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-08-11 US US10/915,338 patent/US7232938B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-11-03 US US11/265,113 patent/US7514258B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-30 JP JP2005345712A patent/JP2006217913A/ja active Pending
-
2006
- 2006-10-06 US US11/544,039 patent/US7355094B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-10-06 US US11/543,786 patent/US20070033664A1/en not_active Abandoned
- 2006-10-26 HK HK06111842.1A patent/HK1090089A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7232938B2 (en) | Cloning ungulates from a quiescent donor cell | |
| ES2309989T3 (es) | Oocitos inactivados que son receptores de citoplastos para transferencia nuclear. | |
| JP2002534118A (ja) | 二重核移植法及びその結果物 | |
| GB2331751A (en) | Quiescent cell populations for nuclear transfer | |
| AU2003271356B9 (en) | Quiescent cell population for nuclear transfer | |
| US7361804B1 (en) | Unactivated oocytes in nuclear transfer to produce ungulates | |
| AU2005246962A1 (en) | Quiescent cell population for nuclear transfer | |
| MXPA98001646A (en) | Cellular populations inactive for transfer celu | |
| MXPA98001645A (en) | Oocytes inactivated as receptors of cytopllasto for nuclear transfer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |