PT1159415E - Modificação genética de células somáticas e suas utilizações - Google Patents

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Angelika Elisabeth Schnieke
Alexander Jarvis Kind
David Lee Ayares
Yifan Dai
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Description

DESCRIÇÃO "MODIFICAÇÃO GENÉTICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS E SUAS UTILIZAÇÕES"
Esta invenção descreve a produção de animais geneticamente modificados, nos quais as modificações genéticas são manipuladas em células somáticas cultivadas in vitro utilizando a técnica de direccionamento génico. As células geneticamente modificadas são, depois, utilizadas como dadores nucleares para produzir, inter alia, animais vivos.
Os métodos descritos podem ser, também, utilizados para validar loci nos cromossomas animais que são locais adequados para adição de transgenes às células. 0 método é particularmente útil para células que se requer que não tenham qualquer efeito prejudicial imprevisto, tal como células destinadas para transplantação autóloga. A técnica de transferência nuclear permite a produção de descendência pela reconstrução de um embrião prematuro. 0 material genético de uma célula dadora ou carioplasto é transferido para uma célula receptora adequada, da qual o material genético nuclear ou genómico foi removido. Nas primeiras demonstrações desta técnica, o desenvolvimento bem sucedido só foi obtido quando o material genético dador foi retirado de blastómeros de embriões prematuros. Subsequentemente, o desenvolvimento foi obtido utilizando material genético dador de células diferenciadas mantidas em cultura e isoladas de tecidos embrionários (Campbell et al., Nature 380, 64-66, 1996), fetais e adultos (Wilmut et al., 1
Nature 385, 810-813, 1997); estes relatos formam a base dos pedidos de patente WO 97/07669 e WO 97/07668 que são incorporados no presente pedido na sua totalidade, incluindo todas as tabelas e diagramas.
Os métodos de transferência nuclear foram, também, descritos nos pedidos de patente publicados W098/39416, WO98/30683, WO98/07841, WO97/37009, W098/27214, WO99/01163 e WO99/01164 .
Foi obtida descendência viva no murganho utilizando
populações de células quiescentes derivadas directamente ex vivo como dadoras (Wakayama et ai., Nature 394, 369-373 1998). A utilização bem sucedida de células diferenciadas foi, também, demonstrada em ovelhas (Wilmut et al., Nature 385, 810-813, 1997), gado vacum (Kato et al., Science 282, 2095-2098, 1998;
Wells, et al., Theriogenology 1, 217, 1999; Zakhartchenko, et al., Theriogenology 1, 218, 1999; Vignon, et al.,
Theriogenology 1, 216, 1999) e murganhos (Wakayama et al.,
Nature 394, 369-373) .
Em todas as referências citadas anteriormente, o dador nuclear e a célula receptora são retiradas da mesma espécie. Contudo, foi referido sucesso no alcance de desenvolvimento a partir de embriões reconstruídos utilizando células nucleares de dador e receptor de espécies diferentes (Dominko, et al.,
Theriogenology 49, 385, 1998; Mitalipova, et al., Theriogenology 49, 389, 1998). A utilização da tecnologia de transferência nuclear tem muitas utilizações e benefícios provados e potenciais na 2 produção de embriões, fetos e descendência de mamíferos. Estes incluem mas não estão limitados a; 1. A capacidade de efectuar modificação genética de células cultivadas a serem utilizadas como dadores nucleares, antes da reconstrução do embrião. 2. A capacidade de efectuar múltiplas modificações genéticas num único animal por múltiplas modificações genéticas de uma população celular em cultura ou por modificação genética sequencial, transferência nuclear e re-isolamento de uma população celular a partir de um embrião, feto ou animal assim produzido. 3. A capacidade de aumentar a esperança de vida de populações celulares cultivadas a serem utilizadas para modificação genética por transferência nuclear e re-isolamento de uma população celular do embrião, feto ou animal adulto assim produzido. 4. A capacidade de produzir múltiplas cópias de um animal a partir de uma população celular geneticamente modificada, seleccionada ou clonada. 5. A capacidade de produzir múltiplas cópias de qualquer embrião, feto ou animal adulto por transferência nuclear de células retiradas directamente ex vivo ou populações celulares derivadas de quaisquer tecidos retirados de quaisquer destes estádios, com ou sem cultura in vitro. 6. A capacidade de produzir clones verdadeiros (que partilham não apenas a identidade genética nuclear mas, também, a identidade genética mitocondrial) por utilização de oócitos da linha materna do dador celular como receptores de citoplasto para reconstrução de embrião. 7. A capacidade de armazenar genomas intactos durante longos períodos (e. g., por congelamento de populações 3 celulares em N2 líquido) e utilizar subsequentemente, estas células armazenadas para a produção de descendência por transferência nuclear. 8. A capacidade de desdiferenciar núcleos somáticos e produzir células indiferenciadas que podem ser utilizadas para produzir embriões, fetos e animais adultos quiméricos por agregação ou injecção de embriões. Isto pode ser, também, utilizado para produzir populações de células estaminais ou embrionárias ou populações de células germinativas embrionárias. 9. A capacidade de desdiferenciar qualquer tipo de célula somática por transferência nuclear e isolar a partir do embrião assim produzido, células estaminais embrionárias ou qualquer outro tipo de célula especializada ou não especializada desejada, e. g., neurónios. 10. A possibilidade de se obter qualquer dos objectivos delineados em 1 a 9, por utilização de células nucleares de dador e receptor de espécies diferentes.
Este processo pode ser combinado com técnicas de manipulação genética para a produção de descendência transgénica (Schnieke et ai., Science 278, 2130-2133, 1997). A utilização de transferência nuclear combinada com modificação genética de células em cultura e a sua selecção antes da produção animal tem um determinado número de vantagens provadas, incluindo; 1. Produção de animais não-mosaico, garantindo transmissão de linha germinativa da(s) modificação (modificações) genética(s) (Schnieke et al., Supra). 2. Uma eficiência aumentada na produção de tais animais geneticamente modificados (Schnieke et al., Supra). 4 3. A produção de múltiplas cópias da descendência reduzindo-se, desse modo, o intervalo de geração para produzir rebanhos ou manadas de animais comercialmente importantes ou aumentando-se o número de animais para disseminação da modificação genética dentro de uma população como um todo (Cibelli, et al.r Nat. Biotechnol. 16, 642-6, 1998) . A tecnologia de transferência nuclear existente e publicada, combinada com a modificação genética de células em cultura, proporciona animais contendo modificações genéticas simples e múltiplas, onde os transgenes são incorporados em locais não seleccionados dentro do genoma hospedeiro. Contudo, a produção de células cultivadas que incorporam uma modificação genética desejada manipulada, numa localização exacta e predeterminada no genoma hospedeiro (direccionamento génico), foi apenas anteriormente descrita na técnica, para o murganho, utilizando células ES e os métodos publicados não envolvem a tecnologia de transferência nuclear. Não existem tais métodos equivalentes para outros animais. Tais modificações poderiam ter um determinado número de vantagens quando aplicadas a uma variedade de espécies animais, incluindo gado vacum, ovelhas, cabras, cavalos, camelos, coelhos e roedores. Tais vantagens incluem mas não estão limitadas a: 1. Produção de animais transgénicos com características superiores de expressão transgénica por colocação do transgene num local predeterminado. 2. Remoção, modificação, inactivação ou substituição de um gene ou genes endógenos escolhidos e/ou as suas sequências de controlo. 5 3. Se se verificar que tais modificações não contêm qualquer efeito prejudicial imprevisto no animal resultante que possa ser atribuído a, por exemplo, disrupção de genes endógenos, activação de oncogenes, etc., isto constituiria validação do lócus escolhido como um local preferido para modificação genética, particularmente se o lócus conferisse, também, boa expressão de transgenes colocados no lócus. É um objectivo desta descrição de patente rectificar esta situação e descrever, pela primeira vez, métodos que podem ser utilizados para produzir tais células modificadas que podem ser, depois, opcionalmente utilizadas para preparar, inter alia, animais completos por transferência nuclear. Estes métodos (e outros) podem ser, também, utilizados para identificar loci cromossómicos específicos como alvos preferidos para adição de transgenes, como parte do processo da terapia génica ex vivo. A presente invenção proporciona, de acordo com um primeiro aspecto, um método de transferência nuclear compreendendo: (a) preparação de uma célula somática não humana para transferência nuclear por um método compreendendo modificação do material genético das células somáticas não humanas por um evento de direccionamento genético num lócus endógeno; e (b) transferência do material genético da célula somática não humana para uma célula receptora não humana. De um modo preferido, a célula somática não humana é uma célula somática primária. De um modo preferido, a célula somática é uma célula somática de um animal vertebrado. De um modo preferido, a célula não é uma célula imortalizada. Tradicionalmente, as células podem ser definidas como "somáticas" ou de "linha germinativa". Algumas células, e. g., células ES, podem não se incluir facilmente em qualquer 6 destas duas categorias tradicionais, em virtude de serem derivadas de embriões, antes que as linhagens somáticas ou germinativas possam ser distinguidas. 0 seu equivalente funcional, as células EG (germinativas embrionárias) são mais facilmente definidas como células de "linha germinativa", em virtude de serem derivadas de células germinativas primordiais. No presente texto, o termo "somático" não abrange células ES ou EG. A utilização deste método não está restringida a um tipo particular de célula dadora. As células adequadas incluem células embrionárias, fetais e somáticas adultas (de cariótipo normal). Neste texto, uma célula "adulta" ou um animal "adulto" é uma célula ou animal que nasceu. Deste modo, um animal e as suas células são considerados "adultos" desde o nascimento. Tais animais adultos, de facto, abrangem animais do nascimento em diante e, deste modo, incluem "bebés" e "juvenis". A invenção inclui a utilização de células estaminais somáticas, e. g., indiferenciadas, tal como células estaminais hematopoiéticas, pelo menos células parcialmente diferenciadas e totalmente diferenciadas. Exemplos de células parcialmente diferenciadas incluem células de linhagem embrionária ou células precursoras (e. g., células precursoras neurais). São preferidas as células somáticas adequadas de acordo com o primeiro aspecto da invenção mas, não necessariamente, em cultura. As células somáticas adequadas incluem fibroblastos, células epiteliais, células endoteliais, células neurais, queratinócitos, células hematopoiéticas, melanócitos, condrócitos, linfócitos (B e T), eritrócitos de aves, macrófagos, monócitos, células mononucleares, células musculares cardíacas, outras células musculares, células da granulosa, 7 células do cúmulo e células da epiderme. As células para o método do primeiro aspecto da invenção podem ser obtidas a partir de uma variedade de diferentes órgãos, tais como pele, mesênquima, pulmão, pâncreas, coração, intestino, estômago, bexiga, vasos sanguíneos principais do rim, uretra, órgãos reprodutivos, etc., ou uma preparação desagregada da totalidade ou parte de um feto ou embrião.
As células adequadas podem ser obtidas ou derivadas de qualquer animal não humano, incluindo aves, tais como aves domésticas, espécies de anfíbios e espécies de peixes. Na prática, contudo, são os animais mamíferos que são considerados como tendo maior vantagem comercial. Um animal preferido, do qual a célula somática é obtida, é um ungulado, seleccionado de bovídeo, ovídeo, cervídeo, suídeo, equídeo ou camelídeo. Em particular, o ungulado é uma vaca ou touro, ovelha, cabra, bisão, búfalo da índia ou porco. São, também, contempladas pela presente invenção células somáticas obtidas ou derivadas de cavalo, camelo, roedor (e. g., rato, murganhos) ou um lagomorfo (e. g., coelho).
As fontes adequadas para células receptoras não humanas no processo de transferência nuclear não são limitantes. A célula receptora é, de um modo preferido, um oócito não humano, um zigoto fertilizado não humano ou um embrião de duas células não humano, tendo todos eles sido enucleados. 0 evento de direccionamento genético pode ser qualquer um que permita modificação do material genético da célula somática num local predeterminado. Tal evento de direccionamento genético inclui inactivação, remoção ou modificação de material genético: regulação positiva da função de material genético; substituição de material genético; e introdução de material genético. 0 material genético compreende, em particular, um gene ou uma sua parte ou uma região que influencia a expressão de um gene ou genes. Consequentemente, os eventos de direccionamento genético podem incluir inactivação, remoção ou modificação de um gene, regulação positiva de um gene, substituição de gene ou substituição de transgene num lócus.
De um modo preferido, o evento de direccionamento genético ocorre por recombinação homóloga.
De um modo preferido, a derivação de clones celulares de direccionamento génico ocorre com elevada eficiência. De acordo com este aspecto da invenção, elevada eficiência é definida como a proporção de direccionamento génico:clones celulares transfectados aleatoriamente dentro da mesma população celular seleccionada que é igual ou superior a 1:100.
Os detalhes exactos de direccionamento genético podem ser variados para melhorar a eficiência. De acordo com a variedade de modificações, o direccionamento genético de uma célula somática adequada para transferência nuclear pode ser manipulado para maximizar a frequência de direccionamento homólogo. Um factor que pode ser utilizado para aumentar o direccionamento genético por recombinação homóloga é o efeito de transcrição sobre o material genético alvo. De um modo preferido, o direccionamento genético é activamente transcrito ou é adjacente a um lócus genético que é activamente transcrito. Tais alvos genéticos ou loci podem ser identificados, dependendo do tipo de célula somática utilizada e, também, possivelmente, do estádio de uma tal célula. Tais genes podem ser identificados com base na abundância das moléculas de ARNm correspondentes. Genes 9 adequados produziriam ARNm que se incluem na arbitrariamente definida classe intermédia ou abundante de ARNm que estão presentes em 300 ou mais cópias de cada molécula por célula (Alberts et al. 1994, Molecular Biology of the Céu, Garland Publishing, Nova Iorque e Londres). Um exemplo de um direccionamento génico adequado em fibroblastos é qualquer gene ou lócus codificando colagénio, em particular os loci génicos C0LIA1 ou C0LIA2. Contudo, muitos loci adequados estão presentes no material genético de uma célula, tais como genes da proteína do leite, por exemplo, em células epiteliais mamárias; imunoglobulinas em linfócitos; HS e transferrina em células do figado; e colagénio de tipo VII em queratinócitos.
De acordo com este aspecto da invenção, podem ser utilizados meios eficientes de transfecção que maximizem o número de clones de células derivadas que foram submetidas a um evento de direccionamento génico. Por exemplo, podem ser utilizados reagentes de transfecção mediada por lipidos, e. g., "LipofectaAMINE" (Gibco/Life Sciences) ou "GenePorter" (Gene Therapy Systems).
Alternativamente ou adicionalmente, regiões longas de homologia para o lócus alvo podem ser incluídas no vector de direccionamento génico. 0 comprimento total de homologia presente no vector de direccionamento é, de um modo preferido, superior a 7 kb.
Alternativamente ou adicionalmente, pode ser utilizado ADN de vector de direccionamento não linear, i. e., ADN que não foi linearizado por clivagem de enzima de restrição. Nesta forma de realização da invenção, o ADN transfectado está, 10 predominantemente, numa forma circular que pode ser substancialmente superenrolada ou substancialmente relaxada.
As caracteristicas anteriores dos métodos de transfecção podem ser utilizadas isoladamente ou em combinação entre si.
Uma estratégia particularmente útil para aumentar o direccionamento genético é a indução artificial de expressão génica ou indução de alterações de cromatina num tipo de célula somática. De um modo preferido, o evento de direccionamento genético é facilitado por um agente que inibe a desacetilação de histona ou por um factor que estimula a transcrição no lócus alvo. 0 factor pode ser expresso na célula hospedeira. Esta estratégia é descrita em maior detalhe no restante texto.
De acordo com o direccionamento genético da presente invenção, pode ser útil ou necessário, em algum ponto após o evento e, de um modo preferido, antes de qualquer transferência nuclear, remover porções de material genético da célula. Tal material pode ser um marcador seleccionável ou, por exemplo, um activador de transcrição genética introduzido. Tal remoção pode ser efectuada por processos descritos a seguir ou por outros processos bem conhecidos na técnica. A preparação da célula somática (por modificação do material genético da célula) pode ser uma etapa precursora para transferência nuclear. A presente invenção proporciona, pela primeira vez, um método pelo qual uma célula somática pode ser geneticamente modificada e que suporta, também, com sucesso a transferência nuclear. 0 suporte bem sucedido de transferência nuclear requer que o embrião reconstituído continue a produzir um animal viável nascido vivo ou um embrião ou feto que pode ser 11 utilizado como uma fonte de tecido, incluindo células EG e células ES. 0 método de transferência nuclear para a presente invenção não é limitado. Pode ser utilizado qualquer método de transferência nuclear. A transferência nuclear pode incluir material genético de uma espécie animal ou um tipo de animal para uma célula receptora da mesma ou diferente espécie ou tipo de animal.
As células receptoras podem ser qualquer célula receptora adequada para qualquer método de transferência nuclear, incluindo um oócito, um zigoto fertilizado ou um embrião de duas células que foi enucleado. A transferência do material genético de uma célula somática para uma célula receptora proporciona um embrião animal (o embrião animal compreende o resultado de célula simples da transferência nuclear para qualquer e todos os estádios multicélula). 0 método da invenção pode compreender, também, a produção de células totipotentes ou pluripotentes clonadas a partir de um embrião ou feto derivado por transferência nuclear. Os métodos para a derivação de células totipotentes ou pluripotentes, tal como células estaminais, a partir de embriões (células ES e células semelhantes a ES) e a partir de células germinativas primordiais de embriões e fetos de estádio tardio (células EG) foram descritos por muitos autores, como citado no final deste texto. Células estaminais pluripotentes são particularmente úteis para produção de células diferenciadas e seus precursores 12 in vitro, o que pode proporcionar uma fonte de células para transplantação (de um modo preferido, para humanos).
As células (incluindo células somáticas) derivadas de embriões ou fetos (ou adultos) podem ser, também, utilizadas para ciclos adicionais de transferência nuclear. A rederivação das células de um embrião ou feto produzido por transferência nuclear pode facilitar manipulações genéticas múltiplas ou sequenciais que, de outro modo, não são possíveis nas células primárias iniciais.
Alternativamente, o método de obtenção de um embrião animal de acordo com a invenção pode compreender, adicionalmente, fazer com que um animal se desenvolva até ao fim do tempo a partir do embrião. Num tal método, o embrião animal é, de um modo preferido, desenvolvido até ao fim do tempo. Se o desenvolvimento até ao blastocisto tiver ocorrido in vitro, então a transferência para dentro de um animal substituto ocorre neste estado. Se o desenvolvimento de blastocisto tiver ocorrido in vivo, apesar de, em princípio, o blastocisto poder ser deixado desenvolver-se até ao fim do tempo no hospedeiro de pré-blastocisto, na prática o blastocisto será habitualmente deslocado do receptor de pré-blastocisto temporário e, após dissecação do meio protector, será transferido para o receptor de pós-blastocisto permanente. 0 desenvolvimento do embrião num adulto passa pelo estádio de um feto.
Um segundo aspecto da invenção proporciona um embrião ou feto transgénico obtido por um método de acordo com a invenção. As características preferidas do primeiro aspecto aplicam-se, também, ao segundo aspecto. 13
Um terceiro aspecto da invenção proporciona um método para a preparação de um animal transgénico compreendendo fazer com que um animal não humano se desenvolva até ao fim do tempo, a partir de um embrião ou feto não humano de acordo com o segundo aspecto da invenção. Opcionalmente, o animal não humano transgénico do terceiro aspecto pode ser reproduzido e tal descendência (incluindo embriões, fetos ou adultos) é também abrangida pela presente invenção. As caracteristicas preferidas do primeiro e segundo aspectos aplicam-se, também, ao terceiro aspecto.
Um quarto aspecto da invenção proporciona um animal transgénico ou a sua descendência, de acordo com o terceiro aspecto da invenção. As caracteristicas preferidas do primeiro ao terceiro aspectos aplicam-se, também, ao quarto aspecto.
Os métodos de transferência nuclear da presente invenção abrangem mas não estão limitados a um método de dupla transferência nuclear. Um tal método, assim como detalhes de métodos de transferência nuclear de etapa única, é descrito no documento WO 0042174 e é descrito abaixo. A invenção não se refere à clonagem reprodutiva humana.
Deste modo, "célula receptora", "população celular totipotente", "embrião transgénico", "célula transgénica", "célula somática" e "embrião animal" utilizados com a invenção não incluem células ou embriões humanos.
Em geral, os oócitos interrompidos na metafase da segunda divisão meiótica têm sido utilizados como receptores de citoplasto. O material genético dador foi introduzido no 14 citoplasma da célula receptora pelos processos de 1) fusão celular, 2) injecção de células intactas, células ou núcleos lisados. A transferência do material genético pode ocorrer quer no momento da activação, anterior à activação (ver os pedidos de patente WO 97/07669 e WO 97/07668 ou após a activação (Campbell et al., Biol. Reprod. 49 9330942 (1993); Campbell et al. Biol. Reprod. 50 1385-1393 (1994)). Em cada destes casos, a ploidia do embrião reconstruído deve ser mantida pela utilização do material genético dador num estádio apropriado do ciclo celular (para revisão ver Campbell et al., Reviews of Reproduction 1:40-46 (1996)). Este processo pode ser combinado com técnicas de manipulação genética para a produção de descendência transgénica (Schnieke et al., Science 278, 2130-2133, 1997). A utilização de transferência nuclear combinada com modificação genética de células em cultura e a sua selecção antes da produção animal tem um determinado número de vantagens, como descrito anteriormente.
Em porcos, a utilização de transferência nuclear para a produção de descendência viva tem sido associada a dificuldades. Embora a descendência tenha sido produzida por troca dos pronúcleos de zigotos fertilizados, apenas 1 leitão foi produzido a partir de um estádio de desenvolvimento posterior (4 células) (Prather et al., Biol Reprod 1989, Setembro, 41:3 414-8). O processo de reconstrução de embrião e produção de descendência viável por transferência nuclear é um processo de múltiplos processos. Cada destas etapas irá ser agora descrita em maior detalhe. A descrição abaixo pretende proporcionar uma explicação para as etapas e não é uma descrição exaustiva nem limitante. 15 A Célula ou o Citoplasto Receptor. Oócitos, zigotos fertilizados e embriões de duas células têm sido utilizados como receptores de citoplasto para transferência nuclear. Em geral, os oócitos interrompidos na metafase da segunda divisão meiótica (também designados de óvulos não fecundados) tornaram-se o citoplasto de escolha. Neste ponto do desenvolvimento de oócito, o material genético é disposto sobre o fuso meiótico e é facilmente removido utilizando meios mecânicos. Vários relatos demonstraram que durante a maturação, í. e., entre o estádio de vesícula germinal (prófase da primeira divisão meiótica) e a interrupção na metafase da segunda divisão meiótica, adn genómico pode ser removido e o citoplasto resultante utilizado para transferência nuclear (Kato Y., Tsunoda Y., Mol Reprod Dev (1993), Outubro, 36:2 276-8). A utilização de zigotos fecundados como receptores de citoplasto foi referida no murganho (Kwon 0. Y., Kono T., Proc Natl Acad Sei U.S.A. (1996) 12 de Novembro, 93: 23 13010-3), gado vacum (Prather R. S., First N. L., J Reprod Fértil Suppl (1990) 41:) e porcos (Prather et ai., Biol Reprod (1989), Setembro, 41: 3, 414-8). Em gado vacum e porcos, o desenvolvimento de embriões reconstruídos utilizando zigotos como receptores de citoplasto é baixo e, em geral, limitado à troca de pronúcleos, sugerindo que os factores essenciais para o desenvolvimento bem sucedido são removidos com os pronúcleos. O método de dupla transferência nuclear produz uma estrutura semelhante a pronúcleo (incluindo um pronúcleo) por transferência de um núcleo adequado, de um modo preferido para um oócito de Metafase II enucleado. , A estrutura semelhante a pronúcleo formada deste modo irá conter factores que, geralmente, são removidos durante a enucleação de zigoto. Esta 16 estrutura semelhante a pronúcleo é, depois, utilizada como um dador de material genético para uma reconstrução de embrião de segunda transferência nuclear. Os núcleos ou células de qualquer estádio do ciclo celular podem ser utilizados como dadores de material genético, de um modo preferido, contudo, o estádio de ciclo celular do citoplasto receptor deve ser controlado em conformidade.
Preparação de um Receptor de Citoplasto por Remoção do Material Genético Genómico.
Este processo tem sido designado, em geral, enucleação. Na maioria dos receptores utilizados, o ADN genómico não está fechado dentro de uma membrana nuclear no momento da remoção. A remoção do material genético, de acordo com a presente invenção e descrita pelo termo "enucleação", não requer que o material genético esteja presente numa membrana nuclear (pode ou não estar ou pode estar parcialmente). A enucleação pode ser fisicamente alcançada por remoção efectiva do núcleo, pronúcleos ou placa de metafase (dependendo da célula receptora) ou funcionalmente, tais como pela aplicação de radiação ultravioleta ou outra influência de enucleação. A remoção do material genético é possível por meios físicos e/ou químicos. Nos relatos iniciais de transferência nuclear, os oócitos MII eram simplesmente cortados ao meio, com base em que uma metade iria conter o material genético e a outra não. As modificações a esta abordagem foram realizadas para reduzir o volume de citoplasma que era removido, isto pode ser alcançado por aspiração de uma pequena quantidade de citoplasma directamente sob o primeiro corpo polar, utilizando micropipetas de vidro ou por utilização de uma faca para cortar a parte do oócito sob o 17 corpo polar. De modo a facilitar a plasticidade do oócito, este pode ser pré-tratado com o inibidor de microtúbulos, Citocalasina B, ou qualquer outro agente que dissocie o citoesqueleto. Em contraste com a enucleação física, demonstrou-se que o tratamento químico causa a remoção completa do material genético no murganho. 0 tratamento de oócitos em maturação com o inibidor de Topoisomerase, etoposide, resulta na expulsão de todo o material genómico com o primeiro corpo polar (Elsheikh A.S. et al. Jpn J Vet Res (1998), Fevereiro, 45:4, 217-20), contudo, não foi descrito qualquer desenvolvimento até ao fim do tempo, utilizando receptores de citoplasto produzidos por este método e não existem relatos deste processo em outras espécies. Foi referido que a centrifugação de oócitos MII, combinada com tratamento de Citocalasina B, causa a enucleação em oócitos de hamster e gado vacum (Tatham et al. Hum Reprod (1996) Julho, 11:7 1499-503). O desenvolvimento de embriões reconstruídos a partir de tais citoplastos foi referido em gado vacum, contudo, a frequência de desenvolvimento é baixa.
Quando se utilizam zigotos, o material genético pode ser removido por aspiração mecânica de ambos os pronúcleos. Dependendo da espécie, para facilitar a visualização dos pronúcleos, os zigotos podem ser centrifugados antes da enucleação. 18
Introdução de material genético (reconstrução de embrião).
Tendo-se preparado uma célula ou um citoplasto receptor adequado, o dador de material genético deve ser introduzido. Foram referidas várias técnicas, incluindo; 1. Fusão celular induzida por meios quimicos, virais ou eléctricos. 2. Injecção de uma célula intacta por qualquer método 3. injecção de uma célula lisada ou danificada. 4. Injecção de um núcleo.
Qualquer destes métodos pode ser utilizado em qualquer espécie com algumas modificações de protocolos individuais.
Activação do embrião reconstruído.
Adicionalmente à transferência de material genético dador do carioplasto para o citoplasto, o citoplasto deve ser estimulado a iniciar o desenvolvimento. Quando se utiliza um zigoto fecundado como um receptor de citoplasto, o desenvolvimento já foi iniciado por entrada de esperma na fecundação. Quando se utilizam oócitos MII como receptores de citoplasto, o oócito deve ser activado por outros estímulos. Foram referidos vários tratamentos para a indução da activação do oócito e promoção do desenvolvimento embrionário precoce, incluindo mas não limitados a aplicação de um estímulo eléctrico DC, tratamento com etanol, ionomicina, tris-fosfato de Inositol (IP3), ionóforo de cálcio A23187, tratamento com extractos de esperma ou qualquer outro tratamento que induza a entrada de cálcio no oócito ou libertação de reservas internas de cálcio e resulte no início do desenvolvimento. Adicionalmente, pode ser 19 aplicado qualquer destes tratamentos, isolado ou em combinação, à sua aplicação nos mesmos ou diferentes momentos ou em combinação com inibidores de síntese proteica (i. e., ciclo- heximida ou puromicina) ou inibidores de proteínas serinas treoninas cinases (i. e., 6-DMAP).
Cultura de embriões reconstruídos.
Os embriões reconstruídos por transferência nuclear podem ser cultivados in vitro até um estádio adequado para transferência para um receptor final utilizando qualquer meio de cultura adequado ou processo de cultura. Alternativamente, os embriões podem ser cultivados in vitro no oviduto laqueado de um animal hospedeiro adequando (em geral, ovelhas) até que seja alcançado um estádio adequado para transferência para um receptor substituto final. Os embriões de gado vacum, ovelhas e outras espécies podem ser cultivados num receptor de transespécie; para simplificar, uma ovelha proporciona um receptor adequado para as espécies bovina, ovina e porcina. Para evitar dano mecânico ou ataque por macrófagos aos embriões reconstruídos, enquanto no oviduto do receptor temporário, é habitual embeber os embriões numa camada protectora de agar ou material semelhante.
Os sistemas de cultura in vitro presentemente disponíveis para embriões porcinos suportam o desenvolvimento para o estádio de blastocisto, contudo, a frequência de nascimentos vivos de tais embriões é baixa (Machaty et al., Biology of Reproduction, (1998) 59, 451-455) . No método de dupla transferência nuclear, o embrião reconstruído de primeira transferência nuclear pode ser cultivado por qualquer destes métodos até que ocorra a formação 20 de um corpo semelhante a pronúcleo e o embrião seja utilizado para a reconstrução da segunda transferência nuclear. Na prática é presentemente preferido que este primeiro periodo de cultura seja efectuado utilizando um meio adequado in vitro.
Cada das etapas envolvidas na reconstrução de embriões de mamífero por transferência nuclear é ineficiente. Em porcos, isto é particularmente evidente pela ausência de relatos sobre a produção de descendência viva a partir de embriões reconstruídos por transferência nuclear. A base da dupla transferência nuclear é minimizar as etapas ineficientes envolvidas no processo de reconstrução, utilizando um processo de reconstrução de embrião multietapa e cultivando os embriões no receptor final substituto. 0 método de dupla transferência nuclear proporciona um método de reconstituição de um embrião animal. 0 processo compreende a transferência de um núcleo para dentro de um oócito, seguido de remoção e transferência do referido núcleo do referido oócito para uma célula receptora adicional. De um modo preferido, o núcleo transferido do primeiro oócito está na forma de uma estrutura semelhante a pronúcleo. De um modo preferido, a segunda célula receptora é um oócito ou um zigoto fertilizado enucleado. Isto envolve um processo de dupla transferência nuclear. A primeira etapa deste processo é a produção de uma estrutura semelhante a pronúcleo por transferência de um núcleo dador para um oócito. De um modo preferido, o oócito é um oócito de metafase II maduro (óvulo não fecundado) que foi anteriormente, simultaneamente ou subsequentemente activado, ou um oócito MII activado (a activação é habitualmente por entrada física ou química). Um exemplo da primeira etapa é mostrado na Figura 21 (por uma questão de simplificação, a utilização de um receptor activado na Figura 21 não é mostrada, mas está documentado na Tabela 1 abaixo). Na segunda etapa do processo, a 21 estrutura semelhante a pronúcleo produzida pela primeira etapa é removida do primeiro embrião reconstruído e transferida para um oócito ou para um zigoto fecundado activado partenota ou enucleado (Figura 21). Se a transferência for para um oócito, de um modo preferido, a estrutura semelhante a pronúcleo é removida do primeiro embrião reconstruído e transferida para um oócito que é um oócito MII enucleado antes, concomitante ou após activação. Após a segunda transferência nuclear, o embrião reconstruído pode ser transferido directamente para um receptor final substituto para desenvolvimento até ao fim do tempo.
Tabela 1. Combinações possíveis do ciclo celular de células dadoras e receptoras para primeiro NT para manter a ploidia do(s) núcleo(s) dos zigotos reconstruídos.
ESTÁDIO DE CICLO DE CÉLULA DADORA CITOPLASTA RECEPTOR OUTRO TRATAMENTO GO MII CONCOMITANTE com ACTIVAÇÃO GO MII PÓS-ACTIVAÇÃO MANUTENÇÃO QUÍMICA DE ploidia (í. e., Nocodazole, Colcemida, DMAP ou outros inibidores de serina treonina cinase). GO PRÉ-ACTIVAÇÃO MII G1 MII CONCOMITANTE com ACTIVAÇÃO 22 (continuação)
ESTÁDIO DE CICLO DE CÉLULA DADORA CITOPLASTA RECEPTOR OUTRO TRATAMENTO G1 MII PÓS-ACTIVAÇÃO MANUTENÇÃO QUÍMICA DE PLOIDIA (i. e.r Nocodazole, Colcemida, DMAP ou outros inibidores de serina treonina cinase). Gl PRÉ-ACTIVAÇÃO MII S PRÉ-ACTIVAÇÃO G2 PÓS-ACTIVAÇÃO DE MII ENUCLEADA PN Tetraplóide Transferência para zigoto em G2 tardio/ 1 célula mitótica G2 MII não enucleada PÓS- ACTIVAÇÃO Enucleação subsequente *Supressão de formação de PB se requerida para formar 2 pronúcleos diplóides G2 PRÉ-ACTIVAÇÃO MII S PRÉ-ACTIVAÇÃO MII 23 (continuação) ESTÁDIO DE CICLO DE CÉLULA DADORA CITOPLASTA RECEPTOR OUTRO TRATAMENTO M PÓS-ACTIVAÇÃO DE MII enucleada Despolimerização de fuso se requerida, í. e., nocodazole para formar um único pronúcleo tetraplóide. Transferência para zigoto em G2 tardio/ 1 célula mitótica M MII enucleada PRÉ-ACTIVAÇÃO de G2 TARDIO (mpf subindo ou elevado) M PÓS-ACTIVAÇÃO DE MII enucleada Tetraplóide PN Transferência para zigoto em G2 tardio/ 1 célula mitótica M MII não enucleada PÓS-ACTIVAÇÃO Enucleação subsequente *Supressão de formação de PB se requerida para formar 2 pronúcleos diplóides *Dependente de espécie O material genético dador para a reconstrução de embrião pode ser proporcionado por qualquer célula diferenciada, parcialmente diferenciada ou indiferenciada retirada directamente de qualquer estádio no desenvolvimento de um 24 animal, tais como um embrião, feto, juvenil ou animal adulto ou qualquer linha celular derivada destes. Em relatos anteriores, foi mostrado que o estádio do ciclo celular do núcleo dador é crítico para o desenvolvimento. Na presente invenção, uma célula em qualquer estádio do ciclo celular pode ser utilizada como dador de material genético para o primeiro processo de reconstrução. Contudo, a combinação de estádios de ciclo celular do núcleo dador e citoplasma receptor irá variar, dependendo do estádio do ciclo celular a ser utilizado como dador de material genético no momento da transferência. Não é requerido que o material genético dador e as células receptoras sejam da mesma espécie animal, embora isto possa ser preferido. PREPARAÇÃO DE CÉLULAS DADORAS.
Os métodos e materiais para a cultura, a sincronização e selecção de células dadoras a serem utilizados como dadores nucleares para a reconstrução de embriões por transferência nuclear são bem conhecidos de qualquer especialista na técnica. Qualquer população celular obtidas directamente de qualquer estádio na vida de um animal (por exemplo, embrião, feto ou animal adulto) pode ser utilizada como material genético dador, alternativamente, pode ser utilizada uma célula de qualquer população (por exemplo, uma população celular indiferenciada, parcialmente diferenciada ou diferenciada) derivada de qualquer estádio (por exemplo, embrião, feto, juvenil ou animal adulto) e mantida em cultura ou em qualquer célula (por exemplo, célula indiferenciada, parcialmente diferenciada ou diferenciada), resultando durante cultura de isolados primários ou como resultado de tratamento da população celular cultivada com hormonas, factores de crescimento ou substâncias químicas que 25 alteram o estado diferenciado. 0 estádio do ciclo celular de células mantidas em cultura pode ser manipulado, de modo a garantir a coordenação com o citoplasto receptor, utilizando qualquer meio disponível para um especialista na técnica. Os exemplos seguintes não são limitantes e são meramente representativos de diversos aspectos da técnica.
Fase GO
Pode ser utilizado qualquer método que resulte na produção células diplóides quiescentes (de não crescimento) que tenha interrompido o ciclo celular após a mitose e divisão celular, mas antes do começo da replicação de adn ou fase S. Métodos adequados incluem mas não estão limitados a; I. Quiescência induzida por inibição de contacto de populações celulares cultivadas II. Quiescência induzida por remoção ou redução na concentração de soro ou outro nutriente essencial no meio de cultura, i. e., leucina ou outro aminoácido, factor(es) de crescimento específico(s). III. Quiescência induzida por senescência IV. Quiescência induzida por adição de um factor de crescimento específico ou outra substância. V. Quiescência induzida por qualquer meio físico, tal como choque térmico, pressão hiperbárica ou tratamento com compostos químicos que induzem uma resposta de choque térmico ou stress, e. g., puromicina, azacitidina. 26
Fase G1
Os núcleos dadores podem ser interrompidos na fase G1 do ciclo celular por tratamento com qualquer substância química, hormona, factor de crescimento ou outra substância que cause a interrupção ou por qualquer stress físico que induza a interrupção do ciclo celular, í. e., indução de uma resposta de choque térmico como resultado de temperatura elevada ou tratamento com compostos que induzem uma tal resposta, i. e., puromicina, azacitidina. Alternativamente, as células de fase G1 podem ser obtidas por sincronização da população celular por qualquer meio e selecção de células G1 num momento apropriado. Por exemplo, as células podem ser interrompidas na fase M do ciclo celular por tratamento com fármacos de disrupção de microtúbulos, tais como Colcemida ou Nocodazole, as células mitóticas podem ser, depois, seleccionadas da população por agitação e colocadas dentro de um recipiente de cultura separado. As células G1 podem ser, depois, seleccionadas a um momento apropriado após agitação. Como uma variação desta técnica, as células mitóticas podem ser, também, seleccionadas de uma população não sincronizada. As células G1 podem ser enriquecidas fazendo com que as células saiam do ciclo de crescimento e sejam interrompidas num estádio quiescente ou GO (como anteriormente) e, depois, reestimulando o crescimento por readição do factor de restrição. As células G1 podem ser, depois, seleccionadas num momento após reestimulação a ser verificado por experimentação para cada tipo de célula/população individual. Esta técnica pode ser combinada com qualquer outra técnica que, depois, interrompa as células quer na fase Gl do ciclo celular ou na fronteira da fase Gl/S, i. e., tratamento com hidroxiureia ou afidicolina. 27
Fase S
As células de fase S podem ser seleccionadas ou enriquecidas por tratamento com qualquer agente químico que interfira com qualquer ponto do processo de replicação, e. g., afidicolina que inibe o alongamento de cadeia num modo dependente de concentração, Hidroxiureia, que inibe a enzima ribonucleótido redutase. As células sincronizadas em qualquer outro estádio do ciclo celular podem ser libertadas e o momento da fase S após libertação determinado experimentalmente. Adicionalmente, estes dois processos podem ser combinados ou utilizado qualquer outro processo de selecção ou sincronização ou combinação destes.
Fase G2
As células de fase G2 podem ser seleccionadas de uma população em crescimento que tenha sido sincronizada por qualquer método físico, químico ou selectivo. Alternativamente, as células G2 podem ser enriquecidas por tratamento de uma população celular, sincronizada ou não sincronizada, com quaisquer agentes que interrompam especificamente o ciclo celular após a conclusão da fase S e antes do começo da mitose.
Fase M
As células mitóticas podem ser seleccionadas de uma população não sincronizada, utilizando qualquer meio possível, incluindo mas não estando limitando a agitação mitótica, 28 elutriação, FAC (triagem celular de activação fluorescente) . Alternativamente, as células podem ser interrompidas na mitose por tratamento com agentes de disrupção de microtúbulos, tais como colcemida ou nocodazole, por tratamento com DMAP ou quaisquer outros inibidores de proteina serina treonina cinase, ou por qualquer outro meio químico ou físico que interrompa a progressão normal do crescimento e cause interrupção na mitose.
Populações celulares não sincronizadas.
As populações celulares não sincronizadas podem ser obtidas de qualquer tecido fetal embrionário ou adulto e cultivadas in vitro ou qualquer célula removida directamente de um embrião, feto, juvenil ou animal adulto. Uma célula não sincronizada é definida como uma célula, cujo estádio do ciclo celular é desconhecido no momento de transferência para um citoplasto receptor. TRANSFERÊNCIA NUCLEAR. I) Oócitos.
Os oócitos que actuam como receptores de citoplasto adequados podem ser obtidos utilizando-se uma variedade de técnicas e protocolos, estes incluem mas não estão limitados a i) Maturação in vitro após a aspiração dos folículos dos ovários obtidos no abate ou removidos cirurgicamente. 29

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES 1. Método de transferência nuclear compreendendo: (a) preparação de uma célula somática não humana para transferência nuclear por um método compreendendo o material genético da célula somática não humana por um evento de direccionamento genético num lócus endógeno; e (b) transferência do material genético das células somáticas não humanas para uma célula receptora não humana.
1.2 ENUCLEAR 1.3 TRANSFERIR NÚCLEO POR FUSÃO CELULAR, INJECÇÃO CELULAR OU.NUCLEAR. ACTIVAÇÃO SIMULTÂNEA OU SUBSEQUENTEI 1.4 FORMAÇÃO DE PRONÚCLEO
I 1.5 PREPARAR CARIOPLASTO CONTENDO PRONÚCLEO
2.4 kb FIG. 14 Seguenciação de ADN 14/19 Braço 3' de vector de direccionamento ot-1,3GT Sequencia plasmídica bacteriana . . .GACCCAGTCCTCATGACTAAACAGCAAGGGCGAATTCCTAGAAGATCTCCTAGAGTTAACACTGGCCÔTCGTTTTACCGGTCCG. . . Sequência de vectores de direccionamento a-l,3GT porcinos pPL501 e 502 na extremidade 3' de braço homólogo 3' Região presente dentro do vector de direccionamento Região única ao lócus a-1, 3GT .gacccagtcctcatgactaaacagcttttcaatccctttctctaagaaaagctatgacatcttacatgtaatttaaacttaagcagtttggtgt aaaggaagttaggaggcaatatttacatctgcaggtatgtgatatacttttgcttgtgttccagttiaggtcatttgtgtccattttcaaatga TTTACTTGAAGAGCCATTGCACTGACTTGATGTTCAGCACGATGGGCT Sequência de fragmentos PCR amplificados de cada um dos quatro clones celulares Iniciador alfa-Gte9a2 FIG. 15 10 kb 15/19 6 kb
Lócus Natural de BLG bovino Exão BLG 2 até Intrão 3 (1,9 kb) FIG. 16 Promotor BLG (10 kb) Xho I Vector KO pPL522 de armadilha de Poli A de BLG bovino 16/19 Braço 5' Braço 3' PGK-neo λ';-', ' x! V/////////////////////////////////////A Recombinaçao ^ Lócus Natural de BLG Neo442s V/ MWMBWMÍ:" WÊÊÊÊkV///// Rastreio de PCR / wmv//// FIG. 17 Subclonagem Sequenciaçao de ADN 17/19 Braço 3' de vector de direccionamento de BLG Sequencia plasmídica bacteriana .agggcggcctcagactcagtggtgagtgttcccaagtccaggaggtggtggagggtccctggcggatcgogggggtcgacgcggccgccatggtcatagct. Sequência de vector de direccionamento BLG pPL522 na extremidade 3' de braço homólogo 3' Região presente dentro do vector de direccionamento Região única ao lócus BLG .AGGGCGGCCTCAGACTCAGTGGTGAGTGTTCCCAAGTCCAGGAGGTGGTGGAGGGTCCCTGGCGGATCCAGAGTTGGGCTTCCAGAGTGA GGGCTTCCTGGGCCCCATGTGCCTGGCAGTGGCAGCAGGGAAGGGGCCACACCATTTTGGGGCTGGGGGATGCCAGAGGGCGCTCCCCAC Sequência de fragmentos PCR amplificados de cada um dos três clones CCCGTCCTCACCAAGTGGTGACCCCGGGGGAGCCCCGCTGGTTGTGGGGGGTGCTGGGGGCTGACCAGÂAACCCCCCTCCTGCTGGAACT celulares CACTTTCCTCCCGTCTTGATCTCTTCCAGCCTTGAATGAGAACAAAGTCCTTGTGCTGG FIG. 18 Iniciador BLG3'1 18/19 1 2 3456 789 10
FIG. 19
Data de Ordenha FIG. 20 lâ ETAPA NT ο 1.1 OÓCITO Mil
2. Método, como reivindicado na reivindicação 1, em que o evento de direccionamento genético é mediado por recombinação homóloga.
3. Método, como reivindicado na reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a modificação é inactivação, remoção ou modificação de um gene; regulação positiva de um gene, substituição de gene ou colocação de transgene.
4. Método, como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o evento de direccionamento genético resulta num clone celular de direccionamento génico: proporção de clone celular aleatoriamente direccionado igual ou superior a 1:100.
5. Método, como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o evento de direccionamento 1 genético é efectuado num lócus abundantemente expresso na célula somática hospedeira.
6. Método, como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que um gene estrutural é colocado adjacente a um promotor endógeno.
7. Método, como reivindicado na reivindicação 6, em que 0 promotor endógeno é o de um gene de colagénio.
8. Método, como reivindicado na reivindicação 6, em que o promotor endógeno é o de um gene da proteína do leite
• 9. Método, como reivindicado na reivindicação 6, em que 0 promotor endógeno dirige expressão abundante em células de fibroblastos.
10. Método, como reivindicado na reivindicação 6, em que 0 promotor endógeno dirige expressão abundante em células endoteliais.
11. Método, como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o evento de direccionamento genético é mediado por lipofecção.
12. Método, como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o evento de direccionamento genético envolve a utilização de um vector de direccionamento génico, vector que compreende uma região longa de homologia com o lócus alvo. 2
13. Método, como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o evento de direccionamento genético envolve a utilização de um vector de direccionamento génico que está numa forma circular.
14. Método, como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o evento de direccionamento genético inclui a indução artificial de expressão génica ou a indução de alterações de cromatina na célula.
15. Método, como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o evento direccionamento genético é facilitado por um agente que inibe a desacetilação de histona ou por expressão na célula de um factor que estimula a transcrição no lócus alvo.
16. Método, como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que a célula somática não humana é uma célula somática primária.
17. Método, como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que a célula somática não humana é uma célula epitelial, uma célula de fibroblasto, uma célula endotelial ou uma célula muscular.
18. Método, como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que a transferência do material genético da célula somática não humana para uma célula receptora não humana proporciona um embrião animal não humano. 3
19. Método, como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 compreendendo, adicionalmente, a produção de uma população celular clonada, totipotente ou pluripotente, não humana.
20. Embrião não humano transgénico ou um feto não humano transgénico, obtenível por um método como reivindicado na reivindicação 18, em que o genoma contém ADN exógeno.
21. Célula não humana transgénica, derivada do embrião não humano ou feto não humano da reivindicação 20.
22. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que uma célula de um embrião animal não humano é utilizada para transferência nuclear adicional.
23. Método para preparação de um animal não humano transgénico, compreendendo fazer com que um animal não humano se desenvolva até ao fim do tempo a partir do embrião não humano, como reivindicado na reivindicação 20 e, opcionalmente, reprodução a partir do animal.
24. Animal transgénico obtenível pelo método como reivindicado na reivindicação 23.
25. Animal transgénico, como reivindicado na reivindicação 24 que é uma ovelha, vaca, touro, cabra, porco, cavalo, camelo, coelho ou roedor.
26. Animal transgénico que é produzido a partir de um animal, como reivindicado na reivindicação 24 ou reivindicação 25. 4
27. Método para obtenção de uma população celular não humana clonal, pluripotente ou totipotente, compreendendo o cultivo de uma linha celular a partir de um embrião transgénico não humano ou um feto transgénico não humano, como reivindicado na reivindicação 20.
28. População celular não humana clonal, pluripotente ou totipotente, obtenível de acordo com o método como reivindicado na reivindicação 27. Lisboa, 23 de março de 2010 5 1/19 m mil!? Sn X Xo £ 333 c/) c/)o 5 3 7 jiioinOQ.a^ww^aa o 9.“ 2έ2 = =Ϊ'Ξ.'Ξ.<Ξ = t v / / CD Iq » •a 3 o £i 5 -A I / m gg co =S si cn C I. "Ό _l_l_L 3 Q. CU =T homologia 5' (3 kb) IRES-neo sem promotor Homologia 3' (8,3 kb) Vector pSL1180 Vector de Direccionamento COLT-(16,95 kb) Hindlll Hindlll Ssp! EcoRI Clal Xhol Xhol EcoRI BamHI Hpal Sspl BamHI Mlul Hindlll Smal Hindlll Xhol Sacll BamHI j^saLU— l l I l l I —U....... . II j_ _L Terminação traducional de COLIA1 ovino tt Sítio poli A m τ τ oíí _ _ Λ -- Tjg ?a cnΙΙ»ϊϊ2=Ιϊϋ<ϋ »ijg |ií m miig1 o8f»S ' m Lócus natural de COLIA1 ovino 0 *Í3 Ω. 3- Q. ft) = O = CD XX CD ->Ov
Terminação traducional de COLIA1 ovino FIG. 1 Lócus de direccionamento de COLIA1 ovino 2/19 FIG. 2
x >< u' rr q. O — -LL;^;nb i - '.... a.íi VJ Iniciadores de PCR (fragmento diagnóstico de 3,4 kb) - 3' Lócus de direccionamento de COLIA1 ovino Sequencia B Sequência A Sequência A C C ro o cr ω cr cu m ro ro 0» KJ IO u> gagccacagctcagcctcaaggcccctccccagccagtaccctgtttcccccaaggaagggggtttgttcccaggtgctcaccccagcttacacaaagcc Iniciador COLT PCR4 I I// I TAAATCTGCTTGAAGATTCACCTGGGGTCAGGAGGGATGGATGTGGCAGGAACAGATGTGAAGGGATTTGGCCAAGGGGAGATTTCATCTGTAGCTCAGG 0D — m o m o m o 7S 03 5. ro $ o o wro o ro o ro ol ro ro n wE (II crt \V Vv7 Ϊ I CTGTTCCAGCCCTGAGCCGAGCTCCTCCAACCAGGATCTAATCCTCTCTTTGCTCTCCCTAGGGTCCTGCTGGTCCTGCTGGTCCCATTGGCCCCGTTGG Lócus endógeno COL1A1 Homologia 5' COLT-1 3/19 Sequência B Terminação de tradução de C0LIA1 TCGGCTTCGACATCGGCTCTGTCTGCTTCCTGTAAACTCCTTCCACCCCAGCCTGGCTCCCTCCCACCCAACCCACTTGCCCCTGACTCTGGAAACAGAC < ω 3 (D CO | TJ c5zz m v oS z3 ntnroí o 2. O CD Q S2, 2«“ = I TT TT V AAACAACCCAAACTGAAACCCCCCAAAAGCCAAAAAATGGGAGACAATTTCACATGGACTTTGGAAAATCCTAGGATGCATATGGCGGCCGCACTAGAGG •p -______ Sso! Hall EcoR I Ψ' IRES neo Homologia 5' de COLT-1 AATTCCGCCCCTCTCCCCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTG BseMI Bsp120 I BsrD I Ppel Apa I CD σ V) Avr II BsaM I BsaM I 1 I I V T I I | CCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGT Iniciador COLT PCR8 FIG.2 continuação 4/19 Marcador de Tamanho 14 12 Marcador de 26 Tamanho 6 13 2 1
FIG. 3 [D 5/19 q 2251 2 2 ϊI ¥7 Ϊ í I TCGACCTGCAGGTCAACGGATCTAATCCTCTCTTTGCTCTCCCTAGGGTCCrGCTGGTCCTGCTG Região terminal derivada de vector de clonagem Extremidade 5'de vector COLT-1 linearizado com Sall
m o 0 Ό > / 1/ ccaaggggagatttcatctgtagctcaggctgttccagccctgagccgagctcctccaaccaggatctaatcctctctttgctctccctagggtcctgctggtcctgotg 6 •CCAAGGGGAGATTTCATCTGTAGCTCAGGCTGTTCCAGCCCTGAGCCGAGCTCCTCCAACCAG€ATCTAATCCTCTCTTTGCTCTCCCTAGGGTCCTGCTGGTCCTGCTG 13 ccaaggggagatticatctgtagctcaggctgttccagccctgagccgagctcctccaaccaggatctaatcctctctttgctctccctagggtccxgctggxcctgctg 14 "D C Q
01
Fragmentos de PCR amplificados de clones de direccionamento ^OJq Lócus COLIAl de CCAAGGGGAGATTTCATÇTGXAGÇTÇAGÇÇTGTTCCAGCCCTGAGCCGAGÇTCCTCCAACCAGGATCTAATCCTCTCTTTGCTCTCCCTAGGGTCCTGCTGGTCCTGCTG PDFF2 FIG.4 6/19 Sall
MluI Homologia 5' IRES-neo sem de C0LIA1 (3 Wd) promotor AATC2 •o 3 δ CD 0> 23 m X 73 c X —LJJ___ __LL
Homologia 3' de C0LIA1 (8,3 kb) COLT-1 (16.95kb) Xhol Xhol EcoRI Clal BamHI m mi ω »«83 BamHI BamHI BamHI BamHI Sspl BamHI BamHI Hindlll Hmdlil EcoRI BamHI Hpal BamHI MluI Sspl Hindlll Smal X o l,.L I -Λ\ II .. I II I I I I I I I _LL J_ I I Homologia 5' IRES-neo sem Promotor BLG Intrao ADNc de C0LIA1 (3 Wd) promotor AAT FIG. 5 Homologia 3' de C0LIA1 (8,3 kb) Vector de direcc ionamento COLT-2 {25,35 kb) 7/19 FIG. 6 ABCDEFGH I
Chave para os corredores Cordeiros de direccionamento com C0LT1 (transferência nuclear do clone celular PDC0L6) A. cordeiro nascido vivo de ovelha 941235 B. cordeiro nado-morto de ovelha 9600356 C. cordeiro nascido vivo de ovelha 950030 D. cordeiro nado-morto de ovelha 941053 Cordeiros de direccionamento com COLT2 (transferência nuclear do clone celular PDCAAT90) E. carneiro nado-morto de ovelha NZ1418 F. carneiro nascido vivo de ovelha 941026 G. carneiro de tipo selvagem H. clone celular PDCAAT90 I. células PDFF2 não transfectadas transfectadas clones celulares PDCAAT PCR +VO PCR +vo 22 59 71 73 78 81 84 86 87 89 90 92 95 99 125
FIG. 8 8/19 KA B-Jl—L Terminação poli B I B A I Lócus C0LIA1 Sonda do Southern KBA K B d Vector COLT-1 Homologia 5' IRES-neo KA B Terminação KBA K Homologia 3' B B pSL1180 IRES-neo -► Lócus de direccionamento de COLT-1 SC KBA SK
Homologia 5' IRES-neo B KABABB AB B K J l 1 II l_LI_I_| B B Sc BLG-AAT Homologia 3' pSL11 80 Vector COLT-2 KA B AiX Terminação KBA SK
B KABABB AB B K I I I II I_U I I B B AX... IRES-neo -► BLG-AAT 2 kb FIG. 7 Lócus de direccionamento de COLT-2 9/19
FIG. 9 σ) Η \ Ο Η Sss d 0) 33 o 'β §
Colagénio induzido Colagénio não induzido Colagénio induzido Colagénio não induzido FN não induzido FN induzido Colagénio induzido Colagénio não induzido Colagénio induzido Colagénio não induzido FN induzido FN não induzido FN induzido FN não induzido Glândula mamária com 115 dias
O T-(!) L o hl i co 0 Sal1 pBS 11/19 Vector BLAT-3 S N C CSS=l| 1 I 1·!— 1 I 11 I Homologia 5' IRES-neo X S N s Sal1 Homologia 3' BLAT3-3 iniciadores de PCR COLTPCR8 Lócus BLG ovino S S N CSS Vl -r-1 I l| \ X S Promotor BLgATG Exão 3 Terminação Poli A 2 kb FIG. 11 Abreviaturas para sítios de enzimas de restrição S Saci N Notl XXbal CCIal
n Õ i -ΛhO
Marcador de tamanho POME não transfectado Controlo positivo Clone POME 10 Clone POME 11 Clone POME 12 Clone POME 13 Clone POME 14 Clone POME 15 Clone POME 16
μ X Marcador de tamanho Controlo positivo Clone POME 1 Clone POME 2 Clone POME 3 Clone POME 4 Clone POME 5 Clone POME 6 Clone POME 7 Clone POME 8 Clone POME 9 POME não transfectado 6Τ/2Τ N * ω σ >ι οι Ν| 01 13/19 BraÇ° 5' IVS-IRES-neO-pA Braço 3'
Genoma de cxGT Neo442S Recombinação
Rastreio de PCR e subclonagem
19/19 FIG. 21 VISÃO GERAL DA METODOLOGIA DE DUPLA TRANSFERÊNCIA NUCLEAR
RESUMO "MODIFICAÇÃO GENÉTICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS E SUAS UTILIZAÇÕES" É descrita a produção de animais geneticamente modificados, nos quais as modificações genéticas são manipuladas em células somáticas cultivadas in vitro por direccionamento génico. As células geneticamente modificadas podem ser, depois, utilizadas como loci de dadores nucleares em cromossomas animais que são locais adequados para adição de transgenes às células.
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