ES2233208B1

ES2233208B1 - Metodo para la preparacion enzimatica de compuestos antioxidantes.

Info

Publication number: ES2233208B1
Application number: ES200302791A
Authority: ES
Inventors: Arian Geerlings; Pedro Luis Benitez Sanchez; Deyanira Rondon Rodriguez; Luis Perez Martinez; Juan Carlos Morales Sanchez; Maria Jesus Guardia Alba; Miguel Angel Moreno Valle; Julio Boza Puerta; Jesus Jimenez Lopez
Original assignee: Puleva Biotech SA
Current assignee: Biosearch SA
Priority date: 2003-11-27
Filing date: 2003-11-27
Publication date: 2006-10-01
Anticipated expiration: 2023-11-27
Also published as: ES2233208A1

Abstract

Método para la preparación enzimática de compuestos antioxidantes. La invención proporciona un método ésteres de hidroxitirosol, representados por la fórmula 1, donde R1 se selecciona del grupo formado por los radicales OCOalquilo y OCOalquenilo, que comprende las siguientes etapas: a) preparar un extracto enriquecido en hidroxitirosol a partir de aceituna, pulpa de aceituna, hojas de olivo, o de los restos líquidos o sólidos del prensado del aceite de oliva, b) hacer reaccionar el extracto preparado en la etapa a) con una fuente alquílica o alquenílica en presencia de una enzima lipasa o esterasa y, c) opcionalmente, purificar el éster de hidroxitirosol de la mezcla de reacción obtenida en la etapa b); así como un suplemento dietético que comprende un extracto que contiene dichos ésteres de hidroxitirosol.

Description

Método para la preparación enzimática de compuestos antioxidantes.

Campo de la invención

La invención se relaciona, en general, con un método para la preparación de moléculas antioxidantes a partir de hidroxitirosol natural, extraído del fruto o de las hojas del olivo. El producto obtenido es útil para la preparación de ingredientes alimenticios, nutracéuticos y medicinas.

Antecedentes de la invención

Es bien conocido que el stress oxidativo y la generación de radicales libres son factores determinantes en la aparición de enfermedades hepáticas y renales, debido a la presencia de elevadas cantidades de oxígeno en estos órganos. Así mismo, es conocida la acción del oxígeno como inductor de procesos inflamatorios en numerosas situaciones. Por esta razón, la presencia de antioxidantes en la dieta puede ser determinante para la prevención de este tipo de patologías.

El aceite de oliva es un producto saludable que es rico en ácido oleico y antioxidantes. El tirosol y el hidroxitirosol (también llamado 2-(3,4-dihidroxifenil) etilo) son compuesto fenólicos obtenidos a partir del olivo y que presentan una elevada capacidad antioxidante que ha sido demostrada tanto en estudios in vitro como in vivo. Algunos autores (Masella et al. 2001, Lipids 36, 1195-1202) han determinado que el papel potencialmente favorable ejercido por el hidroxitirosol en la prevención y tratamiento de enfermedades cardiovasculares se debe a la reducción de la susceptibilidad de las LDL lipoproteínas a la oxidación. También se ha sugerido, en base a estudios en animales, que el hidroxitirosol podría reducir la peroxidación de los lípidos en microsomas hepáticos y que el hidroxitirosol podría tener un potente efecto anti-inflamatorio.

El hidroxitirosol es una molécula que se oxida fácilmente y, por tanto, su uso en forma de extractos obtenidos a partir de hoja o fruto de olivo puede presentar el problema de que una proporción importante del hidroxitirosol se encuentre oxidado en la matriz alimenticia y, como consecuencia de esta oxidación, no sea capaz de ejercer su función final en el consumidor. Por lo tanto, resulta sumamente beneficioso el desarrollo de compuestos y procesos (WO 03082798 y WO 03082259) que faciliten la estabilidad del de forma que éste pueda alcanzar inalterado el organismo del consumidor y ejercer allí su actividad antioxidante.

Por otro lado, el hidroxitirosol es una molécula de carácter polar y por tanto es soluble en solventes acuosos y escasamente liposoluble.

En la técnica se han descrito procesos para la preparación de ésteres de hidroxitirosol por síntesis química
(WO 03082798 y WO 03082259). La naturaleza de esta síntesis química implica una escasa selectividad dando lugar a la producción de ésteres localizados en grupos hidroxilo no deseados. Por tanto, cuando se realiza esta síntesis química es conveniente realizar una purificación posterior con el fin de obtener el éster deseado con la suficiente pureza.

Se conoce en la técnica un proceso enzimático para la esterificación de compuestos fenólicos (Buisman et al. 1998, Biotechnology Letters 20 (2), 131-136). Estos autores describen la preparación de un octanoil éster de hidroxitirosol mediante un proceso de esterificación enzimática utilizando hidroxitirosol puro y ácido octanoico.

El hidroxitirosol es un buen candidato para su uso como agente efectivo en la prevención y tratamiento de enfermedades cardiovasculares de tipo agudo y crónico así como para enfermedades hepáticas, renales e inflamatorias. Estas aplicaciones se pueden realizar tanto en forma de fármaco como de ingrediente alimenticia, ya que el hidroxitirosol evita el estrés oxidativo y, por tanto, la producción de sustancias pro-inflamatorias y la acumulación de células implicadas en estos procesos. Sin embargo, el uso de hidroxitirosol como antioxidante útil para la prevención de estas enfermedades presenta dos problemas:

1) el hidroxitirosol se oxida con mucha facilidad en la matriz alimenticia o en la formulación farmacéutica.

2) el hidroxitirosol es escasamente soluble en productos alimenticios de alto contenido en grasas.

Una posible solución a estos problemas se presentó en nuestras solicitudes de patente internacional WO 03082798 y WO 03082259. En estas solicitudes se describen moléculas de hidroxitirosol modificadas (ésteres de hidroxitirosol) que son más estables que el hidroxitirosol y más solubles en un alimento de alto contenido en grasas. Estos compuestos, cuando se consumen oralmente, se hidrolizan en el estómago o en el intestino debido al ambiente ácido presente en estos órganos, liberando hidroxitirosol y la cadena lateral protectora. Por tanto, los ésteres de hidroxitirosol presentan la misma actividad biológica que el hidroxitirosol no modificado.

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Esquema I

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El éster de hidroxitirosol acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (111) se hidroliza en el tracto digestivo tras su consumo por vía oral, liberando hidroxitirosol (II) y ácido acético. Esta hidrólisis ocurre de forma espontánea en un ambiente ácido (pH<2).

Los ésteres de hidroxitirosol que se mencionan en WO 03082798 y WO 03082259 presentan la estructura común que se represente por la fórmula (1), donde el grupo representa distintas cadenas laterales que generan diferentes esteres de hidroxitirosol. El grupo R_{1} contiene un grupo hidroxilo protegido por una cadena de ácido graso unida por medio de un enlace tipo éster, con una longitud de entre 2 y 22 átomos de carbono.

2

Como un ejemplo más concreto, algunos de los ésteres de hidroxitirosol descritos son:

(1) acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (III): R_{1} es un grupo hidroxilo protegido con ácido acético a través de un enlace tipo éster.

(2) estearato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (IV): R_{1} es un grupo hidroxilo protegido con ácido esteárico a través de un enlace tipo éster.

(3) oleato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (V): R_{1} es un grupo hidroxilo protegido con ácido oléico a través de un enlace tipo éster.

(4) eicosapentanoato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (VI): R_{1} es un grupo hidroxilo protegido con ácido eicosapentanoico a través de un enlace tipo éster.

(5) docosahexanoato de 2-(3,4-dihidroxifenil) etilo (VII): R_{1} es un grupo hidroxilo protegido con ácido docosahexanoico a través de un enlace tipo éster.

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Esquema II

3

Adicionalmente, el hidroxitirosol, también llamado 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo, se representa por la estructura II.

Existe, por tanto, una necesidad en la técnica, de métodos para la preparación de los ésteres de hidroxitirosol mencionados anteriormente que superen las desventajas de la síntesis química de ésteres de hidroxitirosol que se describe en WO 03082798 y WO 03082259.

Breve descripción de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un método para la preparación enzimática de ésteres de hidroxitirosol, que mejore el procedimiento de síntesis química de dichos compuestos.

Un objeto adicional es proporcionar un suplemento dietético que comprende un extracto que contiene dichos ésteres de hidroxitirosol.

Finalmente, otro objeto de la invención es el empleo de las enzimas lipasa y esterasa en la preparación de ésteres de hidroxitirosol.

Descripción de la figura

Figura 1. Estabilidad del acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (III) y del hidroxitirosol (II) frente a la oxidación, cuando estos compuestos se incorporan en una matriz alimenticia oleosa y se incuban a 120ºC.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un procedimiento para la preparación de ésteres de hidroxitirosol, representados por la fórmula I,

4

donde R_{1} se selecciona del grupo formado por los radicales OCOalquilo y OCOalquenilo, que comprende las siguientes etapas:

a): preparar un extracto enriquecido en hidroxitirosol a partir de aceituna, pulpa de aceituna, hojas de olivo, o de los restos líquidos o sólidos del prensado del aceite de oliva,

b): hacer reaccionar el extracto preparado en la etapa a) con una fuente alquílica o alquenílica en presencia de una enzima lipasa o esterasa y,

c): opcionalmente, purificar el éster de hidroxitirosol de la mezcla de reacción obtenida en la etapa b).

El procedimiento de la invención para la preparación de ésteres de hidroxitirosol presenta varias ventajas con respecto a los métodos de síntesis química descritos en el estado de la técnica (WO 03082798 y WO 03082259); así, los ésteres de hidroxitirosol se obtienen a partir de una fuente natural, el procedimiento es limpio y respetuoso con el medio ambiente, el procedimiento, así como los ésteres de hidroxitirosol son adecuados para la preparación de alimentos y, más importante, la reacción enzimática que tiene lugar en el procedimiento de la invención es específica para generar enlaces éster entre los ésteres o ácidos alquílicos o alquenílicos y el grupo OH presente en la cadena lateral etanólica, y no en los grupos OH de la parte fenólica del hidroxitirosol.

Según la presente invención la primera etapa del procedimiento consiste en la preparación de un extracto enriquecido en hidroxitirosol a partir de aceituna, pulpa de aceituna, hojas de olivo, o de los restos líquidos o sólidos del prensado del aceite de oliva.

En una realización particular de esta etapa de la invención, el hidroxitirosol presente en el extracto acuoso de la pulpa de aceituna o de las hojas de olivo, se solubiliza por la adición de un ácido. Tras la neutralización del pH, el hidroxitirosol se extrae de la fase acuosa empleando disolventes orgánicos o acuosos. Preferentemente, el pH a que se efectúa dicha hirólisis ácida es de 1 o menor.

El empleo de hidroxitirosol directamente obtenido de extracto de aceituna u hojas de olivo en el presente procedimiento presenta la ventaja de provenir de una fuente natural, en contraste con el hidroxitirosol empleado por Buisman et al., que emplea hidroxitirosol obtenido por síntesis química. Así, si los ésteres de hidroxitirosol van a ser empleados en composiciones alimenticias, la utilización de hidroxitirosol sintético puede no ser adecuado para la preparación de productos alimenticios.

En la segunda etapa del procedimiento de la presente invención, el extracto obtenido anteriormente se hace reaccionar mediante catálisis enzimática, con lipasa o esterasa, para transformar el hidroxitirosol en ésteres de hidroxitirosol.

Esquema III

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R_{2} representa un hidrogeno, un grupo metilo o un grupo etilo y R_{3} representa una cadena alquílica o alquenílica de entre 2 y 22 átomos de carbono.

En una realización particular de esta etapa del procedimiento de la invención, la fuente alquílica o alquenílica es un ácido carboxílico o un éster de dicho ácido carboxílico. Preferentemente los ácidos carboxílicos se seleccionan del grupo formado por ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido palmítico, ácido oleico, ácido esteárico, ácido eicosapentanoico, ácido docosahexanoico, cualquiera de sus mezclas, un producto natural que contenga cualquiera de estos ácidos y sus mezclas. Preferentemente los ésteres de los ácidos carboxílicos se seleccionan del grupo formado por acetato de metilo, propionato de metilo, butirato de metilo, palmitato de metilo, oleato de metilo, estearato de metilo, eicosapentanoato de metilo, docosahexanoato de metilo, cualquiera de sus mezclas, un producto natural que contenga cualquiera de estos ésteres y sus mezclas; o del grupo formado por acetato de etilo, propionato de etilo, butirato de etilo, palmitato de etilo, oleato de etilo, estearato de etilo, eicosapentanoato de etilo, docosahexanoato de etilo, cualquiera de sus mezclas, un producto natural que contenga cualquiera de estos ésteres y sus mezclas. Es preferible el empleo de estos ésteres de ácidos carboxílicos como substrato ya que el procedimiento presenta varias ventajas como son el que como sub-producto se obtiene etanol, metano) u otros alcoholes volátiles dependiendo del tipo de éster empleado. Si la reacción se efectúa en condiciones de presión reducida, los alcoholes volátiles se evaporan rápidamente favoreciendo la reacción de esterificación, lo cual se traduce en la obtención de rendimientos más altos de ésteres de hidroxitirosol.

En otra realización particular de esta etapa del procedimiento de la invención, los ésteres de hidroxitirosol obtenidos se seleccionan de entre acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (III), estearato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (IV), oleato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (V), eicosapentanoate de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (VI), o docosahexanoato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (VII).

Finalmente, en otra realización particular de esta segunda etapa del procedimiento de la invención, la lipasa o la esterasa está presente en uno o más compuestos derivados de un caldo de fermentación de un microorganismo, o en uno o más compuestos derivados de un extracto celular del microorganismo, o en un soporte sólido que inmoviliza uno a más compuestos derivados de un caldo de cultivo del microorganismo, o en un soporte sólido que inmoviliza uno o más compuestos derivados de un extracto celular del microorganismo. Preferiblemente el microorganismo que produce la lipasa o la esterasa es un hongo o bacteria filamentosa. Más preferiblemente es una levadura, y aún más preferiblemente una levadura del género Cándida. Es conveniente realizar esta etapa del procedimiento de la invención en condiciones de presión reducida.

Una ventaja del procedimiento de la invención con respecto a los métodos de síntesis química de los derivados del hidroxitirosol descritos en WO 03082798 y WO 03082259 consiste en que dicha síntesis química es un procedimiento caro y que no es apropiado para la preparación de ingredientes alimenticios. Más aún, la síntesis química no es muy específica en la introducción de enlaces éster en un grupo OH específico. El método de la presente invención no presenta estos inconvenientes.

En la tercera etapa del procedimiento de la presente invención, que es opcional, el éster de hidroxitirosol de la mezcla de reacción obtenida en la etapa anterior es purificado.

La purificación puede realizarse por separación cromatográfica, electrodiálisis o destilación. Preferentemente la purificación se realiza por cromatografía de columna, y más preferentemente por cromatografía de columna y empleando material de columna absorbente hidrofóbico.

En una realización particular, el procedimiento de la invención comienza con el tratamiento del extracto acuoso de la pulpa de aceituna o de hojas de olivo con un ácido inorgánico fuerte, como por ejemplo el ácido sulfúrico, de tal forma que el pH del extracto alcanza valores de 1 o menores que 1. El tratamiento ácido es útil porque aumenta el contenido en hidroxitirosol del extracto acuoso al hidrolizar hidroxitirosol de otras estructuras, como oleuropeína. Tras 30 minutos de tratamiento ácido, el pH del extracto acuoso se ajusta a valores entre 7 y 8 por la adición de hidróxido sódico. A continuación, el hidroxitirosol se extrae con disolvente orgánico, como por ejemplo acetato de etilo, se seca por evaporación y se disuelve en agua. El extracto así obtenido presenta una riqueza en hidroxitirosol del 60 al 70%.

En la segunda etapa del procedimiento de la invención, el hidroxitirosol extraído se esterifica mediante catálisis enzimática, empleando una lipasa o esterasa, para formar ésteres de hidroxitirosol (ver esquema III). En función del tipo de compuesto que se quiera obtener, se emplearán diferentes ésteres alquílicos o alquenílicos en esta conversión enzimática. Por ejemplo, para la preparación de acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (III), en la segunda etapa se realiza la adición de acetato de etilo a la solución de hidroxitirosol purificado en presencia de una lipasa o esterasa. Ambas enzimas catalizan la formación de un enlace éster entre el alcohol primario del hidroxitirosol y el grupo carbonilo del éster alquílico o alquenílico, generando el éster de hidroxitirosol.

En la tercera y última etapa del procedimiento de la invención, los ésteres de hidroxitirosol son purificados por cromatografía de columna, destilación o electrodiálisis.

En caso de que la purificación se realice por cromatografía de columna, se emplea preferentemente como material de columna un absorbente hidrofóbico. La solución acuosa que contiene el éster de hidroxitirosol se añade a la columna, de tal forma que el éster de hidroxitirosol purificado es eluído. Si se emplea electrodiálisis para purificar el hidroxitirosol, los contaminantes polares se separan de la disolución mediante un campo eléctrico.

El producto obtenido por cualquiera de los métodos de purificación mencionados anteriormente, puede presentar una pureza superior al 95%.

Después de efectuar la purificación, los ésteres de hidroxitirosol pueden ser extraídos con un disolvente orgánico y secados para obtener un polvo. El producto obtenido es útil para la preparación de píldoras y comprimidos, así como para la preparación de nutracéuticos o de aditivos o ingredientes alimenticios.

Un segundo objeto de la presente invención es proporcionar un suplemento dietético que comprende un extracto que contiene los ésteres de hidroxitirosol. Preferentemente el suplemento comprende un éster o mezcla de ésteres de hidroxitirosol e hidroxitirosol en una relación en peso de 5:1 a 50:1, siendo los ésteres preferidos acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo, estearato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo, oleato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo, eicosapentanoato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo y docosahexanoato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo.

El suplemento dietético puede presentarse en forma de polvo, en forma de píldora, de comprimido, de nutracéutico o de ingrediente alimenticio. Dicho complemento dietético puede emplearse, por tanto, para la preparación de una composición alimenticia. Pudiendo ser la composición alimenticia, leche, leche aromatizada, yogurt, un producto láctico fermentado, leche en polvo, mantequilla, queso, margarina, mayonesa, grasa, un producto de charcutería, pan, tarta, un producto de pastelería, una galleta, un dulce, goma de mascar, un producto alimenticio infantil, alimento deshidratado, zumo o un producto de nutrición hospitalario.

Finalmente, un último objeto de la invención es el empleo de las enzimas lipasa y esterasa en la preparación de ésteres de hidroxitirosol.

Los siguientes ejemplos se presentan como ilustración de la presente invención:

Ejemplos Ejemplo 1 Extracción y purificación de hidroxitirosol

Una muestra de 300 g de un extracto acuoso obtenido durante la extracción a presión de aceite de oliva se mezcla con 600 g de agua y 36 g de ácido sulfúrico (96%). La pasta formada se calienta a 70ºC bajo agitación continuadurante 30 min. A continuación la fase acuosa se separa se separa de los restos sólidos mediante filtración. La solución acuosa se extrae con 500 ml de acetato de etilo y la fase orgánica se filtra a través de sulfato sódico anhidro para eliminar los restos de agua. Tras eliminar el solvente orgánico aplicando presión reducida, se obtienen 1,67 g de un extracto que contiene un 60% de hidroxitirosol.

Ejemplo 2 Preparación de acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (III)

Se prepara una solución de un extracto enriquecido en hidroxitirosol (100 mg) en acetonitrilo (40 ml), y se le añade vinagre (6 ml, conteniendo un 5% de ácido acético) y 20 mg de lipasa (Novozyme 435). La mezcla se agita suavemente a 37ºC durante 24 horas y a continuación se filtra y se evapora a sequedad reduciendo la presión progresivamente. El residuo se purifica por cromatografía en columna usando agua como eluyente y produciendo 89 mg de una mezcla de acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo e hidroxitirosol (ratio 15:1) en forma de un jarabe transparente.

RMN-^{1}H (300 mHz, CDCl_{3}): 6.78 (d, J=8.1 Hz, 1H, aromático), 6.73 (d, J=1.5 Hz, 1H, aromático), 6.63 (dd, J=8.0, 1.5 Hz, 1H, aromático), 4.23 (t, J=7.1 Hz, 2H, -CH_{2}OOO-), 2.81 (t, J=7.1 Hz, 2H, ar-CH_{2}-), 2.03 (s, 3H, -CH_{3}).

Ejemplo 3 Preparación de oleato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (V)

Se añaden 20 mg de lipasa (Novozyme 435) a una solución de extracto de olivo enriquecido en hidroxitirosol (100 mg) en 3.5 mL de oleato de etilo. La mezcla se agita suavemente a 37ºC durante 24 horas y bajo una presión reducida para facilitar la eliminación del etanol formado como sub-producto. A continuación se equilibra con presión atmosférica y se filtra la mezcla. El exceso de oleato de etilo se elimina sometiendo la mezcla a alto vacío. Finalmente, el residuo se seca completamente a alto vacío para producir 186 mg de un jarabe transparente de oleato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo.

RMN-^{1}H (300 mHz, CDCl_{3}): 6.78 (d, J=8.1 Hz, 1H, aromático), 6.72 (d, J=2, 1H, aromático), 6.63 (dd, J=8.0, 2.0 Hz, 1H, aromático), 5.34 (m, 2H, HC=CH), 4.23 (t, J=7.1 Hz, 2H, -CH_{2}OOC-), 2.80 (t, J=7.1 Hz, 2H, ar-CH_{2}-), 2.28 (t, J=7.6 Hz, 2H, -OOC-CH_{2}-), 1.99 (m, 4H, -CH_{2}-HC=CH-CH_{2}-), 1.58 (m, 2H, - OOC-CH_{2}-CH_{2}-), 1.26 (m, 26H, -CH_{2}-), 0.87 (t, J=6.9, 3H, -CH_{3}).

Ejemplo 4 Estabilidad del acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo

La estabilidad del hidroxitirosol (II) y del acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil) etilo (III) se comprueba pasando una corriente de aire seco (\sim 20 L/h) a través de una solución del compuesto (5 mg) en aceite de girasol refinado (5 mL) situada en un reactor calentado a 120ºC. Tras diferentes tiempos de incubación en estas condiciones, se toman muestras del aceite y se analiza la concentración de hidroxitirosol y de acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC, en la terminología inglesa) con detección por UV a 254 y 280 nm. Los resultados muestran claramente que el acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo es más estable que el hidroxitirosol en las condiciones analizadas (Figura 1). Por ejemplo, tras 4 horas de incubación, la cantidad de acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo que permanece en el aceite es el doble de la que permanece de hidroxitirosol en las mismas condiciones.

Ejemplo 5 Biodisponibilidad del acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo

La absorción de hidroxitirosol y la capacidad del acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo y del estearato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo de liberar hidroxitirosol se estudia utilizando ratones como modelo experimental. Para ello, se administran por vía oral cantidades equivalentes de cada compuesto (10 mg de hidroxitirosol, 13 mg de acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo y 23 mg de estearato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo). Se toman muestras de sangre de los ratones 15 y 60 minutos después de dicha administración. Los compuestos fenólicos presentes en cada muestra de sangre se determinan mediante extracción del plasma con acetato de etilo y posterior análisis por cromatografía de gases combinada con espectrometría de masas.

Los resultados obtenidos se muestran en la tabla I. Tanto a los 15 como a los 60 minutos tras la administración de acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo como de estearato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo, la cantidad de hidroxitirosol en plasma es muy similar a la detectada cuando se administra hidroxitirosol no esterificado.

TABLA 1

Compuesto administrado	Hidroxitirosol en	Hidroxitirosol en
	plasma, 15 min.	plasma, 60 min.
Hidroxitirosol	0.79 mg/L	0.05 mg/L
Acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo	0.68 mg/L	0.06 mg/L
Estearato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo	0.74 mg/L	0.04 mg/L

Estos resultados indican que tanto el acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo como el estearato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo son capaces de liberar hidroxitirosol en el estómago o en el intestino de los ratones y que éste puede ser absorbido y puede pasar al flujo sanguíneo.

Ejemplo 6 Preparación de un producto con base mantequilla conteniendo compuestos antioxidantes

Se prepara una mantequilla con una fórmula equilibrada nutricionalmente y que contiene los siguientes ingredientes (tabla II):

TABLA II

Ingredientes	Cantidad por kg
Mantequilla	200 g
Mezcla de aceites	208 g
Almidón	8 g
Caseinato	6 g
Emulgentes	2 g
Maltodextrina	6 g
Agua	570 g
Oleato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo	150 mg

Procedimiento

Se prepara en primer lugar la fase acuosa conteniendo los compuestos hidrosolubles. Los emulgentes y el oleato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo se disuelven en la mezcla de aceites. A continuación se incorpora la fase acuosa en la fase grasa por adición continua a altas temperaturas y con agitación. Esta mezcla se pasteuriza usando un cambiador de calor. El producto final se obtiene utilizando un rotor de alta velocidad que incorpora un sistema de enfriamiento externo.

Ejemplo 7 Preparación de un producto con base leche con acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo

Se prepara un producto con base leche utilizando los ingredientes que se indican en la tabla III:

TABLA III

Ingrediente	Cantidad por litro
Leche desnatada	960 g
Leche desnatada en polvo	17 g
Extracto que contiene acetato de 2-(3,4-Dihidroxifenil)etilo	100 mg
Fosfato Bisódico	0.5 g
Fosfato Tripotásico	0.2 g
Agua	2 g
Vitamina B6	3 mg
Vitamina B12	3.8 \mug
Vitamina A	1200 \mug
Vitamina D	7.5 \mug
Vitamina E	15 mg
Ácido fólico	300 \mug

Procedimiento

Se mezclan todos los ingredientes sólidos con la leche líquida y el agua. A continuación se añade el acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo y la mezcla se homogeniza en ausencia de oxígeno. El producto lácteo resultante se somete a tratamiento U.H.T (150ºC durante 4 a 6 segundos) y se envasa finalmente en ausencia de oxígeno.

Claims

1. Un procedimiento para la preparación de ésteres de hidroxitirosol, representados por la fórmula I,

6

2. Un procedimiento según la etapa 1, donde los radicales OCOalquilo o OCOalquenilo se seleccionan del grupo formado por aquellos radicales OCOalquilo o OCOalquenilo que contienen de 2 a 7 y de 9 a 22 átomos de carbono por radical.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, donde la fuente alquílica o alquenílica se selecciona del grupo formado por ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido palmítico, ácido oleico, ácido esteárico, ácido eicosapentanoico, ácido docosahexanoico, cualquiera de sus mezclas, un producto natural que contenga cualquiera de estos ácidos y sus mezclas.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1, donde la fuente alquílica o alquenílica se selecciona del grupo formado por acetato de metilo, propionato de metilo, butirato de metilo, palmitato de metilo, oleato de metilo, estearato de metilo, eicosapentanoato de metilo, docosahexanoato de metilo, cualquiera de sus mezclas, un producto natural que contenga cualquiera de estos ésteres y sus mezclas.

5. Un procedimiento según la reivindicación 1, donde la fuente alquílica o alquenílica se selecciona del grupo formado por acetato de etilo, propionato de etilo, butirato de etilo, palmitato de etilo, oleato de etilo, estearato de etilo, eicosapentanoato de etilo, docosahexanoato de etilo, cualquiera de sus mezclas, un producto natural que contenga cualquiera de estos ésteres y sus mezclas.

6. Un procedimiento según la reivindicación 1, donde los ésteres de hidroxitirosol se seleccionan de entre acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (III), estearato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (IV), oleato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (V), eicosapentanoate de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (VI), o docosahexanoato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (VII).

7. Un procedimiento según la reivindicación 1, donde el extracto enriquecido en hidroxitirosol se obtiene por hidrólisis ácida seguida por extracción con mezclas orgánicas o acuosas.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, donde dicha hidrólisis ácida se realiza a un pH de 1 o menor.

9. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde la lipasa o la esterasa está presente en uno o más compuestos derivados de un caldo de fermentación de un microorganismo, o en uno o más compuestos derivados de un extracto celular del microorganismo, o en un soporte sólido que inmoviliza uno a más compuestos derivados de un caldo de cultivo del microorganismo, o en un soporte sólido que inmoviliza uno o más compuestos derivados de un extracto celular del microorganismo.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, donde el microorganismo que produce la lipasa o la esterasa es un hongo o bacteria filamentosa.

11. Un procedimiento según la reivindicación 9, donde el microorganismo que produce la lipasa o la esterasa es una levadura.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11, donde el microorganismo que produce la lipasa o la esterasa es una levadura del género Cándida.

13. Un procedimiento según la reivindicación 1, donde dicha reacción con lipasa o esterasa se realiza en condiciones de presión reducida.

14. Un procedimiento según la reivindicación 1, donde dicha purificación se realiza por separación cromatográfica, electrodiálisis o destilación.

15. Un procedimiento según la reivindicación 14, donde dicha separación cromatográfica se realiza por cromatografía de columna empleando material de columna absorbente hidrofóbico.

16. Un suplemento dietético que comprende un extracto que contiene acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo e hidroxitirosol en una relación en peso de entre 5:1 a 50:1.

17. Un suplemento dietético que comprende un extracto que contiene estearato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo e hidroxitirosol en una relación en peso de entre 5:1 a 50:1.

18. Un suplemento dietético que comprende un extracto que contiene oleato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo e hidroxitirosol en una relación en peso de entre 5:1 a 50:1.

19. Un suplemento dietético que comprende un extracto que contiene eicosapentanoato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo e hidroxitirosol en una relación en peso de entre 5:1 a 50:1.

20. Un suplemento dietético que comprende un extracto que contiene docosahexanoato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo e hidroxitirosol en una relación en peso de entre 5:1 a 50:1.

21. Un suplemento dietético según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, donde dicho suplemento está en forma de polvo.

22. Un suplemento dietético según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, donde dicho suplemento está en la forma de una píldora, de un comprimido, de un nutracéutico o de un ingrediente alimenticio.

23. Empleo de un suplemento dietético según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20 para la preparación de una composición alimenticia.

24. Un suplemento dietético según la reivindicación 23, donde dicha composición alimenticia es leche, leche aromatizada, yogurt, un producto láctico fermentado, leche en polvo, mantequilla, queso, margarina, mayonesa, grasa, un producto de charcutería, pan, tarta, un producto de pastelería, una galleta, un dulce, goma de mascar, un producto alimenticio infantil, alimento deshidratado, zumo o un producto de nutrición hospitalario.

25. Empleo de las enzimas lipasa y esterasa para la preparación de ésteres de hidroxitirosol de fórmula I.