MÉTODOS DE PRODUCIR MAMÍFEROS CLONADOS Y TRANSGENICOS
Antecedentes de la Invención La transferencia nuclear (o clonación) es una técnica usada para generar múltiples embriones idénticos. Se lleva a cabo como sigue: se recolectan oocitos sin fertilizar. E-stoS oocitos puede ser madurados ya sea in vi tro o in vivo . Los 0 oocitos en la etapa apropiada de maduración pueden ser enuclea- dos . Después de la enucleación, los oocitos pueden ser fusionados a una célula donadora o núcleo donador. La célula donadora puede ser una célula somática o no somática de un mamífero
*9- embriónico, fetal o adulto. El oocito enucleado y la célula 5 donadora puede ser activados ya sea simultáneamente durante la fusión, o bien antes o después de la fusión. Por ejemplo, el oocito puede ser activado después de incubar la célula donadora o núcleo con el oocito enucleado por un período de tiempo, v.gr., hasta 24 horas. La activación puede ser entonces lograda, por 0 ejemplo, por medios químicos o físicos. El embrión resultante puede entonces ser transferidos de inmediato o cultivado in vi tro- y transferido en cualquier momento hasta la etapa de blastocisto. Compendio de la Invención La presente invención está basada, en parte, en el 5 descubrimiento de que el desarrollo de un embrión en una etapa posterior, v.gr., en un animal post-natal, puede ser optimizado proveyendo células que aporten un componente extra-embriónics ai- organismo en desarrollo. Se ha descubierto que las consecuencias negativas de las manipulaciones de transferencia nuclear pueden ser reducidas transfiriendo un embrión reconstruido en conjunción con una agregación tetraploide. Aunque es posible obtener preñeces de término completo en diversas especies de mamíferos, usando técnicas de embrión reconstruido, se pierde un gran número ß& de estas preñeces ya sea poco tiempo después de la implantación, o bien perinatalmente . A mayor abundamiento, la progenie de
10 preñeces clonadas a menudo exhibe defectos y anormalidades fisiológicos. Tales consecuencias pueden ser resultado de desarrollo inapropiado del componente extra-embriónico de los embriones clonados. El uso de células extra-embriónicas, v.gr., una agregación tetraploide, puede utilizarse para reducir los
15 defectos del componente extra-embriónico de los embriones clonados . En consecuencia, en un aspecto, la invención se refiere a un método de promover el desarrollo de un animal no humano prenatal, v.gr., un embrión. El método incluye proveer al embrión con una o mas células extra-embriónicas. Aunque no se desea quedar limitado por la teoría, los inventores creen que las células extra-embriónicas contribuyen a o se desarrollan en tejido de la placenta u otro tejido no embriónico, lo que promueve el desarrollo. De esta manera, el método incluye: 5 proveer un embrión, v.gr., un embrión reconstruido, en
asociación con una o mas células extra-embriónicas ; permitir al embrión desarrollarse, in vivo o in vi tro, a una etapa posterior, v.gr., permitir al embrión completar una preñez de término completo para proveer un animal no humano postnatal . En una forma de realización preferida, la célula extra- embnónica es una célula distinta de una célula diploide, v.gr. , cromosomas de mas de 2 , y en formas de realización mas preferi0 das, es una célula tetraploide. La célula extra-embriónica puede ser derivada de un embrión, v.gr., un embrión en el cual las células están fusionadas para incrementar el grado de repetición del número básico de cromosomas, v.gr., un embrión de la etapa de dos células que ha sido tetraploidizado. 5 En una forma de realización preferida, el embrión es un embrión reconstruido, v.gr., es el resultado de la combinación de un genoma de una primera célula con una segunda célula funcionalmente enucleada, v.gr., un oocito enucleado. A guisa de ejemplo, el embrión reconstruido puede ser formado combinando el genoma de ( una célula, v.gr., célula somática (v.gr., una célula somática embriónica, fetal o de adulto) , una célula madre o una célula similar a célula madre (v.gr., una célula obtenida de un embrión hasta la formación de un disco embriónico) , célula de masa embriónica interna, con una célula receptora, v.gr., célula 5 enucleada funcionalmente, v.gr., un oocito enucleado. El embrión
» »; -<c.?t . ~ ^^ -4- puede ser clonado, sometido a ingeniería genética, o ambos. En una forma de realización preferida, un oocito no* fertilizado es funcionalmente enucleado, v.gr., enucleado. En< ,¿ ... una forma de realización preferida, el oocito es enucleado por medios físicos o químicos. En una forma de realización preferida, el genoma de la célula, v.gr., el genoma de una célula somática (v.gr., un , , .y fibroblasto) o célula no somática (v.gr., una célula madre, célula similar a célula madre, o una célula germinal) , es
10 introducido en el oocito por fusión. En una forma de realización preferida, la fusión ocurre por medios eléctricos, químicos o físicos. En una forma de realización preferida, el oocito es
* • activado antes de, simultáneamente con, o después de la introducción del genoma. En una forma de realización preferida, el
15 oocito es: activado por electrofusión; activado por activación de ionofora; activado por activación con etanol; está en una etapa activada, v.gr., telofase. En una forma de realización preferida, el embrión reconstruido es: implantado en el animal receptor; implantado en un animal receptor después de la formación del -"A embrión reconstruido; cultivado in vi tro, v.gr., cultivado iu vi tro hasta la etapa de dos células, la etapa de cuatro células, la etapa de ocho células, la etapa de 16 células, la etapa de blastocisto . En una forma de realización preferida, el método
25 incluye además permitir al animal no humano desarrollarse a
-5- término y obtener una sustancia útil, v.gr., una proteína, del animal no humano o de un producto, v.gr., leche, del animal no humano. En una forma de realización preferida, el animal es un mamífero, v.gr., una cabra, oveja, vaca, un cerdo, caballo, conejo, ratón, una llama o un camello. En una forma de realización preferida, el mamífero es un mamífero macho o hembra. Eñ otra forma de realización preferida, el mamífero es inducido a
'"ß ^** lactar . En otro aspecto, la invención se refiere a un método dé
10 promover el desarrollo de un animal no humano pre-natal, v.gr., un embrión. El método incluye: introducir un genoma donador en una célula enucleada i í- receptora para formar un embrión reconstruido; e implantar el embrión reconstruido, en asociación con
15 una o mas células extra-embriónicas, a un mamífero no humano receptor y permitir que el embrión se desarrolle a una etapa posterior, v.gr., un feto o un animal no humano post-natal. El embrión reconstruido puede ser asociado con células extra-embriónicas en cualquier momento, pero de preferencia antes
2^ del tiempo de implantación. De esta manera, el embrión reconstruido puede ser asociado con las células extra-embriónicas antes, en el momento, o después de la introducción del genoma donador. Por ejemplo, las células extra-embriónicas puede ser asociadas con la célula enucleada funcionalmente, receptora,
25 v.gr., oocito enucleado funcionalmente, antes o después de la
-6- mtroducción del genoma donador. En una forma de realización preferida, el embrión reconstruido es dejado desarrollar a una etapa posterior, v.gr., se de a completar una preñez de término completo para proveer un animal no humano post-natal. En una forma de realización preferida, la célula extra- embpónica es una célula distinta de una célula diploide, v.gr.,
una célula con un grado de repetición del número básico de cromosomas de mas de 2 , y en formas de realización mas preferidas
10 es una célula tetraploide. La célula extra-embpónica puede ser derivada de un embrión, v.gr., un embrión de etapa de dos células, que ha sido tetraploidizado. En una forma de realiza¬
* ß^- ción preferida, el embrión reconstruido puede ser formado combinando el genoma de una célula, v.gr., célula somática
15 (v.gr., una célula somática embriónica, fetal, o de adulto), una célula madre o una célula similar a célula madre (v.gr., una célula obtenida de un embrión hasta la formación de un disco embriónico) , una célula de masa embriónica interna, con una célula receptora, v.gr., célula enucleada funcionalmente, v.gr.,
20 un oocito enucleado. El embrión puede ser clonado, sometido a
• ingeniería genética, o ambos. En una forma de realización preferida, un oocito sin fertilizar es enucleado funcionalmente, v.gr., enucleado. En una forma de realización preferida, el oocito es enucleado por medios
25 físicos o químicos.
En una forma de realización preferida, el genoma de 1* célula donadora, v.gr., el genoma de una célula somática o \ma?- J^? célula no somática (v.gr., una célula madre, una célula similaí^J a célula madre, o una célula germinal), es introducido en el oocito por fusión. En una forma de realización preferida, el oocito es activado antes de, simultáneamente con, o después de la ' introducción del genoma. En una forma de realización preferida, el oocito es: activado por electrofusión; activado por activación t de ionofora; activado por activación con etanol; está en una etapa activada, v.gr., telofase . En una forma de realización preferida, el embrión reconstruido es: implantado en el animal receptor; implantado en un animal receptor después de la formación del embrión reconstruido; cultivado ín vitro hasta la etapa de dos células, la etapa de cuatro células, la etapa de ocho células, la etapa de blastocisto. En una forma de realización preferida, el método incluye además usar un genoma sometido a ingeniería genética como el genoma donador. El cambio de ingeniería genética puede ser introducido antes o después de que se introduce el genoma donador en la célula receptora. En una forma de realización preferida, el método incluye además introducir un transgén, v.gr., una construcción que incluye un promotor de leche acoplado con una secuencia que codifica una proteína heteróloga, al genoma donador. El transgén
puede ser introducido antes o después de que se introduce el genoma donador en la célula receptora. En una forma de realización preferida, la construcción puede incluir además una o mag - secuencias reguladoras, v.gr., una secuencia de flanqueo 5', una secuencia de flanqueo 3', al menos una secuencia aislante. En una forma de realización preferida, el método incluye además permitir al animal no humano desarrollarse hasta término y obtener una sustancia útil, v.gr., una proteína, del animal no humano o a partir de un producto, v.gr., leche, del
10 animal no humano. En una forma de realización preferida, el animal es un mamífero, v.gr., una cabra, oveja, vaca, un cerdo, caballo, conejo, ratón, una llama o un camello. En una forma de
**1P^ realización preferida, el mamífero es un mamífero macho o hembra. En otra forma de realización preferida, el mamífero es inducido»
15 a lactar. En otro aspecto, la invención se refiere a un método de proveer un producto. El método incluye: proveer un animal no humano, v.gr. , un animal no humano transgénico, hecho por un método descrito en la presente; obtener el producto del animal no humano, v.gr., obtener una sustancia útil, v.gr., un polipéptido, a partir de un producto, v.gr., leche, del animal no humano. En otro aspecto, la invención se refiere a un embrión en asociación con una o mas células extra-embriónicas, v.gr., un 5 embrión en asociación con una o mas células extra-embriónicas,
interna, con una célula receptora, v.gr., célula enucleada funcionalmente, v.gr., un oocito enucleado. El embrión puede ser > clonado, sometido a ingeniería genética, o ambos. En una forma t« de realización preferida, un oocito sin fertilizar es funcional- mente enucleado, v.gr., enucleado. En una forma de realización preferida, el oocito es enucleado por medios físicos o químicos. En una forma de realización preferida, el genoma de la célula, v.gr., el genoma de una célula somática (v.gr., un fibroblasto) o célula no somática (v.gr., una célula madre, célula similar a 10 célula madre, o célula germinal), se introduce en el oocito por fusión. En una forma de realización preferida, la fusión ocurre por medios eléctricos, químicos o físicos. En una forma de
realización preferida, el oocito es activado antes de, simultáneamente con, o después de la introducción del genoma. En una
15 forma de realización preferida, el oocito es: activado por electrofusíón; activado por activación de ionofora; activado por activación con metanol; está en un estado activado, v.gr., telofase. En una forma de realización preferida, el embrión reconstruido es: implantado en un animal receptor; implantado en | ^ un animal receptor siguiendo la formación del embrión reconstruido; cultivado in vi tro, v.gr., cultivado ín vi tro hasta la etapa de dos células, la etapa de cuatro células, la etapa de ocho células, la etapa de 16 células, la etapa de blastocisto. En una forma de realización preferida, el método
25 incluye además permitir al animal no humano desarrollarse hasta
reconstruido puede ser formado combinando el genoma de una z'TS S célula, v.gr., célula somática (v.gr., una células somática embriónica, fetal o de adulto) , una célula madre o una célula similar a célula madre (v.gr., una célula obtenida de un embrión hasta la formación de un disco embriónico) , una célula de masa embriónica interna, con una célula receptora, v.gr., célula enucleada funcionalmente, v.gr., un oocito enucleado. El embrión puede ser clonado, sometido a ingeniería genética, o ambos. En
A'" una forma de realización preferida, un oocito sin fertilizar es enucleado funcionalmente, v.gr., enucleado. En una forma de realización preferida, el oocito es enucleado por medios físicos o químicos. En una forma de realización preferida, el genoma de la célula, v.gr., el genoma de una célula somática (v.gr., un fibroblasto) o célula no somática (v.gr., una célula madre, célula similar a célula madre, o una célula germinal) es introducido en el oocito por fusión. En una forma de realización preferida, la fusión ocurre por medios eléctricos, químicos o físicos. En una forma de realización preferida, el oocito es activado antes de, simultáneamente con, o después de la introducción del genoma. En una forma de realización preferida, el oocito es: activado por electrofusión; activado por activación de ionofora; activado por activación con etanol; está en una etapa activada, v.gr., telofase. En una forma de realización preferida, el embrión reconstruido es: implantado en el animal receptor; implantado en un animal receptor después de la formación del embrión reconstruido; cultivado in vi tro, v.gr., cultivado in
y en formas de realización mas preferidas es una célula tetraploide. La célula extra-embriónica puede ser derivada de un embrión, v.gr., un embrión en el cual las células son fusionadas para incrementar el grado de repetición del número básico dé cromosomas, v.gr., un embrión de etapa de dos células que ha sido tetraploidizado . En una forma de realización preferida, el embrión reconstruido puede ser formado combinando el genoma de una célula, v.gr., una célula somática (v.gr., una célula somática embriónica, fetal o de adulto) , una célula madre o una célula similar a célula madre (v.gr., una célula obtenida de un embrión hasta la formación de un disco embriónico) , una célula de masa -'* embriónica interna, con una célula receptora, v.gr., célula enucleada funcionalmente, v.gr., un oocito enucleado. El embrión puede ser clonado, sometido a ingeniería genética, o ambas. En" una forma de realización preferida, un oocito sin fertilizar es _ » funcionalmente enucleado, v.gr., enucleado. En una forma de realización preferida, el oocito es enucleado por medios físicos o químicos. En una forma de realización preferida, el genoma de la célula, v.gr., el genoma de una célula somática (v.gr., un fibroblasto) o célula no somática (v.gr., una célula madre, célula similar a célula madre, o una célula germinal), es introducido en el oocito por fusión. En una forma de realización preferida, la fusión ocurre por medios eléctricos, químicos O físicos. En una forma de realización preferida, el oocito es activado antes de, simultáneamente con, o después de la introducción del genoma. En una forma de realización preferida, el oocito es: activado por electrofusión; activado por activación de ionofora; activado por activación con etanol; está en una etapa r -15- act vada, v.gr., telofase. En una forma de realización preferida, el embrión reconstruido es: implantado en el animal receptor; implantado en un animal receptor después de la formación del embrión reconstruido; cultivado m vi tro, v.gr., cultivado m vi tro hasta la etapa de dos células, la etapa de cuatro células, la etapa de ocho células, la etapa de 16 células, la etapa de blastocisto . En una forma de realización preferida, el método incluye además obtener una sustancia útil, v.gr., una proteína, a partir del mamífero no humano o a partir de un producto, v.gr., leche, del mamífero no humano. En una forma de realización preferida, el mamífero es: una cabra, oveja, vaca, un cerdo, caballo, conejo, ratón, una llama o un camello. En una forma de realización preferida, el mamífero es un mamífero macho o hembra» En otra forma de realización preferida, el mamífero es inducido a lactar. En otro aspecto, la invención se refiere a un método de hacer un mamífero no humano transgénico. El método incluye: introducir un genoma sometido a ingeniería genética de una célula donadora de mamífero en un oocito, para formar un embrión reconstruido que tiene asociación con al menos una célula extra- embpónica; transferir el embrión a un mamífero receptor; y permitir que se desarrolle el embrión reconstruido en un mamífero post-natal, con ello proveyendo un mamífero transgénico. En una forma de realización preferida, la célula extra-
* v -16- embriónica es una célula distinta de una célula diploide, v.gr., una célula con un grado de repetición del número básico de cromosomas mayor de 2 , y en formas de realización mas preferidas es una célula tetraploide. La célula extra-embriónica puede ser derivada de un embrión, v.gr., un embrión en el cual las células están fusionadas para incrementar el grado de repetición del número básico de cromosomas, v.gr., un embrión de etapa de dos ^ células que ha sido tetraploidizado . En una forma de realización preferida, el embrión 0 reconstruido puede ser formado combinando el genoma de una célula, v.gr., célula somática (v.gr., una célula somática embriónica, fetal o de adulto) , una célula madre o una célula
* >' similar a célula madre (v.gr., una célula obtenida de un embrión hasta la formación de un disco embriónico) , una célula de masa 5 embriónica interna, con una célula receptora, v.gr., una célula enucleada funcionalmente, v.gr., un oocito enucleado. En una forma de realización preferida, un oocito sin fertilizar es enucleado funcionalmente, v.gr., enucleado. En una forma de realización preferida, el oocito es enucleado por medios físicos o químicos. En una forma de realización preferida, el genoma de la célula v.gr., el genoma de una célula somática (v.gr., un fibroblasto) o célula no somática (v.gr., una célula madre, célula similar a célula madre, o una célula germinal) , es 5 introducido en el oocito por fusión. En una forma de realización
preferida, la fusión ocurre por medios eléctricos, químicos o físicos. En una forma de realización preferida, el oocito es" activado antes de, simultáneamente con, o después de la introduce ción del genoma. En una forma de realización preferida, el oocito es: activado por electrofusión; activado por activación dé . ionofora; activado por activación con etanol; está en una etapa activada, v.gr., telofase. En una forma de realización preferida, el embriófi reconstruido es: implantado en el animal receptor; implantado en"
10-- un animal receptor después de la formación del embrión reconstruido; cultivado in vi tro, v.gr., cultivado in vi tro hasta la- etapa de dos células, la etapa de cuatro células, la etapa dé «««¡JiR- ocho células, la etapa de 16 células, la etapa de blastocisto. En una forma de realización preferida, el método
15 incluye además obtener una sustancia útil, v.gr., una proteína, a partir del mamífero no humano o a partir de un producto, v.gr. , leche, del mamífero no humano. En una forma de realización preferida, el mamífero es: una cabra, oveja, vaca, un cerdo, caballo, conejo, ratón, una llama o un camello. En una forma de
'20 realización preferida, el mamífero es un mamífero macho o hembra. En otra forma de realización preferida, el mamífero es inducido a lactar. Descripción Detallada de la Invención Genomas Donadores 25 Los genomas donadores pueden ser naturales o producto de ingeniería genética. Un genoma donador puede ser derivado de una célula embriónica, fetal o de adulto. La célula puede ser una célula somática o una célula no somática, v.gr., una célula que no está comprometida con un linaje de célula somática. Células Somáticas Las células somáticas pueden suministrar el genoma para producir un embrión reconstruido. El término "célula somática", como se usa en la presente, se refiere a una célula diferenciada. La célula puede ser una célula somática o una célula que está
10 comprometida con un linaje de célula somática. De manera alternativa, una célula madre diploide que da lugar a una célula germinal puede ser utilizada a fin de suministrar el genoma para
producir un embrión reconstruido. La célula somática puede ser de un animal o de un
15 cultivo celular. Si se toma de un animal, el animal puede estar en cualquier etapa de desarrollo, v.gr., un embrión, un feto o un adulto. Se prefieren las células embriónicas. Las células embriónicas pueden incluir células madre embriónicas así como células embriónicas comprometidas con un linaje de célula 0 somática. Tales células pueden ser obtenidas del endoderma, el mesoderma o el ectoderma del embrión. De preferencia, las células embriónicas están comprometidas con un linaje de célula somática. Las células embriónicas comprometidas con un linaje de célula somática se refieren a células aisladas al o después del 5 día 10 de la embriogénesis. Sin embargo, las células pueden ser
obtenidas antes del día 10 de la embriogénesis. Si se usa una línea celular como una fuente de un genoma cromosomal, se prefieren células primarias. El término "línea celular primaria", como se usa en la presente, incluye líneas celulares primarias así como líneas celulares derivadas de primarias. Células somáticas adecuadas incluyen fibroblastos (v.gr., fibroblastos primarios, v.gr., fibroblastos primarios
**• embriónicos), células de músculo (v.gr., miocitos) , células de cúmulo, células neurales, y células mamarias. Otras células
10 adecuadas incluyen hepatocitos e isletas pancreáticas. De preferencia, la célula somática es una célula somática embriónica, v.gr., células aisladas al o después del día 10 de la embriogénesis. El genoma de las células somáticas puede ser el
"^^ genoma que ocurre naturalmente, v.gr., para la producción de
15 mamíferos clonados, o el genoma puede ser alterado genéticamente para comprender una secuencia transgénica, v.gr., para la producción de mamíferos clonados transgénicos. Las células somáticas pueden ser obtenidas, por ejemplo, por disociación de tejido, v.gr., por medios mecánicos (v.gr., corte, desmenuzamiento) o enzimáticos (v.gr., tripsiniza ción) para obtener una suspensión celular y luego cultivando las células hasta que se obtiene una mono-capa confluente. Las células somáticas pueden entonces ser cosechadas y preparadas para crio-preservación, o mantenidas con un cultivo de línea. 5 La célula somática puede ser una célula somática
quiescente no quiescente . "No quiescente", como se usa en la presente, se refiere a una célula en el ciclo mitótico celular, ül ciclo mitótico celular tiene cuatro fases distintas, Gl t S, G2 y M. El evento de inicio en el ciclo celular, llamado inicio, ff tiene lugar durante la fase G1 . "Inicio", como se usa en la vé < K presente, se refiere a la etapa G? temprana del ciclo celular antes del compromiso de una célula a proceder a través del ciclo celular. Por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 hasta 11 horas después de que una célula entra en la etapa G-, , se conside¬
10 ra que la célula está antes del inicio. La decisión acerca de si la célula se someterá a otro ciclo celular es tomada en el inicio. Una vez que la célula ha pasado a través del inicio,
? ^ pasa a través del resto de la fase G-, (es decir, la etapa pre- síntesis de ADN) . La fase S es la etapa de síntesis de ADN, qué
15 es seguida por la fase G2 , la etapa entre la síntesis y la itosis. La mitosis tiene lugar durante la fase M. Si en el inicio, la célula no se somete a otro ciclo celular, la célula se torna quiescente. Además, una célula puede ser inducida a salir del ciclo celular y tornarse quiescente. Una célula "quiescente", también referida como una célula en la fase G0, se refiere a una célula que no está en ninguna de las cuatro fases del ciclo celular. De preferencia, la célula somática es una célula en la fase G0 o la fase G1 del ciclo mitótico celular. Usar células somáticas donadoras en ciertas fases del
25 ciclo celular, v.gr., fase G0 o G1# puede permitir sincronización
J?
-21- \ %\ Z- "* entre el oocito y el genoma de la célula somática. Por ejemplo, la reconstrucción de un oocito en la meta-fase II por introducción de un núcleo de una célula somática en G0 o G1# v.gr., por activación y fusión simultáneas, puede imitar los eventos que ocurren durante la fertilización. A guisa de otro ejemplo, un. oocito en la telofase II fusionado, v.gr., por activación y fusión simultáneas, con el genoma de una célula somática en Gx
Pi antes del inicio, provee sincronización de un ciclo celular entre el oocito y el núcleo del donador. 0 Son conocidos métodos de determinar en qué fase del ciclo celular se encuentra una célula. Por ejemplo, como se describe mas delante en los ejemplos, están presentes diversos marcadores en diferentes etapas del ciclo celular. Tales -# marcadores pueden incluir las ciclmas D 1, 2 y 3 y el antígeno 5 nuclear de células proliferativas (PCNA) para Gx y BrDu para detectar actividad sintética de ADN. Además, pueden inducirse las células a entrar en la etapa G0 mediante el cultivo de las células en medio desprovisto de suero. Estas células también son referidas en la presente como "células hambrientas de suero" . Alternativamente, las células en la etapa G0 pueden ser inducidas a entrar al ciclo celular, es decir a la etapa Gx, por activación de suero (también referidas como "células no hambrientas de suero" ) . Células Somáticas Sometidas a Ingeniería Genética 5 Mamíferos Transgén cos
J*
-22- Los métodos para generar mamíferos transgénicos no humanos que pueden usarse como una fuente de células somátic s para la producción de un embrión reconstruido son conocidos en la materia. Tales métodos pueden implicar introducir construcciones de ADN en la línea germinal de un mamífero para hacer un mamífero transgénico. Por ejemplo, una o varias copias de la construcción pueden ser incorporadas en el genoma de un embrión mamífero por 3?¡* tB medio de técnicas transgénicas estándar. Aunque las cabras son una fuente preferida de células 10 somáticas manipuladas por ingeniería genética, pueden usarse otros mamíferos no humanos. Mamíferos no humanos preferidos son rumiantes, v.gr., vacas, ovejas, camellos o cabras. Son útiles
en los métodos descritos en la presente cabras de origen suizo, v.gr., las cabras Alpine, Saanen y Toggenburg. Ejemplos
15 adicionales de animales no humanos preferidos incluyen bueyes, caballos, llamas y cerdos. El mamífero usado como fuente de células manipuladas por ingeniería genética dependerá del mamífero transgénico por obtenerse mediante los métodos de la invención, pues, por ejemplo, un genoma de cabra debe ser
20^ introducido en un oocito enucleado funcionalmente de cabra. De preferencia, las células somáticas para uso en la invención son obtenidas a partir de una cabra transgénica. Los métodos de producir cabras transgénicas son conocidos en la materia. Por ejemplo, un transgén puede ser introducido en la
25 línea germinal de una cabra por micro- inyección, como se
^*%; *.* ! ? ^ .23. MM^?N describe, por ejemplo, en Ebert y colaboradores, (1994) Bio/ Technology 12:699, incorporada en la presente por referencia. Otros animales no humanos transgénicos por usarse como < fuente de células somáticas manipuladas por ingeniería genética pueden ser producidos introduciendo un transgén en la línea germinal del animal no humano. Células embriones objetivo en diversas etapas del desarrollo pueden ser usadas para introducir ß^**"4** transgenes. Se usan diferentes métodos, dependiendo de la etapa de desarrollo de la célula embrional objetivo. La(s) línea (s) específica (s) de cualquier animal usado para poner en práctica esta invención son seleccionadas por criterios de buena salud general, buen rendimiento de embriones, buena visibilidad pro- nuclear en el embrión, y buena salud reproductiva. Además, el haplotipo es un factor significativo. Líneas Celulares Transfectadas Pueden obtenerse células somáticas manipuladas por ingeniería genética a partir de una línea celular en la cual se ha introducido un ácido nucleico de interés, v.gr., un ácido nucleico que codifica una proteína. Puede introducirse una construcción en una célula vía técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se usan en la presente, los términos "transfección" y "transformación" incluyen una variedad de técnicas para introducir una secuencia transgénica en una célula hospedera, incluyendo co- precipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfec-
ción mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación,. Además, pueden usarse vectores biológicos, v.gr., vectores virales, como se describe mas adelante. Métodos adecuados para transformar o transfectar células hospederas pueden encontrarse en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989), y otros manuales de laboratorio adecuados. Dos enfoques útiles son electroporación y lipofecsión. Ejemplos breves de cada uno son descritos a continuación. La construcción de ADN puede ser introducida de manera estable en una línea celular somática, donadora, por electroporación, usando el siguiente protocolo: células somáticas, v.gr., fibroblastos, v.gr., fibroblastos embriónicos , son re-suspendidas en PBS a alrededor de 4 x 10s células/ml. Se añaden 50 microgramos de ADN linealizado a 0.5 ml de suspensión celular, y la suspensión es colocada en una probeta con 0.4 cm de espacio libre para electrodos (Biorad) . La electroporación es llevada a cabo usando un electroporador Biorad Gene Pulser con un pulso de 330 voltios a 25 mA, 1,000 micro Faradios y resistencia infinita. Sí la construcción de ADN contiene un gen de resistencia a neomicina para selección, se seleccionan clonas resistentes a neomícina después de incubación con 350 microgramos/ml de G418 (GibcoBRL) por 15 días. La construcción de ADN puede ser introducida de manera
estable en una línea celular somática, donadora, por lipofección,, usando un protocolo tal como el siguiente: alrededor de 2 x 10* células son dispuestas en una placa en una cavidad de 3.5 c y transfectadas con 2 microgramos de ADN linealizado usando LipfectAMINE (GibcoBRL) . 48 horas después de la transfección, las células son divididas: 1:1000 y 1:5000 y, si la construcción de ADN contiene un gen de resistencia neomicina para selección, se añade G418 a una concentración final de 0.35 mg/ml. Clonas resistentes a neomicina son aisladas y expandidas para crio- 0 preservación así como transferencia nuclear. Construcciones para Genomas Manipulados por Ingeniería Genética Expresión de Proteínas Específica a Tejidos Es a menudo deseable expresar una proteína, v.gr., una proteína heteróloga, en un tejido o fluido específico, v.gr., la 5 leche, de un animal transgénico. La proteína heteróloga puede ser recuperada del tejido o fluido en el que se expresa. Por ejemplo, es a menudo deseable expresar la proteína heteróloga en leche. Métodos para producir una proteína heteróloga bajo el control de un promotor específico de la leche son descritos mas adelante. Además, otros promotores específicos a tejidos, así
* como otros elementos regulatorios, v.gr., secuencias de señal y secuencias que acrecientan la secreción de proteínas no secretadas, son descritos mas adelante. Promotores Específicos de la Leche 5 Los promotores de transcripción útiles son aquellos
activan en células les mamarias, incluyendo los promotores que controlan que codifican las proteínas de la, leche, tales como caseínas, ß- 12, 389 (1984) (ADNc de asl y K caseína bovina); Gorodetsky y colaboradores, Gene 66, 87-96 (1988) (ß-caseína bovina); Alexander y colaboradores, Eur. J. Biochem . 178, 395-401 (1988) (K caseína bovina) ; Bpgnon y colaboradores, FEBS Lett 188, 48-55 (1977) (aS2 caseína bovina) ; Jamieson y colaboradores, Gene 61, 85-90 (1987), Ivanov y colaboradores, Biol . Chem . Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988) , Alexander y colaboradores, Nucleic Acids Res . 17, 6739 (1989) ( ß-lactoglobulma bovina) ; Vilotte y colaboradores, Biochimie 69, 609-620 (1987) (a-lactalbúmma
10 bovina) . La estructura y la función de distintos genes de proteínas de la leche son realizados por Mercier & Vilotte, J. Dairy Sci . 16 , 3079-3098 (1993) (incorporada mediante referencia
*^P* por entero para todos los propósitos) . Si son útiles secuencias de flanqueo adicionales para optimizar la expresión, estas
15 secuencias se pueden clonar usando las secuencias existentes como sondas. Las secuencias reguladoras específicas de la glándula mamaria de diferentes organismos se pueden obtener seleccionando bibliotecas de estos organismos usando secuencias de nucleótidos cognados conocidas, o anti -cuerpos para las proteínas cognadas 0^ como sondas . Secuencias de Señal Las secuencias de señal útiles son secuencias de señal específicas de la leche u otras secuencias de señales que dan como resultado la secreción de proteínas eucarióticas o procarió5 ticas. Preferiblemente, la secuencia de señal se selecciona de
secuencias de señales específicas de la leche, es decir, es a partir de un gen el cual codifica un producto secretado en leche. Más preferiblemente, la secuencia de señal específica de la leche se relaciona con el promotor específico de la leche usado en el sistema de expresión de esta invención. El tamaño de la secuencia de señal no es crítico para esta invención. Todo lo que se requiere es que la secuencia tenga un tamaño suficiente
^^» para efectuar la secreción de la proteína recombinante deseada, v.gr., en el tejido mamario. Por ejemplo, la secuencia de señales de genes que codifican caseínas, v.gr., a, ß, ? o K caseínas, ß-lactoglobulina, proteína de ácido de suero de leche, y lactalbúmina son útiles en la presente invención. Una secuencia de señal preferida es la secuencia de señales de ß- caseína de cabra. Las secuencias de señales de otras proteínas secretadas, v.gr., inmunoglobulinas, o proteínas secretadas por células del hígado, células de riñon, o células pancreáticas también se . pueden usar. De preferencia, la secuencia de señal da como resultado la secreción de proteínas en, por ejemplo, orina o '" sangre . Regiones Amino-Terminales de Proteínas Secretadas Una proteína no secretada puede ser también modificada de tal manera que sea secretada tal como por inclusión en la proteína por secretarse de toda o parte de la secuencia de codificación de una proteína que es normalmente secretada. De preferencia, toda la secuencia de la proteína que es normalmente secretada no está incluida en la secuencia de la proteína, sino 5 mas bien solamente una porción suficiente del extremo arrimo- termmal de la proteína que se secreta normalmente para dar como resultado la secreción de la proteína. Por ejemplo, una proteína que no es normalmente secretada es fusionada (habitualmente en su extremo arrimo-terminal) con una porción amino-terminal de una ^á proteína que es secretada normalmente. En un aspecto, la proteína que es normalmente secretada
10 es una proteína que es secretada normalmente en leche. Tales proteínas incluyen proteínas secretadas por células epiteliales mamarias, proteínas de leche tales como caseínas, ß-lactoglobuli- na, proteína acida del suero, y lactalbúmma . Las proteínas de caseína incluyen genes de caseína a, ß, ? o K de cualquier
15 especie de mamíferos. Una proteína preferida es ß-caseína, v.gr., ß-caseína de cabra. La secuencia que codifica la proteína secretada puede ser derivada de ya sea ADNc o secuencias genómicas. De preferencia, son de origen genómico, e incluyen uno o mas mtrones . Otros Promotores Específicos a Tenido Pueden usarse otros promotores específicos a tejidos que provean expresión en un tejido particular. Los promotores específicos a tejidos son promotores que son expresados mas intensamente en un tejido particular que en otros. Promotores
25 específicos a tejidos que son a menudo expresados de manera
%-
-30- esencialmente exclusiva en el tejido específico. '- Promotores específicos a tejidos que pueden ser usados' incluyen: un promotor específico neural, v.gr., nestina, Wnt-1, Pax-1, Engrailed-1, Engrailed-2, Sonic Hedgehog; un promotor específico al hígado, v.gr., albúmina, alfa-1-anti-tripsina; un promotor específico a músculo, v.gr., miogenina, actina, MyoD, miosina; un promotor específico a oocitos, v.gr., ZP1, ZP2 , ZP3 ; un promotor específico a testículos, v.gr., protamina, fertilina, proteína- 1 del complejo sinaptoenemal ; un promotor específico a
10 la sangre, v.gr., globulina, GATA-1, porfobilinógeno desaminasa;„ un promotor específico a los pulmones, v.gr., proteína G tensioactiva; un promotor específico a la piel o la lana, v.gr. ,
,i* - keratina, elastina; promotores específicos al endotelio, v.gr., Tie-1, Tie-2; y un promotor específico a los huesos, v.gr., BMP.
15 Además, pueden usarse promotores generales para expresión en diversos tejidos. Ejemplos de promotores generales incluyen ß-actina, ROSA-21, PGK, FOS, c-myc, Jun-A y Jun-B. Secuencias Aislantes Las construcciones de ADN usadas para hacer un embrión transgénico reconstruido pueden incluir al menos una secuencia aislante. Los términos "aislante", "secuencia aislante" y "elemento aislante" se usan de manera intercambiable en la presente. Un elemento aislante es un elemento de control que aisla la transcripción de genes colocados dentro de su rango de
25 acción pero que no perturba la expresión del gen, ya sea
»í « : -31- negativamente o positivamente. Preferiblemente, una secuencia aislante se inserta en cualquiera de los lados de la secuencia de ADN que se va a transcribir. Por ejemplo, el aislante se puede colocar aproximadamente 200 pares de bases hasta aproximadamente 5 1 kb, 5Ü a partir del promotor, y cuando menos aproximadamente 1 kb a 5 kb a partir del promotor, en el extremo 3Ü del gen de * "- interés. La distancia de la secuencia aislante del promotor y el 'Pp extremo 3Ü del gen de interés se puede determinar por los técnicos en la materia, dependiendo de los tamaños relativos del 10 gen de interés, el promotor y el mejorador usado en la construcción. Además, se puede colocar más de una secuencia aislante 5Ü a partir del promotor o en el extremo 3Ü del transgén. Por *tHp«,(i ejemplo, dos o más secuencias aislantes se pueden colocar 50 del promotor. El aislante o los aislantes en el extremo 3Ü del 15 transgén se pueden colocar en el extremo 3Ü del gen de interés, o en el extremo 3Ü de una secuencia reguladora 3Ü, v.gr., una región no traducida 3Ü (UTR) o una secuencia de flanqueo 3Ü . Un aislante preferido es un segmento de ADN que abarca el extremo 5Ü del lugar ß-globina de pollo y corresponde al sitio 0^^ ' hipersensible constitutivo 5Ü de pollo como se describe en la publicación internacional WO 94/23046, cuyo contenido se incorpora en la presente mediante referencia. Construcciones de ADN Un cartucho que codifica una proteína heteróloga puede 5 ser ensamblado como una construcción que incluye un promotor para
un tejido específico, v.gr., para células epiteliales mamarias, v.gr., un promotor de caseína, v.gr., un promotor de ß-caseína de cabra, una secuencia de señal específica de la leche, v.gr., u a secuencia de señal de caseína, v.gr., una secuencia de señal dé' ß-caseína, y un ADN que codifica la proteína heteróloga. La construcción también puede incluir una región no traducida 3Ü corriente abajo de la secuencia de ADN que codifica mmmm--" la proteína no secretada. Tales regiones pueden estabilizar la transcripción del ARN del sistema de expresión y de este modo
10 aumenta el rendimiento de la proteína deseada del sistema de expresión. Entre las regiones no traducidas 3Ü útiles en las construcciones de esta invención están las secuencias que %& ^ P^*. proporcionan una señal poli A. Estas secuencias se pueden derivar, v.gr., del antígeno t pequeño SV40, la región no
15 traducida 3Ü de caseína u otras secuencias no traducidas 3Ü bien conocidas en la materia. En un aspecto, la región no traducida 3Ü se deriva de una proteína específica de la leche. La longitud de la región no traducida 3Ü no es crítica pero el efecto estabilizante de esta transcripción poli A parece importante para
20 estabilizar el ARN de la secuencia de expresión. JF Opcionalmente, la construcción puede incluir una región no traducida 5Ü entre el promotor y la secuencia de ADN que codifica la secuencia de señales. Tales regiones no traducidas pueden ser de la misma región de control a partir de la cual el
25 promotor se toma o pueden ser de un gen diferente, v.gr., se
pueden derivar de otras fuentes sintéticas, semi-s téticas o «4 naturales. De nuevo su longitud específica no es crítica, sm embargo, parece ser útiles en mejorar el nivel de expresión. La construcción puede también incluir alrededor de 10, 20, 30, o más de la región de codificación N-termmal de un gen preferencialmente expresado en células epiteliales mamarias. Por ejemplo, la región de codificación N-terminal puede corresponder ^-I-I-I-I-I-W al promotor usado, v.gr., una región de codificación N-termmal de ß-caseína de cabra. w La construcción puede ser preparada usando métodos conocidos en la materia. La construcción puede ser preparada como parte de un plásmido mas grande. Tal preparación permite la # clonación y la selección de las construcciones correctas de una manera eficiente. La construcción puede estar ubicada entre
15 sitios de restricción convenientes en el plásmido, de modo que puedan aislarse fácilmente de las secuencias de plásmido remanentes para incorporación en el mamífero deseado. Proteínas Heterólogas Secuencias transgénicas que codifican proteínas heterólogas pueden ser introducidas en la línea germinal de un mamífero no humano o pueden transfectarse en una línea celular para proveer una fuente de células somáticas manipuladas por ingeniería genética, como se describió antes. La proteína puede ser una proteína compleja o multimé5 rica, v.gr., un homo o hetero-multímero, v.gr., proteínas que
-34- *•****$* ocurren naturalmente como homo o hetero-multímeros, v.gr., hora© o hetero-dímeros, trímeros o tetrámeros. La proteína puede ser una proteína que es procesada por remoción, v.gr., corte, del término N, el término C o fragmentos internos. Incluso proteínas -*&{ - complejas pueden ser expresadas en forma activa. Las secuencias de codificación de proteína que pueden ser introducidas en el genoma del mamífero, v.gr., cabra, incluyen glicoproteínas, neuro-péptidos, inmunoglobulinas, enzimas, péptidos y hormonas. La proteína puede ser una proteína natural o una proteína
10 recombinante, v.gr., un fragmento, proteína de fusión, v.gr., una proteína de fusión de inmunoglobulina, o mutante. Puede ser d® origen humano o no humano. La proteína heteróloga puede ser un agente terapéutico o farmacéutico potencial, tal como, pero sin limitarse a: inhibidor de alfa-1 proteinasa, alfa-1 anti¬
15 tripsina, fosfatasa alcalina, angiogenina, anti-trombina III, cualquiera de los factores de coagulación de la sangre, incluyendo el factor VIII, factor IX, y factor X, quitinasa, decorína, eritropoyetina, super-óxido dismutasa extra-celular, fibrinógeno, glucocerebrosidasa, glutamato descarboxilasa, factor del crecimiento humano, albúmina del suero humana, inmunoglobulina, insulina, proteína básica de mielina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, pro-insulina, pro-lactina, CD4 soluble o un componente o complejo del mismo, lactoferrina, lactoglobulina, lisozima, lactalbúmina, activador del plasminógeno de tejidos, o 5 una variante de éstos .
Las inmunoglobulinas son proteínas heterólsgá©-, particularmente preferidas. Ejemplos de inmunoglobulina$ incluyen IgA, IgG, IgE, IgM, anti -cuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anti -cuerpos recombinantes, anti -cuerpos dé cadena sencilla, y fusiones de anti-cuerpo/proteína . La información de secuencia de nucleótidos está disponible para varios de los genes que codifican las proteínas heterólogas antes listadas, en al menos uno, y a menudo en diversos organismos. Ver, v.gr., Long y colaboradores (1984) 0 Biochem . 23 (21) : 4828-4837 (alfa-1 anti -tripsina) ; Mitchell y colaboradores (1986) Proc . Nati . Acad . Sci . USA 83:7182-7186 (fosfatasa alcalina) ; Schneider y colaboradores (1988) EMBO J.
•, 7 (13) :4151-4156 (angiogenina) ; Bock y colaboradores (1988) Biochem . 27(16) ¡6171-6178 (anti-trombina III) ; Olds y colaborado5 res (1991) Br. J. Hae a tol . 78 (3 ): 408-413 (anti-trombina III); Lin y colaboradores (1985) Proc . Nati . Acad . Sci . USA 82(22): 7580-7584 (eritropoyetina); patente US 5,614,184 (eritropoyetina); Horowitz y colaboradores (1989) Genomics 4(l):87-9ß (glucocerebrosidasa) ; Kelly y colaboradores (1992) Ann . Hum,
F0 Genet . 56 (3) : 255-265 (glutamato descarboxilasa) ; patente US 5,707,828 (albúmina de suero humana); patente US 5,652,352 (albúmina de suero humana); Lawn y colaboradores (1981) Nucleic Acid Res . 9 (22) : 6103 -6114 (albúmina de suero humana); Kamholz y colaboradores (1986) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 83 (13) :4962-4966 5 (proteína básica de mielina) ; Hiraoka y colaboradores (1991) Mol .
Cell Endocnnol . 75(1) :71-80 (prolactma) ; patente US 5,571,89-éf (lactoferrma) ; Pennica y colaboradores (1983) Nature 301(5897): 214-221 (activador del plasminógeno de tejidos); Sarafanov y colaboradores (1995) Mol . Biol . 29:161-165, cuyo contenido sé incorpora en la presente por referencia. Células Receptoras Puede usarse cualquier célula enucleada funcionalmente w^ que puede sustentar el desarrollo a una etapa posterior. Son particularmente preferidos los oocitos. Oocitos Los oocitos que pueden usarse para hacer un embrión reconstruido incluyen oocitos en la etapa de metafase II, v.gr. oocitos detenidos en la metafase II, y telofase II. Los oocitos en la metafase II contienen un cuerpo polar, mientras que los 5 oocitos en telofase pueden ser identificados con base en la presencia de una protuberancia de la membrana de plasma del segundo cuerpo polar hasta la formación de un segundo cuerpo polar. En adición, los oocitos en la metafase II pueden ser distinguidos de los oocitos en la telofase II con base en Í " distinciones bioquímicas y/o del desarrollo. Por ejemplo, los oocitos en la metafase II pueden estar en un estado detenido, mientras que los oocitos en la telofase están en un estado activado. De preferencia, el oocito es un oocito caprino. Otras fuentes preferidas de oocitos incluyen oveja, vaca, cerdo, llama, 5 camello, conejo y ratón.
Los oocitos pueden ser obtenidos en diversos momentos durante el ciclo reproductivo de un mamífero. Por ejemplo, e momentos dados durante el ciclo reproductivo, un porcentaje considerable de los oocitos, v.gr., alrededor de 55, 60, 65, 70, 75, 80% o mas, son oocitos en telofase. En adición, oocitos en diversas etapas del ciclo celular pueden obtenerse y luego inducirse in vi tro a entrar a una etapa particular de meiosis. Por ejemplo, los oocitos cultivados en medio agotado en suero se tornan detenidos en la metafase. Además, los oocitos detenidos
10 pueden ser inducidos a entrar en la telofase por activación- mediante suero. De esta manera, los oocitos en la telofase pueden ser fácilmente obtenidos para uso en la invención. ! Los oocitos pueden ser madurados ín vi tro antes de que sean usados para formar un embrión reconstruido. Este proceso,
15 requiere habitualmente de recolectar oocitos de ovarios de mamífero, y madurar el oocito en un medio antes de enucleación hasta que el oocito alcance la etapa meiótica deseada, v.gr., metafase o telofase. Además, los oocitos que han sido madurados in vivo pueden ser usados para formar un embrión reconstruido. Los oocitos pueden ser recolectados de un mamífero hembra durante la super-ovulación. Brevemente, los oocitos pueden ser recuperados quirúrgicamente vaciando con un líquido con oocitos del oviducto de la hembra donadora. Son conocidos los métodos de inducir super-ovulación y la recolección de
De preferencia, la etapa mitótica del oocito, v.gr metafase II o telofase II, se correlaciona con la etapa del cic celular de la célula somática donadora. La correlación entre ¡r etapa meiótica del oocito y la etapa mitótica del ciclo celular de la célula somática donadora es referida en la presente como "sincronización". Por ejemplo, la reconstrucción de un oocito en la metafase II por introducción de un núcleo de una célula , *
F somática en G0 o Gl f v.gr., por activación y fusión simultáneas, -^ puede imitar los eventos que ocurren durante la fertilización.
10 A guisa de otro ejemplo, un oocito en telofase fusionado, v.gr., por activación o fusión simultáneas, con el genoma de una célula- somática en Gx antes del inicio, provee una sincronización entr<S
** •' el oocito y el núcleo donador. Enucleación Funcional 15 El oocito donador debe ser funcionalmente enucleado tal . que el genoma endógeno del oocito sea incapaz de funcionar, v.gr., replicando o sintetizando ADN. Métodos de enuclear funcionalmente un oocito incluyen: remover el genoma del oocito (es decir, enucleación) ; inactivar ADN dentro del oocito, v.gr., por irradiación (v.gr., por irradiación con rayos X, o irradia ción láser); inactivación química, o similares. Enucleación Un método de hacer que el genoma de un oocito sea - incapaz de funcionar es el de remover el genoma del oocito (es *
25 decir, enucleación) . Una micro-pipeta o una aguja puede
»»rjv.
-39- insertarse en la capa externa del óvulo a fin de remover material nuclear de un oocito. Por ejemplo, los oocitos de la etapa de metafase II que tienen un cuerpo polar pueden ser enucleadoé mediante una micro-pipeta aspirando el primer cuerpo polar y el citoplasma adyacente que rodea al cuerpo polar, v.gr., aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60% del citoplasma, que presumiblemente contiene la placa de metafase. Los oocitos de la etapa dé
^^* telofase que tienen dos cuerpos polares pueden ser enucleados con una micro-pipeta o una aguja, removiendo el segundo cuerpo polar
10 y el citoplasma circundante, v.gr., aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60% del citoplasma. Específicamente, los oocitos en la etapa de telofase pueden ser enucleados en cualquier punto a
*tH -- partir de la presencia de una protuberancia en la membrana de plasma a partir del segundo cuerpo polar hasta la formación del
15 segundo cuerpo polar. De esta manera, como se usa en la presente, los oocitos que muestran una protuberancia en la membrana de plasma, habitualmente con un husillo en tope, hasta la extrusión del segundo cuerpo polar, son considerados ser oocitos en telofase. De manera alternativa, los oocitos que
^^l tienen un cuerpo polar claro y distinto sin evidencia de protuberancia son considerados ser oocitos en metafase. Irradiación El oocito puede ser funcionalmente enucleado mactivan- do el ADN endógeno del oocito usando irradiación. Los métodos de
25 usar irradiación son conocidos en la materia y descritos, por
ejemplo, en Bradshaw y colaboradores (1995), Molecul . Dev. 41; 503-512, cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia . Inactivación Química El oocito puede ser enucleado funcionalmente inactivan- do químicamente el ADN endógeno del oocito. Los métodos de inactivar químicamente el ADN son conocidos en la materia. Por ejemplo, la inactivación química puede ser llevada a cabo usando el método de etopsoide-cicloheximida, como se describe en Fulkaj - y Moore (1993) Molecul . Reprod . Dev. 34:427-430, cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia. Introducción de un Genoma Cromosomal Funcional en un Oocito Los métodos descritos en la presente pueden incluir la introducción de un genoma cromosomal funcional en un oocito, v.gr., un oocito enucleado funcionalmente, v.gr., un oocitó enucleado, para formar un embrión reconstruido. El genoma cromosomal funcional dirige el desarrollo de un animal clonado o transgénico que surge del embrión reconstruido. Pueden usarse los métodos que dan como resultado la transferencia de un genoma cromosomal esencialmente intacto al oocito. Ejemplos incluyen fusión de una célula que contiene el genoma cromosomal funcional con el oocito e inyección nuclear, es decir transferencia directa del núcleo hacia el oocito. Fusión La fusión de la célula somática con un oocito puede ser
llevada a cabo, por ejemplo, mediante electrofusión, fusión viral, fusión con reactivo bioquímico (v.gr., proteína HA), o fusión química (v.gr., con polietilén glicol (PEG) o etanol) . La fusión de la célula somática con el oocito y la- activación pueden llevarse a cabo de manera simultánea. Por ejemplo, el núcleo de la célula somática puede ser deposita dentro de la capa del óvulo, que contiene el oocito. Los pasos de fusionar el núcleo con el oocito y la activación pueden entonces llevarse a cabo de manera simultánea, por ejemplo
10 aplicando un campo eléctrico. La fusión de la célula somática con un oocito también puede llevarse a cabo antes o después de la, activación del oocito. • Activación de un Embrión Recombinante La activación se refiere al inicio del desarrollo
15 embriónico, v.gr., replicación y síntesis de ADN. La activación puede ser inducida, por ejemplo, mediante choque eléctrico (v.gr., en electrofusión), el uso de ionoforas, activación por etanol, o el oocito puede ser obtenido durante una etapa en la cual esté naturalmente activado, v.gr., un oocito en telofase. Electrofusión ^ JAP Un embrión reconstruido puede ser activado usando choque eléctrico, es decir electrofusión. El uso de electrofusión permite que la fusión de la célula somática con el oocito y la activación sean llevadas a cabo de manera simultánea. 25 Cámaras, tales como el sistema de manipulación de
embriones BTX 200, para llevar a cabo electrofusión, está comercialmente disponibles de, por ejemplo, BTX de San Diego, California, Estados Unidos. Ionoforas En adición, el embrión reconstruido puede ser activado, mediante activación de ionoforas . Usando una ionofora, v.gr., una ionofora de calcio, se cambia la concentración de calcio a través de la membrana del embrión reconstruido. Al incrementars la concentración de calcio libre en la célula, hay una reducción en la fosforilación de proteínas intra-celulares y se activa el Oocito. Tales métodos de activación son descritos, por ejemplo, . en la patente US 5,496,720, cuyo contenido es incorporado por referencia. Activación por Etanol ' Antes de la enucleación, un oocito, v.gr., un oocíto en metafase II, puede ser activado con etanol de acuerdo con el tratamiento de activación por etanol descrito en Presicce y Yang ' (1994), Mol . Reprod . Dev. 37:61-68, y Bordignon y Smith (1998) Mol . Reprod . Dev. 49:29-36, cuyo contenido es incorporado en l presente por referencia. Oocitos en Telofase Los oocitos en telofase generalmente ya están activados. De esta manera, estas células exhiben a menudo naturalmente reducción en la concentración de calcio que impide la fertiliza-,
25 ción y permite al embrión desarrollarse.
Células Extra-Embriónicas En una forma de realización preferida, la célula extra-v "*^ embriónica es una que se añade exógenamente al embrión. Una* célula extra-embriónica se refiere a una célula que no se desarrolla en el embrión (es decir, el embrión propiamente) sino mas bien un tejido de soporte tal como la placenta. Por ejemplo, las células de trofectoderma son células extra-embriónicas qué contribuyen al desarrollo de la placenta. De preferencia, la célula extra-embriónica es una célula que tiene un grado de 10 repetición del número básico de cromosomas de mas de dos, v.gr., una célula tetraploide. La célula extra-embriónica puede ser * derivada de un embrión u oocito, v.gr., una célula teniendo un ^ ^ grado de repetición del número básico de cromosomas de mas de 2 derivada de un embrión u oocito. 15 Tetraploidización Un embrión tetraploide puede ser generado usando embriones pre-implantación, de preferencia pero no necesariamente en la etapa de dos células, sometiendo estos embriones a un procedimiento de tetraploidización. El término "embrión*
~A tetraploide" se refiere a un oocito activado que ha sido sometido a un procedimiento de tetraploidización. La tetraploidización puede ser lograda por medios físicos, químicos o eléctricos. La tetraploidización es usada para generar células embriónicas que tienen el doble del complemento genético de una célula normal.
25 Por ejemplo, un embrión de la etapa de dos células puede ser
-44- inducido, v.gr., usando fusión eléctrica, para recrear un embrión de una célula en el cual el complemento genético es 4N en vez de 2N, como se observa en embriones de la etapa de dos manipular . Puede usarse electrofusión para generar un embrión tetraploide. Por ejemplo, un embrión, v.gr., un embrión de la etapa de dos células, puede exponerse a pulsos de campo eléctrico que ocasionan degradación de la membrana celular y fusión celular para producir un embrión tetraploide, v.gr., para producir un
10 embrión tetraploide de una célula a partir de un embrión de la etapa de dos células. Los métodos de tetraploidización por medios eléctricos pueden ser llevados a cabo como se describe,
por ejemplo, en James y colaboradores (1995) Dev. Biol . 167:213- 226; Prather y colaboradores (1996) Mol . Reprod . & Develop . 45:
15 38-42; Duncan y colaboradores (1997) Development 124 : 279-287, que se incorporan en la presente por referencia. Los embriones tetraploides pueden también ser generados usando medios químicos. Por ejemplo, puede usarse citochalasina B (Sigma, St . Louis, Missouri, Estados Unidos) para generar un
JA embrión tetraploide. Tales métodos son descritos, por ejemplo, en Koizumi y colaboradores (1995) Exp . Ani . 44 (2) : 105-109; Koizumi y colaboradores (1996) Exp . Anim . 45 (2) : 179-181 , cuyo contenido se incorpora por referencia. Después del procedimiento de tetraploidización, el
25 embrión tetraploide puede ser cultivado a al menos la etapa de
una célula hasta la etapa de blastocisto. El embrión tetraploide puede entonces ser tratado con medios químicos, biológicos o físicos para remover la capa externa del óvulo, y las células tetraploides son agregadas, lo que se refiere en la presente como "agregación tetraploide", a la(s) célula (s) del embrión reconstruido. El embrión reconstruido puede estar en cualquier etapa de la etapa de una célula hasta la etapa de blastocisto. El . embrión tetraploide al cual se agrega (o añade) el embrión clonado puede también estar en cualquier etapa de la etapa de una iu célula a la etapa de blastocisto. El embrión tetraploide y el embrión clonado no necesitan estar en la misma etapa de desarrollo. Tales procedimientos pueden también ser llevados a cabo agregando células madre embriónicas, tetraploides a un embrión clonado en cualquier etapa de desarrollo. 15 El agregado tetraploide/embrión clonado resultante, también referido en la presente como "pareja", puede entonces cultivarse in vi tro hasta la etapa de blastocisto o puede ser transferido de inmediato a una receptora pseudo-preñada. La pareja resultante también puede ser cultivada in vivo en una"
2A receptora intermedia antes de transferencia a una receptora pseudo-preñada . Transferencia de Embriones Reconstruidos Un embrión reconstruido puede ser transferido a un receptor y permitido desarrollarse en un mamífero clonado o
25 transgénico. Por ejemplo, el embrión reconstruido puede ser
transferido vía la fimbria1 al lumen oviductal de cada receptor, como se describe mas adelante en los ejemplos. Además, son conocidos en la materia métodos de transferir un embrión a un mamífero receptor y se describen, por ejemplo, en Ebert y colaboradores (1994) Bio/Technology 12:699. El embrión reconstruido puede ser mantenido en cultivo hasta al menos el primer corte (etapa de dos células) hasta la wKt" etapa de blastocisto, de preferencia los embriones siendo transferidos en la etapa de dos o cuatro células. Se conocen en
10 la materia diversos medios de cultivo para desarrollo de embriones. Por ejemplo, el embrión reconstruido puede ser co- cultivado con mono-capa de células epiteliales, oviductal, f*-' derivada del tipo de mamífero a proveerse mediante la invención. Purificación de Proteínas a partir de la Leche 15 La proteína de fusión transgénica se puede producir en la leche a concentraciones relativamente altas y en volúmenes grandes, proporcionando una producción a alto nivel continuo de péptido procesado normalmente que es fácilmente cosechado de un recurso renovable. Hay varios métodos diferentes conocidos en la !A materia para el aislamiento de proteínas a partir de leche. Las proteínas de la leche usualmente se aislan mediante una combinación de procesos. La leche bronca primero se fracciona para remover las grasas, por ejemplo, mediante formación de nata, centrifugación, sedimentación (H.E. Swaisgood, 5 Developments in Dairy Chemistry, I : Chemistry of Milk Protein,
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-47- ' t' " Applied Science Publ?she¿ , New York, 1982) , la precipitación acida (patente US 4,644,056) o coagulación enzimática con renma o quimiotripsma (Swaisgood, íbid . ) . Enseguida, las principal j- proteínas de leche se pueden fracci clara o un precipitado en volumen purificar fácilmente la proteína de interés específica. La patente FR 2487642 describe el aislamiento de TBR' proteínas de leche a partir de leche descremada o suero de leché mediante ultra- filtración en membrana en combinación con 0 cromatografía por exclusión o cromatografía por intercambio de iones. El suero de leche es primero producido removiendo la
(.» caseína por coagulación con cuajo o ácido láctico. La patente US • 4,485,040 describe el aislamiento de un producto enriquecido en a-lactoglobulma en el cuajado del suero de leche mediante dos 5 pasos de ultra-fíltración secuenciales . La patente US 4,644,056 provee un método para purificar mmunoglobulma a partir de leche o calostro por precipitación acida a pH de 4.0-5.5, y filtración secuencial en flujo cruzado, primero sobre una membrana con un tamaño de poro de 0.1 a 1.2 mieras, para aclarar el conjunto del A producto, y luego sobre una membrana con un límite de separación de 5 a 80 kd para concentrarla. De manera similar, la patente US 4,897,465 enseña la concentración y el enriquecimiento de una proteína tal como mmunoglobulma a partir de suero de sangre, yemas de huevo O 5 suero de leche, mediante ultra-f ltración secuencial sobre
, Í '
-48- membranas de óxido metálico con un desplazamiento del pH. La filtración es llevada a cabo primero a un pH por debajo del punto isoeléctrico (pl) de la proteína selecta para remover Jos contaminantes a granel del cuajado de proteína, y luego a sobre el pl de la proteína selecta para retener impurezas y la proteína selecta al permeado. Un método diferente de concentración por filtración es enseñado por la patente EP 0 467
482 Bl, en la cual leche descremada, desgrasada, es reducida a un pH de 3 a 4, por debajo del pl de las proteínas de leche, para -,*! solubilizar tanto caseína como proteínas de suero de leche. Tres rondas sucesivas de ultra-filtración o diafíltración concentran entonces las proteínas para formar un cuajado que contiene 15-20%
TmW'"3 de sólidos, de los cuales 90% es proteína. De manera alternativa, la solicitud de patente UK 2179947 divulga el aislamiento dé 'ÍS lactoferrina a partir de suero de leche por ultra-filtración para concentrar la muestra, seguido por cromatografía por intercambio débil de cationes a un pH aproximadamente neutro. No se reporta ninguna medida de pureza. En la publicación internacional WO 95/22258, una proteína tal como lactoferrina es recuperada de 20^ ' leche que ha sido ajustada a una concentración iónica elevada por adición de sal concentrada, seguida por cromatografía por intercambio de cationes. En todos estos métodos, la leche o una fracción de la misma es primero tratada para remover grasas, lípidos y otra
25 materia en partículas que taparía las membranas de filtración o
los medios de cromatografía. Las fracciones iniciales producidas de esta manera pueden consistir en caseína, suero de leche, -© t Í ~ proteína total de leche, de las cuales se aisla entonces *1- proteína de interés. La publicación internacional WO 94/19935 divulga un método de aislar una proteína biológicamente activa de leche entera, estabilizando la solubilidad de las proteínas totales de leche con un agente de carga positiva tal como arg ma, imidazola o Bis-Tps. Este tratamiento forma una solución
10 aclarada de la cual puede aislarse la proteína, v.gr., por filtración a través de membranas que de otra manera se taparían por las proteínas precipitadas. La solicitud de patente US 08/648,235 divulga un método para aislar un componente soluble de la leche, tal como un
15 péptido, en su forma biológicamente activa, a partir de leche entera o una fracción de leche, mediante filtración por flujo tangencial. A diferencia de métodos de aislamiento previos, esto elimina la necesidad de un primer fraccionamiento de la leché entera para remover grasa y micelios de caseína, con ello
2ü simplificando el proceso y evitando pérdidas de recuperación y
^ bioactividad. Este método puede ser usado en combinación con pasos de purificación adicionales para remover adicionalmente contaminantes y purificar el producto, v.gr., proteína, de interés . 5 El contenido de todas las referencias citadas (ínclu-
yendo referencias de la literatura, patentes concedidas, solicitudes de patente publicadas, y solicitudes de patente pendientes) citadas a través de la esta solicitud, es incorpoado , < en la presente por referencia. *
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