CN103314291B - 通过血液样品判定痴呆症用的检验方法 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于，提供能够简便、低成本、更安全地用于诊断痴呆症(特别是阿尔茨海默型痴呆症)的检验方法、生物标记物。根据本发明，提供一种用于判定被检验血液样品是否来自痴呆症哺乳动物的检验方法，所述检验方法包含以下工序：工序(A)：对被检验血液样品所含有的红血球所含的缩醛磷脂量进行测定；以及工序(B)：将以下两者进行比较，(i)被检验血液样品所含有的红血球所含的缩醛磷脂量与(ii)来自与采取了被检验血液样品的哺乳动物同种的健康哺乳动物的红血球所含的缩醛磷脂量。

Description

通过血液样品判定痴呆症用的检验方法

技术领域

本发明涉及用于判定血液样品是否来自痴呆症哺乳动物的检验方法。另外，涉及利用该检验方法的结果判定血液样品是否来自痴呆症哺乳动物的方法。另外，涉及基于该判定方法的结果来诊断哺乳动物是否患痴呆症的方法。另外，涉及痴呆症诊断用生物标记物以及该生物标记物的使用。

背景技术

痴呆症的诊断以面谈和问卷法为主，现状是仍未确立客观的诊断方法。面谈和问卷法根据诊断者不同而有差异，存在定量性方面欠缺这个缺点。为了解决这样的问题，为了确立客观的诊断方法而进行了研究。例如，在AD(阿尔茨海默病)中，随着病程进行变得可观察到大脑萎缩，因此设计了进行使用了核磁共振成像法(MRI)的影像诊断的方法。另外，在AD中，同时在脑中显著地观察到过度磷酸化的tau蛋白在细胞内聚集(神经原纤维缠结)和β淀粉样蛋白(Aβ)在细胞外沉积(老年斑)。于是认为：如果Aβ沉积，则引起神经细胞内的微管发生结构变化而导致神经细胞死亡，该神经细胞死亡的同时tau蛋白也漏出至细胞外，从而在脑脊液中沉积。由此，还设计了将脑脊液中的tau蛋白用作标记物的诊断方法。但是，这些方法必需大型的专用仪器等，难以说其在便利性、经济性、通用性等方面足够。

在痴呆症中(尤其是据说占痴呆症6成的阿尔茨海默型痴呆症(以下也称为“AD”))，在属于髓磷脂(Myelinlipid)的缩醛磷脂的代谢体系中可观察到异常，其暗示了AD患者、AD动物模型的脑内的缩醛磷脂量降低。另外，最近有报道暗示如果罹患AD，则不仅脑内而且血清中的缩醛磷脂量也降低(非专利文献1)。然而，由于血清中本来就仅含有微量的缩醛磷脂，因此难以简便地检测出其降低，将其用作痴呆症的诊断用的生物标记物时，难以说其在便利性、经济性、通用性等方面足够。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：JLipidRes48，2485-2498，2007

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于，提供能够用于简便、低成本、更安全地诊断痴呆症(特别是阿尔茨海默型痴呆症)的检验方法、生物标记物。

解决问题的手段

本发明人等发现：令人惊讶的是，红血球所含有的缩醛磷脂是用于诊断痴呆症(特别是AD)而有用的生物标记物，将其进一步反复改良，从而完成了本发明。

即，本发明包含例如在以下项中记载的方法、生物标记物、使用以及试剂盒。

项1.一种用于判定被检验血液样品是否来自痴呆症哺乳动物的检验方法，所述检验方法包含以下工序：

工序(A)：对被检验血液样品所含有的红血球所含的缩醛磷脂量(即，红血球脂质中的缩醛磷脂量)进行测定，以及

工序(B)：将以下两者进行比较，(i)被检验血液样品所含有的红血球所含的缩醛磷脂量与(ii)来自与采取了被检验血液样品的哺乳动物同种的健康哺乳动物的红血球所含的缩醛磷脂量。

项2.根据项1所述的检验方法，其中，工序(A)是采用高效液相色谱法对被检验血液样品所含有的红血球的膜脂所含的缩醛磷脂量进行测定的工序，

工序(B)是将以下两者比较的工序：(i)在工序(A)中测定的缩醛磷脂量与(ii)采用高效液相色谱法测定的、来自与采取了被检验血液样品的哺乳动物同种的健康哺乳动物的红血球的膜脂所含的缩醛磷脂量。

项3.根据项2所述的检验方法，其中，在工序(B)中，通过将由高效液相色谱法得到的色谱图中的表示缩醛磷脂的峰面积进行比较来进行(i)与(ii)的比较。

项4.根据项3所述的检验方法，其中，基于表示乙醇胺缩醛磷脂的峰面积与表示磷脂酰乙醇胺的峰面积之比来进行上述表示缩醛磷脂的峰面积的比较。

项5.根据项1～4中任一项所述的检验方法，其是用于判定在上述(i)少于上述(ii)时，被检验血液样品是来自痴呆症哺乳动物的检验方法。

项6.一种判定被检验血液样品是否来自痴呆症哺乳动物的方法，所述判定方法包含项1～4中任一项所述的检验方法中的工序(A)和工序(B)，

并且包含工序(C)：判定在上述(i)少于上述(ii)时，被检验血液样品是来自痴呆症哺乳动物。

项7.一种痴呆症检测用生物标记物，其包含红血球所含有的缩醛磷脂。

项8.红血球所含有的缩醛磷脂作为痴呆症检测用生物标记物的使用。

项9.一种血液样品检查用、来自痴呆症的血液样品判定用或者痴呆症诊断用的试剂盒，其具备红血球溶血用低渗溶液和/或脂质萃取用有机溶剂。

项10.一种诊断采取了被检验血液样品的哺乳动物患痴呆症的方法，所述诊断方法包含项6所述的工序(A)、工序(B)以及工序(C)，

并且包含工序(D)：在工序(C)中判定了被检验血液样品是来自痴呆症哺乳动物时，诊断采取了该被检验血液样品的哺乳动物患痴呆症。

项11.根据项10所述的诊断方法，其中，哺乳动物是非人类哺乳动物。

项12.用于在痴呆症的诊断中使用的红血球所含有的缩醛磷脂。

发明效果

根据本发明的检验方法，能够简便、安全且低成本地取得用于判定被检验血液样品是否来自痴呆症(特别是阿尔茨海默型痴呆症)哺乳动物的数据。而且，根据本检验方法的结果，能够判定被检验血液样品是否来自痴呆症哺乳动物，还能够由该判定结果诊断痴呆症。并且，利用本发明的痴呆症检测用生物标记物、试剂盒，可以简便、安全且低成本地进行上述检查、判定、诊断。

附图说明

图1：显示利用HPLC/ELSD法对大鼠红血球脂质样品分析而得的色谱图。

图2：显示利用HPLC/ELSD法对大鼠血清脂质样品分析而得的色谱图。各脂质物质的简称与图1或3通用。

图3：显示利用HPLC/ELSD法对人类红血球脂质样品分析而得的色谱图。

图4：显示利用HPLC/ELSD法对人类血清脂质样品分析而得的色谱图。各脂质物质的简称与图1或3通用。

图5：显示由利用HPLC/ELSD法对正常小鼠和痴呆症模型小鼠的红血球脂质样品分析而得的色谱图的峰面积，计算出(pl-PE/PE)值，进行统计处理而得的结果。

图6：显示从分成正常组、轻度痴呆症(轻度AD)组、重度痴呆症(重度AD)组3组的各患者采血，制备红血球脂质样品，利用HPLC/ELSD法对其进行分析而得到色谱图的峰面积，由此计算出(pl-PE/PE)值，进行统计处理而得的结果。

具体实施方式

下面，对本发明进一步加以详细的说明。

本发明是发现如果罹患痴呆症(特别是AD)，则红血球膜中的缩醛磷脂量减少而完成的技术方案，其包含利用了该特征的检验方法、判定方法以及诊断方法。而且也包含在这些方法中使用的试剂盒。而且本发明还包含含有红血球所含的缩醛磷脂的生物标记物以及红血球所含有的缩醛磷脂用作生物标记物。

缩醛磷脂

所谓缩醛磷脂，通常是指在甘油骨架的1位具有介由乙烯基醚键连接的长链烯基的甘油磷脂。以下示出了缩醛磷脂的通式。

〔式中，R¹和R²表示脂肪族烃基。R¹通常是碳原子数为1～20的脂肪族烃基，例如可以举出十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基等。R²通常是来自脂肪酸残基的脂肪族烃基，例如可以举出十八碳二烯酰基、十八碳三烯酰基、二十碳四烯酰基、二十碳五烯酰基、二十二碳四烯酰基、二十二碳五烯酰基、二十二碳六烯酰基等。另外，式中，X表示极性基团。X优选为-CH₃CH₃NH₂、-CH₃CH₃N⁺(CH₃)₃、-CH₃CH₃(NH₂)COOH，或者X优选为：H与X键合成的化合物(H-X)为肌醇或者甘油。〕

特别是在自然界中存在的缩醛磷脂之中，主要有在上述式中X为氨基乙基(-CH₃CH₃NH₂)的乙醇胺缩醛磷脂和X为三甲基氨基乙基(-CH₃CH₃N⁺(CH₃)₃)的胆碱缩醛磷脂。在红血球中，含有非常多的乙醇胺缩醛磷脂作为缩醛磷脂。

检验方法

本发明的检验方法包含以下的工序(A)和工序(B)。

工序(A)：对被检验血液样品所含有的红血球所含的缩醛磷脂量进行测定

工序(B)：将以下两者进行比较，(i)被检验血液样品所含有的红血球所含的缩醛磷脂量与(ii)来自与采取了被检验血液样品的哺乳动物同种的健康哺乳动物的红血球所含的缩醛磷脂量

该检验方法能够用于判定被检验血液样品是否来自痴呆症哺乳动物。换言之，也可以说本发明的检验方法是用于判定被检验血液样品是否来自痴呆症哺乳动物的检验方法(即，提供判定用数据的检验方法)。在该判定中，判定在上述(i)少于上述(ii)时，被检验血液样品是来自痴呆症哺乳动物。

此外，在本说明书中，作为哺乳动物，可以举出人类和非人类哺乳动物。作为非人类哺乳动物，例如可以举例示出宠物、实验动物、家畜等。具体而言可以举例示出狗、猫、猴、牛、马、绵羊、山羊、猪、小鼠、大鼠、仓鼠、兔等。另外，在本说明书中，作为痴呆症，优选退行性痴呆症，具体而言可以举例示出阿尔茨海默型痴呆症、帕金森病(伴随其的痴呆症)、额颞叶型痴呆症、皮克病、弥漫性路易体病等。优选为阿尔茨海默型痴呆症、帕金森病(伴随其的痴呆症)，更优选为阿尔茨海默型痴呆症。

〔工序(A)〕

作为被检验血液样品，可以使用从哺乳动物采取的血液本身、以及对该血液实施了某些处理而含有红血球的样品。作为此处对血液实施的处理(在处理后让红血球残留的处理)，可举例示出离心处理、添加抗凝血药等。抗凝血药能够使用公知的抗凝血药，例如可举例示出柠檬酸、EDTA(乙二胺四乙酸)或者其金属盐(钠盐等)、氟化钠、肝素等。此外，虽无特别限制，但优选被检验血液样品是由通常的采血方法(例如注射器采血或者真空采血)得到的血液或者将该血液处理而得的样品。

被检验血液样品所含有的红血球所含的缩醛磷脂量的测定例如能够利用HPLC(高效液相色谱法；也称为高性能液相色谱法)、GC-MS(气相色谱质谱联用仪)、TLC(薄层色谱法)等进行。其中，优选使用HPLC。

利用HPLC的测定具体而言可通过以下进行：将被检验血液样品离心，除去上清液(即血清)，进一步除去血小板和白血球，制备红血球样品，使该红血球样品溶血，萃取脂质，利用HPLC对其进行分析。

血清、血小板、以及白血球的除去例如可以通过以下进行：将被检验血液样品离心(例如1000×g，5分钟)后，除去上清液和血球部的上层。更优选：在除去了血清、血小板以及白血球的样品中加入生理盐水并混和，离心(例如1000×g，5分钟)，进一步除去血清成分和血球部上层的白血球和血小板。在除去血清、血小板以及白血球后，可加入生理盐水制备任意的(例如约10％)红细胞压积的红血球悬浮液(红血球样品)。可利用血球分析仪(Sysmex800，Sysmex，神户，日本)来分析该红血球悬浮液中的红血球数、血红蛋白值等。

另外，为了使红血球样品溶血，能够使用公知的方法，例如可以通过将浸透压低的溶液(低渗溶液)加到红血球样品中来进行。低渗溶液优选为缓冲液，例如可优选举例示出磷酸缓冲液。作为使红血球溶血后，萃取脂质而获得红血球脂质样品的方法，能够使用公知的脂质萃取法，例如可以举例示出将甲醇和氯仿加到使红血球溶血而成的样品中并混和，然后回收氯仿层的方法。更具体而言，可以举出以下方法：在已溶血的红血球溶液(红血球悬浮液)中加入1～2倍体积的甲醇和与该甲醇相同体积的氯仿并混和，静置10分钟～2小时左右之后离心，回收氯仿层。使回收的氯仿层干燥后，可将其在-20℃～-40℃左右的条件下保存。该干燥可以使用氮气进行。

例如通过利用HPLC对如上所得的红血球脂质样品进行分析，能够获得呈现出存在于红血球膜上的各脂质成分(也包含缩醛磷脂)的峰的色谱图。在利用此处的HPLC进行的分析中，优选通过蒸发光散射检测(ELSD：EvaporativeLightScatteringDetector)进行试样的检测。即优选采用HPLC/ELSD法进行分析。具体而言，例如能够通过使红血球膜脂样品溶解在己烷/异丙醇(1∶1)中，注入HPLC的色谱柱中，利用ELSD进行检测来分析存在于红血球膜上的各脂质成分。另外，流动相A中能够使用例如己烷/异丙醇/乙酸(82∶17∶1，体积比)、流动相B中能够使用异丙醇/水/乙酸(85∶14∶1，体积比)。所得色谱图的各峰面积表示各脂质成分的含量。例如能够通过计算出表示缩醛磷脂的峰面积相当于色谱图整体的峰面积的多少％来求出其含量。这是由于在ELSD中，如果是具有类似结构的物质，则显示出相同的面积响应。此外，例如优选将醋酸和三乙胺用作溶剂使酸性脂质带电来进行分析。这是由于通过使其带电可以显示出更一致的面积响应。

此外，在工序(A)中的缩醛磷脂量的测定中，不一定非要求出质量值等绝对量，只要在工序(B)中得到以下数据即可：能够与来自和采取了被检验血液样品的哺乳动物同种的健康哺乳动物的红血球所含的缩醛磷脂量进行比较的数据。例如采用相同的测定方法测定(i)被检验血液样品所含有的红血球所含的缩醛磷脂量(以下也称为“被检验红血球PL量”)与(ii)来自和采取了被检验血液样品的哺乳动物同种的健康哺乳动物的红血球所含的缩醛磷脂量(以下也称为“健康红血球PL量”)，对所得数据之间进行比较，由此，可以在不求出被检验红血球PL量和健康红血球PL量各自的绝对量的情况下进行工序(B)中的比较。

〔工序(B)〕

在工序(B)中比较以下两者：(i)被检验血液样品所含有的红血球所含的缩醛磷脂量(被检验红血球PL量)与(ii)来自和采取了被检验血液样品的哺乳动物同种的健康哺乳动物的红血球所含的缩醛磷脂量(健康红血球PL量)。该比较结果(即被检验红血球PL量相对于健康红血球PL量的多少)能够用于判定被检验血液样品是否来自痴呆症哺乳动物。

作为被检验红血球PL量，能够采用在上述工序(A)中求出的缩醛磷脂量。此外，也将以下被检验血液样品所含有的红血球称为“被检验红血球”。

所谓“来自与采取了被检验血液样品的哺乳动物同种的健康哺乳动物的红血球”(以下也称为“健康红血球”)，是与采取了被检验样品的哺乳动物同种、健康的哺乳动物的血液样品所含有的红血球。例如，从人类获得被检验血液样品时，从健康人采取的血液样品所含有的红血球相当于健康红血球。另外，所谓健康哺乳动物，是不患有痴呆症(优选为健康的哺乳动物)的哺乳动物。

就(i)被检验红血球PL量与(ii)健康红血球PL量的比较而言，可以在采用不同或者相同的测定方法来求出各自的绝对量的基础上进行比较，更优选采用相同的测定方法。另外，如上所述，只要能够比较(i)和(ii)，则即使(i)和(ii)不一定是绝对量值亦可，例如也可以是相对值。

例如，同时以绝对量值(例如质量值或者摩尔值等)的形式测得(i)和(ii)时，通过使测定用红血球量(即用于测定的样品量)一致，能够比较(i)和(ii)。例如能够如下使红血球量一致：使测定样品的红血球质量一致、使测定样品的红血球数量一致或者使测定样品的血红蛋白值一致等。这样，通过比较存在于一定量红血球中的被检验红血球PL量与存在于与其等量的红血球中的健康红血球PL量，能够确定被检验红血球PL量相对于健康红血球PL量的多少。

另外，以通过相同的分析方法测定得到的数据的形式测得(i)和(ii)时，能够将这些数据之间进行比较。

例如，能够如下互相比较：利用HPLC(优选用ELSD进行检测)，对被检验血液样品所含有的红血球的膜脂以及来自与采取了被检验血液样品的哺乳动物同种的健康哺乳动物的红血球的膜脂进行分析，得到的分别的色谱图中的表示缩醛磷脂的峰面积。此时，通过使获得测定HPLC用的膜脂的红血球量一致，能够确定被检验红血球PL量相对于健康红血球PL量的多少。

另外，即使不使获得测定HPLC用的膜脂的红血球量一致、或者在使其一致的基础上，也能够以将表示缩醛磷脂的峰面积与其它表示特定脂质成分的峰面积相比时的比例来表示，通过比较该比例，还能确定被检验红血球PL量相对于健康红血球PL量的多少。即，对被检验红血球和健康红血球分别进行HPLC分析获得色谱图，在各自的色谱图中，求出缩醛磷脂量相对于某一特定的脂质成分量的比例(比值)，通过比较该比值的大小，能够比较缩醛磷脂量。该比值大时缩醛磷脂量多，该比值小时缩醛磷脂量少。此外，可将该比值记成(缩醛磷脂量/特定的脂质成分量)，能够由(表示缩醛磷脂的峰面积/表示特定脂质成分的峰面积)求得。在该比较方法中，优选选择被检验红血球和健康红血球所含有的、且其含量几乎相同的特定脂质成分作为在该比值的分母中使用的“特定的脂质成分”。作为这样的脂质成分，可以举出磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂(Sphingomyelin)、胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氮酸、磷脂酰肌醇等，优选磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、胆固醇，更优选磷脂酰乙醇胺。此外，在使获得测定HPLC用的膜脂的红血球量一致的基础上，且求得缩醛磷脂量相对于特定脂质成分量的比例(比值)，由此能够获得精度更高的比较结果，因而优选。

采用本发明的检验方法得到的(i)被检验红血球PL量与(ii)健康红血球PL量的比较结果优选用于判定被检验血液样品是否来自痴呆症哺乳动物。在该判定中，在上述(i)少于上述(ii)时，判定被检验血液样品是来自痴呆症哺乳动物。即，本发明的检验方法可优选用作用于判定在上述(i)少于上述(ii)时被检验血液样品是来自痴呆症哺乳动物的检验方法(即，取得用于判定的比较数据用的检验方法)。

特别优选：由通过上述的HPLC分析而得的色谱图计算出(缩醛磷脂量/特定的脂质成分量)之比，利用该比比较缩醛磷脂量时，比较(乙醇胺缩醛磷脂量/磷脂酰乙醇胺量)。(乙醇胺缩醛磷脂量/磷脂酰乙醇胺量)比值在健康哺乳动物(特别是健康人)中为0.85～0.9左右，与此相对，在痴呆症哺乳动物(特别是痴呆症患者)中变成0.7以下的程度(0.7～0.5左右)。可以说痴呆症患者的(乙醇胺缩醛磷脂量/磷脂酰乙醇胺量)比值是健康者的该比值的90％以下(优选为85％以下，更优选为80％以下)。因此，比较该比值时，认为在被检验红血球的该比值为健康红血球的该比值的90％以下(优选为85％以下，更优选为80％以下)时，能够判定被检验红血球是来自痴呆症哺乳类。

如上，本发明的检验方法用于判定被检验血液样品是否来自痴呆症哺乳动物是而有用。特别是由于血液样品是所需的试样，其能够用通常的仪器来实施，因此可以说在便利性、经济性、通用性等方面得以大幅改善。本发明的检验方法例如能够用于在临床检验公司进行血液试样的检验。另外，例如在将痴呆症动物模型运送出去时，可用于在该过程中检查运送出去的动物模型是否患有痴呆症。或者在将正常动物运送出去时，可用于检查运送出去的动物是否未患痴呆症。

判定方法

本发明包含判定被检验血液样品是否来自痴呆症哺乳动物的方法。该判定方法包含上述工序(A)和工序(B)，进一步包含工序(C)：判定在(i)少于(ii)时，被检验血液样品是来自痴呆症哺乳动物，其中，所述(i)是被检验血液样品所含有的红血球所含的缩醛磷脂量，所述(ii)是来自与采取了被检验血液样品的哺乳动物同种的健康哺乳动物的红血球所含的缩醛磷脂量。

该判定方法也能够与对上述检验方法所述的同样地使用。

诊断方法

本发明还包含诊断哺乳动物是否患痴呆症的方法。此本发明的痴呆症诊断方法是基于上述判定方法的结果，诊断采取了被检验血液样品的哺乳动物患痴呆症的方法。即，其是以下方法：在根据上述判定方法判定被检验血液样品是来自痴呆症哺乳动物时，诊断采取了该被检验血液样品的哺乳动物患痴呆症。更具体而言，可以说本发明的诊断方法包含上述判定方法中的工序(A)、工序(B)以及工序(C)，且包含工序(D)，其中，所述工序(D)是在判定了工序(C)中被检验血液样品是来自痴呆症哺乳动物时，诊断采取了该被检验血液样品的哺乳动物患痴呆症的工序。

此外，虽无特别限制，但本发明的诊断方法在工序(A)之前还能够包含从欲诊断是否患痴呆症的哺乳动物采取被检验血液样品的工序。作为用于获得被检验血液样品的采血方法，能够使用公知的方法，例如可以举例示出注射器采血法或者真空采血法。

生物标记物

在本说明书中，所谓痴呆症检测用生物标记物，是指成为判定或诊断痴呆症发病的指标的生物分子。也可以称之为痴呆症发病判定或诊断指标用生物分子。本发明也包含含有红血球所含的缩醛磷脂的痴呆症检测用生物标记物。更详细而言，也包含含有红血球膜所含的缩醛磷脂的痴呆症检测用生物标记物。此外，用作本发明的痴呆症检测用生物标记物不是在生物体中存在的缩醛磷脂，而是从生物体分离出的红血球所含有的缩醛磷脂。因此，也可将本发明的生物标记物称为包含从红血球萃取出的缩醛磷脂(红血球萃取缩醛磷脂)的痴呆症检测用生物标记物。而且也可以称之为痴呆症诊断用生物标记物。

本发明的痴呆症检测用生物标记物具有如下特征：就痴呆症哺乳动物而言，与健康哺乳动物相比其生物标记物的量减少。因此，在从被检验哺乳动物和健康哺乳动物分别分离出该生物标记物，测定其量并进行比较，被检验哺乳动物的生物标记物量少时，可诊断被检验哺乳动物患有痴呆症。

此外，作为本发明的痴呆症检测用生物标记物，在缩醛磷脂之中特别优选乙醇胺缩醛磷脂。即，本发明优选包含含有红血球所含的乙醇胺缩醛磷脂的痴呆症检测用生物标记物(也可以称为包含红血球萃取乙醇胺缩醛磷脂的痴呆症检测用生物标记物、或者包含红血球萃取乙醇胺缩醛磷脂的痴呆症诊断用生物标记物)。

试剂盒

本发明也包含用于上述检验方法、判定方法或者诊断方法的试剂盒(检验用试剂盒、判定用试剂盒或者诊断用试剂盒)。更详细而言，可以将这些试剂盒称为血液样品检验用试剂盒、来自痴呆症的血液样品判定用试剂盒、痴呆症诊断用试剂盒。

在本发明的试剂盒中，配备用于测定红血球所含有的缩醛磷脂量而有用的试剂。作为这样的试剂，可以举出红血球溶血用低渗溶液、脂质萃取用有机溶剂。具体而言，作为红血球溶血用低渗溶液可以举例示出低渗磷酸缓冲液等，作为脂质萃取用有机溶剂可以举例示出甲醇、氯仿、甲醇/氯仿(优选为1∶1)液等。本发明的试剂盒优选配备红血球溶血用低渗溶液和/或脂质萃取用有机溶剂。

另外，在本发明的试剂盒中，可以进一步配备采血用器具或者试剂。例如可以举例示出采血用注射器、采血用试管、抗凝剂等。另外，在本发明的试剂盒中，还可以进一步配备HPLC分析用的溶剂。作为这样的溶剂，虽无特别限制，但可以举例示出己烷/异丙醇/醋酸(82∶17∶1)、异丙醇/水/醋酸(85∶14∶1)、三乙胺等。

本发明的试剂盒可以优选用于上述检验方法、判定方法或者诊断方法。

实施例

以下，对本发明进行具体说明，但本发明不限于下述例子。

测定样品的制备

<采血>

大鼠的采血：通过使用了注射器的心脏穿刺，采血。在采取的血液中加入作为抗凝剂的肝素。将其作为大鼠血液样品。此外，用于采血的大鼠有6只，其是用MF固体食物(东方酵母工业株式会社)饲养了4周的Wistar大鼠(12周龄)。

人的采血：用注射器取静脉血。在采取的血液中加入作为抗凝剂的EDTA-Na(乙二胺四乙酸钠盐)。将其作为人类血液样品。

<血清和红血球样品的制备>

将如上得到的血液样品以1000×g离心5分钟，除去上清液(即血清)。将除去的血清预先保存(将其作为血清样品)。进一步除去血小板和白血球。然后，在除去了血小板和白血球的样品中加入生理盐水并混和，以1000×g离心5分钟，除去血清成分和血球部上层的白血球及血小板。再重复2次该操作。之后，加入生理盐水制备10％红细胞压积的红血球悬浮液。利用血球分析仪(Sysmex800，Sysmex，神户，日本)分析该红血球悬浮液中的红血球数和血红蛋白值等，并记录。

<脂质样品的制备>

将如上得到的红血球悬浮液2.5ml取至带磨砂塞的试管中，离心(1000×g、5分钟)除去上清液。在如此得到的红血球中加入0.25ml的5mM磷酸缓冲液(pH8.0)使其溶血，加入4ml甲醇混和后，静置30分钟。在其中加入4ml氯仿并混和，在室温下静置20分钟然后萃取出脂质。将其离心(1000×g，5分钟)采取上清液后，在残渣中加入甲醇/氯仿(1∶1)液4ml，再次萃取脂质。之后，离心(1000×g，5分钟)采取上清液，将其与之前预先取出的上清液合并，再在其中加入50mM氯化钾液10ml并混和，离心(1000×g，5分钟)。取出氯仿层1ml，用氮气使其干燥后，在-30℃下保存。将这样得到的脂质样品作为红血球脂质样品。制备大鼠红血球脂质样品和人类红血球脂质样品。

从血清样品萃取脂质时，在0.5ml血清样品中加入甲醇4ml，之后加入4ml氯仿，从此时开始与红血球同样地萃取出脂质。这样得到的脂质样品为血清脂质样品。制备大鼠血清脂质样品和人类血清脂质样品。

样品中缩醛磷脂量的测定

<利用HPLC/ELSD法对红血球脂质样品进行分析：大鼠>

将大鼠红血球脂质样品溶解于0.2ml己烷/异丙醇(1∶1)中，在HPLC中进样0.01ml。HPLC使用下述DIOL色谱柱(250mm×4mm，硅胶平均粒径5μm)。下面记载了测定条件。

仪器；ShimadzuLC-10AD(岛津制作所，京都，日本)

色谱柱；LichrospherDiol100(250-4，Merck社)(无预柱)

流速；1.0ml/min

检测；蒸发光散射检测器(ELSD)(岛津制作所，京都，日本)

流动相A中使用己烷/异丙醇/醋酸(82∶17∶1，体积比)，流动相B中使用异丙醇/水/醋酸(85∶14∶1，体积比)、(与流动相A、B一起加入三乙胺以使其为0.08％(v/v))。就流动相A而言，从95％开始直线减少，23分钟时为63％，27分钟时为15％，在27分钟到28分钟之间保持在15％，4分钟后回到初期条件，5分钟后重复初期条件注入下一个试样。各脂质的检测采用蒸发光散射检测器(ELSD)。将结果示于图1(图1上侧的色谱图)。得到表示各种脂质的峰，知道了也可以准确地读取作为缩醛磷脂的乙醇胺缩醛磷脂(pl-PE)的峰。

此外，与酰基键相比，缩醛磷脂的乙烯基醚键对酸水解敏感，因此如果用盐酸处理脂质样品，则缩醛磷脂被选择性地分解掉。同样地通过HPLC对用盐酸处理过的大鼠红血球脂质样品进行分析，结果也可以确认到仅来自缩醛磷脂(pl-PE)的峰消失(图1下侧的色谱图)。由此也可以确认消失的峰是缩醛磷脂。此外，能够通过预先同样地分析各种脂质成分的标准品来确认出峰位置从而确定色谱图的各峰是来自哪一个脂质成分的峰。

根据以上结果，能够确认通过利用HPLC/ELSD法进行的分析，可以检测出红血球脂质样品所含有的缩醛磷脂。另外，可确认采用HPLC/ELSD法，不仅对于缩醛磷脂，而且对于其它脂质成分皆可一次性地分离、检测出。

另外，同样地，采用HPLC/ELSD法分析大鼠血清脂质样品。将结果示于图2(图2下侧的色谱图是将图2上侧的色谱图放大而得)。由该结果可知，血清中几乎不存在缩醛磷脂(至少在上述HPLC分析的条件下难以检测出)。

<利用HPLC/ELSD法对红血球脂质样品进行的分析：人类>

与上述大鼠红血球脂质样品的分析同样地采用HPLC/ELSD法分析人类红血球脂质样品。将结果示于图3(图3上侧的色谱图)。与大鼠的情况同样地获得表示各种脂质的峰，知道了也可以准确地读取作为缩醛磷脂的乙醇胺缩醛磷脂(pl-PE)的峰。

另外，同样地采用HPLC/ELSD法分析用盐酸处理过的人类红血球脂质样品，结果也能够确认仅来自缩醛磷脂(pl-PE)的峰消失(图3下侧的色谱图)。

根据以上结果，也能够确认通过利用HPLC/ELSD法进行的分析，可以检测出红血球脂质样品所含有的缩醛磷脂。另外，也能够确认采用HPLC/ELSD法，不仅对于缩醛磷脂，而且对于其它脂质成分也可以一次性地分离、检测出。

通过对图3上侧的色谱图的各峰面积进行分析，能够求得缩醛磷脂量相对于各种脂质成分量之比，或求得缩醛磷脂量在人类红血球脂质中所占的比例。缩醛磷脂量在人类红血球脂质中所占的比例约为12％。

此外，人类血清脂质样品也同样地采用HPLC/ELSD法分析。将结果示于图4。由该结果也知道了在血清中几乎不存在缩醛磷脂(至少在上述HPLC分析的条件下难以检测出)。

人类痴呆症患者与健康者的比较

从痴呆症患者(患阿尔茨海默病的79岁男性、并发痴呆症的帕金森病74岁男性)、以及与所述患者性别相同的老年健康者6人(68～74岁：平均72岁)采血，如上所述，由分别得到的血液制备红血球脂质样品，进行基于HPLC/ELSD法的分析。

然后，对由分别的血液得到的各色谱图的来自各脂质成分的峰面积进行分析，计算出乙醇胺缩醛磷脂(pl-PE)的峰面积与磷脂酰乙醇胺(PE)的峰面积之比(pl-PE/PE)。结果如下。

老年健康者…0.87±0.07

阿尔茨海默病患者…0.58

帕金森病患者…0.63

根据这些结果，能够确认痴呆症患者红血球脂质中的缩醛磷脂量降低。此外，在此，为了比较健康者与痴呆症患者的红血球所含有的缩醛磷脂量，计算出乙醇胺缩醛磷脂量相对于红血球膜所含的脂质之一的磷脂酰乙醇胺量的比率，进行比较(即，进行以磷脂酰乙醇胺为基准的比较)，也可以同样地进行计算出乙醇胺缩醛磷脂量相对于其它脂质的比率然后进行比较。

利用痴呆症小鼠模型的研究

已知通过将LPS(脂多糖；lipopolysaccharide)对小鼠腹腔内给药，能够造出痴呆症小鼠模型(例如，参照Jpn.J.Pharmacol.87，195-201(2001))。于是，与文献(LeeJWet.al，Neuroinflammation，2008，Aug29；5：37)中记载的方法同样地，使其引发脑部炎症，造出痴呆症小鼠模型。具体而言，用LPS(250μg/kg，西格玛(Sigma)公司制)一日一次连续7周对8-12周龄C57BL雄性小鼠(九动株式会社产)腹腔内给药，获得患有慢性脑内炎症的痴呆症小鼠模型(将该小鼠组作为LPS组)。另外，将用生理盐水代替LPS对8-12周龄C57BL雄性小鼠连续7天腹腔内给药而得的小鼠组作为对照组(Control组)。LPS组的n＝5，Control组的n＝5。

在最后给予LPS(最后对对照组给予生理盐水)的24小时后，对各小鼠给予戊巴比妥实施麻醉，剖开腹部后，从左心室采血制成被检验血液样品。然后，与上述同样地由该被检验血液样品制备红血球脂质样品，进行基于HPLC/ELSD法的分析，计算出乙醇胺缩醛磷脂(pl-PE)的峰面积与磷脂酰乙醇胺(PE)的峰面积之比(pl-PE/PE)。然后进行Steeltest(非参数)鉴定。将结果示于图5。

根据该结果，能够确认与正常小鼠相比，痴呆症小鼠模型的红血球脂质中的缩醛磷脂量的降低有统计学意义。

利用阿尔茨海默型痴呆症患者的研究

根据修改后的长谷川式简易智能评定量表，对多个老年人进行评价，在30分的满分中，将21分以上判定为正常(n＝8)，将20～11分判定为轻度痴呆症(轻度AD；n＝19)，将10分以下判定为重度痴呆症(重度AD；n＝14)并分组。

此外，也将修改后的长谷川式简易智能评定量表记为HDS-R，其作为通常用于从老年人中筛选出痴呆症老年人的方法，是在临床现场被广泛使用的方法(参照老年精神医学雑誌，2：1339-1347(1991)；高齢者のための知的機能検查の手引き(用于老年人的智力检测之启蒙)，ワ一ルドプランニング(WorldPlanning)，(1991)等)。

与上述同样地从各患者采血，获得被检验血液样品，由该被检验血液样品制备红血球脂质样品，进行基于HPLC/ELSD法的分析，计算出乙醇胺缩醛磷脂(pl-PE)的峰面积与磷脂酰乙醇胺(PE)的峰面积之比(pl-PE/PE)。然后进行SteelTest(非参数)鉴定。将结果示于图6。此外，图6的纵轴的单位为％。

由该结果可知，阿尔茨海默型痴呆症患者的红血球脂质中的缩醛磷脂量降低，特别是重度痴呆症患者与未患痴呆症的人(正常)相比，红血球脂质中的缩醛磷脂量的降低有统计学意义。

Claims (5)

1.测定红血球所含有的缩醛磷脂的试剂在制备痴呆症检测用的血液样品检查用试剂盒、来自痴呆症的血液样品判定用试剂盒或者痴呆症诊断用的试剂盒中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述缩醛磷脂为红血球膜中所含的缩醛磷脂。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述缩醛磷脂为乙醇胺缩醛磷脂。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述试剂包含红血球溶血用低渗溶液和/或脂质萃取用有机溶剂。

5.根据权利要求3所述的用途，其中，所述试剂包含红血球溶血用低渗溶液和/或脂质萃取用有机溶剂。