DE69433713T2 - Für die behandlung neurologischer erkrankungen nützliche methoden und pharmazeutische zusammensetzungen - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung betrifft therapeutische Anwendungen zur Behandlung von neurologischen Störungen, einschließlich bestimmten neurodegenerativen Krankheiten und psychiatrischen Störungen, wie sie in den Ansprüchen definiert sind, durch Gabe einer Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Öles aufweist, das Triglyceride und / oder Phospholipide aufweist, welche Docosahexaensäure (DHA) enthalten und / oder ein Öl aufweist, das Triglyceride und / oder Phospholipide aufweist, welche Arachidonsäure (ARA) enthalten, für eine Person, die solch eine Behandlung benötigt. Die Öle können als pharmazeutische Zubereitung, als Nahrungsergänzungsmittel oder in Form eines Nahrungsmittelproduktes durch Ersatz eines Anteils des Pflanzenöls oder Fetts darin gegeben werden.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das menschliche Hirn und andere neurale Gewebe sind mit langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren hoch angereichert, die, wie man glaubt, eine wichtige Rolle darin spielen, die Struktur, Fluidität und Funktion von Zellmembranen in diesen Geweben zu beeinflussen. Arachidonsäure (die im weiteren als ARA bezeichnet wird), ist eine langkettige, ungesättigte Fettsäure der ω–6-Klasse (5, 8, 11, 14-Eicosatetraensäure, 20:4ω–6), und es ist die im menschlichen Körper am häufigsten vorkommende mehrfach ungesättigte C20-Fettsäure. Zusätzlich zu dieser Schlüsselrolle als Strukturlipid ist ARA außerdem ein direkter Vorläufer für eine Anzahl von im Blutkreislauf befindlichen Eicosanoide wie Prostaglandin E2 (PGE2), Prostacyclin I2 (PGI2), Thromboxan A2 (TXA2) und Leukotriene B4 (LTB4) und C4 (LTC4). Diese Eicosanoide haben regulatorische Wirkungen auf den Lipoprotein-Stoffwechsel, die Blutfließeigenschaften, den Gefäßtonus, die Leukozytenfunktion und die Thrombozytenaktivierung. Im Menschen wird ARA nicht de novo synthetisiert, aber es kann durch Verlängerung und Sättigung von Linolsäure synthetisiert werden, einer essentiellen Fettsäure, die mit der Nahrung aufgenommen werden muss.
  • Docosahexaensäure (die im weiteren als DHA bezeichnet wird) ist die häufigste Fettsäure der strukturellen Bestandteile der grauen Substanz des menschlichen Hirns und anderer Nervengewebe. DHA kann de novo im Menschen nicht synthetisiert werden, aber es gibt Anhaltspunkte dafür, dass diese ω–3 Fettsäure von einigen Zelltypen synthetisiert werden kann, wie Astrozyten, wenn geeignete langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäuren in der Nahrung vorhanden sind. S. Moore et al., Journal of Neurochemistry 56 (1991), Seiten 518 bis 524. Man glaubt, dass das meiste DHA, was man im Hirn und Retinazellmembranen findet, aus der Nahrung stammt.
  • Nach dem Stand der Wissenschaft ist es wohlbekannt, dass die Zufuhr von mehrfach ungesättigten Fettsäuren während der Periode des schnellen Hirnwachstums wichtig ist, um irreversible Schäden an Hirnzellen zu vermeiden. Menschliche Kinder scheinen teilweise eine schwach ausgeprägte Fähigkeit zu haben, DHA zu synthetisieren, aber dieser Mangel kann dadurch ausgeglichen werden, dass Kinder mit Muttermilch gefüttert werden, die eine gute Quelle für essentielle Fettsäuren darstellt, besonders für DHA und ARA. Sanders et al., American Journal of Clinical Nutrition 31 (1978), Seiten 805 bis 813. Neuere Studien, bei denen die Leistungsfähigkeit von Kindern mit Standardintelligenztests verglichen wurden, wobei die eine Gruppe mit Muttermilch und die andere Gruppe mit kommerzieller Kindernahrung gefüttert wurde, deuten darauf hin, dass es eine direkte Korrelation zwischen dem Anteil von aufgenommener Muttermilch in der Nahrung und dem IQ gibt. A. Lucas, R. Morley, T.J. Cole, G. Lister und C. Leeson-Payne Lancet 339 (1992), Seiten 261 bis 264. Diese Studien deuten darauf hin, dass eine diätetische Interventionstherapie die Menge von DHA beeinflussen kann, die für die strukturelle Entwicklung des Nervensystems verfügbar ist.
  • Man hat beobachtet, dass die DHA-Mengen in zwei größeren Phospholipidklassen, Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylcholin, im Hirngewebe von Alzheimer-Patienten signifikant reduziert sind. Dagegen zeigten Kontrollproben, die von Patienten fortgeschrittenen Alters entnommen wurden, die keine klinischen Manifestation von Demenz oder einer anderen Hirnleistungsstörung zeigten, keine signifikanten Änderungen in der Zusammensetzung von Fettsäuren in diesen zwei Phospholipidklassen. Diese Befunde legen nahe, dass die Veränderungen der DHA-Konzentration im Hirngewebe von Alzheimer-Patienten nicht das Ergebnis eines normalen Alterungsprozesses sind, sondern dass sie spezifisch für pathologische Mechanismen sind, die an diesen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind. M. Soderberg, C. Edlund, K. Kristensson und G. Daliner, Lipids 26 (1991), Seiten 421 bis 425.
  • Peroxysomale Krankheiten sind eine Gruppe von degenerativen neurologischen Störungen, die durch erhöhte Werte von sehr langkettigen Fettsäuren gekennzeichnet sind, was daher rührt, dass die betroffenen Patienten eine verminderte Fähigkeit aufweisen, diese Fettsäuren abzubauen. Diese Krankheiten stehen so mit einander in Beziehung, dass sie alle ihre Ursache in einem Defekt zu haben scheinen, der in subzellulären Organellen lokalisiert ist, die Peroxysomen genannt werden. N. Gordon „Peroxysomal Disorders", Brain Development 9, (1987), Seiten 571 bis 575. In Abhängigkeit der Stärke des peroxysomalen Funktionsverlustes bei der entsprechenden Krankheit werden diese peroxysomalen Krankheiten in drei verschiedene Klassen eingeteilt. A. C. Theil, European Journal of Pediatrics, 151 (1992) Seiten 117 bis 120.
  • Die erste Gruppe der peroxysomalen Krankheiten ist durch einen nahezu kompletten Verlust von Peroxysomen und peroxysomalen Funktionen gekennzeichnet. Zu diesen Krankheiten gehören das Zellweger-Syndrom, die neonatale Adrenoleukodystrophie, die infantile Refsum-Krankheit und die Hyperpipecholinsäure Azidose.
  • Die zweite Gruppe der Krankheiten sind durch einen Verlust multipler peroxysomaler Funktionen charakterisiert und schließen die Rhizomele Chondrodisplasia punktata und das Zellweger-ähnliche Syndrom ein. Die Krankheiten der Gruppe drei sind von einem Verlust von nur einer einzigen peroxysomalen Funktion charakterisiert und schließen die Adrenoleukodystrophie, Adrenomyeloneuropathie, Acetyl-CoA-Oxidasemangel, Mangel des bifunktionalen Proteins, Thiolase-Mangel, Hyperoxalurie Typ I, Akatalasämie und adulter Refsum-Krankheit. Das klinische Bild von Patienten mit peroxysomalen Krankheiten zeigt große Unterschiede in ihrer phänotypischen Ausprägung, die signifikant mit dem Alter des Patienten variiert. Unabhängig davon sind bei allen Patienten neurologische Funktionen progressiv beeinträchtigt, was oftmals zu einer Verschlechterung der autonomen Funktionen und zum Tod in frühem Alter führt.
  • Neuere Studien zur Zusammensetzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren in Geweben von Patienten mit peroxysomalen Krankheiten haben gezeigt, dass auch wenn die Gesamtmenge von Fettsäuren in diesen Geweben normal ist, es signifikante Änderungen in der Fettsäurezusammensetzung in den Geweben des Patienten gibt. Diese Patienten haben eine signifikante Verminderung der Gesamtmenge von DHA und ARA in ihren Lipidserumzusammensetzungen. Die Plasmalogenserumspiegel sind genauso vermindert.
  • Das Usher-Syndrom ist eine autosomal rezessiv genetische Krankheit, die mit einer Degeneration von Netzhautzellen assoziiert ist, was Retinitis Pigmentosa verursacht. Die Netzhautzellen enthalten extrem große Mengen von DHA, die in den Phospholipiden des Fotorezeptors verestert sind, welche die äußeren Segmente der Netzhautzellen ausmachen. Bazan und Mitarbeiter haben kürzlich herausgefunden, dass die Plasmaphospholipide von Usher-Patienten signifikant weniger DHA und ARA enthalten als die Plasmaphospholipide von nichtbetroffenen Patienten. N. G. Bazan, B. L: Scott, T. S. Reddy und M. Z. Pelias, Biochem. Biophys. Res. Comm. 141 (1986), Seiten 600 – 604.
  • Wissenschaftler haben zusätzlich herausgefunden, dass Patienten, die an anderen klinischen Zuständen leiden, wie senile Demenz, Diabetes induzierte Neuropathie, Multiple Sklerose, Schizophrenie und Neuropathien, die mit hohen Dosen von Schwermetallen, wie Blei, Aluminium und Quecksilber assoziiert sind, genauso häufig DHA- und/oder ARA-Spiegel in ihren Serumlipiden haben, die signifikant erniedrigt sind, im Vergleich mit den Spiegeln, die man in gesunden Personen findet. Zum Beispiel haben neuere Studien eine Korrelation zwischen einerseits Veränderungen im Grad der Veresterung von ARA innerhalb der Phospholipide von Thrombozyten und andererseits der Häufigkeit von schizoaffektiven Krankheiten bei Patienten nachgewiesen. L. Demisch et al., Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 46 (1992), Seiten 47 – 52. Über eine Evidenz für eine abnormale Biochemie der essentiellen Fettsäuren bei Patienten mit Schizophrenie ist ebenso berichtet worden. D. F. Horrobin, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 46 (1992), Seiten 71 – 77.
  • Obwohl es einen gewissen Fortschritt darin gibt, neurodegenerative Krankheiten, wie Alzheimer und verschiedene peroxysomale Krankheiten zu verstehen, hat man bisher keine effektiven Behandlungsmöglichkeiten gefunden.
  • US-A-5,130,242 und WO89/00606 beschreiben die mikrobielle Produktion von ungesättigten Fettsäuren, aber sie geben keine Vorschläge, um diese mikrobiellen Öle in der Behandlung von neurologischen Krankheiten einzusetzen.
  • EP-A-0404058 lehrt den Vorteil einer Versorgung einer Mixtur von ungesättigten Fettsäuren in der Nahrung von normalen Kindern.
  • EP-A-0622463 schlägt die Gewinnung von DHA durch Kultivierung von marinen Mikroalgen vor, aber die einzige Lehre eines spezifischen Gebrauchs für die DHA, die auf diese Weise erhalten wurde, ist eine Kreuzreferenz zu EP-A-0342795, was weiter unten besprochen wird.
  • Martinez, et al., in New Developments in Fatty Acids Oxidation, P. Coates ed., vol. 375, 1992, Seiten 398 – 397, und in World Review of Nutrition and Dietetics, vol. 66, 1991, Seiten 87 – 102, maßen die relativen Mengen von verschiedenen Fettsäuren im Gewebe einer Patientenpopulation und einer Kontrollpopulation. Martinez beobachtete, dass DHA-Mangel im Gewebe mit peroxysomalen Krankheiten korrelierte, aber Martinez war nicht in der Lage, aus den Daten zu schließen, was den DHA-Mangel, der in der Patientenpopulation beobachtet wurde, verursachte.
  • JP-A-02730081 schlägt vor, ARA durch Kultivierung von Entomophthora sp. Pilzen zu gewinnen, aber dort gibt es keine Lehre einer spezifischen Nutzung des erhaltenen ARA in dieser Weise, außer einer allgemein gehaltenen Aussage, dass ARA für Medikamente, Gesundheitsnahrung und Kosmetik geeignet wäre.
  • EP-A-0342795 beschreibt Studien zum Lernen und Gedächtnis bei Ratten; die mit verschiedenen Fettsäure-Derivaten gefüttert wurden. Alle diese in der Referenz beschriebenen Diäten enthalten EPA und ARA zusätzlich zu DHA.
  • EP-A-0234733 beschäftigt sich mit der Behandlung von Senilität mit Mischungen von Metaboliten von Gamma-Linolsäure (GLA).
  • Bates et al., in Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry, vol. 52, 1989, Seiten 18 – 22, berichten über Studien mit hochgradig EPA-haltigem Fischöl, das ebenso einen geringeren Anteil von DHA enthält, welches Multiple Sklerose-Patienten gegeben wurde.
  • EP-A-0218460 beschäftigt sich mit der Behandlung von Senilität mit Mischungen von Metaboliten, von Gamma-Linolsäure (GLA).
  • WO92/13086 lehrt die Methode, Nahrung von Individuen mit ARA zu ergänzen, und das eine solche Ergänzung für Individuen vorteilhaft ist, die einen bekannten ARA-Mangel aufweisen.
  • US-A-5198468, EP-A-0599576, EP-A-0454102 und EP-A-0347056 handeln von der Behandlung von Schizophrenie mit Fettsäure-Mischungen.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine therapeutische Anwendung zur Behandlung von neurologischen Störungen vorzuschlagen, bei denen der Serum-, Gewebe- oder Membranspiegel von essentiellen Fettsäuren DHA und ARA betroffen ist.
  • Die vorliegende Erfindung schlägt die Verwendung eines aus Triglyceriden und/oder Phospholipiden bestehenden Docosahexaensäure (DHA) enthaltenden Öles zur Herstellung einer Mischung für die Behandlung einer neurologischen Störung in Verbindung mit einer DHA-Mangel-assoziierten Pathologie, wobei die genannte Störung Retinitis Pigmentosa ist, und wobei die genannte Mischung für orale, nasale oder topische Gabe angepasst ist, vor.
  • Die vorliegende Erfindung schlägt weiterhin die Verwendung eines aus Triglyceriden und/oder Phospholipiden bestehenden Arachidonsäure (ARA) enthaltenden Öles zur Herstellung einer Mischung für die Behandlung einer neurologischen Störung in Verbindung mit einer ARA-Mangel-assoziierten Pathologie, genannte Störung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus multipler Sklerose und Retinitis Pigmentosa, vor.
  • Die vorliegende Erfindung schlägt weiterhin die Verwendung eines aus Triglyceriden und/oder Phospholipiden bestehenden Docosahexaensäure (DHA) enthaltenden Öles und eines aus Triglyceriden und/oder Phospholipiden bestehenden Arachidonsäure (ARA) enthaltenden Öles zur Herstellung einer Mischung für die Behandlung einer neurologischen Störung in Verbindung mit einer DHA- und ARA-Mangel-assoziierten Pathologie, genannte Störung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus multipler Sklerose und Retinitis Pigmentosa, wobei die genannte Mischung für orale, nasale oder topische Gabe angepasst ist, vor.
  • Die vorliegende Erfindung schlägt weiterhin die Verwendung eines aus Triglyzeriden und/oder Phospholipiden bestehenden Docosahexaensäure (DHA) enthaltenden Öles, wobei das Öl ein Verhältnis von DHA zu EPA von mindestens 10:1 hat, zur Herstellung einer Mischung für die Behandlung einer neurologischen Störung in Verbindung mit einer DHA-Mangel-assoziierten Pathologie, genannte Störung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus diabetischer Neuropathie und multipler Sklerose, vor.
  • Die vorliegende Erfindung schlägt weiterhin die Verwendung eines aus Triglyceriden und/oder Phospholipiden bestehenden Arachidonsäure (ARA) enthaltenden Öles, wobei das Öl ein Verhältnis von ARA zu EPA von mindestens 10:1 hat, zur Herstellung einer Mischung für die Behandlung einer neurologischen Störung in Verbindung mit einer ARA-Mangel-assoziierten Pathologie, wobei genannte Störung eine diabetische Neuropathie ist, vor.
  • Die vorliegende Erfindung schlägt weiterhin die Verwendung eines aus Triglyceriden und/oder Phospholipiden bestehenden Docosahexaensäure (DHA) enthaltenden Öles, wobei das Öl ein Verhältnis von DHA zu EPA von mindestens 10:1 hat, und eines aus Triglyceriden und/oder Phospholipiden bestehenden Arachidonsäure (ARA) enthaltenden Öles, wobei das Öl ein Verhältnis von ARA zu EPA (Eicosapentaensäure) von mindestens 10:1 hat, zur Herstellung einer Mischung für die Behandlung einer neurologischen Störung in Verbindung mit einer DHA- und ARA-Mangel-assoziierten Pathologie, wobei genannte Störung eine diabetische Neuropathie ist.
  • DHA und ARA liegen in Form von natürlichen Lipidkomplexen aus Triglyzeriden, Phospholipiden und Mischungen daraus vor. DHA und ARA liegen vorzugsweise in der Form von Triglyzeriden vor, obwohl sie auch in der Form von Phospholipiden vorliegen können. Sie werden als Öle von mikrobiellen Einzellern durch die Kultivierung von DHA-produzierenden Mikroorganismen oder ARA-produzierenden Organismen unter Öl-produzierenden Bedingungen gewonnen.
  • Entsprechend der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Mikroorganismen, die ein mikrobielles Einzelleröl, welches DHA oder ARA enthält, produzieren können, in einem Fermenter kultiviert, der eine Nährlösung enthält, die geeignet ist, das Wachstum von solchen Organismen zu unterstützen. Vorzugsweise ist das produzierte mikrobielle Öl mit den interessierenden Fettsäuren angereichert, was bedeutet, dass es mindestens 20 Gewichtsprozente DHA oder 10 Gewichtsprozente ARA enthält.
  • Jeder Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein DHA oder ARA enthaltendes mikrobielles Öl zu produzieren, kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Mikroorganismen können dadurch identifiziert werden, indem man bestimmt, ob DHA- oder ARA-Öle in den Fettsäureprofilen der geernteten Biomasse einer Kultur von Mikroorganismen vorhanden sind. Diese Profile erhält man typischerweise durch Gaschromatographie von Methylesterderivaten von Fettsäuren, die in der Probe vorhanden sind.
  • Wenn hier die Bezeichnung Mikroorganismus benutzt wird oder ein bestimmter Typ eines Mikroorganismus, schließt dies den Wildtypstamm, mutante Stämme oder rekombinante Stämme ein. Wildtypen und rekombinante Mikroorganismen zur Produktion von aus mikrobiellen Zellen gewonnenem Öl, das DHA oder ARA enthält, können benutzt werden, um die DHA-enthaltenden und ARA-enthaltenden mikrobiellen Öle zu produzieren. Mikroorganismen, die ausgewählt oder geschaffen wurden, um kostengünstigere Substrate effizient zu nutzen, während sie dieselbe Menge des DHA- oder ARA-enthaltenden Öls aus Einzellern produzieren, sind verglichen mit dem Wildtypmikroorganismus besonders nützlich für die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • Für die Produktion von DHA-enthaltenden mikrobiellen Ölen können Spezies von photosynthetisch aktiven Algen, wie Chattonella, Skeletonema, Thalassiosira, Isochrysis, Hymenomonas oder Kryptomonas verwendet werden. Bevorzugte Mikroorganismen sind heterotrophe Algenspezies, einschließlich aber nicht ausschließlich Dinophyceae, zum Beispiel Crypthekodinium; oder Pilze wie Chytridiomyceten, zum Beispiel Thraustochytrium oder Schizochytrium oder für die Oomyceten, zum Beispiel Mortierella, Saprolegnia oder Mucor.
  • Bevorzugte Mikroorganismen zur Produktion DHA sind Dinoflagellaten, einschließlich Crypthecodinium. Besonders bevorzugt ist Crypthecodinium cohnii, ein obligater Heterotroph, der in der US-Anmeldung Nr. 479,135, eingereicht am 13. Februar 1990, beschrieben ist. C. cohnii wird bevorzugt, weil er Fettsäuren produziert, in denen DHA die einzige mehrfach ungesättigte Fettsäure ist, die in Mengen größer als ein Prozent des totalen Gehaltes von mehrfach ungesättigten Fettsäuren vorkommt, eine Menge, die entscheidend ist, um die Verfahren der vorliegenden Erfindung durchzuführen. Proben eines Stammes von C. cohnii, der reichliche Mengen von DHA produziert, wurden bei der amerikanischen biologischen Hinterlegungsstelle (American Type Culture Collection) in Rockville, Maryland, hinterlegt und erhielt die ATCC Nummer 40750.
  • Zur Produktion von ARA geeignete Mikroorganismen schließen Spezies der Algen wie Porphyridium, Ochromonas und Euglena ein sowie Pilze wie Pythium und Mortierella. Viele von diesen Spezies, die ARA produzieren, produzieren ebenso erhebliche Mengen von Eikosapenthaensäure (EPA). Überraschenderweise wurde gefunden, dass P. Insidiosum und M. Alpina ARA produzieren, aber substantiell frei von EPA sind. „Substantiell frei" wird so definiert, dass das Verhältnis von ARA zu EPA mindestens 5:1 ist. Vorzugsweise ist das Verhältnis mindestens 10:1. Es ist höchst wünschenswert, dass nicht mehr als ein Prozent des Fettsäuregehaltes des Öls EPA ist. Wie bei Fischölen führen hohe EPA-Mengen in Nahrungsergänzungsmitteln zu einer verminderten Fähigkeit, ARA aus Linolsäure der Nahrung zu bilden. Weiterhin ist die Gabe von EPA-haltigem Fischöl an Patienten, insbesondere ältere, hypertensive oder schwangere, die erhöhte Prothrombin-Werte haben könnten, auf Grund der blutverdünnenden Effekte von EPA ungeeignet. Obwohl diese ARA- und EPA- produzierenden Pilzarten in dem Verfahren dieser Erfindung benutzt werden können, werden dementsprechend vorzugsweise Spezies benutzt, die keine signifikanten Mengen von EPA produzieren. Bevorzugte Spezies schließen Pythium insidiosum und Mortierella alpina ein. Beide Spezies sind kommerziell erhältlich und in der amerikanischen Hinterlegungsstelle in Rockville, Maryland hinterlegt und haben die ATCC-Nummern 28251 und 42430.
  • Obwohl also mikrobielle Spezies, die sowohl DHA als auch EPA produzieren, als Quelle von DHA-Öl entsprechend dieser Erfindung benutzt werden können, ist es besser, Spezies zu benutzen, die substantiell frei von EPA sind. Vorzugsweise ist dieses Verhältnis kleiner als 10:1. Es ist höchst wünschenswert, dass nicht mehr als ein Prozent des Fettsäuregehaltes des Öles EPA ist.
  • Produktion des DHA-enthaltenden Öls
  • Die DHA produzierenden Mikroorganismen können in einem einfachen Medium kultiviert werden, dass eine Kohlenstoffquelle wie Glukose und eine Stickstoffquelle wie Hefeextrakt oder Pepton enthält. Die Nutzung von diesen Komponenten in einer Lösung wie Meerwasser erzielt ökonomisch bedeutsame Wachstumsraten und Zelldichten. Während des Verlaufs einer drei- bis fünftägigen Fermentation kann man zum Beispiel C. cohnii-Zelldichten erhalten, die mindestens 10 Gramm Biomasse pro Liter Lösung und vorzugsweise 20 bis etwa 40 Gramm pro Liter betragen.
  • Obwohl die Kultivierung in jedem geeigneten Fermenter geschehen kann, werden die Organismen vorzugsweise entweder in einem Rührtank-Fermenter oder in einem Airlift-Fermenter gezüchtet. Wenn ein Rührtank-Fermenter ausgewählt wird, erfolgt die Bewegung entweder durch Benutzung einer Hocheffizienzturbine vom Rushton-Typ oder durch Steilblatt- oder Schiffsschrauben. Die Bewegung und das Durchblasen versorgen die Mikroorganismen mit frischem Sauerstoff. Die Bewegung wird normalerweise mit dem Wachstum der Biomasse erhöht, weil der Bedarf an Sauerstoff wächst. Es ist wünschenswert, die Geschwindigkeit an der Spitze nicht größer als 500 cm pro Sekunde werden zu lassen, vorzugsweise nicht größer als 300 cm pro Sekunde. Die Auswahl von Mikroorganismus-Stämmen, die in der Lage sind, größeren Geschwindigkeiten der Spitze zu widerstehen, ohne durch Scherkräfte zerstört zu werden, liegt innerhalb des Geltungsbereiches des Standes der Technik.
  • Die Mikroorganismen, die für die Produktion von DHA-haltigem Öl genutzt werden, können in jeder geeigneten Nährflüssigkeit gezüchtet werden. Wie vorher erwähnt wurde, ist Meerwasser ein geeignetes Medium für die Nährlösung für viele Organismen. Das Meerwasser kann entweder natürlich sein, gefiltert oder eine künstliche Mixtur, jedes von diesem kann mit Wasser verdünnt werden, um den Salzgehalt zu reduzieren, wie ½ bis ¼ der normalen Stärke, oder konzentriert bis zum Zweifachen der normalen Stärke. Ein bevorzugtes Medium ist künstliches Seewasser der Marke Instant Ocean® oder alternativ eine Mixtur aus 4,5 bis 20 Gramm NaCl pro Liter, 1,23 Gramm pro Liter MgSO4 7 H2O und 90 Milligramm pro Liter CaCl2 in Wasser. Mikronährstoffe können zugegeben werden und notwendig sein, wenn ein definiertes Medium gebraucht wird. Jedoch sind solche Mikronährstoffe gemäß dem Stand der Technik bekannt und im Allgemeinen im Meerwasser oder Leitungswasser vorhanden. Wenn der ausgewählte Organismus heterotroph ist, so wie Crypthecodinium und Thraustocytrium, dann wird eine Quelle von reduziertem Kohlenstoff hinzu gegeben. Crypthecodinium und Thraustochytrium benötigen eine Quelle an reduziertem Kohlenstoff zum Wachstum.
  • Vorzugsweise wird nach der Zugabe des Meerwassermediums zum Fermenter der das Medium enthaltende Fermenter sterilisiert und gekühlt, bevor die Nährstoffe und eine ausgesäte Kultur von Mikroorganismen, die kultiviert werden sollen, dazu gegeben. Obwohl es möglich ist, die Nährstoffe zusammen mit dem Meerwasser zu sterilisieren, kann eine Sterilisation in dieser Weise ein Verlust der verfügbaren Glukose nach sich ziehen. Die Nährstoffe und Mikroorganismen können zusammen oder hintereinander zugeben werden.
  • Eine effektive Saatkonzentration kann gemäß dem Stand der Technik bestimmt werden. Wenn ein Rührtank-Fermenter benutzt wird, ist die Zugabe einer Population von über 0,05 bis 1,0 Gramm Trockengewichtäquivalenten pro Liter zu Beginn der Fermentation vorzuziehen. Zum Beispiel wären mindestens über 1 bis 5 × 106 Zellen von C. cohnii pro Milliliter geeignet. Auf diese Weise werden für einen 30-Liter-Fermenter ein bis drei Liter des zu säenden Mediums hinzugegeben, das lebende Zellen mit einer Dichte von 10 bis 20 Gramm Trockengewicht pro Liter enthält.
  • Der Sauerstoff-Spiegel entspricht vorzugsweise gelöstem Sauerstoff bei mindestens über 10 Prozent des Luftsauerstoffsättigungsspiegels. Die Biosynthese von DHA benötigt Sauerstoff und dementsprechend benötigen größere Ausbeuten von DHA gelöste Sauerstoffspiegel von etwa 10 bis 50 Prozent des Luftsauerstoffsättigungsspiegels. Zum Beispiel erzielt eine Bewegungsgeschwindigkeit der Spitze von 150 bis 200 cm pro Sekunde in Kombination mit einer Belüftungsrate von einem Volumen Luft pro Volumen des Fermenters pro Minute (VVM) einen Spiegel von gelöstem Sauerstoff von etwa 20 Prozent bis etwa 30 Prozent bei Biomassendichten von etwa 25 Gramm Trockengewicht pro Liter einer C. Cohnii-Kultur. Höhere Zelldichten können höhere Spiegel von gelöstem Sauerstoff benötigen, was durch eine höhere Belüftungsrate durch O2-Durchblasung oder durch Erhöhung des Luftdrucks im Fermenter erreicht werden kann.
  • Geeignete Kohlenstoffquellen sind nach dem Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel kann Kohlenstoff in der Form von Mono- oder Disachariden, wie Sukrose, Laktose, Fruktose oder Glukose geliefert werden. Autotrophe Organismen benutzen Kohlendioxid als Kohlenstoffquelle. Viele Organismen wachsen genauso auf reduzierten, komplexeren Kohlenstoffquellen, wie Molasse, Fruktose-Mais-Sirup und hydrolisierter Stärke. Typischerweise wird eine Fermentation mit etwa 20 bis 50 Gramm pro Liter Glukose eingeleitet. Weitere Glukose wird während der Fermentation zugefügt, soweit sie benötigt wird. Alternativ kann mit ungefähr 50 bis 150 Gramm Glukose pro Liter begonnen werden, wodurch die Häufigkeit von weiteren Zugaben minimiert wird. Die Menge von Kohlenstoffquellen für andere Organismen kann leicht dem Stand der Technik entnommen werden.
  • Zusätzlich zu einer Quelle von reduziertem Kohlenstoff enthält das Medium eine Stickstoffquelle, wie etwa Hefeextrakt oder Pepton. Zum Beispiel kann Hefeextrakt der Marke Difco oder Marcor und Pepton der Marke Sheftone verwendet werden. Hefeextrakt und Pepton sind organische Stickstoffquellen, die außerdem Mikronährstoffe enthalten. Andere Stickstoffquellen können leicht aus dem Stand der Technik entnommen werden. Solche Bestandteile sind jedoch im Allgemeinen teurer als Hefeextrakt. Alle DHA oder ARA-produzierenden Algenstammvarianten, die in der Lage sind, Harnstoff, Ammoniak oder Nitrate als Stickstoffquelle zu verwenden, können gemäß dieser Erfindung verwendet werden.
  • Typischerweise wird die Fermentation mit etwa 6 bis 2 Gramm Hefeextrakt pro Liter begonnen. Mehr Hefeextrakt wird hinzugefügt wie benötigt. Ein typischer Fermentationsdurchlauf benötigt etwa 8 bis 15 Gramm Hefeextrakt in einem Durchlauf. Dementsprechend kann diese Menge von Hefeextrakt initial hinzugegeben werden mit einem reduzierten Bedarf an weiteren Zugaben. Die genaue Menge kann dem Stand der Technik entnommen werden. Im Allgemeinen liegt das Verhältnis von Glukose zu Hefeextrakt zwischen 2:1 bis 25:1.
  • Die Kultivierung kann bei allen lebenserhaltenden Temperaturen durchgeführt werden. Im Allgemeinen wachsen Mikroorganismen, wie Crypthecodinium oder Thraustochytrium in Temperaturbereichen von etwa 15 bis 34 °C. Einige Pilze wachsen effektiv in einem Temperaturbereich von etwa 10 bis 80 °C. Vorzugsweise wird die Temperatur bei etwa 20 bis 30 °C gehalten. Stämme, die bei höheren Temperaturen wachsen, werden bevorzugt, weil sie eine schnellere Verdopplungszeit haben und hierdurch die benötigte Gesamtzeit für die Fermentation verringern. Geeignete Temperaturbereiche können leicht dem Stand der Technik entnommen werden.
  • Die Kultivierung kann in einem weiten pH-Bereich, typischerweise von etwa 5,0 bis 9,0, durchgeführt werden. Vorzugsweise wird ein pH-Bereich von 6,0 bis 7,0 für die Wachstumsphase verwendet. Vor der Impfung wird eine Base, wie KOH oder NaOH, verwendet, um den pH des Mediums einzustellen. Während der späteren Phasen der Fermentation kann der pH des Nährmediums größer oder kleiner werden, wenn die Nährstoffe verbraucht werden. Wenn dies notwendig ist, kann der pH während der Fermentation durch Zugabe von geeigneter Säure oder Base eingestellt werden, um Alkalität oder Acidität zu korrigieren.
  • Die Produktion von mikrobiellem Öl wird in den Mikroorganismen durch die Induktion einer stationären Phase angeregt, indem der Kultur erlaubt wird, eine Phase der Stickstoff- oder Phosphatverarmung zu erreichen oder der Kultur zu erlauben, den pH zu senken. Eine Hefeextraktmangel kann dadurch erreicht werden, indem nur eine begrenzte Menge von Hefeextrakt zugeführt wird, so dass das Medium an seiner Stickstoffquelle verarmt, während ausreichende Glukosemengen für das Wachstum bleiben. Es ist das Verhältnis von Kohlenstoffquelle zu Stickstoffquelle, das die effiziente Produktion des Einzelleröls fördert. Wenn man z.B. Glukose und Hefeextrakt verwendet, beträgt vorzugsweise das Verhältnis von Kohlenstoffquelle zu Stickstoffquelle zum Zeitpunkt der Impfung etwa 10 bis 15 Teile Glukose auf einen Teil Hefeextrakt. Andere Verhältnisse für andere Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können aus dem Stand der Technik errechnet werden.
  • Nach der Induzierung der Öl-Produktion lässt man die Kultur ungefähr 24 zusätzliche Stunden wachsen. Während dieser Periode wird das DHA-haltige Einzeller-Öl synthetisiert und Öltropfen sind innerhalb der Zellen sichtbar, wenn diese mit einem Mikroskop beobachtet werden. Nach dem Stand der Technik kann die für die Fermentation benötigte Zeit leicht berechnet werden, um die erwartete Menge von Zellbiomasse, basierend auf der zugegebenen Menge von Hefeextrakt, zu erhalten. Nachdem diese Zeit abgelaufen ist, lässt man die Kultur für weitere 24 Stunden wachsen und erntet sie dann. Im Allgemeinen kultiviert man z.B. die Crypthecodinium- oder Thraustochytrium-Zellen für ungefähr 60 bis 90 Stunden, obwohl diese Zeit variiert werden kann.
  • Nimmt man z.B. den Crypthecodinium-Stamm mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 40750, dann besteht die resultierende Biomasse zu etwa 15 bis 30 Prozent aus extrahierbarem Öl. Eine Selektion des Stammes kann diesen Prozentsatz erhöhen.
  • Vorzugsweise besteht das Öl zu mehr als 70 Prozent aus Triglyzeriden, die im Allgemeinen die folgende Fettsäurezusammensetzung haben.
    • 15 – 20 % Myristinsäure (C14:0)
    • 15 – 25 % Palmitinsäure (C16:0)
    • 5 – 15 % Oleinsäure (C18:1)
    • 30 – 50 % DNA (C22:6)
  • Das Rohöl ist durch eine gelb-orange Farbe charakterisiert und ist bei Raumtemperaturflüssig. Wünschenswerterweise enthält das Öl mindestens etwa 20 Gewichtsprozente DHA, vorzugsweise etwa 40 Gewichtsprozente, am besten vorzugsweise 50 Gewichtsprozente DHA.
  • Die Organismen werden mit konventionellen Mitteln geerntet, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie durch Zentrifugation, Ausfällung oder Filtration und können sofort weiterverarbeitet oder für eine zukünftige Weiterverarbeitung getrocknet. werden. In jedem Fall kann das Öl leicht mit einer effektiven Menge von Lösungsmittel extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel können dem Stand der Technik entnommen werden. Bevorzugte Lösungsmittel schließen jedoch reines Hexan und superkritische Flüssigkeiten, sowie superkritisches CO2 ein. Bestimmte lipophile Antioxidantien, so wie β-Karotin, α-Tocopherol, Ascorbylpalmitat und BHT können vor der Extraktion hinzugegeben werden. Diese Komponenten helfen, das Öl vor Oxidation während der Extraktion und des Raffinierungsprozesses zu schützen.
  • Allgemeine Extraktionstechniken unter Verwendung von superkritischen Flüssigkeiten sind für die Extraktion von Öl aus ölreichen Pflanzensamen entwickelt worden (McHugh et al., Supercritical fluid Extraction, Butterworth, 1986). Jedoch sind diese Standardmethoden im Allgemeinen für die Extraktion von Mikroorganismen nicht anwendbar. Zum Beispiel haben sprühgetrocknete Algenzellen die Konsistenz von Mehl und der Fluss von superkritischem CO2 ist beschränkt, wenn die Mikroorganismenbiomasse komprimiert ist. Um die Kompression zu verhindern und einen effizienten Fluss und eine effiziente Extraktion zu erlauben, kann die Algenbiomasse mit 0,1 bis 5,0 Anteilen lipidfreier Strukturagenzien, wie Celite oder Kieselerde, gemischt werden. In einem 50ml-Reaktionsgefäß wurden bei 450 Atm. und 100 °C 86 Prozent des Öls von C. Cohnii in 25 Minuten extrahiert und 100 Prozent wurden in 85 Minuten extrahiert.
  • Wenn die Extraktionslösung Hexan ist, ist ein geeignetes Verhältnis von Hexan zur Trockenbiomasse etwa 4 Liter Hexan pro Kilogramm Trockenbiomasse. Das Hexan wird vorzugsweise mit der Biomasse in einem gerührten Reaktionsgefäß bei einer Temperatur von ungefähr 20 bis 50 °C für etwa zwei Stunden gemixt. Nach dem Mixen wird die ölhaltige Biomasse gefiltert und von dem Hexan getrennt. Alternativ kann eine feuchte Biomassenpaste mit einem festen Anteil von 30 bis 35 Prozent direkt mit Hilfe von polareren Lösungsmitteln extrahiert werden, wie z.B. Ethanol, Isopropanol oder Mischungen aus Hexan und Isopropanol. Das Lösungsmittel wird von dem Öl mittels Destillierungstechniken entfernt, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind. Ein konventionelles Equipment zur Verarbeitung von Samenöl ist geeignet, um die Filtration, Separation und Destillation durchzuführen. Zusätzliche Verfahrensschritte, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, können durchgeführt werden, wenn dieses notwendig oder wünschenswert für eine bestimmte Anwendung ist. Diese Verarbeitungsschritte sind auch denen ähnlich, die bei der konventionellen Verarbeitung von Pflanzenöl durchgeführt werden und die Auftrennungvon DHA-angereicherten polaren Lipidfraktionen erlauben.
  • Produktion von ARA-haltigem Öl
  • ARA-produzierende Pilze oder Algen werden unter geeigneten ARA-haltigen, ölproduzierenden Kultivierungsbedingungen kultiviert. Wenn es gewünscht wird, kann der Mikroorganismus am Anfang in einer Schüttelflasche gezüchtet und dann in einen Fermenter eingebracht werden. Die Zusammensetzung des Wachstumsmediums kann variieren, aber es enthält immer Kohlenstoff- und Stickstoffquellen. Eine bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Glukose, die Mengen können im Bereich von 10 bis 200 Gramm Glukose pro Liter Wachstumsmedium liegen. Typischerweise werden etwa 50 Gramm pro Liter für eine Schüttelflaschenkultur verwendet. Die Menge kann in Abhängigkeit der gewünschten Dichte der entgültigen Kultur variieren. Andere Kohlenstoffquellen, die benutzt werden können, schließen Melasse, Fruktose-Mais-Sirup, hydrolisierte Stärke und andere preiswerte, konventionelle Kohlenstoffquellen, die man in Fermentationsprozessen verwendet, ein. Zusätzlich kann Laktose als Kohlenstoffquelle zur Verfügung gestellt werden. Auf diese Weise kann Molke-Permeat, das einen hohen Laktosegehalt hat und eine sehr preisgünstige Kohlenstoffquelle ist, als Substrat benutzt werden. Geeignete Mengen von diesen Kohlenstoffquellen kön nen leicht aus dem Stand der Technik bestimmt werden. Während des Verlaufs der Fermentation müssen gewöhnlich zusätzliche Mengen von Kohlenstoffquellen hinzugegeben werden.
  • Stickstoff wird typischerweise in der Form von Hefeextrakt bei einer Konzentration von etwa 2 bis etwa 15 Gramm pro Liter Wachstumsmedium zur Verfügung gestellt. Andere Stickstoffquellen können verwendet werden, einschließlich Peptone, Tryptone, reiner Maiskornextrakt usw. Die Mengen, die von diesen Quellen hinzugefügt werden müssen, können leicht dem Stand der Technik entnommen werden. Stickstoff kann während der Kultivierung oder auf Vorrat zugegeben werden, das heißt, die gesamte Menge auf einmal vor der Kultivierung.
  • Nach einer drei- bis viertägigen Kultivierung bei geeigneter Temperatur, typischerweise bei etwa 25 bis 30°C, ist eine Menge an Pilzen oder Algen gewachsen, die sich zur Verwendung als Impfmittel in einem konventionellen Rührtank-Fermenter oder einem Airlift-Fermenter eignet. Die Fermentierung kann im Batch-, Fed-Batch- oder kontinuierlichen Fermenter durchgeführt werden. Der Rührtank-Fermenter ist entweder mit einer Turbine vom Rushton-Typ oder, vorzugsweise, mit einem schiffsschraubenartigen axialen Propeller ausgestattet.
  • Der Fermenter wird durch Zugabe der gewünschten Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen vorbereitet. Zum Beispiel kann ein 1,5 Liter-Fermenter durch Mischen von etwa 50 Gramm Glucose mit etwa 6 Gramm Hefeextrakt pro Liter Wasser vorbereitet werden. Wie oben erörtert wurde, können andere Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen oder Mischungen davon verwendet werden.
  • Der die Nährlösung enthaltende Reaktor sollte sterilisiert werden, zum Beispiel durch Erhitzen vor der Impfung, wie oben in der Erörterung der Mikroorganismus-Kultivierung zur Produktion von DNA beschrieben. Nach dem Herunterkühlen auf etwa 30°C kann das Impfmittel zugegeben und die Kultivierung begonnen werden. Der Gasaustausch wird durch das Durchblasen mit Luft gewährleistet. Die Luft-Durchblasrate kann variieren, aber wird vorzugsweise von etwa 0,5 bis 2,0 Volumen Luft pro Fermenter-Volumen pro Minute eingestellt. Vorzugsweise wird der Spiegel an gelöstem Luftsauerstoff bei etwa 10% bis etwa 50% des Luftsättigungswertes der Lösung gehalten. Dementsprechend können Einstellungen der Luft-Durchblasrate während der Kultivierung nötig sein.
  • Während der Fermentation ist eine Bewegung wünschenswert. Die Bewegung wird durch den Propeller erzielt. Die Geschwindigkeit der Spitze wird vorzugsweise innerhalb eines Bereiches von etwa 50 cm/s bis etwa 500 Zentimeter pro Sekunde eingestellt, vorzugsweise zwischen 100 bis 200 Zentimeter pro Sekunde.
  • Im Allgemeinen kann die Menge des Impfstoffes, der in einer Fermentation benutzt wird, variieren. Typischerweise kann eine logarithmisch wachsende Kultur, die etwa 2 bis etwa 10 Prozent des Gesamtvolumens des Mediums in dem Fermenter ausmacht, als Impfmittel benutzt werden.
  • Die Nährstoffspiegel sollten überwacht werden. Wenn die Glukosespiegel unter 5 Gramm pro Liter fallen, sollte zusätzliche Glukose hinzugegeben werden. Ein typischer Kultivierungszyklus benötigt 100 Gramm Glukose und etwa 15 Gramm Hefe pro Liter. Es ist wünschenswert, während des Verlaufes der Kultivierung den Stickstoff verarmen zu lassen, weil dieses die Ölproduktion durch Pilze oder Algen vermehrt. Dies trifft besonders zu, wenn M. alpina als Produktionsorganismus verwendet wird.
  • Gelegentlich produziert die Kultur eine überschüssige Menge an Schaum. Optional kann ein Antischaummittel, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, z.B. Mazu 310®, hinzugegeben werden, um Schaumbildung zu vermeiden.
  • Die Temperatur der Kultur kann variiert werden. Jedoch tendieren diejenigen Mikroorganismen, die sowohl ARA als auch EPA produzieren, dazu, weniger EPA und mehr ARA zu produzieren, wenn sie bei höheren Temperaturen kultiviert werden. Wenn z.B. Mortierella alpina bei Temperaturen unter 18 Grad Celsius kultiviert wird, beginnt sie, EPA zu produzieren. Darum ist es vorzuziehen, die Temperatur auf einem Wert zu halten, der die Produktion von vorzugsweise ARA induziert. Geeignete Temperaturen liegen typischerweise zwischen etwa 25 und 30 Grad C.
  • Vorzugsweise wird die Kultivierung weitergeführt, bis die gewünschte Dichte der Biomasse erzielt ist. Eine wünschenswerte Biomasse liegt bei etwa 15 bis 40 Gramm pro Liter des Organismus. Solch eine Biomasse erreicht man typischerweise innerhalb 48 bis 72 Stunden nach der Impfung. Zu dieser Zeit enthalten die Organismen typischerweise etwa 5 bis 40 Prozent Lipidkomplexe, von denen etwa 10 bis 50 Prozent ARA sind, und die geerntet werden können.
  • Die Ernte kann durch jede geeignete Methode, wie etwa Filtration, Zentrifugation oder Ausfällung durchgeführt werden.
  • Nach dem Ernten kann die Biomasse ohne Trocknung extrahiert werden. Optional kann der Biomasse vor der Extraktion das restliche Wasser entzogen werden, etwa durch Vakuumtrocknung, Wirbelschichttrocknung oder Lyophilisierung. Wenn das Wasser entfernt ist, werden vorzugsweise nichtpolare Lösungsmittel benutzt, um das ARA-haltige Öl zu extrahieren. Obwohl jeder nichtpolare Extrakt geeignet ist, ist Hexan vorzuziehen. Wie oben erörtert wurde, können ebenso superkritische Flüssigkeiten, wie CO2 oder NO, für die Aufreinigung von ARA-angereicherten Ölen aus Algen und Pilzen verwendet werden. Obwohl Pilze wie M. alpina unerwarteterweise schwierig mit CO2 zu extrahieren sind, kann man soviel wie 89 Prozent des Öls von einer Pilzbiomasse bei Temperaturen über 90 Grad und Drücken von über 400 Atm. zurückgewinnen. Alternativ kann man die feuchte Biomasse, die typischerweise etwa 30 bis 50 Prozent Feststoff enthält, zerhacken und direkt durch Verwendung von polaren Lösungsmitteln, wie Ethanol, Isopropylalkohol oder durch eine Mischung aus Hexan und Isopropylalkohol, extrahiert werden.
  • Eine besonders geeignete Methode der wässrigen Extraktion besteht darin, die Biomasse mit dem polaren Lösungsmittel Isopropylalkohol in einem geeigneten Reaktionsgefäß zu vermischen. Solche Gefäße sind bekannt. Die Verwendung von drei bis sechs Teilen des Lösungsmittels pro Teil der Biomasse ist wünschenswert. Am besten wird das Mischen unter Stickstoff unter Zugabe von Antioxidantien wie β-Karotin, α-Tocopherol, Ascorbylpalmitat und BHT durchgeführt, um die Oxidation von ARA in den Lipidextrakten zu verhindern.
  • Das Lösungsmittel wird vom Öl entfernt, wie weiter oben in dem Abschnitt, der die Produktion von DNA-haltigem Öl betrifft, erörtert wurde. Zusätzliche Schritte zur weiteren Reinigung des Öls können auch durchgeführt werden.
  • Die Ausbeuten können von etwa 5 bis 50 Gramm ARA-haltigem Öl pro 100 Gramm getrockneter Biomasse variieren. Im Fall von M. alpina können 10 bis 50 Gramm Triglyceride pro 100 Gramm getrockneter Biomasse erhalten werden. Im Fall von Ochromonas können 5 bis 20 Gramm Triglyceride pro 100 Gramm Biomasse erhalten werden.
  • Vorzugsweise enthält das Öl von M. alpina mehr als 70 Prozent Triglyceride, die im Allgemeinen die folgende Fettsäure-Zusammensetzung haben:
    • 5 – 15 % Palmitinsäure
    • 15 – 20 % Stearinsäure
    • 5 – 10 % Oleinsäure
    • 6 – 10 % Linolsäure
    • 2 – 10 % Linolensäure
    • 2 – 10 % Dihommo-gamma Linolensäure
    • 40 – 50 % Arachidonsäure
  • Gabe von DHA- und ARA-haltigem Öl
  • Gemäß dieser Erfindung werden DHA-haltige mikrobielle Öle, ARA-haltige mikrobielle Öle oder geeignete Kombinationen dieser Öle Patienten gegeben, die von einer neurologischen Krankheit betroffen sind, welche durch erniedrigte Spiegel von DHA und / oder ARA im Blut oder Geweben charakterisiert sind, verglichen mit Spiegeln, die man bei gesunden Individuen findet. Der spezifische Behandlungsverlauf wird basierend auf der Normalisierung der Spiegel von Serum- und Erytrozyten-DHA und –ARA bestimmt. Wie man glaubt, spiegeln diese DHA- und ARA-Serum-Spiegel die Zusammensetzungen der langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren in neurologischen Membranen wieder. In einigen Fällen müssen die ARA- und DHA-Serum-Spiegel auf das vier- bis fünffache der Spiegel, die in einer durchschnittlichen Population als normal betrachtet werden, erhöht werden, um einen therapeutischen Effekt zu beobachten. Patienten, die an Krankheiten wie Retinitis Pigmentosa oder seniler Demenz leiden, können auf die alleinige Gabe von DHA-haltigem Öl ansprechen, während Patienten, die an Adrenoleukodystrophie, Diabetes-induzierter Neuropathie oder Schizophrenie leiden, besser auf die Gabe einer Kombination von DHA- und ARA-haltigem Öl ansprechen. Wieder andere Patienten profitieren von einer ausschließlichen Gabe von ARA-haltigem mikrobiellem Öl.
  • Der Verlauf der Behandlung kann überwacht werden, indem man die interessierenden Fettsäure-Spiegel im Serum der behandelten Patienten misst. Bei einigen Patienten ist es möglich, die Normalisierung der DHA- oder ARA-Spiegel in neuralem Gewebe zu verfolgen, indem man die DHA- und ARA-Spiegel in Erythrozyten- oder Serum-Lipiden während der Behandlung misst.
  • Obwohl es möglich ist, die DHA- und / oder ARA-haltigen Öle den Patienten direkt zu geben, werden sie häufiger mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen und, optional, mit anderen therapeutischen Bestandteilen kombiniert. Geeignete Trägerstoffe sind Trägerstoffe, die mit den anderen Komponenten der Formulierung kompatibel und nicht schädlich für den Patienten sind.
  • Formulierungen schließen diejenigen ein, die für orale, nasale, topische oder parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre, intravenöse und intradermale) Gabe geeignet sind. Es ist zu erwähnen, dass die bevorzugte Formulierung mit dem Zustand und Alter des Patienten variieren kann. Die Formulierungen können günstigerweise in Form einer Dosiereinheit gegeben werden, z.B. Emulsionen, Tabletten und Retardkapseln und können durch jedes geeignete pharmazeutische Verfahren hergestellt werden.
  • Formulierungen, die gemäß der Erfindung für orale Gabe geeignet sind, können als diskrete Einheiten, Kapseln oder Tabletten, vorliegen, wobei jede von Ihnen eine vorherbestimmte Menge DHA- oder ARA-Öl oder eine vorherbestimmte Menge einer geeigneten Kombination von DHA- und ARA-Ölen enthält. Diese oralen Formulierungen können außerdem eine Lösung oder eine Suspension in wässriger Flüssigkeit. oder in nichtwässriger Flüssigkeit aufweisen. Die Lösung kann eine Emulsion, wie eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder eine Wasser-in-Öl-Emulsion, sein. Die Öle können durch Zugabe der gereinigten und sterilisierten Flüssigkeiten einer Nahrungszubereitung hinzugegeben werden, die dann in die Magensonde eines Patienten gegeben wird, der nicht schlucken kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das mikrobielle DHA- oder ARA-Öl in Gelkapseln eingebracht, so wie in Beispiel 6 beschrieben. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass gemäß der vorliegenden Erfindung alle bekannten Mittel zur Produktion von Gelkapseln verwendet werden können.
  • Gepresste Tabletten können dadurch hergestellt werden, dass das mikrobielle Öl in einer geeigneten Maschine gepresst oder geformt wird. Das Öl kann mit trockenen inerten Hilfsstoffen, wie Carboxymethylzellulose gemischt werden. Die Tabletten können optional überzogen oder mit Teilungskerbe versehen werden und können so formuliert werden, dass sie den aktiven Wirkstoff langsam oder kontrolliert freisetzen.
  • Andere Formulierungen, die für die topische Gabe geeignet sind, schließen Pastillen ein, die DHA-Öl, ARA-Öl oder eine Kombination davon auf einer aromatisierten Basis, gewöhnlich Saccharose und Akazie oder Tragant aufweisen.
  • Formulierungen, die für die topische Gabe auf die Haut geeignet sind, können Salben, Cremes und Gels sein, die DHA- und / ARA-Öle mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägerstoff aufweisen. Ein bevorzugtes System zur topischen Abgabe ist ein transdermales Pflaster, das das zu verabreichende Öl enthält. In Formulierungen, die für die nasale Gabe geeignet sind, ist der Träger eine Flüssigkeit, so wie er auch in konventionellen Nasensprays oder Nasentropfen verwendet wird.
  • Formulierungen, die für die parenterale Gabe geeignet sind, schließen wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösungen ein, welche optional Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, welche die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfänger isotonisch machen; und wässrige und nichtwässrige sterile Suspensionen, welche Suspensions- und Bindemittel enthalten können. Die Formulierungen können in Einmal-Dosis oder Mehrfach-Dosis Packungen angeboten werden. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt die Einbringung der DHA- und / oder ARA-Öle in eine Formulierung zur parenteralen Ernährung eines Patienten ein.
  • Die Zusammensetzungen des mikrobiellen Öles der vorliegenden Erfindung müssen nicht als eine pharmazeutische Zusammensetzung gegeben werden. Sie können ebenso als ein Nahrungsergänzungsmittel formuliert werden, so wie eine Vitaminkapsel oder als Nahrungsersatz in der normalen Nahrung. Die mikrobiellen Öle können als ein Ersatz für Küchenöl gegeben werden in einer Form, dass der Patient im normalen Gebrauch Mengen an DHA und / oder ARA erhält, die ausreichend sind, um die Konzentrationen von diesen Fettsäuren im Serum und in den Membranen der betroffenen neuralen Gewebe zu normalen oder nahezu normalen Spiegeln anzuheben. Eine spezielle Emulsion in der Art einer Margarine kann formuliert werden, um Butter oder gewöhnliche Margarine in der Nahrung zu ersetzen. Die mikrobiellen Einzelleröle können verarbeiteten Nahrungsmitteln hinzugefügt werden, um eine bessere Quelle von ungesättigten ω–3 und ω–6 Fettsäuren zur Verfügung zu stellen.
  • Unter Verwendung von Gelatine, Kasein oder anderen geeigneten Proteinen kann das Öl mikrogekapselt sein, wobei Verfahren nach dem Stand der Technik verwendet werden können, wodurch für die Verarbeitung von Nahrungsmitteln das Öl in Form eines trockenen Inhaltsstoffes zur Verfügung gestellt wird. Solche Arten der Gabe bevorzugt können im Fall einer Person angewendet werden, die bekanntermaßen eine genetische Prädisposition für eine Krankheit hat, die mit einem metabolischen DHA- oder ARA-Mangel assoziiert ist, so wie eine neurodegenerative Erkrankung, z.B. Huntington oder Alzheimer. Versorgt man solch eine Person mit einem Nahrungsersatzmittel, kann dies einen signifikanten prophylaktischen Effekt haben, der das Auftreten von Symptomen einer bestimmten Krankheit verzögert. Die Gabe der langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren DHA und ARA bietet einen signifikanten Vorteil gegenüber der Gabe von lediglich den Vorstufen dieser Fettsäuren, Linol- und Linolensäure, aus Standardnahrungsmitteln oder Spezialölen, wie Primel- oder Gurkenkrautöl. Das zugeführte DHA und ARA liegt immer in seiner aktiven Form vor, so dass der Patient keine Nahrungsmittelvorstufen metabolisieren muss. Dies führt dazu, dass die effektiven Dosierungen signifikant niedriger sind als die von den Vorstufen, die notwendig wären, um den therapeutischen Effekt zu erzielen.
  • Es sollte klargestellt werden, dass, zusätzlich zu den Bestandteilen, die oben besonders erwähnt wurden, die Formulierung gemäß dieser Erfindung außerdem andere geeignete Agenzien, wie Geschmacksstoffe, Konservierungsstoffe und Antioxidantien enthalten kann. Es ist gerade wünschenswert, die mikrobiellen Öle mit Antioxidantien zu mischen, um die Oxidation von DHA oder ARA zu verhindern. Solche Antioxidantien wären essbar und könnten Vitamin E, Karotin, BHT oder andere Antioxidantien gemäß dem Stand der Technik einschließen.
  • Die Tagesdosis der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die einem Patienten verabreicht wird, hängt vom Ausmaß des DHA- und /oder ARA-Mangels ab, der vorher durch eine Serum-Lipid-Analyse festgestellt wird, und zwar vor Einleitung der Therapie. Typischerweise liegt die Anfangsdosis für einen Patienten, der schwerer als 50 Pfund ist, in einem Bereich von etwa 50 mg DHA bis 5.000 mg DHA pro Tag. Eine bevorzugte Erhaltungsdosis liegt bei etwa 500 mg DHA pro Tag. Wenn z.B. das benutzte DHA-Öl zu 50 % mit DHA angereichert ist, würde eine solche Dosis einer Zugabe von etwa 1.000 mg Öl pro Tag entsprechen.
  • Die Tagesdosis ARA für einen Patienten, der schwerer als 50 Pfund ist, ist 50 mg ARA bis 5.000 mg pro Tag. Die bevorzugte Erhaltungsdosis liegt bei etwa 500 bis 1.000 mg pro Tag. Wenn das benutzte ARA-Öl zu 50 Prozent mit ARA angereichert ist, würde eine solche Dosis der Zugabe von etwa 1.000 bis 2.000 mg ARA-Öl pro Tag entsprechen. Die Dosierungen für eine geeignete Kombination von DHA- und ARA-haltigen Ölen liegen bei 1.000 mg DHA und 1.000 mg ARA pro Tag.
  • Wünschenswerterweise werden nach etwa vier Wochen dieser täglichen Therapie die Serum-Fettsäuren-Profile des Patienten ausgewertet. Die nachfolgenden Dosierungen können dann in Abhängigkeit der beobachteten DHA- und ARA-Plasmalipid-Spiegel oder DHA- und ARA-Spiegel in roten Blutkörperchen und in Abhängigkeit der beobachteten klinischen Wirkungen der Therapie angepasst werden. Patienten mit peroxysomalen Krankheiten können in den roten Blutkörperchen DHA-Spiegel von nur 1 – 3 µg DHA pro Milliliter Plasma haben. Normale, anzustrebende Werte liegen in einem Bereich von 10 – 30 µg DHA pro Milliliter Plasma. Normale anzustrebende Werte von zirkulierendem ARA liegen zwischen etwa 75 bis etwa 120 µg ARA pro Milliliter Plasma. Nachdem einmal normalisierte Spiegel der interessierenden zirkulierenden Fettsäuren erzielt worden sind, kann die Tagesdosis des Öls modifiziert werden, um das zirkulierende DHA und / oder ARA auf dem gewünschten Niveau zu halten.
  • Wie oben erwähnt wurde, kann es zur Behandlung von bestimmten neurologischen Krankheiten wünschenswert sein, den Spiegel von im Blut zirkulierendem DHA und /oder ARA auf den vier- bis fünffachen Normalwert zu erhöhen. Die Spiegel von zirkulierendem DHA und ARA können deshalb auf etwa 120 bis 150 bzw. 480 bis 600 µg pro Milliliter erhöht werden.
  • Obwohl er nicht an eine bestimmte Theorie gebunden sein möchte, glaubt der Erfinder, dass die Gabe von DHA deshalb bei der Behandlung neurologischer Krankheiten wirksam ist, weil sie in der Lage ist, die Kalziumaufnahme von neuronalen Zellen zu regulieren. Eine Depolarisierung von neuronalen Zellen bewirkt erhöhte Spiegel von intrazellulärem Kalzium, was die Aktivierung einer Phospholipase bewirkt und zur Freisetzung von freien DHA aus der Zellmembran führt. Dieses freie DHA wirkt als ein Kalziumkanalblocker und begrenzt dadurch die Kalzium-Aufnahme in die Zelle. Dadurch kann der DHA-Spiegel in der neuronalen Zellmembran, der dadurch für die aktivierungsinduzierte Freisetzung von diesen langkettigen, mehrfach ungesättig ten Fettsäuren verfügbar ist, intrazelluläre Kalzium-Spiegel kontrollieren. Wenn ein DHA-Mangel existiert, steigen die intrazellulären Kalzium-Spiegel und die Produktion des amyloiden Plaque-Proteins wird stimuliert. Weiterhin stimuliert ein hoher intrazellulärer Kalzium-Spiegel die Phosphorylierung des Mikrotubuli-assoziierten Tau-Proteins, was die Entwicklung von neurofibrillären Verklebungen zur Folge hat.
  • Serum-Lipide sind die wahrscheinlichste Quelle von in neuronalen Zellen eingelagertem DHA und ARA, weil Serum-Lipide generell als das Transport- oder Fördersystem für Fettsäuren agieren. Studien mit Tieren und Menschen haben gezeigt, dass hohe DHA- und ARA-Spiegel im Serum mit hohen DHA- und ARA-Spiegeln im Hirn korrelieren. Daher sollte die Erhöhung der DHA und ARA Konzentration in der Zusammensetzung des Gesamt-Serum-Lipids durch eine Zufuhr von mit diesen Komponenten angereicherten mikrobiellen Ölen zur Nahrungsmittelergänzung die Versorgung der neuronalen Zielgewebe mit DHA und ARA verbessern.
  • Die Rolle von ARA bei der neuronalen Funktion ist weniger klar, obwohl es ebenso ein größerer Bestandteil von neurologischen Membranen ist. Viele neurologische Krankheiten gehen mit einem Mangel von sowohl DHA als auch ARA einher. Das Ziel dieser Erfindung ist es, die Spiegel dieser beiden Komponenten unter Verwendung von DHA und ARA aus mikrobiellem Öl aufzubessern, um beide dieser wichtigen Fettsäuren zu normalisieren. Ein wichtiger Aspekt dieser Erfindung ist der Zusatz von DHA und ARA ohne signifikante Mengen von EPA, weil die EPA-Spiegel in neurologischen Geweben generell niedrig sind und eine Ergänzung mit EPA die ARA-Spiegel erniedrigt und unter gewissen Umständen kontraindiziert sein könnte. Die therapeutische Gabe von DHA-Öl in Kombination mit dem ARA-Öl kann zur Aufrechterhaltung oder Herstellung eines Verhältnisses von ω–3 zu ω–6 langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren im Körper gut sein, das mit dem bei normalgesunden Individuen vergleichbar ist.
  • Die vorliegende Erfindung ist allgemein beschrieben worden. Es wurde auf die folgenden, nicht beschränkenden, spezifischen Beispiele Bezug genommen.
  • Beispiel 1
  • Ein Medium mit der halben Konzentration von künstlichem Meerwasser, dass aus der Mischung von 4,3 kg Instant Ocean® mit 230 Litern Leitungswasser hergestellt wurde, wurde in einen 350 Liter fassenden Rührtank-Fermenter gefüllt. Der Fermenter mit dem Medium wurde sterilisiert und auf 28 Grad Celsius heruntergekühlt, 6,8 Liter konzentrierten Hefeextraktes mit einer Konzentration von 400 Gramm pro Liter, 12,5 Liter Glukosesirup mit einer Konzentration von 400 Gramm pro Liter und 30 Liter C. cohnii Impfmittel aus einem Seed-Fermenter mit einer Konzentration von 106 Zellen pro Milliliter oder eine Biomassen-Dichte von etwa 1,3 Gramm pro Liter wurden dem Medium hinzugegeben. Die Bewegung wurde auf eine Geschwindigkeit der Spitze von 73 Zentimeter pro Sekunde und die Belüftung wurde auf 1 VVM eingestellt, was 280 Litern pro Minute entspricht. Nach 44 Stunden wurden zusätzlich 12 Liter Glukosesirup und nach weiteren 44 Stunden weitere 43 Liter innerhalb der nächsten 32 Stunden hinzugegeben. Insgesamt wurden also 67,5 Liter Glukosesirup hinzugegeben.
  • Um den gelösten Sauerstoff höher als 20 Prozent zu halten, wurde die Geschwindigkeit der Spitze auf 175 Zentimeter pro Sekunde nach 44 Stunden und auf 225 Zentimeter nach 55 Stunden erhöht. Nach 76 Stunden wurde die Geschwindigkeit der Spitze auf 150 Zentimeter pro Sekunde vermindert. Die Kultur wurde für eine zusätzliche Zeit wachsen gelassen, die ausreichend war, um den Restbestand an Glukose in zellulares Öl umzuwandeln, dann geerntet. Die geernteten Zellen wurden bis auf einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 4 Prozent getrocknet. Zu der getrockneten Biomasse wurde Hexan hinzugegeben und in einem Glasgefäß zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius gerührt. Ein Rotationsevaporator, der benutzt wurde, um das Hexan zu entfernen, produzierte etwa 7 Gramm reines, DNA-haltiges Öl.
  • Beispiel 2
  • 60 Kg Hefeextrakt, 45 kg NaCl, 12,3 kg MgSO4 7H2O und 0,9 kg CaCl2 2H2O wurden mit 7.000 Litern Wasser in einen 15.000 Liter Fermenter gefüllt. Danach wurde diese Lösung sterilisiert, 3.000 Liter einer sterilisierten Glukoselösung mit einer Konzentration mit 650 kg Glukose pro 3.000 Litern Volumen wurden hinzugegeben. Der An fangs-pH des Mediums war 6,3, die Temperatur war 28 °C, die Belüftung war 0,5 bis 1,0 VVM, der Überdruck des Gefäßes war auf 0,2 bar eingestellt und die Geschwindigkeit der Spitze wurde auf 120 Zentimeter pro Sekunde eingestellt, bevor das Gefäß mit 300 Litern einer Impfmittelkultur von C. cohnii geimpft wurde, die eine Zelldichte von etwa 60 × 106 Zellen pro Milliliter aufwies, was 4 bis 5 Gramm Trockengewicht Biomasse pro Liter Kultur in dem Impfmitteltank entspricht. Während des Verlaufs der Fermentation wurde ein Lebensmittel-Antischaummittel, wie etwa Dow 1520, wie benötigt, hinzugegeben und der pH wurde entweder mit 8 N H2SO4 oder 4 N NaOH in benötigter Menge auf seinem Wert gehalten. Der Spiegel an gelöstem Sauerstoff wurde auf einem Wert von über 20 Prozent des Luftsättigungswertes durch Erhöhung des Gefäßüberdrucks und der Bewegung gehalten. Zusätzliche Glukosegaben wurden nach 93 Stunden und nach 111 Stunden benötigt, um die Glukosespiegel über 5 Gramm pro Liter zu halten. Nach 119 Stunden wurde der Fermenter auf 17 °C heruntergekühlt und die Fermentationsbrühe wurde mit einer Zentrifuge weiterverarbeitet. 608 kg einer Paste, die 25 Prozent an festen Bestandteilen enthielt, wurde gewonnen. Die Paste wurde sprühgetrocknet und produzierte etwa 150 kg Algentrockenpulver, das etwa 30 bis 40 kg Öl mit 40 – 45-prozentigem DHA-Gehalt enthielt.
  • Das Algentrockenpulver wurde mit Hexan extrahiert, wobei Standard-Equipment und –Verfahren zur Extraktion von Pflanzenöl verwendet wurden. Nach der Entfernung des Lösungsmittels wurde das Rohöl durch Zugabe von Wasser bei 50 Grad entgummiert. Das entgummierte Öl wurde durch Zentrifugation gesammelt und durch Mischung mit einer ätzenden Base und Phosphorsäure bei 55 Grad für eine- Stunde raffiniert. Das raffinierte und entgummierte Öl wurde dann durch Zentrifugation gesammelt und bei 90 Grad durch Zugabe von Zitronensäure und Bleicherde sanft gebleicht. Durch Filtration der Bleicherde wurde das raffinierte, geblichene Öl (RB–Öl) mit einem Peroxid-Wert von weniger als 5 mEq pro Kilogramm erhalten. Das RB–Öl wurde durch Hochvakuum-Kurzwegdestillierung desodoriert und das gewonnene desodorierte RB–Öl (RBD–Öl) war dann fertig für die Verkapselung, Tablettierung oder Versand als Bulkware. Das erhaltene Öl hatte einen Peroxid-Wert von weniger als 1 mEq pro Kilogramm, einen Gehalt an freien Fettsäuren von weniger als 0,05 Prozent, einen DHA-Gehalt von 45 bis 47 Prozent und eine Jodzahl von etwa 200.
  • Beispiel 3
  • Herstellung von Thraustochytrium Aurum Lipid
  • 2,5 Gramm NaCl, 5 Gramm MgSO4 7H2O, 1 Gramm KCl, 0,1 Gramm KH2PO4, 0,2 Gramm CaCO3, 0,2 Gramm (NH4)2SO4, 2,0 Gramm Natriumglutamat in einem Liter Wasser wurden in einen 11,7 Liter fassenden Rührtank-Fermenter gefüllt. Nachdem der Tank sterilisiert worden war, wurde eine sterile Lösung hinzugegeben, die 10 µg Thiamin-HCl, 0,1 Gramm NaHCO3 und 10 µg Vitamin B12 enthielt- nach Thiamin B12 wurden 150 ml steriler 30-prozentiger Glukose und 50 ml steriler 10-prozentiger Hefeextrakt hinzugegeben. Der pH wurde auf 6,0 eingestellt, die Durchblasrate auf 1,0 VVM eingestellt und die Bewegung wurde auf 300 Rpm eingestellt, bevor mit 100 ml einer 5 Tage alten Schüttelflaschenkultur von Thraustochytrium Aurum geimpft wurde, die in demselben Medium gezüchtet wurde. Die Kultur wurde nach 5 Tagen geerntet und hatte eine Ausbeute von 4 Gramm Trockengewicht Biomasse. Der DHA-Gehalt der Lipide in der Biomasse beträgt 10 bis 15 Prozent.
  • Beispiel 4
  • Herstellung von Pythium Insidiosum Lipid
  • In einem 80 Liter (Gesamtvolumen) fassenden Fermenter wurden zusammen 51 Liter Leitungswasser, 1,2 kg Glukose, 240 Gramm Hefeextrakt und 50 ml MAZU 210S® Antischaummittel gegeben. Der Fermenter wurde 45 Minuten lang bei 121 Grad Celsius sterilisiert. Während des Sterilisationsprozesses wurden zusätzlich 5 Liter Kondenswasser hinzugegeben. Der pH wurde auf 6,2 eingestellt und ungefähr 1 Liter Impfmittel mit einer Zelldichte von 5 bis 10 Gramm Pythium Insidiosum (ATCC-Nummer: 28251) pro Liter wurde dann hinzugegeben. Die Bewegungsrate wurde auf 125 Rpm eingestellt, was einer Geschwindigkeit an der Spitze von 250 Zentimeter pro Sekunde entsprach und die Belüftungsrate wurde auf 1 SCFM (Standard-Kubikfuß pro Minute) eingestellt. Nach 24 Stunden wurde während des Betriebs die Belüftungsrate auf 3 SCFM erhöht. Nach 28 Stunden wurden 2 Liter zusätzlicher, nach Gewicht 50-prozentiger Glukosesirup hinzugegeben. Nach 50 Stunden wurde der Fermenter abgeerntet und ergab eine Ausbeute von etwa 2,2 kg Feuchtgewicht Biomasse, was ungefähr 15 Gramm Trockengewicht pro Liter der Kultur entsprach.
  • Die geerntete Biomasse wurde mit einem Saugfilter zu einem hochfesten Kuchen gepresst, der etwa zu 50 Prozent aus Feststoff bestand, bevor er gefriergetrocknet wurde. Die getrocknete Biomasse wurde mit einem Mörser zerrieben und mit einem Liter Hexan pro 200 Gramm Trockenmasse bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Rühren 2 Stunden extrahiert. Die Mixtur wurde dann gefiltert und das Filtrat evaporiert und ergab eine Ausbeute von etwa 5 bis 6 Gramm Rohöl pro 100 Gramm getrockneter Biomasse. Die Biomasse wurde wieder mit einem Liter Ethanol pro 20 Gramm getrockneter Biomasse für eine Stunde bei Raumtemperatur extrahiert, gefiltert und das Lösungsmittel evaporiert, was eine Ausbeute von zusätzlichen 22 Gramm Rohöl pro 100 Gramm getrockneter Biomasse ergab. Die zweite Fraktion bestand hauptsächlich aus Phospholipiden, wohingegen die erste Fraktion eine Mischung aus Phospholipiden und Triglyceriden enthielt. Die gemischten Fraktionen ergaben ein Öl, das etwa 30 bis 35 Prozent Arachidonsäure und kein nachweisbares EPA enthielt.
  • Beispiel 5
  • Herstellung von Mortierella alpina Lipid
  • Ein 7.500 Liter Fermenter wurde mit 4.500 Litern Wasser gefüllt und mit 225 kg Dextrose, 27 kg Hefeextrakt und 450 Gramm Antischaummittel (Dow 1520®) befüllt. Der pH wurde auf 5,0 eingestellt und das Medium wurde für 60 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Nach der Sterilisation und dem Herunterkühlen auf 28 °C wurde der pH auf 5,5 mit NaOH eingestellt, die Durchlüftung wurde auf 0,25 VVM eingestellt, der Überdruck wurde auf 0,2 bar eingestellt und die Bewegung der A315-Propeller wurde auf eine Geschwindigkeit von 80 Zentimeter pro Sekunde eingestellt. Die Kultur wurde mit 180 Litern einer 20 Stunden alten Saatkultur von Mortierella alpina bei 2,2 Gramm pro Liter geimpft. Der pH konnte während des Durchlaufes fluktuieren, bis er nach 37 Stunden auf 6,5 eingestellt wurde. Nach 26 Stunden wurde während des höchsten Sauerstoffbedarfs die Bewegung auf 110 Zentimeter pro Sekunde erhöht, aber nach 32 Stunden wurde sie auf 80 Zentimeter pro Sekunde zurückgestellt. Nach 123 Stunden wurde der Tank unter Verwendung einer Bock Korb-Zentrifuge mit einem 40 Mikronbeutel abgeerntet. Das Material wurde dann mit einem Fließbetttrock ner getrocknet und mit Hexan, wie in Beispiel 2, extrahiert. Die Fermentation ergab eine Ausbeute an 17 kg Rohöl mit einem 45-prozentigem ARA-Gehalt.
  • Beispiel 6
  • DNA-angereichertes Öl wurde wie in Beispiel 1 oder 2 für orale Verwendung entweder durch Verkapselung oder Tablettierung hergestellt. Klare dichte Gelatinekapseln mit 1 Gramm pro Kapsel wurden mit konventionellen Herstellungsverfahren hergestellt. Zusammengesetzte Gelkapseln, die eine Ölsorte oder eine Mischung von Ölen enthalten, wurden hergestellt, in dem mittels eines Druck-Mehrfach-Pipettier-Gerätes 250 µl Öl in das Unterteil der Gelkapsel gefüllt wurden. Mit diesem Verfahren wurde eine Gewichtsgenauigkeit von ± 3 bis 5 Prozent erzielt. Die Oberteile wurden dann über den Gelkapseln platziert und mit gefärbter Gelatine unter Benutzung einer Verkapselungsmaschine zusammengesetzt. Alternativ wurden die Gelkapselunterteile mit Carboxymethylzellulose gefüllt und 120 µl des Öls wurden direkt auf das Bindemittel pipettiert, wo es absorbiert wurde, wodurch jegliches Auslaufen verhindert wurde. Die Oberteile wurden über den Gelkapseln platziert und mit gefärbter Gelatine mittels einer Verkapselungsmaschine zusammengesetzt. Alternativ kann die Carboxymethylzellulose mit dem Öl in einem Verhältnis von drei Teilen Carboxymethylzellulose und einem Teil Öl in einem getrennten Behälter gemischt werden und dann mit einer Tablettenpresse in Tabletten gepresst werden.
  • Das Verfahren wurde mit ARA-angereichertem Öl gemäß der Beispiele 4 und 5 wiederholt.
  • Beispiel 7
  • Aus Mikroorganismen hergestelltes mikrobielles Rohöl, wie in den Beispielen 1, 2, 3, 4 und 5 beschrieben, wurde unter Benutzung konventioneller Pflanzenölherstellungsverfahren weiterverarbeitet. Das Öl wurde entgummiert, um Phospholipide zu entfernen, indem es bei 50 Grad mit Wasser gemischt wurde und dann das Wasser und die Gummimischung durch Zentrifugation entfernt wurde. Um die freien Fettsäuren zu entfernen, wurde das Öl durch Mischung mit ätzender Base, gefolgt von Phosphorsäure bei 55 Grad raffiniert, und dann das Wasser und die Fettsäurenmischung durch Zentrifugation entfernt. Das verarbeitete mikrobielle Öl wurde gebleicht, in dem es mit Zitronensäure und Standard-Bleicherde bei 90 Grad gemischt wurde, bevor es filtriert wurde, um die verbrauchte Bleicherde und alle verbleibenden polaren Partikel in dem Öl zu entfernen. In einigen Fällen wurde das Öl unter Verwendung einer Hoch-Vakuum-Destillation oder eines Gegenstrom-Dampf-Stripping-Desodorierers desodoriert, um das endgültige, raffinierte, gebleichte und desodorierte Öl (RBD–Öl) zu erhalten. Die Spezifikation dieses Öls, das dieses Verfahren durchlaufen hatte, ergab typischerweise einen Peroxid-Wert von weniger 2 mEq pro Kilogramm und einen freien Fettsäuregehalt von weniger als 0,05 Prozent. Diese Werte sind typisch für Standard-Pflanzenöle und die mikrobiellen Öle in diesem Zustand werden statt Pflanzenöls für die Herstellung von Margarine, Backfett, löffelbaren Dressings, flüssigen Dressings oder als Ölbestandteile von anderen hergestellten Nahrungsmitteln verwendet. Die mikrobiellen Öle sind mit langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren hochgradig angereichert, im besonderen DNA und ARA, und werden mindestens im Verhältnis 1 Teil zu 10 Teilen mit demjenigen konventionellen Öl verdünnt, das für das besondere Produkt, das zubereitet werden soll, ausgewählt wird. Für die Verwendung in Schokoladenprodukten wird das Öl mit Kakaobutter verdünnt. Für die Verwendung als Backfett oder Backprodukt wird das Öl mit Kokosnuss- oder Palmöl verdünnt. Für die Verwendung als Salatdressing wird das Öl mit Standardsalatölen, wie Raps-, Soja-, Färberdistel- oder Maiskeimöl verdünnt.

Claims (21)

  1. Verwendung eines Triglyceride und/oder Phospholipide aufweisenden Docosahexaensäure (DHA) enthaltenden Öles für die Zubereitung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer neurologischen Störung im Zusammenhang mit einer DHA-Mangel-assoziierten Pathogenese, wobei die genannte Störung Retinitis Pigmentosa ist, und wobei die genannte Zusammensetzung für orale, nasale oder topische Verabreichung angepasst ist.
  2. Verwendung eines Triglyceride und/oder Phospholipide aufweisenden Arachidonsäure (ARA) enthaltenden Öles für die Zubereitung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer neurologischen Störung im Zusammenhang mit einer ARA-Mangel-assoziierten Pathogenese, genannte Störung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus multipler Sklerose und Retinitis Pigmentosa.
  3. Verwendung eines Triglyceride und/oder Phospholipide aufweisenden Docosahexaensäure (DHA) enthaltenden Öles und eines Triglyceride und/oder Phospholipide aufweisenden Arachidonsäure (ARA) enthaltenden Öles für die Zubereitung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer neurologischen Störung im Zusammenhang mit einer DHA- und ARA-Mangel-assoziierten Pathogenese, genannte Störung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus multipler Sklerose und Retinitis Pigmentosa, wobei die genannte Zusammensetzung für orale, nasale oder topische Verabreichung angepasst ist.
  4. Die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei die genannte Zusammensetzung für orale Verabreichung angepasst ist.
  5. Die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei das Triglyceride und/oder Phospholipide aufweisende Docosahexaensäure (DHA) enthaltende Öl Fischöl aufweist.
  6. Verwendung eines Triglyceride und/oder Phospholipide aufweisenden Docosahexaensäure (DHA) enthaltenden Öles, wobei das Öl ein Verhältnis von DHA zu EPA (Eicosapentaensäure) von mindestens 10:1 hat, für die Zubereitung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer neurologischen Störung im Zusammenhang mit einer DHA-Mangel-assoziierten Pathogenese, genannte Störung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus diabetischer Neuropathie und multipler Sklerose.
  7. Verwendung eines Triglyceride und/oder Phospholipide aufweisenden Arachidonsäure (ARA) enthaltenden Öles, wobei das Öl ein Verhältnis von ARA zu EPA (Eicosapentaensäure) von mindestens 10:1 hat, für die Zubereitung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer neurologischen Störung im Zusammenhang mit einer ARA-Mangel-assoziierten Pathogenese, wobei genannte Störung eine diabetische Neuropathie ist.
  8. Verwendung eines Triglyceride und/oder Phospholipide aufweisenden Docosahexaensäure (DHA) enthaltenden Öles, wobei das Öl ein Verhältnis von DHA zu EPA (Eicosapentaensäure) von mindestens 10:1 hat, und eines Triglyceride und/oder Phospholipide aufweisenden Arachidonsäure (ARA) enthaltenden Öles, wobei das Öl ein Verhältnis von ARA zu EPA von mindestens 10:1 hat, für die Zubereitung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer neurologischen Störung im Zusammenhang mit einer DHA- und ARA-Mangel-assoziierten Pathogenese, wobei genannte Störung eine diabetische Neuropathie ist.
  9. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Triglyceride und/oder Phospholipide aufweisende Docosahexaensäure (DHA) enthaltende Öl ein Verhältnis von DHA zu EPA (Eicosapentaensäure) von mindestens 10:1 hat, oder wobei das Triglyceride und/oder Phospholipide aufweisende Arachidonsäure (ARA) enthaltende Öl ein Verhältnis von ARA zu EPA von mindestens 10:1 hat.
  10. Die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Triglyceride und/oder Phospholipide aufweisende Docosahexaensäure (DHA) enthaltende Öl und/oder das Triglyceride und/oder Phospholipide aufweisende Arachidonsäure (ARA) enthaltende Öl mikrobielles Öl aufweist.
  11. Die Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei das genannte DHA enthaltende mikrobielle Öl mindestens 20% DHA enthält.
  12. Die Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei das genannte ARA enthaltende mikrobielle Öl mindestens 10% ARA enthält.
  13. Die Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei das genannte DHA oder ARA enthaltende mikrobielle Öl mindestens 40% DHA oder ARA enthält.
  14. Die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung einer neurologischen Störung, bei Verabreichung, in der Lage ist, die Blutserumwerte von DHA und/oder ARA bei einem Patienten zu erhöhen oder den Gehalt von DHA und/oder ARA in den Erythrozyten eines Patienten zu erhöhen.
  15. Die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung einer neurologischen Störung, bei Verabreichung, in der Lage ist, ein Verhältnis von ω–3 langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu ω–6 langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren im Körper aufrecht zu erhalten oder zu erreichen, das dem Verhältnis von normalgesunden Individuen vergleichbar ist.
  16. Die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei DHA und/oder ARA in der Form von Triglyceriden vorliegen.
  17. Die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das genannte DHA-Öl durch Kultivierung von mindestens einer Alge oder einem Pilz, welche ein DHA enthaltendes Öl unter DHA-Öl-produzierenden Bedingungen produzieren können, gewonnen wird und/oder das genannte ARA-Öl durch Kultivierung von mindestens einer Alge oder einem Pilz, welche ein ARA enthaltendes Öl unter ARA-Öl-produzierenden Bedingungen produzieren können, gewonnen wird, und das produzierte Öl bzw. die produzierten Öle wiedergewonnen werden.
  18. Die Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei das genannte DHA-Öl durch Kultivierung einer Dinoflagellate oder einer Chytridiomycete oder einer Oomycete gewonnen wird.
  19. Die Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die genannte Alge oder der genannte Pilz einer Species von Crypthecodinium, Thraustochytrium, Schizochytrium, Mortierella, Saprolegnia oder Mucor angehört.
  20. Die Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei der ARA-produzierende Organismus ein Pilz ist, der einer Species von Pythium oder Mortierella angehört, oder eine Alge ist, die einer Species von Ochromonas, Euglena oder Porphyridium angehört.
  21. Die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die genannte Zusammensetzung in Form einer Kapsel, einer Tablette, einer Emulsion oder einer Nahrungsmittelzubereitung vorliegt.
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