CN112451512A - 一种药物组合物及其治疗骨质疏松的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种药物组合物及其治疗骨质疏松的用途，其中所述药物组合物包括9Z，11E和10E，12Z共轭亚油酸，质量比为1：1；该药物组合物可单独或者与紫外照射联合使用作为治疗骨质疏松的手段，利用抗氧化作用以影响细胞凋亡或者影响细胞功能，可抑制紫外线照射的负面影响，充分发挥其有益于骨代谢的作用，具有很好的治疗效果和明显的医学价值。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种药物组合物及其治疗骨质疏松的用途，尤其是涉及共轭亚油酸促进紫外线照射作用治疗骨质疏松疾病的药物中的应用。
背景技术
共轭亚油酸((conjugatedlinoleicacid.简写CLA))是一组含有共轭双键的亚油酸的同分异构体混合物，以双键在9和11(c9，t11-CLA)或10和12(t10，c12-CLA)位置上的同分异构体含量最多，属于多不饱和脂肪酸。已发现CLA的天然形式主要存在于反刍动物的肉类和奶制品。近年来的广泛研究证明，共轭亚油酸有多种生物学活性，例如减少动脉粥样硬化的严重程度，改善免疫不良刺激的影响，改善瘦素抵抗来发挥其降脂，CLA可以抑制肿瘤细胞繁殖、抑制肿瘤细胞向细胞外基质成分和纤维粘连蛋白粘附的作用。
哺乳动物的骨骼具有许多功能，例如提供支持、保护内脏器官以及提供连接肌肉和腱的部位而使动物移动的操作功能。骨在生长和发育过程中是一直被再吸收、替换和重建的活性组织。骨组织的沉积、再吸收和/或重建是由特殊的合成细胞称之为成骨细胞(骨组织的沉积中所涉及)和分解细胞称之为破骨细胞(骨组织的再吸收和/或重建所涉及)来完成。这些特殊细胞的活性在生长和发育中是变化的。在人的早期正常发育中，新的骨组织的形成快于老骨的吸收，造成骨变大、变重和变得更致密。在完全发育的成人中，在最近20岁达到最大骨密度。但是，在晚年生活中，破骨细胞的活性超过了成骨细胞，造成骨密度的下降，骨质疏松疾病多发。
目前公认日照对骨质疏松的预防一定作用的，太阳光谱分析大部分是紫外线(Ultraviolet，UV)，很多学者都对紫外线进行了研究，文献报道：维生素D的产生与日光中紫外线的照射密不可分。人体所需维生素D约有80％靠自身合成，对于大多数人来说，维生素D主要来自阳光对皮肤的照射。而维生素D对预防骨质疏松起重要作用，只有在活性维生素D的作用下，钙才能被骨骼利用，适量的钙及维生素D的补充可保持人体内钙的平衡，提高骨量。维生素D代谢产物1,25-二羟维生素D3[1,25(OH)2D3]是体内生物活性最强的维生素D活性形式，通过对成骨细胞和破骨细胞的作用，参与骨形成和骨吸收的代谢调节。活性维生素D能活化成骨细胞和破骨细胞，由于血钙增加所致的反馈作用，使甲状旁腺分泌减少，破骨作用减弱，成骨作用相对增强，最终骨量丢失延缓，可有效地降低骨质疏松症的发生。国内也有学者对紫外线照射与骨质疏松骨代谢方面研究证实：紫外线照射可以提高骨质疏松模型大鼠血清1,25(OH)2D3含量，促进骨形成，升高骨密度，缓解骨质疏松造成的骨质丢失。但我们也清楚的认识到过度的接受阳光照射可增加皮肤癌发生率。仅靠阳光照射预防骨质疏松是局限的。
发明内容
为了寻找一种新的治疗骨质疏松疾病的药物，从而提供一种药物组合物及其治疗骨质疏松的用途，利用共轭亚油酸，调节紫外线照射作用治疗骨质疏松疾病提供新的方案。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：药物组合物，其中：所述药物组合物的活性成分包括9Z，11E和10E，12Z共轭亚油酸，质量比为1：1。
优选的，所述药物组合物还包括药用可接受的基料、载体、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、加溶剂、成膜剂、稀释剂、成浆液剂、增粘剂、乳化剂、表面活性剂中的一种或几种。
作为本发明的另一方面，本发明提供上述药物组合物用于制备治疗骨质疏松药物中的应用。
优选的，所述的骨质疏松包括紫外线直接照射骨表面导致的骨质疏松。
优选的，所述紫外线照射包括直接照射或雌激素缺失后进行紫外线照射。
优选的，所述紫外线照射，其为照射骨代谢细胞而发生生长异常，导致骨组织稀疏。
优选的，所述骨代谢细胞包括BMSCs细胞、成骨细胞或成骨、骨髓巨噬细胞、破骨细胞或破骨中的一种或几种
优选的，所述应用其方式包括单独使用药物组合物、或药物组合物与紫外照射联合处理的。
优选的，所述联合处理，其紫外照射的距离为24～72cm，药物组合物中共轭亚油酸的有效浓度小于200μM。
优选的，所述应用，其方式还包括进行7～21天的诱导。
本发明的有益效果：
本发明研究了紫外线照射对小鼠BMSCs、巨噬细胞的各种影响，并通过使用CLA优化紫外线照射对骨质疏松进行治疗，获得了很好的治疗效果，有很好的医学价值。
附图说明
图1是实施例1的实验结果图；
图2是实施例2的实验结果图；
图3是实施例3的实验结果图；
图4是实施例4的染色实验结果图；
图5是实施例4的ROS检测实验结果图；
图6是实施例5的ALP活性检测实验结果图；
图7是实施例5的ALP及茜素红染色实验结果图；
图8是实施例5的ROS检测实验结果图；
图9是实施例7的实验结果图；
图10是实施例8的实验结果图；
图11是实施例9的TRAP染色实验结果图；
图12是实施例9的F-actin染色实验结果图；
图13是实施例10的TRAP染色实验结果图；
图14是实施例10的F-actin染色实验结果图；
图15是实施例10的ELISA检测实验结果图；
图16是实施例11的生化检测实验结果图；
图17是实施例11的Micro CT检测实验结果图；
图18是实施例11的生物力学分析实验结果图；
图19是实施例11的HE染色实验结果图；
图20是实施例11的TRAP染色实验结果图；
图21是实施例11的茜素红染色实验结果图；
图22是实施例4的ALP活性检测实验结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实验材料及仪器
材料：SD乳鼠，6月龄SD雌性大鼠(300g±20g，常州卡文斯)，70％乙醇，PBS，骨髓间充质干细胞专用培养基，4％多聚甲醛(上海润捷)，0.1％Triton(上海润捷)，5％FBS(Hyclone)，FBS(Hyclone)，FBS(Gibico)，青链双抗(上海生工)，1×PBS，CD90一抗(Abcamab225)，CY3标记抗小鼠二抗(Proteintech SA00009-1)，Hoechst(碧云天C1017)，BMSCs细胞(CTCC)，UVB紫外线灯管(Philips)，DMEM培养基(Hyclone)，CCK-8(碧云天C0037)，Conjugated(9Z,11E)-Linoleic acid(Sigma 16413)，Conjugated(10E,12Z)-Linoleicacid(Sigma 04397)，地塞美松(Solarbio)，1％戊巴比妥钠，β-甘油磷酸钠(Solarbio)，Vc(Solarbio)，胰岛素(Solarbio)，M-CSF(Peprotech 315-02-10μg)，红细胞裂解液(ACK)，培养板(Costar公司)，RANKL(Peprotech 315-11C-100μg)，Cell Navigator F-actinLabeling Kit Green Fluorescence (AAT Bioquest 22661)，25(OH)D3 ELISA Kit(Elabscience E-EL-0015c)，CTX ELISA Kit(Elabscience E-EL-R1405c)，OC ELISA Kit(Elabscience E-EL-R0243c)，PTH-C ELISA Kit(Elabscience E-EL-R0535c)，Rat IL-6ELISA Kit(Elabscience E-EL-R0015c)，Rat IL-10 ELISA Kit(Elabscience E-EL-R0016c)，Rat TNF-αELISA Kit(Elabscience E-EL-R2856c)；
ALP活性检测试剂盒(南京建成A059-2)，ALP染色试剂盒(Solarbio)，活性氧检测试剂盒(Solarbio CA1410)，茜素红染色试剂盒(Solarbio)，1640培养基(Hyclone)，SOD测定试剂盒(南京建成A001-3)，TRAP染色试剂盒(Sigma)；
抗酒石酸酸性磷酸酶染色液(Solarbio G1492)，茜素红染色液(SolarbioG1452)，无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，二甲苯(无锡展望)，固定液(无锡菩禾)，PBS(无锡菩禾)，软蜡(50-54℃)，硬蜡(58-62℃)，载玻片(世泰粘附性载玻片)，苏木素(上海展云化工有限公司)，1％盐酸乙醇(无锡菩禾)，伊红(上海展云化工有限公司)，中性树胶(中国上海懿洋仪器有限公司)；
仪器：细胞培养箱(Thermo)，光学显微镜(XDS-1A)，荧光显微镜(OLYMPUS IX71)，低速离心机(上海卢湘仪TDZ4B-WS)，超净工作台(苏州安泰科技有限公司)，96孔培养板(Costar公司)，酶标检测仪(Thermo MK3型)，摇床(Qilinbeier TS-1000)，细胞培养箱(Thermo Scientific 8000)，UVB照射灯(311nm)，血生化仪(泽成)，Micro CT，HD-310型生物组织自动包埋机。HD-310型包埋机专用冷冻台，轮转式切片机，HD-330型摊片烤片机
实施例1：大鼠BMSCs分离与鉴定
1.1大鼠BMSCs的分离：
1)将超净台紫外消毒，将乳鼠采用颈椎脱臼法处死，浸泡在70％的酒精中消毒5～10min；
2)将股骨、胫骨迅速剥离下来，置于已消毒并盛有含双抗的1×PBS的平皿中，将股骨、胫骨上残留的肌肉剔除干净，用手术剪分别剪去股骨、胫骨的两端；
3)打开骨髓腔，用5ml注射器吸取4ml完全培养基，从骨髓腔的一端将骨髓冲出到培养皿中；
4)用吸管将平皿中的细胞悬液轻轻吹打混匀，然后将悬液贴壁轻轻加入到预置等体积淋巴细胞分离液的离心管中，悬于上层，1500rpm，离心20min；
5)用吸管小心地将中间云雾状白膜层的单个核细胞吸取到另一离心管中，用DMEM培养基洗涤两次(1000rpm,5min)，弃上清液；
6)用骨髓间充质干细胞专用培养基重悬细胞，以1×105个/cm2接种于培养板中，5d后全量换液，以后每3d全量换液一次；
7)待贴壁细胞达到80％～90％融合后，按1:2比例传代。
1.2大鼠BMSCs的荧光鉴定：
1)PBS漂洗1次后，4％多聚甲醛固定15min～30min；
2)0.1％Triton室温下处理15min；
3)PBS洗2次；
4)5％FBS室温下封闭15min；
5)一抗4℃孵育过夜；
6)PBS洗3次，每次5min；
7)加二抗，37℃孵育1h；
8)室温避光孵育Hoechst 15min；
9)荧光显微镜下拍照，结果如图1。
实施例2：CCK8检测紫外照射剂量对大鼠BMSCs毒性研究
2.1设置以下组别：
A.BMSCs组；B.BMSCs+UVB(24cm)组；C.BMSCs+UVB(48cm)组；D.BMSCs+UVB(72cm)组；E.BMSCs+UVB(96cm)组；F.BMSCs+UVB(120cm)组；
1)培养BMSCs细胞，待细胞长满后调整细胞浓度为2×104cells/ml，接种于96孔培养板，每孔100μl，37℃，5％CO2培养箱内培养24h；
2)按照上述分组进行紫外照射，对照组在紫外照射时遮以铝箔，照射30min后，37℃继续培养12h，24h，48h，72h，96h后进行CCK-8检测；
3)每孔加入20μl的CCK-8，37℃，5％CO2培养箱内避光孵育3h；
4)酶标仪450nm波长下测定同一时间点OD值，用测得的OD值进行细胞生长影响的分析。CCK-8结果如图2，紫外照射距离为24cm及48cm时，BMSCs细胞生长受到抑制。
实施例3：CCK8筛选共轭亚油酸对大鼠BMSCs的无毒浓度
3.1设置以下组别：
A.BMSCs组；B.BMSCs+CLA(12.5μM)组；C.BMSCs+CLA(25μM)组；D.BMSCs+CLA(50μM)组；E.BMSCs+CLA(100μM)组；F.BMSCs+CLA(200μM)组；
1)培养BMSCs细胞，待细胞长满后调整细胞浓度为2×104cells/ml，接种于96孔培养板，每孔100μl，37℃，5％CO2培养箱内培养24h；
2)将两种CLA 1:1混合后，按照上述分组进行给药，37℃继续培养12h，24h，48h，72h，96h后进行CCK8检测；
3)每孔加入20μl的CCK-8，37℃，5％CO2培养箱内避光孵育3h；
4)酶标仪450nm波长下测定同一时间点OD值，用测得的OD值进行细胞生长影响的分析。CCK-8结果如图3，显示200μM CLA处理的BMSCs细胞生长速率受到一定抑制。
实施例4：紫外照射对大鼠BMSCs成骨诱导效果检测
4.1细胞培养及处理
4.1.1设置以下组别：
A.BMSCs组；B.BMSCs+成骨诱导组；C.BMSCs+成骨诱导+UVB(120cm)组；D.BMSCs+成骨诱导+UVB(96cm)组；E.BMSCs+成骨诱导+UVB(72cm)组；
1)将BMSCs细胞接种到培养皿或孔板中，并在含有10％FBS的DMEM培养基中进行培养；
2)待细胞贴壁后，进行紫外UVB照射30min，然后换成成骨诱导培养基进行培养(成骨诱导培养基:DMEM,5μg/ml胰岛素,100nM地塞米松,10mM的β-甘油磷酸钠和0.2mM的Vc)；
3)3d换一次液，诱导分化，分别于成骨诱导14d，21d后进行ALP染色及茜素红染色，诱导14d进行ALP活性检测及ROS检测。
4.2 ALP活性检测
4.2.1实验方法
1)酶标仪预热30min以上，调节波长到520nm，蒸馏水调零；
2)按照下表进行加样；
3)ALP计算公式：
定义：100ml液体在37℃与基质作用15分钟产生1mg酚为1个金氏单位。
实验结果如图22显示，UVB照射距离为72cm时BMSCs细胞成骨诱导14d时ALP活性有轻微降低。
4.3 ALP及茜素红染色
4.3.1ALP染色
1)移除培养板中培养基，PBS清洗干净；
2)加入ALP固定液固定3min或4％多聚甲醛固定10～15min，PBS清洗；
3)滴加配制好的ALP孵育液，放入湿盒中，避光孵育15～20min，PBS清洗；
4)显微镜下观察并拍照。
4.3.2茜素红染色
1)移除培养板中培养基，用PBS洗2次；
2)用10％中性福尔马林或4％多聚甲醛固定10-15min；
3)弃去固定液，用ddH2O洗3次；
4)将水完全吸干净后慢慢加入茜素红S染色液，染色20-30min；
5)弃去染料，用ddH2O洗3-5次；
6)每孔加入适量ddH2O防止孔内干燥。显微镜下观察并拍照。
实验结果如图4，显示UVB照射距离为72cm时成骨受到轻微抑制。
4.4 ROS检测
4.4.1实验方法
1)按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/l；
2)去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA，加入的体积以能充分盖住细胞为宜；
3)37℃细胞培养箱内孵育20分钟；
4)用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；
5)用荧光倒置显微观察细胞荧光强度并拍照。
实验结果如图5显示，UVB紫外照射后细胞ROS生成率上升，其中UVB照射距离为72cm时细胞ROS荧光最为显著。
实施例5：共轭亚油酸对紫外照射引起成骨细胞氧化损伤的缓解效应研究
5.1细胞培养及处理
5.1.1设置以下组别：
A.BMSCs组；B.BMSCs+成骨诱导组；C.BMSCs+成骨诱导+UVB组；D.BMSCs+成骨诱导+UVB+CLA(25μM)组；E.BMSCs+成骨诱导+UVB+CLA(50μM)组；F.BMSCs+成骨诱导+UVB+CLA(100μM)组；
1)将BMSCs细胞接种到培养皿或孔板中，并在含有10％FBS的DMEM培养基中进行培养；
2)待细胞贴壁后，进行紫外UVB照射，照射距离为72cm，照射时间30min，然后换成成骨诱导培养基进行培养(成骨诱导培养基:DMEM,5μg/ml胰岛素,100nM地塞米松,10mM的β-甘油磷酸钠和0.2mM的Vc)，并加入相应浓度的CLA(两种CLA 1:1混合)；
3)3d换一次液，诱导分化，分别于成骨诱导14d，21d后进行ALP染色及茜素红染色，诱导14d进行ALP活性检测及ROS检测。
参见实施例4的检测方法，进行ALP活性检测、ALP及茜素红染色、ROS检测，实验结果如图6显示，CLA能够显著提高成骨诱导14d时细胞的ALP活性；如图7显示，CLA能够明显促进成骨形成；如图8显示，CLA能有效缓解UVB紫外照射对细胞产生的氧化损伤。
实施例6：大鼠骨髓巨噬细胞的分离
6.1实验方法
1)无菌条件下取出SD乳鼠双侧股骨和胫骨：超净台中剪开干骺端，用5ml无菌注射器，抽取无血清1640培养基反复轻柔冲洗骨髓腔4次；100μm细胞过滤器过滤后1200rpm离心5min，弃上清；
2)加入10倍细胞体积(约5ml)无菌的1×红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，在冰上裂解5min，1000rpm离心5min，弃红色上清以去除红细胞；
3)用无血清1640培养基重悬沉淀洗涤2次，用含体积分数10％的1640培养液5ml重悬骨髓细胞，接种于25cm2塑料培养瓶中，于37℃、体积分数5％CO2培养箱静置培养过夜，收集上清，并用无血清1640培养液清洗培养瓶3次，1200rpm离心5min；
4)用10％的FBS和100μg/l M-CSF的1640培养液10ml重悬单核细胞后接种于100mm培养皿中即可；
实施例7:CCK8检测紫外照射剂量对大鼠骨髓巨噬细胞毒性研究
7.1设置以下组别：
A.BMMCs组；B.BMMCs+UVB(24cm)组；C.BMMCs+UVB(48cm)组；D.BMMCs+UVB(72cm)组；E.BMMCs+UVB(96cm)组；F.BMMCs+UVB(120cm)组；
1)BMMCs细胞，接种于96孔培养板，用含10％的FBS和100μg/l M-CSF的1640培养液培养刺激贴壁，37℃，5％CO2培养箱内培养24h；
2)按照上述分组进行紫外照射，对照组在紫外照射时遮以铝箔，照射30min后，37℃继续培养12h，24h，48h，72h，96h后进行CCK8检测；
3)每孔加入20μl的CCK-8，37℃，5％CO2培养箱内避光孵育3h；
4)酶标仪450nm波长下测定同一时间点OD值，用测得的OD值进行细胞生长影响的分析。CCK-8结果如图9显示，紫外照射距离为24cm及48cm时，细胞生长受到抑制。
实施例8：CCK8筛选共轭亚油酸对大鼠骨髓巨噬细胞的无毒浓度
8.1设置以下组别：
A.BMMCs组；B.BMMCs+CLA(12.5μM)组；C.BMMCs+CLA(25μM)组；D.BMMCs+CLA(50μM)组；E.BMMCs+CLA(100μM)组；F.BMMCs+CLA(200μM)组；
1)BMMCs细胞，接种于96孔培养板，用含10％的FBS和100μg/l M-CSF的1640培养液培养刺激贴壁，37℃，5％CO2培养箱内培养24h；
2)将两种CLA 1:1混合后，按照上述分组进行给药，37℃继续培养12h，24h，48h，72h，96h后进行CCK8检测；
3)每孔加入20μl的CCK-8，37℃，5％CO2培养箱内避光孵育3h；
4)酶标仪450nm波长下测定同一时间点OD值，用测得的OD值进行细胞生长影响的分析。CCK-8结果显示如图10，200μM CLA处理的BMMCs细胞生长速率受到一定抑制。
实施例9：紫外照射对大鼠骨髓巨噬细胞破骨诱导效果检测
9.1细胞培养及处理
9.1.1设置以下组别：
A.BMMCs组；B.BMMCs+破骨诱导组；C.BMMCs+破骨诱导+UVB(120cm)组；D.BMMCs+破骨诱导+UVB(96cm)组；E.BMMCs+破骨诱导+UVB(72cm)组；
1)将BMMCs细胞接种到培养皿或孔板中，并在含有10％的FBS和100μg/l M-CSF的1640培养液中进行培养；
2)待细胞贴壁后，进行紫外UVB照射30min，后加入含10％FBS，100ng/ml M-CSF和30μg/l RNAKL的1640培养液，破骨诱导7d后进行后期实验检测。
9.2TRAP染色
9.2.1实验方法
1)诱导结束后，将各组细胞固定后，洗涤3～5次，每次3～5min；
2)预热足量的去离子水至37℃，使用前检测温度；
3)预热固定液至室温(18～26℃)，将诱导组+不加钛片组和诱导组+纯钛片组再固定30s，然后用去离子水彻底清洗，不要使细胞表面干燥；
4)配置孵育液。取1个离心管，加入0.1ml的Fast Garnet GBC Solution和0.1ml的Sodium Nitrite Solution，轻轻的上下翻转混匀30s，静置2min；
5)随后依次加入9ml预热至37℃的去离子水、0.1ml Naphthol AS-BI PhosphateSolution、0.4ml Acetate Solution和0.2ml Tartrate Solution；
6)将离心管置于水浴锅中预热至37℃；
7)将孵育液加入两组细胞中，37℃避光孵育1h；
8)弃掉孵育液，苏木素复染8～10min，自来水冲洗反蓝；
9)显微镜下拍照。
实验结果显示如图11，UVB照射能够促进破骨形成，照射距离为72cm时促进效果最为明显。
9.3F-actin染色
9.3.1实验方法
1)破骨诱导完成后弃培养基，PBS清洗后用4％多聚甲醛固定30min；
2)PBS清洗3遍，5min/次；
3)0.1％TritonX-100通透15-20min；
4)PBS清洗3遍，5min/次；
5)加入F-actin探针，37℃孵育30min；
6)PBS清洗3遍，5min/次；
7)Hoechst室温孵育10min；
8)荧光倒置显微镜下拍照。
实验结果显示如图12，UVB照射能够促进破骨形成，照射距离为72cm时促进效果最为明显。
实施例10：共轭亚油酸抑制紫外照射引起破骨细胞生成效应检测
10.1细胞培养及处理
10.1.1设置以下组别：
A.BMMCs组；B.BMMCs+破骨诱导组；C.BMMCs+破骨诱导+UVB；D.BMMCs+破骨诱导+UVB+CLA(25μM)组；E.BMMCs+破骨诱导+UVB+CLA(50μM)组；F.BMMCs+破骨诱导+UVB+CLA(100μM)组；
1)将BMMCs细胞接种到培养皿或孔板中，并在含有10％的FBS和100μg/l M-CSF的1640培养液中进行培养；
2)待细胞贴壁后，进行紫外UVB照射，照射距离为72cm，照射时间30min，后加入含10％FBS，100ng/ml M-CSF和30μg/l RNAKL的1640培养液，并按照上述分组分别添加CLA(两种CLA1:1混合)，破骨诱导7d后进行后期实验检测。
参照实施例9的方法进行TRAP染色、F-actin染色，实验结果显示如图13，UVB照射能够促进破骨形成，而加入CLA后破骨形成受到抑制。实验结果显示如图14，UVB照射能够促进破骨形成，而加入CLA后破骨形成受到抑制。
10.2ELISA检测
10.2.1实验方法
1)将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100μl。待测样品加入到其他孔，每孔100μl。
2)给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。
3)弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μl，混匀，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时；
4)甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干，重复此洗板步骤3次；
5)每孔加酶结合物工作液100μl，加上覆膜，37℃温育30分钟；
6)弃去孔内液体，甩干，洗板5次；
7)每孔加底物溶液(TMB)90μl，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右；
8)每孔加终止液50μl，终止反应；
9)立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度。
ELISA实验结果显示如图15，与单纯破骨诱导组相比，进行紫外UVB照射后，细胞培养上清中IL-6、TNF-α浓度显著上升，IL-10浓度显著下降；而与破骨诱导+UVB组相比，加入共轭亚油酸后，细胞培养上清中IL-6、TNF-α浓度显著下降，IL-10浓度显著上升。
实施例11：去卵巢模型构建及观察
11.1设置以下组别：
A组：Control；B组：OVX；C组：OVX+UVB照射；D组：OVX+UVB照射+CLA低剂量；E组：OVX+UVB照射+CLA中剂量；F组：OVX+UVB照射+CLA高剂量；
1)SD大鼠随机分成上述6组，每组5只。1％戊巴比妥钠麻醉，取腰椎后侧面切口，暴露卵巢，将卵巢切除；
2)卵巢切除术后60天，待大鼠体内雌激素代谢完毕后，各组分别给予UVB照射(每日一次，每次2h)及共轭亚油酸灌胃(每日一次，低剂量组按0.4g/kg灌胃，中剂量组0.8g/kg，高剂量组1.2g/kg)；
3)分别于治疗2周、4周、8周时眼眶采血进行生化指标检测，同时8周时各组动物被脱颈处死，取股骨(Micro CT及组织学检测)及椎骨(生物力学分析)。
生化检测
血清制备：SD大鼠眼眶采血，3000rpm离心3min取上清待检。
ALP、磷、钙检测：生化仪上机检测。
25(OH)D3、CTX浓度检测(竞争法ELISA，详情参见说明书)
1)将标准品工作液依次加入到96孔板中，每个浓度的工作液加50μl。待测样品加入到其他孔，每孔50μl。立即每孔加入配好的生物素化抗体工作液50μl。给酶标板覆膜，37℃孵育45分钟；
2)甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次；
3)每孔加酶结合物工作液100μl，加上覆膜，37℃温育30分钟；
4)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤2；
5)每孔加底物溶液(TMB)90μl，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右。
6)每孔加终止液50μl，终止反应；
7)立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。
OC、PTH-C检测(夹心法ELISA，详情参见说明书)
1)将标准品工作液依次加入到96孔板中，每个浓度的工作液加100μl。待测样品加入到其他孔，每孔100μl。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟；
2)弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μl，混匀，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时；
3)甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。
4)每孔加酶结合物工作液100μl，加上覆膜，37℃温育30分钟。
5)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。
6)每孔加90μl底物溶液(TMB)，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右。
7)每孔加终止液50μl，终止反应。
8)立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。
SOD检测(WST-1法，详情参见说明书)
按照下表进行加样及检测。
实验结果显示如图16，与模型组相比，随紫外UVB照射及共轭亚油酸灌胃周期延长，SD大鼠血清中ALP、磷、CTX、PTH-C浓度均显著下降，表明骨吸收受到抑制。
而与模型组相比，随紫外UVB照射及共轭亚油酸灌胃周期延长，SD大鼠血清中25-HVD3、钙、OC浓度均显著升高，表明UVB照射及共轭亚油酸能促进维生素D的形成、钙形成累积，以及促进成骨细胞活性，从而使骨钙素增加，促进骨形成，有效缓解骨质疏松。
紫外照射同时会加剧氧化损伤，血清中SOD水平较模型组显著下降，而共轭亚油酸灌胃能显著提高血清中SOD酶活性，有效缓解紫外照射引起的氧化损伤。
Micro CT检测
1)SD大鼠脱颈处死，75％酒精消毒5min；
2)剔除股骨周围组织；
3)4％中性甲醛固定；
4)Micro CT扫描股骨远端。
Micro CT结果显示如图17，UVB照射能促进去卵巢手术后SD大鼠骨形成，同时CLA辅助治疗能显著促进骨新生。
生物力学分析
1)SD大鼠脱颈处死，75％酒精消毒5min；
2)取同一部位4节胸椎椎骨，剔除周围组织，生理盐水浸润的纱布包裹骨组织；
3)低温寄送上海怀宇生物进行检测分析。
生物力学结果显示如图18，去卵巢大鼠胸椎骨抗形变能力显著下降，而UVB照射及共轭亚油酸灌胃治疗后椎骨刚性增加，抗形变能力提高。
组织学检测
石蜡切片
1)取材切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5×5mm2。
2)固定10％甲醛固定2天以上，10％甲醛固定后的组织水洗20min*3次。
3)脱水
a)水洗后组织于5ml离心管内50％乙醇脱水1h-3h；
b)75％乙醇脱水1h-2h或过夜；
c)80％乙醇脱水1h-2h；
d)90％乙醇脱水1h；
e)95％乙醇脱水0.5h或者过夜；
f)无水乙醇脱水20min，继续换无水乙醇脱水20min；
g)无水乙醇+二甲苯1:1 20min(进行过渡，以防脱水不彻底，加入二甲苯直接浑浊)。
4)透明 二甲苯透明2次，每次20min。
5)浸蜡 软蜡1h；软蜡2h；硬蜡2h。
6)组织包埋
a)准备好模具，将组织平放在模具底部；
b)切面朝下后将包埋盒盖在模具上；
c)将熔蜡倒入模具内至蜡液溢出模具；
d)轻轻提起模具，平放在冰冻台中；
e)待其迅速冷却凝固约10min后取出。
7)切片
a)将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截；
b)将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行；
c)在微动装置上调节切片要求的厚度，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触；
d)切片完毕，应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。
8)展片 将切片分开，投入到48℃的温水浴中，这时切片都浮在水面上。
9)捞片和拷片 捞片后50℃拷片30min以上。
HE染色
1)二甲苯Ⅰ脱蜡30min，二甲苯Ⅱ脱蜡10min；
2)梯度酒精复水：100％酒精3min，100％酒精3min，95％酒精3min，85％酒精3min，75％酒精3min，50％酒精3min，蒸馏水3min，蒸馏水3min，PBS 5min；
3)染苏木素3～5min，水洗；
4)1％HCl-75％乙醇分化5～10s，水洗；
5)用碱水促蓝20s，水洗；
6)伊红染色30～60s，水洗；
7)80％乙醇洗3～5s，95％乙醇洗3～5s，无水乙醇洗3～5s；
8)丙三醇封片，倒置显微镜下观察。
TRAP染色
1)切片常规脱蜡至水；
2)TRAP固定液4度固定1min，流水冲洗1min；
3)TRAP染色液37度染色60min，流水冲洗1min；
4)苏木素室温染色5min，流水冲洗至组织反蓝；
5)无水乙醇浸泡，擦干组织周围液体；
6)中性树胶封固。
茜素红染色
1)PBS冲洗；
2)95％乙醇浸泡后自然风干；
3)滴加茜素红染液，常温下孵育5min；
4)蒸馏水冲洗3遍；
5)滴加苏木素染核1min；
6)蒸馏水冲洗，擦干组织周围液体；
7)无水乙醇浸泡，擦干组织周围液体；
8)滴加中性树胶，进行封片。
实验结果如下：
HE染色：结果显示如图19，去卵巢大鼠骨组织稀疏，骨小梁断裂排列不整，骨髓腔扩大，而UVB照射及共轭亚油酸灌胃治疗后骨小梁数目有所增加，骨小梁断裂减少。
TRAP染色：结果显示如图20，去卵巢大鼠骨组织TRAP阳性区域显著增加，而UVB照射及共轭亚油酸灌胃治疗后，TRAP阳性面积显著减少，表明UVB照射及共轭亚油酸在体内实验中能够抑制破骨性骨溶解。
茜素红染色：结果显示如图21，去卵巢大鼠骨组织茜素红染色阳性显著降低，而UVB照射及共轭亚油酸灌胃治疗后，染色阳性有所增加，表明UVB照射及共轭亚油酸在体内实验中能够增强成骨活性，促进骨新生。
本申请通过实验证实，紫外线照射不会导致骨质疏松的这个概念是有问题的。我们发现紫外线对细胞直接照射可能是由于氧化作用加速细胞凋亡或者影响细胞功能，所以在应用CLA后可抑制紫外线照射的负面影响，充分发挥其有益于骨代谢的作用。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的活性成分包括9Z，11E和10E，12Z共轭亚油酸，质量比为1：1。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还包括药用可接受的基料、载体、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、加溶剂、成膜剂、稀释剂、成浆液剂、增粘剂、乳化剂、表面活性剂中的一种或几种。
3.权利要求1或2所述的药物组合物用于制备治疗骨质疏松药物中的应用。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的骨质疏松包括促进紫外线照射导致的骨质疏松。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于：所述紫外线照射包括直接照射或雌激素缺失后进行紫外线照射。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述紫外线照射，其为照射骨代谢细胞而发生生长异常，导致骨组织稀疏。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述骨代谢细胞包括BMSCs细胞、成骨细胞或成骨、骨髓巨噬细胞、破骨细胞或破骨中的一种或几种。
8.如权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于：所述应用，其方式包括单独使用药物组合物、或采用药物组合物与紫外线照射联合处理。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述联合处理，其紫外照射的距离为24~72cm，药物组合物中共轭亚油酸的有效浓度小于200μM。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述应用，其方式还包括进行7~21天的诱导。
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|---|---|---|---|
| CN202011347362.XA CN112451512A (zh) | 2020-11-26 | 2020-11-26 | 一种药物组合物及其治疗骨质疏松的用途 |
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| CN112451512A true CN112451512A (zh) | 2021-03-09 |
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| CN202011347362.XA Pending CN112451512A (zh) | 2020-11-26 | 2020-11-26 | 一种药物组合物及其治疗骨质疏松的用途 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115708829A (zh) * | 2021-09-29 | 2023-02-24 | 浙江中医药大学 | 一种抗骨质疏松药物组合物及其应用 |
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- 2020-11-26 CN CN202011347362.XA patent/CN112451512A/zh active Pending
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