ES2225662T3

ES2225662T3 - Procedimiento para la preparacion de fosfatidos puros y su utilizacion en los sectores cosmetico, farmaceutico y alimenticio.

Info

Publication number: ES2225662T3
Application number: ES02002360T
Authority: ES
Inventors: Guenter Kirschner; Giampaolo Menon; Susanna Vaccaro
Original assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2002-01-31
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2022-01-31
Also published as: HK1049166A1; EP1231213A1; WO2002064603A1; ATE273313T1; JP2007259866A; AU1006402A; DE60200895D1; CA2366705C; HK1049166B; NO317429B1; EP1231213B1; RU2289625C2; NO20020019L; DE60200895T2; JP2002253288A; AU766891B2; CZ20032137A3; ITPD20010031A1; HUP0303977A3; CA2366705A1

Abstract

Proceso para la preparación de fosfátidos con la fórmula (I): **(Fórmula)** en la que R es un diacilglicerol y R1 es un grupo alcohólico, cuyo proceso comprende: la reacción de un fosfátido de la fórmula (II): R-O-PO(OH)-O-R2, en la que R representa lo mismo que antes y R2 es CH2-CH2-NH2 y/o CH2-CH2-N(CH3)3, con un alcohol primario o secundario con una longitud de cadena de C2 a C4, posiblemente sustituido por uno o más grupos polares seleccionados del grupo formado por amino, hidroxilo y carboxilo, en una fase únicamente acuosa en presencia de fosfolipasa D con una actividad de transfosfatidilación producida a partir de una cepa de Streptomyces hachijoense.

Description

Procedimiento para la preparación de fosfátidos puros y su utilización en los sectores cosmético, farmacéutico, y alimenticio.

Tema de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para la preparación de fosfátidos puros a partir de mezclas de fosfátidos naturales, o de sus componentes individuales, tales como la lecitina de soja o de huevo o fosfolípidos animales, o a partir de fosfátidos sintéticos haciéndolos reaccionar con fosfolipasa D, con actividad de transfosfatidilación, en medio únicamente acuoso en presencia de sustratos definidos que contienen un grupo alcohólico primario o secundario.

La invención también se refiere a la preparación, purificación y caracterización de la fosfolipasa D utilizada en el proceso.

Antecedentes de la invención

La síntesis de fosfolípidos puros, particularmente a escala industrial, es un problema particularmente extendido. De hecho, han habido numerosas publicaciones y patentes científicas, incluyendo algunas muy recientes, que describen diversas metodologías. En general, dichos métodos explotan las propiedades de transfosfatidilación de la fosfolipasa D para obtener fosfátidos ópticamente activos. Uno de los problemas principales es el hecho de que cada uno de estos métodos es adecuado para la preparación de un único fosfátido específico y no puede adaptarse para la síntesis de todo el conjunto de compuestos. En general, el fosfolípido estudiado más ampliamente es la fosfatidilserina (PS), ya que es ampliamente utilizada en la preparación de composiciones farmacéuticas, en la preparación de formulaciones de liposomas y en suplementos alimenticios. Respecto a la síntesis de esfingofosfolípidos no se ha descrito nada o relativamente poco.

Una limitación de todos los métodos descritos en la literatura, tanto científica como de patentes, consiste en el hecho de que la reacción de transfosfatidilación tiene lugar en sistemas bifásicos agua/disolvente orgánico. Esto presenta una serie de problemas técnicos unidos con la utilización de grandes cantidades de disolvente, especialmente cuando el proceso industrial es de naturaleza química, dirigido a obtener un producto de calidad. En la solicitud de patente No. DE 19917249 A1, se describe un método que realmente emplea únicamente la fase acuosa, pero no se indica ni el rendimiento ni el grado de pureza de la PS obtenida, ni el tipo de enzima utilizado. Además, no se menciona si es posible obtener otros fosfolípidos a parte de PS utilizando la misma técnica y comenzando a partir de los sustratos utilizados, o si, en las condiciones descritas, otros fosfolípidos pueden actuar como sustratos de reacción. La Publicación de la Patente Japonesa No. 5/42917 (JP 2130088) también da a conocer un método que utiliza un medio formado únicamente por agua o una mezcla de agua y un disolvente orgánico. Sin embargo, esta patente declara que se prefiere que el contenido de agua sea del 10% en peso o inferior para evitar una reacción lateral. Esta referencia, por tanto, parece sugerir que utilizar un medio únicamente acuoso no es favorable. De hecho, los ejemplos de la misma dan a conocer únicamente procesos que utilizan una mezcla bifásica de agua y etil éter.

La naturaleza genérica de la información aportada o la ausencia de enseñanza de las técnicas mencionadas anteriormente con respecto a la aplicabilidad de la reacción de transfosfatidilación de la fosfolipasa D en fase únicamente acuosa, no podía, de ninguna manera, haber conducido a un experto en el sector a pensar que ésta era la solución del problema. Además, la importancia de la eliminación de impurezas derivadas de la utilización de disolventes orgánicos en procesos para la fabricación de productos para utilización en los sectores alimentario y farmacéutico solamente se ha conocido en los últimos años, siguiendo las limitaciones dictadas por la Farmacopea de los Estados unidos (USP) y las directivas Europeas (CPMP/CH/283/95).

Otro punto crítico que no se ha investigado con profundidad, tanto en la literatura científica como en las patentes, se refiere a la peroxidación de productos causada por la utilización de fases heterogéneas de agua/disolvente en emulsión durante la reacción de transfosfatidilación, las condiciones de reacción utilizadas y la consecuente necesidad de llevar a cabo numerosas etapas del proceso (re-precipitación, lavados y, posiblemente también, cromatografía) para obtener productos con un grado elevado de pureza. Muchos de los disolventes utilizados para estas reacciones en fase heterogénea no garantizan la ausencia de precursores radicales habituales en la iniciación de la reacción de peroxidación. Además, la agitación requerida para conseguir una reacción en fase heterogénea incrementa la probabilidad de que haya contacto con el oxígeno de la atmósfera y la consecuente activación de fenómenos oxidativos. Esta peroxidación actúa como una reacción en cadena, cuando incluso las etapas cebadoras iniciales negligibles pueden dar resultados devastadores con el tiempo, incluso cuando las condiciones de activación se han eliminado o minimizado. La peroxidación de una sustancia "grasa", tal como triglicéridos (aceites o grasas) y fosfolípidos también, provoca que los ácidos grasos se vuelvan "rancios", con la consecuente formación de un olor y un sabor desagradables. Es particularmente importante que los productos tengan un grado elevado de palatabilidad (olor y sabor) cuando, particularmente la PS, se utilizan para preparar suplementos alimenticios (nutracéuticos) con formulaciones particulares, tales como gránulos o las denominadas "comidas funcionales", a las que se añade el producto para enriquecer su contenido. Consecuentemente, es importante que los productos obtenidos, particularmente la PS, se caractericen claramente en términos químicos, tanto con respecto a la composición química de los ácidos grasos, como por la extensión de su peroxidación y la palatabilidad consiguiente.

Por último, debería señalarse que las enzimas de fosfolipasa D disponibles en el mercado tienen, principalmente, una actividad de transfosfatidilación en la fracción de fosfatidilcolina de la mezcla de fosfolípidos. Por lo tanto, los otros componentes, tales como la fosfatidiletanolamina (PE), experimentan hidrólisis a ácido fosfatídico, reduciéndose así tanto el rendimiento como el grado de pureza del producto acabado.

La Patente EP A 1 04 8738 da a conocer un proceso para la preparación de fosfatidilserinas que comprende la reacción de fosfátidos con serina racémica o enantioméricamente pura en presencia de una fosfolipasa D (PLD) derivada de una cepa específica de Streptomyces.

La Patente de Estados Unidos 4.699.879 da a conocer la desacilación de la N-acil-DL-3-(3,4-dihidroxifenil) serina o un derivado de la misma utilizando la actividad acilasa de un microorganismo del género Streptomyces o Streptoverticillium.

Descripción detallada de la invención

Sorprendentemente, el Solicitante ha descubierto que utilizando una fracción purificada de fosfolipasa D de Streptoverticillium hachijoense, es posible obtener una reacción de transfosfatidilación con varios receptores alcohólicos comenzando a partir de una mezcla de fosfátidos naturales o de sus fracciones purificadas en un medio acuoso al 100% con rendimientos de producto elevados, un grado elevado de pureza y un índice de peróxido (grado de peroxidación) inferior a 5, establecido según la Farmacopea Europea - Supl. 2000, página 41 (método A), mediante una única etapa de reacción y una única precipitación.

La reacción de transfosfatidilación se puede llevar a cabo en varias condiciones de temperatura y concentración de sustrato, ajustando la primera entre 20 y 60ºC, preferiblemente 45ºC, y la última, entre 10 y 500 mg/ml, preferiblemente 150 mg/ml, según la dispersabilidad de los sustratos.

Un segundo aspecto de la presente invención consiste en el hecho de que esta preparación enzimática particular tiene una actividad de transfosfatidilación con rendimientos elevados incluso en sustratos diferentes de la fosfatidilcolina (lecitina), permitiendo así que el proceso se utilice también con materias primas de bajo coste y sin purificar.

La importancia de la cepa utilizada para la preparación de la Fosfolipasa D y su fraccionamiento se puede deducir de la siguiente tabla, en la que se indica una comparación con diferentes preparaciones enzimáticas comerciales para la fracción enzimática purificada preparada según el Ejemplo 1.

Preparación de fosfaridilserina

1

\begin{minipage}[t]{130mm}(lecitina pura, contenido de fosfatidilcolina 95%, como sustrato; condiciones de reacción, como en el ejemplo 1)\end{minipage}

Otra ventaja de la preparación de la enzima concreta y de las condiciones de reacción descritas en la presente invención es la conversión prácticamente completa del sustrato a PS en comparación con la velocidad de conversión no superior al 70% conseguida en el sistema bifásico agua/disolvente orgánico de la Patente JP 213008.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a la preparación de composiciones farmacéuticas y cosméticas y de suplementos alimenticios y dietéticos basados en fosfolípidos, obtenidos según el proceso descrito anteriormente, con un grado de peroxidación inferior a 5 y un grado de palatabilidad elevado, para hacerlos preferibles a otros productos similares del mercado que, sin embargo, no tienen las características mencionadas anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas y los suplementos alimenticios y dietéticos están particularmente indicados en el tratamiento de condiciones de estrés psicofísico con falta de atención, concentración y memoria, asociadas frecuentemente con una edad avanzada, y se pueden preparar, por ejemplo, en forma de cápsulas, pastillas y gránulos.

Las composiciones cosméticas se pueden aplicar principalmente en el tratamiento de piel con disfunciones fisiológicas y como ayudas en la terapia de dermatitis de tipo eccematoso y/o inflamatorio, y se pueden preparar, por ejemplo, en forma de cremas o geles.

Con propósitos puramente ilustrativos, se indican a continuación algunos ejemplos de preparación de Fosfolipasa D y fosfolípidos derivados de ésta según la presente invención.

Ejemplo 1 Preparación de Fosfolipasa D

Se utiliza la cepa de Streptoverticillium hachijoense ATCC 19769.

La preparación de la inoculación a utilizar en la prueba de fermentación se inicia con una colonia en un medio sólido en una placa de Petri. La composición del medio sólido es la siguiente: 21,0 g/litro de Y.M., 2% de agar. Las bacterias extraídas de las placas de Petri se utilizan para iniciar un sistema de "escalado" en matraces Erlenmeyer, tal como se indica a continuación:

- se extraen las bacterias del medio sólido con una "asa" de platino estéril y se inoculan en un matraz de 100 ml que contiene 20 ml de medio con la siguiente composición: 21,0 g/l de caldo de cultivo Y.M;

- se coloca el matraz en un incubador con agitación a 30ºC, 150 rpm durante 48 horas;

- se transfieren 20 ml de cultivo a un matraz de 5,0 l que contiene 2,5 l de medio con la composición descrita anteriormente;

- el matraz se coloca en un incubador con agitación a 30ºC, 150 rpm durante 72 horas.

En este punto, el cultivo está preparado para ser inoculado en el fermentador. Esta operación es posible por el hecho de que el cultivo se encuentra en un matraz ajustado con un tubo de silicona y un sistema de agujas. El fermentador utilizado tiene una capacidad de 50 l (Braun Biostat U). La composición del medio es la siguiente: caldo de cultivo Y.M. 21,0 g/l, pH 6,5 (el medio se esteriliza directamente en el fermentador mediante la adición de un agente antiespumante); los parámetros de la fermentación son: agitación a 200 rpm, temperatura 30ºC, flujo de aire a 0,5 vvm.

La fermentación se interrumpe después de 72 horas. La cantidad máxima de enzima alcanzada es de 5.000 U/l y la actividad enzimática se determina mediante el método modificado de Kato y otros descrito en la literatura (K. Shimbo y otros, Agric. Biol. Chem. 54(5), 1189-93, 1990).

El caldo de cultivo se filtra para eliminar la biomasa, se concentra el sobrenadante utilizando un cartucho espiral en acetato de celulosa con un peso molecular de corte de 10.000 D y se dializa contra un tampón de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. La muestra obtenida de este modo se carga en una columna cromatográfica (i.d. = 10 cm, h = 50 cm) empaquetada con 500 g de una resina de intercambio aniónico Whatman DE-52 preequilibrada con el mismo tampón utilizado para la diálisis. La enzima que no se adsorbe y se eluye de la columna, se dializa contra un tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 5,4 y, a continuación, se carga en una columna cromatográfica (i.d. = 10 cm, h = 50 cm) empaquetada con 50 g de una resina de intercambio catiónico CM-Sephadex Pharmacia C-50 preequilibrada con el mismo tampón que la enzima. Se eluye la enzima con un gradiente de pH entre 5,4 y 7,0 utilizando un tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 7,0. Se recoge la fracción que se eluye a pH 6,2, se concentra y se dializa contra un tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, hasta una concentración de 100 U/ml y, a continuación, se liofiliza.

2

Ejemplo 2 Preparación de PS a partir de PC

Se disuelven en un reactor encamisado adaptado con un agitador y un condensador de reflujo, 272 g de acetato sódico trihidrato y 59 g de hidrocloruro cálcico trihidrato en 10 l de agua. Se ajusta el pH a 5,6 (tampón acetato,
0,2 M + cloruro cálcico 0,04 M, pH 5,6) y se añaden 5,0 kg de L-serina y se solubilizan calentando a 45ºC. Todo el proceso se lleva a cabo bajo atmósfera de nitrógeno.

Una vez se ha completado la solubilización, se añaden 1,5 kg de lecitina de soja purificada con la siguiente composición: PC 95%, PA 4%, liso-PC 1%. Diez minutos después, se añaden 16.100 U de fosfolipasa D, tal como en el ejemplo 1, y se deja reaccionar durante 24 horas a 45ºC.

Al completarse la reacción, se descarga el reactor mediante la adición de 10 l de una mezcla de n-hexano/isopropa-
nol/agua (60/80/15); se disuelve la masa mediante agitación, a continuación, se detiene la agitación y se deja que se separen las dos fases.

Se recoge la fase inferior y se recupera la L-serina no reaccionada por enfriamiento en un cristalizador.

La fase superior se lava con 6.950 ml de HCl 1 N y 1.113 ml de isopropanol a 5ºC.

La fase ácida se extrae con 10 l de una mezcla de hexano/isopropanol/agua (60/80/15), después de lo cual, las dos fases orgánicas se lavan en cascada con una mezcla de 7 l de agua y 6 l de isopropanol.

Las fases orgánicas se concentran mediante vacío y se precipitan añadiendo lentamente una solución de 450 ml de acetato sódico, 4,5 M en agua en 33,2 l de etanol.

Se filtra y se seca.

Se obtienen 1,14 kg de fosfatidilserina con un título superior al 95%, un contenido de ácido fosfatídico inferior al 5% y un índice de peróxido inferior a 5.

Después de la cristalización y el secado, se recogen 3,25 kg de L-serina.

Ejemplo 3 Preparación de PS a partir de lecitina de huevo

Se introducen 180 ml de tampón acetato, 0,2 M + cloruro cálcico, 0,04 M, pH 5,6, en un reactor encamisado con un agitador y un condensador de reflujo, después de lo cual, se añaden 90 g de L-serina y se solubilizan calentando a 45ºC. Todo el proceso se lleva a cabo bajo atmósfera de nitrógeno.

Una vez se ha completado la solubilización, se añaden 27 g de lecitina de huevo (contenido de PC \geq 95%); diez minutos después, se añaden 290 U de fosfolipasa D, tal como en el ejemplo 1, y se deja reaccionar durante 24 horas a 45ºC.

Una vez se ha completado la reacción, se descarga el reactor mediante la adición de 200 ml de una mezcla de n-hexano/isopropanol/agua (60/80/15) y se disuelve la masa mediante agitación, a continuación, se detiene la agitación y se deja que se separen las dos fases.

Se descarta la fase inferior.

La fase superior se lava con 150 ml de HCl 1 N y 30 ml de isopropanol a 5ºC.

La fase ácida se extrae con 180 ml de una mezcla de n-hexano/isopropanol/agua (60/80/15), a continuación, las dos fases orgánicas se lavan en cascada con una mezcla de 100 ml de agua y 130 ml de isopropanol.

Las fases orgánicas se concentran mediante vacío y se precipitan añadiendo lentamente una solución de 8 ml de acetato sódico 4,5 M en agua en 600 ml de etanol.

Se filtra y se seca.

Se obtienen 20,8 g de fosfatidilserina con un título superior al 95%, un contenido de ácido fosfatídico inferior al 5% y un índice de peróxido inferior a 5.

Ejemplo 4 Preparación de fosfatidilserina a partir de lecitina de soja cruda

Una vez se ha completado la solubilización, se añaden 27 g de lecitina de soja cruda (contenido total de fosfolípido del 75%; porcentaje de la composición PC 60,6/PE 29,5/PA 3,4/liso-PC 2,5/otros 3,9); 10 minutos después, se añaden 290 U de fosfolipasa D, tal como en el ejemplo 1, y se deja reaccionar durante 24 horas a 45ºC.

Una vez se ha completado la reacción, se descarga la solución mediante la adición al reactor de 200 ml de una mezcla de n-hexano/isopropanol/agua (60/80/15) y se disuelve la masa mediante agitación, a continuación, se detiene la agitación y se deja que se separen las dos fases.

Se descarta la fase inferior.

La fase superior se lava con 150 ml de HCl 1 N y 30 ml de isopropanol a 5ºC.

Se filtra y se seca.

Se obtienen 19 g de fosfatidilserina con un título del 83,5% (PA 7,7%, liso-PS 2,3%, PE 1,9%, otros 4,5%) y un índice de peróxido inferior a 5.

Ejemplo 5 Preparación de fosfatidil-D-serina

Se introducen 180 ml de tampón acetato, 0,2 M + cloruro cálcico, 0,04 M, pH 5,6, en un reactor encamisado con un agitador y un condensador de reflujo, después de lo cual, se añaden 90 g de D-serina y se solubilizan calentando a 45ºC. Todo el proceso se lleva a cabo bajo atmósfera de nitrógeno.

Una vez se ha completado la solubilización, se añaden 27 g de lecitina de soja purificada, tal como en el ejemplo 2; 10 minutos después, se añaden 290 U de fosfolipasa D, tal como en el ejemplo 1, y se deja reaccionar durante 24 horas a 45ºC.

Una vez se ha completado la reacción, se descarga el reactor mediante la adición de 200 ml de una mezcla de n-hexano/isopropanol/agua (60/80/15). Se disuelve la masa mediante agitación, a continuación, se detiene la agitación y se deja que se separen las dos fases.

Se descarta la fase inferior.

La fase superior se lava con 150 ml de HCl 1 N y 30 ml de isopropanol a 5ºC.

Se filtra y se seca.

Se obtienen 18,7 g de fosfatidil-D-serina con un título superior al 95%, un contenido de ácido fosfatídico inferior al 5% y un índice de peróxido inferior a 5.

Ejemplo 6 Fosfatidiletanolamina (PE) a partir de PC

Se introducen 200 ml de tampón acetato, 0,2 M + cloruro cálcico, 0,04 M, pH 5,6, en un reactor encamisado con un agitador y un condensador de reflujo. Todo el proceso se lleva a cabo bajo atmósfera de nitrógeno.

Se añaden 58 g de etanolamina y se ajusta el pH a 5,6 con ácido acético glacial a una temperatura fijada a 30ºC.

Al final de la operación, se calienta a 45ºC y se añaden 30 g de lecitina de soja purificada, tal como en el ejemplo 2. Después de 10 minutos, se añaden 325 U de fosfolipasa D, tal como en el ejemplo 1, y se deja reaccionar durante 24 horas a 45ºC.

Una vez se ha completado la reacción, se descarga el reactor mediante la adición de 400 ml de una mezcla de n-hexano/isopropanol/agua (60/80/15), a continuación, se detiene la agitación y se deja que se separen las dos fases.

Se descarta la fase inferior.

La fase superior se lava con 150 ml de HCl 1 N y 30 ml de isopropanol a 5ºC.

La fase ácida se extrae con 180 ml de una mezcla de n-hexano/isopropanol/agua (60/80/15), a continuación, las dos fases orgánicas se lavan en cascada con una mezcla de 100 ml de agua y 130 ml de isopropanol, y, posteriormente, con 100 ml de acetato sódico 1 N, y 130 ml de isopropanol.

Las fases orgánicas se concentran mediante vacío.

Se purifica por cromatografía en gel de sílice utilizando un cromatógrafo de presión axial con una columna de 1 l equilibrada con cloroformo/metanol (80/20); se lleva a cabo una elución en gradiente hasta llegar a cloroformo/metanol/agua (70/30/3).

Las fracciones puras se evaporan, se disuelven en 250 ml de ciclohexano y se liofilizan, obteniendo 24 g de un producto sólido amarillo pálido, sin ácido fosfatídico y lisoderivados, y más de un 99% puro.

Ejemplo 7 Preparación de fosfatidil-homoserina a partir de PC

Se introducen 180 ml de tampón acetato, 0,2 M + cloruro cálcico, 0,04 M, pH 5,6, en un reactor encamisado con un agitador y un condensador de reflujo, después de lo cual, se añaden 102 g de homoserina y se solubilizan calentando a 45ºC. Todo el proceso se lleva a cabo bajo atmósfera de nitrógeno.

Se descarta la fase inferior.

La fase superior se lava con 150 ml de HCl 1 N y 30 ml de isopropanol a 5ºC.

Se filtra y se seca.

Se obtienen 22,6 g de fosfatidil-homoserina, con un título superior al 95%, un contenido de ácido fosfatídico inferior al 5% y un índice de peróxido inferior a 5.

Ejemplo 8 Preparación de fosfatidil-hidroxiprolina a partir de PC

Se introducen 180 ml de tampón acetato, 0,2 M + cloruro cálcico, 0,04 M, pH 5,6, en un reactor encamisado con un agitador y un condensador de reflujo, después de lo cual, se añaden 112 g de hidroxiprolina y se solubilizan calentando a 45ºC. Todo el proceso se lleva a cabo bajo atmósfera de nitrógeno.

Se descarta la fase inferior.

La fase superior se lava con 150 ml de HCl 1 N y 30 ml de isopropanol a 5ºC.

Se filtra y se seca.

Se obtienen 18,4 g de fosfatidil-hidroxiprolina con un título superior al 95%, un contenido de ácido fosfatídico inferior al 5% y un índice de peróxido inferior a 5.

Ejemplo 9 Preparación de fosfatidilglicerol a partir de PC

Se añaden 80 g de glicerol; se calienta a 45ºC, a continuación, se añaden 30 g de lecitina de soja purificada, tal como en el ejemplo 2; después de 10 minutos, se añaden 325 U de fosfolipasa D, tal como en el ejemplo 1, y se deja reaccionar durante 24 horas a 45ºC.

Se descarta la fase inferior.

La fase superior se lava con 150 ml de HCl 1 N y 30 ml de isopropanol a 5ºC.

La fase ácida se extrae con 180 ml de una mezcla de n-hexano/isopropanol/agua (60/80/15), a continuación, las dos fases orgánicas se lavan en cascada con una mezcla de 100 ml de agua y 130 ml de isopropanol, y, posteriormente, con 100 ml de acetato sódico, 1 N, y 130 ml de isopropanol.

Las fases orgánicas se concentran mediante vacío.

Se realiza una purificación por cromatografía en gel de sílice utilizando un cromatógrafo de presión axial con una columna de 1 l equilibrada con cloroformo/metanol (80/20). Se lleva a cabo una elución en gradiente hasta llegar a cloroformo/metanol/agua (70/30/3).

Las fracciones puras se evaporan, se disuelven en 250 ml de ciclohexano y se liofilizan, obteniendo 22,2 g de un producto sólido blanco, sin ácido fosfatídico y lisoderivados, y con una pureza superior al 95%.

Se filtra y se seca.

Ejemplo 10 Recolección y recirculación de L-serina

Las aguas madres de la primera separación de la reacción enzimática, tal como en el ejemplo 2, se mantienen a una temperatura de 0ºC durante 24 horas, a continuación, se filtra el producto cristalizado. Se lava con etanol y se seca, dando lugar a agujas blancas de producto puro idéntico al original.

Se añade el déficit en cantidad (aproximadamente el 20%) y el producto se puede utilizar de forma normal.

Ejemplo 11 Ejemplos de composiciones farmacéuticas

(a) Cada cápsula gelatinosa contiene:
fosfatidilserina	100,0 mg
aceite vegetal	270,0 mg
lecitina de soja	30,0 mg
(b) Cada vial de inyectable contiene:
fosfatidilserina	50,0 mg
manitol	100,0 mg
lecitina de soja (grado inyectable)	7,5 mg
tampón fosfato	2,2 mg
agua	c.s.a. 2,0 ml

Ejemplo 12 Ejemplos de suplementos alimenticios y dietéticos

(a) Cada cápsula gelatinosa contiene:
fosfatidilserina	100,0 mg
vitamina E	5,0 mg
aceite vegetal	295,0 mg
(b) Cada sobrecito contiene:
fosfatidilserina	100,0 mg
creatina	1,5 g
beta-caroteno	0,6 mg
vitamina E	5,0 mg
vitamina C	30,0 mg
vitamina B1	0,7 mg
vitamina B6	1,0 mg
vitamina B12	0,5 mcg
ácido fólico	0,1 mg
(c) Cada pastilla masticable contiene:
fosfatidilserina	75,0 mg
vitamina E	5,0 mg
vitamina C	30,0 mg
vitamina B1	0,7 mg
vitamina B6	1,0 mg
vitamina B12	0,5 mcg
ácido fólico	0,1 mg

Ejemplo 13 Ejemplos de composiciones cosméticas

(a) Cada tubo de crema corporal contiene:
fosfatidilserina	4,0 g
macadamia ternifolia	2,0 g
hialuronato sódico	10,0 mg
ceteariloctanoato	8,0 g
triglicérido caprílico/capricho	7,0 g
sorbitol	5,0 g
cetearil alcohol	4,0 g
polisorbato 20	1,0 g
carbómero	0,8 g
deshidroacetato sódico	0,4 g
EDTA disódico	0,3 g
antioxidante (tocoferol)	50,0 mg
agua	c.s.a. 100,0 ml
(b) Cada tubo de ungüento corporal contiene:
fosfatidilserina	3,0 g
colesterol	2,0 g
hialuronato sódico	10,0 mg
ceteariloctanoato	9,0 g
triglicérido caprílico/cáprico	7,0 g
sorbitol	7,0 g
cetearil alcohol	3,5 g
polisorbato 20	1,0 g
carbómero	0,6 g
deshidroacetato sódico	0,5 g
EDTA disódico	0,3 g
antioxidante (tocoferol)	50,0 mg
agua	c.s.a. 100,0

Claims

1. Proceso para la preparación de fosfátidos con la fórmula (I):

(I)R-O-PO(OH)-O-R_{1}

en la que R es un diacilglicerol y R_{1} es un grupo alcohólico, cuyo proceso comprende:

la reacción de un fosfátido de la fórmula (II): R-O-PO(OH)-O-R_{2},en la que R representa lo mismo que antes y R_{2} es CH_{2}-CH_{2}-NH_{2} y/o CH_{2}-CH_{2}-N(CH_{3})_{3}, con un alcohol primario o secundario con una longitud de cadena de C2 a C4, posiblemente sustituido por uno o más grupos polares seleccionados del grupo formado por amino, hidroxilo y carboxilo, en una fase únicamente acuosa en presencia de fosfolipasa D con una actividad de transfosfatidilación producida a partir de una cepa de Streptomyces hachijoense.

2. Proceso, según la reivindicación 1, en el que el diacilglicerol contiene dos ácidos grasos, que pueden ser iguales o diferentes, saturados o insaturados, con una longitud entre C12 y C14.

3. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la temperatura de reacción es 45ºC\pm5ºC.

4. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la fosfolipasa D se purifica en una resina de intercambio aniónico o catiónico.

5. Proceso, según la reivindicación 4, en el que la fracción de fosfolipasa D utilizada se eluye de la resina de intercambio catiónico a pH 6,2.

6. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la cepa de Streptomyces hachijoense es ATCC 19769.

7. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el fosfátido de fórmula (I) es fosfatidil-D-serina, fosfatidiletanolamina, fosfatidil-homoserina, fosfatidil-hidroxiprolina o fosfatidilglicerol.

8. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el fosfátido de fórmula (I) es fosfatidil-L-serina y el fosfátido de fórmula (II) es lecitina de soja cruda o purificada.

9. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el fosfátido de fórmula (I) es fosfatidil-L-serina y el fosfátido de fórmula (II) es lecitina de huevo.

10. Producto de fosfatidil-L-serina obtenible mediante el proceso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que tiene una composición de ácidos grasos idéntica a la de la lecitina de soja o de huevo y un grado de peroxidación inferior a 5.

11. Composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un fosfátido de fórmula (I) obtenible mediante el proceso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. Composición cosmética que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un fosfátido de fórmula (I) obtenible mediante el proceso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

13. Suplemento alimenticio y dietético que comprende un vehículo y un fosfátido de fórmula (I) obtenible mediante el proceso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

14. Suplemento alimenticio y dietético, según la reivindicación 13, en el que el fosfátido de fórmula (I) es fosfatidil-L-serina.

15. Composición farmacéutica, según la reivindicación 11, o suplemento alimenticio y dietético, según las reivindicaciones 13 ó 14, que tiene una composición de ácidos grasos idéntica a la de la lecitina de huevo o de soja, un grado de peroxidación inferior a 5 y un grado elevado de palatabilidad en términos de sabor y olor.

16. Composición cosmética para aplicación tópica en la piel, que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y fosfatidil-L-serina obtenible mediante el proceso, según la reivindicación 1, que tiene una composición de ácidos grasos idéntica a la de la lecitina de huevo o de soja, y un grado de peroxidación inferior a 5.

17. Utilización de un fosfátido de fórmula (I), obtenible según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la preparación de una composición farmacéutica o de un suplemento alimenticio o dietético para el tratamiento del estrés psicofísico, la falta de atención, concentración y memoria, frecuentemente asociadas con la edad avanzada.

18. Utilización de un fosfátido de fórmula (I), obtenible según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la preparación de una composición cosmética para el tratamiento de dermatitis o de piel con disfunciones fisiológicas.

19. Composición farmacéutica o suplemento alimenticio o dietético, según la reivindicación 15, en forma de cápsula, pastilla o gránulo.

20. Composición cosmética, según la reivindicación 16, en forma de crema o gel.