DE69231418T2 - Arachidonsäure enthaltendes pilzöl, methode zur dessen herstellung und dieses öl enthaltende zusammensetzung - Google Patents

Arachidonsäure enthaltendes pilzöl, methode zur dessen herstellung und dieses öl enthaltende zusammensetzung

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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Arachidonsäure, auf Zusammensetzungen, die Arachidonsäure enthalten, und auf ihre Verwendung.
  • Arachidonsäure (ARA) ist eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA) der Omega-6-Klasse (5,8,11,14-Eicosatetraensäure, d. h. 20 : 4). ARA ist die häufigste C&sub2;&sub0;-PUFA im menschlichen Körper. Sie ist insbesondere vorherrschend in Organ-, Muskel- und Blutgeweben und spielt eine wichtige Rolle als Strukturlipid, das vorwiegend mit Phospholipiden im Blut, der Leber, der Muskulatur und anderen wichtigen Organsystemen assoziiert ist. Neben seiner primären Rolle als Strukturlipid ist ARA auch der direkte Vorläufer von mehreren im Blutkreislauf zirkulierenden Eicosenoiden, wie Prostaglandin E&sub2; (PGE&sub2;), Prostacyclin I&sub2; (PGI&sub2;), Thromboxan A&sub2; (TxA&sub2;) und Leukotrien B&sub4; (LTB&sub4;) und C4 (LTC&sub4;). Diese Eicosenoide haben regulatorische Wirkungen auf den Lipoproteinstoffwechsel, die Blutrheologie, den Gefäßtonus, die Leucocytenfunktion und die Thrombocytenaktivierung.
  • Trotz seiner Bedeutung für den menschlichen Stoffwechsel kann ARA vom Menschen nicht de novo synthetisiert werden. ARA wird durch die Verlängerung und Dehydrierung von Linoleinsäure (LOA), einer essentiellen Fettsäure, synthetisiert. Dieser Vorgang erfordert die Gegenwart des Enzyms Δ&sup6;-Desaturase, eines Enzyms, das im menschlichen Körper in geringen Mengen vorhanden ist (Burre et al., Lipids, 25: 354-356 (1990). Dementsprechend muss das meiste ARA mit der Nahrung aufgenommen werden, und dies ist in Zeiten sehr schnellen Körperwachstums, wie in der Kindheit, besonders wichtig.
  • In seinem ersten Lebensjahr kann ein Säugling sein Gewicht verdoppeln oder verdreifachen. Folglich sind größere Mengen an ARA in der Nahrung erforderlich. Um diesen erhöhten Bedarf zu decken, enthält Muttermilch große Mengen ARA (Sanders et al., Am. J. Clin. Nutr., 31: 805-8I3 (1978)). ARA ist die häufigste C&sub2;&sub0;-PUFA in Muttermilch. Von den Müttern, insbesondere Vegetarierinnen, die ihre Säuglinge stillen, würden viele von zusätzlichem ARA in der Nahrung profitieren. Viele Mütter stillen ihre Säuglinge jedoch nicht oder stillen sie nicht während der gesamten Zeit des schnellen Wachstums, sondern verwenden lieber künstliche Säuglingsnahrung.
  • Der Anmelderin ist keine handelsübliche künstliche Säuglingsnahrung bekannt, die ARA enthält. Das US-Patent Nr. 4,670,285 (Clandinin et al.) offenbart den Bedarf von Säuglingen an Fettsäuren einschließlich ARA. Um diese Fettsäuren zur Verfügung zu stellen, schlagen Clandinin et al. ein Gemisch von Eigelb, Fischöl oder Phospholipiden aus Roten Blutkörperchen und Pflanzenölen als Fettkomponente einer künstlichen Säuglingsnahrung vor. Fischöl enthält jedoch große Mengen an Eicosapentaensäure (EPA). Es ist bekannt, dass EPA die ARA-Synthese bei Säuglingen unterdrückt (Carlson et al., INFORM, 1: 306 (1990)). Es wäre also wünschenswert, ARA zur Verfügung stellen zu können, ohne auch zusätzliches EPA zuzuführen. Weiterhin enthält Eigelb eine relativ geringe Konzentration an ARA, so dass sich das Gemisch von Clandinin et al. ökonomisch nicht durchsetzen kann.
  • Da ARA in tierischen, aber nicht in pflanzlichen Ölen vorhanden ist, ist seine Herstellung in kommerziellen Mengen immer noch ein wünschenswertes, aber schwer zu erreichendes Ziel. Shinmen et al., Microbiol. Biotech. 31: 11-16 (1989), haben über die Herstellung von ARA durch einen isolierten Pilz, Mortiereila alpina, mit Hilfe herkömmlicher Rührtankfermentierung berichtet. (Siehe auch Japanisches Patent 1,215,245, Shinmen et al.) Nach der Kultur werden die Organismen geerntet, getrocknet, und ihre Lipide werden mit einem organischen Lösungsmittel aus der Pilzbiomasse extrahiert und chemisch (kovalent) modifiziert. Das Lipidgemisch wird zum Beispiel hydrolysiert oder in Ethylester umgewandelt und dann mit Cyclodextrin kombiniert, bevor es als Nahrungszusatz verwendet wird. Shinmen et al. offenbaren nicht die Verabreichung unmodifizierter mikrobischer Öle oder legen diese nahe.
  • Porphyridium cruentum, eine rote Mikroalge, kann in Teichen in großen Mengen gezüchtet werden und hat einen Lipidgehalt, der bis zu 40% ARA enthalten kann (Ahern et al., Biotech Bioeng., 25: 1057-1070 (1983)). Leider ist ARA primär mit Galactolipiden assoziiert, einem komplexen polaren Lipid, das in Muttermilch nicht vorkommt. Nicht nur ist also die gesamte hergestellte Menge an verwertbarem ARA ein Bruchteil von einem Prozent der Biomasse, sondern die Form, in der ARA vorliegt, ist auch nicht ohne weitere Modifikation zur Verwendung als Zusatz zu künstlicher Säuglingsnahrung geeignet.
  • Das US-Patent Nr. 4,870,011 (Suzuki et al.) offenbart ein Verfahren zur Gewinnung von Lipiden, wie γ-Linolensäure, aus Pilzen der Gattung Mortierella. Die γ-Linolensäure wird aus dem in den Pilzen enthaltenen Lipidgemisch gereinigt.
  • DE 36 03 000A1 (Milupa) offenbart ein Fettgemisch mit in hohem Maße mehrfach ungesättigten Fettsäuren sowie seine Verwendung als Fettkomponente einer künstlichen Säuglingsnahrung. Das Fettgemisch hat einen hohen Gehalt an ARA und Docosahexaensäuren (DHA) in einem Verhältnis von 2,5 : 1 sowie einen hohen Gehalt an Cholesterin. Als Quellen für die Fettsäuren werden bestimmte Typen von Makroalgen, Fischölen, Organfetten aus Rindern oder Schweinen sowie hochraffiniertes Eidotteröl aufgeführt. Als Quelle für das DHA und ARA werden Makroalgen der Typen Phaeophyta (Braunalgen) und Rhodophyta (Rotalgen) genannt. Es wird nicht nahegelegt, Mikroben als Quelle für das Öl zu verwenden. Algen- und Fischöle enthalten außerdem typischerweise EPA, das die ARA- Synthese in vivo unterdrückt. Außerdem ist hochraffiniertes Eidotteröl keine ökonomische Quelle für ARA. Überdies wird dort kein ARA-konzentrierter Zusatz zur Ergänzung von bereits vorhandener künstlicher Säuglingsnahrung offenbart.
  • H. Yamada et al. beschreiben im Journal of Dispersion Science and Technology, Vol. 10 (4 und 5), Seite 561-579 (1989), biotechnologische Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren. Diese Verfahren bestehen darin, Pilzmyzelien, wie solche von Mortierella alpina, zu kultivieren und aus dem Myzel ein Öl zu extrahieren, das reich an mehrfach ungesättigten Fettsäuren ist. Zu den Fettsäuren, die in hoher Ausbeute hergestellt werden können, gehört Arachidonsäure (ARA).
  • JP-A-01304892 beschreibt die Herstellung von Lipiden, die ARA enthalten, durch Kultivieren eines Mikrobenstammes, wie Mortierella oder Pythium, in einem Kulturmedium, das Öl und Fett als Kohlenstoffquelle enthält. Welche ungesättigten Fettsäuren bei der Kultur erzeugt werden, hängt davon ab, welches Öl und Fett als Kohlenstoffquelle verwendet wurde.
  • JP-A-01038007 beschreibt ein pharmazeutisches Präparat für die örtliche Anwendung auf der Haut, das ein ARA-haltiges Lipid als Wirkstoff enthält.
  • EP-A-0 140 805 beschreibt eine künstliche Säuglingsnahrung, die langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthält, die aus ARA, Linolensäure und in einem Lipidextrakt von Placenta enthaltener Docosahexaensäure (DHA) ausgewählt sind.
  • EP-A-0 148 303 beschreibt eine Nahrungszusammensetzung, die Phospholipide einschließlich ARA-Phospholipiden, die aus pflanzlichen Quellen, wie Leinsaatöl, erhalten werden, enthält.
  • Es besteht weiterhin ein Bedürfnis nach ökonomischen, kommerziell herstellbaren Nahrungszusammensetzungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen, die ARA enthalten, vorzugsweise ohne gleichzeitig EPA zu enthalten. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, dieses Bedürfnis zu befriedigen.
  • Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, einen Zusatz sowie eine Quelle für diesen Zusatz zur Verwendung in künstlicher Säuglingsnahrung bereitzustellen, so dass die ARA-Mengen in der künstlichen Nahrung ungefähr den Mengen in Muttermilch entsprechen.
  • Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines ARA-haltigen Pilzöls zur Verwendung in enteralen, parenteralen oder dermalen Produkten bereitzustellen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine nährende oder pharmazeutische Zusammensetzung für den Menschen bereit, die ein Pilzöl enthält, das Fettsäuren umfasst, wobei es sich bei 10 bis 50% der Fettsäuren um Arachidonsäure (ARA), vorwiegend in Form von Triglyceriden, handelt, wobei die Fettsäuren nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure (EPA) wie ARA enthalten und wobei das Pilzöl von einer Mortierella- Spezies erzeugt wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine nährende oder pharmazeutische Zusammensetzung für den Menschen bereit, die ein unmodifiziertes Pilzöl enthält, das Fettsäuren umfasst, wobei die Fettsäuren 10 bis 50% Arachidonsäure (ARA) und nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure (EPA) wie ARA umfassen, wobei das Pilzöl weiterhin von Pythium insidiosum erhalten wird.
  • Diese Erfindung bezieht sich auch auf die Herstellung eines Arachidonsäure enthaltenden Pilzöls (ARASCO) und auf Zusammensetzungen, die solche Öle enthalten. Das Öl kann als Einzelleröl bezeichnet werden. Pilze werden unter ölerzeugenden Bedingungen kultiviert, geerntet, und das Öl wird extrahiert und abgetrennt. Das Öf kann ohne weitere chemische Modifizierung direkt verwendet werden, um Personen, die ARA benötigen, einschließlich Säuglingen, schwangeren oder stillenden Frauen oder Menschen, die unter pathologischem ARA-Mangel leiden, mit zusätzlichem ARA zu versorgen.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines Arachidonsäure enthaltenden Pilzöls (ARASCO), das im wesentlichen frei von Eicosapentaensäure (EPA) ist. "Im wesentlichen frei" bedeutet hier, dass EPA in weniger als etwa einem Fünftel der Menge an ARA in dem Öl vorhanden ist. Dieses Öl, ein Einzelleröl, kann direkt in unmodifizierter Form verabreicht werden. "Unmodifiziert" bedeutet hier, dass die chemischen Eigenschaften von Fettsäuren oder der Öle selbst nicht kovalent verändert wurden. So würde zum Beispiel eine vorübergehende Modifikation des ARASCO oder ARA, die nach der Aufnahme des Öls wieder rückgängig gemacht werden kann, noch in den Umfang dieser Erfindung fallen.
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arachidonsäure enthaltenden Öls bereit, wobei das Öl weiterhin nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure wie Arachidonsäure umfasst, umfassend:
  • (a) Kultivieren von Pythium insidiosum in einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle enthält, wobei Luft durchgeleitet und das Kulturmedium gerührt wird, so dass Pythium insidiosum dazu gebracht wird, ein Öl zu erzeugen, das Arachidonsäure und nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure wie Arachidonsäure enthält;
  • (b) Ernten des Pythium insidiosum;
  • (c) Extrahieren des Öls aus dem geernteten Pythium insidiosum; und
  • (d) Gewinnen des Öls.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein raffiniertes, Arachidonsäure enthaltendes Pilzöl bereit, wobei die in dem Pilzöl vorhandenen Fettsäuren 30% bis 50% Arachidonsäure (ARA) und nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure (EPA) wie ARA umfassen und wobei das Pilzöl aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Pilzölen, die von einer Mortierella-Spezies erzeugt werden und ARA vorwiegend in Form von Triglyceriden enthalten, und Pilzölen, die von Pythium insidiosum erzeugt werden, besteht, wobei das Pilzöl zur Verwendung bei der Herstellung einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Tabelle 1. Fettsäurezusammensetzung mehrerer Pilzspezies.
  • Es hat sich gezeigt, dass die meisten der Pilzarten, deren Fettsäuren bereits charakterisiert wurden, kein ARA erzeugen (J. D. Weete, Fungal Lipid Biochemistry, Plenum Press, N.Y. (1974). Viele der Spezies, die ARA erzeugen, einschließlich aller bereits charakterisierter Pythium-Spezies erzeugen neben ARA erhebliche Mengen an Eicosapentaensäure (EPA). Tabelle 1 zeigt das Fettsäureprofil von P. insidiosum sowie das Fettsäureprofil anderer Pilzarten. Unerwarteterweise wurde gefunden, dass P. insidiosum ARA erzeugt, ohne gleichzeitig EPA zu erzeugen. Wie bei den Fischölen führen hohe EPA-Mengen in Nahrungszusätzen zu einer Unterdrückung der Fähigkeit, ARA aus in der Nahrung enthaltener Linoleinsäure (LOA) zu bilden. Entsprechend können im Verfahren dieser Erfindung zwar auch diejenigen Pilzspezies verwendet werden, die sowohl ARA als auch EPA erzeugen, doch werden vorzugsweise Spezies verwendet, die keine nennenswerten Mengen an EPA erzeugen. Zu diesen bevorzugten Spezies gehören Pythium insidiosum und Mortierella alpina. Beide Spezies sind kommerziell erhältlich und sind bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, unter den Zugriffsnummern 28251 bzw. 42430 hinterlegt. Wenn nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist, stellt P. insidiosum in dieser Offenbarung durchweg die repräsentative Pilzspezies dar.
  • Eines der bedeutenden Probleme, das durch eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung überwunden wird, ist die Unterdrückung der ARA- Biosynthese bei Säuglingen, die durch die Gegenwart größerer Mengen von EPA in der Nahrung verursacht wird. Dieses Problem kann gelöst werden, indem man ARA zur Verwendung in künstlicher Säuglingsnahrung in Mengen zur Verfügung stellt, die im wesentlichen denen entsprechen, die man in Muttermilch findet. Typischerweise beträgt das Verhältnis von ARA: EPA in Muttermilch etwa 20 : 1.
  • Die vorliegende Erfindung zieht insbesondere Zusammensetzungen in Betracht, die ein Pilzöl enthalten, das eine ausreichende Menge an ARA zur Verfügung stellt, um die negativen Wirkungen von EPA in der Nahrung zu überwinden. Vorzugsweise weist das Ara-haltige Öl ein ARA : EPA- Verhältnis von wenigstens etwa 5 : 1 auf. Besonders bevorzugt beträgt das Verhältnis wenigstens etwa 10 : 1 und am meisten bevorzugt wenigstens etwa 20 : 1. Wie man sieht, gilt folgendes: Je höher die Menge an ARA im Endprodukt in bezug auf die Menge an EPA, desto wünschenswerter das Ergebnis.
  • In einem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die Pilze unter geeigneten Kultivierungsbedingungen kultiviert, bei denen ARA-haltiges Öl erzeugt wird. Im allgemeinen sind Techniken der Pilzkultur dem Fachmann wohlbekannt, und diese Techniken können auf das Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Zum Beispiel kann die Kultivierung eines Pilzinokulums in Submerskultur in Schüttelkolben erfolgen. Der Kolben wird mit einem Kulturmedium versehen, mit Pilzmyzel beimpft und etwa drei bis vier Tage lang in einer Schwingschüttelvorrichtung kultiviert.
  • Die Zusammensetzung des Kulturmediums kann variieren, es enthält jedoch stets Kohlenstoff- und Stickstoffquellen. Eine bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Glucose, deren Mengen in einem Bereich von etwa 10-100 Gramm Glucose pro Liter Kulturmedium liegen können. Typischerweise werden für die Schüttelkolbenkultur etwa 15 g/l verwendet. Die Menge kann in Abhängigkeit von der gewünschten endgültigen Dichte der Kultur variiert werden. Zu den weiteren Kohlenstoffquellen, die verwendet werden können, gehören Melasse, Maissirup mit hohem Fructosegehalt, hydrolysierte Stärke oder jede andere kostengünstige herkömmliche Kohlenstoffquelle, die in Fermentierungsprozessen verwendet wird.
  • Zusätzlich kann Lactose als Kohlenstoffquelle für P. insidiosum bereitgestellt werden. So kann etwa Molkenpermeat, das einen hohen Lactosegehalt hat und eine sehr kostengünstige Kohlenstoffquelle ist, als Substrat verwendet werden. Geeignete Mengen dieser Kohlenstoffquellen kann der Fachmann leicht bestimmen. Gewöhnlich muss im Verlauf der Kultur noch zusätzlicher Kohlenstoff hinzugefügt werden, weil die Organismen so viel Kohlenstoff verbrauchen, dass es sich als unzweckmäßig erweisen könnte, die gesamte Menge auf einmal hinzuzufügen.
  • Stickstoff wird typischerweise in Form von Hefeextrakt in einer Konzentration von etwa 2 bis etwa 15 g Extrakt pro Liter Kulturmedium bereitgestellt. Vorzugsweise werden etwa vier Gramm pro Liter bereitgestellt. Es können auch andere Stickstoffquellen verwendet werden, einschließlich Pepton, Trypton, Maisquellwasser usw. Die hinzuzufügende Menge dieser Quellen kann der Fachmann leicht bestimmen. Stickstoff kann diskontinuierlich hinzugefügt werden, d. h. die gesamte Menge auf einmal vor der Kultur.
  • Nach 3-4 Tagen Kultur bei einer geeigneten Temperatur, typischerweise etwa 25-30ºC, ist eine Menge an Pilzen gewachsen, die zur Verwendung als Inokulum in einem herkömmlichen Rührtankfermenter (STF) ausreicht. Solche Fermenter sind dem Fachmann bekannt und kommerziell erhältlich. Die Fermentierung kann im diskontinuierlichen, halbkontinuierlichen (fed-batch) oder kontinuierlichen Fermentierungsmodus durchgeführt werden. Vorzugsweise ist der STF mit einem Turborührwerk des Rushton-Typs ausgestattet.
  • Der Fermenter wird vorbereitet, indem man die gewünschten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen hinzufügt. Zum Beispiel kann ein 1,5-Liter- Fermenter vorbereitet werden, indem man etwa 50 Gramm Glucose und etwa 15 Gramm Hefeextrakt pro Liter Leitungswasser miteinander mischt.
  • Wie bereits diskutiert, können auch andere Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen oder Gemische davon verwendet werden.
  • Der Reaktor, der die Nährlösung enthält, sollte vor dem Beimpfen sterilisiert werden, zum Beispiel durch Erhitzen. Nach dem Abkühlen auf etwa 30ºC kann das Inokulum hinzugefügt und die Kultur gestartet werden. Für den Gasaustausch wird durch Einperlen von Luft gesorgt. Die Lufteinleitungsrate kann variieren, wird jedoch vorzugsweise auf etwa 0,5 bis etwa 4,0 VVM (Volumen Luft pro Volumen Fermenter pro Minute) eingestellt. Vorzugsweise wird die Menge des gelösten Sauerstoffs auf etwa 10% bis etwa 50% des Luftsättigungswerts der Lösung gehalten. Dementsprechend kann es während der Kultur erforderlich sein, die Einleitungsrate anzupassen. Es ist wünschenswert, dass gerührt wird. Das Rühren erfolgt mit dem Rührwerk. Die Geschwindigkeit der Rührerspitze wird vorzugsweise in einem Bereich von etwa 50 cm/s bis etwa 500 cm/s, vorzugsweise etwa 100 bis 200 cm/s, eingestellt.
  • Im allgemeinen kann die Menge des Inokulums variieren. Typischerweise können etwa 2 bis etwa 10 Vol.-% Inokulum verwendet werden. Vorzugsweise können in einem Fermenterimpfzug etwa 5 Vol.-% Inokulum verwendet werden.
  • Die Menge der Nährstoffe sollte überwacht werden. Wenn die Glucosekonzentration unter 5 g/l fällt, sollte zusätzliche Glucose hinzugefügt werden. Bei einem typischen Kulturcyclus werden etwa 100 Gramm Glucose und etwa 15 Gramm Hefeextrakt pro Liter verwendet. Es ist wünschenswert, den Stickstoff im Verlauf der Kultur abreichern zu lassen, da dies die Ölerzeugung durch die Pilze verstärkt. Dies gilt insbesondere, wenn M. alpina als Produktionsorganismus verwendet wird.
  • Gelegentlich wird die Kultur eine übermäßige Menge an Schaum produzieren. Gegebenenfalls kann ein Schaumverhütungsmittel, wie sie dem Fachmann bekannt sind, z. B. Mazu 310®, hinzugefügt werden, um die Schaumbildung zu verhindern.
  • Die Temperatur der Kultur kann variieren. Diejenigen Pilze, die sowohl ARA als auch EPA erzeugen, neigen jedoch dazu, weniger EPA und mehr ARA zu erzeugen, wenn man sie bei höheren Temperaturen kultiviert. Wenn Mortierella alpina zum Beispiel bei weniger als 18ºC kultiviert wird, beginnt es, EPA zu erzeugen. Es ist also zu bevorzugen, die Temperatur auf einem Niveau zu halten, bei dem die präferentielle Erzeugung von ARA induziert wird. Geeignete Temperaturen betragen typischerweise etwa 25ºC bis etwa 30ºC.
  • Vorzugsweise wird die Kultur fortgesetzt, bis eine gewünschte Dichte der Biomasse erreicht ist. Eine wünschenswerte Biomasse enthält etwa 25 g des Organismus pro Liter. Eine solche Biomasse wird typischerweise innerhalb von 48-72 Stunden nach der Beimpfung erreicht. Zu diesem Zeitpunkt enthalten die Organismen typischerweise etwa 5-40% komplexe Lipide, d. h. Öl, wovon etwa 10-4% ARA sind, und können geerntet werden.
  • Das Ernten kann mit jedem geeigneten Verfahren erfolgen, wie zum Beispiel Filtration, Zentrifugation oder Sprühtrocknen. Wegen der niedrigeren Kosten kann die Filtration bevorzugt sein.
  • Nach dem Ernten kann der Myzelkuchen extrahiert werden. "Myzelkuchen" bezeichnet die Ansammlung von Biomasse, die man nach der Ernte erhält. Der Kuchen kann lose oder gepresst, zerkrümelt oder nicht zerkrümelt sein. Gegebenenfalls kann noch vorhandenes Wasser vor der Extraktion aus dem Kuchen entfernt werden, etwa durch Vakuumtrocknen oder Lyophilisierung.
  • Wenn man sich dafür entscheidet, werden vorzugsweise unpolare Lösungsmittel verwendet, um das ARA-haltige Öl zu extrahieren. Jedes unpolare Extraktionsmittel ist geeignet, doch ist Hexan bevorzugt.
  • Alternativ dazu kann der feuchte Kuchen (der typischerweise etwa 30- 50% Feststoffe enthält) auch zerkrümelt und direkt extrahiert werden, wobei man polare Lösungsmittel, wie Ethanol oder Isopropylalkohol, oder Extraktion mit überkritischen Fluiden mit Lösungsmitteln wie CO&sub2; oder NO verwendet. Vorzugsweise werden die Kuchen vor der Extraktion zerkrümelt. Vorteilhafterweise erlaubt die vorliegende Erfindung die ökonomische Verwendung von Extraktionstechniken mit überkritischen Fluiden (McHugh et al., Supercritical Fluid Extraction, Butterworth (1986)). Solche Techniken sind dem Fachmann bekannt; dazu gehören zum Beispiel diejenigen, die zur Zeit zum Entkoffeinieren von Kaffeebohnen verwendet werden. Während die Ausbeuten aus der feuchten und der trockenen Extraktion ähnlich sind, ist die feuchte Extraktion im allgemeinen ein ökonomischeres Verfahren.
  • Ein zu bevorzugendes Verfahren zur wässrigen Extraktion beinhaltet das Mischen der Myzelbiomasse mit dem polaren Lösungsmittel Isopropylalkohol in einem geeigneten Reaktionskessel. Solche Kessel sind bekannt. Die Verwendung von drei bis sechs Teilen Lösungsmittel pro Teil Biomasse ist erwünscht. Am meisten bevorzugt erfolgt das Mischen unter Stickstoff oder in Gegenwart von Antioxidantien, um die Oxidation des ARA in dem Lipidextrakt zu verhindern. Die hier verwendeten Ausdrücke "Lipidextrakt", "Öl", "Lipidkomplex" und "Pilzöl" werden mit gleicher Bedeutung verwendet.
  • Nach dem Extrahieren kann das Gemisch filtriert werden, um die Biomasse aus dem Lösungsmittel zu entfernen, das den Lipidextrakt enthält. An diesem Punkt kann die Biomasse gewonnen und als Nahrungszusatz verwendet werden. Der hier verwendete Ausdruck "Nahrungszusatz" bedeutet Futter oder ein Zusatz, der mit typischem Futter, wie Korn usw., mit dem Tiere gefüttert werden können, zu mischen ist.
  • Das Lösungsmittel wird von dem Lipidextrakt abgetrennt und kann auch zur Wiederverwendung zurückgewonnen werden, etwa durch Übersieden in eine geeignete Vorlage, wobei das zurückbleibt, was hier als "rohes Öl" bezeichnet wird. Die Verwendung von Isopropylalkohol als Lösungsmittel führt wünschenswerterweise zur Entfernung von Restwasser aus dem rohen Öl, da bei der Verdampfung das Wasser/Isopropylalkohol-Azeotrop entfernt wird, das sich spontan gebildet hat.
  • Das rohe Öl kann ohne weitere Behandlung verwendet, aber auch weiter gereinigt werden. Bei diesem zusätzlichen Reinigungsschritt können Verfahren verwendet werden, wie sie bei der Herstellung von Lecithin aus Pflanzenprodukten verwendet werden und dem Fachmann bekannt sind. Bei solchen Verfahren werden die ARA-haltigen Lipide oder das ARA selbst nicht chemisch oder kovalent modifiziert.
  • Die Ausbeuten variieren, betragen jedoch typischerweise etwa 5 Gramm ARA-haltiges Phospholipid pro 100 g getrocknetes Myzel. Im Falle von M. alpina können weitere 10-30 Gramm Triglycerid pro 100 Gramm trockenes Myzel erhalten werden. Entweder das rohe Öl oder das raffinierte Produkt können für die Verabreichung an Menschen verwendet werden. In der hier verwendeten Definition für ARASCO sollen beide mit umfasst sein.
  • Ein am meisten bevorzugtes Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von künstlicher Nahrung für menschliche Säuglinge, so dass die Konzentration von ARA in einer solchen Nahrung der Konzentration von ARA in der Muttermilch sehr nahe kommt. Tabelle 2 vergleicht die Zusammensetzung der Fettsäuren in ARASCO mit der in Muttermilch und künstlicher Säuglingsnahrung, die ARASCO enthält bzw. nicht enthält. Tabelle 2. Fettsäurezusammensetzung von Pilzölprodukten und Muttermilch.
  • ¹ Simopoulis, A., Omega-3 Fatty Acids in Health and Disease, pp. 115-156 (1990)
  • Wie man sieht, kommt die in der künstlichen Säuglingsnahrung mit dem ARASCO-Zusatz vorhandene ARA-Menge den ARA-Mengen in Muttermilch sehr nahe. Außerdem wurde die Gesamtfettsäurezusammensetzung der künstlichen Säuglingsnahrung durch die Zugabe des ARASCO nicht wesentlich geändert. Typischerweise können etwa 50 bis etwa 1000 mg ARASCO pro Liter künstlicher Säuglingsnahrung verwendet werden. Die spezielle erforderliche Menge an ARASCO hängt vom ARA-Gehalt ab. Sie kann von etwa 10 bis etwa 50% der Fettsäuren im Öl variieren. Typischerweise beträgt der ARA-Gehalt jedoch etwa 30%. Wenn der ARA- Gehalt etwa 30% beträgt, beträgt eine besonders bevorzugte Zusatzmenge etwa 600 bis 700 mg ARASCO pro Liter künstlicher Säuglingsnahrung. Eine solche Menge verdünnt die bereits vorhandenen Fettkomponenten einer künstlichen Säuglingsnahrung wie Similac® (Ross Laboratories, Columbus, Ohio) um nur einen Teil ARASCO auf fünfzig Teile in der Nahrung enthaltener Öle. Vorzugsweise ist das ARASCO im wesentlichen frei von EPA.
  • Wenn in dem beschriebenen Verfahren Pythium insidiosum verwendet wird, besteht das extrahierte ARA-haltige Öl vorwiegend aus Phospholipid. Wenn in diesem Verfahren Mortierella alpina verwendet wird, besteht das ARAhaltige Öl vorwiegend aus Triglycerid. Beide Formen von ARASCO sind als Additive zu künstlicher Säuglingsnahrung geeignet. Erstere versorgt die Nahrung nicht nur mit ARA; sondern auch mit einem Emulgator, d. h. Phosphatidylcholin, das üblicherweise zu kommerzieller künstlicher Säuglingsnahrung gegeben wird. Das Öl aus M. alpina ist wahrscheinlich ökonomischer herzustellen.
  • Das ARA-haltige Öl der vorliegenden Erfindung hat neben seiner Verwendung als Zusatz zu künstlicher Säuglingsnahrung noch viele andere Anwendungen. Wie dem Fachmann bekannt ist, gibt es viele Krankheiten, die mit ARA-Mangel verbunden sind, wie Marasmus (Vajreswari et al., Metabolism 39: 779-782 (1990)) oder atopische Krankheiten (Melnik, B., Monatsschr. Kinderheilk., 138: 162-166 (1990)). In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden diese Krankheiten behandelt, indem man eine pharmazeutisch effektive Menge des Öls der vorliegenden Erfindung verabreicht. Das Öl kann nach Ermessen des Arztes enteral, topisch oder parenteral verabreicht werden.
  • Wie der Fachmann weiß, ist die Verkapselung ein effektives Verfahren zur enteralen Verabreichung. Kapseln, die das Pilzöl enthalten, können an Personen verabreicht werden, die einen Nahrungszusatz von AR. A benötigen oder wünschen. Ein solches Verfahren ist besonders effektiv für die Verabreichung von ARA an schwangere oder stillende Frauen.
  • In Fällen, bei denen ARASCO verabreicht wird, um mit ARA-Mangel verbundene Krankheiten zu bekämpfen, sollte eine pharmazeutisch wirksame Menge verabreicht werden. Diese Menge kann vom Fachmann ohne aufwendige Versuche bestimmt werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft kosmetische Zusammensetzungen, die ARASCO enthalten. "Kosmetische Zusammensetzungen" bezieht sich auf solche Verbindungen, die als Kosmetika angewendet werden. Ein bevorzugtes Beispiel für eine solche Zusammensetzung ist eine Faltencreme. Solche kosmetischen Zusammensetzungen liefern ein effektives Mittel zum örtlichen Auftragen von ARA auf Haut, um die Aufrechterhaltung der Hautspannkraft zu unterstützen.
  • Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben wurde, werden die folgenden speziellen nichteinschränkenden Beispiele dargelegt, um die Erfindung näher zu erläutern.
    • Beispiel 1. Herstellung von P.-insidiosum-Lipid und Zugabe zu künstlicher Säuglingsnahrung
  • In einem 80-Liter-(Bruttovolumen)-Fermenter wurden 51 Liter Leitungswasser, 1,2 kg Glucose, 240 Gramm Hefeextrakt und 15 ml MAZU-210S®- Schaumverhütungsmittel miteinander kombiniert. Der Fermenter wurde 45 Minuten lang bei 121ºC sterilisiert. Während des Sterilisationsvorgangs wurden weitere 5 Liter Kondenswasser hinzugefügt. Der pH-Wert wurde auf 6,2 eingestellt, und dann wurde ungefähr 1 Liter Inokulum (mit einer Zelldichte von 5-10 g/l,) von Pythium insidiosum (ATCC #28251) hinzugefügt. Die Rührgeschwindigkeit wurde auf 125 U/min (250 cm/s Geschwindigkeit der Spitze) eingestellt, und die Belüftungsrate wurde auf 1 SCFM (standard cubic feet per minute) eingestellt. In der 24. Stunde der Inbetriebnahme wurde die Belüftungsrate auf 3 SCFM erhöht. In der 28. Stunde wurden weitere 2 Liter 50%iges Glucosesirup (1 kg Glucose) hinzugefügt. In der 50. Stunde wurde der Fermenter abgeerntet, was zu einer Ausbeute von etwa 2,2 kg Nassgewicht (ungefähr 15 g Trockengewicht) pro Liter führte. Die geerntete Biomasse wurde vor dem Gefriertrocknen auf einer Nutsche zu einem Kuchen mit hohem Feststoffanteil (50% Feststoffanteil) gepresst. Die getrocknete Biomasse wurde in einem Mörser gemahlen und bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren 2 Stunden lang mit 1 Liter Hexan pro 200 Gramm trockener Biomasse extrahiert. Dann wurde das Gemisch filtriert, und das Filtrat wurde eingedampft, was etwa 5-6 Gramm rohes Öl pro 100 Gramm trockener Biomasse ergab. Dann wurde die Biomasse 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 1 Liter Ethanol pro 20 g trockener Biomasse erneut extrahiert; filtriert, und das Lösungsmittel wurde verdampft, was weitere 22 g rohes Öl pro 100 g trockener Biomasse ergab. Die zweite Fraktion bestand vorwiegend aus Phospholipiden, während die erste Fraktion ein Gemisch von Phospholipiden und Triglyceriden enthielt. Die kombinierten Fraktionen ergaben ein Öl, das etwa 30-35% Arachidonsäure und kein nachweisbares EPA enthielt. Dieses Öl wurde in einer Zusatzmenge von 600 mg pro Liter hergestelltem Medium tropfenweise zu dem kommerziellen künstlichen Säuglingsnahrungsprodukt Simulac® (Ross Laboratories, Columbus, Ohio) gegeben.
    • Beispiel 2. Herstellung von M.-alpina-Lipid und Zugabe zu künstlicher Säuglingsnahrung
  • Mortierella alpina (ATCC #42430) wurde in einem 2-Liter-Schüttelkolben gezüchtet, der 1 Liter Leitungswasser und 20 Gramm Kartoffeldextrosemedium enthielt. Der Kolben wurde mit einem Planetenrührer ständig umgerührt und sieben Tage lang auf 25ºC gehalten. Nach dem Ernten durch Zentrifugation wurde die Biomasse gefriergetrocknet, was etwa 8 Gramm lipidreiches Myzel ergab. Die Myzelien wurden wie in Beispiel 1 mit Hexan extrahiert, und etwa 2,4 g rohes 01 wurde erhalten. Dieses Öl enthält etwa 23% Arachidonsäure und wurde in Konzentrationen von 1000 mg pro Liter tropfenweise zu der kommerziellen künstlichen Nahrung Similac® gegeben.

Claims (18)

1. Nährende oder pharmazeutische Zusammensetzung für den Menschen, die ein Pilzöl enthält, das Fettsäuren umfasst, wobei es sich bei 10 bis 50% der Fettsäuren um Arachidonsäure (ARA), vorwiegend in Form von Triglyceriden, handelt, wobei die Fettsäuren nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure (EPA) wie ARA enthalten und wobei das Pilzöl von einer Mortierella-Spezies erzeugt wird.
2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Pilzöl von Mortierella alpina erzeugt wird.
3. Nährende oder pharmazeutische Zusammensetzung für den Menschen, die ein unmodifiziertes Pilzöl enthält, das Fettsäuren umfasst, wobei die Fettsäuren 10 bis 50% Arachidonsäure (ARA) und nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure (EPA) wie ARA umfassen, wobei das Pilzöl weiterhin von Pythium insidiosum erhalten wird.
4. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das ARA enthaltende Pilzöl vor dem Einbau in die Zusammensetzung raffiniert wurde.
5. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Verhältnis von ARA zu EPA in dem Pilzöl größer als 10 : 1 ist.
6. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Verhältnis von ARA zu EPA in dem Pilzöl größer als 20 : 1 ist.
7. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Fettsäuren des Pilzöls 30% bis 50% ARA umfassen.
8. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei der es sich um eine künstliche Säuglingsnahrung handelt und die ARA in einer Menge enthält, die der Menge in der Muttermilch sehr nahe kommt.
9. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, die für die enterale Verabreichung an einen Menschen geeignet ist.
10. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, die für die parenterale Verabreichung an einen Menschen geeignet ist.
11. Verfahren zur Herstellung eines Arachidonsäure enthaltenden Öls, wobei das Öl weiterhin nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure wie Arachidonsäure umfasst, umfassend:
(a) Kultivieren von Pythium insidiosum in Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle enthält, wobei Luft durchgeleitet und das Kulturmedium gerührt wird, so dass Pythium insidiosum dazu gebracht wird, ein Öl zu erzeugen, das Arachidonsäure und nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure wie Arachidonsäure enthält;
(b) Ernten des Pythium insidiosum;
(c) Extrahieren des Öls aus dem geernteten Pythium insidiosum; und
(d) Gewinnen des Öls.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die in dem Öl vorhandenen Fettsäuren 10% bis 50% ARA umfassen.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die in dem Öl vorhandenen Fettsäuren 30% bis 50% ARA umfassen.
14. Verfahren gemäß Anspruch 11, 12 oder 13, wobei das Öl wenigstens 10 Teile Arachidonsäure pro Teil Eicosapentaensäure umfasst.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das Öl wenigstens 20 Teile Arachidonsäure pro Teil Eicosapentaensäure umfasst.
16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei die Menge des in dem Kulturmedium gelösten Sauerstoffs während der gesamten Kultivierung auf 10% bis 50% des Luftsättigungswerts des Mediums gehalten wird.
17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 16, wobei die Kohlenstoffquelle Glucose ist, die in einer Konzentration von 10 bis 100 g Glucose pro Liter Medium bereitgestellt wird, und die Stickstoffquelle Hefeextrakt ist, der in einer Konzentration von 2 bis 15 g Hefeextrakt pro Liter Medium bereitgestellt wird.
18. Raffiniertes, Arachidonsäure (ARA) enthaltendes Pilzöl, wobei die in dem Pilzöl vorhandenen Fettsäuren 30% bis 50% ARA und nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure (EPA) wie ARA umfassen und wobei das Pilzöl aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Pilzölen, die von einer Mortierella-Spezies erzeugt werden und ARA vorwiegend in Form von Triglyceriden enthalten, und Pilzölen, die von Pythium insidiosum erzeugt werden, besteht, wobei das Pilzöl zur Verwendung bei der Herstellung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 10 geeignet ist.
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