ES2309989T3 - Oocitos inactivados que son receptores de citoplastos para transferencia nuclear. - Google Patents
Oocitos inactivados que son receptores de citoplastos para transferencia nuclear. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2309989T3 ES2309989T3 ES96928586T ES96928586T ES2309989T3 ES 2309989 T3 ES2309989 T3 ES 2309989T3 ES 96928586 T ES96928586 T ES 96928586T ES 96928586 T ES96928586 T ES 96928586T ES 2309989 T3 ES2309989 T3 ES 2309989T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- human
- embryo
- nucleus
- activation
- mammal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 54
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 51
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 49
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 claims abstract description 17
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 75
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 25
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 16
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 12
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 9
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 claims 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims 1
- 208000035752 Live birth Diseases 0.000 claims 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 11
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 abstract description 11
- KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N Nocodazole Chemical compound C1=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=CC=C1C(=O)C1=CC=CS1 KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 39
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 37
- 238000011161 development Methods 0.000 description 26
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 26
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 17
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 14
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 10
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 9
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 9
- 229950006344 nocodazole Drugs 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 6
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 6
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 6
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 5
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 5
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 5
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 5
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 4
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940119336 Microtubule stabilizer Drugs 0.000 description 3
- 239000004218 Orcein Substances 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 3
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 244000144980 herd Species 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 231100000782 microtubule inhibitor Toxicity 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001550206 Colla Species 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940122255 Microtubule inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 2
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010449 nuclear transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 2
- 230000001776 parthenogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N (-)-demecolcine Chemical compound C1=C(OC)C(=O)C=C2[C@@H](NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000030939 Bubalus bubalis Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N Demecolcine Natural products C1=C(OC)C(=O)C=C2C(NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000289695 Eutheria Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001416149 Ovis ammon Species 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000010428 chromatin condensation Effects 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000002 embryonic disk Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000029115 microtubule polymerization Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000027291 mitotic cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
- C12N15/8773—Ovine embryos
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
- C12N15/8771—Bovine embryos
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA RECONSTITUIR UN EMBRION ANIMAL QUE IMPLICA LA TRANSFERENCIA DE UN NUCLEO DIPLOIDE HACIA EL INTERIOR DE UN OOCITO QUE ESTA DETENIDO EN LA METAFASE DE LA SEGUNDA DIVISION MEIOTICA. EL OOCITO NO SE ACTIVA HASTA EL MOMENTO DE LA TRANSFERENCIA, DE FORMA QUE EL NUCLEO DONANTE SE MANTIENE EXPUESTO AL CITOPLASMA RECEPTOR DURANTE UN PERIODO DE TIEMPO. EL NUCLEO DIPLOIDE PUEDE SER DONADO POR UNA CELULA EN FASE G0 O G1 DEL CICLO CELULAR EN EL MOMENTO DE LA TRANSFERENCIA. POSTERIORMENTE SE ACTIVA EL EMBRION RECONSTITUIDO. SE MANTIENE LA CORRECTA PLOIDIA DURANTE LA ACTIVACION, POR EJEMPLO, INCUBANDO EL EMBRION RECONSTITUIDO EN PRESENCIA DE UN INHIBIDOR DE MICROTUBULOS, TAL COMO NOCODAZOL. ENTONCES EL EMBRION RECONSTITUIDO PUEDE DAR LUGAR A UNO O MAS NACIMIENTOS DE ANIMALES VIVOS. LA INVENCION RESULTA UTIL PARA LA PRODUCCION DE ANIMALES TRANSGENICOS, ASI COMO DE ANIMALES NO TRANSGENICOS CON ELEVADAS VENTAJAS GENETICAS.
Description
Oocitos inactivados que son receptores de
citoplastos para transferencia nuclear.
Esta invención se refiere a la generación de
mamíferos no humanos incluyendo, pero no limitado a mamíferos no
humanos genéticamente seleccionados y/o modificados, y a células
útiles para su generación.
La reconstrucción de embriones de mamíferos no
humanos por la transferencia de un núcleo donante no humano a un
ovocito enucleado no humano o un cigoto de célula no humana permiten
producir individuos genéticamente idénticos. Esto tiene ventajas
claras tanto para la investigación (es decir, como controles
biológicos) como también en aplicaciones comerciales (es decir,
multiplicación de ganado genéticamente valioso, uniformidad de
productos de carne, gestión de animales).
La reconstrucción de embriones por transferencia
nuclear se propuso por primera vez (Spemann, Embryonic
Development and Induction 210-211 Hofner
Publishing Co., New York (1938)) con el fin de contestar a la
pregunta de equivalencia nuclear o ¿cambian los núcleos durante el
desarrollo? Mediante la transferencia de núcleos de estados
embrionarios cada vez más desarrollados, estos experimentos se
diseñaron para determinar en que punto los núcleos están limitados
para su potencial de desarrollo. Debido a limitaciones técnicas y a
la desafortunada muerte de Spemann, estos estudios no se
completaron hasta 1952, cuando se demostró en la rana que algunos
núcleos podían dirigir el desarrollo a un adulto sexualmente maduro
(Briggs and King, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 38
455-461 (1952)). Sus descubrimientos condujeron al
concepto actual de que los núcleos totipotentes equivalentes de un
solo individuo, cuando se transfieren a un huevo enucleado, podrían
dar lugar a individuos "genéticamente idénticos". En el
verdadero sentido del significado, estos individuos no serían clones
puesto que pueden variar contribuciones citoplasmáticas desconocidas
en cada uno y también habría que demostrar la ausencia de cualquier
reorganización cromosómica.
Desde la demostración de la clonación de
embriones en anfibios, se han aplicado técnicas similares a especies
de mamíferos. Estas técnicas entran en dos categorías:
1) transferencia de un núcleo donante a un
ovocito en metafase II madurado al que se le ha quitado su ADN
cromosómico, y
2) transferencia de un núcleo donante a un
cigoto de una célula fertilizada al que se le han quitado ambos
pronúcleos. En los ungulados el primer procedimiento ha sido el
método elegido, ya que no se ha descrito el desarrollo usando el
último, más que cuando los pronúcleos se intercambian.
La transferencia del núcleo donante al
citoplasma del ovocito normalmente se logra induciendo la fusión
celular. En los ungulados la fusión se induce por aplicación de un
pulso eléctrico DC a lo largo del plano de contacto/fusión de la
pareja. El mismo pulso que induce la fusión celular también activa
el ovocito receptor. Después de la reconstrucción del embrión, el
posterior desarrollo depende de un gran número de factores que
incluyen la capacidad del núcleo para dirigir el desarrollo, es
decir, totipotencia, competencia para el desarrollo del citoplasto
receptor (es decir, maduración de ovocito), activación de ovocito,
cultivo del embrión (revisado, Campbell and Wilmut en Vth World
Congress on Genetics as Applied to Livestock 20
180-187 (1994)).
Además de lo anterior, se ha demostrado que el
mantenimiento de la ploidía correcta durante le primero ciclo
celular del embrión reconstruido tiene una gran importancia
(Campbell et al., Biol. Reprod. 49
933-942 (1993); Campbell et al., Biol.
Reprod. 50 1385-1393 (1994)). Durante un solo
ciclo celular debe replicarse todo el ADN genómico solo una vez
antes de la mitosis. Si algo del ADN no se replica o se replica más
de una vez, entonces la ploidía de ese núcleo en el momento de la
mitosis será incorrecta. Los mecanismos por los que la replicación
está restringida a una vez durante cada ciclo celular no están
claros, sin embargo, algunas líneas de investigación han implicado
que el mantenimiento de una membrana nuclear intacta es crucial para
este control. Los sucesos morfológicos que se producen en el núcleo
donante después de la transferencia a un ovocito en metafase II
enucleado se han estudiado en una serie de especies que incluyen el
ratón (Czolowiska et al., J. Cell Sci. 69
19-34 (1984)), conejo (Collas and Robl, Biol.
Reprod. 45 455-455 (1991)), cerdo (Prather et
al., J. Exp. Zool. 225 355-358 (1990)),
vaca (Kanka et al., Mol. Reprod. Dev. 29
110-116 (1991)). Inmediatamente tras la fusión, la
envuelta del núcleo donante se rompe (REND) y los cromosomas
condensan prematuramente (CCP). Estos efectos son catalizados por
una actividad citoplasmática denominada factor promotor de
maduración/mitosis/meiosis (MPF). Esta actividad se encuentra en
todas las células mitóticas y meióticas, y llega a una actividad
máxima en la metafase. Los ovocitos de mamífero maduros se detienen
en la metafase de la 2ª división meiótica (metafase II) y tienen
una actividad de MPF alta. Tras la fertilización o activación, la
actividad de MPF disminuye, la segunda división meiótica se completa
y el segundo cuerpo polar es extruido, entonces la cromatina se
descondensa y se produce la formación pronuclear. En la
transferencia nuclear, los embriones se reconstruyen cuando los
niveles de MPF son altos y se produce la REND y CCP; cuando la
actividad de MPF disminuye a estos sucesos les sigue la
descondensación de la cromatina y reformación nuclear y posterior
replicación del ADN. En los embriones reconstruidos la ploidía
correcta se puede mantener en una de dos formas; primero, por
transferencia de núcleos en una etapa definida del ciclo nuclear, p.
ej., núcleos diploides de células en G1, a ovocitos en metafase II
en el momento de la activación; o segundo por activación del
ovocito receptor y transferencia del núcleo donante después de la
desaparición de la actividad de MPF. En ovejas este último
procedimiento ha dado un aumento de la frecuencia de desarrollo a la
etapa de blastocito de 21% a 55% de los embriones reconstruidos
cuando se usaban blastómeros de embriones de 16 células como
donantes nucleares. (Campbell et al., Biol. Reprod. 50
1385-1393 (1994)).
Estas mejoras en la frecuencia de desarrollo de
embriones reconstruidos no humanos todavía no han abordado la
cuestión de la reprogramación nuclear. Durante el desarrollo algunos
genes quedan "silenciados", es decir, son alterados de modo
que yo no son transcritos. Los estudios de silenciamiento han
mostrado que este "silenciamiento" se suprime durante la
formación de la célula germinal (es decir, se reprograma). Una
posibilidad es que esta reprogramación esté afectada por la
exposición de la cromatina a factores citoplasmáticos que están
presentes en las células que experimentan meiosis. Esto plantea la
cuestión de cómo se puede mimetizar esta situación durante la
reconstrucción de embriones por transferencia nuclear con el fin de
reprogramar el reloj del desarrollo del núcleo donante.
Ahora se ha encontrado que la transferencia
nuclear a un ovocito no humano detenido en la metafase II puede dar
lugar a un embrión no humano viable si se mantiene la ploidía normal
(es decir, diploidía) y si el embrión no humano no es activado en el
momento de la transferencia nuclear. El retraso en la activación
permite que el núcleo no humano permanezca expuesto al citoplasma
del receptor no humano.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona un método para reconstituir un embrión de
mamífero no humano, comprendiendo el método transferir un núcleo
diploide diferenciado no humano a un ovocito enucleado no humano que
está detenido en la metafase de la segunda división meiótica, sin
activar simultáneamente el ovocito, mantener el núcleo expuesto al
citoplasma del receptor no humano durante un periodo de tiempo
suficiente para que el embrión sea capaz de dar lugar a un nacido
vivo, y posteriormente activar el embrión reconstituido mientras se
mantiene la ploidía correcta. En esta etapa, el embrión
reconstituido no humano es una sola célula.
En principio, esta invención es aplicable a
todos los animales no humanos, en especial mamíferos no humanos, en
particular mamíferos placentarios, para los que se prevé actualmente
la mayor aplicabilidad comercialmente útil. Es probable que la
invención sea más útil con ungulados, en particular ungulados
económicamente importantes tales como ganado, ovejas, cabras,
búfalos de agua, camellos y cerdos, como medio para clonar animales
y como medio para generar animales transgénicos. También debe
indicarse que también es probable que la invención sea aplicable a
otras especies de animales no humanos económicamente importantes
tales como, por ejemplo, caballos, llamas o roedores, p. ej. ratas o
ratones, o conejos.
La invención también se puede aplicar en la
producción de mamíferos no humanos transgénicos, así como no
transgénicos. Los animales no humanos transgénicos se pueden
producir a partir de células donantes no humanas genéticamente
alteradas. El procedimiento general tiene una serie de ventajas
frente a los procedimientos convencionales para producir mamíferos
no humanos transgénicos (es decir, genéticamente modificados), que
se pueden resumir como sigue:
(1) serán necesarios menos receptores no
humanos;
(2) se pueden generar múltiples fuentes
singénicas usando células donantes clonales no humanas;
(3) está permitida la sutil alteración genética
mediante manipulación dirigida de genes;
(4) todos los animales no humanos producidos a
partir de embriones preparados por la invención transmitirán la
modificación genética importante a través de la línea germinal, ya
que cada animal no humano deriva de un solo núcleo; en contraste,
la producción de animales transgénicos no humanos por inyección
pronuclear o quimerismo después de inclusión de poblaciones de
células madres no humanas por inyección de blastocito produce una
proporción de animales no humanos mosaico en los que no todas las
células contienen la modificación y pueden no transmitir la
modificación a través de la línea germinal; y
(5) las células no humanas se pueden
seleccionar por el sitio de la modificación genética (p. ej.,
integración) antes de la generación del animal completo.
Hay que indicar que el término
"transgénico", en relación con mamíferos no humanos, no debe
considerarse que esté limitado a la referencia a mamíferos no
humanos que contienen en su línea germinal uno o más genes de otra
especie, aunque muchos mamíferos no humanos transgénicos contendrán
dicho gen o genes. Antes bien, el término se refiere más
ampliamente a cualquier mamífero no humano cuya línea germinal haya
sido objetivo de intervención técnica por tecnología de ADN
recombinante. Así, por ejemplo, un mamífero no humano en cuya línea
germinal se haya suprimido, duplicado, activado o modificado un gen
endógeno, es un mamífero no humano transgénico para el propósito de
esta invención, tanto como un mamífero no humano en cuya línea
germinal se ha añadido una secuencia de ADN exógena.
En realizaciones de la invención en las que el
mamífero no humano es transgénico, el núcleo donante no humano está
genéticamente modificado. El núcleo donante no humano puede contener
uno o más transgenes y la modificación genética puede tener lugar
antes de la transferencia nuclear y reconstitución del embrión no
humano. Aunque se puede usar la microinyección, análoga a la
inyección en el pronúcleo masculino no humano o femenino no humano
de un cigoto como método de modificación genética, la invención no
está limitada por esta metodología: también se pueden usar técnicas
de transformación de masa o transfección, p. ej. electroporación,
transfección vírica o lipofección.
En el método de la invención descrito antes, se
transfiere un núcleo diploide no humano de un donante no humano a
un ovocito receptor enucleado no humano. Son necesarios donantes que
sean diploides en el momento de la transferencia con el fin de
mantener la polidía correcta del embrión reconstituido; por lo
tanto, los donantes pueden estar en la fase G1 o preferiblemente,
como es el caso de la solicitud de patente PCR de los autores de la
invención en tramitación junto con la presente nº PCT/GB96/02099
presentada hoy (que reivindica la prioridad de GB 9517780.4), en la
fase G0 del ciclo celular.
El ciclo celular mitótico tiene cuatro fases
distintas, G, S, G2 y M. El suceso inicial en el ciclo celular,
llamado inicio, se produce en la fase G1 y tiene una función
única. La decisión o misión de experimentar otro ciclo celular se
hace en el inicio. Una vez que una célula ha pasado por el
inicio, pasa por el resto de la fase G1, que es la fase de
presíntesis de ADN. La segunda etapa, la fase S, es cuando se
produce la síntesis de ADN. A esta le sigue la fase G2 que es el
periodo entre la síntesis de ADN y la mitosis. La propia mitosis
ocurre en la fase M. Las células quiescentes (que incluyen células
en las que la quiescencia se ha inducido así como aquellas células
que son quiescentes naturales, tales como algunas células
completamente diferenciadas) normalmente se considera que no están
en ninguna de estas cuatro fases del ciclo; normalmente se describe
como que están en un estado G0, para indicar así que no progresarían
normalmente a través del ciclo. Los núcleos de células G0
quiescentes, como los núcleos de células G1 tienen un contenido de
ADN diploide; y en la presente invención se pueden usar ambos
núcleos diploides.
En relación con lo anterior, se cree que no hay
limitación significativa en las células no humanas que se pueden
usar en donantes de núcleos: se pueden usar células total o
parcialmente diferenciadas o células no diferenciadas, así como
células que se cultivan in vitro o extraídas ex vivo.
La única limitación es que las células donantes no humanas tengan
contenido de ADN normal y sean cariotípicamente normales. Se
describe una fuente preferida de células en la solicitud de patente
PCT de los autores de la invención en tramitación junto con la
presente nº PCT/GB95/02095, publicada como WO 96/07732. Se cree que
todas dichas células no humanas normales contienen toda la
información genética necesaria para la producción de un mamífero no
humano adulto. La presente invención permite que esta información se
proporcione al embrión no humano en desarrollo alterando la
estructura de cromatina de modo que el material genético pueda
redirigir el desarrollo.
Las células receptoras no humanas útiles en la
invención son ovocitos no humanos enucleados que están detenidos en
la metafase de la segunda división meiótica. En la mayoría de los
vertebrados, la maduración del ovocito continúa in vivo a
esta etapa bastante final del proceso de maduración del huevo y
entonces se detiene. En la ovulación, el ovocito detenido se libera
del ovario (y si se produce la fertilización, el ovocito es
estimulado naturalmente para completar la meiosis). En la práctica
de la invención, los ovocitos pueden hacerse madurar in vitro
o in vivo y se recogen cuando aparece el primer cuerpo polar
o tan pronto como sea posible después de la ovulación,
respectivamente.
Más recientemente, se han usado diferentes
procedimientos para intentar separar los cromosomas con un mínimo de
citoplasma. Se ha encontrado que la aspiración del primer cuerpo
polar y el citoplasma vecino elimina el aparato de la metafase II en
el 67% de los ovocitos de oveja. (Smith & Wilmut, Biol.
Reprod. 40 1027-1035 (1989)). Sólo el uso del
método del fluorocromo específico de ADN (Hoechst 33342)
proporcionaba la enucleación garantizada con la mínima reducción en
el volumen de citoplasma (Tsunoda et al., J. Reprod.
Fertil. 82 173 (1988)). En especies de ganado, probablemente
este es el procedimiento rutinario usado actualmente (Prather &
First J. Reprod. Fertil. Suppl. 41 125 (1990), Westhusin
et al., Biol. Reprod. (Suppl.) 42 176 (1990)).
Ha habido pocas publicaciones de procedimientos
no invasivos para la enucleación en mamíferos, mientras que en
anfibios se usa la irradiación con luz ultravioleta como un
procedimiento rutinario (Gurdon Q., J. Microsc. Soc. 101
299-5 311 (1960)). No hay publicaciones detalladas
del uso de este procedimiento en mamíferos, aunque durante el uso
del fluorocromo específico de ADN se ha indicado que la exposición
de ovocitos de ratón a la luz ultravioleta durante más de 30
segundos reducía el potencial de desarrollo de la célula (Tsunoda
et al., J. Reprod. Fertil. 82 173 (1988)).
Como se ha descrito antes, la enucleación se
puede lograr físicamente, mediante la eliminación real del núcleo,
pronúcleo o placa de la metafase no humanos (dependiendo de la
célula receptora), o funcionalmente, tal como por la aplicación de
radiación ultravioleta u otro factor para la enucleación.
Después de la enucleación, el núcleo donante no
humano se introduce por fusión en células donantes no humanas en
condiciones que no inducen la activación del ovocito, o por
inyección en condiciones no activantes. Con el fin de mantener la
ploidía correcta del embrión no humano reconstruido, el núcleo
donante no humano debe ser diploide (es decir, en la fase Go o G1
del ciclo celular) en el momento de la fusión.
Una vez se han preparado las células donante no
humana y receptora no humana, es necesario transferir el núcleo no
humano de la primera a esta última. De forma más conveniente, la
transferencia nuclear se efectúa por fusión. La activación no debe
tener lugar en el momento de la fusión.
Tres métodos establecidos que se han usado para
inducir la fusión son:
(1) exposición de células a productos químicos
que promueven la fusión, tales como polietilenglicol;
(2) el uso de virus inactivado, tal como virus
Sendai; y
(3) el uso de estimulación eléctrica.
La exposición de las células a productos
químicos que promueven la fusión tales como polietilenglicol u otros
glicoles es un procedimiento rutinario para la fusión de células
somáticas, pero no se ha usado ampliamente con embriones. Puesto que
el polietilenglicol es tóxico, es necesario exponer las células
durante un periodo mínimo y la necesidad de poder eliminar el
producto químico rápidamente puede hacer necesario la eliminación de
la zona pelúcida (Kanka et al., Mol. Reprod. Dev. 29
110-116 (1991)). En experimentos con embriones de
ratón, el virus Sendai inactivado proporciona un medio eficaz para
la fusión de células de embriones en etapa de división (Graham
Wistar, Inst. Symp. Monogr. 9 19 (1969)), con la ventaja
experimental adicional de que no se induce activación. En los
ungulados, la fusión normalmente se logra mediante la misma
estimulación eléctrica que se usa para inducir la activación
partenogenética (Willadsen, Nature 320 (6)
63-65 (1986), Prather et al., Biol.
Reprod. 37 859-866 (1987)). En estas especies,
el virus Sendai induce la fusión en una proporción de los casos,
pero no es suficientemente fiable para la aplicación rutinaria
(Willadsen, Nature 320 (6) 63-65 (1986)).
Aunque la fusión célula-célula
es un método preferido para efectuar la transferencia nuclear, no es
el único método que se puede usar. Otras técnicas adecuadas incluyen
la microinyección (Ritchie and Campbell, J. Reproduction and
Fertility, Abstract Series No. 15, p60).
En una realización preferida de la invención, la
fusión de la pareja ovocito y carioplasto no humanos, se lleva a
cabo en ausencia de activación por electropulsación en solución de
manitol 0,3 M o solución de sacarosa 0,27 M; alternativamente, el
núcleo no humano se puede introducir por inyección en un medio sin
calcio. La edad de los ovocitos no humanos en el momento de la
fusión/inyección y la ausencia de iones calcio del medio de
fusión/inyección, evitan la activación del ovocito receptor.
En la práctica, es mejor enuclear y llevar a
cabo la transferencia tan pronto como sea posible después de que el
ovocito no humano alcance la metafase II. El momento en el que esto
ocurre después del inicio de la maduración (in vitro) o del
tratamiento hormonal (in vivo) dependerá de la especie. Para
el ganado u ovejas, la transferencia nuclear debe tener lugar
preferiblemente en 24 horas; para cerdos, en 48 horas; ratones, en
12 horas; y conejos en 20-24 horas. Aunque la
transferencia se puede tener lugar más tarde, se hace cada vez más
difícil lograrlo a medida que el ovocito envejece. También es
deseable una actividad alta de MPF.
Posteriormente, el embrión reconstruido no
humano fusionado, que generalmente se devuelve al medio de
maduración, se mantiene sin ser activado de modo que el núcleo
donante no humano se expone al citoplasma del receptor durante un
periodo de tiempo suficiente para permitir que el embrión no humano
reconstruido sea capaz, finalmente, de dar lugar a un nacido vivo
(preferiblemente de una descendencia fértil).
El periodo de tiempo óptimo antes de la
activación varía de una especie a otra y se puede determinar
fácilmente mediante experimentación. Para el ganado, es adecuado un
periodo de 6 a 20 horas. El periodo de tiempo probablemente no
debería ser menor que el que permita la formación de cromosomas, y
no debería ser tan largo que la pareja se activara espontáneamente,
o en casos extremos que muriera.
Cuando es el momento de la activación, se puede
usar cualquier protocolo de activación convencional u otro adecuado.
Experimentos recientes han demostrado que los requisitos para la
activación partenogenética son más complicados de lo que se había
imaginado. Se había supuesto que la activación es un fenómeno de
todo o nada y que el gran número de tratamientos que podían inducir
la formación de un pronúcleo producían todos "activación". Sin
embargo, la exposición de ovocitos de conejo a pulsos eléctricos
repetidos, puso de manifiesto que sólo la selección de una serie de
adecuada de pulsos y el control del Ca^{2+} eran capaces de
promover el desarrollo de ovocitos diploidizados a media gestación.
(Ozil, Development 109 117-127 (1990)).
Durante la fertilización hay aumentos transitorios repetidos de
concentración de calcio intracelular (Cutbertson & Cobbold,
Nature 315 541-542 (1985)) y se cree que los
pulsos eléctricos producen aumentos análogos en la concentración de
calcio. Hay pruebas de que el patrón de calcio transitorio varía con
la especie y se puede anticipar que el patrón óptimo de pulsos
eléctricos variará de una forma similar. El intervalo entre pulsos
en el conejo es aproximadamente 4 minutos (Ozil, Development
109 117-127 (1990)), y en el ratón 10 a 20 minutos
(Cutbertson & Cobbold, Nature 316 541-542
(1985)), mientras que hay observaciones preliminares en la vaca de
que el intervalo es aproximadamente 20 a 30 minutos (Robl et
al., en Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation
(Seidel ed.), Colorado State University, 24-27
(1992)). En la mayoría de los experimentos publicados la activación
se indujo con un solo pulso eléctrico, pero nuevas observaciones
sugieren que la proporción de embriones reconstruidos que se
desarrollan aumenta por exposición a varios pulsos (Collas &
Robl, Biol. Reprod. 43 877-884 (1990)). En
cualquier caso individual se pueden hacer ajustes rutinarios para
optimizar el número de pulsos, la fuerza del campo y la duración de
los pulsos y la concentración de calcio del medio.
En la práctica de la invención, la ploidía
correcta debe mantenerse durante la activación. Es conveniente
inhibir o estabilizar la polimerización de microtúbulos con el fin
de prevenir la producción de múltiples pronúcleos, para mantener así
la ploidía correcta. Esto se puede lograr por la aplicación de un
inhibidor de microtúbulos tal como nocodazol con una concentración
eficaz (tal como aproximadamente 5 \mug/ml). La colquicina y
colcemida son otros inhibidores de microtúbulos. Alternativamente,
se podría usar un estabilizador de microtúbulos, tal como, por
ejemplo, taxol.
El componente molecular de los microtúbulos
(tubulina) está en un estado de equilibrio dinámico entre los
estados polimerizado y no polimerizado. Los inhibidores de
microtúbulos tales como el nocodazol previenen la adición de
moléculas de tubulina a los microtúbulos, alterando así el
equilibrio y conduciendo a la despolimerización de microtúbulos y
destrucción del huso. Es preferible añadir el inhibidor de
microtúbulos un tiempo suficiente antes de la activación para
asegurar la despolimerización completa o casi completa de los
microtúbulos. Es probable que veinte a treinta minutos sea
suficiente en la mayoría de los casos. Un estabilizador de
microtúbulos tal como el taxol previene la rotura del huso y por lo
tanto también puede prevenir la producción de múltiples pronúcleos.
El uso de un estabilizador de microtúbulos preferiblemente es en
condiciones similares a las usadas para los inhibidores de
microtúbulos.
El inhibidor o estabilizador de microtúbulos
debe permanecer presente después de la activación hasta la formación
de los pronúcleos. Debe separarse después, y en cualquier caso antes
de que se produzca la primera división.
En una realización preferida de la invención, a
las 30-42 horas después del inicio de la maduración
(bovina y ovina, es decir, 6-18 horas después de la
transferencia nuclear), los ovocitos no humanos reconstruidos se
ponen en medio que contiene nocodazol (5 \mug/ml) y se activan
usando protocolos convencionales. La incubación en nocodazol se
puede continuar durante 4-6 horas después del
estímulo de activación (dependiendo de la especie y la edad del
ovocito).
De acuerdo con un segundo aspecto de la
invención, se proporciona un método para preparar un mamífero no
humano, comprendiendo el procedimiento:
(a) reconstituir un embrión de mamífero no
humano como se ha descrito antes; y
(b) hacer que se desarrolle un mamífero no
humano hasta el final a partir del embrión; y
(c) opcionalmente, reproducción del mamífero no
humano así formado.
La etapa (a) se ha descrito antes con
profundidad.
La segunda etapa, la etapa (b) en el método de
este aspecto de la invención es hacer que se desarrolle un mamífero
no humano hasta el final a partir del embrión. Esto se puede hacer
directa o indirectamente. En el desarrollo directo, el embrión no
humano reconstituido de la etapa (a) se deja simplemente que se
desarrolle sin ninguna intervención más allá de cualquiera que
pueda ser necesaria para que se produzca el desarrollo. Sin
embargo, en el desarrollo indirecto el embrión no humano puede ser
manipulado más antes de que tenga lugar el desarrollo completo. Por
ejemplo, el embrión no humano puede escindirse y las células
expandirse clonalmente, con el propósito de mejorar el
rendimiento.
Alternativa o adicionalmente, se puede lograr
aumentar los rendimientos de embriones no humanos viables mediante
la presente invención por expansión clonal de donantes no humanos
y/o si se usa el proceso de transferencia (nuclear) seriada. La
limitación en la tasa de formación de blastocitos no humanos lograda
hasta ahora puede deberse al hecho de que una mayoría de los
embriones no humanos no se "reprograman" (aunque lo hace un
número aceptable). Si este es el caso, entonces la tasa se puede
mejorar como sigue. Cada embrión no humano que se desarrolla por sí
mismo se puede usar como un donante nuclear no humano en la etapa
celular 32-64; alternativamente, se pueden usar
células de la masa celular interna en la etapa de blastocito. Si
estos embriones no humanos reflejan realmente los que tienen
expresión génica reprogamada y esos núcleos están de hecho
reprogramados (como parece probable), entonces cada embrión no
humano en desarrollo puede multiplicarse de esta forma por la
eficacia del proceso de transferencia nuclear. El grado de
potenciación que probablemente puede lograrse, depende del tipo de
célula. En ovejas, se puede obtener fácilmente 55% de embriones en
estado de blastocito por transferencia de un solo blastómero de un
embrión de 16 células a un ovocito "receptor universal"
preactivado. Por lo tanto es razonable plantear la hipótesis de que
cada embrión no humano desarrollado a partir de una sola célula
podría dar lugar a ocho en la etapa de 16 células. Aunque estas
cifras son sólo una guía somera, está claro que en las etapas de
desarrollo finales, el alcance del beneficio dependerá de la
eficacia del procedimiento en esa etapa.
Aparte de la cuestión de la viabilidad de
mejorar el rendimiento, el embrión no humano reconstituido puede
cultivarse in vivo o in vitro a blastocito.
La experiencia sugiere que los embriones no
humanos obtenidos por transferencia nuclear son diferentes de los
embriones normales y a veces se benefician o incluso requieren
condiciones de cultivo in vivo distintas de aquellas en las
que los embriones normalmente se cultivan (al menos in vivo).
No se conoce la razón de esto. En la multiplicación rutinaria de
embriones bovinos, los embriones reconstituidos (muchos de ellos de
una vez) se han cultivado en oviductos de oveja durante 5 a 6 días
(como describe Willadsen, en Mammalian Egg Transfer (Adams,
E.E., ed.) 185 CRC Press, Boca Raton, Florida (1982)). Sin embargo,
en la práctica de la presente invención, con el fin de proteger el
embrión no humano, se sumergirá preferiblemente en un medio
protector tal como agar antes de transferirlo y después se
diseccionará del agar después de recuperarlo del receptor no humano
temporal. La función del agar u otro medio protector es doble:
primero, actúa como una ayuda estructural para el embrión no humano
manteniendo junta la zona pelúcida; y segundo, actúa como una
barrera para las células no humanas del sistema inmunitario del
animal receptor. Aunque este procedimiento aumenta la proporción de
embriones no humanos que forman blastocitos, tiene la desventaja de
que se puede perder una serie de embriones.
Si se usan condiciones in vitro, las que
se usan habitualmente en la técnica son bastante aceptables.
En la etapa de blastocito, puede cribarse el
embrión no humano para que sea adecuado para el desarrollo hasta el
final. Normalmente, esto se hará cuando el embrión no humano es
transgénico y se ha llevado a cabo el cribado y selección de
integrantes estables. También puede llevarse a cabo en esta etapa el
cribado de marcadores genéticos no transgénicos. Sin embargo, puesto
que el método de la invención permite cribar los donantes no humanos
en una etapa anterior, en general se preferirá esto.
Después del cribado, si ha tenido lugar el
cribado, se deja que el embrión blastocito se desarrolle hasta el
final. Esto en general se hará in vivo. Si el desarrollo
hasta blastocito ha tenido lugar in vitro, entonces la
transferencia al animal no humano receptor final tiene lugar en esta
etapa. Si el desarrollo del blastocito ha tenido lugar in
vivo, aunque en principio el blastocito no humano puede dejarse
desarrollar hasta el final en el hospedante del preblastocito, en la
práctica normalmente el blastocito se sacará del receptor del
preblastocito (temporal) y después de disección del medio protector,
se transferirá al receptor del postblastocito (permanente).
En la etapa opcional (c) de este aspecto de la
invención, los mamíferos no humanos pueden reproducirse a partir del
mamífero no humano preparado por las etapas precedentes. De esta
forma, un mamífero no humano puede usarse para establecer una manada
o rebaño de mamíferos no humanos que tienen la o las características
genéticas deseadas.
Los mamíferos no humanos producidos por
transferencia de núcleos no humanos de una fuente de células no
humanas genéticamente idénticas, comparten el mismo núcleo, pero no
son estrictamente idénticos puesto que derivan de diferentes
ovocitos humanos. La importancia de este origen diferente no esta
clara, pero puede afectar a las características comerciales. El
análisis reciente del ADN mitocondrial de vacas lecheras en el Iowa
State University Breeding Herd puso de manifiesto la asociación con
la leche y el rendimiento reproductivo (Freeman & Beitz, en
Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation
(Seidel, G. E. Jr., ed.) 17-20, Colorado State
University, Colorado (1992)). Queda por confirmar que hay efectos
similares en toda la población de ganado y considerar si es posible
o es necesario en situaciones específicas considerar la selección de
ovocitos no humanos. En el campo de la reproducción de ganado, la
capacidad de producir un gran número de embriones no humanos a
partir de donantes con gran importancia genética puede tener un
considerable valor potencial en la propagación de la mejora genética
por los rebaños nacionales. La escala de aplicación dependerá del
coste de cada embrión y la proporción de embriones transferidos que
pueden desarrollarse hasta el final.
A modo de ilustración y resumen, el siguiente
esquema expone un procedimiento típico por el cual se pueden
preparar mamíferos no humanos transgénicos y no transgénicos. Se
puede considerar que el procedimiento implica cinco etapas:
(1) aislamiento de células donantes diploides no
humanas;
(2) opcionalmente, transgénesis, por ejemplo por
transfección con construcciones adecuadas, con o sin marcadores
seleccionables;
(2a) opcionalmente cribado y selección de
integrantes estables - omitir para microinyección;
(3) reconstitución del embrión no humano por
transferencia nuclear;
(4) cultivo, in vivo o in vitro, a
blastocito;
(4a) opcionalmente cribado y selección de
integrantes estables - omitir si se ha hecho 2a - y otras
características deseadas;
(5) transferencia si es necesario al receptor no
humano final.
Este protocolo tiene una serie de ventajas
frente a métodos previamente publicados de transferencia
nuclear:
1) La cromatina del núcleo donante no humano se
puede exponer al citoplasma meiótico del ovocito receptor no humano
en ausencia de activación durante periodos de tiempo adecuados.
Esto puede aumentar la "reprogramación" del núcleo donante no
humano alterando la estructura de la cromatina.
2) La ploidía correcta del embrión no humano
reconstruido se mantiene cuando se transfieren los núcleos en
G0/G1.
3) Estudios previos han mostrado que la
sensibilidad a la activación de ovocitos bovinos/ovinos aumenta con
la edad. Un problema que se ha observado previamente es que en
oocitos envejecidos no enucleados se produce la duplicación de los
cuerpos polares del huso meiótico y se observan husos multipolares.
Sin embargo, se describe que en embriones no humanos reconstruidos y
mantenidos con niveles altos de MPF, aunque se produce la rotura de
la envuelta nuclear y la condensación de la cromatina, no se observa
huso organizado. Los cromosomas condensados prematuramente
permanecen en un haz apretado, y por lo tanto puede aprovecharse el
proceso de envejecimiento y aumentar la respuesta a la activación
del ovocito no humano reconstruido sin afectar adversamente la
ploidía del embrión no humano reconstruido.
Las características preferidas de cada aspecto
de la invención lo son para cualquier otro aspecto, cambiando lo que
haya que cambiar.
La invención ahora se describirá con referencia
a los ejemplos que acompañan que se proporcionan con el propósito de
ilustrar y no debe considerarse que sean limitantes de la presente
invención. En la siguiente descripción se hace referencia al dibujo
que acompaña, en el que:
La Figura 1 muestra la tasa de maduración de
ovocitos bovinos in vitro.
Los ovocitos receptores objeto de este
procedimiento experimental se denominan receptores MAGIC (por sus
siglas en ingles Metaphase Arrested G1/G0 AcceptIng
Cytoplast, citoplasto receptor de G1/G0 detenido en
metafase).
Se estudiaron los sucesos nucleares y
citoplasmáticos durante la maduración del ovocito in vitro.
Además, también se investigaron las funciones de la fusión y
activación en embriones reconstruidos a diferentes edades. Los
estudios han mostrado que la maduración del ovocito es asíncrona;
sin embargo, se puede hacer una selección morfológica de una
población de ovocitos maduros a las 18 horas (Figura 1).
En la figura 1 los ovarios se obtuvieron de un
matadero local y se mantuvieron a 28-32ºC durante el
transporte al laboratorio. Se aspiraron los complejos
cúmulo-ovocito (COC) de folículos de
3-10 mm de diámetro usando una aguja hipodérmica
(1,2 mm de diámetro interno) y se pusieron en recipientes
universales de plástico estéril. Los recipientes universales se
pusieron en una cámara caliente (35ºC) y se dejó que el material
folicular se depositara durante 10-15 minutos antes
de verter tres cuartos del líquido sobrenadante. El material
folicular que quedaba se diluyó con un volumen igual de medio de
disección (TCM 199 con sales de Earles (Gibco), kanamicina 75,0
mg/l, Hepes 30,0 mM, pH 7,4, osmolaridad 280 mOsmol/kg de H_{2}O)
complementado con suero bovino al 10%, se transfirió a una placa
petri de 85 mm y se buscaron los COC con un microscopio
estereoscópico.
Se seleccionaron complejos con al menos
2-3 capas compactas de células cúmulo, se lavaron
tres veces en medio de disección y se transfirieron a medio de
maduración (medio TC 199 con sales de Earles (Gibco), kanamicina
75,0 mg/l, Hepes 30,0 mM, NaHCO_{3} 7,69 mM, pH 7,8, osmolaridad
280 mOsmol/kg de H_{2}O) complementado con suero bovino al 10% y
1x10^{6} células de la granulosa/ml y se cultivaron en una mesa
basculante a 39ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% en aire. Se
sacaron los ovocitos del disco de maduración y se montaron húmedos
en portaobjetos de vidrio limpiados con etanol con cubreobjetos que
se unieron usando una mezcla de vaselina al 5% y cera al 95%.
Después, los embriones montados se fijaron durante 24 horas en
metanol:ácido acético glacial (3:1) recién preparado, se tiñeron con
aceto-orceína al 45% (Sigma) y se examinaron
mediante contraste de fase y microscopio DIC usando un Nikon
Microphot-SA, la gráfica de la figura 1 muestra el
porcentaje de ovocitos en MII y aquellos con un cuerpo polar
visible.
Si la maduración después se continúa hasta 24
horas, estos ovocitos se activan con una tasa muy baja (24%) en
manitol que contiene calcio (Tabla 1a). Sin embargo, la eliminación
de calcio y magnesio del medio de electropulsación evita cualquier
activación.
La Tabla 1a muestra la activación de ovocitos
foliculares bovinos madurados in vitro durante diferentes
periodos. Se sacaron los ovocitos del medio de maduración, se
lavaron una vez en medio de activación, se pusieron en la cámara de
activación y se les aplicó un solo pulso eléctrico de 1,25 kV/cm
durante 80 \mus.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 1b muestra la respuesta a la activación
de ovocitos bovinos madurados in vitro enucleados falsos
aproximadamente 22 horas después de inicio de la maduración (hpm,
horas postmaduración). Los ovocitos se trataron exactamente como
para la enucleación, se aspiró un pequeño volumen de citoplasma que
no contenía placa de la metafase. Después de manipulación, se aplicó
a los ovocitos un solo pulso DC de 1,25 kV/cm y se devolvieron al
medio de maduración, a las 30 hpm y 42 hpm se montaron grupos de
ovocitos, se fijaron y se tiñeron con aceto-orceína.
Los resultados muestran el número de ovocitos en cada punto de
tiempo de cinco experimentos individuales como el número de células
que tienen pronúcleos con respecto al número total de células.
La Tabla 2 muestra la formación pronuclear en
ovocitos enucleados fusionados con fibroblastos bovinos primarios
(24 hpm) y posteriormente activados (42 hpm). Los resultados
representan cinco experimentos separados. Los ovocitos se dividieron
en dos grupos, el grupo A se incubó en nocodazol durante 1 hora
antes de la activación y durante 6 horas después de la activación.
El grupo B no se trató con nocodazol. Los ovocitos activados se
fijaron y se tiñeron con aceto-orceína 12 horas
después de activación. Después se anotó el número de pronúcleos (NP)
en cada partenote mediante contraste de fase. Los resultados se
expresan como el porcentaje de ovocitos activados que contienen 1 o
más pronúcleos.
\vskip1.000000\baselineskip
La ausencia de un huso organizado y la ausencia
de un cuerpo polar sugieren que con el fin de mantener la ploidía en
el embrión reconstruido sólo se debería transferir un núcleo
diploide, es decir G0/G1, en esta situación citoplasmática. La
incubación de ovocitos activados en presencia del inhibidor de
microtúbulos nocodazol durante 5 horas, 1 hora antes de y después
del estímulo de activación previene la formación de micronúcleos
(Tabla 2), y así cuando el núcleo donante está en la fase G0/G1 del
ciclo celular se mantiene la ploidía correcta del embrión
reconstruido.
Estos resultados muestran que:
i) estos ovocitos pueden ser enucleados a las 18
horas después del inicio de la maduración (Figura 1);
ii) los ovocitos enucleados se pueden fusionar
con blastómeros/células donantes en manitol 0,3 M o sacarosa 0,27 M,
alternativamente las células o núcleos donantes se pueden inyectar
en medio sin calcio en ausencia de cualquier respuesta de
activación;
iii) los embriones reconstruidos o los ovocitos
pulsados enucleados se pueden cultivar en medio de maduración y no
experimentan activación espontánea;
iv) se ve que el núcleo transferido experimenta
rotura de la envuelta nuclear (REN) y condensación de cromosomas. No
se observa huso meiótico/mitótico organizado independientemente de
la etapa del ciclo celular del núcleo transferido;
v) dichas parejas manipuladas se activarán a las
30 horas y 42 horas con una frecuencia igual a los ovocitos testigo
no manipulados;
vi) no se observa cuerpo polar después de la
subsiguiente activación, independientemente de la etapa del ciclo
celular del núcleo transferido;
vii) tras la subsiguiente activación se forman
1-5 micronucleos por cigoto reconstruido (Tabla
2).
En experimentos prelimares esta técnica se ha
aplicado a la reconstrucción de embriones bovinos usando
fibroblastos primarios sincronizados en la fase G0 del ciclo celular
por privación de suero durante cinco días. Los resultados se resumen
en la Tabla 3.
La Tabla 3 muestra el desarrollo de embriones
bovinos reconstruidos por transferencia nuclear de fibroblastos
primarios bovinos (G0) privados de suero a ovocitos MII inactivados
enucleados. Los embriones se reconstruyeron 24 hpm y las parejas
fusionadas se activaron a las 42 hpm. Las parejas fusionadas se
incubaron en nocodazol (5 \mug/ml) en medio M2 durante 1 hora
antes de la activación y 5 horas después de la activación. Las
parejas se activaron con un solo pulso DC de 1,25 kV/cm durante 80
\mus.
También se han hecho observaciones similares a
las del Ejemplo 1 en ovocitos ovinos que se han hecho madurar in
vivo. Se pueden recoger ovocitos recién ovulados por barrido de
los oviductos de ovejas superestimuladas 24 horas después de
tratamiento con prostaglandina. El uso de PBS/FCS al 1,0% sin calcio
ni magnesio como medio de barrido evita la activación del ovocito.
Los ovocitos se pueden enuclear en medio sin calcio y las células
donantes se introducen como antes en ausencia de activación. No se
observa huso organizado, se forman múltiples núcleos tras la
subsiguiente activación y esto se puede suprimir mediante
tratamiento con nocodazol.
En experimentos preliminares en ovejas, una sola
gestación ha dado como resultado el nacimiento de un solo cordero
vivo. Los resultados se resumen en las Tablas 4 y 5.
La Tabla 4 muestra el desarrollo de embriones
ovinos reconstruidos por transferencia de una línea celular
establecida derivada de embrión a ovocitos ovinos madurados in
vivo enucleados e inactivados. Los ovocitos se obtuvieron de
ovejas caranegra escocesas superestimuladas, la línea celular se
estableció a partir del disco embrionario de un embrión de 9 días
obtenido de una oveja galesa de montaña. Los embriones reconstruidos
se cultivaron en el oviducto ligado de una oveja receptora temporal
durante 6 días, se recuperaron y se evaluó el desarrollo.
La Tabla 5 muestra la inducción de preñez
después de transferencia de todos los embriones reconstruidos en
etapa de mórula/blastocito a la trompa uterina de ovejas caranegra
receptoras finales sincronizadas. La tabla muestra el número total
de embriones para cada grupo transferido y la frecuencia de preñez
en términos de ovejas y embriones, en la mayoría de los casos se
transfirieron 2 embriones a cada oveja. Se estableció una sola
gestación doble que dio como resultado el nacimiento de un solo
cordero vivo.
Claims (11)
1. Un método para reconstituir un embrión de
mamífero no humano, comprendiendo el procedimiento transferir un
núcleo diploide diferenciado no humano a un ovocito enucleado no
humano que está detenido en la metafase de la segunda división
meiótica sin activación simultánea del ovocito, mantener el núcleo
no humano expuesto al citoplasma del receptor no humano durante un
periodo de tiempo suficiente para que el embrión no humano sea capaz
de dar lugar un nacido vivo, y posteriormente activar el embrión
reconstituido mientras que se mantiene la ploidía correcta.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que el mamífero no humano es una especie ungulada.
3. Un método según la reivindicación 2, en el
que el mamífero no humano es una vaca o toro, cerdo, cabra, oveja o
caballo.
4. Un método según la reivindicación 1, en el
que el mamífero no humano es una especie roedora.
5. Un método según la reivindicación 4, en el
que el roedor es una rata o un ratón.
6. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la célula diferenciada se obtiene
ex vivo o de un cultivo in vitro.
7. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el núcleo donante está
genéticamente modificado.
8. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el núcleo diploide es donado por
una célula quiescente.
9. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la transferencia nuclear se logra
por fusión celular.
10. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el mamífero no humano es una vaca
o toro, y en el que el núcleo donante se mantiene expuesto al
citoplasma receptor durante un periodo de tiempo de 6 a 20 horas
antes de la activación.
11. Un método para preparar un mamífero no
humano, comprendiendo el método:
(a) reconstituir un embrión de mamífero no
humano según cualquiera de las reivindicaciones precedentes;
(b) hacer que se desarrolle un mamífero no
humano hasta el final a partir del embrión; y
(c) opcionalmente, reproducción a partir del
mamífero no humano así formado.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9517779 | 1995-08-31 | ||
| GBGB9517779.6A GB9517779D0 (en) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | Biological manipulation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2309989T3 true ES2309989T3 (es) | 2008-12-16 |
Family
ID=10779997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96928586T Expired - Lifetime ES2309989T3 (es) | 1995-08-31 | 1996-08-30 | Oocitos inactivados que son receptores de citoplastos para transferencia nuclear. |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (12) | US6252133B1 (es) |
| EP (1) | EP0847237B1 (es) |
| JP (3) | JP2000506721A (es) |
| KR (4) | KR100533477B1 (es) |
| CN (3) | CN1250715C (es) |
| AT (1) | ATE400176T1 (es) |
| AU (1) | AU728809B2 (es) |
| BR (1) | BR9610013A (es) |
| CA (1) | CA2229657A1 (es) |
| CZ (1) | CZ60498A3 (es) |
| DE (1) | DE69637591D1 (es) |
| DK (1) | DK0847237T3 (es) |
| ES (1) | ES2309989T3 (es) |
| GB (1) | GB9517779D0 (es) |
| HK (1) | HK1004937A1 (es) |
| HU (1) | HUP9802485A3 (es) |
| IL (1) | IL123417A0 (es) |
| NO (1) | NO980846L (es) |
| NZ (2) | NZ335407A (es) |
| PL (1) | PL325336A1 (es) |
| SG (1) | SG75919A1 (es) |
| WO (1) | WO1997007668A1 (es) |
| ZA (1) | ZA967383B (es) |
Families Citing this family (191)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5480772A (en) | 1993-02-03 | 1996-01-02 | Brandeis University | In vitro activation of a nucleus |
| US7304204B2 (en) | 1995-08-31 | 2007-12-04 | Roslin Institute | Ungulates produced by nuclear transfer of G1 cells |
| GB9517779D0 (en) | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| GB9517780D0 (en) * | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| US6025155A (en) * | 1996-04-10 | 2000-02-15 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US6077697A (en) | 1996-04-10 | 2000-06-20 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US6271436B1 (en) | 1996-10-11 | 2001-08-07 | The Texas A & M University System | Cells and methods for the generation of transgenic pigs |
| US6235969B1 (en) | 1997-01-10 | 2001-05-22 | University Of Massachusetts | Cloning pigs using donor nuclei from non-quiescent differentiated cells |
| US5945577A (en) * | 1997-01-10 | 1999-08-31 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
| AU8154398A (en) | 1997-01-10 | 1999-01-25 | University Of Massachusetts | Cloning using donor nuclei from non-serum starved, differentiated cells |
| US20090092588A1 (en) * | 1997-01-10 | 2009-04-09 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloned ungulate embryos and animals, use of cells, tissues and organs thereof for transplantation therapies including parkinson's disease |
| US6011197A (en) | 1997-03-06 | 2000-01-04 | Infigen, Inc. | Method of cloning bovines using reprogrammed non-embryonic bovine cells |
| WO1998042850A1 (en) | 1997-03-26 | 1998-10-01 | Rpms Technology Limited | Anticoagulant fusion protein anchored to cell membrane |
| US7923216B2 (en) | 1997-08-14 | 2011-04-12 | Institut Pasteur | In vivo modulation of neuronal transport |
| US7923015B2 (en) | 1997-08-14 | 2011-04-12 | Institut Pasteur | Methods for direct visualization of active synapses |
| JPH11127852A (ja) * | 1997-10-28 | 1999-05-18 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 上皮細胞のｇ０期同調方法 |
| AU747070B2 (en) * | 1998-01-16 | 2002-05-09 | Agrobiogen Gmbh | Efficient nuclear transfer using primordial germ cells |
| US7351876B2 (en) | 1998-01-16 | 2008-04-01 | Agrobiogen Gmbh Biotechnologie | Efficient nuclear transfer with primordial gametes |
| US6331659B1 (en) | 1998-01-21 | 2001-12-18 | University Of Hawaii | Cumulus cells as nuclear donors |
| WO1999046982A1 (en) * | 1998-03-16 | 1999-09-23 | Relag Pty Ltd | Porcine nuclear transfer |
| AUPP294898A0 (en) * | 1998-04-15 | 1998-05-07 | Monash University | Method of nuclear transfer |
| GB9808325D0 (en) * | 1998-04-20 | 1998-06-17 | Ltr Ciz Di Associazione Italia | Source of nuclei for nuclear transfer |
| US6143564A (en) * | 1998-07-07 | 2000-11-07 | University Of Hawaii | Use of the polar body chromosomes for the production of embryos and normal offspring |
| GB9820988D0 (en) * | 1998-09-25 | 1998-11-18 | Biotech & Biolog Scien Res | Screening method |
| WO2000022098A1 (en) * | 1998-10-12 | 2000-04-20 | Geron Bio-Med Limited | Porcine oocytes with improved developmental competence |
| EP1818397A1 (en) * | 1998-11-02 | 2007-08-15 | Trustees Of Tufts College | Methods for cloning animals |
| US6781030B1 (en) * | 1998-11-02 | 2004-08-24 | Trustee Of Tufts College, Ballou Hall | Methods for cloning mammals using telophase oocytes |
| WO2000030436A1 (en) | 1998-11-19 | 2000-06-02 | Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd. | Stabilisation of milk from transgenic animals |
| US6700037B2 (en) | 1998-11-24 | 2004-03-02 | Infigen, Inc. | Method of cloning porcine animals |
| US6258998B1 (en) | 1998-11-24 | 2001-07-10 | Infigen, Inc. | Method of cloning porcine animals |
| JP2002534118A (ja) * | 1999-01-13 | 2002-10-15 | ピーピーエル セラピューティクス （スコットランド） リミテッド | 二重核移植法及びその結果物 |
| US7531715B1 (en) * | 1999-01-13 | 2009-05-12 | Ppl Therapeutics (Scotland) | Double nuclear transfer method and results thereof |
| CA2361201A1 (en) | 1999-01-28 | 2000-08-03 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna |
| WO2000050443A2 (en) | 1999-02-26 | 2000-08-31 | Millennium Pharmaceutcals, Inc. | Secreted proteins and uses thereof |
| US20020012660A1 (en) * | 1999-03-04 | 2002-01-31 | Alan Colman | Method of preparing a somatic cells for nuclear transfer |
| EP2199392A3 (en) * | 1999-03-04 | 2010-12-15 | Revivicor, Inc. | Genetic modification of somatic cells and uses thereof |
| AU5553600A (en) | 1999-06-23 | 2001-01-31 | Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd | Fusion proteins incorporating lysozyme |
| KR100368435B1 (ko) * | 1999-06-30 | 2003-01-24 | 황우석 | 체세포 복제동물의 생산을 위한 세포융합방법 |
| CN1304444A (zh) * | 1999-06-30 | 2001-07-18 | 黄禹锡 | 一种通过用种间核转移技术生产人类克隆胚胎的方法 |
| JP2003503045A (ja) * | 1999-06-30 | 2003-01-28 | ワン，ウー−サク | 異種間核移植技術を用いたクローントラの生産方法 |
| CA2334382A1 (en) | 1999-06-30 | 2001-01-04 | Woo-Suk Hwang | Method for producing cloned cows |
| KR100414043B1 (ko) * | 1999-06-30 | 2004-01-13 | 황우석 | 체세포 복제동물 및 그 생산방법 |
| US7291714B1 (en) | 1999-06-30 | 2007-11-06 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Glycoprotein VI and uses thereof |
| AU7072700A (en) | 1999-08-23 | 2001-03-19 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor |
| EP2275559A3 (en) | 1999-09-28 | 2011-03-23 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Optimized messenger RNA |
| WO2002064799A2 (en) | 1999-09-28 | 2002-08-22 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Optimized messenger rna |
| US7074983B2 (en) * | 1999-11-19 | 2006-07-11 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transgenic bovine comprising human immunoglobulin loci and producing human immunoglobulin |
| US7820878B2 (en) * | 1999-11-19 | 2010-10-26 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins |
| US7414170B2 (en) * | 1999-11-19 | 2008-08-19 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transgenic bovines capable of human antibody production |
| WO2001035735A1 (en) * | 1999-11-19 | 2001-05-25 | Hematech, Llc | Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins |
| KR100417566B1 (ko) * | 1999-11-19 | 2004-02-05 | 한국생명공학연구원 | 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법 |
| GB9927444D0 (en) * | 1999-11-19 | 2000-01-19 | Cancer Res Campaign Tech | Inhibiting gene expression |
| CN1293188C (zh) | 2000-01-04 | 2007-01-03 | 康涅狄格州大学 | 一种将长期培养的可包括人工诱导基因改变的雌或雄体细胞的细胞核转移到去核受体细胞中实现靶向基因改变的克隆动物的方法 |
| US6635802B1 (en) * | 2000-01-10 | 2003-10-21 | The Texas A&M University System | Nuclear transfer using cells cultured in serum starvation media containing apoptosis inhibitors |
| WO2001052871A1 (en) | 2000-01-20 | 2001-07-26 | Diatranz Limited | Preparation and xenotransplantation of porcine islets |
| AU2001236919A1 (en) * | 2000-02-09 | 2001-08-20 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Premeiotic and postmeiotic origin of teratomas: isolated teratoma stem cells for therapeutic uses |
| US6906238B2 (en) | 2000-03-15 | 2005-06-14 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Effective nuclear reprogramming in mammals using CDK2 inhibitors |
| GB2360522A (en) | 2000-03-24 | 2001-09-26 | Geron Corp | A strategy for maintaining pregnancy |
| WO2001088096A2 (en) * | 2000-05-15 | 2001-11-22 | Geron Corporation | Ovine tissue for xenotransplantation |
| JP2004510411A (ja) | 2000-06-05 | 2004-04-08 | ジェネティックス・インスチチュート・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | Ｉ型糖尿病の同定およびモジュレーションのための組成物、キット、および方法 |
| CA2413857C (en) | 2000-06-28 | 2010-04-27 | Genetics Institute, Llc. | Pd-l2 molecules: pd-1 ligands and uses therefor |
| MXPA03001915A (es) | 2000-08-03 | 2004-09-10 | Therapeutic Human Polyclonals | Produccion de anticuerpos humanizados en animales transgenicos. |
| US6677500B2 (en) | 2000-08-15 | 2004-01-13 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Ungulates expressing exogenous IGF-I in their milk |
| FR2814642B1 (fr) | 2000-10-03 | 2005-07-01 | Ass Pour Le Dev De La Rech En | Souris transgenique pour la recombinaison ciblee mediee par la cre-er modifiee |
| WO2002028164A2 (en) * | 2000-10-06 | 2002-04-11 | Advanced Cell Technology, Inc. | Cloning endangered and extinct species |
| JP2004526425A (ja) | 2000-11-28 | 2004-09-02 | ワイス | 前立腺癌の診断および治療に有用なｆｋｂｐ核酸およびポリペプチドの発現分析 |
| EP2295606A1 (en) | 2000-11-28 | 2011-03-16 | Wyeth LLC | Expression analysis of KIAA nucleic acids and polypeptides useful in the diagnosis and treatment of prostate cancer |
| IL156234A0 (en) * | 2000-11-30 | 2004-01-04 | Stemron Inc | Isolated homozygous stem cells, differentiated cells derived therefrom, and materials and methods for making and using same |
| ATE466089T1 (de) | 2000-12-22 | 2010-05-15 | Agronomique Inst Nat Rech | Positionsunabhängige und gewebespezifische expression eines transgens in der milch eines transgen-tieres |
| WO2002051997A1 (en) * | 2000-12-22 | 2002-07-04 | Aurox Llc | Methods for cloning mammals using reprogrammed donor chromatin or donor cells |
| US20020142397A1 (en) * | 2000-12-22 | 2002-10-03 | Philippe Collas | Methods for altering cell fate |
| US7491534B2 (en) * | 2000-12-22 | 2009-02-17 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Methods for altering cell fate to generate T-cells specific for an antigen of interest |
| EP1860199B1 (en) | 2001-01-12 | 2014-03-05 | Exelixis, Inc. | Modulating insulin receptor signaling |
| US20050177883A1 (en) | 2001-01-30 | 2005-08-11 | Rebholtz Paul C. | Systems of transferring embryos and managing recipients |
| US20020132257A1 (en) | 2001-01-31 | 2002-09-19 | Tony Giordano | Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell |
| JP2002262716A (ja) * | 2001-03-07 | 2002-09-17 | National Agricultural Research Organization | 株化細胞を用いて家畜個体を作出する方法 |
| US8981061B2 (en) | 2001-03-20 | 2015-03-17 | Novo Nordisk A/S | Receptor TREM (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof |
| AU2002242854A1 (en) * | 2001-03-21 | 2002-10-03 | Geron Corporation | Use of telomerase reverse transcriptase to create homozygous knockout animals |
| US7126039B2 (en) * | 2001-03-21 | 2006-10-24 | Geron Corporation | Animal tissue with carbohydrate antigens compatible for human transplantation |
| CA2442066C (en) | 2001-04-02 | 2005-11-01 | Wyeth | Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor |
| KR100886095B1 (ko) | 2001-04-16 | 2009-02-27 | 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 | 폴리펩티드 항원을 암호화하는 신규한 스트렙토코쿠스 뉴모니애 개방형 판독 프레임 및 이를 포함하는 조성물 |
| WO2002103350A1 (en) * | 2001-06-14 | 2002-12-27 | Infigen, Inc. | Methods for cloning mammals using remodeling factors |
| EP1406917A4 (en) * | 2001-06-15 | 2007-11-14 | New Century Pharmaceuticals | HUMAN ANALYTICAL MODELS FOR THE EVALUATION OF MEDICINAL PRODUCTS AND FOR TOXICOLOGICAL AND IMMUNOGENIC EXAMINATIONS |
| US7691995B2 (en) | 2001-07-12 | 2010-04-06 | University Of Massachusetts | In vivo production of small interfering RNAS that mediate gene silencing |
| EP1900815B1 (en) | 2001-07-12 | 2016-09-07 | University of Massachusetts | In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing |
| US20030211603A1 (en) * | 2001-08-14 | 2003-11-13 | Earp David J. | Reprogramming cells for enhanced differentiation capacity using pluripotent stem cells |
| US20030224380A1 (en) * | 2001-10-25 | 2003-12-04 | The General Hospital Corporation | Genes and polymorphisms on chromosome 10 associated with Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases |
| AU2002364945A1 (en) * | 2001-10-25 | 2003-07-09 | Neurogenetics, Inc. | Genes and polymorphisms on chromosome 10 associated with alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases |
| US20030170678A1 (en) * | 2001-10-25 | 2003-09-11 | Neurogenetics, Inc. | Genetic markers for Alzheimer's disease and methods using the same |
| JP2005514921A (ja) | 2001-11-09 | 2005-05-26 | ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート インク | ＰＧＣ−１β、新規ＰＧＣ−１相同体およびその用途 |
| WO2003046129A2 (en) * | 2001-11-09 | 2003-06-05 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions for the derivation of germ cells from stem cells and methods of use thereof |
| CA2473909A1 (en) * | 2002-01-15 | 2003-07-24 | Advanced Cell Technology, Inc. | Cloning b and t lymphocytes |
| US20030134422A1 (en) * | 2002-01-16 | 2003-07-17 | Sayre Chauncey Bigelow | Stem cell maturation for all tissue lines |
| US20050170506A1 (en) * | 2002-01-16 | 2005-08-04 | Primegen Biotech Llc | Therapeutic reprogramming, hybrid stem cells and maturation |
| US20050090004A1 (en) * | 2003-01-16 | 2005-04-28 | Sayre Chauncey B. | Stem cell maturation for all tissue lines |
| US20030204860A1 (en) * | 2002-04-01 | 2003-10-30 | David Melican | Method for selecting cell lines to be used for nuclear transfer in mammalian species |
| US20030217378A1 (en) * | 2002-04-05 | 2003-11-20 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc | Cloning using rapidly matured oocytes |
| US7612250B2 (en) | 2002-07-29 | 2009-11-03 | Trustees Of Tufts College | Nuclear transfer embryo formation method |
| EP1565581B1 (en) | 2002-08-20 | 2011-08-10 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer |
| CA2501752A1 (en) | 2002-10-10 | 2004-04-22 | Wyeth | Compositions, organisms and methodologies employing a novel human kinase |
| EP1581636A4 (en) * | 2002-10-16 | 2006-09-20 | Advanced Cell Tech Inc | METHOD OF USE OF STEM CELLS TREATED BY DERGENVALENTECHNIK (GENE TRAP) FOR MARKING STRAIN CELL DIFFERENTIATION PATHS, AND THE PREPARATION AND ISOLATION OF DIFFERENTIATED CELLS |
| US7208306B2 (en) | 2002-10-24 | 2007-04-24 | Wyeth | Compositions employing a novel human protein phosphatase |
| AU2003290689A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-06-03 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Transgenic ungulates having reduced prion protein activity and uses thereof |
| US7611839B2 (en) | 2002-11-21 | 2009-11-03 | Wyeth | Methods for diagnosing RCC and other solid tumors |
| US7297525B2 (en) | 2002-11-27 | 2007-11-20 | Wyeth | Composition employing a novel human kinase |
| EP2474631B1 (en) | 2002-12-20 | 2014-02-12 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction, methods of detection and uses thereof |
| DE602004015064D1 (de) | 2003-01-06 | 2008-08-28 | Wyeth Corp | Zusammensetzungen und verfahren zur diagnose und behandlung von kolonkrebs |
| US8309704B2 (en) | 2003-06-02 | 2012-11-13 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNAi |
| AU2004248136B2 (en) | 2003-06-02 | 2011-09-15 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for controlling efficacy of RNA silencing |
| US20080050313A1 (en) | 2003-08-14 | 2008-02-28 | Exelixis, Inc. | Sulfs as Modifiers of the Beta-Catenin Pathway and Methods of Use |
| CA2761987A1 (en) | 2003-10-07 | 2005-04-21 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer |
| US7951532B2 (en) | 2003-11-12 | 2011-05-31 | Children's Hospital Medical Center | Method of screening a midkine modulating agent |
| EP2386659B1 (en) | 2003-11-26 | 2014-01-15 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with cardiovascular disorders and drug response, methods of detection and uses thereof |
| US7682828B2 (en) | 2003-11-26 | 2010-03-23 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods for reprogramming somatic cells |
| US7420099B2 (en) * | 2004-04-22 | 2008-09-02 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Transgenic animals and uses thereof |
| EP2423327B1 (en) | 2004-05-07 | 2014-01-08 | Celera Corporation | Genetic polymorphism associated with liver fibrosis methods of detection and uses thereof |
| JP2008517931A (ja) | 2004-10-22 | 2008-05-29 | ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド | 脂質関連疾患および障害を処置するための、ＰＧＣ−１βを調節するための方法および組成物 |
| GB0426146D0 (en) | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Bioxell Spa | Therapeutic peptides and method |
| CN1274829C (zh) | 2004-12-10 | 2006-09-13 | 四川大学华西医院 | 抗eb病毒所致肿瘤多肽及其应用与制备方法 |
| WO2006099365A2 (en) | 2005-03-11 | 2006-09-21 | Applera Corporation | Genetic polymorphisms associated with coronary heart disease, methods of detection and uses thereof |
| US20070011603A1 (en) * | 2005-07-06 | 2007-01-11 | Mikko Makela | Method, system, device and software product for showing tooltips for page segments and generating content for the page segments |
| NZ565711A (en) | 2005-08-09 | 2011-10-28 | Revivicor Inc | Transgenic ungulates expressing a porcine CTLA4 peptide fused to an immunoglobulin |
| JP2009507835A (ja) | 2005-09-09 | 2009-02-26 | ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ | 抗体、アゴニストおよびアンタゴニストを用いてニューリチン遺伝子をターゲティングすることによる調節性ｔ細胞およびｄｃの機能の操作 |
| AU2006292224B2 (en) | 2005-09-19 | 2013-08-01 | Histogenics Corporation | Cell-support matrix and a method for preparation thereof |
| US7799530B2 (en) | 2005-09-23 | 2010-09-21 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with cardiovascular disorders and drug response, methods of detection and uses thereof |
| US7695911B2 (en) | 2005-10-26 | 2010-04-13 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with Alzheimer's Disease, methods of detection and uses thereof |
| SG174053A1 (en) | 2006-09-01 | 2011-09-29 | Therapeutic Human Polyclonals Inc | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals |
| EP2636754B1 (en) | 2006-09-11 | 2015-03-04 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with psoriasis, methods of detection and uses thereof |
| WO2008051511A2 (en) | 2006-10-20 | 2008-05-02 | Applera Corporation | Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis, methods of detection and uses thereof |
| KR101398220B1 (ko) * | 2006-10-30 | 2014-05-22 | 건국대학교 산학협력단 | 형질전환 배아 생성방법 |
| WO2008085891A1 (en) * | 2007-01-05 | 2008-07-17 | Worcester Polytechnic Institute | Oocyte spindle-associated factors improve somatic cell cloning |
| CA2683056C (en) | 2007-04-07 | 2020-03-24 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Reprogramming of somatic cells |
| WO2008134522A1 (en) * | 2007-04-26 | 2008-11-06 | President And Fellows Of Harvard College | Deriving embryonic stem cells |
| US7972849B2 (en) * | 2007-05-17 | 2011-07-05 | Oregon Health & Science University | Primate pluripotent stem cells produced by somatic cell nuclear transfer |
| US20090111764A1 (en) * | 2007-10-25 | 2009-04-30 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Mitochondrial selection |
| WO2009055656A2 (en) | 2007-10-26 | 2009-04-30 | Centocor, Inc. | Vectors, host cells, and methods of production and uses |
| US8039212B2 (en) | 2007-11-05 | 2011-10-18 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with liver fibrosis, methods of detection and uses thereof |
| US20090221620A1 (en) | 2008-02-20 | 2009-09-03 | Celera Corporation | Gentic polymorphisms associated with stroke, methods of detection and uses thereof |
| KR100915397B1 (ko) * | 2008-02-22 | 2009-09-03 | 삼성전자주식회사 | 커버부재, 현상 카트리지 및 화상형성장치의 현상유닛 |
| WO2009114185A2 (en) | 2008-03-12 | 2009-09-17 | The Rockefeller University | Methods and compositions for translational profiling and molecular phenotyping |
| US8288094B2 (en) | 2008-04-09 | 2012-10-16 | Institut Pasteur | APOBEC3 mediated DNA editing |
| EP2300611B1 (en) | 2008-06-13 | 2017-08-09 | Whitehead Institute for Biomedical Research | Programming and reprogramming of cells |
| US8216786B2 (en) | 2008-07-09 | 2012-07-10 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof |
| US9181315B2 (en) | 2009-01-08 | 2015-11-10 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for induced brown fat differentiation |
| US8722964B2 (en) | 2009-04-23 | 2014-05-13 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically engineered or transgenic rats exhibiting a cancer phenotype due to a disruption of germline tumor suppressor genes |
| CA2759608A1 (en) | 2009-04-24 | 2010-10-28 | Oregon Health & Science University | Methods for mitochondrial dna replacement in oocytes |
| EP2267153A1 (en) | 2009-05-26 | 2010-12-29 | Université Claude Bernard Lyon 1 | Identification of netrin-1 receptor unc5c gene mutation in solid cancers |
| US9314005B2 (en) | 2009-07-01 | 2016-04-19 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for severe combined immunodeficiency (SCID) |
| EP2456876A2 (en) | 2009-07-24 | 2012-05-30 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for cytokine-cytokine signaling pathways |
| US20110145936A1 (en) | 2009-07-30 | 2011-06-16 | Ostertag Eric M | Genetically Modified Rat Models for Pharmacokinetics |
| US20110035816A1 (en) | 2009-08-05 | 2011-02-10 | Ostertag Eric M | Genetically Modified Rat Models for Drug Metabolism |
| WO2011022634A2 (en) | 2009-08-20 | 2011-02-24 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for pain |
| US9420770B2 (en) | 2009-12-01 | 2016-08-23 | Indiana University Research & Technology Corporation | Methods of modulating thrombocytopenia and modified transgenic pigs |
| US10429384B2 (en) | 2010-01-22 | 2019-10-01 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of metabolic disorders |
| TWI518325B (zh) | 2010-02-04 | 2016-01-21 | 自治醫科大學 | 對ａｌｋ抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療 |
| US10745467B2 (en) | 2010-03-26 | 2020-08-18 | The Trustees Of Dartmouth College | VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders |
| US9631018B2 (en) | 2010-03-26 | 2017-04-25 | The Trustees Of Dartmouth College | Vista regulatory T cell mediator protein, vista binding agents and use thereof |
| US20150231215A1 (en) | 2012-06-22 | 2015-08-20 | Randolph J. Noelle | VISTA Antagonist and Methods of Use |
| US8383793B2 (en) | 2010-04-15 | 2013-02-26 | St. Jude Children's Research Hospital | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cancer resistant to anaplastic lymphoma kinase (ALK) kinase inhibitors |
| US20110269735A1 (en) | 2010-04-19 | 2011-11-03 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with statin response and cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof |
| KR20140023871A (ko) | 2010-10-22 | 2014-02-27 | 어그리-네오 인코포레이티드 | 생육 중인 식물 내 및 상의 병원균 구제를 위한 과아세트산 및 적어도 하나의 sar 인듀서의 상승 활성 |
| US20120108651A1 (en) | 2010-11-02 | 2012-05-03 | Leiden University Medical Center (LUMC) Acting on Behalf of Academic Hospital Leiden (AZL) | Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis and statin response, methods of detection and uses thereof |
| KR101352641B1 (ko) | 2010-11-08 | 2014-01-17 | 광주과학기술원 | 골격근-유래된 다능성 세포의 화학적 제조방법 및 이의 용도 |
| NZ759163A (en) | 2011-02-14 | 2023-03-31 | Revivicor Inc | Genetically modified pigs for xenotransplantation of vascularized xenografts and derivatives thereof |
| WO2012129198A1 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for obesity and diabetes |
| HUE039793T2 (hu) | 2011-05-16 | 2019-02-28 | Univ Missouri | Sertés reproduktív és légzési szindróma vírus rezisztens állatok |
| CA2848368C (en) | 2011-09-13 | 2023-02-14 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for brown fat induction and activity using fndc5 |
| PL2814844T3 (pl) | 2012-02-15 | 2017-12-29 | Novo Nordisk A/S | Przeciwciała wiążące i blokujące receptor aktywujący wykazujący ekspresję na komórkach szpikowych -1 (trem-1) |
| US9550830B2 (en) | 2012-02-15 | 2017-01-24 | Novo Nordisk A/S | Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1) |
| WO2013120554A1 (en) | 2012-02-15 | 2013-08-22 | Novo Nordisk A/S | Antibodies that bind peptidoglycan recognition protein 1 |
| US9890215B2 (en) | 2012-06-22 | 2018-02-13 | King's College London | Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer |
| FI3421486T3 (fi) | 2012-06-22 | 2023-12-15 | Dartmouth College | Uusia vista-ig-rakenteita ja vista-ig:n käyttö autoimmuuni-, allergia- ja tulehdushäiriöiden hoitamiseksi |
| CN109793893B (zh) | 2012-09-07 | 2023-05-26 | 达特茅斯大学理事会 | 用于诊断和治疗癌症的vista调节剂 |
| MX369173B (es) | 2013-12-24 | 2019-10-30 | Janssen Pharmaceutica Nv | Anticuerpos y fragmentos anti-vista. |
| US11014987B2 (en) | 2013-12-24 | 2021-05-25 | Janssen Pharmaceutics Nv | Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same |
| CA2935804A1 (en) | 2014-01-14 | 2015-07-23 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of melanoma using pd-l1 isoforms |
| WO2015191881A2 (en) | 2014-06-11 | 2015-12-17 | Green Kathy A | Use of vista agonists and antagonists to suppress or enhance humoral immunity |
| PL3172232T3 (pl) | 2014-07-17 | 2024-06-24 | Novo Nordisk A/S | Ukierunkowana miejscowo mutageneza przeciwciał trem-1 dla zmniejszania lepkości |
| US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
| JP2018505911A (ja) | 2014-12-05 | 2018-03-01 | イミュネクスト，インコーポレーテッド | 推定上のｖｉｓｔａ受容体としてのｖｓｉｇ８の同定と、ｖｉｓｔａ／ｖｓｉｇ８調節剤を産生するためのその使用 |
| KR102316842B1 (ko) | 2014-12-09 | 2021-10-25 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 분화 클러스터 274 유전자를 갖는 비인간 동물 |
| CA2975631C (en) | 2015-02-19 | 2024-02-20 | Agri-Neo Inc. | Composition of peracetic acid and at least one organic fungicide for the control of pathogens in and onto growing plants |
| US11009509B2 (en) | 2015-06-24 | 2021-05-18 | Janssen Pharmaceutica Nv | Anti-VISTA antibodies and fragments |
| DK3331355T3 (en) | 2015-08-06 | 2024-07-08 | Univ Missouri | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv)-resistant porcine and cells having modified cd163 genes |
| CA3002676A1 (en) | 2015-10-29 | 2017-05-04 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for identification, assessment, prevention, and treatment of metabolic disorders using pm20d1 and n-lipidated amino acids |
| MX2018009800A (es) | 2016-02-12 | 2018-11-09 | Janssen Pharmaceutica Nv | Anticuerpos y fragmentos anti-vista, usos de los mismos y procedimientos de identificacion de los mismos. |
| MA44776A (fr) | 2016-04-15 | 2019-03-06 | Immunext Inc | Anticorps anti-vista humain et leur utilisation |
| CA3092387A1 (en) | 2018-04-02 | 2019-10-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Anti-trem-1 antibodies and uses thereof |
| US11160260B2 (en) | 2018-04-17 | 2021-11-02 | The Curators Of The University Of Missouri | Methods for protecting porcine fetuses from infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| AU2021385081A1 (en) | 2020-11-20 | 2023-06-29 | Revivicor, Inc. | Multi-transgenic pigs with growth hormone receptor knockout for xenotransplantation |
| JP2024534702A (ja) | 2021-09-20 | 2024-09-20 | レバイビコア，インコーポレイティド | 異種移植のための１０個の遺伝子改変を含むマルチトランスジェニックブタ |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1030255A (zh) * | 1987-04-14 | 1989-01-11 | 路明尼斯有限公司 | 转移基因的动物 |
| US5057420A (en) | 1987-06-05 | 1991-10-15 | Granada Biosciences, Inc. | Bovine nuclear transplantation |
| CA2059199A1 (en) | 1992-01-10 | 1993-07-11 | Steen Willadsen | Method for producing mature reconstituted mammalian eggs by nuclear transplantation |
| GB2265909B (en) | 1992-04-01 | 1996-03-20 | Inst Of Animal Physiology And | Fusion of donor nucleus with recipient cytoplast in the absence of calcium ion |
| EP0661969B1 (en) * | 1992-09-22 | 2003-03-12 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Taxol for treating lymphomas and breast cancer and for reducing multi-drug resistance to taxol |
| CA2092258A1 (en) | 1992-12-30 | 1994-07-01 | Steven L. Stice | Synchronized donor cells for bovine nuclear transfer |
| US5480772A (en) | 1993-02-03 | 1996-01-02 | Brandeis University | In vitro activation of a nucleus |
| US5496720A (en) | 1993-02-10 | 1996-03-05 | Susko-Parrish; Joan L. | Parthenogenic oocyte activation |
| US5523226A (en) | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
| US5333948A (en) | 1993-06-22 | 1994-08-02 | Tekonsha Engineering Company | Multiple-gain electronic brake actuator with trigger point inertial sensor |
| PT1118325E (pt) * | 1993-07-29 | 2006-05-31 | Us Health | Utilizacao de paclitaxel e seus derivados na preparacao de um medicamento para o tratamento de restenose |
| WO1995017500A1 (en) | 1993-12-23 | 1995-06-29 | Abs Global, Inc. | Embryonic stem cells as nuclear donors and nuclear transfer techniques to produce chimeric and transgenic animals |
| GB9417831D0 (en) | 1994-09-05 | 1994-10-26 | Biotech & Biolog Scien Res | Biological manipulation |
| GB9517779D0 (en) | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| US7304204B2 (en) * | 1995-08-31 | 2007-12-04 | Roslin Institute | Ungulates produced by nuclear transfer of G1 cells |
| GB9517780D0 (en) * | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| US6235969B1 (en) | 1997-01-10 | 2001-05-22 | University Of Massachusetts | Cloning pigs using donor nuclei from non-quiescent differentiated cells |
| US7291764B1 (en) * | 1997-01-10 | 2007-11-06 | University of Massachusetts, a Public Institution of Higher Education of the Commonwealth of Massachusetts, as Represented by its Amherst Campus, Office of Vice Chancellor for Research at Amherst | Cloning pigs using non-quiescent differentiated donor cells or nuclei |
| US6215041B1 (en) | 1997-01-10 | 2001-04-10 | University Of Mmassachusetts | Cloning using donor nuclei from a non-quiesecent somatic cells |
| US5945577A (en) | 1997-01-10 | 1999-08-31 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
| US7361804B1 (en) * | 1997-02-19 | 2008-04-22 | Roslin Institute (Edinburgh) | Unactivated oocytes in nuclear transfer to produce ungulates |
| US6011197A (en) | 1997-03-06 | 2000-01-04 | Infigen, Inc. | Method of cloning bovines using reprogrammed non-embryonic bovine cells |
| AU739902B2 (en) | 1998-01-16 | 2001-10-25 | Agrobiogen Gmbh | Efficient nuclear transfer using fetal fibroblasts |
| JP3573964B2 (ja) * | 1998-06-17 | 2004-10-06 | 三洋電機株式会社 | アルカリ電池用水素吸蔵合金電極及びアルカリ蓄電池用水素吸蔵合金電極の製造方法 |
| WO2000022098A1 (en) * | 1998-10-12 | 2000-04-20 | Geron Bio-Med Limited | Porcine oocytes with improved developmental competence |
| US6700037B2 (en) * | 1998-11-24 | 2004-03-02 | Infigen, Inc. | Method of cloning porcine animals |
| US20050156424A1 (en) * | 2000-02-29 | 2005-07-21 | Thyssenkrupp Presta Ag | Steering column and manufacturing method thereof |
| US8302202B2 (en) * | 2005-08-03 | 2012-10-30 | International Business Machines Corporation | Transportable computing environment apparatus system and method |
-
1995
- 1995-08-31 GB GBGB9517779.6A patent/GB9517779D0/en active Pending
-
1996
- 1996-08-30 EP EP96928586A patent/EP0847237B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 AU AU68309/96A patent/AU728809B2/en not_active Expired
- 1996-08-30 AT AT96928586T patent/ATE400176T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 KR KR1019980701382A patent/KR100533477B1/ko active IP Right Grant
- 1996-08-30 NZ NZ335407A patent/NZ335407A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 DE DE69637591T patent/DE69637591D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 ES ES96928586T patent/ES2309989T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 CZ CZ98604A patent/CZ60498A3/cs unknown
- 1996-08-30 IL IL12341796A patent/IL123417A0/xx unknown
- 1996-08-30 PL PL96325336A patent/PL325336A1/xx unknown
- 1996-08-30 CN CNB961978929A patent/CN1250715C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 ZA ZA9607383A patent/ZA967383B/xx unknown
- 1996-08-30 DK DK96928586T patent/DK0847237T3/da active
- 1996-08-30 BR BR9610013-3A patent/BR9610013A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-08-30 NZ NZ316148A patent/NZ316148A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 CN CN2006100037660A patent/CN1813642B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 CA CA002229657A patent/CA2229657A1/en not_active Abandoned
- 1996-08-30 KR KR1020067006296A patent/KR20060057638A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-08-30 HU HU9802485A patent/HUP9802485A3/hu unknown
- 1996-08-30 SG SG1999000941A patent/SG75919A1/en unknown
- 1996-08-30 WO PCT/GB1996/002098 patent/WO1997007668A1/en active IP Right Grant
- 1996-08-30 CN CNA2005101270278A patent/CN1772891A/zh active Pending
- 1996-08-30 JP JP9509995A patent/JP2000506721A/ja active Pending
- 1996-08-30 KR KR1020057014691A patent/KR100743006B1/ko active IP Right Grant
- 1996-08-30 KR KR1020077007531A patent/KR20070041793A/ko not_active Application Discontinuation
-
1997
- 1997-02-19 US US08/803,165 patent/US6252133B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-02-27 NO NO980846A patent/NO980846L/no unknown
- 1998-05-13 HK HK98104135A patent/HK1004937A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-08-29 US US09/650,285 patent/US6525243B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-10-11 US US09/973,701 patent/US20030037352A1/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-07-09 US US10/190,617 patent/US7326824B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-09-05 US US10/234,854 patent/US7321075B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-08-03 US US10/909,845 patent/US7329796B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-08-10 US US10/914,161 patent/US7321076B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-03-02 US US11/068,903 patent/US7432415B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-03 US US11/265,114 patent/US7524677B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-30 JP JP2005345998A patent/JP2006340710A/ja active Pending
-
2006
- 2006-10-06 US US11/544,038 patent/US20070028312A1/en not_active Abandoned
- 2006-10-06 US US11/543,881 patent/US7326825B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-04-22 JP JP2008111492A patent/JP2008194053A/ja active Pending
-
2009
- 2009-12-24 US US12/647,316 patent/US20100146654A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2309989T3 (es) | Oocitos inactivados que son receptores de citoplastos para transferencia nuclear. | |
| US7232938B2 (en) | Cloning ungulates from a quiescent donor cell | |
| US7304204B2 (en) | Ungulates produced by nuclear transfer of G1 cells | |
| US7361804B1 (en) | Unactivated oocytes in nuclear transfer to produce ungulates | |
| GB2340493A (en) | Unactivated oocytes as cytoplast recipients for nuclear transfer | |
| MXPA98001645A (es) | Oocitos inactivados como receptores de citoplastopara transferencia nuclear | |
| NZ504101A (en) | A method of preparing a non-human mammal comprising reconstituting a non-human mammalian embryo | |
| AU2801301A (en) | Unactivated oocytes as cytoplast recipients for nuclear transfer | |
| AU2801401A (en) | Unactivated oocytes as cytoplast recipients for nuclear transfer | |
| AU2005246962A1 (en) | Quiescent cell population for nuclear transfer |