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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der menschlichen und tierischen
Ernährung,
und insbesondere Zusammensetzungen, die konjugierte Linolsäuren (CLA)
enthalten.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
konjugierte Linolsäure
(CLA) ist in den Brennpunkt zahlreicher Forschungsprogramme gerückt, in denen
nach Möglichkeiten
gesucht wird, einen Nutzen aus ihren ernährungsmäßigen, therapeutischen und pharmakologischen
Eigenschaften zu ziehen.
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Es
ist gezeigt worden, dass die Umlagerung der Doppelbindungen von
Linolsäure
in konjugierte Positionen während
einer Behandlung mit Katalysatoren wie Nickel oder Alkali bei hohen
Temperaturen und während
einer Autooxidation erfolgt. Theoretisch würden sich acht mögliche geometrische
Isomere der 9,11- und 10,12-Octadecadiensäure (c9,c11; c9,t11; t9,c11;
t9,t11; c10,c12; c10,t12; t10,c12 und t10,t12) aus der Isomerisierung
von c9,c12-Octadecadiensäure
bilden. Ein allgemeiner Mechanismus für die Linolsäure-Isomerisierung
wurde von J. C. Cowan in JAOCS 72: 492–99 (1950) beschrieben. Es
wird geglaubt, dass die Doppelbindung als Resultat eines Stoßes von
einem aktivierenden Katalysator polarisiert wird. Das polarisierte
Kohlenstoffatom und sein unmittelbar benachbarter Kohlenstoff sind
dann frei zum Rotieren, und die Kräfte sind dergestalt, um das
instabile Kohlenstoffatom im Wesentlichen planar zu machen. Verschiebt
sich das System, um diese Kräfte
abzuschwächen,
die als Resultat des Stoßes
auftreten, so werden sowohl cis- als auch trans-Isomere gebildet. Die Bildung bestimmter
CLA-Isomere ist thermodynamisch begünstigt. Dies erfolgt aufgrund
der coplanaren Charakteristika der fünf Kohlenstoffatome in Nähe der konjugierten
Doppelbindung und eines räumlichen
Konflikts des Resonanzradikals. Der relativ höhere Anteil an 9,11- und 10,12-Isomeren
scheint aus der weiteren Stabilisierung der c9,t11- oder t10,c12-geometrischen
Isomere zu resultieren.
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Fortschritte
in der Gaschromatographie haben es Forschern ermöglicht, die isomere Zusammensetzung
von CLA-Proben genau zu bestimmen. In Christie et al., JAOCS 74
(11): 1231 (1997) wird berichtet, dass die Isomerverteilung einer
handelsüblichen
CLA-Probe folgendermaßen
war: 8,10 (14%); 9,11 (30%); 10,12 (31%) und 11,13 (24%). In einer
anderen von Christie et al. veröffentlichten
Untersuchung, die in Lipids 33(2): 217–21 (1998) erschien, wurde
die folgende Isomerzusammensetzung eines handelsüblichen CLA-Präparats genannt:
t11,t13 (0,74%; t10,t12 (1,23%); t9,t11 (1,18%); t8,t10 (0,46%);
c1l,t13 und t11,c13 (21,7%); c10,t12 und t10,c12 (29,0%); c9,t11
und t9,c11 (29,5%); c8,t10 und t8,c10 (12,3%); c11,c13 (0,96%);
c10,c12 (0,88%); c9,c11 (0,88%) und c8,c10 (0,20%). Aus diesen Untersuchungen
ist ersichtlich, dass selbst dann, wenn die Bildung bestimmter Isomere
begünstigt
ist, weitere CLA-Isomere zu der Zusammensetzung von alkali-isomerisierten
CLA-Präparaten
erheblich beitragen können.
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1978
entdeckten Forscher der University of Wisconsin die Identität einer
in gekochtem Rindfleisch enthaltenen Substanz, welche die Mutagenese
zu hemmen schien. Diese Substanz wurde als CLA bestimmt. Fettsäuren mit
konjugierten ungesättigten
Bindungen sind normalerweise nicht Bestand teile der Rindernahrung.
Allerdings wird c9,t11-Octadecadiensäure im Pansen
als ein erstes Intermediat in der Biohydrierung von Linolsäure mit
Hilfe der Linolsäure-Isomerase vom anaeroben
Bakterium Butyrivibrio fibrisolvens gebildet, wie von Kepler et
al. J. Biol. Chem. 241: 1350–54
(1966) berichtet.
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Die
biologische Aktivität
einzelner CLA-Isomere ist Gegenstand mancher Spekulation gewesen.
Allgemein lässt
die Literatur vermuten, dass das biologisch aktive Isomer das c9,t11-Isomer
ist, das von Butyrivibrio fibrisolvens gebildet wird (für einen Überblick,
der diese Position stützt,
siehe P. W. Parodi, J. Nutr. 127(6): 1055–60 (1997), M. A. Belury, Nutrition
Reviews 53(4): 83–9
(1995)). Weitere Daten, die diese Vermutung untermauern, erscheinen
in Ha et al., Cancer Res., 50: 1097 (1991). Dort führten die
Forscher Untersuchungen über
die markierte Aufnahme durch, die andeuten, dass das 9,11-Isomer
scheinbar etwas bevorzugt aufgenommen und in die Phospholipid-Fraktion
von tierischen Geweben eingebaut wird, was auch in geringerem Maße für das 10,12-Isomer
zutrifft.
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Die
mit CLA assoziierte biologische Aktivität ist vielfältig und komplex. Bis heute
ist sehr wenig über den
Wirkmechanismus von CLA bekannt, obwohl mehrere in Arbeit befindliche
präklinische
und klinische Studien wahrscheinlich über die physiologischen und
biochemischen Wirkungsweisen neuen Aufschluss geben werden. Die
antikarzinogenen Eigenschaften von CLA sind gut dokumentiert. Eine
Verabreichung von CLA hemmt die Mammatumorgenese bei Ratten, wie
von Ha et al., Cancer Res., 52: 2035-s (1992) gezeigt. Ha et al.,
Cancer Res., 50: 1097 (1990) berichtete von ähnlichen Ergebnissen bei einem
Mausvordermagen-Neoplasiemodell. CLA ist auch als ein starkes cytotoxisches
Agens gegen das humane Melanom, Colorektalkrebszellen und Brustkrebszellen
in vi tro identifiziert worden. Ein neuer Übersichtsartikel bestätigt die
aus einzelnen Studien gezogenen Schlüsse (Ip, Am. J. Clin. Nutr.
66(6): 1523s (1997)).
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Obwohl
die CLA-Wirkmechanismen noch nicht bekannt sind, ist es offensichtlich,
dass manche Komponente bzw. Komponenten des Immunsystems zumindest
in vivo beteiligt sein können.
U.S. Patent Nr. 5.585.400 (Cook et al.) offenbart ein Verfahren
zur Abschwächung
allergischer Reaktionen in Tieren, die von Typ I oder TgE-Hypersensibilität vermittelt
sind, durch eine Verabreichung einer CLA-haltigen Diät. Es ist
ebenfalls gezeigt worden, dass CLA in Konzentrationen von etwa 0,1
bis 1,0 Prozent ein wirksames Adjuvans beim Schutz weißer Blutzellen
ist. In U.S. Patent Nr. 5.674.901 (Cook, et al.) ist offenbart,
dass eine orale oder parenterale Verabreichung von CLA entweder
in Form einer freien Säure
oder als Salz zu einer Erhöhung
von CD-4 und CD-8-Lymphocyten-Subpopulationen
führte,
die mit einer Zell-vermittelten
Immunität
einherging. Nachteilige Wirkungen, die aus einer Vorbehandlung mit
exogenem Tumor-Nekrose-Faktor
erwuchsen, konnten indirekt durch Erhöhen oder Aufrechterhalten der
Niveaus von CD-4 und CD8-Zellen in Tieren gelindert werden, denen
CLA verabreicht worden war. Schließlich beschreibt U.S. Patent
Nr. 5.430.066 die Wirkung von CLA bei der Verhinderung von Gewichtsverlust
und Anorexie durch eine Immunstimulierung.
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Abgesehen
von potenziellen therapeutischen und pharmakologischen Anwendungen
von CLA, wie sie oben angeführt
sind, hat es viel Aufregung hinsichtlich der Verwendung von CLA
in der Nahrung als ein Nahrungsergänzungsmittel gegeben. Es ist
festgestellt worden, dass CLA eine große allgemeine Wirkung auf die Körperbeschaffenheit
ausübt,
insbesondere eine Umleitung der Verteilung von fetter und magerer
Gewebemasse. U.S. Patent Nr. 5.554.646 (Cook, et al.) offenbart ein
Verfahren, das CLA als ein Nahrungsergänzungsmittel nutzt, in dem
Schweine, Mäuse
und Menschen mit einer 0,5 Prozent CLA-haltigen Nahrung ernährt wurden.
Bei jeder Spezies wurde eine signifikante Abnahme des Fettgehalts
bei einer gleichzeitigen Zunahme der Proteinmasse beobachtet. Interessant
ist, dass bei diesen Tieren eine Erhöhung des Fettsäuregehalts
der Nahrung durch Zugabe von CLA zu keiner Zunahme des Körpergewichts
führte,
aber mit einer Umverteilung von Fett und Magergewebe im Körper verbunden
war. Ein weiteres interessantes Nahrungsphänomen ist die Wirkung der CLA-Ergänzung auf
die Futterkonversion. U.S. Patent Nr. 5.428.072 (Cook, et al.) lieferte
Daten, die zeigen, dass die Beimengung von CLA in Tierfutter (Vögel und
Säuger)
die Effizienz der Nahrungsmittelkonversion steigerte, was zu einer
größeren Gewichtszunahme
bei den CLA-ergänzten
Tieren führte.
Ein Verfahren zur Aufrechterhaltung eines bestehenden Levels von
Körperfett
im Menschen durch eine Verabreichung von CLA ist in WO 9746230 offenbart.
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Die
möglichen
vorteilhaften Wirkungen einer CLA-Ergänzung für Tierfutterproduzenten sind
offensichtlich. Es besteht ein Bedarf danach, zu bestimmen, welches
die tatsächlichen
biologisch aktiven Isomere und die genauen Verhältnisse sind, mit denen die
Isomere verwendet werden sollten.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
wissenschaftliche Literatur lässt
vermuten, dass das aktive CLA-Isomer das c9,t11-Isomer ist. Wie hierin
allerdings gezeigt, besitzt ein erhöhtes Verhältnis von 10,12- zu 9,11-Isomeren
einen deutlichen Effekt auf die biologische Aktivität von CLA-Präparaten.
Deshalb besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung
der Verwendung von Zusammensetzungen, die biologisch aktive CLA-Isomere
mit einem angereicherten Gehalt zur Optimierung der erwünschten
biologischen Wirkungen enthalten.
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In
einer Ausführungsform
stellt die Erfindung die Verwendung von Zusammensetzungen und Präparaten,
die wenigstens 80% t10,c12-CLA umfassen, für die Herstellung eines Medikaments
zur Reduzierung von Körperfett
bereit. In einigen Ausführungsformen
ist die t10,c12-CLA wenigstens ungefähr zu 90% rein und in noch
anderen Ausführungsformen
ist die t10,c12-CLA wenigstens ungefähr zu 92% rein.
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Die
obigen Zusammensetzungen können
in Acylglyceride oder Alkylester eingebaut sein. In einigen Ausführungsformen
umfasst die Acylglycerol-Zusammensetzung eine Vielzahl an Acylglycerol-Molekülen mit der
Struktur:
worin R
1,
R
2 und R
3 aus der
Gruppe, bestehend aus einer Hydroxylgruppe und einer Octadecadiensäure ausgewählt sind,
wobei die Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet ist, dass sie wenigstens
ungefähr
80% t10,c12-Octadecadiensäure
an den Positionen R
1, R
2 und
R
3 enthält.
In anderen Ausführungsformen
ist die Acylglycerol-Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, dass
sie wenigstens ungefähr
90% t10,c12-Octadecadiensäure an den
Positionen R
1, R
2 und
R
3 enthält.
In noch anderen Ausführungsformen
ist die Acylglycerol-Zusammensetzung
dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens ungefähr 92% t10,c12-Octadecadiensäure an den
Positionen R
1, R
2 und
R
3 enthält.
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In
weiteren Ausführungsformen
können
die angereicherten t10,c12-Zusammensetzungen in Lebensmittelprodukte
eingebaut sein, einschließlich
Tierfuttermittel und Lebensmittel für den menschlichen Verzehr, oder
können
mit einem Träger
oder oralen Darreichungsvehikel formuliert sein.
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Zusammensetzungen,
die t10,c12-CLA enthalten, können
in der Herstellung eines Medikaments zur Reduzierung von Körperfett
bei Menschen und Tieren verwendet werden.
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In
einigen Ausführungsformen
ist die t10,c12-CLA wenigstens ungefähr zu 80% rein, in anderen
Ausführungsformen
ist die t10,c12-CLA wenigstens ungefähr zu 90% rein und in noch
anderen Ausführungsformen
ist die t10,c12-CLA wenigstens ungefähr zu 92% rein. In noch weiteren
Ausführungsformen
wird das t10,c12-Präparat
an das Tier, einschließlich
Menschen, verabreicht, so dass das Körperfett vermindert wird.
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In
anderen Ausführungsformen
stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von t10,c12-CLA
für gängige Samenöle bereit,
einschließlich,
doch nicht beschränkt
auf Sonnenblumenöl,
Färberdistelöl, Sojabohnenöl und Maisöl. In einigen
Ausführungsformen
wird ein gängiges
Samenöl
und ein Verfahren zur Behandlung des Samenöls bereitgestellt. In anderen
Ausführungsformen
ist das Öl
unter Bedingungen behandelt, bei denen ein t10,c12-CLA enthaltendes
Präparat
erzeugt wird. In einigen Ausführungsformen
ist die CLA wenigstens ungefähr
zu 80% t10,c12, in anderen Ausführungsformen
ist die CLA wenigstens ungefähr zu
90% t10,c12 und in noch anderen Ausführungsformen ist die CLA wenigstens
ungefähr
zu 92% t10,c12. In weiteren Ausführungsformen
wird eine Mischung aus Alkylestern von dem gängigen Samenöl gebildet.
In noch anderen Ausführungsformen
sind dann die Alkylester konjugiert. In einigen Ausführungsformen
sind die konjugierten Alkylester in einem Lösemittel verdünnt und durch
Temperaturabsenkung auf wenigstens etwa minus 56°C bis minus 57°C ausgefällt. In
anderen Ausführungsformen
werden die gesättigten
Fettsäuren
aus dem Präparat
mittels Temperaturabsenkung auf ungefähr –30°C entfernt. In noch weiteren
Ausführungsformen
können
die gesättigten
Fettsäuren
mittels Harnstoff-Fraktionierung entfernt werden. In anderen Ausführungsformen
stellt die Erfindung die mit dem gerade beschriebenen Verfahren
hergestellte t10,c12-CLA bereit.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
ein Diagramm einer logarithmischen Regressionsanalyse dreier separater
Studien, die das Verhältnis
von den 10,12- und 9,11-Isomeren von CLA mit der prozentualen Reduzierung
von Rückenfett
in Hausschweinen vergleichen.
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2 zeigt
ein Diagramm einer linearen Regressionsanalyse dreier separater
Studien, die den Gesamtanteil des 10,12-Isomers von CLA im Futter von Hausschweinen
mit der prozentualen Reduzierung von Rückenfett vergleichen.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Definitionen:
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich „konjugierte Linolsäure" oder „CLA" auf eine beliebige
konjugierte Linolsäure
oder freie Octadecadien-Fettsäure.
Dieser Ausdruck soll sämtliche
Stellungs- und geometrische bzw. Stereoisomere der Linolsäure mit
zwei konjugierten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen an einer beliebigen
Stelle im Molekül
umfassen. CLA unterscheidet sich von der gewöhnlichen Linolsäure darin,
dass gewöhnliche
Linolsäure
Doppelbindungen an Kohlenstoffatomen 9 und 12 besitzt. Beispiele
für CLA
umfassen cis- und trans-Isomere („E/Z-Isomere") der folgenden Stellungsisomere:
2,4-Octadecadiensäure,
4,6-Octadecadiensäure,
6,8-Octadecadiensäure,
7,9-Octadecadiensäure,
8,10-Octadecadiensäure, 9,11-Octadecadiensäure und
10,12-Octadecadiensäure, 11,13-Octadecadiensäure. Wie
hierin verwendet, umfasst „CLA" ein einziges Isomer,
eine ausgewählte
Mischung zweier oder mehrerer Isomere und eine nichtausgewählte Mischung aus
Isomeren, die aus natürlichen
Quellen erhalten sind, wie auch synthetische und halbsynthetische
CLA.
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Wie
hierin verwendet, ist beabsichtigt, dass „Triglyceride" von CLA CLA an jeder
oder allen der drei Positionen im Triglycerid-Rückgrat enthalten. Dementsprechend
kann ein Triglycerid, das eine CLA enthält, jedes beliebige Stellungs- und Stereoisomer
von CLA umfassen.
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Wie
hierin verwendet, ist beabsichtigt, dass „Ester" von CLA sämtliche Stellungs- und Stereoisomere von
CLA umfassen, die über
eine Esterbindung an einen Alkohol oder eine beliebige andere chemische
Gruppe, einschließlich,
doch nicht beschränkt
auf physiologisch verträgliche,
natürlich
vorkommende Alkohole (z.B. Methanol, Ethanol, Propanol) gebunden
sind. Deshalb kann ein Ester von CLA oder eine veresterte CLA irgendeines
der Stellungs- und Stereoisomere von CLA umfassen.
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Es
ist beabsichtigt, dass „nicht-natürlich vorkommende
Isomere" von CLA
c11,t13; t11,c13; t11,t13; c11,c13; c8,t10; t8,c10; t8,t10; c8,c10
und trans-trans-Isomere der Octadecadiensäure umfassen, jedoch nicht darauf
beschränkt
sind, und nicht t10,c12 und c9,t11-Isomere der Octadecadiensäure umfassen. „Nicht-natürlich vorkommende
Isomere" können auch
als „mindere" bzw. "sekundäre Isomere" von CLA bezeichnet
sein, da diese Isomere im Allgemeinen in geringen Mengen produziert
sind, wenn CLA mittels Alkaliisomerisierung synthetisiert ist.
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„Lebensmittelfertigprodukt" meint jedes abgepackte
Lebensmittel, das für
den menschlichen Verzehr zugelassen ist.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet „c" eine chemische Bindung
in cis-Orientierung, und „t" bezieht sich auf
eine chemische Bindung in trans-Orientierung. Falls ein Stellungsisomer
von CLA ohne ein „c" oder ein „t" genannt ist, dann
umfasst diese Bezeichnung alle vier möglichen Isomere. Zum Beispiel
umfasst 10,12-Octadecadiensäure
die c10,t12-; t10,c12-; t10, t12- und c10,c12-Octadecadiensäure, während t10,c12-Octadecadiensäure oder
CLA sich exakt auf ein einziges Isomer bezieht.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Öl" auf eine frei fließende Flüssigkeit, die langkettige Fettsäuren (einschließlich CLA)
oder andere langkettige Kohlenwasserstoffgruppen enthält. Diese
langkettigen Fettsäuren
umfassen die verschiedenen Isomeren von CLA, sind aber hierauf nicht
beschränkt.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „physiologisch verträglicher
Träger" auf einen beliebigen
Träger
oder beliebiges Vehikel, der/das üblicherweise mit öligen Arzneimitteln
verwendet wird. Derartige Träger
oder Vehikel umfassen Öle,
Stärke,
Sucrose und Lactose.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „orales Darreichungsvehikel" auf ein beliebiges
Mittel zur oralen Darreichung eines Arzneimittels, einschließlich, aber
hierauf nicht beschränkt,
Kapseln, Pillen, Tabletten und Sirupe.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Lebensmittelprodukt" auf ein beliebiges
Lebens- oder Futtermittel, das für
den Verzehr durch Menschen, nicht wiederkäuende Tiere oder wiederkäuende Tiere geeignet
ist. Das „Nahrungsmittelprodukt" kann ein zubereitetes
und abgepacktes Lebensmittel (z.B. Mayonnaise, Salatdressing, Brot
oder Käse)
oder ein Tierfutter (z.B. extrudiertes und pelletiertes Tierfutter
oder gemischtes Rohfutter) sein. Verschiedene Verwendungen von CLA
sind in der Patentliteratur und in der wissenschaftlichen Literatur
gut belegt. Diese Verwendungen können
in zwei allgemeine Kategorien eingeteilt sein. Die erste Kategorie
ist die Verwendung von CLA in der Ernährung als Nahrungsergänzungsmittel.
Die zweite Kategorie ist die therapeutische und pharmakologische
Verwendung.
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In
U.S. Patent Nr. 5.554.646 (Cook et al.), das hierin durch Verweis
aufgenommen ist, ist die Verwendung von CLA zur Reduzierung von
Körperfett
in Tieren offenbart. Bei diesem Verfahren wird eine sichere und wirksame
Menge an CLA, die hinreichend ist, eine Reduzierung des Körpergewichts
zu bewirken, an das Tier verfüttert.
Mäuse,
denen ein 0,5% CLA-haltiges Futter verfüttert wurde, besaßen einen
Gesamtfettgehalt am Ende der Fütterung,
der signifikant geringer war als der Fettgehalt von Kontrollmäusen, denen
ein 0,5% Maisöl-haltiges
Futter verfüttert
wurde. Die exakt zu verabreichende CLA-Menge für eine Reduzierung des Körperfetts
hängt von
dem Tier, der eingesetzten CLA-Form und dem Verabreichungsweg ab.
Die Menge liegt allgemein im Bereich von etwa 0,001 g/kg bis etwa
1 g/kg Körpergewicht
des Tieres. Pharmazeutische Mengen liegen allgemein im Bereich von
etwa 1.000 Parts per Million (ppm) bis etwa 10.000 ppm CLA der menschlichen Kost.
Allerdings ist die obere Grenze der Menge, die eingesetzt werden
soll, nicht kritisch, da CLA relativ nicht-toxisch ist. CLA für diese
und andere Verwendungen kann in ein einer Vielfalt von Formen präpa riert
sein. Diese umfassen nicht-toxische Natrium- oder Kaliumsalze von
CLA zusammen mit einem pharmazeutischen Verdünnungsmittel und aktiven Estern.
CLA kann auch dem Tierfutter oder Lebensmittel direkt beigemischt sein,
das von einem Menschen verzehrt werden soll, so dass CLA ungefähr 0,01%
bis 2,0% oder mehr Gew.-% des Tierfutters oder Lebensmittels umfasst.
Dieses Patent offenbart ebenfalls, dass eine Ergänzung eines Tierfutters mit
CLA zum Schutz von Körperprotein
in einem Tier und zur Zunahme von Muskelprotein in einem Tier dienen
kann.
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Eine
andere der Ernährung
dienende Verwendung von CLA ist in U.S. Patent Nr. 5.428.072 offenbart (Cook
et al.), das hierin als Verweis aufgenommen ist. Dort ist gezeigt,
dass die Verfütterung
einer sicheren und wirksamen CLA-Menge an Tiere die Gewichtszunahme
und Futtereffizienz im Tier verbessert. Gruppen von Hühnern, denen
ein mit 0,5% CLA ergänztes
Futter verfüttert
wurde, zeigten eine gleiche Gewichtszunahme wie Kontrolltiere, denen
0,5% Linolsäure
verfüttert
wurde, obgleich die CLA-gefütterten
Hühner
weniger Futter konsumierten. Des weiteren zeigten Hühner, die
mit 0,5% CLA gefüttert
wurden und denen anschließend
Endotoxin injiziert wurde, eine Gewichtszunahme, während Hühner, die
mit Kontrollfuttermitteln gefüttert wurden,
entweder an Gewicht verloren oder sehr wenig an Gewicht zunahmen. Ähnliche
Ergebnisse waren bei Ratten, denen ein 0,5% CLA haltiges Futter
verfüttert
wurde, und bei Kaninchen zu beobachten, denen entweder 0,5% oder
1% CLA verfüttert
wurde. Richtlinien für
CLA-Mengen, die im Futter verfüttert
oder enthalten sein sollen, sind mit den im U.S. Patent Nr. 5.554.646
offenbarten Mengen identisch.
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Studien
haben außerdem
gezeigt, dass CLA tatsächlich
zur Reduzierung von Körpergewicht
beim Menschen verwendet werden kann. In einer Doppelblindstudie,
die von Erling Thom 1997 in Norwegen durchgeführt wurde, war die Nahrung
von 20 gesunden Individuen entweder mit 3 g CLA-Mischung oder mit
3 g Placebo ergänzt.
Die CLA-ernährte
Gruppe erfuhr sowohl eine Abnahme des Körpergewichts als auch des Körperfettanteils,
während
die Placebo-ernährte
Gruppe eine Zunahme des Körpergewichts
und Körperfettanteils erfuhr.
Die PCT-Veröffentlichung
WO 97/46230 offenbart ein Verfahren zur Aufrechterhaltung eines
bestehenden Levels an Körperfett
und/oder Körpergewicht.
Die Ansprüche
dieses Patents beruhen auf einer unkontrollierten Einzelstudie,
worin CLA von insgesamt 3 Individuen konsumiert wurde.
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Weitere
Patente über
eine CLA-Verwendung haben sich auf die Rolle von CLA bei einer Immunantwort konzentriert.
U.S. Patent Nr. 5.585.400 (Cook et al.), das hierin als Verweis
aufgenommen ist, offenbart ein Verfahren zur Abschwächung allergischer
Reaktionen bei Tieren, die von Typ I oder TgE-Hypersensibilität vermittelt sind, durch die
Verabreichung einer CLA-haltigen Nahrung. Dieses Patent offenbart
ebenfalls die Verabreichung von CLA in Konzentrationen von etwa
0,1 bis 1,0%, um die Zahlen von weißen Blutzellen zu erhalten. Bei
den in diesem Patent offenbarten Untersuchungen wurde ein Meerschweinchentracheen-Allergiemodell eingesetzt.
Meerschweinchen wurden mit 0,25% CLA oder Kontrollfutter zwei Wochen
gefüttert,
dann mit Ovalbumin an Woche zwei und drei für eine Hyperimmunisierung immunisiert.
Ein Superfusionsmodellsystem wurde verwendet, um zu bestimmen, ob
eine Fütterung
mit CLA irgendeine Wirkung auf die Allergen-induzierte Tracheenkontraktion
haben würde.
Tracheen von Meerschweinchen, die mit CLA gefüttert wurden, waren in dem
Superfusionssystem stabiler als Tracheen von Meerschweinchen, die
mit Kontrollfutter gefüttert
waren. Wenn das Allergen über
die Meerschweinchentracheen infundiert war, wurde eine geringere
Tracheenkontraktion im Gewebe von CLA-gefütterten Tieren beobachtet.
Die Zahl weißer
Blutzel len von Tieren, die mit CLA gefüttert waren, war im Vergleich
zu Kontrolltieren erhöht;
die CLA-gefütterten
Tiere besaßen
3,5 × 106 ± 0,6 weiße Blutzellen
im Vergleich zu 2,4 × 106 ± 0,3
weißen
Blutzellen bei den Kontrolltieren.
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Die
Verwendung von CLA zur Wachstumverbesserung und Prävention
von Anorexie und Gewichtsverlust aufgrund von Immunstimulation (z.B.
Endotoxinexposition) und den nachteiligen Wirkungen katabolischer
Hormone (z.B. IL-1) wurde in U.S. Patent Nr. 5.430.066 (Cook et
al.) offenbart, das hierin als Verweis aufgenommen ist. Hühner, die
mit einem 0,5% CLA-Futter gefüttert
und anschließend
durch eine Endotoxininjektion gefordert wurden, zeigten eine Gewichtszunahme,
während
Hühner,
die mit einem Kontrollfutter gefüttert
wurden, keine Gewichtszunahme nach einer Endotoxin-Exposition zeigten. Ähnliche
Ergebnisse wurden mit Ratten erhalten, die mit einem 0,5% CLA-haltigen
Futter gefüttert
wurden, im Vergleich zu Tieren, die mit einem Kontrollfutter mit
0,5% Maisöl
gefüttert
wurden. Die offenbarten Präparate
und Dosisbereiche waren mit jenen identisch, die im U.S. Patent
Nr. 5.554.646 offenbart wurden.
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Die
Verfahren zur Behandlung von Tieren, um die CD-4- und CD-8-Levels
aufrecht zu halten oder zu erhöhen
und um die nachteiligen Wirkungen auf die Tiere, die durch die Produktion
oder exogene Verabreichung von Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) oder von
einem Virus entstehen, zu verhindern oder abzumildern, und die darin
bestehen, den Tieren eine sichere und wirksame Menge an CLA zu verabreichen,
wurden in U.S. Patent Nr. 5.674.901 (Cook et al.) offenbart, das
hierin als Verweis aufgenommen ist. Mäuse wurden entweder mit einem
Kontrollfutter oder 0,5% CLA gefüttert
und anschließend
mit TNF-Injektionen gefordert. CLA-gefütterte Mäuse verloren weniger Gewicht
als die Kontrollmäuse. Ähnlich nahmen
Hühner,
die mit 0,5% CLA-Futter gefüttert
wur den und nachfolgend mit einer Flügelstichinjektion mit lebendem
abgeschwächtem
Hühnerpockenvirus
gefordert wurden, mehr an Gewicht zu als mit Kontrollfutter gefütterte Hühner. Mit
0,5% CLA-Futter gefütterte
Hühner
zeigten einen deutlich gesteigerten Anteil an CD-4 und CD-8-Zellen
im Vergleich zu Hühnern,
die ein Kontrollfutter erhielten.
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Die
Europäische
Patentanmeldung 779.033 A1 (Lievense, et al.), die hierin als Verweis
aufgenommen ist, offenbart die Verwendung von CLA für eine Verbesserung
des Blutfettprofils. Zusammengefasst wurden Hamster mit einem Futter
gefüttert,
das CLA eingebaut in ein Triglycerid in Form einer Fettdistribution
eingebaut bei einem Anteil von 1,5% an den Gesamtkalorien ihres
Futters enthielt. CLA-gefütterte
Hamster zeigten eine Abnahme bei Gesamtcholesterol, eine Abnahme
bei HDL-Cholesterol und eine Abnahme bei LDL-Cholesterol.
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Es
ist ebenfalls gezeigt worden, dass CLA Knocheneinlagerungen beeinflusst,
wie es in den PCT Veröffentlichungen
WO 98/05318 (Cook, et al.) und WO 98/05319 (Cook, et al.) berichtet
ist, die beide hierin als Verweise aufgenommen sind. Hühner, die
mit einem Futter, das 0,1875%, 0,375% oder 0,75 des Futters enthielt,
gefüttert
waren, zeigten einen wesentlichen Rückgang bei Skelettanomalien
im Vergleich zu Hühnern, die
kein CLA in ihrem Futter erhielten. Außerdem zeigten Hühner, die
mit einem 0,5% CLA-haltigen Futter gefüttert wurden, eine Zunahme
des Knochenmineralgehalts.
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Weitere
Patente beschreiben verschiedene CLA-Formulierungen. Die Europäische Patentanmeldung
EP779033 A1 offenbart
eine genießbare
Fettdistribution, die 0,05 bis 20 Gew.-% konjugierte Linolsäure-Reste enthält. Darin
wurde eine im Handel erhältliche
Mischung freier Fettsäuren
mit einem Linolsäuregehalt
von 95,3% einer Alkaliisomerisierung mit NaOH in Ethylenglycol unterzogen.
Die freien Fettsäuren
wurden an Triglyceride durch Mischen mit 10 Teilen Palmöl und Lipase
gebunden. Die Mischung wurde 48 Stunden bei 45°C gerührt und die Lipase und freien
Fettsäuren
entfernt. Siebzig Teile dieser Zusammensetzung und 29 Teile Wasser,
0,5 Teile Molkenproteinpulver, 0,1 Teile Salz und eine kleine Menge
an Geschmacksstoff und Citronensäure
(um einen pH von 4,5 zu erhalten) wurden vereinigt und verarbeitet,
um eine Fettdistribution herzustellen.
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Andere
Nahrungsmittel, die eine sichere und wirksame Menge an CLA enthalten,
sind in der PCT-Veröffentlichung
WO 97/46118 (Cook et al.) offenbart, die hierin als Verweis aufgenommen
ist. Darin ist ein flüssiges
diätetisches
Nahrungsmittel für
eine parenterale Verabreichung an Menschen offenbart, das emulgierte Fettpartikel
mit etwa 0,33–0,5
Mikrometer im Durchmesser enthält.
Die Emulsion enthält
0,5 mg/g bis 10 mg/g CLA oder alternativ 0,3% bis 100% CLA bezogen
auf das Nahrungsmittelfett oder 0,03 g bis 0,3 g CLA pro 100 Kalorienportion.
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Diese
Anmeldung legt ebenfalls eine Kleinkind-Formel offen, die ähnliche
Mengen an CLA zusammen mit 2,66 g Protein, 5,46 g Fett, 10,1 g Kohlenhydrate,
133 g Wasser und Vitamine und Mineralien in RDA-Mengen enthält. Ein
weiteres Beispiel für
ein rückstandsarmes
flüssiges
enterales diätetisches
Produkt ist offen gelegt, das als ein proteinreicher Vitamin- und
Mineralienzusatz zweckdienlich ist. Dieser Zusatz enthält CLA mit 0,05%
bis etwa 5 Gew.-% des Produkts oder von 0,3% bis etwa 100% des enthaltenen
Lipids oder etwa 0,03 bis 0,3 g CLA pro 100 Kalorien. Zusätzlich können 140
Kalorien einer repräsentativen
Formel 7,5 g Eiweiß-Feststoffe, 0,1 g
CLA, 27,3 g Kohlenhydrate wie Sucrose oder hydrolysierte Maisstärke, 1,9
g Wasser und Vitamine und Mineralien in RDA-Mengen enthalten.
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In
der vorliegenden Erfindung sind mit 10,12-Isomer angereicherte Präparate bevorzugt
für jede
der oben beschriebenen Anwendungen verwendbar. CLA-Präparate,
die mit dem t10,c12-Isomer angereichert sind, können vorzugsweise mit Hilfe
der präparativen
Gaschromatographie oder mit Hilfe des in Beispiel 4 gezeigten Präzipitationsverfahrens
hergestellt sein.
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Die
Erfinder haben im Gegensatz zu der gegenwärtig weit verbreiteten wissenschaftlichen
Meinung entdeckt, dass ein besonders aktives CLA-Isomer tatsächlich das
t10,c12-Isomer von CLA sein kann.
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Die
Isomerzusammensetzung der verschiedenen CLA-Präparate der vorliegenden Erfindung
kann vorzugsweise mit Hilfe der Gaschromatographie bestätigt werden,
wie es in der Technik bekannt ist.
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Die
10,12-Isomere können
als eine tägliche
Ration in einem Vehikel mit einer Lipidkomponente bereitgestellt
sein, die 0,01 bis 10 Gramm-Äquivalente
der 10,12-Isomere, am bevorzugtesten 0,01 bis 10 Gramm-Äquivalente
des t10,c12-Isomers,
enthält
oder umfasst. Gramm-Äquivalente
bedeuten, dass die Gesamtmenge an bereitgestelltem 10,12-Isomer
ungeachtet weiterer vorhandener Isomere zwischen 0,01 bis 10 g liegt.
Wenn die 10,12-Isomere als Teil einer täglichen Ration bereitgestellt
sind, kann die Aufnahme mit einer einzigen Dosis oder mehreren Dosen
in der Nahrung oder in verschiedenen Nahrungsmittelprodukten erfolgen,
die über
den Tag konsumiert werden.
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Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in Form eines
Massenprodukts für
den Verkauf im Handel sein. Das CLA-Massenprodukt enthält oder
umfasst wenigstens 50 Prozent konjugierte Linolsäure-Isomere. Dieses Massenprodukt
kann in Nahrungsmittelprodukten wie Tierfutter, menschlichen Diätzusätzen und
menschlichen Lebensmittelprodukten verdünnt sein.
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Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden für die Herstellung
eines Medikaments für
die Reduzierung von Körperfett
bei Tieren verwendet. Der Ausdruck Tier umfasst alle Säuger, einschließlich Menschen.
Die für
die Anwendung eingesetzten bevorzugten Dosierungen und Verhältnisse
der 10,12-Isomere, am bevorzugtesten des t10,c12-Isomers, sind dieselben
wie die oben beschriebenen.
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In
einer bevorzugten Anwendungsform der vorliegenden Erfindung wird
eine sichere und wirksame ernährungsmäßige oder
therapeutische Menge an t10,c12-CLA zur Herstellung eines Medikaments
für eine
orale Verabreichung an ein Tier (einschließlich des Menschen) verwendet,
um das Körpergewicht
oder -fett zu vermindern. In einigen Anwendungsformen ist die t10,c12-CLA
wenigstens ungefähr
zu 80% rein, in anderen Anwendungsformen ist die t10,c12-CLA wenigstens
ungefähr
zu 90% rein und in noch weiteren Anwendungsformen ist die t10,c12-CLA
wenigstens ungefähr
zu 92% rein. t10,c12-CLA kann an fettleibige oder nicht fettleibige
Menschen verabreicht sein. Weil t10,c12-CLA ein nicht-toxischer,
natürlich
vorkommender Nahrungsmittelbestandteil und kein Medikament ist,
kann t10,c12-CLA als ein Teil der normalen Nahrung konsumiert sein und
als ein Teil der tagtäglichen
Ernährung
für Menschen
ohne Fettleibigkeit Verwendung finden. Eine ernährungsmäßig wirksame Menge ist diejenige
t10,c12-CLA-Menge,
die, wenn sie in gereinigter Form oder als Nahrungsergänzungsmittel
aufgenommen ist, zu einer Reduzierung des Körpergewichts oder -fetts führt, ohne die
normale Ernährung
zu beeinträchtigen
oder mit dieser zu interferieren. Dementsprechend führt eine
Verabreichung einer ernährungsmäßig wirksamen
Menge an t10,c12-CLA zu einer Gewichtsabnahme ohne geschmacklichen
Verlust bei der Nahrung, die mit einer Verminderung der Nahrungsaufnahme
verbunden ist. t10,c12-CLA kann auch zur Behandlung von Menschen
mit einer geringen bis ausgeprägten
klinischen Fettleibigkeit verwendet werden. Werden Menschen mit
einer klinischen Fettleibigkeit behandelt, so wird eine therapeutisch
wirksame Menge an t10,c12-CLA verabreicht. Eine therapeutisch wirksame
Menge ist diejenige Menge, die eine Reduzierung des Gewichts oder
Körperfetts
einer klinisch fettleibigen Person bewirkt. In der vorliegenden
Erfindung können
etwa 0,1 bis 15 g CLA pro Tag verabreicht sein, bevorzugt etwa 0,1
bis 5 g pro Tag verabreicht sein und am bevorzugtesten etwa 1,8
g pro Tag verabreicht sein. Im Allgemeinen ist die verabreichte
CLA-Menge nicht entscheidend, sofern sie hinreichend ernährungsmäßig oder
therapeutisch wirksam ist. Die CLA-Mengen, die als ernährungsmäßig oder
therapeutisch wirksam erachtet werden, sind diejenigen Mengen, die
zu einem messbaren Gewichts- oder Fettverlust führen, wenn sie über einen
vierwöchigen oder
längeren
Zeitraum verabreicht werden.
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Es
ist anzunehmen, dass es gewisse Schwankungen in der Wirksamkeit
aufgrund von Unterschieden zwischen den Individuen bei Parametern
gibt, wie beispielsweise Körpergewicht,
Grundumsatz, körperlicher Aktivität und anderen
Ernährungsaspekten.
Das Individuum sollte mit einer bevorzugten 1,8 g Dosis in den ersten
beiden Wochen beginnen und dann, falls keine Gewichtsabnahme erfolgt,
die CLA-Dosis stufenweise auf bis zu 10–15 g pro Tag erhöhen.
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Die
vorliegende Erfindung befasst sich ebenfalls mit der Verwendung
von Derivaten des mit Isomeren angereicherten CLA-Präparats.
Zum Beispiel kann die CLA frei oder über Esterbindungen gebunden
oder in Form eines Öls,
das mit Isomeren angereicherte CLA-Triglyceride enthält, bereitgestellt
werden, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist. In diesen Anwendungsformen
können
die Triglyceride teilweise oder vollständig aus Isomer-angereicherter
CLA zusammengesetzt sein, die an das Glycerol-Rückgrat gebunden sind. Die Isomer-angereicherte
CLA kann auch als ein Methylester oder Ethylester bereitgestellt
werden, wie es in den Beispielen beschrieben ist. Außerdem kann
die Isomer-angereicherte CLA in Form eines nicht-toxischen Salzes, wie
ein Kalium- oder Natriumsalz (z.B. ein Salz, das durch Reaktion
chemisch äquivalenter
Mengen an freien Fettsäuren
mit einem Alkalihydroxid bei einem pH von etwa 8 bis 9 gebildet
wird), vorliegen.
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In
einigen bevorzugten Anwendungsformen erfolgt die Verabreichung oral.
Die Isomer-angereicherte CLA kann mit geeigneten Trägern wie
Stärke,
Sucrose oder Lactose in Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Lösungen,
Flüssigkeiten,
Aufschlämmungen,
Suspensionen und Emulsionen formuliert sein. Die Isomer-angereicherte
CLA kann als wässrige
Lösung, ölige Lösung oder
in beliebig anderen oben diskutierten Formen bereitgestellt sein.
Die Tablette oder Kapsel der vorliegenden Erfindung kann mit einer
Magensaft resistenten Beschichtung versehen sein, die sich bei einem
pH von etwa 6,0 bis 7,0 auflöst.
Eine geeignete Magensaft-resistente
Beschichtung, die sich im Dünndarm,
aber nicht im Magen auflöst,
ist Celluloseacetatphthalat. In einer bevorzugten Formulierung ist
die Isomer-angereicherte CLA als weiche Gelatinekapseln bereitgestellt.
Die Isomer-angereicherte
CLA kann auch über
einen von mehreren anderen Pfaden bereitgestellt sein, einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf intravenöse,
intramuskuläre,
intraarterielle, intramedulläre,
intrathekale, intraventrikuläre,
transdermale, subkutane, intraperitoneale, intranasale, enterale,
topische, sublinguale oder rektale Weise. Weitere Einzelheiten über Verfahren
zur Formulierung und zur Verabreichung können der neuesten Ausgabe von
Remington's Pharmaceutical
Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA) entnommen werden.
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Die
Isomer-angereicherte CLA kann auch als eine Ergänzung in verschiedenen zubereiteten
Lebensmittelprodukten und Getränken
bereitgestellt werden. Im Sinne dieser Anmeldung bedeutet ein zubereitetes Lebensmittelprodukt
jedes natürliche,
verarbeitete Diät-
oder Nichtdiät-Lebensmittelprodukt,
dem Isomer-angereicherte CLA zugefügt worden ist. Die Isomer-angereicherte
CLA kann in Form freier Fettsäuren
oder als ein Öl
zugefügt
sein, das partielle oder vollständige
Triglyceride von Isomer-angereicherter CLA enthält. Deshalb kann Isomer-angereicherte
CLA direkt in verschiedene zubereitete Nahrungsmittelprodukte eingebaut sein,
einschließlich,
jedoch nicht darauf beschränkt,
Diätgetränke, Diätriegel,
Ergänzungsmittel,
zubereitete eingefrorene Mahlzeiten, Süßigkeiten, Imbissprodukte (z.B.
Chips), zubereitete Fleischprodukte, Milch, Käse, Joghurt und beliebige andere
fett- oder ölhaltige
Produkte.
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CLA
ist auch oxidationsempfindlich. Deshalb ist es erwünscht, Isomer-angereicherte
CLA für
den menschlichen Gebrauch mit geeigneten Antioxidantien wie Lecithin,
Tocopherolen, Ascorbat, Ascorbylpalimitat oder Gewürzextrakten
wie Rosmarinextrakt abzupacken.
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Gegenwärtig ist
der größte Teil
der CLA mit einem alkalischen Isomerisierungsverfahren hergestellt. Ein Öl, das eine
große
Menge an Linolsäure
wie Sonnenblumenöl,
Nachtker zenöl
oder Färberdistelöl enthält, wird
unter inertem Stickstoff mit Kaliumhydroxid und einem Lösemittel
wie Propylenglycol bei etwa 180°C
etwa 2,5 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird angesäuert und
einige Male mit saurem Wasser gewaschen und schließlich unter
Vakuum getrocknet. Eine vollständige
Beschreibung der CLA-Produktion im Labormaßstab mit Hilfe der alkalischen
Isomerisierung ist dem U.S. Patent Nr. 5.554.646 zu entnehmen, das
hierin als Verweis aufgenommen ist. CLA kann auch mit Hilfe eines
kontinuierlichen alkalischen Isomerisierungsfließverfahrens hergestellt werden,
wie im U.S. Patent Nr. 4.164.505 beschrieben, das hierin als Verweis
aufgenommen ist. Das mit diesen Verfahren gewonnene Reaktionsprodukt
ist eine Mischung aus CLA, Linolsäure und anderen Fettsäuren, die
im Ausgangsöl
gefunden werden. Im Allgemeinen ist die Menge an CLA, die von der
alkalischen Isomerisierung von Sonnenblumenöl stammt, etwa 60% des Gesamtprodukts
an freien Fettsäuren
und enthält
ungefähr
gleiche Mengen an c9,t11- und t10,c12-Isomeren. Ein Verfahren zur Herstellung von
CLAs mit einem vorbestimmten c9,t11:t10,c12-Verhältnis ist in WO 97/18320 offen
gelegt.
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Ein
weiteres Verfahren zur Herstellung eines aus primär cis-9,trans-10-CLA
bestehenden Präparats ist
in U.S. Patent Nr. 5.674.901 offen gelegt, das hierin als Verweis
aufgenommen ist. In diesem Verfahren ist das die Linolsäure enthaltende Öl mit dem
Mikroorganismus Butyrivibrio fibrisolvens inkubiert. B. fibrisolvens enthält eine Δ12-cis, Δ11-Isomerase, die Linolsäure in cis-9,
trans-11 CLA umwandelt.
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In
den folgenden Beispielen werden jegliche Zusammensetzungen, die
mehr als 80% cis10, trans12-CLA enthalten, als Teil der Erfindung
betrachtet.
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BEISPIELE
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Beispiel 1:
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Es
wurden drei verschiedene Studien durchgeführt, bei denen die Beziehung
zwischen CLA-Gehalt im Futter und die Menge an Rückenfett in Schweinen untersucht
wurde. In einer Studie, die von der Iowa State University durchgeführt wurde
und von der bei den Midwest Animal Science Meetings berichtet wurde,
berichtet R. L. Thiel et al, dass Schweine, denen CLA verfüttert wurde,
eine Reduzierung des Rückenfetts
erfuhren. Zusammengefasst wurden in acht Wiederholungsversuchen
fünf Borge
aus einem Geschwisterwurf mit einem durchschnittlichen Anfangsgewicht
von 26,3 kg in einzelne Koben zufällig verteilt. Die Schweine
wurden durchschnittlich 93 Tage gefüttert und besaßen ein
durchschnittliches Schlachtgewicht von 116 kg. Die mit 0,5% CLA-Futter
gefütterte
Gruppe erfuhr eine Abnahme des Rückenfetts
um 10,3%. Obwohl nicht ursprünglich
veröffentlicht,
lag das Verhältnis
der 10,12- zu 9,11-CLA-Isomere der im Futter verwendeten CLA bei
1,05:1.
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In
einer anderen Untersuchung, die von Wissenschaftlern an der Kansas
State University durchgeführt und
von der bei den Midwest Animal Science Meetings berichtet wurde,
wurden 36 gekreuzte Borge mit einem durchschnittlichen Anfangsgewicht
von 83 lbs. mit einem Futter gefüttert,
das 0,50% CLA enthielt. Das durchschnittliche Endgewicht lag bei
ungefähr
230 lbs. Die Borge, denen CLA-haltiges Futter verfüttert wurde,
erfuhren eine Abnahme des Rückenfetts
um 7,2%. Das Verhältnis
der 10,12- zu 9,11-CLA-Isomere der in diesem Versuch eingesetzten
CLA war 0,487:1.
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In
einer weiteren Studie, die bis jetzt unveröffentlicht ist, wurden 24 Borge
mit einem Anfangsgewicht von 26 kg mit einem 0,48% CLA-haltigem
Futter oder einem Kontrollfutter gefüttert. Die Schweine wurden
bis zu einem Endgewicht von 118 kg gefüttert. Mit CLA gefütterte Schweine
erfuhren eine Abnahme des Rückenfetts
um 13,7%. Das Verhältnis
der 10,12 zu 9,11-CLA-Isomere war in diesem Versuch 1,16:1.
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Das
Verhältnis
der 10,12- zu 9,11-Isomere von CLA, die in allen Studien eingesetzt
wurden, wurde gegen die prozentuale Reduzierung des Rückenfetts
aufgetragen und mittels logarithmischer Regression analysiert. Die
Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Diese Ergebnisse
zeigen, dass, wenn das Verhältnis
der 10,12 zu 9,11-CLA-Isomere größer wird,
die prozentuale Reduzierung des Rückenfetts ebenfalls zunimmt.
Deshalb sind CLA-Präparate
mit einem 10,12 zu 9,11 Verhältnis
von höher
als etwa 1,2:1 erwünscht.
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Die
Gesamtmenge an 10,12-Isomeren im Futter kann ebenfalls die Einlagerung
von Rückenfett
beeinflussen. Der Prozentsatz an 10,12-Isomeren in den Futtermitteln
wurde gegen die prozentuale Reduzierung des Rückenfetts aufgetragen und mittels
linearer Regression analysiert. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
Die Ergebnisse zeigen, dass, wenn die Gesamtmenge an 10,12-Isomeren
im Futter zunimmt, das Rückenfett
reduziert wird. Diese beobachtete Wirkung ist nicht so groß wie beim
Isomerenverhältnis.
Allerdings stimmen diese Ergebnisse mit den Verhältnis-Ergebnissen überein.
Die zugrunde liegenden Studien machten keine Unterschiede zwischen
den Isomeren. Es ist möglich,
dass die Mengen und Verhältnisse
der 9,11 und anderer vorhandener Isomere jeden Effekt maskierten,
der mit der Erhöhung
des Anteils der 10,12-Isomere im Futter in Beziehung stand. Wird
ein CLA-Präparat,
das mit 10,12-Isomeren angereichert war, verwendet, so wird erwartet,
dass die Ergebnisse mit den Verhältnis-Ergebnissen
vergleichbar sind.
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Beispiel 2:
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Die
wissenschaftliche Literatur weist darauf hin, dass entweder die
biologisch aktiven CLA-Isomere nicht identifiziert worden sind oder
dass c9,t11-CLA das biologisch aktive Isomer ist. Basierend auf
den Ergebnissen von Beispiel 1 glauben die Forscher, dass das t10,c12-Isomer
ein aktives Isomer ist. Deshalb wird die Wirkung der Verfütterung
unterschiedlicher CLA-Verhältnisse
und CLA-Mengen an Mäuse
untersucht, um zu zeigen, dass das t10,c12-Isomer ein biologisch
aktives Isomer ist und dass das Verhältnis von t10,c12 zu c9,t11
zur Herbeiführung
erwünschter
biologischer Wirkungen beeinflusst werden kann.
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Der
Versuch wurde mit 84 ICR-Mäusen
durchgeführt,
die von Harlan Sprague Dawley (Madison, WI) erhalten waren. Die
Futtermittel wurden aus dem Basisfutter, Zucker, Maisöl und einem
Isomer oder einer Mischung aus Isomeren von konjugierter Linolsäure gemischt.
Jede Behandlung umfasste 2 Käfige
mit 3 Mäusen.
Futter und Wasser erhielten die Mäuse ad libitum. Der Futterverbrauch
wurde täglich
kontrolliert und die Mäuse
wurden jeden zweiten Tag gewogen, wenn die Streu gewechselt wurde.
Nach drei Wochen Verfütterung des
Futters wurden die Mäuse
mit CO2 getötet und das Körpergewicht
festgehalten. Die Mäuse
wurden dann seziert und die Fettpolster gewogen. Die Mäuse wurden
auch auf ihr Gesamtkörperfett
untersucht. Die Mäuse wurden
gefriergetrocknet und zerkleinert. Doppelproben wurden mittels Grobanalyse
(Etherextraktion, Veraschung, Kjeldahl und Feuchteanteil) untersucht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.
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Mäuse, denen
ausschließlich
c9,t11-CLR verfüttert
wurde, zeigten eine lineare Zunahme des Wachstums (16%), wenn kein
t10,c12 vorhanden war. Das Gegenteil erfolgte mit dem t10,c12-Isomer,
wobei sich eine Wachstumsverringerung um 10% ergab. Folglich erhöhte c9,t11
auch den Verbrauch um 8% bei einem Verhältnis von 0,2:0%. Diese Daten
zeigen ebenfalls, dass erhöhte
Mengen des t10,c12-Isomers im Futter eine Reduzierung des Körperfetts
bewirkt. Verglichen mit Kontrollmäusen, die keine CLA im Futter
erhielten, hatten Mäuse,
denen ausschließlich
t10,c12-CLA verfüttert
wurde, weniger Körperfett
und zeigten ein vermindertes Wachstum. Im Gegensatz dazu zeigten
Mäuse,
denen ausschließlich c9,t11-CLA
verfüttert
wurde, ein erhöhtes
Wachstum, erhöhte
Gewichtszunahme und erhöhte
Futterkonversion. Wurde Mäusen
sowohl t10,c12- als auch c9,t11-CLA verfüttert, so nahm das Körperfett
mit steigendem t10,c12 ab. Es wurde festgestellt, dass das optimale
Verhältnis
für eine
Verbesserung von Wachstum, Futterkonversion und Reduzierung von
Fett bei etwa ungefähr
2:1 c9,t11:t10,c12 liegt. Diese Daten weisen darauf hin, dass die
verschiedenen CLA-Isomere verschiedene biologische Wirkungen besitzen.
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Beispiel 3:
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Ein
mit dem 10,12-Isomer angereichertes CLA-Präparat wurde mittels Gaschromatographie
im präparativen
Maßstab
hergestellt. Das resultierende Produkt wurde gaschromatographisch
analysiert. Neuere Beschreibungen gaschromatographischer Verfahren
siehe bei Christie et al., JAOCS 74(11): 1231 (1997), Christie et
al., Lipids 33(2): 217–21
(1998), Sehat et al., Lipids 33(2): 217–21 und Marcel S. F. Lie Ken
Jie und J. Mustafa, Lipids 32(10): 1019–34 (1997). Die vorangehenden
Quellen sind hierin als Verweis aufgenommen. Die gaschromatographischen
Bedingungen waren folgendermaßen:
| System: | Perkin-Elmer
Auto System |
| Injektor: | Splitless
bei 240°C |
| Detektor: | Flammenionisationsdetektor
bei 280°C |
| Träger: | Helium |
| Säule: | WCOT
Fused Silica 0,25 mm X100M, CP-SL 88 für FAME, DF 0,2 |
| Ofenprogramm: | 80°C (0 min)
Anstieg auf 220°C
mit 10°C
pro min und 10 min bei 220°C
halten |
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Alle
Ergebnisse sind als prozentualer Anteil der Peakfläche ausgedrückt. Die
Ergebnisse der Analyse waren:
| Isomer | Fläche (%) |
| C16:0 | 2,01 |
| C18:0 | 0,57 |
| C18:1 | 0,26 |
| c9,t11 | 1,61 |
| t10,c12 | 92,75 |
| t9,t11;t10,t12 | 1,16 |
| nicht
identifiziert | 1,64 |
| Gesamt | 100,0 |
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Beispiel 4:
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t10,c12-CLA
kann in größeren Mengen
mit einem alternativen Verfahren hergestellt werden. Vollständig raffiniertes
Sonnenblumenöl
(ersatzweise Färberdistelöl) wird
als Rohstoff verwendet. Ethylester werden durch Zugabe reinen Ethanols
im Überschuss,
das 1% Natriumethylat als Katalysator enthält, zum Öl gebildet. Die Mischung wird
unter Rühren
30 min auf 60°C
erhitzt und darf sich dabei auftrennen. Die untere Schicht wird
abgezogen, und die obere Schicht wird mit leicht saurem Wasser gewaschen
und im Vakuum getrocknet.
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Die
Ethylestermischung wird dann mit Hilfe der Hochvakuumdestillation
bei 160°C
und 10–2 mbar Druck
gereinigt und der Rückstand
wird verworfen. Die Konjugation erfolgt durch Zugabe von 0,5–1% Ethanol und
0,5–1%
Kaliumethylat zum Ethylester und 1 Stunde Rühren der Mischung bei 120°C. Die Reaktion
wird durch Zugabe verdünnter
Citronensäure
gestoppt. Das Öl
wird dann gewaschen und getrocknet.
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Der
konjugierte Ethylester wird dann in Aceton verdünnt und auf –30°C gekühlt und
filtriert, um den Großteil
der gesättigten
Fettsäuren
zu entfernen. Das Filtrat wird dann weiter auf –56 bis –57°C gekühlt, um den t10,c12-Ethylester
zu fällen.
Der Ethylester wird durch Entfernen des Acetons vom Niederschlag
durch Anlegen eines Vakuums bei leichter Erwärmung erhalten. Der so erhaltene
t10,c12-Ethylester besitzt wenigstens etwa 90% Reinheit. Falls eine
höhere
Reinheit erwünscht
ist, kann weiteres gesättigtes
Fett aus dem Ethylester vor der Konjugation entfernt werden. Dies
kann durch Harnstoff-Fraktionierung erfolgen. Das resultierende Produkt
besteht zu wenigstens etwa 97% aus t10,c12 nach der letzten Fällung.
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Freie
Fettsäuren
werden aus den Ethylestern durch Verseifung und anschließende Neutralisation
hergestellt. Zur Verseifung werden 10% Wasser, das Ethanol für eine Verbesserung
der Löslichkeit
enthält,
und 100% Überschuss
an NaOH zu den Alkylestern für
eine Seifenbildung gegeben. Die Reaktion wird bei 70°C durchgeführt. Dann
wird die Seife mit Wasser verdünnt
und HCl zugegeben, um die gesamte Mischung während intensiven Rührens anzusäuern. Die
freien Fettsäuren
trennen sich ab und bilden eine obere Schicht und werden mit verdünnter Citronensäure gewaschen
und zum Schluss getrocknet. Die Ergebnisse wurden, wie oben beschrieben,
gaschromatographisch analysiert. Die Ergebnisse mit der Harnstoff-Fraktionierung
waren:
| Isomer | Fläche (%) |
| c9,t11 | 1,80 |
| t10,c12 | 97,49 |
| t9,t11;t10,t12 | 0,71 |
| Gesamt | 100,0 |
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Die
Ergebnisse ohne Harnstoff-Fraktionierung waren:
| Isomer | Fläche (%) |
| C16:0 | 1,75 |
| C18:2,c9,c12 | 0,16 |
| C18:1,c9 | 2,22 |
| c9,t11 | 6,36 |
| t10,c12 | 88,84 |
| t9,t11:t10,t12 | 0,23 |
| c9,c11;c10,c12 | 0,15 |
| nicht
identifiziert | 1,64 |
| Gesamt | 100,0 |
-
Beispiel 5
-
CLA-Triacylglycerole
können
mit Hilfe einer direkten Veresterung hergestellt werden. Immobilisierte Candida
antarctica-Lipase (1,25 g) wird zu einer Mischung aus Glycerol (1,22
g 13,3 mmol) und Isomer-angereicherter (entweder mit t10,c12 oder
c9,t11 angereichert) CLA als freie Fettsäure (MG 280,3 g/mol; 11,6 g, 41,5
mmol) gegeben. Die Mischung wird auf einer warmen Platte eines Magnetrührers bei
65°C unter
einem stetigen Vakuum von 0,01–0,5
Torr vorsichtig gerührt.
Der während
des Reaktionablaufs gebildete Wasserdampf wird kontinuierlich in
mit Flüssigstickstoff
gekühlten
Fallen kondensiert. Nach 48 h wird die Reaktion abgebrochen, n-Hexan
zugegeben und das Enzym mittels Filtration abgetrennt. Die organische
Phase wird mit alkalischer wässriger
Natriumcarbonat-Lösung
behandelt, um überschüssige freie
Fettsäuren
zu entfernen (sofern erforderlich). Das organische Lösungsmittel
(gegebenenfalls nach Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat) wird in vacuo auf einem Rotationsverdampfer
mit anschließender
Hochvakuumbehandlung entfernt, um das praktisch reine Produkt als
leicht gelbliches Öl
zu erhalten. Werden stöchiometrische
Mengen freier Fettsäuren
verwendet, so wird eine Titration mit standardisiertem Natriumhydroxid
angewendet, um den Gehalt an freien Fettsäuren des Reaktionsrohprodukts
zu bestimmen (weniger als 1% Gehalt an freien Fettsäuren, basierend
auf der Anzahl von Mol der Estergruppen, was einem Einbau von wenigstens
99% entspricht, äquivalent
zu einem Triglycerid-Gehalt
von mindestens 97%). Das Rohprodukt wird direkt auf die HPLC aufgetragen,
das mit 10% Diethylether in n-Hexan eluiert wird, um 100% reines
Triglycerid als ein farbloses Öl
zu liefern.
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Um
den Verlauf der Reaktion zu kontrollieren und weitere Einzelheiten über die
Zusammensetzung der einzelnen Triglyceride während der Reaktion zu erhalten,
werden Proben regelmäßig zu verschiedenen
Reaktionsstadien gesammelt. Sie werden mittels HNMR-Spektroskopie
analysiert und liefern einen guten Einblick in die Zusammensetzung
der Mono-, Di- und
Triglycerole während
des Reaktionsverlaufs.
-
Beispiel 6
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Chargen-Produktion von konjugiertem Fettsäuremethylester
(FAME) der Färberdistel
im Großmaßstab. Die
Produktion von konjugiertem FAME der Färberdistel kann in zwei Schritte
aufgeteilt werden, nämlich
die Methanolyse und die Konjugation. Für die Methanolyse wurden 6.000
kg Färberdistelöl in einen
geschlossenen Reaktor überführt. Der
Reaktor wurde mit Stickstoff mit Atmosphärendruck gespült, und
1150 Liter Methanol und 160 kg NaOCH3 (30%
Lösung)
wurden zugegeben. Die Mischung wurde auf 65°C unter Rühren erhitzt und durfte bei
65°C für 2 Stunden
reagieren. Die resultierende untere Schicht wurde abgeschöpft, während der
Reaktor mit Stickstoffgas gespült
wurde. 1000 Liter Wasser (40–50°C, in dem 50
kg Citronensäure-Monohydrat
gelöst
worden waren) wurden dann unter Rühren zugegeben. Die Schichten konnten
sich trennen (unge fähr
60 min), und die untere Schicht wurde abgeschöpft, während der Reaktor mit Sickstoffgas
gespült
wurde. Das resultierende Färberdistel-FAME-Produkt
wird bei 80°C
unter Vakuum eine Stunde getrocknet. Das resultierende Färberdistel-FAME-Produkt
kann, wie oben beschrieben, konjugiert und entweder mit t10,c12-CLA
oder c9,t11-CLA angereichert werden.
