KR20050088162A - 핵이식용 세포질 수용체로서의 불활성화 난모 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제2 감수 분열의 중기에서 정지된 난모 세포내로 이배체 핵을 이식시키는 것을 포함하여 동물의 배를 재구성하는 방법에 관한 것이다. 상기 난모 세포는 이식시에 활성화되지 않아 공여체 핵은 일정 시간 동안 수용체 세포질에 노출된 상태로 유지된다. 상기 이배체 핵은 이식시 세포 주기의 G0 또는 G1기의 세포에 의해 공여될 수 있다. 이어서, 상기 재구성된 배를 활성화한다. 활성화 중에 정확한 배수성은 예를 들어, 노코다졸과 같은 미소관 억제제의 존재하에서 재구성된 배를 항온 처리함으로써 유지된다. 그 후, 상기 재구성된 배는 한 마리 이상의 동물을 출산할 수 있다. 본 발명은 유전적 이점이 큰 형질전환 동물뿐만 아니라, 비형질전환 동물을 제조하는 데 이용할 수 있다.

Description

핵이식용 세포질 수용체로서의 불활성화 난모 세포 {UNACTIVATED OOCYTES AS CYTOPLAST RECIPIENTS FOR NUCLEAR TRANSFER}
본 발명은 유전학적으로 선별된 동물 및/또는 변형된 동물(이것에만 제한되는 것은 아님)을 포함하는 동물의 생산 및 이러한 동물 생산에 유용한 세포에 관한 것이다.
공여체(donor)의 핵을 핵출된 난모 세포(enucleated oocyte)나 하나의 세포 수정란에 이식시켜 포유류의 배(胚)를 재구성하는 방법은 유전학적으로 동일한 개체의 생성을 가능하게 해준다. 이 방법은 연구 목적(즉, 생물학적 조절용) 및 산업적 적용(즉, 유전학적으로 유용한 가축의 증식, 육류 제품의 균일성, 동물 관리)에도 명백한 잇점이 있다.
핵 이식에 의한 배의 재구성은 핵의 등가성 또는 '발생 중에 핵은 변화하는가?'라는 물음에 답하기 위해 문헌[참조: Spemann, Embryonic Development and Induction 210-211 Hofner Publishing Co., New York (1938)]에 최초로 제안되었다. 이들 실험은, 점진적으로 진행되는 배 단계로부터의 핵을 이식함으로써, 핵이 그들의 발생 가능성에서 제한되는 시점을 결정하기 위해 고안되었다. 그러나, 기술적인 한계와 스피만(Spemann)의 불행한 죽음으로 인해, 이들 연구는 특정의 핵은 성적으로 성숙한 성체(成體)까지의 발생을 유도할 수 있다고 개구리에서 입증된[참조: Briggs 및 King, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 38 455-461 (1952)] 1952년까지 완료되지 못하였다. 그들의 발견은, 핵이 제거된 난(卵)에 이식시, 단일 개체로부터의 동등한 전능성(全能性) 핵이 "유전학적으로 동일한" 개체를 발생시킨다는 현재의 개념을 이끌어내었다. 각 개체에서 미지의 세포질 기여가 달라질 수 있고, 또한 임의의 염색체 재배열의 부재가 입증되어야만 하기 때문에, 진정한 의미에서 이들 개체는 클론(clones)은 아니다.
양서류에 있어서 배의 클로닝에 대한 입증이 있는 이래, 유사한 기법이 포유류종에 적용되어 왔다. 이들 기법은 2 가지 범주, 즉 (1) 염색체 DNA가 제거된 성숙한 중기 II의 난모 세포에 대한 공여체 핵의 이식과, (2) 전핵(pronucleus)이 둘 다 제거된 수정된 하나의 세포 접합자에 대한 공여체 핵의 이식에 속한다. 유제(有蹄) 동물에 있어서는 전자의 기법이 선택 방법으로 되어 있는데, 그 이유는 전핵이 교환되는 경우 이외에 후자의 기법을 이용하는 발생은 보고된 바 없기 때문이다.
난모 세포질체 내에 공여체 핵을 이식하는 것은 일반적으로 세포 융합을 유도함으로써 달성된다. 유제 동물에 있어서, 융합은 커플리트(couplet)의 접촉/융합면을 가로질러 직류(DC) 전기 펄스를 인가하므로써 유도된다. 또한, 세포 융합을 유도하는 동일한 펄스는 수용체 난모 세포를 활성화시킨다. 배의 재구성 후 추가의 발생은, 발생을 유도하는 핵의 능력, 즉 전능성(totipotency) 수용체 세포질의 발생 능력(즉, 난모 세포 성숙), 난모 세포 활성화, 배의 배양을 비롯한 다수의 요인에 좌우된다[참조: Campbell and Wilmut in Vth World Congress on Genetics as Applied to Livestock 20 180-187 (1994)].
상기 요인들 이외에 본 발명자들은 재구성된 배의 최초 세포 주기 중에 정확한 배수성(倍數性;ploidy)의 유지가 매우 중요하다는 사실을 확인하였다[참조: Campbell 등, Biol. Reprod. 49 933-942 (1993); Campbell 등, Biol. Reprod. 50 1385-1393 (1994)]. 단세포 주기 중에 모든 게놈 DNA는 1회, 유사 분열 이전에 단지 1회 복제되어야만 한다. 상기 DNA 중 어떤 것이 복제되지 않거나 1회 이상 복제되는 경우에는 유사 분열시에 그 핵의 배수성은 정확하지 않을 것이다. 그러나, 각 세포 주기 중에 상기 복제가 1회로 제한되는 메카니즘은 명백하지 않으며, 손상되지 않은 핵막의 유지가 상기 조절에 결정적이라는 몇 가지 증거가 있을 뿐이다. 핵이 제거된 중기 II의 난모 세포에 이식 후에 공여체 핵 내에서 발생하는 형태학적 현상은 마우스[참조: Czolowiska 등, J. Cell Sci. 69 19-34 (1984)], 토끼[참조: Collas 및 Robl, Biol. Reprod. 45 455-465 (1991)], 돼지[참조: Prather 등, J. Exp. Zool. 225 355-358 (1990)], 소[참조: Kanka 등, Mol. Reprod. Dev. 29 110-116 (1991)]를 비롯한 다수의 동물종에서 연구되어 왔다. 융합 직후, 공여체 핵 엔벨로프가 소실되고(nuclear envelope breaks down: NEBD), 염색체는 조기 응축한다(chromosomes prematurely condense: PCC). 이들 효과는 성숙/유사 분열/감수 분열 촉진 인자(maturation/mitosis/meiosis promoting factor: MPF)라 부르는 세포질 활성에 의해 촉진된다. 이 활성은 모든 유사 분열 및 감수 분열 세포에서 확인되며, 중기에서 최대 활성에 도달한다. 성숙한 포유류 난모 세포는 제2 감수 분열의 중기(중기 II)에서 정지되며, 높은 MPF 활성을 보유한다. 수정 또는 활성화시 MPF 활성은 감소하며, 제2 감수 분열은 완료되고, 제2 극체는 퇴화되며, 이어서 염색사는 응축이 풀어지고, 전핵 형성이 일어난다. MPF 수준이 높을 경우 재구성된 핵 이식배에서는 NEBD 및 PCC가 일어나는데, 이 현상에는 MPF 활성이 감소하는 경우, 염색사의 응축이 풀어지고, 핵이 재형성되며, 후속되는 DNA의 복제가 뒤따른다. 재구성된 배에 있어서, 정확한 배수성은 두 가지 방법 중 한 가지 방법, 즉 첫째로 소정의 세포 주기 단계에 있는 핵, 예를 들어 G1 세포의 이배체(diploid) 핵을 활성화 시기의 중기 II 난모 세포에 이식하거나, 또는 둘째로 수용체 난모 세포를 활성화시키고, MPF 활성이 사라진 후 공여체 핵을 이식하는 방법에 의해 유지할 수 있다. 양(sheep)에 있어서, 후자의 방법이 핵 공여체로서 16 세포기의 배로부터 얻은 할구를 이용하는 경우, 21% 내지 55%의 재구성된 배의 포배기까지의 발생 빈도의 증가를 가져온 바 있다[참조: Campbell 등, Biol. Reprod. 50 1385-1393 (1994)].
재구성된 배의 발생 빈도에 대한 이들 개선은 아직도 핵의 재프로그래밍(nuclear reprogramming)에 대한 의문을 설명하지 못하였다. 발생 중, 특정의 유전자들은 "각인(刻印)"된다. 즉, 이 특정의 유전자들은 변경되어 더 이상 전사되지 않는다. 각인에 대한 연구 결과, 이 "각인"은 생식 세포 형성(즉, 재프로그래밍) 중에 제거된다는 것이 확인되었다. 한 가지 가능성은 상기 재프로그래밍이 감수 분열을 수행 중인 세포 내에 존재하는 세포질 인자에 대한 염색사의 노출에 의해 영향받는다는 것이다. 이는 본 발명자들이 공여체 핵의 발생 시계를 재프로그래밍하기 위해 핵이식에 의한 배의 재구성 중에 어떤 방법으로 이러한 상황을 모방할 수 있을까라는 문제를 제기한다.
이제, 본 발명자들은 중기 II에서 정지한 난모 세포 내에 핵이식이 생존가능한 배를 형성할 수 있다는 것을 밝혀내기에 이르렀는데, 이는 정상적인 배수성(즉, 이배체)이 유지되고, 상기 배가 핵이식시에 활성화되지 않는다는 것을 전제로 한다. 활성화의 지연으로 인해 핵은 수용체 세포질에 노출되게 된다.
본 발명의 제1의 특징에 따르면, 동물배(動物胚)를 재구성하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 제2 감수 분열의 중기에서 정지한 난모 세포의 활성화를 수반하는 일이 없이, 상기 난모 세포에 이배체 핵을 이식시키는 단계와, 상기 재구성된 배가 후대를 산출할 수 있게 되기에 충분한 시간 동안 상기 수용체의 세포질에 상기 핵을 계속 노출시키는 단계와, 이어서 정확한 배수성을 유지하면서 상기 재구성된 배를 활성화시키는 단계를 포함한다. 이 단계에서, 상기 재구성된 배는 단세포이다.
원칙적으로, 본 발명은 가금류와 같은 조류, 양서류 및 어류를 포함하는 모든 동물에 적용할 수 있다. 그러나, 실제로는 산업적인 이용성이 현재로서 가장 클 것으로 예상되는 인간을 제외한 동물, 특히 인간을 제외한 포유 동물, 구체적으로는 태반을 형성하는 동물에 적용할 수 있을 것이다. 또한, 동물의 클로닝 수단 및 형질전환 동물(transgenic animal)의 생산 수단으로서 본 발명이 가장 유용할 것으로 생각되는 것은 유제 동물, 예컨대 소, 양, 염소, 물소, 낙타 및 돼지와 같이 특히 경제적으로 중요한 유제 동물의 경우이다. 또한, 유념해야 할 점은 본 발명이 경제적으로 중요한 다른 동물종, 예를 들어 말, 라마 또는 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스, 또는 토끼에도 적용할 수 있을 것이라는 점이다.
본 발명은 형질전환 동물 뿐만 아니라 비형질전환 동물의 생성에 동등하게 적용할 수 있다. 형질전환 동물은 유전학적으로 변화된 공여체 세포로부터 생산할 수 있다. 전체적인 과정은 형질전환(즉, 유전학적으로 변화된) 동물의 생산을 위한 통상적인 방법에 비하여 하기한 바와 같이 개략적으로 설명할 수 있는 다수의 이점이 있다.
(1) 더 적은 수의 수용체를 요구한다는 점.
(2) 클론성 공여체 세포를 이용하여 다수의 공통 유전자형 파운더(syngeneic founder)를 생성할 수 있다는 점.
(3) 유전자 표적화에 의한 미세한 유전자 변화가 허용된다는 점.
(4) 본 발명에 의해 생성된 배로부터 생산된 모든 동물은 각 동물이 단일핵으로부터 유도되기 때문에 배선(胚線)을 통해 관련된 유전자 변화를 전달하지만, 반대로 포배 주입에 의해 변화된 줄기세포군의 주입 후 전핵 주입 또는 키메라 현상(chimerism)에 의한 형질전환 동물의 생산은 모든 세포가 상기 변화를 포함하지 않고, 그 결과 생산된 동물은 상기 배선을 통해 상기 변화를 전달할 수 없다는 일정 비율의 모자이크 동물을 생산한다는 점.
(5) 동물의 생산 전에 유전자 변화[예를 들어, 통합(integration)]의 부위에 대해 세포를 선택할 수 있다는 점
동물과 관련하여 본 명세서에서 사용한 용어 "형질전환(transgenic)"이라는 용어는 다수의 형질전환 동물이 이종(異種)의 유전자(들)를 함유하게 되지만, 동물의 배선 내에 그러한 유전자를 1개 이상 함유하는 동물을 나타내는 것으로 한정하여 이해하여서는 아니된다. 오히려, 상기 용어는 배선이 재조합 DNA 기법에 의한 기술적 개입의 대상이 되어 왔던 모든 동물을 광범위하게 이르는 것이다. 예를 들어, 배선 내의 내인성 유전자가 결실, 중복, 활성화 또는 변화된 동물은 배선 내에 외인성 DNA 서열이 첨가된 동물 만큼 본 발명의 목적에 유용한 형질전환 동물이다.
동물이 형질전환된 동물인 본 발명의 구체예에서 공여체 핵은 유전자 변화되어 있다. 상기 공여체 핵은 1개 이상의 형질전환 유전자(transgene)를 함유할 수 있으며, 핵이식 및 배의 재구성 전에 유전자 변화가 일어날 수 있다. 수정란의 웅성또는 자성 전핵(前核) 내로의 주입과 유사한 미세주입법이 유전자 변화의 한 가지 방법으로 사용될 수 있지만, 본 발명은 그러한 방법에만 제한되지 않는다. 또한, 대량 형질전환법 또는 형질 감염법, 예를 들어 일렉트로포레이션(electroporation), 비루스 형질 감염법 또는 리포펙션법(lipofection)을 이용할 수도 있다.
전술한 본 발명의 방법에 있어서, 이배체 핵은 공여체로부터 핵을 제거한 수용체 난모 세포내에 이식된다. 재구성된 배의 정확한 배수성을 유지하기 위해서는 이식시에 이배체인 공여체가 필요하며, 따라서 공여체는 G1기 또는 바람직하게는 본 발명자들의 동시 계류 중인 PCT/GB96/02099(GB 9517780.4의 우선권 주장 출원)의 주제와 같이 세포 주기의 G0기일 수도 있다.
유사 분열 세포 주기에는 뚜렷한 4 단계, 즉 G, S, G2 및 M이 있다. 개시기(start)라고 부르는 세포 주기의 초기 상태는 G1 단계에서 일어나고, 독특한 기능이 있다. 다른 세포 주기를 나타내게 하는 선택이나 결정 또는 유도는 개시기에 이루어진다. 세포는 일단 개시기를 지나 진행하면, 전(前)DNA 합성 단계인 G1 단계의 후반 단계까지 진행된다. 제2 단계인 S 단계는 DNA 합성이 일어나는 시기이다. 이 시기 다음에는 DNA 합성과 유사 분열기 사이의 시기인 G2 단계가 온다. 유사 분열 자체는 M 단계에서 일어나는 시기이다. 휴지기 세포(quiescent cell)(특정한 완전 분화된 세포와 같이 천연적으로 휴지기인 세포 뿐만 아니라 휴지 상태가 유도된 세포를 포함한다)는 일반적으로 상기 세포 주기의 4 단계 중 어느 한 단계에 있는 것이 아닌 것으로 간주된다. 따라서, 이들이 세포 주기를 통해 정상적으로 진행되지 않는다는 것을 나타내기 위해 보통 G0 상태에 있는 것으로 표기한다. G1 세포의 핵과 같이 휴지 상태에 있는 G0 세포의 핵은 이배체 DNA 함량을 갖는데, 이러한 이배체 핵의 양자 모두 본 발명에 사용할 수 있다.
상기 내용에 따라, 핵 공여체로 사용할 수 있는 세포에 대한 특별한 제한은 없는 것으로 생각된다. 즉, 시험관 내에서 배양되거나 생체 외에서 추출된 세포를 사용할 수 있는 것과 같이 완전히 분화된 세포 또는 부분적으로 분화된 세포 또는 미분화된 세포를 사용할 수 있다. 공여체 세포는 정상적인 DNA 함량을 가져야 하며, 핵형이 정상이어야 한다는 제한만 있을 뿐이다. 양호한 세포원은 본 발명자들의 동시 계류 중인 PCT 특허 출원 PCT/GB95/02095(WO 96/07732)에 기재되어 있다. 이러한 모든 정상적인 세포는 성체 동물 생성에 필요한 모든 유전 정보를 함유하고 있는 것으로 생각된다. 본 발명은 염색사 구조를 변경하여 상기 유전 정보를 발생 중인 배에 제공함으로써 그 유전 물질이 발생을 재유도하도록 할 수 있다.
본 발명에 유용한 수용체 세포는 제2 감수 분열의 중기에서 정지되어 있는, 핵이 제거된 난모 세포이다. 대부분의 척추 동물에 있어서, 난모 세포의 성숙은 생체내에서 난(卵) 성숙 과정의 상기한 아주 늦은 단계까지 진행하고, 이어서 정지된다. 배란시, 정지된 난모 세포는 난소로부터 방출된다(수정이 일어나는 경우, 난모 세포는 자연적으로 자극되어 감수 분열을 완료한다). 본 발명을 실시함에 있어서, 난모 세포는 시험관내 또는 생체내에서 성숙될 수 있으며, 각각 제1 극체의 출현시 또는 배란 후 가능한 한 신속하게 수집된다.
수용체는 핵이 제거되는 것이 좋다. 핵이식 과정에서 수용체 난모 세포의 핵 제거는 필수적인 것으로 통념화되어 왔지만, 이러한 판단에 대한 실험적인 확인이 발표된 바 없다. 유제 동물에 대해 설명된 최초의 방법은 세포를 1/2씩으로 나누는 과정을 포함하고 있었는데, 이들 중 하나는 핵이 제거되었을 가능성이 있다[참조: Willadsen Nature 320 (6) 63-65 (1986)]. 이 과정은 다른 미지의 1/2이 여전히 중기 기구(metaphase apparatus)를 가지며, 세포질 부피의 감소로 새로운 배의 분화 패턴을 가속화시킬 수 있다는 단점이 있다[참조: Eviskov 등, Development 109 322-328 (1990)].
더 최근에 이르러, 염색체를 최소의 세포질과 함께 제거하기 위한 시도에 상이한 방법들이 이용되어 왔다. 제1 극체 및 이웃 세포질의 흡출은 양의 난모 세포의 67%에서 중기 II 기구를 제거하는 것으로 확인되었다[참조: Smith & Wilmut Biol. Reprod. 40 1027-1035 (1989)]. 단지 DNA 특이성 플루오로크롬(Hoechst 33342)을 사용하는 방법이 제공되었는데, 이는 세포질 부피의 감소를 최소화하면서 핵의 제거(핵출)를 보장하는 방법이다[참조: Tsunoda 등, J. Reprod. Fertil. 82 173 (1988)]. 가축종에 있어서, 상기 방법은 아마도 현재 통상 사용되고 있는 방법이다[참조: Prather & First J. Reprod. Fertil. Suppl. 41 125 (1990), Westhusin 등, Biol. Reprod. (Suppl.) 42 176 (1990)].
포유류에 있어서 핵출을 위한 비침입성 기법에 대한 보고는 거의 없지만, 양서류에 있어서는 자외선 조사법이 통상 기법으로 사용되고 있다[참조: Gurdon Q. J. Microsc. Soc. 101 299-311 (1960)]. 포유류에 있어서 상기 기법의 사용에 대한 상세한 보고는 없지만, DNA 특이성 플루오로크롬의 이용 중에도 마우스 난모 세포의 자외선에 대한 30초 이상의 노출은 상기 세포의 발생 가능성을 감소시켰다는 점을 유념해야 한다[참조: Tsunoda 등, J. Reprod. Fertil. 82 173 (1988)].
전술한 바와 같이, 핵출은 실제로 핵, 전핵 또는 중기판(수용체 세포에 따라 결정된다)을 제거하여 물리적으로 수행하거나, 또는 예컨대 자외선 조사 또는 다른 핵출화 영향에 의하여 기능적으로 수행할 수 있다.
핵출 후, 공여체 핵은 난모 세포 활성화를 유도하지 않는 조건하에서 공여체 세포로의 융합이나 또는 비활성화 조건하에서 주입에 의해 도입된다. 재구성된 배의 정확한 배수성을 유지하기 위해서, 공여체 핵은 융합시에 이배체(즉, 세포 주기의 G0 또는 G1 단계에서)이어야만 한다.
일단 적합한 공여체 세포 및 수용체 세포가 마련되면, 상기 공여체 세포의 핵을 수용체 세포에 이식시키는 것이 필요하다. 핵이식은 융합법에 의해 수행하는 것이 가장 편리하다. 융합시에 활성화는 일어나지 않아야 한다.
융합을 유도하기 위해 사용되어온 3 가지 확립된 방법은 다음과 같다.
(1) 융합 촉진 화합물, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜에 세포를 노출시키는 방법.
(2) 센다이 비루스(Sendai virus) 등과 같은 불활성화 비루스를 사용하는 방법.
(3) 전기 자극을 이용하는 방법.
폴리에틸렌 글리콜이나 기타 글리콜류와 같은 융합 촉진 화합물에 세포를 노출시키는 방법은 체세포 융합의 경우에는 일반적인 방법이나, 배의 경우에는 널리 사용되지 않는 방법이다. 폴리에틸렌 글리콜은 독성이 있으므로, 세포를 최소 시간 동안 노출시켜야 할 필요성이 있고, 또 신속하게 그 화합물을 제거해야 할 필요성이 투명대(zona pellucida)의 제거를 불가피하게 할 수도 있다[참조: Kanka 등, Mol. Reprod. Dev. 29 110-116 (1991)]. 마우스의 배를 사용한 실험에 있어서, 불활성화 센다이 비루스는 난할 단계의 배로부터 얻은 세포의 융합에 효율적인 수단을 제공하는데[참조: Graham Wistar Inst. Symp. Monogr. 9 19 (1969)], 활성화가 유도되지 않는 부가적인 실험상의 이점도 있다. 유제 동물에 있어서는, 일반적으로 단위 생식 활성화를 유도하는 데 사용된 것과 동일한 전기 자극에 의해 융합을 실시한다[참조: Willadsen Nature 320 (6) 63-65 (1986), Prather 등, Biol. Reprod. 37 859-866 (1987)]. 이들 종에 있어서, 센다이 비루스는 일정 부분 융합을 유도하지만, 통상적으로 적용하기에는 신뢰성이 충분하지 않다[참조: Willadsen Nature 320 (6) 63-65 (1986)].
세포-세포 융합은 핵이식의 양호한 방법이지만, 사용할 수 있는 유일한 방법은 아니다. 기타 적합한 기법으로는 미세주입법(microinjection)을 들 수 있다 [참조: Ritchie 및 Campbell, J. Reproduction and Fertility Abstract Series No. 15, p60].
본 발명의 바람직한 구체예에서, 난모 세포 카리오플라스트 커플리트(karyoplast couplet)의 융합은 0.3M 만니톨 용액 또는 0.27M 수크로즈 용액 내에서 전기 자극에 의한 활성화 부재하에서 수행되는데, 다는 방법으로는 상기 핵을 무칼슘 배지 내에서의 주입에 의해 도입시킬 수 있다. 융합/주입 시기의 난모 세포의 연령 및 융합/주입 배지로부터의 칼슘 이온의 부재는 수용체 난모 세포의 활성화를 예방한다.
실제로, 난모 세포가 중기 II에 도달한 후 가능한 한 신속하게 핵출 및 이식을 수행하는 것이 가장 좋다. 성숙(시험관내) 또는 호르몬 처리(생체내)의 개시 이후가 될 이 시간은 종에 따라 다를 것이다. 소나 양의 경우 핵이식은 24 시간 이내, 돼지의 경우 48 시간 이내, 마우스의 경우 12 시간 이내, 그리고 토끼의 경우 20 내지 24 시간 이내에 일어나야만 바람직하다. 핵이식이 후에 일어날 수도 있지만, 난모 세포가 성장함에 따라 핵이식이 일어나기는 점점 더 어려워진다. 높은 MPF 활성이 바람직하다.
이어서, 일반적으로 성숙 배지 내로 복귀되는, 융합된 재구성 배는 활성화되지 않고, 재구성된 배가 결과적으로 후대(바람직하게는 생식능이 있는 후대)를 생성할 수 있기에 충분한 시간 동안 공여체 핵이 수용체 세포질에 노출된다.
활성화 전의 최적 시간은 종마다 다르며, 실험에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 소의 경우, 6 내지 20 시간이 적합하다. 이 시간은 염색체 형성이 가능한 시간 미만은 아니어야 하며, 또 상기 커플리트가 자연 발생적으로 활성화하거나, 극단적인 경우 사멸할 정도로 긴 시간은 아니어야 한다.
상기 시간이 활성화를 위한 시간인 경우, 임의의 통상적인 방법 또는 기타 적합한 활성화 프로토콜을 이용할 수 있다. 최근의 실험에 따르면, 단위 생식 활성활에 대한 필요 조건은 예상했던 것 보다 훨씬 복잡한 것으로 밝혀졌다. 활성화는 전부 아니면 무의 현상(all-or-none phenomenon)이며, 전핵의 형성을 유도할 수 있는 다수의 처리들이 모두 전부 "활성화"를 유발하는 것으로 추정되어 왔다. 그러나, 토끼 난모 세포의 전기 펄스에의 반복 노출은, 일련의 적절한 펄스의 선택 및 Ca2+의 조절만이 이배체화 난모 세포의 발생을 임신 중기까지 촉진시킬 수 있다는 것을 나타내었다[참조: Ozil Development 109 117-127 (1990)]. 수정하는 동안에는 세포 내의 칼슘 농도의 반복되는 일시적인 증가가 나타나고[참조: Cutbertson & Cobbold Nature 316 541-542 (1985)], 전기 펄스는 칼슘 농도의 유사한 증가를 일으키는 것으로 생각된다. 칼슘 과도성의 패턴은 종마다 다르며, 전기 펄스의 최적 패턴도 유사한 방식으로 달라질 것이라는 증거가 있다. 토끼에 있어서 펄스간의 간격은 약 4분이고[참조: Ozil Development 109 117-127 (1990)], 마우스에 있어서는 10분 내지 20분인 반면에[참조: Cutbertson & Cobbold Nature 316 541-542 (1985)], 소에 대하여 예비 관찰한 결과에서는 그 간격이 약 20분 내지 30분이었다[참조: Robl 등, in Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation(Seidel ed.), Colorado State University, 24-27 (1992)]. 대부분의 발표된 실험에서는, 단일 전기 펄스에 의해 활성화가 유도되었지만, 수차례의 펄스에 노출시키면 재구성된 배의 발생 비율이 증가한다는 새로운 관출 결과가 제시되었다[참조: Collas & Robl Biol. Reprod. 43 877-884 (1990)]. 펄스의 수, 전기장의 강도 및 펄스 지속 시간과 배지의 칼슘 농도를 최적으로 하기 위하여 각 경우마다 통상적인 조절을 행할 수 있다.
본 발명을 실시함에 있어서, 활성화 중에 정확한 배수성이 유지되어야 한다. 복수개의 전핵의 생성을 방지하고, 이것에 의하여 정확한 배수성을 유지하려면, 미소관(微小管) 중합을 억제 또는 안정화시키는 것이 바람직하다. 이는 유효 농도(예를 들어, 약 5 ㎍/㎖)의 노코다졸과 같은 미소관 억제제를 가함으로써 달성할 수 있다. 콜케신 및 콜케미드는 다른 미소관 억제제이다. 또 다른 방법으로서, 예를 들어 탁솔과 같은 미소관 안정화제를 사용할 수 있다.
미소관(투불린)의 분자 성분은 중합된 상태와 중합되지 않은 상태 사이의 동적 평형 상태로 존재한다. 노코다졸과 같은 미소관 억제제는 미소관에 대한 투불린 분자의 첨가를 방해하고, 이에 의하여 상기 평형을 교란시켜 미소관 탈중합(depolymerisation) 및 스핀들(spindle)의 파괴를 초래한다. 활성화 전에 상기 미소관의 완전한 또는 거의 완전한 탈중합을 보장하기에 충분한 시간에 상기 미소관 억제제를 첨가하는 것이 좋다. 대부분의 경우, 20분 내지 30분이 충분할 것이다. 탁솔과 같은 미소관 안정화제는 스핀들의 분해를 방지하며, 따라서 복수개의 전핵의 생성을 역시 예방할 수 있다. 미소관 안정화제는 미소관 억제제를 사용할 때에 적용된 조건과 유사한 조건하에서 사용하는 것이 바람직하다.
상기 미소관 억제제 또는 안정화제는 활성화후 전핵 형성시까지 잔존하여야만 한다. 그 후, 제1 분열이 일어나기 전의 임의의 상황에서 상기 미소관 억제제 또는 안정화제는 제거되어야만 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 성숙 개시 이후 30 내지 42 시간(소 및 양, 즉 핵이식 후 6 내지 18 시간)에 재구성된 난모 세포는 노코다졸(5 ㎍/㎖)을 함유하는 배지 내에 넣고, 통상적인 방법으로 활성화시킨다. 노코다졸 내에서의 항온 처리는 활성화 자극 이후 4 내지 6 시간 동안 계속할 수 있다(종 및 난모 세포의 연령에 의존함).
본 발명의 제2의 특징에 따르면, 앞에서 설명한 방법으로 생성된 생존 가능한 재구성된 동물의 배가 제공된다.
본 발명의 제3의 특징에 따르면, 동물을 생산하는 방법이 제공되는데, 이 방법은
(a) 전술한 바와 같이 동물의 배를 재구성하는 단계;
(b) 동물을 상기 배로부터 출산만기까지 발생시키는 단계
(c) 필요에 따라, 이와 같이 형성된 동물로부터 번식시키는 단계를 포함한다.
상기 단계 (a)는 앞에서 상세히 설명하였다.
이러한 특징의 본 발명 방법의 제2 단계인 상기 단계 (b)는 동물을 그 배로부터 출산만기까지 발생시키는 단계이다. 이는 직접 또는 간접적으로 수행할 수 있다. 직접 발생시에는, 상기 단계 (a)로부터 재구성된 배가 발생이 일어나는 데 필요한 임의의 추가 조치가 없어도 간단히 발생된다. 그러나, 간접 발생시에는, 상기 배가 완전한 발생이 일어나기 전에 추가 조작될 수 있다. 예를 들어, 수율을 증가시키기 위해 상기 배를 난할하고, 상기 세포를 클론 단위로 증식시킬 수 있다.
또 다른 방법으로서 또는 부가적으로, 공여체의 클론 단위 증식에 의한 본 발명의 수단에 의해서 및/또는 그 사용이 일련의 (핵)이식 과정으로 이루어지는 경우, 생존 가능한 배의 수율 증가가 달성될 수 있다. 현재로서 포배 형성의 달성률에 있어서의 제약은 대부분의 배가 "재프로그램"되지 않는다는 사실에 기인할 수 있다(허용할 수 있는 수치가 재프로그램되기는 하지만). 경우가 그러하다면, 이 때 그 달성률은 다음과 같이 증가시킬 수 있다. 그 자체 발생하는 각각의 배는 32 내지 64 세포 단계에서 이와 같이 핵 공여체로 사용할 수 있으며, 다른 방법으로서는, 내부 세포괴 세포를 포배기에서 핵 공여체로 사용할 수 있다. 이들 배가 유전자 발현을 재프로그램한 것을 반영하고, 이들 핵이 실제로 재프로그램되는 경우(가능할 것으로 보임), 발생되는 각 배는 이 방식으로 상기 핵 이식 과정의 효율에 따라 증식될 수 있다. 달성될 가능성이 있는 증가도는 세포 유형에 의존한다. 양에 있어서, 16 세포기의 배로부터 하나의 할구를 미리 활성화한 "보편적인 수용체(universal recipient)" 난모 세포에 이식하여 55% 포배기의 배를 얻는 것은 쉽게 가능한 일이다. 따라서, 단일 세포에서 발생된 각각의 배가 16 세포기에서 8개의 세포를 발생시킬 수 있다는 가설은 타당성이 있다. 이들 수치는 단지 개략적인 지침에 불과하지만, 이후의 발생 단계에서 유리한 정도는 그 단계에서의 상기 과정의 효율에 의해 결정된다는 것은 명백하다.
수율 개선의 편의에 대한 문제점은 차치하고, 상기 재구성된 배는 생체내 또는 시험관내에서 배양시켜 포배 단계를 얻을 수 있다.
핵이식에 의해 유도된 배는 정상적인 배와는 상이하며, 때로는 배가 통상적으로 배양되는 배양 조건(적어도 생체내) 이외의 생체내 배양 조건으로부터 이득을 얻거나 또는 그러한 배양 조건을 필요로 한다는 사실을 경험적으로 알게 되었다. 이에 대한 이유는 아직 알려져 있지 않다. 소의 배를 통상적으로 증식함에 있어서, 재구성된 배(이들의 다수를 한번에)는 양의 수란관에서 5 내지 6일 동안 배양시켜 왔다[참조: Willadsen, In Mammalian Egg Transfer(Adams, E.E., ed.) 185 CRC Press, Boca Raton, Florida (1982)]. 그렇지만, 본 발명을 실시함에 있어서, 바람직하게는 배를 보호하기 위하여 배를 이식 전에 한천과 같은 보호성 배지 내에 매립하고, 이어서 임시 수용체로부터 회수한 후 상기 한천으로부터 절개해내는 것이 좋다. 보호 한천 또는 기타 배지의 기능은 2 가지이다. 즉, 첫째로 투명대를 함께 보유함으로써 배를 위한 구조성 보조제로서 작용하는 것이고, 둘째로, 수용체 동물의 면역계 세포들에 대한 차단체로서 작용하는 것이다. 이러한 접근 방식은 포배를 형성하는 배의 비율을 증가시키지만, 다수의 배가 상실될 수 있다는 단점이 있다.
시험관내 조건이 사용되는 경우, 당업계에서 통상 사용되는 것도 다소 허용될 수 있다.
포배기 단계에서는, 출산만기까지의 발생 적합성에 대해서 배를 스크리닝할 수 있다. 통상, 이것은 상기 배가 형질전환된 것이고, 적절한 구성 요소(integrant)에 대한 스크리닝 및 선별이 수행되는 경우에 행하게 된다. 또한, 비형질전환성 유전자 마커에 대한 스크리닝도 이 단계에서 수행할 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법에 의하면 초기 단계에서 공여체의 스크리닝이 가능하기 때문에, 그것이일반적으로 바람직할 것이다.
스크리닝이 수행된 경우, 그 스크리닝 후, 포배기 단계의 배는 출산만기까지 발생할 수 있다. 이는 일반적으로 생체내에서 일어나게 된다. 포배까지의 발생이 시험관내에서 수행된 경우에는, 이 단계에서 최종 수용체 동물에 대한 이식이 실시된다. 포배 발생이 생체내에서 이루어진 경우에는, 원칙적으로 포배를 포배전 숙주내에서 출산만기까지 발생시킬 수 있지만, 실제로는 상기 포배를 통상 포배전 (임시적) 수용체로부터 분리하고, 보호 배지로부터 절제해 낸 후. 포배후(영구적인) 수용체에 이식되게 된다.
본 발명의 제3의 특징의 선택적인 단계(c)에 있어서, 동물은 선행 단계에 의해 생산된 동물로부터 번식될 수 있다. 이 방식으로, 하나의 동물을 사용하여 목적하는 유전적 특성(들)을 보유하는 동물군 또는 동물 집단을 형성시킬 수 있다.
유전학적으로 동일한 세포원으로부터 핵이식에 의해 생산된 동물은 동일한 핵을 공유하지만, 이들 동물은 상이한 난모 세포로부터 유래되기 때문에 엄격한 의미로는 동일하지 않다. 이러한 상이한 기원의 중요성은 명백하지 않으나, 상업적인 특성에 영향을 미칠 수 있다. 아이오와 주립 대학 사육장(Iowa State University Breeding Herd)에서 행한 젖소의 미토콘드리아 DNA에 대한 최근의 분석에 따르면, 이 DNA가 우유 및 생식능과 관련이 있는 것으로 확인되었다[참조: Freeman & Beitz, In Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation(Seidel, G. E. Jr., ed.) 17-20, Colorado State University, Colorado (1992)]. 유사한 효과가 상기 소 집단 전체에 존재하는지의 여부가 확인되어야 하고, 또 난모 세포의 선택을 고려하는 것이 특정 상황에서 가능 또는 필요한지의 여부도 고려하여야만 한다. 소 번식 분야에 있어서, 많은 유전학적 장점이 있는 공여체로부터 다수의 배를 생성하기 위한 능력은 유전학적 개량을 전국적으로 확산시킴에 있어서 상당한 잠재적 가치를 가질 수 있다. 적용의 규모는 각 배의 비용 및 이식된 배가 출산만기까지 발생할 수 있는 비율에 따라 달라지게 된다.
예시 및 요약의 목적으로, 형질전환 및 비형질전환 동물을 생산할 수 있는 전형적인 방법을 이하에 기재한다. 이 방법은 5개의 단계를 포함하는 것으로 간주할 수 있다.
(1) 이배체 공여체 세포를 분리하는 단계;
(2) 필요한 경우, 예를 들어 선택 가능한 마커의 존부에 관계 없이 적당한 구조체를 사용하는 형질 감염에 의해 형질전환을 유발하는 단계(transgenesis);
(2a) 필요에 따라, 안정한 구성 요소(integrant)에 대해 스크리닝 및 선발하는 단계 - 미세 주입의 생략;
(3) 핵 이식에 의해 배를 재구성하는 단계;
(4) 생체내 또는 시험관 내에서 배양시켜 포배를 얻는 단계;
(4a) 필요에 따라, 안정한 구성 요소 또는 기타 목적하는 특성에 대해
스크리닝 및 선별하는 단계 - 상기 단계 (2a)를 수행하는 경우 생략;
(5) 필요에 따라, 최종 수용체로 이식시키는 단계.
상기 방법은 이미 공지된 핵이식 방법에 비해 다음과 같은 여러 가지 장점이 있다.
1) 공여체 핵의 염색사는 적당한 시간 동안 활성화의 부재하에서 수용체 난모 세포의 감수 분열 세포질에 노출될 수 있다. 이는 상기 염색사 구조를 변경시킴으로써 공여체 핵의 "재프로그래밍"을 증가시킬 수 있다.
2) 재구성된 배의 정확한 배수성은 G0/G1 핵이 이식될 때 유지된다.
3) 종전의 연구 결과, 소/양 난모 세포의 활성화 반응성은 연령에 따라 증가하는 것으로 확인되었다. 종전에 관찰되어 왔던 한 가지 문제점은 미핵출 노화 난모 세포 내에서 감수 분열 스핀들 극체의 복제가 일어나며, 다극체 스핀들이 관찰된다는 점이다. 그러나, 본 발명자들은 재구성되고 높은 MPF 수준으로 유지되는 배에서는, 핵 엔벨로프 소실 및 염색사 응축이 일어나지만, 조직화된 스핀들이 관찰되지 않는다는 것을 보고한다. 조기에 응축된 염색체는 견고한 다발 상태로 존재하며, 따라서 본 발명자들은 노화 과정을 이용할 수 있고, 재구성된 배의 배수성에 나쁜 영향을 끼치지 않고 재구성된 난모 세포의 활성화 반응을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 제4의 특징에 따르면, 전술한 바와 같이 작제된 동물이 제공된다.
본 발명의 각 관점의 바람직한 특징은 필요한 변경을 가하면 각각의 다른 관점에 대한 것과 동일하다.
이제는 본 발명을 하기 실시예에 따라 설명할 것이다. 이 실시예는 예시의 목적으로 제공되는 것으로서, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 아니된다. 이하에서는 첨부 도면을 참고로 하여 설명한다.
실시예 1
소의 난모 세포를 이용하는 "MAGIC" 방법
이 실험의 대상인 수용체 난모 세포는 MAGIC(Metaphase Arrested G1/G0 AcceptIng Cytoplast: 중기 정지된 G1/G0 수용 세포질) 수용체라고 부른다.
시험관내에서의 난모 세포 성숙 중에 일어나는 핵 및 세포질 현상이 연구되었다. 또한 상이한 연령의 재구성된 배에서의 융합 및 활성화의 역할도 역시 조사되었다. 상기 연구는 난모 세포 성숙은 비동기적이지만, 성숙된 난모 세포의 개체군은 18 시간만에 형태학적으로 선별할 수 있다는 것을 보여주었다(도 1).
난모 세포의 형태학적 선별
도 1에 있어서, 난소는 지역 도살장에서 얻은 것이고, 실험실로 옮기는 동안에는 28∼32??로 유지하였다. 큐물러스 난모 세포 복합체(Cumulus Oocyte Complex; COC)는 피하침(내경 1.2mm)을 이용하여 직경이 3∼10 mm인 여포로부터 흡출하고, 멸균 플라스틱 일반 용기에 투입시켰다. 상기 일반 용기는 가온실(35??) 내에 넣고, 10∼15분 동안 여포성 물질을 침강시킨 후, 상징액의 3/4을 폐기하였다. 잔류 여포성 물질은 10% 소 혈청이 보충된 동일한 부피의 해부 배지[dissection medium; 얼레스(Earles)의 염이 있는 TCM 199(Gibco), 카나마이신 75.0 mg/l, 30.0 mM Hepes(pH 7.4), 삼투도 280 mOsmol/kg H2O]로 희석하여, 85 mm 페트리 접시에 옮기고, 해부용 현미경을 이용하여 COC에 대해 조사하였다. 큐물러스 세포로 이루어진 2∼3개 이상의 압축 층을 보유하는 복합체를 선택하고, 해부 배지 내에서 3회 세척하고, 10% 소 혈청 및 1x106 과립막 세포/ml가 보충된 성숙 배지(얼레스의 염이 있는 TC 배지 199(Gibco), 카나마이신 75 mg/l, 30.0 mM Hepes, 7.69 mM NaHCO3(pH 7.8), 삼투도 280 mOsmol/kg H2O) 내에 옮기고, 공기 중에서 5% CO2 분위기하 회전 테이블에서 39??로 배양하였다. 난모 세포를 성숙 접시로부터 꺼내어, 5% 석유 젤리와 95% 왁스로 이루어진 혼합물을 이용하여 부착된 커버슬립 아래에 있는 에탄올로 세척한 유리 슬라이드 위에 젖은 채로 올려놓았다. 이어서, 상기 올려놓은 배를 금방 마련한 메탄올:빙초산(3:1) 중에서 24 시간 동안 고정하고, 45% 아세토-오르세인(Sigma)으로 염색하고, 니콘 마이크로포트-에스에이를 이용하는 상대조(橡對照) 및 DIC 현미경법으로 조사하였다. 도 1의 그래프는 MII의 난모 세포 및 육안으로 보이는 극체가 있는 난모 세포의 백분율을 나타낸다.
소의 여포성 난모 세포의 활성화
성숙이 24 시간까지 계속되는 경우, 이들 난모 세포는 칼슘을 함유하는 만니톨 내에서 매우 낮은 비율(24%)로 활성화한다(표 1a). 그러나, 전기 충격 배지로부터 칼슘 및 마그네슘을 제거하면 임의의 활성화가 방지된다.
표 1a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 소의 여포성 난모 세포의 활성화는 상이한 기간 동안 시험관내에서 성숙되었다. 난모 세포를 성숙 배지로부터 꺼내고, 활성화 배지 내에서 1회 세척하여, 활성화 챔버에 넣고, 1.25 kV/cm의 단일 전기 펄스를 80 ㎲동안 가하였다.
난모 세포의 수(N) 성숙 개시 후의 시간(hpm)(연령(시간)) 전핵 형성(활성화율(%))
73 24 24.6
99 30 84.8
55 45 92.7*
* 다수의 2 이상의 전핵
허위(虛僞) 핵출된 소 난모 세포의 활성화 반응
하기 표 1b는 시험관내에서 성숙 개시 약 22 시간 (hpm) 후 허위 핵출된 성숙한 소의 난모 세포의 활성화 반응을 나타내고 있다. 난모 세포는 핵출시와 완전히 동일하게 처리하고, 중기판을 함유하지 않는 소량의 세포질을 흡출하였다. 조작 후, 난모 세포에 1.25 KV/cm의 단일 직류 펄스를 가하여, 성숙 배지로 복귀시키고, 30 hpm 및 42 hpm에서, 난모 세포 군들을 올려놓아 고정하고, 아세토-오르세인으로 염색하였다. 결과는 각 시점에서 5회의 각 실험에서 얻은 난모 세포의 수를, 전체 세포 수에 대하여 전핵이 있는 세포의 수로서 나타냈다.
실험 전핵이 있는 세포 수/ 총 세포 수30 hpm 전핵이 있는 세포 수/총 세포 수42 hpm
1 1/8 -
2 0/24 0/30
3 0/21 0/22
4 0/27 0/25
5 0/19 0/1
hpm = 성숙 개시 후 시간
핵출된 난모 세포 내에서의 전핵 형성
하기 표 2는 1차 소 섬유아세포에 융합되고(24 hpm), 이어서 활성화한(42 hpm) 핵출된 난모 세포 내에서의 전핵 형성을 나타내고 있다. 결과는 5회의 각 실험을 나타낸다. 난모 세포는 2개의 군으로 구분하였는데, A군은 활성화 전에 1 시간 동안 그리고 활성화후 6 시간 동안 노코다졸 내에서 항온 처리하였다. B군은 노코다졸로 처리하지 않았다. 활성화한 난모 세포를 고정하고, 활성화후 12 시간이 경과한 후 아세토-오르세인으로 염색하였다. 이어서, 상대조하에서 각 파르테노트(parthenote) 내의 전핵(PN)의 수를 측정하였다. 측정 결과는 하나 이상의 전핵을 함유하는 활성화한 난모 세포의 백분율로서 나타낸다.
합계 1 PN 2 PN 3 PN 4 PN ＞4 PN
A 군 52 100 0 0 0 0
B 군 33 45.2 25.8 16.1 3.2 9.7
조직화된 스핀들의 부재 및 극체의 부재는 재구성된 배 내에서 배수성을 유지하기 위해 단지 이배체, 즉 G0/G1핵을 이 세포질 위치에 이식하여야 함을 의미하는 것이다. 활성화 전 5 시간, 1 시간 및 활성화 후 미소관 억제제인 노코다졸의 존재하에서 활성화된 난모 세포의 항온 처리는 미소핵의 형성을 예방하고(표 2), 따라서 공여체 핵이 세포 주기의 G0/G1기에 있는 경우, 재구성된 배의 정확한 배수성이 유지된다.
결과
이들 결과는 다음과 같다.
i) 이들 난모 세포는 성숙 개시후 18 시간 만에 핵출될 수 있다(도 1).
ii) 핵출된 난모 세포는 0.3M 만니톨 또는 0.27M 수크로즈 내에서 공여체 할구/세포에 융합되거나, 또는 상기 공여체 세포 또는 핵은 임의의 활성화 반응 부재하의 무칼슘 배지 내에서 주입될 수 있다.
iii) 재구성된 배 또는 펄스가 인가된 핵출 난모 세포는 성숙 배지 내에서 배양될 수 있고, 자연 발생적인 활성화를 일으키지 않는다.
iv) 이식된 핵은 핵 엔벨로프 소실(NEBD) 및 염색체 응축을 일으키는 것으로 보인다. 이식된 핵의 세포 주기 단계에 관계 없이, 조직화된 감수 분열/유사 분열 스핀들이 관찰되지 않는다.
v) 이와 같이 조작된 커플리트는 조작하지 않은 대조용 난모 세포와 동등한 빈도로 30 시간 및 42 시간만에 활성화하게 된다.
vi) 이식된 핵의 세포 주기 단계에 관계없이, 후속되는 활성화에 따른 극체는 관찰되지 않는다.
vii) 후속 활성화를 일으킬 때 1개의 재구성된 접합자당 1∼5개의 미소핵이 형성된다(표 2).
"MAGIC" 방법을 이용한 소 배의 재구성
예비 실험에 있어서, 이 기법은 5일 동안 혈청 결핍에 의해 세포 주기의 G0기에서 동조된 1차 섬유아세포를 이용하여 소의 배를 재구성하는 데 적용하였다. 그 결과는 하기 표 3에 요약되어 있다.
하기 표 3은 핵출되고 미활성화한 MII 난모 세포 내에 혈청 결핍된(G0) 소의 1차 섬유아세포의 핵을 이식하여 재구성한 소의 배 발생을 나타낸다. 배는 24 hpm에서 재구성되었으며, 융합된 커플리트는 42 hpm에서 활성화하였다. 융합된 커플리트는 활성화전 1 시간 동안 그리고 활성화후 5 시간 동안 M2 배지 중의 노코다졸(5 ㎍/㎖) 내에서 항온 처리되었다. 커플리트는 80 ㎲ 동안 1.25 KV/cm의 단일 직류 펄스를 이용하여 활성화시켰다.
실험 번호 포배의 수/융합된 커플리트의 총수 포배(%)
1 1/30 3.3
2 4/31 12.9
실시예 2
양의 난모 세포를 이용하는 "MAGIC"법
실시예 1에서 행한 관찰과 유사한 관찰이 생체 내에서 성숙된 양의 난모 세포에서도 확인되었다. 새로 배란된 난모 세포는 프로스타글란딘 처리후 24 시간이 경과한 후 초자극된 암양의 수란관으로부터 관류에 의해 회수할 수 있다. 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS/1.0% FCS를 관류 매체로 이용함으로써 난모 세포 활성화를 예방하였다. 난모 세포는 무칼슘 배지 내에서 핵출하고, 공여체 세포는 활성화 부재하에서 상기한 바와 같이 투입할 수 있다. 조직화된 스핀들은 관찰되지 않았으며, 다중핵은 후속 활성화시에 형성되었는데, 이는 노코다졸 처리에 의해 억제할 수 있었다.
결과
양에서의 예비 실험에서, 일회 임신으로 한 마리의 살아있는 양을 출생시켰다. 그 결과는 하기 표 4 및 5에 나타나 있다.
하기 표 4는 생체내에서 활성화하지 않고 핵출된 성숙한 양의 난모 세포에 배 유도된 확립된 세포주의 이식에 의하여 재구성된 양의 배발생을 나타낸다. 난모 세포는 초자극된 스코틀랜드 블랙훼이스종 암양으로부터 얻고, 상기 세포주는 웰시 마운틴종 암양으로부터 얻은 9일령 배의 배반(胚盤)으로부터 확립되었다. 재구성된 배는 일시적인 수용체 암양의 연결된 수란관 내에서 6일 동안 배양하고, 회수하여 발생에 대한 분석을 행하였다.
핵이식 일자 계대 횟수 상실배의 수,포배/총수
1995.1.17 6 4/28
1995.1.19 7 1/10
1995.1.31 13 0/2
1995.2.2 13 0/14
1995.2.7 11 1/9
1995.2.9 11 1/2
1995.2.14 12
1995.2.16 13 3/13
합계 10/78(12.8%)
하기 표 5는 모든 상실배/포배 단계의 재구성된 배의, 동조된 최종 수용체인 블랙훼이스종 암양의 자궁각에 이식 후 임신 유도를 나타낸다. 하기 표는 암양 및 배에 관한 임신 빈도인, 이식된 각 군으로부터 배의 총수를 나타내는데, 대부분의 경우 2개의 배를 각각의 암양에 이식하였다. 단일 쌍태 임신이 이루어졌으며, 한 마리의 살아 있는 양이 탄생되는 결과를 가져왔다.
계대 횟수 "MAGIC"
P6 4
P7 1
P11 2
P12 0
P13 3
총 상실배/포배 10
암양의 총수 6
임신한 암양(%) 1(16.7)
태아/이식된 총수(%) 2/10(20.0)
본 발명은 제2 감수 분열의 중기에서 정지된 난모 세포내로 이배체 핵을 이식시키는 것을 포함하여 동물의 배를 재구성하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 시험관내에서 소의 난모 세포의 성숙률을 나타내는 것이다.

Claims (9)

  1. 인간을 제외한 성체 포유동물의 세포 배양물과 배 클론의 조합물로서,
    (1) 상기 세포 배양물은 인간을 제외한 성체 포유동물 유래의 분화된 세포를 포함하며,
    (2) 상기 배 클론은 핵이식에 의해 배양물내 공여체 세포로부터 생성되고, 상기 배는 출산만기까지 발생될 수 있는 것인 조합물.
  2. 인간을 제외한 성체 포유동물의 세포 배양물과 살아있는 자손 클론의 조합물로서,
    (1) 상기 세포 배양물은 인간을 제외한 성체 포유동물 유래의 분화된 세포를 포함하며,
    (2) 상기 살아있는 자손은 핵이식에 의해 배양물내 공여체 세포로부터 생성되는 것인 조합물.
  3. 인간을 제외한 성체 어미 포유동물과 이의 살아있는 자손 클론을 포함하는 인간을 제외한 한 쌍의 포유동물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분화된 세포가 소, 양, 돼지, 염소, 말, 마우스 또는 랫트 유래인 것인 조합물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 인간을 제외한 포유동물이 소, 양, 돼지, 염소, 말, 마우스 및 랫트로 구성된 군에서 선택되는 것인 인간을 제외한 한 쌍의 포유동물.
  6. (i) 인간을 제외한 포유동물의 이배체 분화된 세포를 불활성화된 핵출된 중기 II에 정지된 난모세포에 융합시켜, 배를 재구성하는 단계;
    (ii) 상기 재구성된 배를 활성화 없이 충분한 시간 동안 유지하여, 핵을 재프로그래밍시키는 단계;
    (iii) 상기 결과 재구성된 배를 활성화시키는 단계; 및
    (iv) 상기 재구성된 배를 인간을 제외한 숙주 포유동물에 이식하여, 재구성된 배를 출산만기까지 발생시키는 단계
    를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물의 클로닝 방법.
  7. (i) 인간을 제외한 포유동물의 이배체 분화된 세포를 불활성화된 핵출된 중기 II에 정지된 난모세포에 융합시켜, 배를 재구성하는 단계;
    (ii) 상기 재구성된 배를 활성화 없이 충분한 시간 동안 유지하여, 핵을 재프로그래밍시키는 단계;
    (iii) 상기 결과 재구성된 배를 활성화시키는 단계;
    (iv) 상기 단계 (iii)의 배 세포를 공여체 세포로 사용하고 상기 단계 (i) 내지 (iii)을 반복하여, 추가적인 배를 생성하는 단계; 및
    (v) 상기 단계 (iv)의 재구성된 배를 인간을 제외한 숙주 포유동물에 이식하여, 재구성된 배를 출산만기까지 발생시키는 단계
    를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물의 클로닝 방법.
  8. (i) 인간을 제외한 포유동물의 이배체 분화된 세포를 불활성화된 핵출된 중기 II에 정지된 난모세포에 미세주입(microinjection)하여, 배를 재구성하는 단계;
    (ii) 상기 재구성된 배를 활성화 없이 충분한 시간 동안 유지하여, 재구성된 배가 출산만기까지 발생될 수 있게 하는 단계;
    (iii) 상기 결과 재구성된 배를 활성화시키는 단계; 및
    (iv) 상기 재구성된 배를 인간을 제외한 숙주 포유동물에 이식하여, 재구성된 배를 출산만기까지 발생시키는 단계
    를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물의 클로닝 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인간을 제외한 포유동물이 소, 양, 돼지, 염소, 말, 마우스 및 랫트로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
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