CZ60498A3 - Neaktivované oocyty jako cytoplastové recipienty pro přenos jádra - Google Patents
Neaktivované oocyty jako cytoplastové recipienty pro přenos jádra Download PDFInfo
- Publication number
- CZ60498A3 CZ60498A3 CZ98604A CZ60498A CZ60498A3 CZ 60498 A3 CZ60498 A3 CZ 60498A3 CZ 98604 A CZ98604 A CZ 98604A CZ 60498 A CZ60498 A CZ 60498A CZ 60498 A3 CZ60498 A3 CZ 60498A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- animal
- embryo
- nucleus
- activation
- oocyte
- Prior art date
Links
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 87
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 62
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 61
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 58
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 53
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 claims abstract description 17
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N Nocodazole Chemical compound C1=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=CC=C1C(=O)C1=CC=CS1 KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229950006344 nocodazole Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 24
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 23
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 14
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 claims description 7
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 claims description 7
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 6
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 claims description 3
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 claims description 3
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 claims description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 claims 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 claims 1
- 208000035752 Live birth Diseases 0.000 claims 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims 1
- 230000012106 negative regulation of microtubule depolymerization Effects 0.000 claims 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 claims 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 claims 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 16
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 abstract description 15
- 231100000782 microtubule inhibitor Toxicity 0.000 abstract description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 abstract description 6
- 229940122255 Microtubule inhibitor Drugs 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 47
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 37
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 22
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 20
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 19
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 7
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 7
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 4
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940119336 Microtubule stabilizer Drugs 0.000 description 3
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 3
- 239000004218 Orcein Substances 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 3
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 3
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 3
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 3
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001550206 Colla Species 0.000 description 2
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 2
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 244000144980 herd Species 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010449 nuclear transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 2
- NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N (-)-demecolcine Chemical compound C1=C(OC)C(=O)C=C2[C@@H](NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N Demecolcine Natural products C1=C(OC)C(=O)C=C2C(NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000289695 Eutheria Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000002779 Morchella esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 240000002769 Morchella esculenta Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 208000034790 Twin pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000010428 chromatin condensation Effects 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001152 differential interference contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001647 gastrula Anatomy 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000025090 microtubule depolymerization Effects 0.000 description 1
- 230000029115 microtubule polymerization Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000012409 spindle disassembly Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
- C12N15/8773—Ovine embryos
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
- C12N15/8771—Bovine embryos
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
Neaktivované oocyty jako cytoplastové recipienty pro přenos jádra
Oblast techniky
Tento vynález se týká vytváření zvířat, která zahrnují, aniž by tím byly omezeny, geneticky selektovaná a/nebo modifikovaná zvířata a dále se týká buněk, použitelných pro jejich vytváření.
Dosavadní stav techniky
Rekonstrukce savčích embryí přenosem dárcovského jádra do enukleovaného oocytu nebo do jednobuněčné zygoty dovoluje vytváření geneticky identických individuí. To představuje jasnou výhodu jak pro výzkum (to jest jako biologické kontrolní vzorky), tak i pro komerční aplikace (to jest multiplikace geneticky cenného dobytka, uniformita produkce masa, řízení chovu zvířat).
Rekonstrukce embrya přenosem jádra byla nejprve navržena (Spemann, Embryonic Development and Introduction, 210-211, * Hofner Publishing Co., New York (1938)) ve snaze odpovědět otázku ekvivalence jádra neboli mění se jádro během vývoje?. Přenášením jádra ze stále pokračujících embryonických fází měly tyto pokusy určit ve kterém okamžiku se jádro stane omezeným ve svém vývojovém potenciálu. Vzhledem k technickým omezením a nešťastné smrti Spemanna nebyly tyto studie dokončeny dříve než v roce 1952, kdy bylo na žábě demonstrováno, že jistá jádra se mohou přímo • · · · · · • · · · · · • ·
vyvinout do pohlavně zralého dospělého živočicha (Briggs a King, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 38, 455-461 (1952)). Jejich poznatky vedly k současnému konceptu že ekvivalentní totipotentní jádra z jednoho individua mohou, když jsou přenesena do enukleovaného vajíčka, umožnit vznik geneticky identických individuí. Přesně vzato tato individua nebudou klony, neboť neznámý cytoplasmatický příspěvek u nich může být proměnlivý a také by bylo třeba dokázat nepřítomnost jakékoli změny chromosomálního uspořádání.
Od demonstrace embryonálního klonování u obojživelníků byly podobné techniky aplikovány na savčí druhy. Tyto techniky spadají do svou kategorií:
1) Přenos dárcovského jádra do oocytu ve stadiu zralé metafáze II, kterému byla odebrána jeho chromosomální DNA a
2) přenos dárcovského jádra do oplodněné jednobuněčné zygoty, za které byla odebrána obě prvojádra.
U kopytníků se první možnost stala jedinou, neboť v případě druhé nebyl pozorován žádný vývoj jindy než když byla vyměněna prvojádra.
Přenosu dárcovského jádra do oocytové cytoplasmy je obecně dosaženo indukcí buněčné fúze. U kopytníků je fúze indukována aplikací stejnosměrného elektrického impulzu rovinou kontaktu/fúze dvojice. Týž impulz, který indukuje buněčnou fúzi, také aktivuje přijímající oocyt. Následující vývoj rekonstruovaného embrya závisí na velkém množství faktorů, které zahrnují schopnost jádra k přímému vývoji, to jest totipotencí, vývojovou schopnost cytoplasmy příjemce (neboli oocytovou zralost), oocytovou aktivaci, kultivaci embrya (přehled viz Campbell a Wilmut, Vth World Congress on • · · · · ·
Genetics as Applied to Livestock, 20, 180-187 (1994))
Kromě výše uvedeného bylo také autory prokázáno, že zachovávání správné ploidity v průběhu prvního buněčného cyklu rekonstruovaného embrya má zásadní důležitost (Campbell a kol., Biol. Reprod. 49, 933-942 (1993));
Campbell a kol., Biol. Reprod., 50, 1385-1393 (1994)). V průběhu jednoho buněčného cyklu musí být všechna genomická DNA replikována jednou a pouze jednou předtím, než dojde k mitóze. Jestliže se buď některá část DNA nereplikuje a nebo je replikována více než jednou, potom bude ploidita tohoto jádra v okamžiku mitózy nesprávná. Mechanismus, kterým je replikace omezena na jediné provedení v průběhu každého buněčného cyklu je však nejasná, nicméně existuje několik důkazů, naznačujících že pro tento průběh je důležité udržovat neporušenou jadernou membránu. Morfologické události, ke kterým dochází v dárcovském jádru po transferu do enukleovaného oocytu v metafázi II byly studovány u řady druhů, mezi jiným u myši (Czolowiska a kol., J. Cell Sci, 69, 19-34 (1984)), králíka (Collas a Robi, Biol. Reprod.,
45, 455-465 (1991)), prasete (Prather a kol., J. Exp. Zool., 225, 355-358 (1990)), krávy (Kaňka a kol., Mol. Reprod.
Dev., 29, 110-116 (1991)). Okamžitě po fúzi se obal dárcovského jádra rozpadá (NEBD - nuclear envelope break down) a chromosom předčasně kondenzuje (PCC - premature chromosom condensation). Tyto efekty jsou katalyzovány cytoplasmatickou aktivitou, nazývanou maturační/ mitózní/ meiózní promotorovy faktor (MPF). Tato aktivita se nachází ve všech mitotických a meiotických buňkách, které dosáhly své maximální aktivity v průběhu metafáze. Zralé savčí oocyty jsou uzavřeny v průběhu metafáze v druhém meiotickém dělení (metafáze II) a mají vysokou MPF aktivitu. Po oplodnění nebo aktivaci MPF aktivita klesá, druhé meiotické dělení je ukončeno a je vyloučeno druhé polární tělísko, chromatiny dekondenzují a dochází k vytváření prvojádra. V embryích rekonstruovaných přenosem jádra v okamžiku když je úroveň MPF vysoká dochází k NEBD a PCC; po těchto událostech následují, když MPF aktivita opadá, dekondenzace chromatinů a přetváření jádra a následná DNA replikace. Správná ploidita v rekonstruovaných embryích může být udržována jedním ze dvou následujících způsobů; předně přenosem jádra v definované etapě buněčného cyklu, například diploidní jádro buněk v etapě G1 do metafáze II oocytů v okamžiku aktivace a za druhé aktivací přijímajícího oocytu a přenosem dárcovského jádra po odeznění MPF aktivity. U ovce tento druhý přístup vedl k vzrůstu frekvence vývoje do blastocystové etapy z 21 % na 55 % rekonstruovaných embryí, pokud byly používány blastomery z 16 buněčných embryí jako v roli buněčných dárců (Campbell a kol., Biol. Reprod., 50, 1385-1393 (1994)).
Toto zlepšení frekvence vývoje rekonstruovaného embrya se až dosud netýkalo otázky přeprogramování jádra. V průběhu vývoje jsou některé geny otištěny, to jest jsou změněny tak, že již dále nejsou transkribovány. Studie této otázky ukazují, že toto otištění je odstraněno v průběhu vytváření zárodečných buněk (to jest přeprogramování). Jednou z možností je, že toto přeprogramování je ovlivněno vystavením chromatinů cytoplasmatickým faktorům, které jsou přítomny v buňce, podstupující meiózu. To přináší otázku, jak můžeme napodobit tuto situace během rekonstrukce embryí přenosem jádra, aby byly přeprogramovány vývojové hodiny dárcovského jádra.
• · • · • · · ·
• « • · »·· · 9
Podstata vynálezu
Bylo zjištěno, že přenos jádra do oocytu, uzavřeného v metafázi II může dát vzniknout životaschopnému embryu, pokud je udržována normální ploidita (to jest diploidita) a jestliže embryo není aktivováno v okamžiku přenosu jádra. Zpoždění aktivace dovoluje jádru zůstat vystaveno cytoplasmě příjemce.
První předmět vynálezu se týká způsobu rekonstituce zvířecího embrya, který spočívá v přenesení diploidního jádra do oocytu, který setrvává v metafázi druhého meiotického dělení, aniž by došlo k související aktivaci oocytu, v uchovávání jádra vystaveného cytoplasmě příjemce po dobu dostatečnou k tomu, aby rekonstituované embryo se stalo schopné dát vzniknout živému tvoru a v následném aktivování rekonstituovaného embrya za současného udržování správné ploidity. V této etapě je rekonstituované embryo jediná buňka.
Vynález je v principu aplikovatelný na všechna zvířata, v to počítaje ptáky, jako je domestikovaná drůbež, dále druhy obojživelníků a ryb. V praxi však je v současné době spatřována oblast největší komerční využitelnosti vynálezu v aplikaci na zvířata, jiná než člověk, speciálně na savce, jiné než člověk, obzvláště placentální savce. Nejpravděpodobnější využití vynálezu se zdá být možné u kopytníků, především u ekonomicky významných kopytníků jako je kráva, ovce, kozy, buvol, velbloudi a prasata a to jak jako prostředek pro klonování zvířat, tak i jako prostředek • · · ·
A · A A • · ·· · · · · · • A · · A A A AAAA A • A AAA AAA
AAAA A AA AAAA AA AA pro vytváření transgenních zvířat. Je nutné uvést, že použití vynálezu je pravděpodobné i v případě dalších ekonomicky významných zvířat, jako jsou například koně, lamy nebo hlodavci, například krysy nebo myši nebo králíci.
Vynález je také možno aplikovat při produkci transgenních stejně tak jako netransgenních zvířat. Transgenní zvířata mohou být produkována z geneticky změněných dárcovckých buněk. Celá procedura má celou řadu výhod ve srovnání s konvenční procedurou transgenních (to jest geneticky modifikovaných) zvířat, které mohou být přehledně sumarizovány následujícím způsobem:
(1) je potřeba menšího počtu příjemců, (2) vícenásobní syngeničtí členové zakládající generace mohou být vytvořeni použitím klonových dárcovských buněk, (3) je umožněna drobná genetická změna genovým cílením, (4) všechna zvířata produkovaná podle tohoto vynálezu by měla přenášet odpovídající genetickou modifikaci zárodečnou linií, neboť každé zvíře je odvozeno z jediného jádra; na rozdíl od toho produkce transgenních zvířat injekcí prvojader nebo chimérismem po inklusi modifikovaného kmene buněčné populace blastocystovou injekcí produkuje část mozaikových zvířat, u nichž ne všechny buňky obsahují modifikaci a nemusí přenášet modifikaci zárodečnou linií; a (5) pro místo genetické modifikace (například integrace) mohou být buňky selektovány před vytvořením celého zvířete.
Je třeba uvést, že výraz transgenní ve vztahu ke zvířeti nesmí být chápán jako omezující ve smyslu popisu zvířat obsahujících v jejich zárodečné linii jeden nebo více genů jiného druhu, ačkoliv mnoho transgenních zvířat skutečně obsahuje takový gen nebo geny. Uvedený výraz je třeba chápat • · · · širším způsobem jako vztahující se k jakémukoli zvířeti, jehož zárodečná linie byla podrobena technickému zákroku pomocí rekombinantní DNA technologie. Tak například zvíře, v jehož zárodečné linii byl vynechán, duplikován, aktivován nebo modifikován endogenní gen je transgenním zvířetem ve smyslu předkládaného vynálezu stejně tak jako zvíře, jehož zárodečná linie obsahuje přidanou exogenní DNA sekvenci.
V provedení předkládaného vynálezu, ve kterém se jedná o transgenní zvíře, je dárcovské jádro geneticky modifikováno. Dárcovské jádro může obsahovat jeden nebo více transgenů a genetická modifikace může být provedena před přenosem jádra a rekonstitucí embrya. Ačkoliv může být jako metoda genetické modifikace použita mikroinjekce, která je analogická injekci do samčího nebo samičího prvojádra zygoty, vynález není omezen na tuto metodologii; mohou být použity také hromadné transformační nebo transfekční techniky, například elektroporace, virální transfekce nebo lipofekce.
Ve způsobu podle předkládaného vynálezu, který byl popsán výše, je diploidní jádro přeneseno z dárce do enukleovaného oocytu příjemce. Je nutné využít dárců, kteří jsou diploidní v okamžiku přenosu, aby se udržela správná ploidita rekonstituovaného embrya; dárci proto mohou být buď ve fázi G1 nebo výhodně ve fázi GO, jak je to popsáno v současně podávané přihlášce vynálezu, číslo PCT přihlášky vynálezu PCT/GB96/02099, podané týž den jako tato přihláška vynálezu (a nárokující prioritu GB přihlášky 9517780.4).
Buněčný cyklus mitotické buňky má čtyři různé fáze, označené G, S, G2 a M. Počáteční událost v buněčném cyklu, nazývaná
44 44 44
4 4 4 4 4 4
4 4444
4 4 4444 4
4 4 4 4 4
4444 44 44 start, nastává v G1 fázi a má jednoznačně určenou funkci. Rozhodnutí nebo úmysl podstoupit další buněčný cyklus je provedeno v okamžiku start. Jakmile buňka prošla etapou start, prochází zbytkem G1 fáze, což je fáze před syntézou DNA. Druhá fáze, nazývaná fáze S, je ta, ve které dochází k syntéze DNA. Ta je následována fází G2, což je časový interval mezi syntézou DNA a mitózou. K samotné mitóze dochází ve fázi M. Buňky v klidovém stavu (mezi něž patří jak buňky, u nichž byl klidový stav indukován, tak i buňky které se nacházejí v klidovém stavu přirozeně, jako jsou některé plně diferencované buňky) jsou obecně považovány za buňky, které nejsou v žádné ze čtyř fází buněčného cyklu; obvykle jsou popisovány jako buňky ve stavu GO, což znamená, že nebudou normálně postupovat buněčným cyklem. Jádro GO buňky v klidovém stavu má podobně jako jádro G1 buňky diploidní DNA obsah; oba druhy takových diploidních jader mohou být použity podle předkládaného vynálezu.
Až na výše uvedené se předpokládá, že není žádné podstatné omezení, kladené na buňky, které mohou být používány jako dárce jádra: mohou být používány plně nebo částečně diferencovatelné buňky nebo nediferencované buňky a jak buňky kultivované in vitro, tak buňky abstrahované ex vivo. Jediným omezením je, že dárcovská buňka má normální DNA obsah a je karyotypicky normální. Výhodný zdroj buněk je popsán v současně podanou přihláškou autorů PCT patentová přihláška č. PCT/GB95/02095, která byla publikována jako WO 96/07732. Předpokládá se, že každá taková normální buňka obsahuje veškerou genetickou informaci, která je potřebná pro produkci dospělého zvířete. Předkládaný vynález dovoluje, aby tato informace byla poskytnuta vyvíjejícímu se embryu změnou struktury chromatinu tak, že genetický • 0 999 9 ··· · • · • 0 I materiál může přesměrovat vývoj.
Buňky, které mohou sloužit jako příjemci podle předkládaného vynálezu jsou enukleované oocyty, které jsou uzavřeny v metafázi druhého meiotického dělení. U většiny obratlovců zrání oocytu postupuje in vivo do tohoto velmi pozdního stádia procesu zrání vajíčka a potom se zastavuje. Při ovulaci jsou uzavřené oocyty uvolněny z vaječníku (a jestliže došlo k oplodnění, oocyt je přirozeně stimulován k dokončení meiózy. Při postupu podle předkládaného vynálezu oocyty mohou být dozrálé buď in vitro nebo in vivo a jsou sbírány při objevení se prvního polárního tělíska nebo co nejdříve po ovulaci.
Příjemce je výhodně enukleován. I když se obecně předpokládá, že enukleace přijímajícího oocytu v průběhu přenosu jádra je podstatná, neexistuje žádné publikované potvrzení tohoto úsudku. Původní procedura, popsaná pro kopytníky zahrnuje rozštěpení buňky na dvě části, přičemž jedna z nich je pravděpodobně enukleovaná (Willadsen, Nátuře, 320 (6), 63-65 (1986)). Nevýhodou této procedury je, že druhá neznámá část má stále metafázový aparát a že se předpokládá, že snížení objemu cytoplasmy vede k akceleraci způsobu diferenciace nových embryí (Eviskov a kol., Development, 109, 322-328 (1990)).
Později byly použity jiné procedury ve snaze odstranit chromosomy spolu s minimálním množstvím cytoplasmy. Bylo zjištěno, že aspirace (odsátí) prvního polárního tělíska a sousedící cytoplasmy odstraní aparát metafáze II u 67 % ovčích oocytu (Smith a Wilmut, Biol. Reprod., 40, 1027-1035
• · · · (1989)). Pouze použití DNA-specifického fluorochromu (Hoechst 33342) byla metoda, která dovolila enukleaci, která zaručila minimální snížení cytoplasmatického objemu (Tsunoda a kol., J. Reprod. Fertil., 82, 173 (1988)). U dobytka je to pravděpodobně v současné době rutinně používaná metoda (Prather a First, J. Reprod. Fertil. Suppl., 41, 125 (1990), Westhusin a kol., Biol. Reprod. (Suppl.), 42, 176 (1990)).
Bylo velmi málo zpráv, popisujících neinvazivní přístup k enukleaci u savců, zatímco u obojživelníků je ozařování ultrafialovým světlem používáno jako rutinní procedura (Gurdon, Q. Microsc. Soc., 101, 299-311 (1960)). Neexistují detailní zprávy o použití tohoto přístupu u savců, ačkoliv v průběhu použití DNA specifického fluorochromu bylo pozorováno, že vystavení myších oocytů ultrafialovému světlu po více než 30 sekund redukuje vývojový potenciál buňky (Tsunoda a kol., <J. Reprod. Fertil., 82, 173 (1988)).
Jak je popsáno výše, enukleace může být dosaženo fyzicky, aktuálním odstraněním jádra, prvojádra nebo metafázové destičky (v závislosti na přijímající buňce) nebo funkčně, jako je použití ultrafialového záření nebo jiný enukleující vliv.
Po enukleaci je vloženo dárcovské jádro buď fúzí do dárcovské' buňky za podmínek, které neindukují aktivaci oocytu nebo injekcí za neaktivujících podmínek. Aby byla zachována správná ploidita rekonstruovaného embrya, dárcovské jádro musí být v okamžiku fúze diploidní (to jest musí se nacházet ve fázi G0 nebo Gl buněčného cyklu).
···· • · 0 • · • · • · • ••a · ·· ·· • · · 4» • · · • · · ·
0 0 00 0000 • 9 9 9
9 99
0000 0
0 0 • 0 00
Jakmile byly připraveny vhodná dárcovská buňka a vhodná přijímající buňka, je nutné, aby bylo jádro dárcovské buňky přeneseno do přijímající buňky. Přenos jádra je nejvýhodněji dosažen fúzí. V okamžiku fúze nesmí existovat aktivace.
Existují tři uznávané metody, které jsou používány pro indukci fúze:
(1) vystavení buněk chemické látce, vyvolávající fúzi, jako je například polyethylenglykol;
(2) použití inaktivovaného viru, jako je například Sendai virus;
(3) použití elektrické stimulace.
Vystavení buněk chemické látce, vyvolávající fúzi, jako je polyethylenglykol nebo jiné glykoly, je rutinní procedura pro fúzi somatických buněk, ale nebyla široce používána u embryí. Jelikož polyethylenglykol je toxický, je nutné buňky vystavit jeho působení po minimální možný čas a nutnost být schopen odstranit rychle chemickou látku může způsobit, že se odstraní zóna pellucida (Kaňka a kol., Mol. Reprod. Dev. , 29, 110-116 (1991)). Při experimentech s myšími embryi se ukázalo, že inaktivovaný Sendai virus je účinný prostředek pro fúzi buněk embryí ve stavu štěpení (Graham, Wistar Inst. Symp. Monogr., 9, 19 (1969)) a tato metoda přináší další experimentální výhodu, spočívající v tom, že není indukována aktivace. U kopytníků je fúze obvykle dosahována stejnou elektrickou stimulací, jaká je používána k indukci parthogenní aktivace (Willandsen, Nátuře, 320 (6), 63-65 (1986)), Prather a kol., Biol. Reprod., 37, 859-866 (1987)). U těchto druhů Sendai virus indukuje fúzi v části případů, • · • · · · · · • · · · · ·
ale není dostatečně spolehlivý pro rutinní aplikaci (Willandsen, Nátuře, 320 (6), 63-65 (1986)).
I když fúze buňka-buňka je výhodným způsobem ovlivnění přenosu jádra, není to jediná metoda, která může být použita. Jiné použitelné techniky zahrnují mikroinjekci (Ritchie a Campbell, J. Reproduction and Fertility Abstracts, Series No.15, str. 60).
Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je fúze oocytové karyoplasmové dvojice dosažena v nepřítomnosti aktivace elektropulzací v 0,3M roztoku mannitolu nebo v 0,27M roztoku sacharózy; alternativně může být jádro vloženo injekcí v médiu, neobsahujícím vápník. Stáří oocytu v okamžiku fúze/injekce a nepřítomnost vápníkových iontů v médiu fúze/injekce zabraňuje aktivaci přijímajícího oocytu.
Při praktickém provádění je nejlepší, aby enukleace a přenos jádra následovaly co nejdříve poté, kdy oocyt dosáhne metafáze II. Doba, ze kterou k tomu dojde po začátku zrání (in vitro} nebo po podání hormonů (in vivo} závisí na živočišném druhu. Pro krávu a ovce by mělo k přenosu jádra dojít do 24 hodin; u prasete do 48 hodin; u myši do 12 hodin; a u králíka do 20-24 hodin. I když k přenosu může dojít i později, stává se stále obtížnějším dosáhnout přenosu, když oocyt stárne. Je žádoucí vysoká MPF aktivita.
Následně je fúzí rekonstruované embryo, které je obvykle navráceno do maturačního média, udržováno aniž by bylo aktivováno, aby bylo dárcovské jádro vystaveno cytoplasmě příjemce po dobu, která je dostatečná k tomu, aby rekonstruované embryo se nakonec stalo schopné dát vzniknout
živému tvorovi (výhodně plodnému potomkovi).
Optimální časový interval před aktivací se mění od jednoho druhu k druhému a může být snadno určen experimenty. Například pro krávu je vhodnou dobou od 6 do 20 hodin. Tento časový interval by pravděpodobně neměl být menší než je doba, za kterou může vzniknout chromosom a neměla by být tak dlouhá, aby jedna z částí dvojice se spontánně aktivovala nebo, v krajním případě, aby odumřela.
V okamžiku, kdy nastane vhodná doba pro aktivaci, může být použit kterýkoli konvenční nebo jiný vhodný protokol. Nedávno provedené experimenty ukazují, že požadavky na parthenogenní aktivaci jsou komplikovanější, než bylo původně předpokládáno. Předpokládalo se, že aktivace je jev typu všechno nebo nic a že všechna z velkého počtu působení, které jsou schopna indukovat vytváření prvojádra skutečně způsobí aktivaci. Vystavení králičích oocytů působení opakovaných elektrických pulsů však ukázalo, že pouze volba vhodné série pulsů a řízení množství iontů Ca2+ je schopno vyvolat vývoj diplodizovaných oocytů do střední gastruly (Ožil, Development, 109, 117-127 (1990)). V průběhu oplodnění dochází k přechodným vzrůstům koncentrace mezibuněčného vápníku (Cutbertson a Cobbold, Nátuře, 316, 541-542 (1985) ) a předpokládá se, že elektrické pulsy způsobují podobný vzrůst koncentrace vápníku. Existují důkazy, že průběh přechodných vzrůstů koncentrace vápníku se mění v závislosti na živočišném druhu a očekává se, že optimální průběh elektrických pulsů se mění podobným způsobem. Interval mezi pulsy u králíka je přibližně 4 minuty (Ožil, Development, 109, 117-127 (1990)) a u myši 10 až 20 minut (Cutbertson a Cobbold, Nátuře, 316, 541-542 • · • · • · • · • · «I · ·· · · · (1985)), zatímco existují předběžná pozorování, ukazující, že u krávy je tento interval přibližně 20 až 30 minut (Robi a kol., Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation (Seidel, ed.), Colorado State University, 24-27 (1992)). U většiny publikovaných experimentů byla aktivace indukována jediným elektrickým pulsem, ale nová pozorováni naznačuji, že počet rekonstituovaných embryi, která se vyvinou, se zvýši vystavením více pulsům (Collas a Robi, Biol. Reprod., 43, 877-884 (1990)). V každém individuálním případě mohou být provedeny rutinní úpravy pro optimalizaci počtu pulsů, intenzity pole a trvání pulsů a vápníkové koncentrace v médiu.
Při postupu podle vynálezu musí být zachovávána správná ploidita v průběhu aktivace. Je žádoucí inhibovat nebo stabilizovat mikrotubulovou polymeraci, aby se předešlo vytváření vícenásobných prvojader a tím aby se udržela správná ploidita. Toho může být dosaženo aplikací mikrotubulárního inhibitoru, jako je například nocodazol v účinné koncentraci (jako je okolo 5 mg/ml). Kolchicin a kolcemid jsou další mikrotubulové inhibitory. Alternativně může být použit mikrotubulový stabilizátor, jako je například taxol.
Molekulární složka mikrotubulů dynamické rovnováhy nepolymerovaným stavem, nocodazol, zabraňují (tubulin) je ve stavu mezi polymerovaným stavem a
Mikrotubulové inhibitory, jako je adici tubulinových molekul do mikrotubulů, čímž narušují rovnováhu a vedou k depolymeraci mikrotubulu a destrukci vřetena. Je výhodné přidat mikrotubulový inhibitor dostatečně dlouho před aktivací, aby se zajistila úplná nebo skoro úplná depolymerace •· ····
I · · · • · 4 • · ·
I · · · 4 • · 4 « · · · mikrotubulů. Dvacet až třicet minut se zdá být dostatečná doba ve většině případů. Mikrotubulový stabilizátor jako je taxol zabraňuje rozpadu vřetene a může také zabránit vytváření vícenásobných prvojader. Použití mikrotubulových stabilizátorů je výhodné za stejných podmínek jako je tomu u použití mikrotubulových inhibitorů.
Mikrotubulový inhibitor nebo stabilizátor by měl zůstat přítomen po aktivaci až do vytvoření prvojádra. Poté by měl být odstraněn a mělo by k tomu v každém případě dojít dříve, než dojde k prvnímu dělení.
Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou rekonstruované oocyty umístěny 30-42 hodin po začátku zrání (u krávy nebo ovce, to jest 6-18 hodin po přenosu jádra) do média, obsahujícího nocodazol (5 mg/ml) a aktivovány použitím konvenčních protokolů. Inkubace v nocodazolu může pokračovat po 4-6 hodin následujících po aktivačním stimulu (v závislosti na živočišném druhu a stáří oocytů).
Druhý předmět předkládaného vynálezu se týká životaschopného rekonstituovaného zvířecího embrya, které bylo získáno výše uvedeným způsobem.
Třetí předmět vynálezu se týká způsobu vytvoření zvířete, který sestává z následujících kroků:
(a) rekonstituce zvířecího embrya výše uvedeným způsobem a (b) způsobením vývoje uvedeného zvířete z embrya a (c) popřípadě rozmnožováním takto vzniklého zvířete.
• · • · · · · ·
Krok (a) byl detailně popsán výše.
Druhý krok, označený (b) , způsobu podle tohoto předmětu vynálezu znamená způsobit vývoj zvířete z embrya do dospělé formy. Toho může být dosaženo přímou nebo nepřímou cestou. Při přímém vývoji je rekonstituované embryo z kroku (a) jednoduše ponecháno vyvíjet se bez jakékoli intervence s výjimkou těch, které mohou být nutné k tomu aby k vývoji zvířete došlo. Při nepřímém způsobu však může docházet k další manipulaci s embryem předtím, než je jeho úplný vývoj dokončen. Embryo může být například rozštěpeno a buňky mohou být klonově pomnoženy, aby bylo dosaženo zvýšeného výtěžku.
Alternativně nebo dodatečně může být pro dosažení zvýšeného výtěžku životaschopných embryí pomocí předkládaného vynálezu použito klonální expanze dárců a/nebo použití procesu sériového přenosu (jader). Omezení v současnosti dosaženého počtu vytváření blastocyst může spočívat v tom, že u většiny embryí nedochází k přeprogramování (ačkoliv k němu dochází u přijatelného počtu embryí). Pokud nastává tento případ, může výtěžek zvýšen následujícím způsobem. Každé embryo, které se samo vyvine může být použito jako dárce jádra v etapě, kdy je jeho velikost 32-64 buněk; alternativně mohou být buňky vnitřní buněčné masy použity v blastocystové etapě. Jestliže tato embrya skutečně jsou ta, u kterých dochází k expresi přeprogramovaného genu a tato embrya jsou skutečně přeprogramována (což se zdá pravděpodobné), pak každé vyvíjející se embryo může být tímto způsobem znásobeno účinností procesu přenosu jádra. Stupeň zesílení, jehož je pravděpodobné dosáhnout, je závislý na typu buněk. U ovce je snadno možné dosáhnout 55% embryí v blastocystové etapě přenosem jediné blastomery z 16 buněčného embrya na
preaktivovaný oocyt, který je univerzální příjemce. Je tedy možno uvažovat o tom, že každé embryo vyvinuté z jediné buňky může dát vzniknout osmi v 16 buněčném stádiu. I když jsou tato čísla pouze hrubý odhad, je zřejmé, že v pozdějších vývojových stádiích bude zlepšení způsobu záviset na účinnosti procesu v tomto stádiu.
Bez ohledu na možná opatření pro zvýšení výtěžku může být rekonstituované embryo kultivováno in vivo nebo in vitro na blastocystu.
Zkušenost ukazuje, že embrya získaná přenosem jádra se odlišují od normálních embryí a někdy jim prospívají nebo jsou dokonce nutné kultivační podmínky in vivo jiné než jsou podmínky u embryí, které jsou normálně kultivovány (přinejmenším in vivo). Důvod tohoto jevu není znám. Při rutinní multiplikací hovězích embryí byla rekonstituovaná embrya (větší množství najednou) kultivována v ovčích vejcovodech po 5 až 6 dní (jak popsal Willadsen, v Mammalian Egg Transfer (Adams, E.E., ed.), 185, CRC Press, Boča Raton, Florida (1982)). Při postupu podle předkládaného vynálezu je však ve snaze chránit embryo žádoucí je vložit do ochranného média jako je agar před přenosem a potom disektovat z agaru po získání z přechodného příjemce. Funkce ochranného média jako je agar je dvojí: předně působí jako strukturální pomoc embryu tím, že se jeho zóna pellucida udržuje pohromadě; a za druhé působí jako bariéra pro buňky imunitního systému přijímajícího zvířete. I když tento přístup zvyšuje počet embryí, které vytvoří blastocysty, nevýhodou je, že řada embryí může být ztracena.
Pokud jsou použity podmínky in vitro, pak postupy běžně « » · * • · · · • · · · • · · · a • · · • · · Β používané podle stavu techniky jsou dobře přijatelné.
V blastocystovém stádiu může být embryo zkoumáno s ohledem na jeho schopnost dospět. Typicky bude tento postup použit, pokud se jedná o transgenní embryo a bude prováděno zkoumání a selekce stabilních integrantů. V této etapě může být také prováděn výběr podle netransgenních markérů. Jelikož však způsob podle vynálezu dovoluje výběr dárců v časnější etapě, bude výhodně postupováno tímto způsobem.
Po výběru embryí, pokud byl prováděn, bude blastocystové embryo ponecháno, aby dospělo. To bude obecně prováděno in vivo. Jestliže k vývoji do etapy blastocysty proběhlo in vitro, dojde v této etapě k přenosu do konečného zvířecího příjemce. Jestliže k vývoji do etapy blastocysty došlo in vivo, pak i když v principu je možno ponechat blastocystu dokončit její vývoj v pre-blastocystovém příjemci, běžně je blastocysta vyjmuta z (dočasného) pre-blastocystového příjemce a po disekci z ochranného média je umístěna do (trvalého) post-blastocystového příjemce.
V případném kroku (c) vynálezu mohou být předcházejících kroků podle tohoto předmětu předkládaného zvířata získaná způsobem podle množena. Tímto způsobem je možno vytvořit stádo zvířat, která mají požadovanou charakteristiku nebo charakteristiky.
genetickou
Zvířata produkovaná přenosem jádra ze zdroje geneticky identických buněk sdílejí totéž jádro, ale nejsou striktně identické, neboť jsou odvozeny z různých oocytu. Význam tohoto různého původu není jasný, ale může ovlivnit komerční znaky. Nedávno provedené analýzy mitochondriální DNA u *
4 4 4 ·
4 « «· 4 · dojnic na chovném stádu Iowa State University odhalily souvislost s dojivostí a reprodukční schopností (Freeman a Beitz, v Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation (Seidel, G.E., Jr. ed.) , 17-20, Colorado State University, Colorado (1992)). Je třeba ale potvrdit, že k podobným efektům v populaci dobytka dochází a uvážit, zda je možné nebo nutné ve specifických situacích provádět selekci oocytů. V oblasti pěstování dobytka může mít schopnost produkovat velké množství embryí od dárců s velkou genetickou hodnotou velkou potenciální hodnotu pro rozšíření genetických zlepšení v celostátním měřítku. Rozsah aplikace bude záviset na ceně každého embrya a počtu přenesených embryí, která jsou schopna dokončit úplně svůj vývoj.
Pro ilustraci a jako shrnutí podává následující schéma typický způsob, kterým mohou být připravena transgenní a netransgenní zvířata. Na způsob je možno pohlížet jako na proces, zahrnující pět kroků:
(1) isolace diploidní dárcovské buňky;
(2) případná transgeneze, například transfekcí vhodného konstruktu, který obsahuje nebo neobsahuje selekční markéry;
(2a) případné prohledávání a selekce na stabilní integranty
- přeskočeno pro mikroinjekce;
(3) rekonstituce embrya přenosem jádra;
(4) kultivace, in vivo nebo in vitro, do etapy blastocysty; (4a) případné prohledávání a selekce na stabilní integranty
- vynecháno, pokud byl prováděn krok 2a - nebo na další požadované vlastnosti;
• *
- 20 • 4 4 4
4 4 · 9 9
4 4
4·· ·
4 ·
4 • 4
4
4444
4»
4 4 4 • 4 4 4
9 9 9 9
4 4
4 4 · (5) přenos, je-li to třeba, do konečného příjemce.
Tento protokol má řadu výhod ve srovnání s dříve publikovanými metodami přenosů jádra:
1) Chromatin dárcovského jádra může být vystaven meiotické cytoplasmě v přijímajícím oocytu za nepřítomnosti aktivace po odpovídající dobu. To může zvýšit přeprogramování v dárcovském jádru změnou struktury chromátinu.
2) Správná ploidita rekonstituovaného embrya je dodržena, pokud je přeneseno G0/G1 jádro.
3) Dřívější studie ukázaly, hovězích/ovčích oocytů se dříve pozorovaný problém že aktivační citlivost zvyšuje se stářím. Jeden spočíval v tom, že u neenukleovaných starých oocytů docházelo k duplikaci meiotických vřeténkových polárních tělísek a byla pozorována multipolární vřeténka. Autoři ale zjistili, že u embryí rekonstruovaných a udržovaných při vysoké MPF úrovni nebyla pozorována organizovaná vřeténka, i když docházelo k rozpadu obalu a kondenzaci chromatinu. Předčasně kondenzovaný chromatin zůstával v těsném klubku a proto autoři mohli využít výhod procesu stárnutí a zvýšit aktivační odezvu rekonstruovaného oocytu, aniž by došlo k nepříznivému ovlivnění ploidity rekonstruovaného embrya.
Čtvrtý předmět vynálezu se týká zvířete, připraveného výše uvedeným způsobem.
• * · · · « « 9 9 9 9 · 9 9 9
9 9 9 9 ·· ····
Výhodné rysy kteréhokoliv předmětu vynálezu představují i výhodné rysy ostatních předmětů vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Vynález nyní bude popsán s odvoláním na uvedené příklady provedení vynálezu, které jsou podány za účelem ilustrace předmětu vynálezu, ale nepředstavují omezení jeho rozsahu. V následujícím textu bude použito odvolání na přiložené vyobrazení, ve kterém obr. 1 představuje rychlost zrání hovězích oocytů in vitro.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Procedura MAGIC, využívající hovězích oocytů
Přijímající oocyty podle tohoto příkladu jsou označeny jako MAGIC (Metaphase Arrested G1/G0 acceptlng Cytoplast) příjemci.
Byly studovány jaderné a cytoplasmatické události v průběhu in vitro zrání oocytů. Navíc byla také zkoumána role fúze a aktivace embryí, rekonstruovaných v různém stáří. Studie ukázaly, že zrání oocytů je asynchronní, avšak populace zralých oocytů může být morfologicky selektována po 18 • · hodinách.
Morfologická selekce oocytů
Obrázek 1 popisuje vaječníky, které byly získány na místních jatkách a při transportu do laboratoře udržovány při teplotě 28-32 °C. Z folikulů o průměru 3-10 mm byly hypodermickou jehlou (vnitřní průměr 1,2 mm) odsáty komplexy oocytárních vyklenutí (cumulus) a umístěny do sterilních plastových univerzálních zásobníků. Univerzální zásobníky byly umístěny do vyhřívané komory (35 °C) a folikulární materiál byl ponechán sedimentovat po 10 - 15 minut a pak byly odlity tři čtvrtiny supernatantu. Zbývající folikulární materiál byl zředěn stejným objemem disekčního média (TCM 199 s Earlovou solí (Gibco) , 75,0 mg/1 kanamycinu, 30,0 mM Hepes, pH 7,4, osmolarita 280 mOsmol/kg H2O), doplněného 10 % hovězím sérem, přenesen na 85 mm Petriho misku a pod disekčním mikroskopem byly vyhledávány komplexy oocytárních vyklenutí.
Byly vybrány komplexy s alespoň 2-3 kompaktními vrstvami buněk, promývány třikrát v disekčním médiu a přeneseny do maturačního média (TC médium 199 s Earlovou solí (Gibco), 75,0 mg/1 kanamycinu, 30,0 mM Hepes, 7,69 mM NaHCO3, pH 7,8, osmolarita 280 mOsmol/kg H2O), doplněného 10 % hovězím sérem a 1 x 106 buněk membrána granulosa/ml a kultivovány na kmitačce při teplotě 39 °C a v atmosféře 5 % oxidu uhličitého ve vzduchu. Oocyty byly odebrány z maturační misky a za vlhka umístěny na ethanolem vyčištěné skleněné destičky pod ochranným krytem, který byl připevněn směsí 5 % petrolejového želé a 95 % vosku. Nanesená embrya potom byla fixována po 24 hodin v čerstvě připravené směsi methanolu a ledové kyseliny octové (3:1), označena 45 % aceto-orceinem • 0 0000 » 0 · 0 * • · *
• 000 0
00 ·· ··
0 0 0 000 0
0 · 0·0* • Φ 0 0 0000 ·
0 0 0 0 0
0000 0» ·· (Sigma) a zkoumána fázovým kontrastem a DIC mikroskopií použitím mikroskopu Nikon Microphot-SA. Graf na obr. 1 ukazuje procento oocytů v Mil a oocytů s viditelným polárním tělískem.
Aktivace hovězích folikulárních oocytů
Jestliže zrání pokračuje až do 24 hodin, tyto oocyty se aktivují ve velmi malém počtu (24 %) v mannitolu obsahujícím vápník (Tabulka la) . Odstranění vápníku a hořčíku z elektropulzačního média zabraňuje jakékoli aktivaci.
Tabulka la ukazuje aktivaci hovězích folikulárních oocytů, které zrály in vitro po různé doby. Oocyty byly odstraněny z maturačního média, jednou promývány v aktivačním médiu, umístěny do aktivační komory a podrobeny jedinému elektrickému pulzu o intenzitě 1,25 kV/cm po dobu 80 ms.
Tabulka la
Aktivační odezva předstíraně enukleovaných hovězích oocytů
| Počet oocytů (N) | Hodin po začátku zrání (hpm) [stáří (hod)] | Vytváření prvojader (% aktivace) |
| 73 | 24 | 24,6 |
| 99 | 30 | 84,8 |
| 55 | 45 | 92,7’ |
* 2 nebo více projader • · · · · · • ·
• · » · · · · ·♦ * · · 4 ···« « • « · · · · ·· ·♦·» · · · ·
Tabulka lb ukazuje aktivační odezvu oocytů, které zrály in vitro, předstíraně enukleovaných přibližně 22 hodin po začátku zrání (hpm). Oocyty byly zpracovávány stejně jako pro enukleaci, bylo odsáto malé množství cytoplasmy, neobsahující metafázovou destičku. Po manipulaci byly oocyty vystaveny jedinému stejnosměrnému pulsu intenzity 1,25 kV/cm a navráceny do maturačního média a 30 hpm respektive 42 hpm byly oocyty uloženy, fixovány a označeny aceto-orceinem. Výsledky ukazují počet oocytů v každý okamžik z pěti individuálních pokusů jako množství buněk, které měly prvojádra vzhledem k celkovému množství buněk.
Tabulka lb
| Pokus | Počet buněk s prvojádrem / celkový počet buněk 30 hpm | Počet buněk s prvojádrem / celkový počet buněk 42 hpm |
| 1 | 1/8 | — |
| 2 | 0/24 | 0/30 |
| 3 | 0/21 | 0/22 |
| 4 | 0/27 | 0/25 |
| 5 | 0/19 | 0/1 |
hpm = hodin po začátku zrání (maturace)
Vytváření prvojádra v enukleovaném oocytu.
Tabulka 2 ukazuje vytváření prvojádra v enukleovaných oocytech, fúzovaných k primárním hovězím fibroblastům (24 • 4 •4 4444 • 4
9
4
4 • 4 4 4 4
4« 44 · · *
I « »
4 4 «
4 4
4444
4 · · ·
4 4 4 « • 4 ·
4 ·4 hpm) a poté aktivovaných (42 hpm). Výsledky představují pět oddělených experimentů. Oocyty byly rozděleny do dvou skupin, skupina Ά byla inkubována v nocodazolu po 1 hodinu před aktivací a po 6 hodin po aktivaci. Skupina B byla bez působení nocodazolem. Aktivované oocyty byly fixovány a označeny aceto-orceinem 12 hodin po aktivaci. Počet prvojader (PN) v každém parthenátu byl potom určován pod fázovým kontrastem. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento aktivovaných oocytů, obsahujících jedno nebo více prvojader.
Tabulka 2
| Celkově | 1 PJ | 2 PJ | 3 PJ | 4 PJ | >4 PJ | |
| Skupina A | 52 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Skupina B | 33 | 45,2 | 25,8 | 16,1 | 3,2 | 9,7 |
Nepřítomnost organizovaného vřeténka a nepřítomnost polárního tělíska naznačuje, že k tomu, aby byla zachována ploidita v rekonstruovaném embryu je nutné, aby byly v této cytoplasmatické situaci byla přenášena pouze G0/G1 jádra. Inkubace aktivovaných oocytů v přítomnosti mikrotubulového inhibitoru nocodazolu po pět hodin, jednu hodinu před a potom po aktivačním stimulu zabraňuje vytváření mikrojader (Tabulka 2) a tudíž pokud je dárcovské jádro v G0/G1 fázi buněčného cyklu, je zachovávána správná ploidita rekonstruovaného embrya.
4· ·· ··
9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·
9 9 9 9 9 99 • * 99 9 9 9 9999 ·
9 9 9 9 9 9 9
9999 9 99 9999 99 ··
Výsledky
Tyto výsledky ukazují, že:
i) tyto oocyty mohou být enukleovány 18 hodin po započetí zrání (obr. 1);
ii) enukleované oocyty mohou být fúzovány s dárcovskými blastomerami/buňkami buď v 0,3 M mannitolu nebo v 0,27 M sacharóze a alternativně mohou být dárcovské buňky nebo jádra injektována v médiu prostém vápníku za nepřítomnosti jakékoli aktivační odezvy;
iii) rekonstruovaná embrya nebo enukleované pulsované oocyty mohou být kultivovány v maturačním médiu a nepodstoupí spontánní aktivaci;
iv) je pozorováno, že přenesená jádra podstupují rozpad obalu jádra (NEBD) a chromosomovou kondenzaci. Není pozorováno žádné organizované meiotické/mitotické vřeténko, bez ohledu na etapu buněčného cyklu přeneseného jádra;
v) takto zpracované dvojice se aktivují po 30 hodinách a po 42 hodinách se stejnou frekvencí jako nezpracované kontrolní oocyty;
ví) po následné aktivaci nebylo pozorováno žádné polární tělísko, bez ohledu na' bez ohledu na etapu buněčného cyklu přeneseného jádra;
• 9
- 27 4 • 499
9« 94 94 »4
444« · 4 4 « • 44 9 9 4 49
4 4 9 4494 · viii) po následné aktivaci ve vytvořilo 1-5 mikrojader na rekonstruovanou zygotu (Tabulka 2).
Rekonstrukce hovězích embryi použitím procedury MAGIC
V předběžných experimentech byla tato technika aplikována na rekonstrukcí hovězích embryí použitím primárních fibroblastů synchronizovaných v GO fázi buněčného cyklu sérovým hladověním po dobu pěti dnů. Výsledky jsou sumarizovány v Tabulce 3.
Tabulka 3 ukazuje vývoj hovězích embryí rekonstruovaných přenosem jádra hovězích primárních fibroblastů po sérovém hladovění (GO) do enukleovaných desaktivovaných Mil oocytů. Embrya byla rekonstruována v okamžik 24 hpm a fúzované dvojice byly aktivovány v 42 hpm. Fúzované dvojice byly inkubovány v nocodazolu (5 mg/ml) v M2 médiu po jednu hodinu před aktivaci a po pět hodin po aktivaci. Dvojice byly aktivovány jediným stejnosměrným pulsem o intenzitě 1,25 kV/CM a trvání 80 ms.
Tabulka 3
| Číslo pokusu | Počet blastocyst/ celkový počet fúzovaných dvojic | % blastocyst |
| 1 | 1/30 | 3,3 |
| 2 | 4/31 | 12,9 |
0« 0000
00 00 0* «0 f 0000 0000
00 000 00 0 0 00 0 00 0000 * 0 0 000 000 • 000 0 00 0000 0* ·*
Příklad 2: MAGIC procedura s použitím ovčích oocytů
Pozorování podobná těm, která byla učiněna v příkladě 1, byla dosažena s ovčími oocyty, které zrály in vivo. Čerstvě ovulované oocyty byly získány propláchnutím z vejcovodů superstimulovaných samic ovce 24 hodin po podání prostaglandinu. Použití PBS prostého vápníku a hořčíku /0,1 % FCS jako proplachovacího média zabránilo oocytové aktivaci. Oocyty byly enukleovány v médiu prostém vápníku a dárcovské buňky byly vloženy výše uvedeným způsobem v , Nebylo pozorováno žádné organizované jádra se vytvořila po následné nepřítomnosti aktivace, vřeténko, vícenásobná aktivaci, což může být potlačeno ošetřením nocodazolem.
Výsledky
V předběžných experimentech s ovcí jedno těhotenství vedlo k narození jednoho živého jehněte. Výsledky jsou přehledně uvedeny v Tabulce 4 a Tabulce 5.
Tabulka 4 ukazuje vývoj ovčích embryí rekonstruovaných přenosem z embrya odvozené buněčné linie do inaktivovaných enukleovaných ovčích oocytů, které zrály in vivo. Oocyty byly získány ze superstimulované ovčí samice Scottish blackface, buněčná linie byla získána z embryonálního disku 9 dní starého embrya získaného z ovčí samice Welsh mountain. Rekonstruovaná embrya byla kultivována v podvázaném vejcovodu dočasného příjemce, představovaného ovčí samicí, po 6 dní a po opětovném vyjmutí by určen dosažený vývoj.
•0 000·
00 00 0 0»0· 0 00 · 0000 0 00 0 0 · 00·· 0 • 0 0 0 · · · • 00 ···· 0· ··
Tabulka 4
| Datum přenosu jádra | Číslo stádia | Počet morul, blastocyst/ Celkový počet |
| 11.1.95 | 6 | 4/28 |
| 19.1.95 | 7 | 1/10 |
| 31.1.95 | 13 | 0/2 |
| 02.2.95 | 13 | 0/14 |
| 07.2.95 | 11 | 1/9 |
| 9.2.95 | 11 | 1/2 |
| 14.2.95 | 12 | |
| 16.2.95 | 13 | 3/13 |
| Celkově | 10/78 (12,8 %) |
Tabulka 5 ukazuje indukcí těhotenství následujícího po přenosu všech rekonstruovaných embryí ve stádiu morula/blastocysta do děložního rohu synchronizovaných samic Scotish blackface. embryí z každé přenesené k počtu ovcí a vzhledem konečných příjemců - ovčích Tabulka ukazuje celkový počet skupiny, frekvenci těhotenství embryí; ve většině případů byla do každé samice přenesena dvě embrya. Bylo dosaženo jedno dvojité těhotenství, které vedlo k narození jednoho živého jehněte.
Claims (18)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob rekonstituce zvířecího embrya, vyznačující se tím, že zahrnuje přenos diploidního jádra do oocytu, který je uzavřen v metafázi druhého meiotického dělení, aniž by přenos byl doprovázen aktivací oocytů, uchovávání jádra vystaveného cytoplasmě příjemce po časový interval dostatečný k tomu, aby embryo se stalo schopné vyvinout se k porodu živého zvířete a nakonec aktivaci rekonstituovaného embrya při zachovávání správné ploidity.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zvíře je kopytník.
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že zvíře je kráva nebo býk, prase, koza, ovce, velbloud nebo bůvol.
- 4. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že dárcovské jádro je geneticky modifikováno.
- 5. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že diploidní jádro je získáno z buňky v klidovém stavu.
- 6. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že přijímající oocyt je enukleovaný.
- 7. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že přenosu jádra je dosaženo buněčnou fúzí.00 00000« 00 00 ·« · 0 · · 0 0 0 0 0 o o ·· ·· ·····Jó ~ «0 0 0 0 ♦ · 000 0 0 • 0 000 00·0«0« 0 00 0000 00 ·0
- 8. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že zvíře je kráva nebo býk a dárcovské jádro je udržováno vystavené cytoplasmě příjemce po dobu od 6 do 20 hodin před aktivací.
- 9. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že správná ploidita je v průběhu aktivace udržována inhibici mikrotubulů.
- 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že inhibice mikrotubulů je dosaženo aplikací nocodazolu.
- 11. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že správná ploidita je v průběhu aktivace udržována stabilizací mikrotubulů.
- 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že stabilizace mikrotubulů je dosaženo aplikací taxolu.
- 13. Způsob přípravy zvířete, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:(a) rekonstituce zvířecího embrya způsobem podle kteréhokoli z předcházejících nároků;(b) způsobením vývoje uvedeného zvířete z embrya až k porodu; a (c) popřípadě rozmnožováním takto vzniklého zvířete.
- 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že zvířecí embryo je dále manipulováno před dokončením jeho úplného vývoje.
- 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že z embrya «· «««· • · ·· 99 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 · ·· • · 9 9 9 9 9 99 9 9 99 9 9 9 9 9 9 99999 9 99 9999 99 99 je odvozeno více než jedno zvíře.
- 16. Rekonstituované zvířecí embryo, schopné se vyvinout k živému porodu a připravené způsobem podle kteréhokoli z nároků 1 až 12.
- 17. Zvíře připravené způsobem podle kteréhokoli z nároků 13 až 15.
- 18. Zvíře vyvinuté z embrya podle nároku 16.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9517779.6A GB9517779D0 (en) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | Biological manipulation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ60498A3 true CZ60498A3 (cs) | 1998-07-15 |
Family
ID=10779997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ98604A CZ60498A3 (cs) | 1995-08-31 | 1996-08-30 | Neaktivované oocyty jako cytoplastové recipienty pro přenos jádra |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (12) | US6252133B1 (cs) |
| EP (1) | EP0847237B1 (cs) |
| JP (3) | JP2000506721A (cs) |
| KR (4) | KR100743006B1 (cs) |
| CN (3) | CN1250715C (cs) |
| AT (1) | ATE400176T1 (cs) |
| AU (1) | AU728809B2 (cs) |
| BR (1) | BR9610013A (cs) |
| CA (1) | CA2229657A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ60498A3 (cs) |
| DE (1) | DE69637591D1 (cs) |
| DK (1) | DK0847237T3 (cs) |
| ES (1) | ES2309989T3 (cs) |
| GB (1) | GB9517779D0 (cs) |
| HK (1) | HK1004937A1 (cs) |
| HU (1) | HUP9802485A3 (cs) |
| IL (1) | IL123417A0 (cs) |
| NO (1) | NO980846L (cs) |
| NZ (2) | NZ316148A (cs) |
| PL (1) | PL325336A1 (cs) |
| SG (1) | SG75919A1 (cs) |
| WO (1) | WO1997007668A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA967383B (cs) |
Families Citing this family (191)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5480772A (en) | 1993-02-03 | 1996-01-02 | Brandeis University | In vitro activation of a nucleus |
| GB9517780D0 (en) * | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| GB9517779D0 (en) * | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| US7332648B2 (en) | 1995-08-31 | 2008-02-19 | Roslin Institute | Unactivated oocytes in nuclear transfer to produce cultured inner cell mass cells and ungulates |
| US6077697A (en) * | 1996-04-10 | 2000-06-20 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US6025155A (en) * | 1996-04-10 | 2000-02-15 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US6271436B1 (en) | 1996-10-11 | 2001-08-07 | The Texas A & M University System | Cells and methods for the generation of transgenic pigs |
| US5945577A (en) * | 1997-01-10 | 1999-08-31 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
| US6235969B1 (en) * | 1997-01-10 | 2001-05-22 | University Of Massachusetts | Cloning pigs using donor nuclei from non-quiescent differentiated cells |
| US20090092588A1 (en) * | 1997-01-10 | 2009-04-09 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloned ungulate embryos and animals, use of cells, tissues and organs thereof for transplantation therapies including parkinson's disease |
| US6011197A (en) | 1997-03-06 | 2000-01-04 | Infigen, Inc. | Method of cloning bovines using reprogrammed non-embryonic bovine cells |
| EP1676920B1 (en) | 1997-03-26 | 2014-07-09 | Imperial Innovations Limited | Anticoagulant fusion protein anchored to cell membrane |
| CA2294916A1 (en) | 1997-07-03 | 1999-01-14 | University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from non-serum starved, differentiated cells |
| US7923216B2 (en) | 1997-08-14 | 2011-04-12 | Institut Pasteur | In vivo modulation of neuronal transport |
| US7923015B2 (en) | 1997-08-14 | 2011-04-12 | Institut Pasteur | Methods for direct visualization of active synapses |
| JPH11127852A (ja) * | 1997-10-28 | 1999-05-18 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 上皮細胞のｇ０期同調方法 |
| ATE407555T1 (de) * | 1998-01-16 | 2008-09-15 | Agrobiogen Gmbh | Efficienter kerntransfer mit primordialen keimzellen |
| US7351876B2 (en) | 1998-01-16 | 2008-04-01 | Agrobiogen Gmbh Biotechnologie | Efficient nuclear transfer with primordial gametes |
| US6331659B1 (en) * | 1998-01-21 | 2001-12-18 | University Of Hawaii | Cumulus cells as nuclear donors |
| JP2002511234A (ja) * | 1998-03-16 | 2002-04-16 | リレグ ピーティーワイ リミテッド | ブタの核移植 |
| AUPP294898A0 (en) * | 1998-04-15 | 1998-05-07 | Monash University | Method of nuclear transfer |
| GB9808325D0 (en) * | 1998-04-20 | 1998-06-17 | Ltr Ciz Di Associazione Italia | Source of nuclei for nuclear transfer |
| US6143564A (en) * | 1998-07-07 | 2000-11-07 | University Of Hawaii | Use of the polar body chromosomes for the production of embryos and normal offspring |
| GB9820988D0 (en) * | 1998-09-25 | 1998-11-18 | Biotech & Biolog Scien Res | Screening method |
| AU6218899A (en) * | 1998-10-12 | 2000-05-01 | Geron Bio-Med Limited | Porcine oocytes with improved developmental competence |
| US6781030B1 (en) | 1998-11-02 | 2004-08-24 | Trustee Of Tufts College, Ballou Hall | Methods for cloning mammals using telophase oocytes |
| EP1818397A1 (en) * | 1998-11-02 | 2007-08-15 | Trustees Of Tufts College | Methods for cloning animals |
| WO2000030436A1 (en) | 1998-11-19 | 2000-06-02 | Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd. | Stabilisation of milk from transgenic animals |
| US6258998B1 (en) | 1998-11-24 | 2001-07-10 | Infigen, Inc. | Method of cloning porcine animals |
| US6700037B2 (en) | 1998-11-24 | 2004-03-02 | Infigen, Inc. | Method of cloning porcine animals |
| US7531715B1 (en) * | 1999-01-13 | 2009-05-12 | Ppl Therapeutics (Scotland) | Double nuclear transfer method and results thereof |
| NZ550899A (en) * | 1999-01-13 | 2008-07-31 | Revivicor Inc | Double nuclear transfer method and the production of a non human animal thereby |
| EP1147204A1 (en) | 1999-01-28 | 2001-10-24 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna |
| EP2301947A3 (en) | 1999-02-26 | 2011-11-23 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Secreted proteins and uses thereof |
| ATE452973T1 (de) * | 1999-03-04 | 2010-01-15 | Revivicor Inc | Genetische veränderung von somatischen zellen und deren verwendungen |
| US20020012660A1 (en) * | 1999-03-04 | 2002-01-31 | Alan Colman | Method of preparing a somatic cells for nuclear transfer |
| WO2001000855A1 (en) | 1999-06-23 | 2001-01-04 | Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd. | Fusion proteins incorporating lysozyme |
| EP1109891A4 (en) | 1999-06-30 | 2004-11-17 | Hwang Woo Suk | PROCESS FOR PRODUCING CLONE COWS |
| EP1117763A4 (en) * | 1999-06-30 | 2004-12-01 | Hwang Woo Suk | METHOD FOR PRODUCING CLONED TIGERS BY MEANS OF INTERSPEZIES CORE TRANSPLANTING TECHNOLOGY |
| US7291714B1 (en) | 1999-06-30 | 2007-11-06 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Glycoprotein VI and uses thereof |
| KR100414043B1 (ko) * | 1999-06-30 | 2004-01-13 | 황우석 | 체세포 복제동물 및 그 생산방법 |
| KR100368435B1 (ko) * | 1999-06-30 | 2003-01-24 | 황우석 | 체세포 복제동물의 생산을 위한 세포융합방법 |
| EP1109890A4 (en) * | 1999-06-30 | 2004-12-29 | Hwang Woo Suk | METHOD FOR PRODUCING CLONED, HUMAN EMBRYOS BY MEANS OF INTERSPEZIES CORE TRANSPLANTING TECHNOLOGY. |
| MXPA02001877A (es) | 1999-08-23 | 2002-08-20 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Pd-1, un receptor para b7-4, y usos del mismo. |
| EP2275559A3 (en) | 1999-09-28 | 2011-03-23 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Optimized messenger RNA |
| WO2002064799A2 (en) | 1999-09-28 | 2002-08-22 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Optimized messenger rna |
| KR100417566B1 (ko) * | 1999-11-19 | 2004-02-05 | 한국생명공학연구원 | 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법 |
| US7074983B2 (en) * | 1999-11-19 | 2006-07-11 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transgenic bovine comprising human immunoglobulin loci and producing human immunoglobulin |
| US7414170B2 (en) * | 1999-11-19 | 2008-08-19 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transgenic bovines capable of human antibody production |
| WO2001035735A1 (en) * | 1999-11-19 | 2001-05-25 | Hematech, Llc | Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins |
| US7820878B2 (en) * | 1999-11-19 | 2010-10-26 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins |
| GB9927444D0 (en) * | 1999-11-19 | 2000-01-19 | Cancer Res Campaign Tech | Inhibiting gene expression |
| CA2396210A1 (en) | 2000-01-04 | 2001-07-12 | Chikara Kubota | Method for cloning animals with targetted genetic alterations by transfer_of long-term cultured male or female somatic cell nuclei, comprising artificially-induced genetic alterations, to enucleated recipient cells |
| US6635802B1 (en) * | 2000-01-10 | 2003-10-21 | The Texas A&M University System | Nuclear transfer using cells cultured in serum starvation media containing apoptosis inhibitors |
| ES2272482T3 (es) | 2000-01-20 | 2007-05-01 | Diabcell Pty Limited | Preparacion y xenotransplante de islotes porcinos. |
| AU2001236919A1 (en) * | 2000-02-09 | 2001-08-20 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Premeiotic and postmeiotic origin of teratomas: isolated teratoma stem cells for therapeutic uses |
| US6906238B2 (en) | 2000-03-15 | 2005-06-14 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Effective nuclear reprogramming in mammals using CDK2 inhibitors |
| GB2360522A (en) | 2000-03-24 | 2001-09-26 | Geron Corp | A strategy for maintaining pregnancy |
| AU2001261650A1 (en) * | 2000-05-15 | 2001-11-26 | Geron Corporation | Ovine tissue for xenotransplantation |
| EP1290227B1 (en) | 2000-06-05 | 2009-08-12 | Genetics Institute, LLC | Compositions, kits, and methods for identification and modulation of type i diabetes |
| AU2001273096B8 (en) | 2000-06-28 | 2005-10-13 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | PD-L2 molecules: novel PD-1 ligands and uses therefor |
| NZ524523A (en) | 2000-08-03 | 2006-02-24 | Therapeutic Human Polyclonals | Production of humanized antibodies in transgenic animals |
| US6677500B2 (en) | 2000-08-15 | 2004-01-13 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Ungulates expressing exogenous IGF-I in their milk |
| FR2814642B1 (fr) | 2000-10-03 | 2005-07-01 | Ass Pour Le Dev De La Rech En | Souris transgenique pour la recombinaison ciblee mediee par la cre-er modifiee |
| US20040031069A1 (en) * | 2000-10-06 | 2004-02-12 | Philip Damiani | Cloning endangered and extinct species |
| EP2295606A1 (en) | 2000-11-28 | 2011-03-16 | Wyeth LLC | Expression analysis of KIAA nucleic acids and polypeptides useful in the diagnosis and treatment of prostate cancer |
| BR0115715A (pt) | 2000-11-28 | 2004-02-03 | Wyeth Corp | Análise de expressão de ácidos nucleìcos e polipeptìdeos úteis na diagnose e tratamento de câncer da próstata |
| WO2002102997A2 (en) * | 2000-11-30 | 2002-12-27 | Stemron Inc. | Isolated homozygous stem cells differentiated cells derived therefrom and materials and methods for making and using same |
| US20020142397A1 (en) * | 2000-12-22 | 2002-10-03 | Philippe Collas | Methods for altering cell fate |
| US7491534B2 (en) * | 2000-12-22 | 2009-02-17 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Methods for altering cell fate to generate T-cells specific for an antigen of interest |
| AU2002232858B2 (en) * | 2000-12-22 | 2007-01-11 | Sab, Llc | Methods for cloning mammals using reprogrammed donor chromatin or donor cells |
| ATE466089T1 (de) | 2000-12-22 | 2010-05-15 | Agronomique Inst Nat Rech | Positionsunabhängige und gewebespezifische expression eines transgens in der milch eines transgen-tieres |
| EP1860199B1 (en) | 2001-01-12 | 2014-03-05 | Exelixis, Inc. | Modulating insulin receptor signaling |
| MXPA03006751A (es) | 2001-01-30 | 2005-04-08 | Amy K Rebholtz | Metodos para el manejo de recipientes para embriones. |
| CA2369944A1 (en) | 2001-01-31 | 2002-07-31 | Nucleonics Inc. | Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell |
| JP2002262716A (ja) * | 2001-03-07 | 2002-09-17 | National Agricultural Research Organization | 株化細胞を用いて家畜個体を作出する方法 |
| US8981061B2 (en) | 2001-03-20 | 2015-03-17 | Novo Nordisk A/S | Receptor TREM (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof |
| US7126039B2 (en) * | 2001-03-21 | 2006-10-24 | Geron Corporation | Animal tissue with carbohydrate antigens compatible for human transplantation |
| AU2002242854A1 (en) * | 2001-03-21 | 2002-10-03 | Geron Corporation | Use of telomerase reverse transcriptase to create homozygous knockout animals |
| MXPA03008959A (es) | 2001-04-02 | 2004-10-15 | Wyeth Corp | Pd-1, un receptor para b7-4 y sus usos. |
| JP2005501518A (ja) | 2001-04-16 | 2005-01-20 | ワイス・ホールディングズ・コーポレイション | ポリペプチド抗原をコードしている新規ストレプトコッカスニューモニアエオープンリーディングフレームおよびその使用 |
| US20050149999A1 (en) * | 2001-06-14 | 2005-07-07 | Infigen Inc. | Methods for cloning mammals using remodeling factors |
| EP1406917A4 (en) * | 2001-06-15 | 2007-11-14 | New Century Pharmaceuticals | HUMAN ANALYTICAL MODELS FOR THE EVALUATION OF MEDICINAL PRODUCTS AND FOR TOXICOLOGICAL AND IMMUNOGENIC EXAMINATIONS |
| EP1900815B1 (en) | 2001-07-12 | 2016-09-07 | University of Massachusetts | In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing |
| ES2566561T3 (es) | 2001-07-12 | 2016-04-13 | University Of Massachusetts | Producción in vivo de ARN pequeños de interferencia que median el silenciamiento génico |
| US20030211603A1 (en) * | 2001-08-14 | 2003-11-13 | Earp David J. | Reprogramming cells for enhanced differentiation capacity using pluripotent stem cells |
| US20030170678A1 (en) * | 2001-10-25 | 2003-09-11 | Neurogenetics, Inc. | Genetic markers for Alzheimer's disease and methods using the same |
| WO2003054143A2 (en) * | 2001-10-25 | 2003-07-03 | Neurogenetics, Inc. | Genes and polymorphisms on chromosome 10 associated with alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases |
| US20030224380A1 (en) * | 2001-10-25 | 2003-12-04 | The General Hospital Corporation | Genes and polymorphisms on chromosome 10 associated with Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases |
| WO2003046129A2 (en) * | 2001-11-09 | 2003-06-05 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions for the derivation of germ cells from stem cells and methods of use thereof |
| AU2002352558A1 (en) | 2001-11-09 | 2003-05-26 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Pgc-1beta, a novel pgc-1 homologue and uses therefor |
| US20030217374A1 (en) * | 2002-01-15 | 2003-11-20 | Advanced Cell Technology | Cloning B and T lymphocytes |
| US20050170506A1 (en) * | 2002-01-16 | 2005-08-04 | Primegen Biotech Llc | Therapeutic reprogramming, hybrid stem cells and maturation |
| US20050090004A1 (en) * | 2003-01-16 | 2005-04-28 | Sayre Chauncey B. | Stem cell maturation for all tissue lines |
| US20030134422A1 (en) * | 2002-01-16 | 2003-07-17 | Sayre Chauncey Bigelow | Stem cell maturation for all tissue lines |
| AU2003230725A1 (en) * | 2002-04-01 | 2003-10-20 | Gtc Biotherapeutics, Inc. | A method for selecting cell lines to be used for nuclear transfer in mammalian species |
| US20030217378A1 (en) * | 2002-04-05 | 2003-11-20 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc | Cloning using rapidly matured oocytes |
| US7612250B2 (en) * | 2002-07-29 | 2009-11-03 | Trustees Of Tufts College | Nuclear transfer embryo formation method |
| JP2006514823A (ja) | 2002-08-20 | 2006-05-18 | ミレニアム ファーマスーティカルズ インク | 子宮頸癌の同定、評価、予防および治療を行うための組成物、キットおよび方法 |
| CA2501752A1 (en) | 2002-10-10 | 2004-04-22 | Wyeth | Compositions, organisms and methodologies employing a novel human kinase |
| EP1581636A4 (en) * | 2002-10-16 | 2006-09-20 | Advanced Cell Tech Inc | METHOD OF USE OF STEM CELLS TREATED BY DERGENVALENTECHNIK (GENE TRAP) FOR MARKING STRAIN CELL DIFFERENTIATION PATHS, AND THE PREPARATION AND ISOLATION OF DIFFERENTIATED CELLS |
| US7208306B2 (en) | 2002-10-24 | 2007-04-24 | Wyeth | Compositions employing a novel human protein phosphatase |
| JP2006505291A (ja) | 2002-11-08 | 2006-02-16 | ヘマテック，エルエルシー | プリオンタンパク質活性が低減されたトランスジェニック有蹄動物及びその用途 |
| CA2505416A1 (en) | 2002-11-21 | 2004-06-10 | Wyeth | Methods for diagnosing rcc and other solid tumors |
| AU2003290664A1 (en) | 2002-11-27 | 2004-06-23 | Wei Liu | Compositions, organisms and methodologies employing a novel human kinase |
| EP2474632B1 (en) | 2002-12-20 | 2015-08-12 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction, methods of detection and uses thereof |
| CA2511907A1 (en) | 2003-01-06 | 2004-07-22 | Wyeth | Compositions and methods for diagnosing and treating colon cancers |
| US8309704B2 (en) | 2003-06-02 | 2012-11-13 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNAi |
| DK1633767T3 (en) | 2003-06-02 | 2019-03-25 | Univ Massachusetts | METHODS AND COMPOSITIONS FOR MANAGING THE EFFECT OF RNA SILENCING |
| CA2535897A1 (en) | 2003-08-14 | 2005-02-24 | Exelixis, Inc. | Sulfs as modifiers of the beta catenin pathway and methods of use |
| CN1964986A (zh) | 2003-10-07 | 2007-05-16 | 千年药品公司 | 用于鉴定、评价、预防和治疗卵巢癌的核酸分子和蛋白质 |
| EP1681988B1 (en) | 2003-11-12 | 2015-04-08 | The Children's Hospital Medical Center | Method for diagnosis and treatment of pulmonary disorders |
| US7682828B2 (en) | 2003-11-26 | 2010-03-23 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods for reprogramming somatic cells |
| EP1711622A2 (en) | 2003-11-26 | 2006-10-18 | Applera Corporation | Genetic polymorphisms associated with cardiovascular disorders and drug response, methods of detection and uses thereof |
| JP2007533328A (ja) | 2004-04-22 | 2007-11-22 | キリンホールディングス株式会社 | トランスジェニック動物及びその用途 |
| JP5236286B2 (ja) | 2004-05-07 | 2013-07-17 | セレラ コーポレーション | 肝線維症に関連する遺伝的多型、その検出方法および使用 |
| JP2008517931A (ja) | 2004-10-22 | 2008-05-29 | ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド | 脂質関連疾患および障害を処置するための、ＰＧＣ−１βを調節するための方法および組成物 |
| GB0426146D0 (en) | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Bioxell Spa | Therapeutic peptides and method |
| CN1274829C (zh) | 2004-12-10 | 2006-09-13 | 四川大学华西医院 | 抗eb病毒所致肿瘤多肽及其应用与制备方法 |
| EP2113572B1 (en) | 2005-03-11 | 2012-12-05 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with coronary heart disease, methods of detection and uses thereof |
| US20070011603A1 (en) * | 2005-07-06 | 2007-01-11 | Mikko Makela | Method, system, device and software product for showing tooltips for page segments and generating content for the page segments |
| AU2006292827B2 (en) | 2005-08-09 | 2013-02-14 | Revivicor, Inc. | Transgenic ungulates expressing CTLA4-IG and uses thereof |
| JP2009507835A (ja) | 2005-09-09 | 2009-02-26 | ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ | 抗体、アゴニストおよびアンタゴニストを用いてニューリチン遺伝子をターゲティングすることによる調節性ｔ細胞およびｄｃの機能の操作 |
| AU2006292224B2 (en) | 2005-09-19 | 2013-08-01 | Histogenics Corporation | Cell-support matrix and a method for preparation thereof |
| US7799530B2 (en) | 2005-09-23 | 2010-09-21 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with cardiovascular disorders and drug response, methods of detection and uses thereof |
| US7695911B2 (en) | 2005-10-26 | 2010-04-13 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with Alzheimer's Disease, methods of detection and uses thereof |
| PE20081216A1 (es) | 2006-09-01 | 2008-09-04 | Therapeutic Human Polyclonals Inc | Expresion mejorada de la inmunoglobulina humana o humanizada en animales transgenicos no humanos |
| EP2636754B1 (en) | 2006-09-11 | 2015-03-04 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with psoriasis, methods of detection and uses thereof |
| WO2008051511A2 (en) | 2006-10-20 | 2008-05-02 | Applera Corporation | Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis, methods of detection and uses thereof |
| KR101398220B1 (ko) * | 2006-10-30 | 2014-05-22 | 건국대학교 산학협력단 | 형질전환 배아 생성방법 |
| WO2008085891A1 (en) * | 2007-01-05 | 2008-07-17 | Worcester Polytechnic Institute | Oocyte spindle-associated factors improve somatic cell cloning |
| WO2008124133A1 (en) | 2007-04-07 | 2008-10-16 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Reprogramming of somatic cells |
| WO2008134522A1 (en) * | 2007-04-26 | 2008-11-06 | President And Fellows Of Harvard College | Deriving embryonic stem cells |
| US7972849B2 (en) * | 2007-05-17 | 2011-07-05 | Oregon Health & Science University | Primate pluripotent stem cells produced by somatic cell nuclear transfer |
| US20090111764A1 (en) * | 2007-10-25 | 2009-04-30 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Mitochondrial selection |
| EP2214708A4 (en) | 2007-10-26 | 2011-01-12 | Centocor Ortho Biotech Inc | VECTORS, HOST CELLS, METHODS OF PRODUCTION AND USES |
| US8039212B2 (en) | 2007-11-05 | 2011-10-18 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with liver fibrosis, methods of detection and uses thereof |
| US20090221620A1 (en) | 2008-02-20 | 2009-09-03 | Celera Corporation | Gentic polymorphisms associated with stroke, methods of detection and uses thereof |
| KR100915397B1 (ko) * | 2008-02-22 | 2009-09-03 | 삼성전자주식회사 | 커버부재, 현상 카트리지 및 화상형성장치의 현상유닛 |
| JP5670755B2 (ja) | 2008-03-12 | 2015-02-18 | ザ ロックフェラー ユニバーシティ | 翻訳プロファイリング及び分子表現型解析のための方法及び組成物 |
| US8288094B2 (en) | 2008-04-09 | 2012-10-16 | Institut Pasteur | APOBEC3 mediated DNA editing |
| EP2300611B1 (en) | 2008-06-13 | 2017-08-09 | Whitehead Institute for Biomedical Research | Programming and reprogramming of cells |
| EP2878680B1 (en) | 2008-07-09 | 2016-06-08 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof |
| US9181315B2 (en) | 2009-01-08 | 2015-11-10 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for induced brown fat differentiation |
| EP2421980A2 (en) | 2009-04-23 | 2012-02-29 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for cancer |
| EP2421958A4 (en) | 2009-04-24 | 2013-09-04 | Univ Oregon Health & Science | PROCEDURE FOR MITOCHONDRIAL DNA REPLACEMENT IN OOCYTES |
| EP2267153A1 (en) | 2009-05-26 | 2010-12-29 | Université Claude Bernard Lyon 1 | Identification of netrin-1 receptor unc5c gene mutation in solid cancers |
| WO2011002988A1 (en) | 2009-07-01 | 2011-01-06 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for severe combined immunodeficiency (scid) |
| WO2011011678A2 (en) | 2009-07-24 | 2011-01-27 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for cytokine-cytokine signaling pathways |
| EP2460016A2 (en) | 2009-07-30 | 2012-06-06 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for pharmacokinetics |
| US20110035816A1 (en) | 2009-08-05 | 2011-02-10 | Ostertag Eric M | Genetically Modified Rat Models for Drug Metabolism |
| WO2011022634A2 (en) | 2009-08-20 | 2011-02-24 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for pain |
| US9420770B2 (en) | 2009-12-01 | 2016-08-23 | Indiana University Research & Technology Corporation | Methods of modulating thrombocytopenia and modified transgenic pigs |
| AU2011207210A1 (en) | 2010-01-22 | 2012-08-16 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions,kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of metabolic disorders |
| TWI518325B (zh) | 2010-02-04 | 2016-01-21 | 自治醫科大學 | 對ａｌｋ抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療 |
| US10745467B2 (en) | 2010-03-26 | 2020-08-18 | The Trustees Of Dartmouth College | VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders |
| CN107098958B (zh) | 2010-03-26 | 2021-11-05 | 达特茅斯大学理事会 | Vista调节性t细胞介体蛋白、vista结合剂及其用途 |
| US20150231215A1 (en) | 2012-06-22 | 2015-08-20 | Randolph J. Noelle | VISTA Antagonist and Methods of Use |
| US8383793B2 (en) | 2010-04-15 | 2013-02-26 | St. Jude Children's Research Hospital | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cancer resistant to anaplastic lymphoma kinase (ALK) kinase inhibitors |
| US20110269735A1 (en) | 2010-04-19 | 2011-11-03 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with statin response and cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof |
| NZ610887A (en) | 2010-10-22 | 2015-07-31 | Agri Neo Inc | Synergistic activity of peracetic acid and at least one sar inducer for the control of pathogens in and onto growing plants |
| US20120108651A1 (en) | 2010-11-02 | 2012-05-03 | Leiden University Medical Center (LUMC) Acting on Behalf of Academic Hospital Leiden (AZL) | Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis and statin response, methods of detection and uses thereof |
| KR101352641B1 (ko) | 2010-11-08 | 2014-01-17 | 광주과학기술원 | 골격근-유래된 다능성 세포의 화학적 제조방법 및 이의 용도 |
| ES2680636T3 (es) | 2011-02-14 | 2018-09-10 | Revivicor Inc. | Cerdos genéticamente modificados para xenotrasplante de xenoinjertos vascularizados y derivados de los mismos |
| WO2012129198A1 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for obesity and diabetes |
| KR102627319B1 (ko) | 2011-05-16 | 2024-01-23 | 더 큐레이터스 오브 더 유니버시티 오브 미주리 | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 내성 동물 |
| US10093705B2 (en) | 2011-09-13 | 2018-10-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for brown fat induction and activity using FNDC5 |
| US9550830B2 (en) | 2012-02-15 | 2017-01-24 | Novo Nordisk A/S | Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1) |
| LT2814844T (lt) | 2012-02-15 | 2017-10-25 | Novo Nordisk A/S | Antikūnai, kurie jungiasi ir blokuoja ekspresuotą ant mieloidinių ląstelių inicijuojantį receptorių 1 (trem-1) |
| RS57827B1 (sr) | 2012-02-15 | 2018-12-31 | Novo Nordisk As | Antitela koja vezuju protein 1 prepoznavanja peptidoglikana |
| US9890215B2 (en) | 2012-06-22 | 2018-02-13 | King's College London | Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer |
| EP2864352B1 (en) | 2012-06-22 | 2018-08-08 | The Trustees Of Dartmouth College | Novel vista-ig constructs and the use of vista-ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders |
| CA2884704C (en) | 2012-09-07 | 2023-04-04 | Randolph J. Noelle | Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer |
| MX369173B (es) | 2013-12-24 | 2019-10-30 | Janssen Pharmaceutica Nv | Anticuerpos y fragmentos anti-vista. |
| US11014987B2 (en) | 2013-12-24 | 2021-05-25 | Janssen Pharmaceutics Nv | Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same |
| EP3094736A4 (en) | 2014-01-14 | 2017-10-25 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of melanoma using pd-l1 isoforms |
| CN107073109B (zh) | 2014-06-11 | 2021-08-06 | 凯西·A·格林 | Vista激动剂和拮抗剂抑制或增强体液免疫的用途 |
| MX2017000484A (es) | 2014-07-17 | 2017-05-01 | Novo Nordisk As | Mutagenesis dirigida al sitio anticuerpos receptor desencadenante expresado en las celulas mieloides de tipo 1 (trem-1) para reducir la viscosidad. |
| US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
| WO2016090347A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Immunext, Inc. | Identification of vsig8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/vsig8 modulators |
| US9913461B2 (en) | 2014-12-09 | 2018-03-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mouse whose genome comprises a humanized CD274 gene |
| CA2975631C (en) | 2015-02-19 | 2024-02-20 | Agri-Neo Inc. | Composition of peracetic acid and at least one organic fungicide for the control of pathogens in and onto growing plants |
| BR112017027870A2 (pt) | 2015-06-24 | 2018-08-28 | Janssen Pharmaceutica Nv | anticorpos e fragmentos anti-vista |
| CN109475107A (zh) | 2015-08-06 | 2019-03-15 | 密苏里大学管理者 | 具有修饰的cd163基因的抗病原体动物 |
| AU2016343978A1 (en) | 2015-10-29 | 2018-05-17 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for identification, assessment, prevention, and treatment of metabolic disorders using PM20D1 and N-lipidated amino acids |
| BR112018016461A2 (pt) | 2016-02-12 | 2019-10-01 | Janssen Pharmaceutica Nv | anticorpos e fragmentos anti-vista, usos dos mesmos e métodos de identificação dos mesmos |
| MX2018012469A (es) | 2016-04-15 | 2019-07-04 | Immunext Inc | Anticuerpos vista antihumanos y uso de los mismos. |
| EA202092302A1 (ru) | 2018-04-02 | 2021-02-02 | Бристол-Майерс Сквибб Компани | Антитела к trem-1 и их применения |
| US11160260B2 (en) | 2018-04-17 | 2021-11-02 | The Curators Of The University Of Missouri | Methods for protecting porcine fetuses from infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| JP2023551404A (ja) | 2020-11-20 | 2023-12-08 | レビビコア， インコーポレイテッド | 異種間移植のための成長ホルモン受容体ノックアウトを有する多重トランスジェニックブタ |
| US20230255185A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-08-17 | Revivicor, Inc. | Multitransgenic pigs comprising ten genetic modifications for xenotransplantation |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1030255A (zh) * | 1987-04-14 | 1989-01-11 | 路明尼斯有限公司 | 转移基因的动物 |
| US5057420A (en) | 1987-06-05 | 1991-10-15 | Granada Biosciences, Inc. | Bovine nuclear transplantation |
| CA2059199A1 (en) | 1992-01-10 | 1993-07-11 | Steen Willadsen | Method for producing mature reconstituted mammalian eggs by nuclear transplantation |
| GB2265909B (en) | 1992-04-01 | 1996-03-20 | Inst Of Animal Physiology And | Fusion of donor nucleus with recipient cytoplast in the absence of calcium ion |
| WO1994006422A1 (en) * | 1992-09-22 | 1994-03-31 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Use of taxol for treating lymphomas and breast cancer |
| CA2092258A1 (en) | 1992-12-30 | 1994-07-01 | Steven L. Stice | Synchronized donor cells for bovine nuclear transfer |
| US5480772A (en) | 1993-02-03 | 1996-01-02 | Brandeis University | In vitro activation of a nucleus |
| US5496720A (en) | 1993-02-10 | 1996-03-05 | Susko-Parrish; Joan L. | Parthenogenic oocyte activation |
| US5523226A (en) | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
| US5333948A (en) | 1993-06-22 | 1994-08-02 | Tekonsha Engineering Company | Multiple-gain electronic brake actuator with trigger point inertial sensor |
| EP0711158B2 (en) * | 1993-07-29 | 2008-07-23 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Method of treating atherosclerosis or restenosis using microtubule stabilizing agent |
| WO1995017500A1 (en) | 1993-12-23 | 1995-06-29 | Abs Global, Inc. | Embryonic stem cells as nuclear donors and nuclear transfer techniques to produce chimeric and transgenic animals |
| GB9417831D0 (en) * | 1994-09-05 | 1994-10-26 | Biotech & Biolog Scien Res | Biological manipulation |
| GB9517779D0 (en) * | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| US7332648B2 (en) * | 1995-08-31 | 2008-02-19 | Roslin Institute | Unactivated oocytes in nuclear transfer to produce cultured inner cell mass cells and ungulates |
| GB9517780D0 (en) * | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| US5945577A (en) | 1997-01-10 | 1999-08-31 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
| US6235969B1 (en) | 1997-01-10 | 2001-05-22 | University Of Massachusetts | Cloning pigs using donor nuclei from non-quiescent differentiated cells |
| US6215041B1 (en) | 1997-01-10 | 2001-04-10 | University Of Mmassachusetts | Cloning using donor nuclei from a non-quiesecent somatic cells |
| US7291764B1 (en) * | 1997-01-10 | 2007-11-06 | University of Massachusetts, a Public Institution of Higher Education of the Commonwealth of Massachusetts, as Represented by its Amherst Campus, Office of Vice Chancellor for Research at Amherst | Cloning pigs using non-quiescent differentiated donor cells or nuclei |
| US7361804B1 (en) * | 1997-02-19 | 2008-04-22 | Roslin Institute (Edinburgh) | Unactivated oocytes in nuclear transfer to produce ungulates |
| US6011197A (en) | 1997-03-06 | 2000-01-04 | Infigen, Inc. | Method of cloning bovines using reprogrammed non-embryonic bovine cells |
| EP0972017B1 (de) | 1998-01-16 | 2004-10-06 | Agrobiogen GmbH | Effizienter kerntransfer mit fetalen fibroblasten |
| JP3573964B2 (ja) * | 1998-06-17 | 2004-10-06 | 三洋電機株式会社 | アルカリ電池用水素吸蔵合金電極及びアルカリ蓄電池用水素吸蔵合金電極の製造方法 |
| AU6218899A (en) * | 1998-10-12 | 2000-05-01 | Geron Bio-Med Limited | Porcine oocytes with improved developmental competence |
| US6700037B2 (en) * | 1998-11-24 | 2004-03-02 | Infigen, Inc. | Method of cloning porcine animals |
| US20050156424A1 (en) * | 2000-02-29 | 2005-07-21 | Thyssenkrupp Presta Ag | Steering column and manufacturing method thereof |
| US8302202B2 (en) * | 2005-08-03 | 2012-10-30 | International Business Machines Corporation | Transportable computing environment apparatus system and method |
-
1995
- 1995-08-31 GB GBGB9517779.6A patent/GB9517779D0/en active Pending
-
1996
- 1996-08-30 WO PCT/GB1996/002098 patent/WO1997007668A1/en active IP Right Grant
- 1996-08-30 CN CNB961978929A patent/CN1250715C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 BR BR9610013-3A patent/BR9610013A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-08-30 DE DE69637591T patent/DE69637591D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 SG SG1999000941A patent/SG75919A1/en unknown
- 1996-08-30 HU HU9802485A patent/HUP9802485A3/hu unknown
- 1996-08-30 NZ NZ316148A patent/NZ316148A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 CN CNA2005101270278A patent/CN1772891A/zh active Pending
- 1996-08-30 JP JP9509995A patent/JP2000506721A/ja active Pending
- 1996-08-30 KR KR1020057014691A patent/KR100743006B1/ko active IP Right Grant
- 1996-08-30 CA CA002229657A patent/CA2229657A1/en not_active Abandoned
- 1996-08-30 CZ CZ98604A patent/CZ60498A3/cs unknown
- 1996-08-30 ES ES96928586T patent/ES2309989T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 NZ NZ335407A patent/NZ335407A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 AT AT96928586T patent/ATE400176T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 KR KR1019980701382A patent/KR100533477B1/ko active IP Right Grant
- 1996-08-30 CN CN2006100037660A patent/CN1813642B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 KR KR1020077007531A patent/KR20070041793A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-08-30 IL IL12341796A patent/IL123417A0/xx unknown
- 1996-08-30 ZA ZA9607383A patent/ZA967383B/xx unknown
- 1996-08-30 DK DK96928586T patent/DK0847237T3/da active
- 1996-08-30 PL PL96325336A patent/PL325336A1/xx unknown
- 1996-08-30 EP EP96928586A patent/EP0847237B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 KR KR1020067006296A patent/KR20060057638A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-08-30 AU AU68309/96A patent/AU728809B2/en not_active Expired
-
1997
- 1997-02-19 US US08/803,165 patent/US6252133B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-02-27 NO NO980846A patent/NO980846L/no unknown
- 1998-05-13 HK HK98104135A patent/HK1004937A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-08-29 US US09/650,285 patent/US6525243B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-10-11 US US09/973,701 patent/US20030037352A1/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-07-09 US US10/190,617 patent/US7326824B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-09-05 US US10/234,854 patent/US7321075B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-08-03 US US10/909,845 patent/US7329796B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-08-10 US US10/914,161 patent/US7321076B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-03-02 US US11/068,903 patent/US7432415B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-03 US US11/265,114 patent/US7524677B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-30 JP JP2005345998A patent/JP2006340710A/ja active Pending
-
2006
- 2006-10-06 US US11/543,881 patent/US7326825B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-10-06 US US11/544,038 patent/US20070028312A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-04-22 JP JP2008111492A patent/JP2008194053A/ja active Pending
-
2009
- 2009-12-24 US US12/647,316 patent/US20100146654A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ60498A3 (cs) | Neaktivované oocyty jako cytoplastové recipienty pro přenos jádra | |
| CZ60898A3 (cs) | Populace buněk v klidovém stavu pro přenos jádra | |
| US7304204B2 (en) | Ungulates produced by nuclear transfer of G1 cells | |
| US7361804B1 (en) | Unactivated oocytes in nuclear transfer to produce ungulates | |
| AU2005202805B2 (en) | Unactivated oocytes as cytoplast recipients for nuclear transfer | |
| AU2005202808B2 (en) | Unactivated oocytes as cytoplast recipients for nuclear transfer | |
| MXPA98001645A (en) | Oocytes inactivated as receptors of cytopllasto for nuclear transfer | |
| NZ504101A (en) | A method of preparing a non-human mammal comprising reconstituting a non-human mammalian embryo | |
| GB2340493A (en) | Unactivated oocytes as cytoplast recipients for nuclear transfer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |