DE60200895T2

DE60200895T2 - Verfahren zur Herstellung von reinen Phosphatiden und deren Verwendung in der Kosmetik, im pharmazeutischen Gebiet und im Bereich der Nahrungsmittel

Info

Publication number: DE60200895T2
Application number: DE60200895T
Authority: DE
Inventors: Guenter Kirschner; Giampaolo Menon; Susanna Vaccaro
Original assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2002-01-31
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2022-02-01
Also published as: ES2225662T3; RU2003125183A; DE60200895D1; WO2002064603A1; DK1231213T3; EP1231213B1; ITPD20010031A1; HUP0303977A3; JP2007259866A; CZ20032137A3; AU1006402A; NO20020019D0; HUP0303977A2; EP1231213A1; RU2289625C2; JP2002253288A; PL362845A1; CA2366705C; HK1049166A1; CA2366705A1

Description

GEGENSTAND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von reinen Phosphatiden, ausgehend von natürlichen Phosphatidgemischen oder deren Einzelbestandteilen wie Sojabohne oder Eilecithin oder tierischen Phospholipiden oder synthetischen Phosphatiden, indem man sie nur im wässrigen Medium mit Phospholipase D mit Transphosphatidylierungsaktivität in Gegenwart definierter Substrate reagieren lässt, die eine primäre oder sekundäre Alkoholgruppe enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Herstellung, Reinigung und Charakterisierung der in dem Verfahren verwendeten Phospholipase D.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Synthese von reinen Phospholipiden, insbesondere im Industriemaßstab, ist ein besonders verbreitetes Problem. Tatsächlich gab es zahlreiche wissenschaftliche Veröffentlichungen und Patente, einschließlich neuerer, die verschiedene Verfahren beschreiben. Im Allgemeinen werden bei den Verfahren die Transphosphatidylierungseigenschaften von Phospholipase D ausgenutzt, um optisch aktive Phosphatide zu erhalten. Eines der Hauptprobleme ist die Tatsache, dass jedes dieser Verfahren für die Herstellung nur eines spezifischen Phosphatids geeignet ist und nicht für die Synthese der gesamten Klasse der Verbindungen übernommen werden kann. Das am weitestgehenden untersuchte Phospholipid ist Phosphatidylserin (PS), da es bei der Herstellung von Arzneimitteln, bei der Herstellung von Liposomenformulierungen sowie Nahrungsergänzungsmitteln weithin verwendet wird. Im Bezug auf die Synthese von Sphingophospholipden wird relativ wenig oder nichts berichtet.
Eine Einschränkung aller Verfahren, über die sowohl in der wissenschaftlichen als auch in der Patentliteratur berichtet wird, besteht darin, dass die Transphosphatidy lierungreaktion in zweiphasigen Systemen mit Wasser/organischen Lösungsmitteln auftritt. Dies stellt eine Reihe technischer Probleme dar, die mit der Verwendung großer Lösungsmittelmengen verbunden sind, insbesondere wenn das industrielle Verfahren chemischer Natur ist, das darauf abzielt, ein Qualitätsprodukt zu erhalten. In der Patentanmeldung DE Nr. 199 117 249 A1 wird ein Verfahren beschrieben, bei dem tatsächlich nur die wässrige Phase genutzt wird, aber es wird weder über den Ertrag und den Reinheitsgrad des erhaltenen PS, noch über die Art des verwendeten Enzyms berichtet. Zudem wird nicht erwähnt, ob es möglich ist, andere Phospholipide neben PS unter Verwendung des gleichen Verfahrens und ausgehend von den verwendeten Substraten zu erhalten, oder ob andere, in den Bedingungen beschriebene Phospholipide als Reaktionssubstrate fungieren können. Die japanische Patentoffenlegungschrift Nr. 5/42917 ( JP 2130088 ) offenbart ebenfalls ein Verfahren zur Verwendung eines Mediums, das nur aus Wasser oder einem Gemisch von Wasser und einem organischen Lösungsmittel besteht. In diesem Patent wird jedoch festgestellt, dass ein Wassergehalt von 10%, bezogen auf das Gewicht, oder weniger bevorzugt wird, um eine Nebenreaktion zu verhindern. Diese Schrift scheint daher nahezulegen, dass die Verwendung einer wässrigen Umgebung allein ungünstig ist. Tatsächlich offenbaren die Beispiele darin nur Verfahren, bei denen ein zweiphasiges Gemisch von Wasser und Ethylether verwendet wird.
Die generische Natur der Angaben oder das Fehlen von Ausführungen im Hinblick auf den vorstehend erwähnten Stand der Technik im Bezug auf die Anwendbarkeit der Transphosphatidylierungreaktion von Phospholipase D in nur wässriger Phase konnte keinesfalls dazu führen, dass ein Fachmann glaubt, dass dies die Lösung des Problems wäre. Zudem wurde erst in den letzten Jahren bekannt, dass die Entfernung von Verunreinigungen wichtig ist, die von der Verwendung von organischen Lösungsmitteln in Verfahren zur Herstellung von Produkten zur Verwendung im Bereich der Nahrungsmittel und der Pharmazie stammen, als Folge der Einschränkungen, die von der Pharmakopöe der Vereinigten Staaten (USP) und den europäischen Richtlinien (CPMP/CH/283/95) diktiert werden.
Ein weiterer kritischer Punkt, der weder in der wissenschaftlichen Literatur noch in Patenten tiefergehend untersucht wurde, betrifft die durch die Verwendung heterogener Wasser/Lösungsmittel-Phasen in Emulsion verursachte Peroxidation von Produkten während der Transphosphatidylierungsreaktion, die verwendeten Reaktions bedingungen und die sich ergebende Notwendigkeit, zahlreiche Verfahrensschritte (Repräzipitation, Waschschritte und möglicherweise auch Chromatographie) durchzuführen, um Produkte mit hohem Reinheitsgrad zu erhalten. Viele der für diese Reaktionen in der heterogenen Phase verwendeten Lösungsmittel garantieren nicht die Abwesenheit von Radikalvorläufern, die für die Initiation der Peroxidationsreaktion typisch sind. Zudem erhöht das Schütteln/Rühren, das erforderlich ist, um eine Reaktion in der heterogenen Phase zu erreichen, die Wahrscheinlichkeit, dass ein Kontakt mit Sauerstoff in der Atmosphäre erfolgt und anschließend ein oxidatives Phänomen erfolgt. Diese Peroxidation wirkt wie eine Kettenreaktion, bei der sogar vernachlässigbare Anfangsprimerschritte zu vernichtenden Ergebnisse über einen Zeitraum führen können, auch wenn die Auslöserbedingungen beseitigt oder minimiert wurden. Die Peroxidation einer „Fett"-Substanz wie Triglyceride (Öle oder Fette) und auch Phospholipide bewirkt, dass die Fettsäuren „ranzig" werden, wobei sich anschließend ein unangenehmer Geruch und Geschmack bildet. Es ist besonders wichtig, dass die Produkte ein hohes Maß an Wohlgeschmack (Geruch und Geschmack) haben sollten, wenn sie, insbesondere PS, verwendet werden, um Nahrungsergänzungsmittel (Nahrungstherapeutika) mit besonderen Formulierungen wie Granula oder die sogenannten „funktionellen Nahrungsmittel" verwendet werden, mit denen das Produkt versetzt wird, um es gehaltvoller zu machen. Folglich ist es wichtig, dass die erhaltenen Produkte, insbesondere PS, sowohl im Hinblick auf die chemische Zusammensetzung der Fettsäuren als auch im Hinblick auf ihren Peroxidierungsgrad und der sich ergebende Wohlgeschmack klar chemisch charakterisiert sein sollten.
Zuletzt sollte hervorgehoben werden, dass die auf dem Markt zur Verfügung stehenden Phospholipase D-Enzyme hauptsächlich bei der Phosphatidylcholinfraktion des Phospholipidgemisches eine Transphosphatidylierungsreaktion bewirken. Deshalb werden die anderen Bestandteile wie Phophatidylethanolamin (PE) zu Phosphatidsäure hydrolysiert, wobei sowohl der Ertrag als auch der Reinheitsgrad des Endprodukts reduziert wird.
EP A 1 04 8738 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserinen, das die Umsetzung von Phosphatiden mit racemischem oder enantiomerenreinem Serin in Gegenwart einer Phospholipase D (PLD) umfasst, die von einem spezifischen Streptomyces-Stamm stammt.
US 4,699,879 offenbart die Deacylierung von N-Acyl-DL-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serin oder einem Derivat davon unter Verwendung der Acylaseaktivität eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces oder Streptoverticillium.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Überraschenderweise hat der Anmelder entdeckt, dass es unter Verwendung einer gereinigten Fraktion der Phospholipase D aus Streptoverticillium hachijoense möglich ist, durch einen einzigen Reaktionsschritt und eine einzige Präzipitation eine Transphosphatidylierungsreaktion mit verschiedenen Alkoholrezeptoren, ausgehend von einem Gemisch von natürlichen Phosphatiden oder deren gereinigten Fraktionen in einer 100% wässrigen Umgebung, mit hohen Produkterträgen, einem hohen Reinheitsgrad und einem Peroxidindex (Peroxidierungsgrad) unter 5 zu erhalten, der nach der europäischen Pharmakopöe – Erg. 2000, Seite 41 (Verfahren A) – erstellt wurde.
Die Transphosphatidylierungsreaktion kann bei verschiedenen Temperaturbedingungen und Substratkonzentrationen durchgeführt werden, wobei Ersteres auf 20 bis 60°C, vorzugsweise 45°C, und Letzteres auf 10 bis 500 mg/ml, vorzugsweise 150 mg/ml, nach der Dispersibilität der Substrate angeglichen wird.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass diese besondere Enzymzubereitung sogar für Substrate, die kein Phosphatidylcholin (Lecithin) sind, eine Transphosphatidylierungsaktivität mit hohen Erträgen aufweist, so dass man daher das zu verwendende Verfahren auch mit billigen, ungereinigten Rohmaterialien verwenden kann.
Die Bedeutung des zur Herstellung von Phospholipase D verwendeten Stammes und seine Fraktionierung kann aus der folgenden Tabelle abgeleitet werden, in der ein Vergleich mit verschieden kommerziellen Enzymzubereitungen für die gereinigte, nach Beispiel 1 hergestellte Enzymfraktion steht.
(reines Lecithin, Phosphatidylgehalt 95%, als Substrat, Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 1)
Ein weiterer Vorteil der tatsächlichen Enzymzubereitung und der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Reaktionsbedingungen ist die praktisch vollständige Umwandlung des Substrats in PS im Vergleich zur Umwandlungsrate von nicht mehr als 70%, die im zweiphasigen System mit Wasser/organischen Lösungsmitteln in JP 213008 erhalten wird.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Herstellung von Arzneimitteln und kosmetischen Zusammensetzungen sowie Nahrungsmitteln und Nahrungsergänzungsmitteln, basierend auf Phospholipiden, die nach dem vorstehenden Verfahren erhalten wurden, die einen Peroxidierungsgrad unter 5 besitzen und einen hohen Grad an Wohlgeschmack besitzen, so dass sie gegenüber anderen ähnlichen Produkten auf dem Markt, die jedoch nicht die vorstehenden Merkmale aufweisen, bevorzugt werden.
Die Arzneimittel sowie die Nahrungsmittel und Nahrungsergänzungsmittel sind besonders bei Behandlungen von Zuständen wie psychopysikalischem Stress mit Aufmerksamkeits-, Konzentrations- und Gedächtnisstörungen angezeigt, die häufig mit fortschreitendem Alter verbunden sind, und sie können beispielsweise in Form von Kapseln, Tabletten und Granula hergestellt werden.
Die kosmetischen Zusammensetzungen können hauptsächlich bei der Behandlung der Haut mit eingeschränkten physiologischen Funktionen und als Hilfsmittel bei der Therapie von Dermatitis vom Ekzem- und/oder entzündlichen Typ angewendet werden, und sie können beispielsweise in Form von Cremes oder Gelen hergestellt werden.
Aus rein anschaulichen Zwecken berichten wir hier nachstehend über einige Herstellungsbeispiele von Phospholipase D und Phospholipiden, die gemäß der vorliegenden Erfindung davon abgeleitet sind.
Beispiel 1 – Herstellung von Phospholipase D
Es wird der Streptoverticillium hachijoense ATCC 19769-Stamm verwendet.
Die Herstellung des in der Fermentation zu verwendenden Animpfmaterials beginnt mit einer Kolonie auf festem Medium in einer Petrischale. Die Zusammensetzung des festen Mediums ist wie folgt: 21,0 g/l Y. M., 2% Agar. Die von den Petrischalen abgenommenen Bakterien werden verwendet, um in Erlenmeyer-Kolben ein „Scale-up"-System wie folgt zu starten:

– die Bakterien werden vom festen Medium mit einer sterilen Platinöse abgenommen und ein 100 ml-Kolben beimpft, der 20 ml Medium mit der folgenden Zusammensetzung enthält: 21,0 g/l Y. M.-Bouillon;
– der Kolben wird 48 Stunden auf einen auf 30°C, 150 U. p. m. eingestellten Schüttelinkubator gestellt;
– 20 ml der Kultur werden in einen 5,0 l-Kolben übertragen, der 2,5 l Medium mit der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung enthält;
– der Kolben wird 72 Stunden auf einen auf 30°C, 150 U. p. m. eingestellten Schüttelinkubator gestellt.

Zu diesem Zeitpunkt ist die Kultur zum Animpfen im Fermenter bereit. Dieser Arbeitsgang wird durch die Tatsache ermöglicht, dass sich die Kultur in einem Kolben befindet, der mit einem Silikonröhrchen und einem Nadelsystem versehen ist. Der verwendete Fermenter besitzt eine Kapazität von 50 l (Braun Biostat U). Die Zusammensetzung des Mediums ist wie folgt: 21,0 g/l Y. M.-Bouillon, pH 6,5 (das Medium wird direkt im Fermenter unter Zugabe eines Antischaummittels sterilisiert); die Parameter der Fermentation sind: Schütteln bei 200 U. p. m., Temperatur 30°C, Luftstrom 0,5 vvm.
Nach 72 Stunden wird die Fermentation unterbrochen. Die maximale erreichte Enzymmenge beträgt 5.000 U/l und die enzymatische Aktivität wird durch das in der Literatur beschriebene modifizierte Verfahren von Kato et al. bestimmt (K. Shimbo et al., Agric. Biol. Chem. 54(5), 1189–93, 1990).
Die Kulturbrühe wird filtriert, um die Biomasse zu entfernen, der Überstand wird unter Verwendung eines Spiralwickelmoduls in Celluloseacetat mit einem molekularen Ausschluss von 10.000 D konzentriert und gegen 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, dialysiert. Die so erhaltene Probe wird auf eine chromatographische Säule (i. D. = 10 cm, h = 50 cm) geladen, die mit 500 g Whatman DE-52 Anionaustauscherharz gepackt ist, das mit dem gleichen Puffer, wie er für die Dialyse verwendet wurde, voräquilibriert wird. Das Enzym wird nicht adsorbiert und eluiert von der Säule, es wird gegen 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 5,4, dialysiert und wird dann auf eine chromatographische Säule (i. D. = 10 cm, h = 50 cm) geladen, die mit 50 g Kationenaustauscherharz CM-Sephadex Pharmacia C-50 gepackt ist, das mit dem gleichen Puffer wie das Enzym voräquilibriert wird. Das Enzym wird mit einem pH-Gradienten zwischen 5,4 und 7,0 unter Verwendung eines Na-Phosphatpuffers, 20 mM, pH 7,0, eluiert. Die Fraktion, die bei pH 6,2 eluiert, wird geerntet, konzentriert und gegen Tris-HCl-Puffer, 50 mM, pH 8,0, bis zu einer Konzentration von 100 U/ml dialysiert und dann gefriergetrocknet.
Beispiel 2 – Herstellung von PS aus PC
In einem ummantelten Reaktor mit einem Schüttler und einem Rückflusskondensator werden 272 g Natriumacetattrihydrat und 59 g Calciumhydrochloridtrihydrat in 10 l Wasser gelöst. Der pH-Wert wird auf 5,6 eingestellt (0,2 M Acetatpuffer + 0,04 M Calciumchlorid, pH 5.8), und 5,0 kg L-Serin werden zugegeben und durch Erhitzen auf 45°C solubilisiert. Der gesamte Vorgang erfolgt unter Stickstoff.
Sobald die Solubilisierung beendet ist, werden 1,5 kg gereinigtes Sojabohnenlecithin mit der folgenden Zusammensetzung zugegeben: PC 95%, PA 4%, Lyso-PC 1%. Zehn Minuten später werden 16.100 U Phospholipase D wie in Beispiel 1 zugegeben, und man lässt dies 24 Stunden bei 45°C reagieren.
Nach Ablauf der Reaktion wird der Reaktor entladen, indem 10 l eines n-Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) zugegeben werden; die Masse wird durch Schütteln gelöst, dann wird das Schütteln beendet und die beiden Phasen werden zur Trennung stehengelassen.
Die untere Phase wird geerntet und das L-Serin, das nicht reagiert hat, wird durch Kühlen in einem Kristallisator rückgewonnen.
Die obere Phase wird mit 6,950 ml 1 N HCl und 1,113 ml Isopropanol bei 5°C gewaschen.
Die saure Phase wird mit 10 l eines Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) gegenextrahiert, anschließend werden die beiden organischen Phasen in einer Kaskade mit einem Gemisch von 7 l Wasser und 6 l Isopropanol gewaschen. Die organischen Phasen werden unter Vakuum konzentriert und durch langsame Zugabe einer Lösung mit 450 ml 4,5 M Natriumacetat in Wasser in 33,2 l Ethanol präzipitiert.
Dies wird filtriert und getrocknet.
Man erhält 1,14 kg Phosphatidylserin mit einem Titer über 95%, einem Phosphatidsäuregehalt unter 5% und einem Peroxidindex unter 5.
Nach der Kristallisation und Trocknung werden 3,25 kg L-Serin geerntet.
Beispiel 3 – Herstellung von PS aus Eilecithin
180 ml 0,2 M Acetatpuffer + 0,04 M Calciumchlorid, pH 5,6, werden in einen ummantelten Reaktor mit einem Schüttler und einem Rückflusskondensator gegeben, anschließend werden 90 g L-Serin zugegeben und durch Erhitzen auf 45°C solubilisiert. Der gesamte Vorgang erfolgt unter Stickstoff.
Sobald die Solubilisierung beendet ist, werden 27 g gereinigtes Eilecithin zugegeben. (PC-Gehalt ≥ 95%); 10 Minuten später werden 290 U Phospholipase D wie bei Beispiel 1 zugegeben, und man lässt es 24 Stunden bei 45°C reagieren.
Sobald die Reaktion abgelaufen ist, wird der Reaktor entladen, indem 200 ml eines n-Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) zugegeben werden; die Masse wird durch Schütteln gelöst, dann wird das Schütteln beendet und die beiden Phasen werden zur Trennung stehengelassen.
Die untere Phase wird verworfen.
Die obere Phase wird mit 150 ml 1 N HCl und 30 ml Isopropanol bei 5°C gewaschen. Die saure Phase wird mit 180 ml eines Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) gegenextrahiert, anschließend werden die beiden organischen Phasen in einer Kaskade mit einem Gemisch von 100 ml Wasser und 130 ml Isopropanol gewaschen.
Die organischen Phasen werden unter Vakuum konzentriert und durch langsame Zugabe einer Lösung mit 8 ml 4,5 M Natriumacetat in Wasser in 600 ml Ethanol präzipitiert.
Dies wird filtriert und getrocknet.
Dies ergibt 20,8 g Phosphatidylserin mit einem Titer über 95% mit einem Phosphatidsäuregehalt unter 5% und einem Peroxidindex unter 5.
Beispiel 4 – Herstellung von Phosphatidylserin aus rohem Sojabohnenlecithin
180 ml 0,2 M Acetatpuffer + 0,04 M Calciumchlorid, pH 5,6, werden in einen ummantelten Reaktor mit einem Schüttler und einem Rückflusskondensator gegeben, anschließend werden 90 g L-Serin zugegeben und durch Erhitzen auf 45°C solubilisiert. Der gesamte Vorgang erfolgt unter Stickstoff.
Sobald die Solubilisierung beendet ist, werden 27 g rohes Sojabohnenlecithin zugegeben (Gesamtphospholipidgehalt 75%, prozentuale Zusammensetzung PC 60,6/PE 29,5/PA 3,4/Lyso-PC 2,5/sonstige 3,9); 10 Minuten später werden 290 U Phospholipase D wie bei Beispiel 1 zugegeben, und dies lässt man 24 Stunden bei 45°C reagieren.
Sobald die Reaktion abgelaufen ist, wird die Lösung entladen, indem 200 ml eines n-Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) zugegeben werden; die Masse wird durch Schütteln gelöst, dann wird das Schütteln beendet und die beiden Phasen werden zur Trennung stehengelassen.
Die untere Phase wird verworfen.
Die obere Phase wird mit 150 ml 1 N HCl und 30 ml Isopropanol bei 5°C gewaschen. Die saure Phase wird mit 180 ml eines Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) gegenextrahiert, anschließend werden die beiden organischen Phasen in einer Kaskade mit einem Gemisch von 100 ml Wasser und 130 ml Isopropanol gewaschen.
Die organischen Phasen werden unter Vakuum konzentriert und durch langsame Zugabe einer Lösung mit 8 ml 4,5 M Natriumacetat in Wasser in 600 ml Ethanol präzipitiert.
Dies wird filtriert und getrocknet.
Dies ergibt 19 g Phosphatidylserin mit einem Titer von 83,5% (PA 7,7%, Lyso-PS 2,3%, PE 1,9%, sonstige 4,59%) und einem Peroxidindex unter 5.
Beispiel 5 – Herstellung von Phosphatidyl-D-serin
180 ml 0,2 M Acetatpuffer + 0,04 M Calciumchlorid, pH 5,6 werden in einen ummantelten Reaktor mit einem Schüttler und einem Rückflusskondensator gegeben, anschließend werden 90 g D-Serin zugegeben und durch Erhitzen auf 45°C solubilisiert. Der gesamte Vorgang erfolgt unter Stickstoff.
Sobald die Solubilisierung beendet ist, werden 27 g gereinigtes Sojabohnenlecithin wie bei Beispiel 2 zugegeben, 10 Minuten später werden 290 U Phospholipase D wie bei Beispiel 1 zugegeben, und man lässt es 24 Stunden bei 45°C reagieren.
Sobald die Reaktion abgelaufen ist, wird der Reaktor entladen, indem 200 ml eines n-Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) zugegeben werden; die Masse wird durch Schütteln gelöst, dann wird das Schütteln beendet und die beiden Phasen werden zur Trennung stehengelassen.
Die untere Phase wird verworfen.
Die obere Phase wird mit 150 ml 1 N HCl und 30 ml Isopropanol bei 5°C gewaschen. Die saure Phase wird mit 180 ml eines Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) gegenextrahiert, anschließend werden die beiden organischen Phasen in einer Kaskade mit einem Gemisch von 100 ml Wasser und 130 ml Isopropanol gewaschen.
Die organischen Phasen werden unter Vakuum konzentriert und durch langsame Zugabe einer Lösung mit 8 ml 4,5 M Natriumacetat in Wasser in 600 ml Ethanol präzipitiert.
Dies wird filtriert und getrocknet.
Dies ergibt 18,7 g Phosphatidyl-D-serin mit einem Titer über 95% mit einem Phosphatidsäuregehalt unter 5% und einem Peroxidindex unter 5.
Beispiel 6 – Herstellung von Phosphatidylethanolamin (PE) aus PC
200 ml 0,2 M Acetatpuffer + 0,04 M Calciumchlorid, pH 5,6 werden in einen ummantelten Reaktor mit einem Schüttler und einem Rückflusskondensator gegeben. Der gesamte Vorgang erfolgt unter Stickstoff.
58 g Ethanolamin werden zugegeben und der pH-Wert wird mit Eisessig bei einer Temperatureinstellung von 30°C auf 5,6 eingestellt.
Am Ende des Arbeitsvorgangs wird es auf 45°C erhitzt, und es werden 30 g gereinigtes Sojabohnenlecithin wie bei Beispiel 2 zugegeben. Nach 10 Minuten werden 325 U Phospholipase D wie bei Beispiel 1 zugegeben, und man lässt dies 24 Stunden bei 45°C reagieren.
Sobald die Reaktion abgelaufen ist, wird der Reaktor entladen, indem 400 ml eines n-Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) zugegeben werden, dann wird das Schütteln beendet und die beiden Phasen werden zur Trennung stehengelassen.
Die untere Phase wird verworfen.
Die obere Phase wird mit 150 ml 1 N HCl und 30 ml Isopropanol bei 5°C gewaschen. Die saure Phase wird mit 180 ml eines Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) gegenextrahiert, anschließend werden die beiden organischen Phasen in einer Kaskade mit einem Gemisch von 100 ml Wasser und 130 ml Isopropanol, dann mit 100 ml 1 N Natriumacetat und 130 ml Isopropanol gewaschen.
Die organischen Phasen werden unter Vakuum konzentriert.
Es erfolgt eine Reinigung durch Kieselgelchromatographie unter Verwendung eines axialen Druckchromatographs mit einer mit Chloroform/Methanol (80/20) äquilibierten 1 l-Säule; die Gradientenelution erfolgt mit Chloroform/Methanol/Wasser (70/30/3).
Die reinen Fraktionen werden abgedampft, in 250 ml Cyclohexan gelöst und gefriergetrocknet, so dass sich 24 g eines blass-gelben, festen Produkts ergeben, das frei von Phosphatidsäure und Lysoderivaten ist und mehr als 99% rein ist.
Beispiel 7 – Herstellung von Phosphatidylhomoserin aus PC
180 ml 0,2 M Acetatpuffer + 0,04 M Calciumchlorid, pH 5,6 werden in einen ummantelten Reaktor mit einem Schüttler und einem Rückflusskondensator gegeben, anschließend werden 102 g Homoserin zugegeben und durch Erhitzen auf 45°C solubilisiert. Der gesamte Vorgang erfolgt unter Stickstoff.
Sobald die Solubilisierung beendet ist, werden 27 g gereinigtes Sojabohnenlecithin wie bei Beispiel 2 zugegeben; 10 Minuten später werden 290 U Phospholipase D wie bei Beispiel 1 zugegeben, und man lässt es 24 Stunden bei 45°C reagieren.
Sobald die Reaktion abgelaufen ist, wird der Reaktor entladen, indem 200 ml eines n-Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) zugegeben werden. Die Masse wird durch Schütteln gelöst, dann wird das Schütteln gestoppt und die beiden Phasen werden zur Trennung stehengelassen.
Die untere Phase wird verworfen.
Die obere Phase wird mit 150 ml 1 N HCl und 30 ml Isopropanol bei 5°C gewaschen. Die saure Phase wird mit 180 ml eines Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) gegenextrahiert, anschließend werden die beiden organischen Phasen in einer Kaskade mit einem Gemisch von 100 ml Wasser und 130 ml Isopropanol gewaschen.
Die organischen Phasen werden unter Vakuum konzentriert und durch langsame Zugabe einer Lösung mit 8 ml 4,5 M Natriumacetat in Wasser in 600 ml Ethanol präzipitiert.
Dies wird filtriert und getrocknet.
Es werden 22,6 g Phosphatidylhomoserin mit einem Titer über 95% mit einem Phosphatidsäuregehalt unter 5% und einem Peroxidindex über 5 erhalten.
Beispiel 8 – Herstellung von Phosphatidylhydroxyprolin aus PC
180 ml 0,2 M Acetatpuffer + 0,04 M Calciumchlorid, pH 5,6 werden in einen ummantelten Reaktor mit einem Schüttler und einem Rückflusskondensator gegeben, anschließend werden 112 g Hydroxyprolin zugegeben und durch Erhitzen auf 45°C solubilisiert. Der gesamte Vorgang erfolgt unter Stickstoff.
Sobald die Solubilisierung beendet ist, werden 27 g gereinigtes Sojabohnenlecithin wie bei Beispiel 2 zugegeben; 10 Minuten später werden 290 U Phospholipase D wie bei Beispiel 1 zugegeben, und man lässt es 24 Stunden bei 45°C reagieren.
Sobald die Reaktion abgelaufen ist, wird der Reaktor entladen, indem 200 ml eines n-Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) zugegeben werden und die Masse wird durch Schütteln gelöst, dann wird das Schütteln beendet und die beiden Phasen werden zur Trennung stehengelassen.
Die untere Phase wird verworfen.
Die obere Phase wird mit 150 ml 1 N HCl und 30 ml Isopropanol bei 5°C gewaschen.
Die saure Phase wird mit 180 ml eines Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) gegenextrahiert, anschließend werden die beiden organischen Phasen in einer Kaskade mit einem Gemisch von 100 ml Wasser und 130 ml Isopropanol gewaschen.
Die organischen Phasen werden unter Vakuum konzentriert und durch langsame Zugabe einer Lösung mit 8 ml 4,5 M Natriumacetat in Wasser in 600 ml Ethanol präzipitiert.
Dies wird filtriert und getrocknet.
Die ergibt 18,4 g Phosphatidylhydroxyprolin mit einem Titer über 95% mit einem Phosphatidsäuregehalt unter 5% und einem Peroxidindex unter 5 erhalten.
Beispiel 9 – Herstellung von Phosphatidylglycerin aus PC
200 ml 0,2 M Acetatpuffer + 0,04 M Calciumchlorid, pH 5,6 werden in einen ummantelten Reaktor mit einem Schüttler und einem Rückflusskondensator gegeben. Der gesamte Vorgang erfolgt unter Stickstoff.
80 g Glycerin werden zugegeben; es wird auf 45°C erhitzt, dann werden 30 g gereinigtes Sojabohnenlecithin wie bei Beispiel 2 zugegeben; 10 Minuten später werden 325 U Phospholipase D wie bei Beispiel 1 zugegeben, und man lässt es 24 Stunden bei 45°C reagieren.
Sobald die Reaktion abgelaufen ist, wird der Reaktor entladen, indem 400 ml eines n-Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) zugegeben werden, dann wird das Schütteln beendet und die beiden Phasen werden zur Trennung stehengelassen.
Die untere Phase wird verworfen.
Die obere Phase wird mit 150 ml 1 N HCl und 30 ml Isopropanol bei 5°C gewaschen. Die saure Phase wird mit 180 ml eines Hexan/Isopropanol/Wasser-Gemisches (60/80/15) gegenextrahiert, anschließend werden die beiden organischen Phasen in einer Kaskade mit einem Gemisch von 100 ml Wasser und 130 ml Isopropanol, dann mit 100 ml 1 N Natriumacetat und 130 ml Isopropanol gewaschen.
Die organischen Phasen werden unter Vakuum konzentriert.
Die Reinigung erfolgt durch Kieselgelchromatographie unter Verwendung eines axialen Druckchromatographs mit einer mit Chloroform/Methanol (80/20) äquilibierten 1 l-Säule. Die Gradientenelution erfolgt mit Chloroform/Methanol/Wasser (70/30/3).
Die reinen Fraktionen werden abgedampft, in 250 ml Cyclohexan gelöst und gefriergetrocknet, so dass sich 22,2 g eines weißen festen Produkts ergeben, das frei von Phosphatidsäure und Lysoderivaten ist und mehr als 95% rein ist.
Dies wird filtriert und getrocknet.
Beispiel 10-Ernte und Recycling von L-Serin
Die Mutterlösungen der ersten Aufteilung der enzymatischen Reaktion wie in Beispiel 2 werden 24 Stunden bei einer Temperatur von 0°C aufbewahrt, dann wird das kristallisierte Produkt filtriert. Es wird mit Ethanol gewaschen und getrocknet, so dass sich weiße Nadeln eines reinen Produkts ergeben, das mit dem Original identisch ist. Die fehlende Menge (etwa 20%) wird ergänzt und das Produkt kann normal verwendet werden.
Beispiel 11 – Beispiele für Arzneimittel
(a) Jede Gelatinekapsel enthält:

Phosphatidylserin 100,0 mg

Pflanzenöl 270,0 mg

Sojalecithin 30,0 mg
(b) Jede Injektionsflasche enthält:

Phosphatidylserin 50,0 mg

Mannit 100,0 mg

Sojalecithin (Injektionsgrad) 7,5 mg

Phosphatpuffer 2,2 mg

Wasser q. s. a. 2,0 ml
Beispiel 12 – Beispiele für Nahrungsmittel und Nahrungsergänzungsmittel
(a) Jede Gelatinekapsel enthält:

Phosphatidylserin 100,0 mg

Vitamin E 5,0 mg

Pflanzenöl 295,0 mg
(b) Jedes Sachet enthält:

Phosphatidylserin 100,0 mg

Kreatin 1,5 g

Beta-Carotin 0,6 mg

Vitamin E 5,0 mg

Vitamin C 30,0 mg

Vitamin B1 0,7 mg

Vitamin B6 1,0 mg

Vitamin B12 0,5 mcg

Folsäure 0,1 mg
(c) Jede Kautablette enthält:

Phosphatidylserin 75,0 mg

Vitamin E 5,0 mg

Vitamin C 30,0 mg

Vitamin B1 0,7 mg

Vitamin B6 1,0 mg

Vitamin B12 0,5 mcg

Folsäure 0,1 mg
Beispiel 13 – Beispiele für kosmetische Zusammensetzungen

(a) Jede Tube mit Körpercreme enthält:

Phosphatidylserin	4,0 g
Macadamia ternifolia	2,0 g
Natriumhyaluronat	10,0 mg
Cetearyloctanoat	8,0 g
Capryl/Caprintriglycerid	7,0 g
Sorbit	5,0 g
Cetearylalkohol	4,0 g
Polysorbat 20	1,0 g
Carbomer	0,8 g
Natriumdehydroacetat	0,4 g
Dinatrium-EDTA	0,3 g
Antioxidans (Tocopherol)	50,0 mg
Wasser q. s. a.	100,0 ml

(b) Jede Tube mit Körpersalbe enthält:

Phosphatidylserin 3,0 g

Cholesterol 2,0 g

Natriumhyaluronat 10,0 mg

Cetearyloctanoat 9,0 g

Capryl/Caprintriglycerid 7,0 g

Sorbit 7,0 g

Cetearylalkohol 3,5 g

Polysorbat 20 1,0 g

Carbomer 0,6 g

Natriumdehydroacetat 0,5 g

Dinatrium-EDTA 0,3 g

Antioxidans (Tocopherol) 50,0 mg

Wasser q. s. a. 100,0 ml

Claims

Verfahren zur Herstellung von Phosphatiden mit der Formel (I): R-O-PO(OH)-O-R₁ (I)wobei der Rest R Diacylglycerin ist und der Rest R₁ eine Alkoholgruppe ist, wobei das Verfahren umfasst: Umsetzen eines Phosphatids der Formel (II): R-O-PO(OH)-O-R₂, wobei der Rest R die vorstehende Bedeutung hat und der Rest R₂ die Bedeutung CH₂-CH₂-NH₂ und/oder CH₂-CH₂-N(CH₃)₃ hat, mit einem primären oder sekundären Alkohol mit einer Kettenlänge von C2 bis C4, welche gegebenenfalls mit einer oder mehreren polaren Gruppen ausgewählt aus Amino, Hydroxy und Carboxy substituiert sind, in einer einzigen wässrigen Phase in der Gegenwart von Phospolipase D mit Transphosphatidylierungsaktivität, welche aus einem Streptomyces hachijoense-Stamm hergestellt worden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Diacylglycerin zwei Fettsäuren enthält, welche gleich oder verschieden, gesättigt oder ungesättigt sein können, wobei sie eine Länge zwischen C12 und C24 haben.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Umsetzungstemperatur 45°C ± 5°C ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Phospholipase D an einem Anionen- und Kationenaustauschharz gereinigt worden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die verwendete Phospholipase D-Fraktion bei pH 6,2 von dem Kationenaustauschharz eluiert worden ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Streptomyces hachijoense-Stamm ATCC 19769 ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Phosphatid der Formel (I) Phosphatidyl-D-serin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylhomoserin, Phosphatidylhydroxyprolin oder Phosphatidylglycerin ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Phosphatid der Formel (I) Phosphatidyl-L-serin ist und das Phosphatid der Formel (II) rohes oder gereinigtes Sojabohnenlecithin ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Phosphatid der Formel (I) Phosphatidyl-L-serin ist und das Phosphatid der Formel (II) Eilecithin ist.
Phosphatidyl-L-serin-Erzeugnis erhältlich mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, welches eine Fettsäurezusammensetzung gleich jener von Sojabohnen- oder Eilecithin und einen Peroxidierungsgrad von weniger als 5 hat.
Arzneimittel umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und ein Phosphatid der Formel (I) erhältlich mit dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
Kosmetische Zusammensetzung umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und ein Phosphatid der Formel (I) erhältlich mit dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
Lebensmittel und Nahrungsergänzungsmittel umfassend einen Träger und ein Phosphatid der Formel (I) erhältlich mit dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
Lebensmittel und Nahrungsergänzungsmittel gemäß Anspruch 13, wobei das Phosphatid der Formel (I) Phosphatidyl-L-serin ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 11 oder ein Lebensmittel und Nahrungsergänzungsmittel gemäß Anspruch 13 oder 14, welche eine Fettsäurezusammensetzung gleich dem Ei- oder Sojabohnenlecithin, einen Peroxidierungsgrad von weniger als 5 und einen hohen Grad an Wohlgeschmack bezogen auf Geschmack und Geruch hat.
Kosmetische Zusammensetzung zur topischen Anwendung auf der Haut umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und Phosphatidyl-L-serin erhältlich mit dem Verfahren gemäß Anspruch 1, welche eine Fettsäurezusammensetzung gleich dem Ei- oder Sojabohnenlecithin und einen Peroxidierungsgrad von weniger als 5 hat.
Verwendung eines Phosphatids der Formel (I) erhältlich gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 für die Herstellung eines Arzneimittels oder eines Lebensmittels oder Nahrungsergänzungsmittels zur Behandlung von psychophysikalischem Stress, Aufmerksamkeits-, Konzentrations- und Gedächtnisstörungen, die im Allgemeinen mit fortschreitendem Alter verbunden sind.
Verwendung eines Phosphatids der Formel (I) erhältlich gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung zur Behandlung von Dermatitis oder in ihren physiologischen Funktionen geschwächte Haut.
Arzneimittel oder Nahrungsmittel oder Nahrungsergänzungsmittel gemäß Anspruch 15 in Form einer Kapsel, Tablette oder eines Granulats.
Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 16 in Form einer Creme oder eines Gels.