WO2012090625A1 - 認知症を血液サンプルで判定するための検査方法 - Google Patents

認知症を血液サンプルで判定するための検査方法 Download PDF

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WO2012090625A1
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dementia
test
plasmalogen
mammal
blood sample
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志郎 馬渡
武彦 藤野
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医療法人社団ブックス
丸大食品株式会社
有限会社梅田事務所
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
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    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8822—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving blood
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders

Definitions

  • the present invention relates to a test method for determining whether a blood sample is derived from a dementia mammal. Moreover, it is related with the method of determining whether a blood sample is derived from a dementia mammal using the result of the said test
  • the diagnosis of dementia mainly consists of interviews and questionnaires, and an objective diagnosis method has not yet been established.
  • the interview method and the questionnaire method have a drawback that there is a difference depending on the diagnostician and lacks quantitativeness.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • a ⁇ ⁇ -amyloid protein
  • AD Alzheimer-type dementia
  • a myelin lipid a myelin lipid.
  • plasma AD is reduced not only in the brain but also in serum when AD is affected.
  • serum contains only a very small amount of plasmalogen from the beginning, it is difficult to easily detect the decrease, and it is convenient, economical and versatile for use as a biomarker for the diagnosis of dementia. It was hard to say that it was sufficient in terms of etc.
  • An object of the present invention is to provide a test method and a biomarker for easily and safely diagnosing dementia (especially Alzheimer type dementia) at low cost.
  • the present inventors have surprisingly found that plasmalogen contained in erythrocytes is a useful biomarker for diagnosing dementia (especially AD), and completes the present invention with further improvements. It came to.
  • the present invention includes, for example, the methods, biomarkers, uses, and kits described in the following sections.
  • Item 1 A test method for determining whether a test blood sample is derived from a dementia mammal, (A) a step of measuring the amount of plasmalogen contained in red blood cells contained in the test blood sample (that is, the amount of plasmalogen in the red blood cell lipid), and (B) (i) contained in red blood cells contained in the test blood sample. And (ii) a plasmalogen amount contained in red blood cells derived from a healthy mammal of the same species as the mammal from which the test blood sample was collected.
  • Step (A) is a step of measuring the amount of plasmalogen contained in the membrane lipid of erythrocytes contained in the test blood sample by high performance liquid chromatography
  • Step (B) includes (i) the amount of plasmalogen measured in step (A), and (ii) red blood cells derived from a healthy mammal of the same species as the mammal from which the test blood sample was collected, as measured by high performance liquid chromatography
  • the inspection method according to Item 1. Item 3.
  • Item 3. Item 3.
  • a method for determining whether a test blood sample is derived from a dementia mammal comprising: 5.
  • the test blood sample comprises dementia feeding when it comprises steps (A) and (B) in the test method according to any one of items 1 to 4, and (C) when (i) is less than (ii)
  • a determination method comprising a step of determining that the animal originates.
  • Item 7. A biomarker for detecting dementia, comprising a plasmalogen contained in red blood cells.
  • Item 8. Use of a plasmalogen contained in erythrocytes as a biomarker for detecting dementia.
  • Item 10 A method of diagnosing a mammal from which a blood sample has been collected as having dementia, Including the step (A), the step (B), and the step (C) according to Item 6, and (D) when the test blood sample is determined to be derived from a dementia mammal in the step (C), A diagnostic method comprising the step of diagnosing a mammal from which a test blood sample has been collected as having dementia.
  • Item 11 Item 11. The diagnostic method according to Item 10, wherein the mammal is a non-human mammal.
  • Item 12. A plasmalogen contained in red blood cells for use in the diagnosis of dementia.
  • test method of the present invention data for determining whether a test blood sample is derived from a dementia (particularly, Alzheimer-type dementia) mammal can be obtained simply, safely and at low cost. Moreover, from the result of this test method, it can be determined whether the test blood sample is derived from a dementia mammal, and dementia can be diagnosed from the determination result. Furthermore, with the biomarker or kit for detecting dementia of the present invention, the above-described examination, determination and diagnosis can be performed simply, safely and at low cost.
  • the chromatogram obtained by analyzing a rat erythrocyte lipid sample by HPLC / ELSD method is shown.
  • the chromatogram obtained by analyzing a rat serum lipid sample by HPLC / ELSD method is shown. Abbreviations for each lipid substance are the same as those in FIG.
  • the chromatogram obtained by analyzing a human erythrocyte lipid sample by HPLC / ELSD method is shown.
  • the chromatogram obtained by analyzing a human serum lipid sample by HPLC / ELSD method is shown. Abbreviations for each lipid substance are the same as those in FIG.
  • the (pl-PE / PE) value is calculated from the peak area of the chromatogram obtained by analyzing erythrocyte lipid samples of normal mice and dementia model mice by HPLC / ELSD method, and the result of statistical processing is shown. Blood samples were collected from each of the patients divided into three groups: normal group, mild dementia (mild AD) group, and advanced dementia (severe AD) group, and erythrocyte lipid samples were prepared and analyzed by HPLC / ELSD method. (Pl-PE / PE) value is calculated from the peak area of the chromatogram obtained in this way, and the result of statistical processing is shown.
  • the present invention has been made by finding that the amount of plasmalogen in the erythrocyte membrane decreases when suffering from dementia (particularly AD), and includes an inspection method, a determination method, and a diagnostic method using this feature. To do. Moreover, the kit used for these methods is also included.
  • the present invention also includes a biomarker composed of a plasmalogen contained in erythrocytes and the use of a plasmalogen contained in erythrocytes as a biomarker.
  • Plasmalogen generally refers to a glycerophospholipid having a long-chain alkenyl group via a vinyl ether bond at the 1-position of the glycerol skeleton.
  • the general formula of plasmalogen is shown below.
  • R 1 and R 2 represent an aliphatic hydrocarbon group.
  • R 1 is usually an aliphatic hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms, and examples thereof include a dodecyl group, a tetradecyl group, a hexadecyl group, an octadecyl group, and an icosanyl group.
  • R 2 is usually an aliphatic hydrocarbon group derived from a fatty acid residue.
  • octadecadienoyl group octadecatrienoyl group, icosatetraenoyl group, icosapentaenoyl group, docosatetraenoyl group, docosa Examples include a pentaenoyl group and a docosahexaenoyl group.
  • X represents a polar group. X is preferably —CH 3 CH 3 NH 2 , —CH 3 CH 3 N + (CH 3 ) 3 , —CH 3 CH 2 (NH 2 ) COOH, or X is preferably X bound to H
  • the compound (H—X) is inositol or glycerol. ]
  • an ethanolamine plasmalogen wherein X is an aminoethyl group (—CH 3 CH 3 NH 2 ) and a choline where X is a trimethylaminoethyl group (—CH 3 CH 3 N + (CH 3 ) 3 )
  • Plasmalogens are the main plasmalogens that exist in nature. Red blood cells contain a particularly large amount of ethanolamine plasmalogen as a plasmalogen.
  • the inspection method of the present invention includes the following steps (A) and (B).
  • the test method is used to determine whether the test blood sample is derived from a dementia mammal be able to.
  • the test method of the present invention can be said to be a test method for determining whether a test blood sample is derived from a dementia mammal (that is, a test method that provides data for determination). In the said determination, when said (i) is less than said (ii), it determines with a test blood sample originating in a dementia mammal.
  • examples of mammals include human and non-human mammals.
  • non-human mammals include pets, laboratory animals, livestock and the like. Specific examples include dogs, cats, monkeys, cows, horses, sheep, goats, pigs, mice, rats, hamsters, rabbits, and the like.
  • dementia is preferable as dementia, specifically, Alzheimer's dementia, Parkinson's disease (with dementia associated with), frontotemporal dementia, Pick's disease, diffuse Examples include Lewy body disease. Alzheimer type dementia and Parkinson's disease (dementia associated therewith) are preferable, and Alzheimer type dementia is more preferable.
  • test blood sample blood itself collected from a mammal and a sample obtained by subjecting the blood to some kind of processing and containing red blood cells can be used.
  • treatment applied to blood treatment in which red blood cells remain after the treatment
  • an anticoagulant for example, a citric acid, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) or its metal salt (sodium salt etc.), sodium fluoride, heparin etc.
  • an anticoagulant for example, a citric acid, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) or its metal salt (sodium salt etc.), sodium fluoride, heparin etc.
  • the test blood sample is preferably blood obtained by a normal blood collection method (for example, syringe blood collection or vacuum blood collection) or a sample obtained by processing the blood.
  • HPLC high performance liquid chromatography; also called high performance liquid chromatography
  • GC-MS gas chromatograph mass spectrometer
  • TLC thin layer Chromatography
  • the measurement using HPLC is performed by centrifuging a test blood sample, removing a supernatant (ie, serum), further removing platelets and white blood cells, preparing a red blood cell sample, and hemolyzing the red blood cell sample. This can be done by extracting the lipid and analyzing it by HPLC.
  • a supernatant ie, serum
  • Serum, platelets, and leukocytes can be removed by, for example, centrifuging the test blood sample (for example, 1000 ⁇ g, 5 minutes) and then removing the supernatant and the upper layer of the blood cell part. It is more preferable that physiological saline is added to the sample from which serum, platelets and leukocytes have been removed, and the mixture is centrifuged (for example, 1000 ⁇ g, 5 minutes) to further remove serum components and leukocytes and platelets in the upper layer of the blood cell portion. After removing serum, platelets, and white blood cells, physiological saline can be added to prepare any (eg, about 10%) hematocrit red blood cell suspension (red blood cell sample). The number of red blood cells, hemoglobin value, etc. in this red blood cell suspension can be measured with a blood cell measuring device (Sysmex 800, Sysmex, Kobe, Japan).
  • a known method can be used, and for example, it can be performed by adding a solution having a low osmotic pressure (hypotonic solution) to the red blood cell sample.
  • the hypotonic solution is preferably a buffer, for example, a phosphate buffer.
  • a known lipid extraction method can be used as a method for obtaining a erythrocyte lipid sample by lysing erythrocytes and then extracting lipids.
  • a known lipid extraction method can be used as a method for obtaining a erythrocyte lipid sample by lysing erythrocytes and then extracting lipids.
  • a known lipid extraction method can be used as a method for obtaining a erythrocyte lipid sample by lysing erythrocytes and then extracting lipids.
  • methanol and chloroform are added to a sample obtained by lysing erythrocytes and mixed.
  • a method for recovering the chloroform layer
  • erythrocyte suspension erythrocyte suspension
  • a method for recovering the chloroform layer can be mentioned.
  • the recovered chloroform layer can be dried and stored at about ⁇ 20 ° C. to ⁇ 40 ° C. The drying can be performed using nitrogen gas.
  • a chromatogram in which the peak of each lipid component (including plasmalogen) existing in the erythrocyte membrane appears can be obtained.
  • the sample is preferably detected by evaporative light scattering detection (ELSD: Evaporative Light Scattering Detector). That is, it is preferable to perform analysis by HPLC / ELSD method.
  • ELSD Evaporative Light Scattering Detector
  • an erythrocyte membrane lipid sample is dissolved in hexane / isopropanol (1: 1), injected into an HPLC column, and detection is performed by ELSD, whereby each lipid component present in the erythrocyte membrane can be analyzed. .
  • hexane / isopropanol / acetic acid (82: 17: 1, volume ratio) can be used for mobile phase A
  • isopropanol / water / acetic acid (85: 14: 1, volume ratio) can be used for mobile phase B.
  • the area of each peak in the obtained chromatogram represents the content of each lipid component.
  • the content can be determined by calculating what percentage of the peak area of the entire chromatogram the peak area indicating plasmalogen is. This is because ELSD shows a similar area response if the substance has a similar structure.
  • it is preferable to analyze by charging acidic lipid using acetic acid and triethylamine as a solvent. This is because the same area response can be shown by charging.
  • the step (A) In the measurement of the amount of plasmalogen in the step (A), it is not always necessary to obtain an absolute amount such as a mass value, and in the step (B), it is derived from a healthy mammal of the same species as the mammal from which the test blood sample was collected. It is only necessary to obtain data that can be compared with the amount of plasmalogen contained in red blood cells.
  • test red blood cell PL amount the amount of plasmalogen contained in red blood cells contained in the test blood sample
  • the amount of plasmalogen contained in erythrocytes derived from blood is measured by the same measurement method, and the obtained data are compared with each other, so that the test erythrocyte PL amount and the healthy erythrocyte PL amount are compared.
  • the comparison in the step (B) can be performed without obtaining each absolute amount.
  • step (B) (i) the amount of plasmalogen contained in the red blood cells contained in the test blood sample (the amount of test red blood cells PL), and (ii) derived from a healthy mammal of the same species as the mammal from which the test blood sample was collected The amount of plasmalogen contained in the red blood cells (the amount of healthy red blood cells PL) is compared.
  • the comparison result (that is, the amount of the test erythrocyte PL amount relative to the healthy erythrocyte PL amount) can be used to determine whether the test blood sample is derived from a dementia mammal.
  • test red blood cells contained in the test blood sample are also referred to as “test red blood cells”.
  • Red blood cells derived from healthy mammals of the same species as the mammal from which the test blood sample was collected are the same species as the mammal from which the test sample was collected and are healthy Red blood cells contained in mammalian blood samples.
  • red blood cells contained in a blood sample collected from a healthy person correspond to healthy red blood cells.
  • a healthy mammal is a mammal that does not suffer from dementia (preferably healthy).
  • the comparison between (i) the test erythrocyte PL amount and (ii) the healthy erythrocyte PL amount may be made by comparing the respective absolute amounts by different or the same measurement method, and the same measurement method is used. Is more preferable.
  • (i) and (ii) are not necessarily absolute values as long as (i) and (ii) can be compared, and may be relative values, for example.
  • (i) and (ii) are both obtained as absolute quantity values (for example, mass value or molar value)
  • by aligning the amount of red blood cells used for measurement ie, the amount of sample used for measurement
  • (I) and (ii) can be compared.
  • the amount of red blood cells can be aligned by, for example, aligning the mass of red blood cells of the measurement sample, aligning the number of red blood cells of the measurement sample, or aligning the hemoglobin values of the measurement sample.
  • the amount of test red blood cells PL present in a certain amount of red blood cells with the amount of red blood cells PL present in the same amount of red blood cells, the amount of test red blood cells PL relative to the amount of healthy red blood cells PL You can decide a little.
  • the membrane lipids of erythrocytes contained in the test blood sample and the membrane lipids of erythrocytes from a healthy mammal of the same species as the mammal from which the test blood sample was collected are analyzed.
  • the areas of the peaks indicating plasmalogen in the respective chromatograms obtained in this manner can be compared with each other.
  • the amount of the test erythrocyte PL amount relative to the healthy erythrocyte PL amount can be determined by aligning the amount of red blood cells to obtain membrane lipids used for HPLC measurement.
  • the ratio of the peak area showing plasmalogen to the peak area showing other specific lipid components is compared with the amount of red blood cells to obtain membrane lipids used for HPLC measurement. It is also possible to determine the amount of the test erythrocyte PL amount relative to the healthy erythrocyte PL amount by comparing the ratios. That is, HPLC analysis is performed on each of the test red blood cells and healthy red blood cells to obtain chromatograms, and in each chromatogram, the ratio (ratio) of the amount of plasmalogen to a specific lipid component amount is obtained, and the magnitude of the ratio is compared. Thus, the amount of plasmalogen can be compared. The larger the ratio, the larger the plasmalogen amount, and the smaller the ratio, the smaller the plasmalogen amount.
  • the ratio can be described as (plasmalogen amount / specific lipid component amount), and can be determined by (peak area showing plasmalogen / peak area showing specific lipid component). In this comparison method, it is preferable to select a specific lipid component that is contained in the test erythrocyte and the healthy erythrocyte and has substantially the same content as the “specific lipid component” used in the denominator of the ratio.
  • lipid components include phosphatidylethanolamine, sphingomyelin, cholesterol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine, sphingomyelin, and cholesterol are preferable, and phosphatidylethanolamine is more preferable.
  • phosphatidylethanolamine is more preferable.
  • the ratio (ratio) of plasmalogen amount to specific lipid component amount can be obtained, a more accurate comparison result can be obtained. preferable.
  • the comparison result of (i) test erythrocyte PL amount and (ii) healthy erythrocyte PL amount obtained by the test method of the present invention is preferable for determining whether or not the test blood sample is derived from a dementia mammal. Used. In the said determination, when said (i) is less than said (ii), it determines with a test blood sample originating in a dementia mammal. That is, the test method of the present invention is a test method for determining that the test blood sample is derived from a dementia mammal when (i) is less than (ii) (that is, obtaining comparative data for determination). Can be preferably used as an inspection method.
  • the ratio of (ethanolamine plasmalogen amount / phosphatidylethanolamine amount) is about 0.85 to 0.9 in healthy mammals (especially healthy people), whereas it is 0 in demented mammals (especially demented patients). About 7 or less (about 0.7 to 0.5).
  • the (ethanolamine plasmalogen amount / phosphatidylethanolamine amount) ratio value of patients with dementia is 90% or less (preferably 85% or less, more preferably 80% or less) of the ratio value of healthy persons. Therefore, when comparing the ratio value, when the ratio value of the test erythrocyte is 90% or less (preferably 85% or less, more preferably 80% or less) of the ratio of the healthy erythrocyte, the test erythrocyte is dementia. It is thought that it can be determined that it originates from a mammal.
  • the test method of the present invention is useful for determining whether a test blood sample is derived from a dementia mammal.
  • the necessary sample is a blood sample and can be carried out by using a general device, it can be said that it is greatly improved in terms of convenience, economy, versatility and the like.
  • the test method of the present invention can be used, for example, for testing a blood sample in a clinical testing company. For example, when carrying out the business which ships a dementia model animal, it can be used in order to check whether the shipped model animal suffers from dementia. Or when carrying out the business which ships a normal animal, it can be used in order to check whether the shipped animal does not suffer from dementia.
  • the present invention includes a method for determining whether or not a test blood sample is derived from a dementia mammal.
  • the determination method includes the above steps (A) and (B), and (C) (i) the amount of plasmalogen contained in red blood cells contained in the test blood sample is (ii) collecting the test blood sample A step of determining that the test blood sample is derived from a dementia mammal when the amount of plasmalogen contained in red blood cells derived from a healthy mammal of the same species as that of the mammal is smaller.
  • the determination method can be used in the same manner as described for the inspection method.
  • the present invention also includes a method for diagnosing whether or not a mammal has dementia.
  • This method for diagnosing dementia of the present invention is a method for diagnosing that a mammal from which a test blood sample has been collected has dementia based on the result of the above-described determination method. That is, when the test blood sample is determined to be derived from a dementia mammal by the above-described determination method, the mammal from which the test blood sample is collected is diagnosed as dementia. More specifically, the diagnostic method of the present invention includes steps (A), (B), and (C) in the above-described determination method, and (D) the test blood sample is recognized in step (C). It can be referred to as a diagnostic method including a step of diagnosing a mammal from which the test blood sample has been collected as having dementia when it is determined to be derived from a sick mammal.
  • the diagnostic method of the present invention can also include a step of collecting a test blood sample from a mammal to be diagnosed as having dementia before the step (A).
  • a blood collection method for obtaining a test blood sample a known method can be used.
  • a syringe blood collection method or a vacuum blood collection method can be exemplified.
  • a biomarker for detecting dementia refers to a biomolecule that serves as an index for determining or diagnosing the onset of dementia. It can also be said to be a biomolecule for determining onset of dementia or a diagnostic indicator.
  • the present invention also includes a biomarker for detecting dementia, comprising a plasmalogen contained in erythrocytes. More specifically, a biomarker for detecting dementia, comprising a plasmalogen contained in the erythrocyte membrane, is also included. Note that plasmalogen contained in erythrocytes isolated from the living body, not plasmalogen present in the living body, is used as the biomarker for detecting dementia of the present invention. Therefore, it can be said that the biomarker of the present invention is a biomarker for detecting dementia composed of plasmalogen extracted from red blood cells (erythrocyte-extracted plasmalogen). It can also be said to be a biomarker for dementia diagnosis.
  • the biomarker for detecting dementia of the present invention is characterized in that the amount thereof is reduced in dementia mammals compared to healthy mammals. Therefore, each of the biomarkers is isolated from the test mammal and the healthy mammal, and the amount thereof is measured and compared. If the test mammal is smaller, the test mammal suffers from dementia. Can be diagnosed.
  • the biomarker for detecting dementia of the present invention is particularly preferably ethanolamine plasmalogen among plasmalogens. That is, the present invention is a dementia detection biomarker comprising ethanolamine plasmalogen contained in erythrocytes (dementia detection biomarker comprising erythrocyte-extracted ethanolamine plasmalogen, or dementia comprising erythrocyte-extracted ethanolamine plasmalogen. Preferably a diagnostic biomarker).
  • Kit The present invention also includes a kit (test kit, test kit, or diagnostic kit) used in the above-described test method, determination method, or diagnostic method. More specifically, these kits can be referred to as blood sample test kits, dementia-derived blood sample determination kits, and dementia diagnosis kits.
  • the kit of the present invention includes a reagent useful for measuring the amount of plasmalogen contained in erythrocytes.
  • a reagent useful for measuring the amount of plasmalogen contained in erythrocytes.
  • examples of such a reagent include a hypotonic solution for erythrocyte hemolysis and an organic solvent for lipid extraction.
  • the hypotonic solution for erythrocyte hemolysis is exemplified by a hypotonic phosphate buffer and the like
  • the organic solvent for lipid extraction is exemplified by methanol, chloroform, methanol / chloroform (preferably 1: 1) solution and the like.
  • the kit of the present invention preferably comprises a hypotonic solution for erythrocyte hemolysis and / or an organic solvent for lipid extraction.
  • the kit of the present invention may further include a blood collection device or reagent.
  • a blood collection device or reagent for example, a syringe for blood collection, a tube for blood collection, an anticoagulant and the like can be exemplified.
  • the kit of the present invention may further include a solvent for HPLC analysis. Examples of such a solvent include, but are not limited to, hexane / isopropanol / acetic acid (82: 17: 1), isopropanol / water / acetic acid (85: 14: 1), triethylamine, and the like.
  • the kit of the present invention can be preferably used in the above-described inspection method, determination method, or diagnosis method.
  • Rat blood collection Blood was collected by cardiac puncture using a syringe. Heparin, an anticoagulant, was added to the collected blood. This is a rat blood sample. The rats used for blood collection were 6 Wistar rats (12 weeks old) raised for 4 weeks on an MF solid diet (Oriental Yeast Co., Ltd.).
  • Human blood collection Venous blood was collected using a syringe. To the collected blood, EDTA-Na (ethylenediaminetetraacetic acid sodium salt) was added as an anticoagulant. This was a human blood sample.
  • EDTA-Na ethylenediaminetetraacetic acid sodium salt
  • ⁇ Preparation of serum and red blood cell samples The blood sample obtained as described above was centrifuged at 1000 ⁇ g for 5 minutes to remove the supernatant (ie serum). The removed serum was stored (this was used as a serum sample). In addition, platelets and leukocytes were removed. Then, physiological saline was added to the sample from which the platelets and leukocytes had been removed and mixed, followed by centrifugation at 1000 ⁇ g for 5 minutes to remove leukocytes and platelets in the upper layer of serum components and blood cells. This operation was further repeated twice. Thereafter, physiological saline was added to prepare a 10% hematocrit erythrocyte suspension. The erythrocyte count and hemoglobin level in the erythrocyte suspension were measured and recorded with a blood cell counter (Sysmex 800, Sysmex, Kobe, Japan).
  • the erythrocytes thus obtained were hemolyzed by adding 0.25 ml of 5 mM phosphate buffer (pH 8.0), mixed with 4 ml of methanol, and then allowed to stand for 30 minutes. 4 ml of chloroform was added thereto and mixed, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 20 minutes to extract lipids. This was centrifuged (1000 ⁇ g, 5 minutes), and the supernatant was collected.
  • methanol / chloroform (1: 1) solution was added to the residue to re-extract the lipid. Thereafter, the supernatant was collected by centrifugation (1000 ⁇ g, 5 minutes), and the supernatant collected earlier was combined, and 10 ml of 50 mM potassium chloride solution was further added and mixed, followed by centrifugation (1000 ⁇ g, 5 minutes). 1 ml of the chloroform layer was collected, dried using nitrogen gas, and stored at ⁇ 30 ° C. The lipid sample thus obtained was used as an erythrocyte lipid sample. Rat erythrocyte lipid samples and human erythrocyte lipid samples were prepared.
  • lipid sample When extracting lipid from a serum sample, 4 ml of methanol was added to a 0.5 ml serum sample, and then 4 ml of chloroform was added, and then the lipid was extracted in the same manner as erythrocytes. The lipid sample thus obtained is used as a serum lipid sample. Rat serum lipid samples and human serum lipid samples were prepared.
  • Mobile phase A decreases linearly from 95%, remains 63% at 23 minutes, 15% at 27 minutes, 15% from 27 to 28 minutes, returns to the initial conditions in 4 minutes, and continues the initial conditions for 5 minutes.
  • the next sample was injected.
  • Each lipid was detected using an evaporative light scattering detector (ELSD).
  • ELSD evaporative light scattering detector
  • the plasmalogen contained in the erythrocyte lipid sample can be detected by analysis by HPLC / ELSD method. Moreover, it was confirmed by HPLC / ELSD method that not only plasmalogens but also other lipid components can be separated and detected at a time.
  • rat serum lipid samples were analyzed by HPLC / ELSD method. The results are shown in FIG. 2 (the lower chromatogram in FIG. 2 is an enlarged version of the upper chromatogram in FIG. 2). From the results, it was found that there was almost no plasmalogen in the serum (at least difficult to detect under the above-mentioned HPLC analysis conditions).
  • ⁇ Analysis of erythrocyte lipid sample by HPLC / ELSD method human> The human erythrocyte lipid sample was analyzed by HPLC / ELSD method in the same manner as the analysis of the rat erythrocyte lipid sample. The results are shown in FIG. 3 (the upper chromatogram of FIG. 3). As in the case of the rat, peaks indicating various lipids were obtained, and it was found that the peak of ethanolamine plasmalogen (pl-PE), which is a plasmalogen, could be clearly read.
  • pl-PE ethanolamine plasmalogen
  • the human serum lipid sample was similarly analyzed by HPLC / ELSD method. The results are shown in FIG. From the results, it was found that there was almost no plasmalogen in the serum (at least difficult to detect under the above-mentioned HPLC analysis conditions).
  • the ratio of the amount of ethanolamine plasmalogen to the amount of phosphatidylethanolamine of one of the lipids contained in the red blood cell membrane was determined. Although calculated and compared (that is, compared with phosphatidylethanolamine as a reference), the ratio of ethanolamine plasmalogen to other lipids can be calculated and compared in the same manner.
  • LPS lipopolysaccharide
  • mice for example, Jpn. J. Pharmacol. 87, 195). -201 (2001)
  • brain inflammation was caused to produce a dementia model mouse.
  • LPS lipopolysaccharide
  • a dementia model mouse having inflammation was obtained (the mouse group was referred to as LPS group).
  • a control group was a group of mice in which physiological saline was administered intraperitoneally for 7 days to 8-12 week old C57BL male mice instead of LPS.
  • each mouse was anesthetized by administration of pentobarbital.
  • blood was collected from the left ventricle to obtain a test blood sample.
  • an erythrocyte lipid sample is prepared from the test blood sample, analyzed by HPLC / ELSD method, and the peak area of ethanolamine plasmalogen (pl-PE) and the peak of phosphatidylethanolamine (PE) are obtained.
  • the ratio to the area (pl-PE / PE) was calculated.
  • a Steel test nonparametric test was performed. The results are shown in FIG.
  • Hasegawa-style simplified intelligence assessment scale is a method widely used in clinical settings as a method for screening elderly people with dementia from the general elderly (Geriatric Psychiatry Journal) , 2: 1339-1347 (1991), Guidance on Intelligent Function Testing for the Elderly, World Planning, (1991), etc.).

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Abstract

　本発明は、認知症（特にアルツハイマー型認知症）を簡便に低コストでより安全に診断可能とするための検査方法やバイオマーカーを提供することを課題とする。　本発明によれば、被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるかを判定するための検査方法であって、 （Ａ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量を測定する工程、及び （Ｂ）（ｉ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量と、（ｉｉ）被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球に含まれるプラズマローゲン量とを、比較する工程 を含む、検査方法が提供される。

Description

認知症を血液サンプルで判定するための検査方法
　本発明は、血液サンプルが認知症哺乳動物由来かを判定するための検査方法に関する。また、当該検査方法の結果を用いて、血液サンプルが認知症哺乳動物由来かを判定する方法に関する。また、当該判定方法の結果に基づいて、哺乳動物が認知症かを診断する方法に関する。また、認知症診断用バイオマーカー、及び当該バイオマーカーの使用に関する。
　認知症の診断は面接及び質問紙法が主体であり、客観的診断法は未だ確立されていないのが現状である。面接及び質問紙法は、診断者による差があり、定量性に欠けるという欠点がある。このような問題を解決するため、客観的診断法の確立のため研究が行われている。例えば、ＡＤ（アルツハイマー病）では、進行に伴い大脳の萎縮が見られるようになるため、磁気共鳴画像法（MRI）を用いた画像診断を行う方法が考案されている。また、ＡＤでは、過剰にリン酸化されたタウタンパク質の細胞内凝集（神経原線維変化）が、βアミロイドタンパク質（Ａβ）の細胞外蓄積（老人斑）とともに、脳で顕著に観察される。そして、Ａβが蓄積すると、神経細胞内の微小管が構造変化を起こして神経細胞が死んでいくことになり、当該神経細胞死が起こると共にタウタンパク質も細胞の外に漏れ、脳脊髄液中に蓄積すると考えられている。このことから、脳脊髄液中のタウタンパク質をマーカーとして用いる診断法も考案されている。しかし、これらの方法は大型の専門機器が必要となる等、利便性　、経済性、汎用性等の面で十分とは言い難いものであった。
　認知症（特に、認知症の６割を占めると言われるアルツハイマー型認知症（以下、「AD」ともいう））では、ミエリン脂質であるプラズマローゲンの代謝系に異常が見られ、AD患者やＡＤモデル動物では、脳内のプラズマローゲン量が低下していることが示唆されている。また、最近、ADに罹患すると、脳内だけでなく血清中のプラズマローゲン量も低下していることを示唆する報告がなされた（非特許文献１）。しかしながら、血清にはもともとプラズマローゲンは微量しか含まれていないため、その低下を簡便に検出することは難しく、認知症の診断のためのバイオマーカーとして用いるには、利便性、経済性、汎用性等の点で十分とは言い難いものであった。
J Lipid Res 48, 2485-2498,2007
　本発明は、認知症（特にアルツハイマー型認知症）を簡便に低コストでより安全に診断可能とするための検査方法やバイオマーカーを提供することを課題とする。
　本発明者らは、驚くべき事に、赤血球に含有されるプラズマローゲンが認知症（特にＡＤ）を診断するために有用なバイオマーカーとなることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の方法、バイオマーカー、使用、及びキットを包含する。
項１．
被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるかを判定するための検査方法であって、
（Ａ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量（すなわち、赤血球脂質中のプラズマローゲン量）を測定する工程、及び
（Ｂ）（ｉ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量と、（ｉｉ）被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球に含まれるプラズマローゲン量とを、比較する工程
を含む、検査方法。
項２．
工程（Ａ）が、被験血液サンプルに含有される赤血球の膜脂質に含まれるプラズマローゲン量を高速液体クロマトグラフィーにより測定する工程であり、
工程（Ｂ）が、（ｉ）工程（Ａ）で測定したプラズマローゲン量と、（ｉｉ）高速液体クロマトグラフィーにより測定した、被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球の膜脂質に含まれるプラズマローゲン量とを、比較する工程である、
項1に記載の検査方法。
項３．
工程（Ｂ）において、（ｉ）と（ｉｉ）との比較を、高速液体クロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムにおけるプラズマローゲンを示すピーク面積を比較することで行う、項２に記載の検査方法。
項４．
前記プラズマローゲンを示すピーク面積の比較を、エタノールアミンプラズマローゲンを示すピーク面積と、ホスファチジルエタノールアミンを示すピーク面積との比に基づいて行う、項３に記載の検査方法。
項５．
前記（ｉ）が前記（ｉｉ）より少ない場合に被験血液サンプルは認知症哺乳動物由来であると判定するための検査方法である、項１～４のいずれかに記載の検査方法。
項６．
被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるかを判定する方法であって、
項１～４のいずれかに記載の検査方法における工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を含み、さらに
（Ｃ）前記（ｉ）が前記（ｉｉ）より少ない場合に、被験血液サンプルは認知症哺乳動物由来であると判定する工程
を含む、判定方法。
項７．
赤血球に含有されるプラズマローゲンからなる、認知症検出用バイオマーカー。
項８．
赤血球に含有されるプラズマローゲンの認知症検出用バイオマーカーとしての使用。
項９．
赤血球溶血用低張液及び／又は脂質抽出用有機溶媒を備えた、血液サンプル検査用、認知症由来血液サンプル判定用、又は認知症診断用のキット。
項１０．
被験血液サンプルを採取した哺乳動物を認知症であると診断する方法であって、
項６に記載の工程（Ａ）、工程（Ｂ）、及び工程（Ｃ）を含み、さらに
（Ｄ）工程（Ｃ）で被験血液サンプルは認知症哺乳動物由来であると判定した場合に、当該被験血液サンプルを採取した哺乳動物を認知症であると診断する工程
を含む、診断方法。
項１１．
哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、項１０に記載の診断方法。
項１２．
認知症の診断における使用のための、赤血球に含有されるプラズマローゲン。
本発明の検査方法によれば、被験血液サンプルが認知症（特にアルツハイマー型認知症）哺乳動物由来であるかを判定するためのデータを簡便、安全且つ低コストに取得できる。また、本検査方法の結果により、被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるかを判定することができ、さらには当該判定結果から認知症を診断することができる。さらには、本発明の認知症検出用バイオマーカーやキットにより、上述の検査、判定、診断を簡便、安全かつ低コストに行い得る。
ラット赤血球脂質サンプルをＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法で分析して得られたクロマトグラムを示す。 ラット血清脂質サンプルをＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法で分析して得られたクロマトグラムを示す。各脂質物質の略称は図１又は３と共通する。 ヒト赤血球脂質サンプルをＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法で分析して得られたクロマトグラムを示す。 ヒト血清脂質サンプルをＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法で分析して得られたクロマトグラムを示す。各脂質物質の略称は図１又は３と共通する。 正常マウス及び認知症モデルマウスの赤血球脂質サンプルをＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法で分析して得られたクロマトグラムのピーク面積から、（ｐｌ－ＰＥ／ＰＥ）値を算出し、統計処理した結果を示す。 正常群、軽度認知症（軽度AD）群、高度認知症（高度AD）群の３群に群分けされた各患者から採血し、赤血球脂質サンプルを調製して、これをＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法で分析して得られたクロマトグラムのピーク面積から、（ｐｌ－ＰＥ／ＰＥ）値を算出し、統計処理した結果を示す。
　以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
　本発明は、認知症（特にＡＤ）に罹患すると、赤血球膜中のプラズマローゲン量が減少することを見出してなされたものであり、この特徴を利用した検査方法、判定方法、及び診断方法を包含する。また、これらの方法に用いるキットも包含する。また、本発明は、赤血球に含まれるプラズマローゲンからなるバイオマーカー、及び、赤血球に含まれるプラズマローゲンのバイオマーカーとしての使用、も包含する。
プラズマローゲン
　プラズマローゲンとは、通常、グリセロール骨格の１位にビニルエーテル結合を介した長鎖アルケニル基をもつグリセロリン脂質をいう。以下にプラズマローゲンの一般式を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
〔式中、Ｒ１及びＲ２は脂肪族炭化水素基を示す。Ｒ１は通常炭素数１～２０の脂肪族炭化水素基であり、例えばドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、イコサニル基等が挙げられる。Ｒ２は通常脂肪酸残基由来の脂肪族炭化水素基であり、例えばオクタデカジエノイル基、オクタデカトリエノイル基、イコサテトラエノイル基、イコサペンタエノイル基、ドコサテトラエノイル基、ドコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基等が挙げられる。また、式中、Ｘは極性基を示す。Ｘは好ましくは、－ＣＨ３ＣＨ３ＮＨ２、－ＣＨ３ＣＨ３Ｎ＋（ＣＨ３）３、－ＣＨ３ＣＨ２（ＮＨ２）ＣＯＯＨ、或いは、Ｘは好ましくは、ＸにＨが結合した化合物（Ｈ－Ｘ）がイノシトール、又はグリセロールである。〕
　特に、上記式中Ｘがアミノエチル基（－ＣＨ３ＣＨ３ＮＨ２）であるエタノールアミンプラズマローゲンと、Ｘがトリメチルアミノエチル基（－ＣＨ３ＣＨ３Ｎ＋（ＣＨ３）３）であるコリンプラズマローゲンが、自然界に存在するプラズマローゲンの中で主要である。赤血球には、プラズマローゲンとしては、エタノールアミンプラズマローゲンが特に多く含まれている。
検査方法
　本発明の検査方法は、以下の工程（Ａ）、及び工程（Ｂ）を含む。
（Ａ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量を測定する工程
（Ｂ）（ｉ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量を、（ｉｉ）被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球に含まれるプラズマローゲン量と、比較する工程
　当該検査方法は、被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるか否かを判定するために用いることができる。言い換えれば、本発明の検査方法は、被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるかを判定するための検査方法（つまり、判定するためのデータを提供する検査方法）ともいえる。当該判定では、前記（ｉ）が前記（ｉｉ）より少ない場合に被験血液サンプルは認知症哺乳動物由来であると判定される。
　なお、本明細書において、哺乳動物としては、ヒト及び非ヒト哺乳動物が挙げられる。非ヒト哺乳動物としては、例えばペット、実験動物、家畜等が挙げられる。具体的には、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、等が例示できる。また、本明細書において、認知症としては、変性性認知症が好ましく、具体的には、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病（に伴う認知症）、前頭側頭型認知症、ピック病、びまん性レビー小体病等が例示できる。好ましくはアルツハイマー型認知症、パーキンソン病（に伴う認知症）であり、より好ましくはアルツハイマー型認知症である。
〔工程（Ａ）〕
　被験血液サンプルとしては、哺乳動物から採取した血液そのもの、及び該血液に何らかの処理が施されたサンプルであって赤血球が含まれるもの、を用いることができる。ここでの血液に施される処理（処理後に赤血球が残存する処理）としては、遠心処理や抗凝固薬の添加等が例示される。抗凝固薬は公知のものを用いることができ、例えば、クエン酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）又はその金属塩（ナトリウム塩等）、フッ化ナトリウム、ヘパリン等が例示できる。なお、特に制限されないが、被験血液サンプルは通常の採血方法（例えばシリンジ採血又は真空採血）により得られる血液又は当該血液を処理して得られるサンプルであると好ましい。
　被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量の測定は、例えばＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー；高性能液体クロマトグラフィーとも呼ばれる）、ＧＣ－ＭＳ（ガスクロマトグラフ質量分析計）、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）等を用いて行うことができる。中でも、ＨＰＬＣを用いるのが好ましい。
　ＨＰＬＣを用いた測定は、具体的には、被験血液サンプルを遠心し、上清（すなわち血清）を除去し、さらに血小板及び白血球を除去して、赤血球サンプルを調整し、当該赤血球サンプルを溶血させ、脂質を抽出して、これをＨＰＬＣにより解析することで行い得る。
　血清、血小板、及び白血球の除去は、例えば被験血液サンプルを遠心（例えば１０００×ｇ、５分間）した後、上清及び血球部の上層を除去することで行うことができる。血清、血小板及び白血球を除去したサンプルに生理食塩水を加えて混和し、遠心（例えば１０００×ｇ、５分間）し、血清成分及び血球部の上層の白血球と血小板をさらに除去するとより好ましい。血清、血小板、及び白血球を除去した後、生理食塩水を加えて任意の（例えば約１０％）ヘマトクリット赤血球浮遊液（赤血球サンプル）を調製できる。この赤血球浮遊液中の赤血球数、ヘモグロビン値等を血球計測装置（シスメックス　８００、シスメックス、神戸、日本）で計測することができる。
　また、赤血球サンプルを溶血させるためには、公知の方法を用いることができ、例えば浸透圧が低い溶液（低張液）を赤血球サンプルに加えることにより行い得る。低張液はバッファーであることが好ましく、例えばリン酸バッファーが好ましく例示される。赤血球を溶血させた後、脂質を抽出して、赤血球脂質サンプルを得る方法としては、公知の脂質抽出法を用いることができ、例えばメタノール及びクロロホルムを、赤血球を溶血させたサンプルに加えて混和し、クロロホルム層を回収する方法が例示できる。より具体的には、溶血した赤血球溶液（赤血球浮遊液）に１～２倍容量のメタノール及び当該メタノールと同容量のクロロホルムを加えて混和し、１０分～２時間程度静置した後遠心して、クロロホルム層を回収する方法が挙げられる。回収したクロロホルム層は、乾燥させた後、－２０℃～－４０℃程度で保存することができる。当該乾燥は、窒素ガスを用いて行い得る。
　例えば上記のようにして得られる赤血球脂質サンプルを、ＨＰＬＣにより分析することで、赤血球膜に存在する各脂質成分（プラズマローゲンも含まれる）のピークが現れたクロマトグラムを得ることができる。ここでのＨＰＬＣによる分析では、試料の検出を蒸発光散乱検出（ELSD：Evaporative Light Scattering Detector）により行うことが好ましい。すなわちＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法により分析を行うことが好ましい。具体的には、例えば赤血球膜脂質サンプルを、ヘキサン/イソプロパノール（1：1）に溶解させてＨＰＬＣのカラムに注入し、検出をＥＬＳＤにより行うことで、赤血球膜に存在する各脂質成分を分析できる。また、移動相Ａには例えばヘキサン/イソプロパノール/酢酸（82：17：1、体積比）、移動相Ｂにはイソプロパノール/水/酢酸（85：14：1、体積比）を用いることができる。得られるクロマトグラムの各ピークの面積が、各脂質成分の含有量を表す。例えば、プラズマローゲンを示すピーク面積がクロマトグラム全体のピーク面積の何％にあたるかを算出することで含有量を求めることができる。ELSDでは、類似した構造を有する物質であれば同様のエリアレスポンスを示すためである。なお、例えば溶媒として酢酸及びトリエチルアミンを用いて酸性脂質をチャージさせて分析することが好ましい。チャージさせることで、より同様のエリアレスポンスを示し得るからである。
　なお、工程（Ａ）におけるプラズマローゲン量の測定では、必ずしも質量値等の絶対量を求める必要はなく、工程（Ｂ）において、被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球に含まれるプラズマローゲン量と比較することができるデータが得られればよい。例えば、（ｉ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量（以下「被験赤血球ＰＬ量」ともいう）と、（ｉｉ）被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球に含まれるプラズマローゲン量（以下「健常赤血球ＰＬ量」ともいう）とを、同じ測定方法により測定し、得られたデータどうしを比較することで、被験赤血球ＰＬ量及び健常赤血球ＰＬ量それぞれの絶対量を求めることなく、工程（Ｂ）における比較を行うことができる。
〔工程（Ｂ）〕
　工程（Ｂ）では、（ｉ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量（被験赤血球ＰＬ量）と、（ｉｉ）被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球に含まれるプラズマローゲン量（健常赤血球ＰＬ量）とを、比較する。当該比較結果（すなわち被験赤血球ＰＬ量の健常赤血球ＰＬ量に対する多少）は、被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるかを判定するために用いることができる。
　被験赤血球ＰＬ量としては、上述の工程（Ａ）において求められたプラズマローゲン量を用いることができる。なお、以下被験血液サンプルに含有される赤血球を「被験赤血球」ともいう。
　“被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球”（以下「健常赤血球」ともいう）とは、被験サンプルを採取した哺乳動物と同一の種であって、健常である哺乳動物の血液サンプルに含有される赤血球である。例えば、被験血液サンプルがヒトから得られたものである場合、健常人から採取した血液サンプルに含有される赤血球が、健常赤血球に該当する。また、健常哺乳動物とは、認知症を患っていない（好ましくは健康な）哺乳動物である。
　（ｉ）被験赤血球ＰＬ量と（ｉｉ）健常赤血球ＰＬ量との比較は、異なった又は同一の測定方法により、それぞれの絶対量を求めた上で比較してよく、同一の測定方法を用いるのがより好ましい。また、上述したように、（ｉ）と（ｉｉ）の比較ができるのであれば、（ｉ）及び（ｉｉ）は必ずしも絶対量値でなくともよく、例えば相対値であってもよい。
　例えば、（ｉ）及び（ｉｉ）が、ともに絶対量値（例えば質量値又はモル値等）として得られている場合は、測定に用いる赤血球量（すなわち測定に用いるサンプル量）を揃えることにより、（ｉ）及び（ｉｉ）を比較することができる。赤血球量を揃えるのは、例えば、測定サンプルの赤血球の質量を揃える、測定サンプルの赤血球数を揃える、或いは測定サンプルのヘモグロビン値を揃える、等により行うことができる。このように、一定の赤血球量中に存在する被験赤血球ＰＬ量と、これと同量の赤血球量中に存在する健常赤血球ＰＬ量とを比較することにより、被験赤血球ＰＬ量の健常赤血球ＰＬ量に対する多少を決めることができる。
　また、（ｉ）及び（ｉｉ）が同一の分析方法により測定されたデータとして得られている場合は、それらのデータどうしを比較することができる。
　例えば、ＨＰＬＣ（検出は好ましくはＥＬＳＤ）により、被験血液サンプルに含有される赤血球の膜脂質、及び、被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球の膜脂質、を分析して得られるそれぞれのクロマトグラムにおける、プラズマローゲンを示すピークの面積を互いに比較することができる。この場合、ＨＰＬＣの測定に用いる膜脂質を得る赤血球量を揃えることにより、被験赤血球ＰＬ量の健常赤血球ＰＬ量に対する多少を決めることができる。
　またさらに、ＨＰＬＣの測定に用いる膜脂質を得る赤血球量を揃えなくとも、あるいは揃えた上で、プラズマローゲンを示すピーク面積を、他の特定の脂質成分を示すピーク面積と比べた場合の割合で表し、当該割合を比較することで、被験赤血球ＰＬ量の健常赤血球ＰＬ量に対する多少を決めることもできる。つまり、被験赤血球及び健常赤血球それぞれについてＨＰＬＣ分析を行ってクロマトグラムを得、それぞれのクロマトグラムにおいて、ある特定の脂質成分量に対するプラズマローゲン量の割合（比）を求め、当該比の大小を比べることにより、プラズマローゲン量を比較することができる。当該比が大きい方が、プラズマローゲン量が多いことになり、当該比が小さい方が、プラズマローゲン量が少ないことになる。なお、当該比は、すなわち（プラズマローゲン量／特定の脂質成分量）と記載することができ、（プラズマローゲンを示すピークの面積／特定の脂質成分を示すピークの面積）で求めることができる。この比較方法では、当該比の分母に用いられる“特定の脂質成分”として、被験赤血球及び健常赤血球に含まれ、かつその含有量がほぼ同じである特定の脂質成分を選択することが好ましい。このような脂質成分としては、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、コレステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール等が挙げられ、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、コレステロールが好ましく、ホスファチジルエタノールアミンがより好ましい。なお、ＨＰＬＣの測定に用いる膜脂質を得る赤血球量を揃えた上、かつ特定の脂質成分量に対するプラズマローゲン量の割合（比）を求めることにより、より精度の高い比較結果を得ることができるので好ましい。
　本発明の検査方法により得られる、（ｉ）被験赤血球ＰＬ量と（ｉｉ）健常赤血球ＰＬ量との比較結果は、被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるか否かを判定するために好ましく用いられる。当該判定では、前記（ｉ）が前記（ｉｉ）より少ない場合に被験血液サンプルは認知症哺乳動物由来であると判定される。つまり、本発明の検査方法は、前記（ｉ）が前記（ｉｉ）より少ない場合に被験血液サンプルは認知症哺乳動物由来であると判定するための検査方法（すなわち、判定するための比較データ取得用検査方法）として好ましく用いることができる。
　特に、上述のＨＰＬＣ分析で得たクロマトグラムから（プラズマローゲン量／特定の脂質成分量）の比を算出し、この比を用いてプラズマローゲン量を比較する場合、（エタノールアミンプラズマローゲン量／ホスファチジルエタノールアミン量）を比較することが好ましい。（エタノールアミンプラズマローゲン量／ホスファチジルエタノールアミン量）比は、健常哺乳動物（特に健常人）では０．８５～０．９程度であるのに対し、認知症哺乳動物（特に認知症患者）では０．７以下程度（０．７～０．５程度）となる。認知症患者の（エタノールアミンプラズマローゲン量／ホスファチジルエタノールアミン量）比値は、健常者の当該比値の９０％以下（好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下）ともいえる。よって、当該比値を比較する場合、被験赤血球の当該比値が健常赤血球の当該比の９０％以下（好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下）になったときに被験赤血球が認知症哺乳類由来と判定することができると考えられる。
　以上のように、本発明の検査方法は、被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるか否かを判定するために有用である。特に、必要となる試料が血液サンプルであって、一般的な機器を用いて実施することができるため、利便性、経済性、汎用性等の点で大きく改善されているといえる。本発明の検査方法は、例えば臨床検査会社において血液試料の検査を行うために用いることができる。また、例えば、認知症モデル動物を出荷する事業を行う場合に、出荷されるモデル動物が認知症を患っているかをチェックするために用いることができる。あるいは、正常動物を出荷する事業を行う場合には、出荷される動物が認知症を患っていないかチェックするために用いることができる。
判定方法
　本発明は、被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるか否かを判定する方法を含む。当該判定方法は、上記の工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を含み、さらに
（Ｃ）（ｉ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量が、（ｉｉ）被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球に含まれるプラズマローゲン量より少ない場合に、被験血液サンプルは認知症哺乳動物由来であると判定する工程
を含む。
　当該判定方法も、上記検査方法について述べたのと同様に用いることができる。
診断方法
　本発明は、哺乳動物が認知症であるか否かを診断する方法も含む。この、本発明の認知症診断方法は、上述の判定方法の結果に基づいて、被験血液サンプルを採取した哺乳動物が認知症であると診断する方法である。つまり、上述の判定方法により、被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であると判定された場合に、当該被験血液サンプルを採取した哺乳動物を認知症であると診断する方法である。より具体的には、本発明の診断方法は、上述の判定方法における工程（Ａ）、工程（Ｂ）、及び工程（Ｃ）を含み、かつ（Ｄ）工程（Ｃ）で被験血液サンプルは認知症哺乳動物由来であると判定した場合に、当該被験血液サンプルを採取した哺乳動物を認知症であると診断する工程を含む、診断方法ということができる。
　なお、特に制限されないが、本発明の診断方法は、工程（Ａ）の前に、認知症か否かを診断したい哺乳動物から被験血液サンプルを採取する工程を含むこともできる。被験血液サンプルを得るための血液採取方法としては公知の方法を用いることができ、例えばシリンジ採血法又は真空採血法が例示できる。
バイオマーカー
　本明細書において、認知症検出用バイオマーカーとは、認知症の発症を判定又は診断する指標となる生体分子をいう。認知症発症判定又は診断指標用生体分子とも言える。本発明は、赤血球に含有されるプラズマローゲンからなる、認知症検出用バイオマーカーも包含する。より詳しくは、赤血球膜に含有されるプラズマローゲンからなる、認知症検出用バイオマーカーも包含する。なお、生体中に存在するプラズマローゲンではなく、生体から単離された赤血球に含有されるプラズマローゲンが、本発明の認知症検出用バイオマーカーとして使用される。よって、本発明のバイオマーカーは、赤血球から抽出されたプラズマローゲン（赤血球抽出プラズマローゲン）からなる認知症検出用バイオマーカーともいえる。また、認知症診断用バイオマーカーともいえる。
　本発明の認知症検出用バイオマーカーは、認知症哺乳動物において、健常哺乳動物に比べその量が減少するという特徴を有する。よって、被験哺乳動物及び健常哺乳動物から当該バイオマーカーをそれぞれ単離して、その量を測定し、比較して、被験哺乳動物の方が少ない場合には、被験哺乳動物が認知症を患っていると診断することができる。
　なお、本発明の認知症検出用バイオマーカーとしては、プラズマローゲンの中でも特にエタノールアミンプラズマローゲンが好ましい。つまり、本発明は、赤血球に含有されるエタノールアミンプラズマローゲンからなる認知症検出用バイオマーカー（赤血球抽出エタノールアミンプラズマローゲンからなる認知症検出用バイオマーカー、又は赤血球抽出エタノールアミンプラズマローゲンからなる認知症診断用バイオマーカー、ともいえる）を好ましく包含する。
キット
　本発明は、上述の検査方法、判定方法、又は診断方法に用いるキット（検査用キット、判定用キット、又は診断用キット）も包含する。これらのキットは、より詳しくは、血液サンプル検査用キット、認知症由来血液サンプル判定用キット、認知症診断用キットということができる。
　本発明のキットには、赤血球に含まれるプラズマローゲン量を測定するために有用な試薬が備えられる。このような試薬としては、赤血球溶血用低張液や、脂質抽出用有機溶媒が挙げられる。具体的には、赤血球溶血用低張液としては低張リン酸バッファー等が、脂質抽出用有機溶媒としてはメタノール、クロロホルム、メタノール/クロロホルム(好ましくは1:1)液等が例示される。本発明のキットは、好ましくは赤血球溶血用低張液及び／又は脂質抽出用有機溶媒を備える。
　また、本発明のキットには、さらに、採血用器具又は試薬が備えられていてもよい。例えば、採血用シリンジ、採血用チューブ、抗凝固剤等が例示できる。また、本発明のキットには、さらに、ＨＰＬＣ分析用の溶媒が備えられていてもよい。このような溶媒としては、特に制限されないが、ヘキサン/イソプロパノール/酢酸（82：17：1）、イソプロパノール/水/酢酸（85：14：1）、トリエチルアミン等が例示できる。
　本発明のキットは、上述の検査方法、判定方法、又は診断方法に好ましく用いることができる。
　以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
測定サンプルの調製
＜血液採取＞
　ラットの血液採取：注射器を用いた心臓穿刺により、血液を採取した。採取した血液には、抗凝固剤であるヘパリンを加えた。これをラット血液サンプルとする。なお、採血に用いたラットは、MF固形食（オリエンタル酵母工業株式会社）で4週間飼育したウィスターラット(12週齢)6匹である。
　ヒトの血液採取：注射器を用いて静脈血を採取した。採取した血液には、抗凝固剤としてＥＤＴＡ－Ｎａ（エチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム塩）を加えた。これをヒト血液サンプルとした。
＜血清及び赤血球サンプルの調製＞
　上述のようにして得た血液サンプルを１０００×ｇ、５分間遠心して、上清（すなわち血清）を除去した。除去した血清は保存しておいた（これを血清サンプルとした）。さらに、血小板及び白血球を除去した。そして、血小板及び白血球を除去したサンプルに生理食塩水を加えて混和し、１０００×ｇ、５分間遠心し、血清成分および血球部の上層の白血球と血小板を除去した。当該操作をさらに２回繰り返した。この後、生理食塩水を加えて１０％ヘマトクリット赤血球浮遊液を調製した。この赤血球浮遊液中の赤血球数及びヘモグロビン値等を血球計測装置（シスメックス　８００、シスメックス、神戸、日本）で計測し、記録した。
＜脂質サンプルの調製＞
　上述のようにして得た赤血球浮遊液2.5mlを共栓付試験管にとり、遠心（１０００×ｇ、５分間）して、上清を除去した。こうして得られた赤血球に0.25mlの5mＭリン酸バッファー（pＨ8.0）を加えて溶血し、4ｍｌのメタノールを加えて混和後、30分間静置した。これに4ｍｌのクロロホルムを加えて混和し、室温で20分間静置して脂質を抽出した。これを遠心（１０００×ｇ、５分間）して上清を採取後、残渣にメタノール/クロロホルム(1:1)液4mlを加え、脂質を再抽出した。その後、遠心（１０００×ｇ、５分間）して上清を採取し、これに先に採取しておいた上清を合わせ、さらに10ｍｌの50mM塩化カリウム液を加えて混和し、遠心（１０００×ｇ、５分間）した。クロロホルム層を1ml採取して、窒素ガスを用いて乾燥させた後、－30℃に保存した。このようにして得られた脂質サンプルを赤血球脂質サンプルとした。ラット赤血球脂質サンプルと、ヒト赤血球脂質サンプルを調製した。
　血清サンプルから脂質を抽出する場合は、0.5ml血清サンプルにメタノール4ｍｌを加え、その後4ｍｌのクロロホルムを加えるところからは、赤血球と同様にして脂質を抽出した。このようにして得られた脂質サンプルを血清脂質サンプルとする。ラット血清脂質サンプルと、ヒト血清脂質サンプルを調製した。
サンプル中のプラズマローゲン量の測定
＜赤血球脂質サンプルのＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法による分析：ラット＞
　ラット赤血球脂質サンプルを0.2mlのヘキサン/イソプロパノール（1：1）に溶解し、0.01mlをＨＰＬＣに注入した。ＨＰＬＣは下記のDIOLカラム(250mm×4mm、シリカゲル平均粒径5μm)を用いた。下に測定条件を記載する。
　　機器；Shimadzu LC-10AD (島津製作所，京都，日本)
　　カラム；LiChrospher Diol 100（250-4, Merck社）（プレカラム無し）
　　流速；1.0ml/min
　　検出；蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ） (島津製作所，京都，日本)
移動相Aにはヘキサン/イソプロパノール/酢酸（82：17：1、体積比）、移動相Ｂにはイソプロパノール/水/酢酸（85：14：1、体積比）、（移動相A、Bともに0.08％（v/v）となるようにトリエチルアミンを加えた）を用いた。移動相A は、95％から直線的に減少し23分で63％、27分で15％、27分から28分まで15％を保ち、4分間で初期条件にもどし、5分間初期条件を継続して次の試料を注入した。各脂質の検出は蒸発光散乱検出器（ELSD）を用いた。結果を図１示す（図１上側のクロマトグラム）。各種脂質を示すピークが得られており、プラズマローゲンであるエタノールアミンプラズマローゲン（ｐｌ－ＰＥ）のピークも明確に読み取れることがわかった。
　なお、プラズマローゲンのビニルエーテル結合がアシル結合と比べて酸加水分解に敏感であることから、脂質サンプルを塩酸で処理すると、プラズマローゲンが選択的に分解される。塩酸処理したラット赤血球脂質サンプルを同様にしてＨＰＬＣで分析したところ、プラズマローゲン（ｐｌ－ＰＥ）由来ピークのみが消失することも確認できた（図１下側のクロマトグラム）。このことからも、消失したピークがプラズマローゲンであることが確認できた。なお、クロマトグラムの各ピークが、どの脂質成分由来のピークであるかは、各種脂質成分の標品を予め同様に分析してピーク検出位置を確認しておくことで、決定することができる。
　以上の結果から、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法による分析により、赤血球脂質サンプルに含まれるプラズマローゲンを検出可能であることが確認できた。また、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法により、プラズマローゲンのみならず、その他の脂質成分についても一度に分離、検出することが可能であることが確認できた。
　また、同様にして、ラット血清脂質サンプルをＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法で分析した。結果を図２に示す（図２下側のクロマトグラムは、図２上側のクロマトグラムを拡大したものである）。当該結果から、血清中にはプラズマローゲンがほとんど存在しない（少なくとも上記ＨＰＬＣ分析の条件では検出が難しい）ことがわかった。
＜赤血球脂質サンプルのＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法による分析：ヒト＞
　ヒト赤血球脂質サンプルを、上記ラット赤血球脂質サンプルの分析と同様にしてＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法により分析した。結果を図３に示す（図３上側のクロマトグラム）。ラットの場合と同様、各種脂質を示すピークが得られており、プラズマローゲンであるエタノールアミンプラズマローゲン（ｐｌ－ＰＥ）のピークも明確に読み取れることがわかった。
　また、塩酸処理したヒト赤血球脂質サンプルを同様にＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法で分析したところ、プラズマローゲン（ｐｌ－ＰＥ）由来ピークのみが消失することも確認できた（図３下側のクロマトグラム）。
　以上の結果からも、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法による分析により、赤血球脂質サンプルに含まれるプラズマローゲンを検出可能であることが確認できた。また、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法により、プラズマローゲンのみならず、その他の脂質成分についても一度に分離及び検出することが可能であることも確認できた。
　図３上側のクロマトグラムの各ピーク面積を分析することにより、各種脂質成分量に対するプラズマローゲン量の比を求めたり、ヒト赤血球脂質中に占めるプラズマローゲン量の割合を求めたりすることができる。ヒト赤血球脂質中に占めるプラズマローゲン量の割合は約１２％であった。
　なお、ヒト血清脂質サンプルも同様にＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法で分析した。結果を図４に示す。当該結果からも、血清中にはプラズマローゲンがほとんど存在しない（少なくとも上記ＨＰＬＣ分析の条件では検出が難しい）ことがわかった。
ヒト認知症患者と健常者との比較
　認知症患者(アルツハイマー病７９歳男性、認知症を合併したパーキンソン病７４歳男性)、及び当該患者と同性の老年健常者6人（６８～７４歳：平均７２歳）から採血し、上述のようにして、得られたそれぞれの血液から赤血球脂質サンプルを調製し、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法による分析を行った。
　そして、それぞれの血液から得られた各クロマトグラムの各脂質成分由来のピーク面積について分析し、エタノールアミンプラズマローゲン（ｐｌ－ＰＥ）のピーク面積とホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のピーク面積との比（ｐｌ－ＰＥ／ＰＥ）を算出した。結果は次のようになった。
老年健常者・・・０．８７±０．０７
アルツハイマー病患者・・・０．５８
パーキンソン病患者・・・０．６３
　これらの結果から、認知症患者では、赤血球脂質中のプラズマローゲン量が低下していることが確認できた。なお、ここでは、健常者と認知症患者との赤血球に含有されるプラズマローゲン量の比較を行うために、赤血球膜に含まれる脂質の一つホスファチジルエタノールアミン量に対するエタノールアミンプラズマローゲン量の比率を算出し、比較をした（すなわち、ホスファチジルエタノールアミンを基準とした比較をした）が、他の脂質に対するエタノールアミンプラズマローゲン量の比率を算出して比較をすることも同様に行い得る。
認知症モデルマウスを用いた検討
　LPS（リポポリサッカライド；lipopolysaccharide）をマウスに腹腔内投与することで、認知症モデルマウスを作製できることが知られている（例えば、Jpn. J. Pharmacol. 87, 195-201 (2001)参照）。そこで、文献（Lee JW et.al, Neuroinflammation, 2008, Aug 29 ; 5 : 37）に記載の手法と同様にして、脳炎症を引き起こさせ、認知症モデルマウスを作製した。具体的には、8-12週齢C57BL雄性マウス（九動株式会社製）にLPS（250μg/kg、シグマ社製）を一日一回連続7週間腹腔内投与して、慢性的な脳内炎症を有する認知症モデルマウスを得た（当該マウス群をLPS群とした）。また、8-12週齢C57BL雄性マウスに、LPSのかわりに生理食塩水を7日間連続腹腔内投与したマウス群を対照群（Control群）とした。LPS群はｎ＝５、Control群はｎ＝５である。
　LPS最終投与（対照群は生理食塩水最終投与）24時間後に、各マウスにペントバルビタールを投与して麻酔を施し、開腹後、左心室より採血して被験血液サンプルとした。そして、上記と同様にして、当該被験血液サンプルから赤血球脂質サンプルを調製し、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法による分析を行い、エタノールアミンプラズマローゲン（ｐｌ－ＰＥ）のピーク面積とホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のピーク面積との比（ｐｌ－ＰＥ／ＰＥ）を算出した。さらに、Steel test（ノンパラメトリック）検定を行った。結果を図５に示す。
　当該結果から、認知症モデルマウスでは、正常マウスに比べ、赤血球脂質中のプラズマローゲン量が有意に低下していることが確認できた。
アルツハイマー型認知症患者を用いた検討
　改訂長谷川式簡易知能評価スケールにより複数の高齢者の評価を行い、３０満点中、２１点以上を正常（ｎ＝８）、２０～１１点を軽度認知症（軽度AD；ｎ＝１９）、１０点以下を高度認知症（高度AD；ｎ＝１４）と判定し、群分けした。
　なお、改訂長谷川式簡易知能評価スケールとは、HDS-Rとも標記され、一般の高齢者から認知症高齢者をスクリーニングするための方法として、臨床現場で広く用いられる方法である（老年精神医学雑誌，２：1339-1347 (1991)、高齢者のための知的機能検査の手引き，ワールドプランニング，(1991)等参照）。
　上記と同様にして、各患者から採血を行って被験血液サンプルを得、当該被験血液サンプルから赤血球脂質サンプルを調製し、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法による分析を行い、エタノールアミンプラズマローゲン（ｐｌ－ＰＥ）のピーク面積とホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のピーク面積との比（ｐｌ－ＰＥ／ＰＥ）を算出した。さらに、Steel Test（ノンパラメトリック）検定を行った。結果を図６に示す。なお、図６の縦軸の単位は％である。
　当該結果から、アルツハイマー型認知症患者では赤血球脂質中のプラズマローゲン量が低下すること、特に、高度認知症患者では認知症ではない人（正常）に比べて有意に赤血球脂質中のプラズマローゲン量が低下すること、がわかった。
 

Claims (11)

  1. 被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるかを判定するための検査方法であって、
    （Ａ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量を測定する工程、及び
    （Ｂ）（ｉ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量と、（ｉｉ）被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球に含まれるプラズマローゲン量とを、比較する工程
    を含む、検査方法。
  2. 工程（Ａ）が、被験血液サンプルに含有される赤血球の膜脂質に含まれるプラズマローゲン量を高速液体クロマトグラフィーにより測定する工程であり、
    工程（Ｂ）が、（ｉ）工程（Ａ）で測定したプラズマローゲン量と、（ｉｉ）高速液体クロマトグラフィーにより測定した、被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球の膜脂質に含まれるプラズマローゲン量とを、比較する工程
    である、請求項1に記載の検査方法。
  3. 工程（Ｂ）において、（ｉ）と（ｉｉ）との比較を、高速液体クロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムにおけるプラズマローゲンを示すピーク面積を比較することで行う、請求項２に記載の検査方法。
  4. 前記プラズマローゲンを示すピーク面積の比較を、エタノールアミンプラズマローゲンを示すピーク面積と、ホスファチジルエタノールアミンを示すピーク面積との比に基づいて行う、請求項３に記載の検査方法。
  5. 前記（ｉ）が前記（ｉｉ）より少ない場合に被験血液サンプルは認知症哺乳動物由来であると判定するための検査方法である、請求項１～４のいずれかに記載の検査方法。
  6. 被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるかを判定する方法であって、
    請求項１～４のいずれかに記載の検査方法における工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を含み、さらに
    （Ｃ）前記（ｉ）が前記（ｉｉ）より少ない場合に、被験血液サンプルは認知症哺乳動物由来であると判定する工程
    を含む、判定方法。
  7. 赤血球に含有されるプラズマローゲンからなる、認知症検出用バイオマーカー。
  8. 赤血球に含有されるプラズマローゲンの認知症検出用バイオマーカーとしての使用。
  9. 赤血球溶血用低張液及び／又は脂質抽出用有機溶媒を備えた、血液サンプル検査用、認知症由来血液サンプル判定用、又は認知症診断用のキット。
  10. [規則91に基づく訂正 05.01.2012]　
    被験血液サンプルを採取した哺乳動物を認知症であると診断する方法であって、
    請求項６に記載の工程（Ａ）、工程（Ｂ）、及び工程（Ｃ）を含み、さらに
    （Ｄ）工程（Ｃ）で被験血液サンプルは認知症哺乳動物由来であると判定した場合に、当該被験血液サンプルを採取した哺乳動物を認知症であると診断する工程
    を含む、診断方法。
  11. 認知症の診断における使用のための、赤血球に含有されるプラズマローゲン。
                       
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