DE69934627T2 - Konjugierte Linolsäurezusammensetzung - Google Patents

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    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der menschlichen und tierischen Ernährung, und insbesondere bestimmte neue Zusammensetzungen von konjugierten Linolsäuren (CLA). Diese Zusammensetzungen werden gemäß eines neuartigen Verfahrens hergestellt, bei dem die Isomerisation von 9,2-Linolsäure kontrolliert wird.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Im Jahre 1978 haben Forscher an der University of Wisconsin die Identität einer Substanz entdeckt, die in gekochtem Rind enthalten ist, welche die Mutagenese zu hemmen schien. Die Substanz wurde als eine Mischung aus Positionsisomeren der Linolsäure (C18:2) mit konjugierten Doppelbindungen befunden. Die c9,t11- und t10,c12-Isomere sind am reichlichsten vorhanden, doch ist ungewiss, welche Isomere für die beobachtete biologische Aktivität verantwortlich sind. Bei Studien des markierten Einbaus ist festgestellt worden, dass das 9,11-Isomer etwas bevorzugter aufgenommen und in die Phospholipid-Fraktion von tierischen Geweben eingebaut zu werden scheint, und in einem geringeren Umfang das 10,12-Isomer. (Siehe Ha, et al. Cancer Res., 50: 1097 (1991)).
  • Die mit konjugierten Linolsäuren (bezeichnet als CLA) assoziierte biologische Aktivität ist vielfältig und komplex. Derzeit ist sehr wenig über die Wirkmechanismen bekannt, obschon mehrere laufende präklinischen und klinischen Untersuchungen wahrscheinlich ein neues Licht auf die physiologischen und biochemischen Wirkungsweisen werten werden. Die antikarzinogenen Eigenschaften von CLA sind gut dokumentiert. Die Verabreichung von CLA hemmt die Ratten-Mammatumorigenese, wie gezeigt von Ha, et al., Cancer Res., 52: 2035s (1992). Ha, et al., Cancer Res., 50: 1097 (1990) berichteten ähnliche Ergebnisse in einem Vormagenneoplasie- Mausmodell. CLA ist auch als ein starkes zytotoxisches Agens gegen humane Ziel-Melanom-, -Kolorektum- und -Brustkrebszellen in vitro identifiziert worden. Ein größerer Überblicksartikel der letzten Zeit bestätigt die aus einzelnen Studien gezogenen Schlussfolgerungen (Ip, Am. J. Clin. Nutr., 66 (6 Supp): 1523s (1997)).
  • Obschon die Mechanismen der CLA-Wirkung nach wie vor im Dunklen liegen, liegt ein Nachweis dafür vor, dass irgendeine/welche Komponente(n) des Immunsystems, zumindest in vivo, beteiligt sein kann/können. US-Pat. Nr. 5.585.400 (Cook, et al.), hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen, beschreibt ein Verfahren zur Abschwächung allergischer Reaktionen bei Tieren, die durch Typ I- oder TgE-Überempfindlichkeit vermittelt sind, durch Verabreichen einer Diät, die CLA enthält. Von CLA in Konzentrationen von etwa 0,1 bis 1,0 % wurde auch gezeigt, dass es ein wirksames Adjuvans in der Konservierung weißer Blutzellen darstellt. US-Pat. Nr. 5.674.901 (Cook, et al.), hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen, beschreibt, dass die orale oder parenterale Verabreichung von CLA in Form entweder der freien Säure oder des Salzes zu einer Zunahme der CD-4- und CD-8-Lymphozyten-Subpopulationen führte, die mit der zellvermittelten Immunität in Verbindung stehen. Nachteilige Wirkungen, die aus einer Vorbehandlung mit exogenem Tumornekrosefaktor entstanden waren, konnten indirekt durch Erhöhung oder Beibehaltung der Spiegel an CD-4- und CD-8-Zellen in Tieren gemildert werden, denen CLA verabreicht wurde. Schließlich beschreibt US-Pat. Nr. 5.430.066, hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen, die Wirkung von CLA in der Verhütung eines Gewichtsverlusts und von Anorexie durch Immunstimulation.
  • Abgesehen von potenziellen therapeutischen und pharmakologischen Anwendungen der CIA, wie zuvor dargestellt, hat die nutritive Anwendung von CLA in Form einer Nahrungsergänzung großes Aufsehen erregt. Die Anwendung von CLA, zusammen mit Isomeren, Salzen und Estern davon, um den Mineraliengehalt von Knochen aufrecht zu erhalten oder zu erhöhen, ist beschrieben in WO 98/05318. Von CLA ist festgestellt worden, dass es eine grundlegende generalisierte Wirkung auf die Körperzusammensetzung ausübt, indem es insbesondere die Verteilung von Fett- und Magergewebemasse neu bestimmt. US-Patent Nr. 5.554.646 (Cook et al.), hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen, beschreibt ein Verfahren unter Verwendung von CLA als einer Nahrungsergänzung, bei dem Schweine, Mäuse und Menschen Diäten erhielten, die 0,5 % CLA enthielten. Bei jeder Spezies wurde ein signifikanter Abfall des Fettgehalts bei gleichzeitiger Zunahme der Proteinmasse beobachtet. Es ist interessant, dass bei diesen Tieren eine Erhöhung des Fettsäuregehalts der Diät durch Zugabe von CLA zu keiner Zunahme im Körpergewicht führte, doch mit einer Neuverteilung von Fett- und Magermasse innerhalb des Körpers verbunden war. Ein anderes ernährungsbezogenes Phänomen von Interesse ist die Wirkung einer CLA-Ergänzung auf die Futterumsetzung. US-Pat. Nr. 5.428.072 (Cook, et al.), hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen, liefert Daten, die zeigen, dass die Aufnahme von CLA in Tierfutter (Vögel und Säuger) die Effizienz der Futterumsetzung erhöhte, was zu einer größeren Gewichtszunahme bei den mit CLA ergänzten Tieren führte. Die potenziell günstigen Effekte einer CLA-Ergänzung für Nahrungstierzüchter sind offenkundig.
  • Eine andere wichtige Quelle von Interesse an CLA, und zwar eine, die ihr frühes kommerzielles Potenzial unterstreicht, ist, dass es in Nahrungsmitteln und Futtermitteln, die von Menschen ebenso wie Tieren konsumiert werden, natürlich vorkommt. Insbesondere kommt CLA in Produkten von Wiederkäuern reichlich vor. Zum Beispiel sind mehrere Studien durchgeführt worden, bei denen CLA in verschiedenen Milchprodukten untersucht wurde. Aneja, et al., J. Dairy Sci., 43: 231 (1990) beobachtete, dass die Verarbeitung von Milch zu Joghurt zu einer Konzentrierung der CLA führte. (Shanta et al., Food Chem., 47:257 (1993)) zeigte, dass eine kombinierte Erhöhung der Verarbeitungstemperatur und Zusatz von Molke die CLA-Konzentration während der Herstellung von Schmelzkäse erhöhte. In einer separaten Studie berichteten Shanta et al. J. Food. Sci., 60: 695 (1995), dass zwar die Verarbeitungs- und Lagerbedingungen die CLA-Konzentrationen nicht merklich verminderten, dass sie aber auch keine Anstiege beobachteten. In der Tat haben mehrere Studien gezeigt, dass eine saisonale oder interanimale Schwankung bis zu dreifache Unterschiede im CLA-Gehalt der Milch von Kühen ausmachen kann (z.B. siehe Parodi et al., J. Dairy Sci., 60: 1550 (1977)). Ebenso sind auch Ernährungsfaktoren in die Variation des CLA-Gehalts einbezogen, wie festgestellt von Chin et al., J. Food Camp. Anal., 5: 185 (1992). Aufgrund dieser Schwankung des CLA-Gehalts in natürlichen Quellen wird eine Aufnahme der vorgeschriebenen Mengen an verschiedenen Nah rungsmitteln nicht garantieren, dass der Mensch oder das Tier die optimalen Dosen erhält, um die Erzielung des erwünschten nutritiven Effekts zu gewährleisten.
  • Linolsäure stellt eine wichtige Komponente von Biolipiden dar und umfasst einen signifikanten Anteil an Triglyceriden und Phospholipiden. Linolsäure ist als eine "essentielle" Fettsäure bekannt, was bedeutet, dass das Tier sie aus exogenen Nahrungsquellen aufnehmen muss, da es sie nicht selbst synthetisieren kann. Die Aufnahme der CLA-Form von Linolsäure kann zu einer direkten Substitution von CLA in Lipidpositionen hinein führen, von denen unkonjugierte Linolsäure abgewandert wäre. Dies ist allerdings nicht nachgewiesen worden, und einige der beobachteten, in hohem Maße nutzbringenden, doch unerklärten Wirkungen können sogar aus einer Repositionierung von CLA innerhalb der Lipidarchitektur an Stellen resultieren, an die unkonjugierte Linolsäure ansonsten nicht gewandert wäre. Es ist nun klar, dass eine Quelle von tierischer CLA, insbesondere in Milchprodukten, aus der biochemischen Wirkung bestimmter Pansenbakterien auf native Linolsäure entstanden ist, wobei zunächst die Linolsäure zu CLA isomerisiert und dann in die Pansenhöhle sekretiert wird. Kepler, et al., J. Nutrition, 56: 1191 (1966) isolierte ein Pansenbakterium, Bufyrivibrio fibrisolvens, welches die Bildung von 9,11-CLA als einem Intermediat in der Biohydrierung von Linolsäure katalysiert. Chin, et al., J. Nutrition, 124: 694 (1994) stellten ferner fest, dass in den Geweben von Nagern gefundene CLA mit Bakterien assoziiert war, da entsprechende keimfreie Ratten keine CLA produzierten. Butyrivibrio tibrisolvens wird auch in US 5.208.356 und EP 0440325 zur Produktion von CLA verwendet.
  • CLA kann durch Isomerisation von Fetten oder Ölen produziert werden. WO 97/46230 beschreibt ein Verfahren zur Beibehaltung bestehender Mengen an Körpergewicht oder Fett beim Menschen durch Verabreichung von CLA entweder als einem Nahrungszusatz oder als einem Pharmazeutikum. Die CLA wird durch die Isomerisation von Speiseölen bei 180°C produziert. Das in EP 0839897 beschriebene Verfahren zur Produktion von CLA wendet Temperaturen von 110 °C bis 170 °C für die Isomerisation an, wobei die höhere Temperatur von 170 °C erforderlich ist, um Umsetzungsraten von über 99 % zu erreichen. WO 97/18320 beschreibt ein Isomerisationsverfahren unter Verwendung von Ethylenglycol als Lösungsmittel, bei dem Temperaturen von 180 °C verwendet werden.
  • In der Entwicklung einer definierten handelsüblichen Quelle von CLA sowohl für die therapeutische als auch nutritionale Anwendung ist ein Prozess zur Erzeugung von großen Mengen eines definierten Materials erforderlich. Das Problem mit den meisten, mittels herkömmlicher Ansätze erzeugten, CLA-Produkten besteht in ihrer Heterogenität und der wesentlichen Abweichung hinsichtlich der Isoform von Charge zu Charge. Beträchtliche Aufmerksamkeit wurde der Tatsache zuteil, dass die Aufnahme großer Mengen an hydrierten Ölen und Backfetten, anstelle von tierischem Fett, zu einer Ernährung mit hohem trans-Fettsäuregehalt geführt hat. Zum Beispiel zeigte Holman, et al., PNAS, 88:4830 (1991), dass mit hydrierten Ölen gefütterte Ratten eine Anhäufung von ungewöhnlichen mehrfach ungesättigten Fettsäure-Isomeren in der Rattenleber zeigten, die den normalen Stoffwechsel der natürlich vorkommenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu beeinträchtigen schienen. Diese Bedenken wurden zusammengefasst in einer frühen Ausgabe in Am. J. Public Health, 84:722 (1974). Daher besteht ein starker Bedarf an einem biologisch aktiven CLA-Produkt von definierter Zusammensetzung.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Zusammensetzung von isomerisierten Fettsäuren bereit, die von Keimölen in gereinigter Nahrungsmittelqualität abgeleitet sind. Die Linolsäure, die in einem Keimöl enthalten ist, das auf einen Gehalt von mindestens 50 % Linolsäure hin als einer praktischen Maßnahme ausgewählt ist, ist typischerweise zu über 90 % das 9,12-Octadecadiensäureisomer. Während der Isomerisation wird die 9,12-Octadecadiensäure zu einem Gemisch anderer Isomere umgewandelt, wodurch eine Zusammensetzung mit mindestens 50 % CLA erhalten wird.
  • Die konjugierte linolsäurehaltige Zusammensetzung ist für den Verzehr sowohl durch Menschen als auch Tiere, einschließlich Nahrungstieren wie Rindern, Schweinen, Schafen und Vögeln, und als ein Humanmedikament und eine Nahrungsergänzung vorgesehen. Es stellt eine wichtige Aufgabe dieser Erfindung dar, ein sicheres, definiertes Produkt für diese Anwendungen bereitzustellen. Auch enthalten herkömmliche Produkte signifikante Mengen an unbekannten Fettsäure-Spezies und ungewöhnlichen Isomeren, die aus der Verarbeitung resultieren. Unter den ungewöhnlichen CLA-Isomeren befinden sich die 11,13-Octadecadiensäure- und 8,10-Octadecadiensäureisomere.
  • Bei der vorliegenden Zusammensetzung wird ein hoher Prozentsatz an Linolsäure primär zu den konjugierten c9,t11- und t10,c12-Isomeren in einer sorgfältig kontrollierten Reaktion umgewandelt, was mehr als 90 % dieser Isomere erbringt, so dass weniger als ein kombiniertes 1 Prozent der 11,13-Isomere, weniger als 1 Prozent der 8,10-Isomere, weniger als 1 Prozent der Doppel-trans-Spezies (die t9,t11- und t10,t12-Isomere) und weniger als insgesamt 1 Prozent an unidentifizierten Linolsäure-Spezies gegenüber den herkömmlichen Zusammensetzungen vorhanden sind. Bei vielen einzelnen Produktionsläufen weist die Endzusammensetzung mittels der GC-Analyse nahezu nicht nachweisliche Mengen an diesen Spezies auf. Die 1-Prozent-Grenze in der Konzentration der 11,13-, 8,10- und trans-trans-Isomere dient als einem bequemen und praktischen Qualitätssicherungsstandard der Reinheit für ein im kommerziellen Maßstab hergestelltes Produkt in Nahrungsmittelqualität.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch einen neuen Prozess zur Herstellung der neuen konjugierten linolsäurehaltigen Zusammensetzungen der erforderlichen Reinheit und definierten Zusammensetzung bereit. Der Prozess umfasst die Schritte des Lösens in dem spezifischen nicht-wässrigen Lösungsmittel von Propylenglycol, einem mit einem nicht-wässrigen Medium kompatiblen Alkali, wie z.B. Kaliumhydroxid, Cäsiumhydroxid, Cäsiumcarbonat, oder einem organischen Alkali, wie z.B. Tetraethylammoniumhydroxid, in Abwesenheit Metall-basierter Isomerisationskatalysatorsysteme, Einmengens in das alkalische Propylenglycol eines Keimöls, Erhitzens unter einer Inertgasatmosphäre und bei Umgebungsdrücken auf eine Temperatur im Bereich von 130–165 °C, vorzugsweise etwa 150 °C, unter Nicht-Refluxbedingungen, Abtrennens der Fettsäurefraktion durch Ansäuerung, und wahlweise weiteren Reinigens und Dehydrierens durch Vakuumdestillation und/oder -zentrifugation der Moleküle bereit. Wahlweise kann der Prozessstrom nach der Zubereitung des Reaktions gemischs, entweder vor oder nach dem Erhitzungsschritt, unterbrochen werden. Das Gemisch kann dann zur weiteren Verarbeitung bei fortgesetzten Ansäuerungs- und Destillationsschritten gelagert werden und/oder an einem anderen Ort weiter verarbeitet werden. Nach der Erhitzung, um die Isomerisation zu bewirken, enthält das isomerisierte vermengte Reaktionsgemisch 30–60 Prozent verarbeitetes Keimöl, 10–40 Prozent Alkali und 30–60 Prozent Propylenglycol. Bei diesem Prozess ist es wichtig, Propylenglycol aufgrund seiner Erhitzungseigenschaften und des erhaltenen Isomerisationsmusters zu nutzen. Die Komponenten des gelösten Fettsäure-Reaktionsgemischs sind wie folgt vorhanden:
    30–60 Prozent Keimöl
    10–40 Prozent Alkali
    30–60 Prozent Propylenglycol
  • Somit umfasst das Verfahren bei einigen Ausführungsformen das Bilden eines vermengten Reaktionsgemischs, das ein linolsäurehaltiges Keimöl, Propylenglycol und ein mit einem nicht-wässrigen Medium kompatibles Alkali enthält, Isomerisieren der in dem Keimöl enthaltenen Linolsäure durch Erhitzen zur Bildung von konjugierten Linolsäuren, und Benetzen zur Freisetzung von Glycerol. Eine Toxizität wird vermieden, wie sie entsteht, wenn andere, unerwünschte organische Lösungsmittel wie Ethylenglycol verwendet werden. Unter den Nicht-Refluxbedingungen ist es möglich, die Verarbeitungstemperatur über einen Bereich zu variieren, um das gewünschte Ergebnis mit Ölen von verschiedenartiger Fettsäure-Zusammensetzung zu erzielen. Die Temperatur ist entscheidend, da der prozentuale Anteil an trans,trans-Spezies, als auch anderen unerwünschten und unidentifizierten Spezies mit steigender Temperatur zunimmt. Die Verarbeitungsdauer erfordert etwa 2 bis 6,5 Stunden und erbringt isomerisierte Ausbeuten von größer als 90 Prozent, häufig von sogar 99,5 Prozent. Bei einigen Ausführungsformen kann das linolsäurehaltige Keimöl zunächst behandelt werden, um Alkylester (z.B. Methylester oder Ethylester) der Linolsäure zu erzeugen. Bei noch anderen Ausführungsformen können die konjugierten Linolsäuren in ein Triglycerid aufgenommen werden, indem sie mit einer Lipase in Gegenwart von Glycerol behandelt werden. Bei weiteren Ausführungsformen liefert die vorlie gende Erfindung das durch die obigen Prozesse erzeugte CLA-Präparat von geringer Unreinheit.
  • Bei dem vorliegenden Verfahren ist die Verwendung von Sonnenblumen- und Distelöl aufgrund ihres hohen nativen Gehalts an 9,12-Linolsäure, doch ebenso aufgrund der geringen Mengen an Sterolen, kontaminierenden Phospholipiden und anderen Rückständen, die zur Verschmutzung der Verarbeitungsgeräte neigen und zu einem weniger reinen Endprodukt führen, bevorzugt. Andere Keimöle, wie etwa Mais-, Sojabohnen- und Leinsamenöle, können ebenfalls verwendet werden, doch wird das Endprodukt weniger kompositionell definiert sein und können die Mengen an Unreinheiten bis nahe der Grenzwerte für die oben betrachtete Qualitätskontrolle abweichen, wobei der Isomerisationsprozess selbst weniger vorhersagbar sein wird. Zwar ist ein Keimöl, das mindestens 50 % Linolsäure enthält, als einer praktischen Maßnahme für die industrielle Isomerisation erwünscht, um die Ausbeuten pro Verarbeitungseinheit zu optimieren, doch bestehen keine Verfahrensbeschränkungen bezüglich eines niedrigeren oder höheren Linolgehalts der linolsäurehaltigen Ausgangsmaterialien. Ein geringerer Linolgehalt kann auftreten, wie in der Situation, bei der Öle von unterschiedlichen Quellen verwendet werden, oder bei der Öle mit Nicht-Ölkomponenten vor der Isomerisation kombiniert werden. Ähnlich kann der Linolsäuregehalt der Isomerisationsflüssigkeit viel höher sein als die in nativen Keimölen vorhandenen Mengen, wie in der Situation, bei der gereinigte oder synthetische Linolsäure zu isomerisieren ist.
  • Bei einigen Ausführungsformen kann die oben beschriebene CLA von geringer Unreinheit als Acylglycerole oder Alkylester bereitgestellt werden. Demgemäß wird bei einigen Ausführungsformen eine Acylglycerol-Zusammensetzung bereitgestellt, die eine Vielzahl von Acylglycerol-Molekülen der folgenden Struktur umfasst:
    Figure 00080001
    worin R1, R2 und R3 ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus einer Hydroxylgruppe und einer Octadecadiensäure, welche Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens etwa 30 % an t10,c12-Octadecadiensäure, mindestens etwa 30 % an c9,t11-Octadecadiensäure und etwas weniger als insgesamt 1 % an 8,10-Octadecadiensäure, 11,13-Octadecadiensäure und trans-trans-Octadecadiensäure an Positionen R1, R2 und R3 enthält. Entsprechend wird bei anderen Ausführungsformen eine konjugierte Linolsäure-Zusammensetzung, umfassend ein Gemisch aus Estern der konjugierten Linolsäureisomere bereitgestellt, welches Gemisch mindestens etwa 30 % an t10,c12-Octadecadiensäure, mindestens etwa 30 % an c9,t11-Octadecadiensäure und etwas weniger als insgesamt 1 % an 8,10-Octadecadiensäure, 11,13-Octadecadiensäure und trans-trans-Octadecadiensäure enthält.
  • Bei alternativen Ausführungsformen können die CLA-freien Fettsäuren, Acylglycerole und Alkylester der vorliegenden Erfindung mit Nahrungsmittelprodukten formuliert werden, einschließlich Tierfutter und Nahrungsmittel für den menschlichen Verzehr. Bei anderen Ausführungsformen können die CLA-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung mit physiologisch annehmbaren Trägern oder oralen Darreichungsvehikeln formuliert werden. Bei anderen Ausführungsformen können die biologischen Wirkungen der CLA von geringer Unreinheit ausgenützt werden.
  • Bei der vorliegenden Erfindung wird ein für Futter- oder Nahrungsmittel sicherer konjugierter Linolsäure-Alkylester unter Bedingungen hergestellt, die präferenziell die Isomerisation der gewünschten 10,12- und 9,11-Isomere kontrollieren und dabei die Bildung der 8,10-, 11,13- und trans-trans-Spezies beschränken. Diese Bedingungen werden durch Verwendung einer durch Alkalialkoholat katalysierten Reaktion erfüllt, wobei ein Keimöl zur Freisetzung der freien Fettsäuren aus einem Glycerol-Rückgrat gespalten und dann vor der Isomerisation verestert wird. Der Schlüssel zu einer Adaptierung dieses Verfahrens auf ein kommerziell tragfähiges Produkt besteht in einer Reduzierung jener Verfahrensschritte, die zusätzliche Kosten produzieren. Typischerweise verschmutzen Rückstände, die von nicht-öligen Komponenten der Keimöle, wie z.B. Sterole und Phosphatide, stammen, die Geräte und vermindern den Wohlgeschmack bei Nutzung als Futter oder Nahrungsmittel. Im Falle typischer Keimöle wie etwa Soja- oder Maisöl sind diese Rückstände in ausreichender Quantität vorhanden, um ein CLA-Ester-Produkt in für den Konsum bestimmten Produkten nicht verwendbar zu machen.
  • In der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung werden nicht-ölige Rückstände nicht aus der Ölkomponente ausgereinigt, sondern vielmehr wird die Quelle des Öls so ausgewählt, dass solche Rückstände auf akzeptablen Höhen gehalten werden. Durch die Wahl von Distel- oder Sonnenblumenöl als einer Ölquelle kann die kritische Menge an Rückständen auf zwischen 0,1 und 0,5 % Phosphatiden und auf eine nicht-verseifte Sterolfraktion kontrolliert werden, die zwischen 5 und weniger als 20 % jeweils an Campesterol und Stigmasterol enthält, ohne umfangreiche Verfahrensschritte für Raffination und Destillation zu erfordern. Der resultierende Linolsäurealkylester setzt sich aus mindestens 50 bis zu etwa 99 Gewichtsprozent Octadecansäureesterisomeren zusammen, die Kombinationen verschiedener möglicher individueller prozentualer Anteile an c9,t11-Octadecansäurealkylester und t10,c12-Octadecansäurealkylester darstellen. Im mit Alkalialkoholat katalysierten Prozess werden nahezu gleiche Mengen jedes dieser Esterisomere erzeugt, doch kann der relative Prozentsatz durch Zugabe der einen oder der anderen Zusammensetzung, die um ein Isomer angereichert ist, verändert werden. Der CLA-Ester kann dann in ein Tierfutter aufgenommen werden, indem das Futter aus herkömmlichen Inhaltsstoffen zu einer für die Spezies und das Alter des Tieres typischen Futterration vermischt wird und damit die konjugierten Linolsäurealkylester in einer biologisch aktiven Konzentration, generell etwa 0,05 bis 3,5 Gewichtsprozent, vermengt werden.
  • Das CLA-Esterprodukt der vorliegenden Erfindung wird durch direkte Isomerisation einer unraffinierten Linolsäure, z.B. einer Linolsäure-Quelle, die keinen Raffinationsschritten unterzogen wurde, erhalten. Die CLA-Ester-Zusammensetzung weist einen Teil auf, der mindestens 50 Gewichtsprozent an Esterisomeren (bis zu im Wesentlichen 100 Prozent) eines Gemischs von Esterisomeren des c9,t11-Octadecansäureesters und t10,c12-Octadecansäureesters umfasst, einen zweiten Teil, der weniger als etwa 10 Prozent nach Aggregatgewicht an Esterisomeren der Struktur 8,10-Octadecansäureester, 11,13-Octadecansäureester und trans,trans-Octadecansäureester, umfasst, und einen dritten Teil, der einen Phosphatidyl-Rest von zwischen 0,1 und 0,5 Prozent des Gesamtgewichts der Zusammensetzung enthält. Die Alkylgruppen können Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl und ähnliches sein. Die Einstellungen der Konzentration der c9,t11- und t10,c12-Isomere können durch Zugabe einer Zusammensetzung vorgenommen werden, die um das eine oder andere Isomer angereichert ist, um eine Esterzusammensetzung zu erhalten, worin das im ersten Teil der Zusammensetzung enthaltene c9,t11 bzw. t10,c12 mehr als 60 Prozent der Gesamtisomere der Octadecansäureester ausmacht.
  • Bei der Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, die zu einer Zusammensetzung in Nahrungsmittelqualität führt, die für ein Tierfutter, als Nahrungsmittelinhaltsstoff oder humane Nahrungsmittelergänzung geeignet ist, wird ein unraffinierter CLA-Ester mit einem Phosphatidyl-Rest von weniger als 0,5 Prozent mit einem Alkalialkoholat in Gegenwart eines einwertigen niedermolekularen Alkohols, wie z.B. Methyl- oder Ethylalkohol, behandelt, wobei die Behandlung bei geringer Temperatur (etwa 90 bis 145 Grad C) fortgesetzt wird, bis wenigstens 50 Prozent des Esters zu einem CLA-Ester umgewandelt sind, woraufhin durch Zugabe einer wässrigen Säure angesäuert und dann der CLA-Ester aus der wässrigen Säure ohne einen Destillationsschritt abgetrennt wird.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt ein Flussdiagramm der für die Produktion von CLA angewandten Verfahrensweise.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Definitionen:
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "konjugierte Linolsäure" oder "CLA" auf eine konjugierte Linolsäure oder Octadecadien-freie Fettsäure. Es ist vorgesehen, dass dieser Begriff alle Positions- und geometrischen Isomere der Linolsäure mit zwei konjugierten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen an einem beliebigen Ort im Molekül umfasst und meint. CLA weicht von gewöhnlicher Linolsäure darin ab, dass die gewöhnliche Linolsäure Doppelbindungen an Kohlenstoffatomen 9 und 12 aufweist. Beispiele der CLA umfassen cis- und trans-Isomere ("E/Z-Isomere") der folgenden Positionsisomere: 2,4-Octadecadiensäure, 4,6-Octadecadiensäure, 6,8-Octadecadiensäure, 7,9-Octadecadiensäure, 8,10-Octadecadiensäure, 9,11-Octadecadiensäure und 10,12-Octadecadiensäure, 11,13-Octadecadiensäure. Wie hierin verwendet, umfasst "CLA" ein einzelnes Isomer, ein ausgewähltes Gemisch von zwei oder mehr Isomeren, und ein nicht-ausgewähltes Gemisch aus Isomeren, die aus natürlichen Quellen erhalten sind, als auch synthetische und halbsynthetische CLA.
  • Wie hierin verwendet, ist beabsichtigt, dass "Triglyceride" von CLA CLA an irgendeiner oder an allen von drei Positionen am Triglycerid-Rückgrat enthalten. Demgemäß kann ein CLA enthaltendes Triglycerid jegliches der Positions- und geometrischen Isomere von CLA enthalten.
  • Wie hierin verwendet, ist beabsichtigt, dass "Ester" von CLA irgendeines und alle Positions- und geometrischen Isomere von CLA umfassen, die durch eine Esterbindung an einen Alkohol oder jegliche andere chemische Gruppe gebunden sind, einschließlich, doch nicht beschränkt, auf physiologisch akzeptable, natürlich vorkommende Alkohole (z.B. Methanol, Ethanol, Propanol). Daher kann ein Ester von CLA oder veresterte CLA jegliche der Positions- und geometrischen Isomere von CLA enthalten.
  • Es ist beabsichtigt, dass "nicht-natürlich vorkommende Isomere" von CLA c11,t13; t11,c13; t11,t13; c11,c13; c8,t10; t8,c10; t8,t10; c8,c10; und trans-trans-Isomere der Octadecadiensäure beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, doch keine t10,c12- und c9,t11-Isomere der Octadecadiensäure beinhalten. "Nicht-natürlich vorkommende Isomere" können auch als "Neben-Isomere" von CLA bezeichnet werden, da diese Isomere in generell in geringen Mengen produziert werden, wenn CLA durch Alkali-Isomerisation synthetisiert wird.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich CLA "einer geringen Unreinheit" auf CLA-Zusammensetzungen, einschließlich freier Fettsäuren, Alkylester und Triglyceride, die weniger als insgesamt 1 % an 8,10-Octadecadiensäuren, 11,13-Octadecadiensäuren und trans,trans-Octadecadiensäuren enthalten.
  • "Zubereitetes Nahrungsmittelprodukt" meint jegliches vorgepackte Nahrungsmittel, das für den menschlichen Verzehr zugelassen ist.
  • Wie hierin verwendet, umfasst "c" eine chemische Bindung in der cis-Orientierung, und bezieht sich "t" auf eine chemische Bindung in der trans-Orientierung. Ist ein Positionsisomer von CLA ohne ein "c" oder ein "t" bezeichnet, so beinhaltet diese Bezeichnung alle vier möglichen Isomeren. Zum Beispiel umfasst 10,12-Octadecadiensäure c10,t12; t10,c12; t10,t12; und c10,c12-Octadecadiensäure, wohingegen t10,c12-Octadecadiensäure oder CLA sich lediglich auf das einzelne Isomer bezieht.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Öl" auf eine frei fließende Flüssigkeit, die langkettige Fettsäuren (z.B. CLA) oder andere langkettige Kohlenwasserstoffgruppen enthält. Die langkettigen Fettsäuren beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, die verschiedenen Isomeren von CLA.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "physiologisch akzeptabler Träger" auf jeglichen Träger oder Exzipienten, der herkömmlicherweise mit öligen Pharmazeutika verwendet wird. Zu solchen Trägern oder Exzipienten zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Öle, Stärke, Sucrose und Lactose.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "orales Darreichungsvehikel" auf jegliches Mittel zur oralen Darreichung eines Pharmazeutikums, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Kapseln, Pillen, Tabletten und Sirupe.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Nahrungsmittelprodukt" auf jegliches Nahrungsmittel oder Futter, das für den Verzehr durch den Menschen, nicht-wiederkäuende Tiere oder wiederkäuende Tiere geeignet ist. Das "Nahrungsmittelprodukt" kann ein zubereitetes und abgepacktes Nahrungsmittel (z.B. Mayonnaise, Salatdressing, Brot oder Käseprodukt) oder ein Tierfutter (z.B. extrudiertes und pelletiertes Tierfutter oder grobes Mischfutter) sein.
  • Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung resultiert aus einem hochkontrollierten Isomerisationsprozess und aus der Verwendung des bevorzugten Ausgangsmaterials aus Sonnenblumen- oder Distelöl. Diese Zusammensetzung ist bisher, zur Anwendung in einem industriellen Maßstab, nicht erhalten worden, da die herkömmlichen Prozesse historisch konjugierte Linolsäuren für gänzlich unterschiedliche Zwecke, nämlich als Trocknungsöle in der Farbenindustrie, produziert wurden. Auch sind die Bedeutungen des Isomergehalts des Endprodukts bisher nicht anerkannt worden, da die analytischen Methoden zur Charakterisierung der Fettsäuren nicht breit verfügbar gewesen sind.
  • Bei den älteren Isomerisationsprozessen, von denen einige nach wie vor in einem moderneren Format in Anwendung sind, wurde die Produktion der konjugierten Fettsäuren in einem wässrigen Alkali (allgemein NaOH) bei hohen Temperaturen von über 200 Grad C und üblicherweise bei Überdrücken vorgenommen. Zum Beispiel offenbart US-Pat. Nr. 2.350.583 (Bradley) einen wässrigen Alkaliprozess unter Verwendung von behandelten Seifen, bei denen sowohl die Konjugation als auch die Polymerisation unter recht harten Bedingungen von 200 bis 250 Grad C für einen Zeitraum von mehreren Stunden erfolgte. Die Fraktionen an Trocknungsöl, beginnend mit Leinsamenöl, wurden durch Destillation erhalten (siehe auch Br. Pat. Nr. 558.881 für einen sehr ähnlichen Prozess). Bei einer Abwandlung des Prozesses lehrt US-Pat. Nr. 4.381.264 ein Verfahren, bei dem eine Reaktionszone mit geringem Wassergehalt (0,5 % Wasser) eine stöchiometrische Base in Gegenwart von SO2 enthält, um die Konjugation der Doppelbindungen der verschiedenen mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu erreichen. Der wässrige Alkali-Prozess wurde in US-Pat. Nr. 4.164.505 auf einen kontinuierlichen Fließprozess adaptiert, bei dem ein alkalisches Metallhydroxid und Wasser kontinuierlich in eine Fließzone eingespeist werden, die auf zwischen 200 und 370 Grad C gehalten wird. Bei diesen Temperaturen sollte die Reaktionszeit stark verkürzt sein, doch besteht relativ wenig Kontrolle über die Isomerisation. Auf der höheren Seite des Temperaturbereichs wäre eine nahezu vollständige Umwandlung der Doppel-trans-Spezies vorhersagbar.
  • Die Methoden zur Produktion von CLA unter Verwendung verschiedener nichtwässriger Lösungsmittel und Katalysatoren sind in der Literatur beschrieben worden.
  • Burr (US-Pat. Nr. 2.242.230) offenbart die Verwendung von Lösungsmitteln, wie etwa Methanol, Butanol, Ethanol und Glycol, in Kombination mit verschiedenen Katalysatoren. Diese Reaktionsparameter sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Mit Ausnahme von Glycol wurden die Reaktionen entweder unter Refluxbedingungen oder in verschlossenen Röhrchen vorgenommen. Diese Reaktionsbedingungen führen zu einer unpräzisen Kontrolle bei zwei der wichtigen Reaktionsparameter, die durch die Erfinder identifiziert wurden – Temperatur und Druck. Eine unpräzise Kontrolle dieser Reaktionsparameter führt wahrscheinlich zu einer weniger als vollständigen Konjugation und der Bildung von unerwünschten Isomeren.
  • Tabelle 1 – Patent 2.242.230
    Figure 00150001
  • Entsprechend beschreibt Baltes et al. (US-Pat. Nr. 3.162.658) die Verwendung von nicht-wässrigen Lösungsmitteln und verschiedenen metallischen Basen als Katalysatoren für die Konjugation von Fettsäuren. Die verschiedenen Reaktionsparameter der von Baltes et al. beschriebenen Methoden sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Baltes et al. offenbart auch die Verwendung verschiedener Lösungsmittel mit niedrigem Siedepunkt. Da die meisten dieser Reaktionen bei Temperaturen oberhalb des Siedepunkts des verwendeten Lösungsmittels durchgeführt wurden, ist erkennbar, dass die Reaktionen unter Druck durchgeführt wurden, was ein unabhängiger Faktor ist, der die Bildung der Octadecadiensäureisomere beeinflusst. Das aus diesen Reaktionen stammende Produkt wird daher unerwünschte Isomere enthalten.
  • Tabelle 2 – Patent 3.162.658
    Figure 00160001
  • Der CLA der vorliegenden Erfindung fehlen Isomere, wie etwa das 8,10-Isomer, das 11,13-Isomer und die verschiedenen trans-trans-Isomere. Diese Zusammensetzung wurde durch einen streng kontrollierten nicht-wässrigen Alkali-Isomerisationsprozess produziert, der in Form des Flussdiagramms in 1 dargestellt ist. Vorzugsweise werden das Sonnenblumenöl oder Distelöl bei einem Umgebungsdruck unter einer inerten Gasatmosphäre mit einem Überschuss an Alkali in einem Lösungsmittel mit hohem Siedepunkt, nämlich Propylenglycol, bei einer Temperatur unterhalb des Siedepunkts umgesetzt. Diese Reaktionsbedingungen erlauben eine präzise Kontrolle der Temperatur (und des konstanten Umgebungsdrucks) des Konjugationsprozesses. Vorzugsweise ist das Alkali ein anorganisches Alkali, wie etwa Kaliumhydroxid, Cäsiumhydroxid, Cäsiumcarbonat, oder ein organisches Alkali, wie etwa Tetraethylammoniumhydroxid. Der Katalysator wird vorzugsweise in einem molaren Überschuss im Vergleich zum Fettsäuregehalt des Öls bereitgestellt. Das Lösungsmittel ist Propylenglycol. Vorzugsweise wird die Reaktion innerhalb eines Temperaturbereichs von 130 bis 165°C, am bevorzugtesten von etwa 150°C, durchgeführt. Die Reaktionszeit kann variieren, wobei allerdings eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Bildung von unerwünschten Isomeren besteht, wenn die Reaktion für lange Zeiträu me vorgenommen wird. Eine relativ kurze Reaktionszeit von 2,0 bis 6,5 Stunden hat sich für ausgezeichnete Ausbeuten als zufriedenstellend erwiesen.
  • Für einen Fachmann des Gebiets wird klar sein, dass zur Erzeugung der gewünschten Zusammensetzung die oben beschriebenen Reaktionsbedingungen in Abhängigkeit von dem zu konjugierenden Öl, der Quelle des Alkali und der Gerätschaft variiert werden können. Eine Voranalyse eines bestimmten Öls kann anzeigen, dass die Bedingungen zum Erhalt der gewünschten Zusammensetzung variiert werden müssen. Daher stellen der Temperaturbereich, Druck und andere Reaktionsparameter einen Ausgangspunkt für die Gestaltung des individuellen Prozesses dar und sind lediglich als Richtlinie zu verstehen. Zum Beispiel darf nicht gefolgert werden, dass der beschriebene Temperaturbereich der einzige anwendbare Bereich ist. Der grundlegende Aspekt besteht in der Schaffung einer präzisen Temperaturkontrolle. Allerdings muss Vorsicht walten, da eine Erhöhung des Drucks zu einer weniger als vollständigen Isomerisation und der Bildung von unerwünschten Isomeren führen kann. Schließlich kann die Länge der Konjugationsreaktion variiert werden. Generell werden mit zunehmender Länge der Reaktion steigende Mengen an unerwünschten Isomeren gebildet. Daher erlaubt die optimale Reaktionszeit der Reaktion einen nahezu oder im Wesentlichen vollständigen Ablauf, führt aber nicht zur Bildung unerwünschter Isomere.
  • Im Anschluss an die Konjugationsreaktion kann die resultierende CLA-enthaltende Zusammensetzung entsprechend der 1 weiter gereinigt werden. Um die Fettsäuren aus dem Konjugations-Reaktionsgemisch abzutrennen, wird das Reaktionsgemisch auf etwa 95°C abgekühlt, wird ein Überschuss an Wasser bei 50°C zugefügt und das Gemisch langsam gerührt, wobei die Temperatur auf etwa 50°C bis 60°C gesenkt wird. Auf die Zugabe des Wassers hin bildet sich eine Seife der Fettsäuren und bildet sich Glycerol als ein Nebenprodukt. Als nächstes wird ein molarer Überschuss an konzentrierter HCL unter Rühren zugesetzt. Die wässrigen und nichtwässrigen Schichten dürfen sich dann bei etwa 80–90°C auftrennen. Die Wasser und Propylenglycol enthaltende Bodenschicht wird dann abgesogen. Das verbliebene Propylenglycol wird durch Vakuumdehydrierung bei 60–80°C entfernt.
  • Die getrocknete CLA-Zusammensetzung kann dann vorzugsweise in einer Entgasungseinheit mit einer Kühlfalle entgast werden, um jegliches restliches Propylenglycol zu entfernen. Als nächstes wird die CLA bei 190°C in einer molekularen Destillationsanlage bei einem Vakuum von 10–1 bis 10–2 Millibar destilliert. Der Vorteil dieses Reinigungssystems liegt in der kurzen Zeit (weniger als eine Minute), für die die CLA bei einer erhöhten Temperatur gehalten wird. Herkömmliche Chargendestillations-Verfahrensweisen müssen strikt vermieden werden, da sie eine erhöhte Temperatur von etwa 180–200°C für bis zu mehrere Stunden einbeziehen. Bei diesen erhöhten Temperaturen wird die Bildung von unerwünschten trans-trans-Isomeren erfolgen. Etwa 90 % des Futtermaterials werden als ein leicht gelbes Destillat rückgewonnen. Die CLA kann dann durch Erhitzen auf etwa 120–170°C, vorzugsweise bei etwa 150°C, für 2 Stunden zur Verbesserung von Geruch und Geschmack desodoriert werden. Übermäßige Hitze kann zur Bildung von trans-trans-Isomeren führen. Diese Verfahrensweisen erzeugen eine CLA-Zusammensetzung mit einer Lösungsmittelmenge von weniger als etwa 5 ppm, vorzugsweise weniger als etwa 1 ppm. Dieser Prozess eliminiert toxische Spurenmengen an Lösungsmittel, so dass die resultierende Zusammensetzung im Wesentlichen frei von toxischen Lösungsmittelrückständen ist.
  • Die oben beschriebenen Prozesse sind ohne weiteres sowohl auf Pilot- als auch kommerzielle Maßstäbe adaptierbar. Zum Beispiel können 400 kg Distelöl bei 150 °C für 5 Stunden in 400 kg Propylenglycol konjugiert werden, wobei 200 kg KOH als Katalysator zugesetzt werden. Die resultierende CLA kann dann wie oben beschrieben gereinigt werden. Ferner können Chargensysteme im kommerziellen Maßstab ohne weiteres modifiziert werden, um die gewünschte CLA-Zusammensetzung zu erzeugen. Zum Beispiel sollten Edelstahlreaktoren zur Vermeidung von Korrosion aufgrund von pH-Werten unterhalb von 3,0 vorzugsweise mit Glas ausgekleidet sein. Es sollte jedoch zur Kenntnis genommen werden, dass Konjugationsprozesse unter Ausnutzung nicht-wässriger Lösungsmittel generell weniger korrosiv sind als solche, die mit Wasser durchgeführt werden.
  • Die bevorzugten Öle für die Konjugation sind Sonnenblumen- und Distelöl. Im Vergleich zu Sojabohnenöl weisen diese Öle geringere Konzentrationen an unerwünsch ten Komponenten auf, wie etwa Phosphatiden und Sterolen. Diese unerwünschten Komponenten können zur Bildung von Gummis, die die Konjugationsapparatur verschmutzen, und anderen unerwünschten Polymeren beitragen. Verschiedene Eigenschaften dieser Öle sind in Tabellen 3, 4 und 5 zusammengefasst. VERGLEICH DER KONTAMINANTEN TABELLE 3
    Figure 00190001
    TABELLE 4
    Figure 00190002
    • * Muss nicht gleich 100 sein TABELLE 5
      Figure 00190003
  • In den folgenden Beispielen wurden mehrere Vergleichsexperimente vorgenommen, um die Schlüsseleigenschaften der vorliegenden CLA-Zusammensetzungen im Gegensatz zu denen, die entweder unter suboptimalen Bedingungen oder gemäß den wässrigen Alkali-Methoden nach dem Stand der Technik vorgenommen wurden, hervorzuheben. In Beispiel 1 wurde die CLA mittels der vorliegenden Methode präpariert. Die CLA wurde mittels der herkömmlichen wässrigen Alkalimethode in Beispiel 2 produziert. In Beispiel 3 wird die Reaktion aus Beispiel 1 im Wesentlichen wiederholt, lediglich bei einer hohen Temperatur. Schließlich wird in Beispiel 4 die im Wesentlichen zu der aus Beispiel 2 identische wässrige Alkalireaktion bei niedriger Temperatur ablaufen gelassen. Die exakten Bedingungen und Einzelheiten jedes Experiments sind in den Beispielen angegeben. Die Profile der Analyse des CLA-Isomergehalts sind in Tabellen 1–4 angegeben.
  • Bezugnehmend auf die Daten in Tabelle 5 ist der prozentuale relative Flächenanteil für jedes identifizierte Peak entsprechend der individuellen Isomere für jedes der vier Experimente angegeben. Das GC-Diagramm ergab eine Anzahl von Peaks für jede getestete Probe. Die Fläche unter jedem dieser Peaks wurde zum Erhalt eines Gesamtwerts integriert. Die Identität des Peaks wurde anhand seiner relativen Position, aus veröffentlichten Atlanten der standardmäßigen Elutionsprofile und der wissenschaftlichen Literatur bestimmt. Die oberste Reihe steht für den Restwert für unkonjugiertes Ausgangsmaterial, 9,12-Linolsäure. Sowohl die Nieder- als auch die Hochtemperaturreaktion in Propylenglycol ergaben extrem hohe Umwandlungen von über 99 % des gesamten Ausgangsmaterials.
  • Bezugnehmend auf Spalte 1 ist in bemerkenswerter Weise offensichtlich, dass, anders als bei irgendeiner der Kontrollzusammensetzungen, in Beispiel 1 ein Peak entsprechend dem 11,13-Gemisch der Isomere, spezifisch der Peak entsprechend c11,c13, die Peaks für jegliches der 8,10-Isomere und der Peak für unidentifizierte Isomere allesamt gänzlich fehlen. Im Falle des c9,t11-Isomers sind die Peaks im GC sowohl für die 8,10- als auch die 9,11-Isomere überlagert und sind hierin lediglich für das Material aus Beispiel 1 aufgetrennt, indem jener Abschnitt des Peaks heraussubtrahiert wird, der als 8,10 mittels NMR-Studien identifiziert wurde. Dies wurde in den anderen Experimenten nicht vorgenommen, so dass Reihe 3 die Werte für kom biniertes 8,10 und 9,11 für Beispiele 2–4 angibt. Allgemein ist für die 8,10-, 11,13- und unidentifizierten Isomere ein Wert von weniger als 1 Prozent bis hin zu nicht nachweisbar von therapeutischen und nutritionalem Wert, da dieser die potenziell schädlichen Kontaminanten zu Spurenmengen reduziert, insbesondere jene, die als fragwürdige Absorptionswege in der Lipogenese aufweisend bekannt sind. Bei Nicht-Wiederkäuern zum Beispiel kann die Zugabe von 0,25 bis 2,5 Prozent CLA zur Nahrung das Auftreten von CLA in Geweben auf annähernd das in Wiederkäuern erhöhen, so dass andere Tiere eine Quelle von CLA sein können, vorausgesetzt, dass keine verfälschenden Isomere vorhanden sind.
  • Beispiel 2 liefert ein typisches wässriges Alkaliprodukt, das für herkömmlich hergestellte CLAs repräsentativ ist. Die Umwandlung ist weniger effizient, und zwar sowohl insgesamt als auch in der Erzeugung der c9,t11- und t10,c12-Isomere. Feststellbar war auch ein hoher prozentualer Anteil der fragwürdigen 11,13-Isomere, und ein signifikanter Prozentsatz an unidentifiziertem Material.
  • Beispiel 3 veranschaulicht das Entscheidende an dem Temperaturparameter. Eine Aufwärtsverschiebung bei der Temperatur in Propylenglycol-Medien erhöht die Menge der kontaminierenden Isomere auf Kosten der c9,t11- und t10,c12-Isomere schart. Ebenso von Interesse bei der höheren Temperatur ist eine enorme Zunahme bei den trans,trans-Spezies, da Neuanordnungen der Doppelbindungen bevorzugt sind, die eine stabilere Elektronenkonfiguration bei Niveaus einer erhöhten Energiebelastung erbringen.
  • Beispiel 4 veranschaulicht, dass eine Senkung der Temperatur im wässrigen Alkalisystem in der Tat die Mengen einiger der kontaminierenden Isomere vermindert. Allerdings erbringt dies einen enormen Abfall der Ausbeute, und bleibt die Menge der 11,13-Gruppe der Isomere sehr hoch, was nahe legt, dass die Bildung dieser Elektronenkonfiguration eher durch die Wirkung der Base in einem wässrigen Medium beeinflusst wird, als durch die kinetische Gesamtenergie im System erklärbar. Feststellbar ist auch eine extrem lange Reaktionszeit von 22,5 Stunden, was zu lang für einen effizienten Chargenprozess im industriellen Maßstab ist.
  • Tabelle 6 wandelt lediglich die relativen Isomer-Prozentsätze in den verschiedenen Reaktionen als einer Funktion der Peakfläche zu ihren entsprechenden Peakverhältnissen um. Das vorliegende Verfahren produziert eine nahezu vollständige Umwandlung der 9,12-Linolsäure zu einer annähernd gleichen Menge jedes der beiden gewünschten CLA-Isomere. Bei der höheren Temperatur ist das Vorkommen des 11,13-Isomers, selbst in Propylenglycol, nach wie vor weniger als ein Drittel dessen bei dem wässrigen Alkali-Prozess bei niedriger Temperatur.
  • Bei einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Erzeugung von Alkylestern der CLA bereit. Nach der Fettspaltung und Dehydrierung werden die freien Fettsäuren mit Methanol oder einem anderen einwertigen niedermolekularen Alkohol kombiniert und auf die Temperatur erhitzt, bei der der Alkohol siedet. Die Veresterung verläuft unter Refluxbedingungen unter Entfernung des Reaktionswassers durch einen Kondensator. Nach der Zugabe einer weiteren Quantität desselben oder eines unterschiedlichen einwertigen Alkohols wird ein Alkoholat-Katalysator dem Estergemisch beigemengt. Typische Alkoholat-Katalysatoren sind Natrium- oder Kaliumethoxid, oder deren Methyl-, Butyl- oder Propyl-Gegenstücke.
  • Bei der Veresterung sind Methanol oder Ethanol bevorzugt, obschon andere verzweigte oder geradkettige einwertige Alkohole verwendet werden können. Je länger die aliphatische Kette der Alkylgruppe, umso Lipid-kompatibler wird das Material. Außerdem neigt die Viskosität zum Steigen. Für verschiedene Typen von Futter oder Nahrung, deren Konsistenz variiert, kann ein Produkt von variierender Viskosität verwendet werden, um die gewünschten Fließ- oder Vermischungs-Eigenschaften ohne Beeinträchtigung der therapeutischen oder nutritionalen Eigenschaften, die von den CLA-Komponenten ausgehen, zu erhalten. Theorie und Praxis der Veresterung sind konventionell. Eine grundlegende Erklärung der meisten herkömmlichen Methoden ist wiedergegeben in der McCraw-Hill Encyclopedia of Science & Technology, McGraw-Hill Book Co., N.Y.: 1996 (5. Aufl.). Der tierische und menschliche Körper weist eine Vielfalt von Esterasen auf, so dass der CLA-Ester zur Freisetzung der freien Fettsäuren ohne weiteres gespalten wird. Die Aufnahme durch das Gewebe kann eine unterschiedliche Kinetik in Abhängigkeit vom beteiligten Gewebe und dem angestrebten Nutzen zeigen.
  • Im Isomerisationsschritt wurde festgestellt, dass die Alkoholat-Katalyse ein viel besseres Produkt erzeugte als die durch wässriges Alkali vermittelte Isomerisation. Der letztere Prozess erzeugte immer unerwünschte Isomere, selbst unter milden Reaktionsbedingungen. Die milderen Bedingungen ergeben geringere Mengen an unerwünschten Isomeren, doch in starkem Maße auf Kosten der Ausbeute, wie in den Beispielen gezeigt. In den meisten Systemen dominiert das Auftreten der c9,t11- und t10,c12-Isomere, wobei diese in nahezu äquimolaren Mengen gebildet werden. Es ist bisher nicht möglich gewesen, die Isomerisation des einen Isomers über einen Ausschluss des anderen zu kontrollieren. Zwar ist eine Erhöhung des prozentualen Anteils des einen oder anderen Isomers erwünscht (was von der zu erzielenden physiologischen Wirkung abhängt), doch muss dies derzeit weitgehend durch Zugabe einer angereicherten Quelle des gewünschten Isomers vorgenommen werden.
  • Die vorliegende Erfindung erwägt die Verwendung von Derivaten des reinen Präparats der CIA. Zum Beispiel kann CLA frei oder durch Esterbindungen gebunden oder in Form eines CLA-Triglyceride enthaltenden Öls vorliegen, wie beschrieben in Beispielen 5 und 6. Bei diesen Ausführungsformen können sich die Triglyceride teilweise oder vollständig aus einer CLA zusammensetzen, die an ein Glycerol-Rückgrat gebunden ist. Die CLA kann vorzugsweise auch als ein Methylester oder Ethylester bereitgestellt werden, wie in Beispielen 8 und 9 beschrieben. Weiterhin kann die CLA in Form eines nicht-toxischen Salzes, wie z.B. eines Kalium- oder Natriumsalzes (z.B. eines durch chemische Reaktion äquivalenter Mengen der freien Säuren mit einem Alkalihydroxid bei einem pH von etwa 8 bis 9 gebildeten Salzes), vorliegen.
  • Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein neues Triacylglyerol, welches das im folgenden beschriebene neue CLA-Isomergemisch umfasst, für die nicht-wässrige Isomerisation von Linolsäure von Sonnenblumen- und/oder Distelölen synthetisiert. Die um CLA (90–96 Prozent) hoch angereicherten reinen Triacylglycerole können durch II NMR bestätigt werden. Die Veresterung läuft unter Verwendung von immobilisierter Candida antarctica-Lipase ab. Vorzugsweise wird die CLA wenigstens 40 und bis zu 45–48 Prozent der c9,t11-Octadecadien- und t10,c12-Octadecadiensäuren, und Gemischen davon, enthalten. Es werden weniger als ein Prozent der Ester von 8,10-, 11,13- und trans,trans-Isomeren oder weniger als fünf Prozent im Aggregat vorliegen. Das resultierende Triacylglycerol wird nicht weiter gereinigt, um alle Mengen an Phosphatidyl- und Sterol-Rückständen zu entfernen. Allerdings werden diese Mengen, die aus der Isomerisation von Sonnenblumen- und Distelölen verbleiben, für kommerzielle Anwendungen einschließlich sicherer, verzehrtauglicher Produkte für Futter und Nahrung adäquat sein.
  • Die immobilisierte Candida antartica-Lipase wird in einer Weise ähnlich der verwendet, die für mehrfach ungesättigte Fettsäuren vom n-3-Typ bei Harraldson et al. beschrieben ist. Die Veresterungsreaktion wird bei 50–75°C, vorzugsweise 65°C, in Abwesenheit jegliches Lösungsmittels vargenommen, und ein Vakuum wird angewendet, um das gleichzeitig produzierte Wasser oder die Alkohole (von Estern) auf deren Bildung hin zu entfernen. Dies treibt die Triacylglycerol-Produktion zur Vollständigkeit und gewährleistet ein hochreines Produkt, das nahezu frei von jeglichen Mono- und Diacylglycerolen in im Wesentlichen quantitativen Mengen ist. Es können stöchiometrische Mengen der freien Fettsäuren verwendet werden, d.h. 3 molare Äquivalente bezogen auf Glycerol oder 1 molares Äquivalent bezogen auf die Anzahl der Moläquivalente der in der Glycerol-Komponente vorhandenen Hydroxylgruppen. Eine Dosis von lediglich 10 % der Lipase, bezogen auf das Gesamtgewicht der Substrate, ist erforderlich, die für wiederholte Male verwendet werden kann. Dies ist vom Standpunkt der Produktivität sehr wichtig. All dies, zusammen mit der Tatsache, dass kein Lösungsmittel erforderlich ist, macht dieses Verfahren in hohem Maße technisch durchführbar vom Standpunkt der Maßstabsvergrößerung und der Industrialisierung, da die Kürzung bei Volumen und Masse enorm ist. Es kann auch ein leichter Überschuss (< 5/5) an freien Fettsäuren verwendet werden, um die Reaktion zum Ende hin zu beschleunigen und eine Vollständigkeit der Reaktion sicherzustellen.
  • Zu Beginn der Reaktion wird zunächst das 1- oder 3-Monoacylglycerid gebildet, gefolgt von dem 1,3-Diacylglycerid, und schließlich dem Triglycerid bei den längeren Reaktionszeiten. Die Mono- und Diacylglyceride stellen dadurch nützliche Intermediate dar, dass sie eine biologische Aktivität zeigen, doch eine größere Löslichkeit in wässrigen zellulären Umgebungen aufweisen und an alternativen Molekül-Synthese wegen teilnehmen können, wie etwa der Synthese von Phospholipiden oder anderen funktionalen Lipiden. Demgegenüber werden Triglyceride häufig in Zellmembranen oder Lagervesikeln intakt abgelagert. Somit kann die Verabreichung von CLA in Mono-, Di- oder Triglycerid-Form und nicht als der freien Fettsäure oder -ester die Art und Weise und Verteilung der Aufnahme, die Stoffwechselrate und die strukturelle oder physiologische Rolle der CLA-Komponente beeinflussen.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verabreichung oral. Die CLA kann mit geeigneten Trägern, wie Stärke, Sucrose oder Lactose, zu Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Lösungen, Flüssigkeiten, Aufschlämmungen, Suspensionen und Emulsionen formuliert werden. Die CLA kann in wässriger Lösung, öliger Lösung oder in irgendeiner der anderen oben erörterten Formen bereitgestellt werden. Die Tablette oder Kapsel der vorliegenden Erfindung kann mit einer enterischen Beschichtung beschichtet werden, die sich bei einem pH von etwa 6,0 bis 7,0 auflöst. Eine geeignete enterische Beschichtung, die sich im Dünndarm, jedoch nicht im Magen auflöst, ist Celluloseacetatphthalat. Bei einigen Ausführungsformen wird die CLA als weiche Gelatinekapseln bereitgestellt, die 750 mg an 80 % CLA (TonalinTM) enthält. Die CLA kann auch auf irgendeinem aus einer Anzahl anderer Wege bereitgestellt werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrameduläre, intrathekale, intraventrikuläre, transdermale, subkutane, interperitoneale, intranasale, enterale, topische, sublinguale oder rektale Methoden. Weitere Einzelheiten zur Technik der Formulierung zur Verabreichung und der Verabreichung sind zu finden in der letzten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA).
  • Eine wirksame Menge der CLA kann auch als eine Nahrungsergänzung in verschiedenen zubereiteten Nahrungsprodukten und Getränken bereitgestellt werden. Für die Zwecke dieser Anwendung meint zubereitetes Nahrungsmittelprodukt jegliche natürliche, verarbeitete, diätetische oder nicht-diätetische Nahrungsmittelprodukte, denen CLA zugesetzt worden ist. Die CLA kann in Form der freien Fettsäuren oder als ein Öl, das partielle oder ganze Triglyceride der CLA enthält, zugesetzt werden. Daher kann CLA direkt in verschiedene zubereitete Nahrungsmittelprodukte aufgenommen werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Diätgetränke, Diätriegel, Nahrungsergänzungen, zubereitete Tiefkühlmahlzeiten, Süßigkeiten, Snack-Produkte (z.B. Chips), zubereitete Fleischprodukte, Milch, Käse, Joghurt und andere fett- oder ölhaltige Nahrungsmittel.
  • CLA ist anfällig für Oxidation. Daher ist es erwünscht, CLA für den menschlichen Gebrauch mit geeigneten Antioxidanzien, wie Lecithin, Tocopherolen, Ascorbat, Ascorbylpalmitat oder Gewürzextrakten wie Rosmarinextrakt, abzupacken.
  • BEISPIELE:
  • Beispiel 1
  • Isomerisation von Distelöl unter Verwendung von Propylenglycol bei niedriger Temperatur.
  • Distelöl wurde in Propylenglycol bei niedrigen Temperaturen unter Verwendung von KOH als einem Katalysator isomerisiert. Der Isomerisationsapparat bestand aus einem zweihälsigen Kolben mit einem Thermometer, das in einen Hals eingebracht war, wobei eine kleine Öffnung zur Abgabe von übermäßigem Druck verblieb. Eine Stickstoffzufuhr wurde am anderen Hals des Kolbens angebracht. Dem Kolben zugegebene Lösungen wurden unter Verwendung eines Magnetstabs und eines Magnetrührers gerührt. Die Temperatur des Kolbens wurde durch Einbringen des Kolbens in ein mit Thermostat kontrolliertes Ölbad, das auf dem Magnetrührer platziert war, kontrolliert.
  • Der Kolben wurde mit 60,27 g Propylenglycol und 28,20 g KOH befüllt und in das Ölbad eingetaucht. Die Temperatur wurde auf 130°C zur Lösung des KOH erhöht. Nachdem sich das KOH gelöst hatte, wurden 60,09 g Distelöl in den Kolben eingebracht. Ein hohes Volumen an Stickstoff wurde durch den zweihälsigen Kolben für 5 Min. zirkuliert und dann auf ein geringeres Volumen reduziert. Das Gemisch wurde auf 150°C erhitzt, was etwa 40 Min. benötigte. Das Gemisch durfte dann bei 150°C für 3,5 Stunden reagieren. In Intervallen wurden 3-ml-Proben für die Analyse entnommen.
  • Die Proben wurden direkt in 6 ml heißes Wasser eingebracht, und Zitronensäure wurde im Überschuss zugegeben, bis sich die freien Fettsäuren als die obere Schicht abtrennten. Die Erhitzung war erforderlich, um eine Verfestigung während der Zugabe der Zitronensäure zu vermeiden. Um die freien Fettsäuren für die Analyse mittels Gaschromatographie zu Methylestern umzuwandeln, wurden 0,025 g der freien Fettsäuren, 5 ml einer 4 % Lösung von HCL und Ethanol einem Teströhrchen zugegeben. Stickstoff wurde dem Röhrchen hinzugefügt, woraufhin es verschlossen und in ein Wasserbad bei 60°C für 20 Min. eingebracht wurde. Das Röhrchen wurde dann abgekühlt, und 1 ml gereinigtes Wasser und 5 ml Isooctan wurden zugegeben.
  • Stickstoff wurde in das Röhrchen eingeführt und dieses für 30 Sekunden geschüttelt.
  • Die resultierende obere Schicht wurde zu 1 μl an gereinigtem Wasser in einem neuen Reagenzröhrchen gegeben und dieses wiederum unter Stickstoff geschüttelt. Die resultierende obere Schicht wurde dann von Isooctan freigewaschen und in ein drittes Reagenzröhrchen abgegossen. Eine kleine Menge des Natriumsulfats wurde für die Wasserabsorption zugegeben. Eine 1-μl-Probe wurde dann direkt in den Gaschromatographen injiziert.
  • Die Bedingungen der Gaschromatograpie waren die folgenden:
    System: Perkins-Elmer Auto System
    Injektor: Splitless bei 240°C
    Detektor: Flammionisationsdetektor bei 280°C
    Träger: Helium
    Säule: WCOT Quarzglas 0,25 mm X100M, CP-SL 88 für FAME, DF 0,2
    Ofenprogramm: 80°C (0 Min.), erhöhend auf 220°C bei 10°C pro Min. und gehalten bei 220°C für 10 Min.
  • Alle Ergebnisse sind als der relative prozentuale Peakflächenanteil ausgedrückt.
  • Standards sind im Allgemeinen nicht verfügbar, so dass die Peaks, die eluierten, mit anderen Systemen verifiziert wurden. GC-MS bestimmt die Anzahl, jedoch nicht die Position der cis- und trans-Bindungen. Daher wurde die NMR-Analyse zur Verifizierung der Bindungspositionen angewendet. Die Hauptpeaks waren c9,t11 und t10,c12. Für die NMR-Analyse der CLA-Isomere wird verwiesen auf Marcel S.F. Lie Ken Jie und J. Mustafa, Lipids, 32 (10) 1019-34 (1997), wie hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen.
  • Diese in Tabelle 6 dargestellten und in Tabelle 10 zusammengefassten Daten zeigen, dass die Isomerisation von Distelöl unter Verwendung von Polypropylenglycol als einem Lösungsmittel, KOH als einem Katalysator und niedrigen Temperaturen zur Produktion von konjugierter Linolsäure führt, der 8,10- und 11,13-Isomere fehlen. Die bei diesem Experiment verwendeten hochpolaren Säulen können zur Trennung der 8,10- und 11,13-Isomere von den c9,t11- und t10,c12-Isomeren erfolgreich verwendet werden. Die 8,10-Isomere neigen zur Koelution oder Elution direkt nach dem c9,t11-Isomer. Das 11,13-Isomer eluiert vor dem t10,c11-Isomer oder koeluiert mit dem t10,c12-Isomer, in Abhängigkeit von den Säulen-Bedingungen.
  • Die gemäß dieses Verfahrens produzierte konjugierte Linolsäure wird durch Vergleich der verschiedenen produzierten Isomere charakterisiert. Zunächst einmal verlief die Isomerisationsreaktion im Wesentlichen bis zur Vollständigkeit. Die Vollständigkeit der Reaktion wird durch Teilen der gesamten Peakfläche für die Linolsäure-Isomere minus der restlichen c9,t12-Linolsäure durch die gesamte Peakfläche erhalten. Dieser Wert beträgt 0,994. Zweitens kann das Verhältnis von c9,t11- und t10,c12-Isomeren zur gesamten Peakfläche bestimmt werden. Dieser Wert beträgt 0,953. Drittens kann das Verhältnis von t9,t11- und t10,t12-Isomeren zu den c9,t11- und t10,c12-Isomeren bestimmt werden. Dieser Wert beträgt 0,010. Viertens kann das Verhältnis von t9,t11- und t10,t12-Isomeren zur gesamten Peakfläche bestimmt werden. Dieser Wert beträgt 0,009. Fünftens kann das Verhältnis des t10,c12-Isomers zu dem c9,t11-Isomer bestimmt werden. Dieser Wert beträgt 1,018. Diese Verhältnisse sind in Tabelle 11 zusammengefasst.
  • Beispiel 2
  • Wässrige Isomerisation bei hoher Temperatur und Druck.
  • Fünfzig Gramm Wasser und 25,32 g NaOH wurden einem Hochdruckreaktor (Parr Modell 450 ML Benchtop Alloy 400, ausgestattet mit einem Druckmesser und Rührer) zugegeben. Das NaOH durfte sich auflösen, und 94,0 g Distelöl wurden dem Reaktor zugegeben. Der Reaktor wurde verschlossen und für 2 Min. mit Stickstoff gespült, woraufhin alle Ventile geschlossen wurden. Der Reaktor wurde in einer Elektromanschette auf 210°C erhitzt und bei dieser Temperatur für 6 Stunden gehalten. Die Temperatur wurde dann auf 60°C gesenkt, bevor Druck freigesetzt und der Reaktor geöffnet wurde. Zwei Gramm der resultierenden verfestigten Seife wurden aus dem Reaktor entnommen und in Wasser bei etwa 40°C gelöst. Zitronensäure wurde dann zugesetzt, um den pH-Wert der Lösung auf unter 6 zu senken. Eine Probe wurde aus der oberen Schicht der Fettsäure entnommen und für die Gaschromatographie wie in Beispiel 1 präpariert.
  • Die Ergebnisse der Gaschromatographie sind in Tabelle 7 dargestellt und in Tabelle 10 zusammengefasst. Diese Daten zeigen, dass diese Isomerisationsmethode zur Bildung relativ hoher Mengen der 8,10- und 11,13-Isomere führt. Die Verhältnisse sind in Tabelle 11 dargestellt.
  • Beispiel 3
  • Nicht-wässrige Alkali-Isomerisation von Distelöl bei hoher Temperatur und Druck.
  • 100,48 g Propylenglycol und 46,75 g KOH wurden einem Hochdruckreaktor wie in Beispiel 2 beschrieben zugegeben. Der Reaktor wurde dann auf 130°C zur Auflösung des KOH erhitzt. 100,12 g Distelöl wurden dann dem KOH-Propylenglycol-Gemisch zugegeben. Der Reaktor wurde verschlossen, für 1 Min. mit Stickstoff gespült und dann alle Ventile geschlossen. Der Reaktor wurde dann auf 210 °C erhitzt und bei dieser Temperatur für 1 Stunde gehalten. Der Reaktor wurde abgekühlt und die Inhaltsstoffe in 120 g heißes Wasser abgegossen. Unter Rühren wurden 35,3 g an 37 % HCL und 27,59 g Zitronensäure nacheinander den Fettsäuren zugegeben. Eine Probe wurde aus der oberen Schicht entnommen und in einem Vakuumkolben bei 60°C getrocknet. Eine Probe der resultierenden Fettsäuren wurde mittels Gaschromatographie wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt und in Tabelle 10 zusammengefasst. Dieses Experiment zeigt, dass die Isomerisation von Distelöl mit KOH und einem nicht-wässrigen Lösungsmittel bei hoher Temperatur zur Bildung signifikanter Mengen an 8,10- und 11,13-Isomeren, als auch den t9,t11- und t10,t12-Isomeren führt. Die Verhältnisse sind in Tabelle 11 dargestellt.
  • Beispiel 4
  • Wässrige Alkalireaktion bei niedriger Temperatur
  • 49,94 g Wasser und 39,96 g NaOH wurden einem Hochdruckreaktor wie in Beispiel 3 beschrieben zugesetzt. Dieses Gemisch wurde erhitzt, bis sich das NaOH auflöste. Als nächstes wurden 100,54 g Distelöl dem Hochdruckreaktor zugesetzt, der Reaktor mit Stickstoff gespült, woraufhin alle Ventile geschlossen wurden. Der Hochdruckreaktor wurde auf 179°C für 22,5 Stunden erhitzt. Proben wurden für die Gaschromatographie wie in Beispiel 3 präpariert. Die Daten sind in Tabelle 9 angegeben und in Tabelle 10 zusammengefasst. Dieses Experiment zeigt, dass dann, wenn niedrige Temperaturen für die wässrige Alkali-Isomerisation angewendet werden, die Konjugationsreaktion nicht bis zur Vollständigkeit abläuft. Weiterhin werden signifikante Mengen der 8,10- und 11,13-Isomere produziert. Die Verhältnisse sind in Tabelle 11 dargestellt. TABELLE 6
    Figure 00310001
    TABELLE 7
    Figure 00320001
    TABELLE 8
    Figure 00330001
    Figure 00340001
    Tabelle 9
    Figure 00350001
    Figure 00360001
    Tabelle 10 – Relativer prozentualer Flächenanteil
    Figure 00370001
    • * – gesamter prozentualer Anteil von 8,10 beträgt weniger als 0,5
    • na – Wert ist als Komponente von c9,t11/8,10 wiedergegeben
    Tabelle 11
    Figure 00380001
    • *c9,t11 beinhaltet 8,10-Isomer
    • na – kein 11,13 nachgewiesen
  • Beispiel 5
  • Präparation der Triacylglycerole von CLA durch direkte Veresterung.
  • Allgemein. H-kernmagnetische Resonanzspektren wurden auf einem Bruker AC 250 NMR-Spektrometer in deuteriertem Chloroform als einem Lösungsmittel aufgezeichnet. Die HPLC-Trennungen wurden mittels eines PrepLCTM System 500A-Instruments von Waters unter Verwendung der PrepPak® 500/Kieselgel-Patronensäule von Millipore unter Elution mit 10 % Diethylether in Petroleumether durchgeführt. Die analytische GLC wurde auf einem Perkin-Elmer 8140 Gaschromatographen gemäß der zuvor beschriebenen Verfahrensweise durchgeführt, wie beschrieben bei Haraldsson et al., Acta Chem Scanned 45: 723 (1991).
  • Die immobilisierte Candida antartica-Lipase wurde bereitgestellt von Novo Nordisk in Dänemark als NovozymTM. Sie wurde direkt verwendet, wie in den Veresterungs-Experimenten angegeben. Diethylether in analytischer Güte, bezogen von Merck, wurde ohne irgendwelche Reinigung verwendet, doch n-Hexan in Synthesegüte, e benso von Merck, wurde vor der Verwendung in Auszügen und der HPLC-Chromatographie frisch destilliert. Glycerol (99 %) wurde von Sigma und Aldrich Chemical Company bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. Das CLA-Konzentrat wurde bereitgestellt von Natural Lipids in Norwegen als freie Fettsäuren als TonalinTM. Seine Reinheit wurde mittels analytischer GLC und Hochfeld-NMR-Spektroskopie bestätigt, was einige Glycerid-Unreinheiten ergab. Das CLA-Konzentrat wurde als 43,3 % 9-cis,11-trans-Linolsäure, 44,5 % 10-trans,12-cis-Linolsäure, 5,4 % an anderen CLA-Isomeren, 5,6 % Oleinsäure und jeweils 0,6 % an Palmitin- und Stearinsäure enthaltend festgestellt, wie mittels GLC am Science Institute bestimmt.
  • Beispiel 6
  • Präparation der Triacylglycerole von CLA durch direkte Veresterung.
  • Immobilisierte Candida antartica-Lipase (1,25 g) wurde einem Gemisch von Glycerol (1,22 g, 13,3 mmol) und CLA als freier Fettsäure (MG 280,3 g/mol; 11,6 g, 41,5 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde auf einer Magnetrührer-Heizplatte bei 65°C unter kontinuierlichem Vakuum von 0,01–0,5 Torr sanft gerührt. Das während des Verlaufs der Reaktion erzeugte flüchtige Wasser wurde kontinuierlich in Flüssigstickstoff-gekühlte Fallen kondensiert. Nach 48 Std. wurde die Reaktion abgebrochen, n-Hexan hinzugefügt und das Enzym mittels Filtration abgetrennt. Die organische Phase wurde mit einer wässrigen Alkalilösung von Natriumcarbonat zur Entfernung überschüssiger freier Fettsäuren (sofern erforderlich) behandelt. Das organische Lösungsmittel (nach Trocknung über anhydrischem Magnesiumsulfat, wenn geeignet) wurde in vacuo auf einem Rotationsverdampfer entfernt, gefolgt von einer Hochvakuumbehandlung, was das nahezu reine Produkt als ein leicht gelbliches Öl (10,9 g; mittleres MG 878,6 g/mol; 93 % Ausbeute) erbrachte. Wurden stöchiometrische Mengen an freien Fettsäuren verwendet, so wurde eine Titration durch standardisiertes Natriumhydroxid angewendet, um den Gehalt an freier Fettsäure des Reaktionsrohprodukts zu bestimmen (weniger als 1 % Gehalt an freier Fettsäure, bezogen auf die Anzahl Mol der Estergruppen, entsprechend einem Einbau von mindestens 99 %, was äquivalent zu dem Minimalgehalt an Triglycerid von 97 % ist). Das Rohprodukt wurde direkt in die HPCL unter Eluieren mit 10 % Diethylether in n-Hexan ein gebracht, was 100 % reines Triglycerid als ein farbloses Öl ergab. 250 MHz 1 H NMR(CDC13) 8 (ppm) 6,35–6,23 (3H, ddt, Jtrans=15,0 Hz, J=10,9 Hz, Jallyl=1,3, =CHCH=CH), 5,98–5,90 (3H, dd, Icis=10,9, J=10,9, -CH=CHCH=), 5,71–5,59 (3H, dtd, Jtrans=15,0 Hz, J=6,9 Hz, J=6,9 Hz, J=2,2 Hz, =CH=CHCH2-), 5,35–5,26 (4H, m, =CH2CH=CH- und -CH2C-ICH2-), 4,33–4,26 (2H, dd, Jgem=11,9 Hz, J=4,3, -CN2CHCH2-), 4,18–4,10 (2H, dd, Jgem=1,8 Hz, J=6,0, -CH2CHCN2-), 2,37–2,31 (6H, t, J=7,4 H2, -CN2COOR), 2,19–2,05 (12H, m, -CH2CH=CH-), 1,66–1,60 (6H, qu., J=Hz, -CH2CH2COOR), 1,43–1,30 (18H, m, -CH2-), 0,91–0,86 (9H, t, J=6,7 Hz, -CH3). 13C-NMR (CDC13): 8 (ppm) 173,2, 172,8, 134,6, 130,0, 128,6, 125,5, 68,8, 62,0, 34,0, 32,9, 31,6, 29,6–28,9 (6C), 27,6, 24,8, 22,5, 14,1.
  • Um den Verlauf der Reaktion zu überwachen und mehr Einzelheiten über die Zusammensetzung der einzelnen Glyceride während der Reaktion zu erhalten, wurden regelmäßig im Verlauf der Reaktion Proben entnommen. Diese wurden mittels HNMR-Spektroskopie analysiert und erbrachten einen guten Einblick in die Zusammensetzung der Mono-, Di- und Triacylglycerole während des Verlaufs der Reaktion. Die Ergebnisse sind in unten stehender Tabelle 12 gezeigt. Wie aus der Tabelle erkennbar ist, dominierten die 1,3-Diacylglycerole das Reaktionsgemisch während der ersten beiden Stunden der Reaktion. Nach 4 Stunden überwogen die Triacylglycerole und hatten 98 % der Zusammensetzung nach 22 Stunden und 100 % nach 48 Stunden erreicht. Wie zu erwarten, erreichten die 1,2-Diacylglycerole beträchtlich geringere Mengen als die 1,3-Diacylglycerole. 1-Monoacylglycerole erreichten ein Maximum während der ersten Stunde der Reaktion, doch 2-Monoacylglycerole wurden während der Reaktion nicht nachgewiesen.
  • TABELLE 12
    Figure 00410001
  • Beispiel 7
  • Effekt der Variierung von Temperatur und Reaktionsdauer auf die CLA-Ausbeute und -Zusammensetzung
  • Die Wirkung von Temperatur und Reaktionsdauer auf die Konjugation des Distelöls wurde bestimmt. Wasser und NaOH wurden einem Hochdruckreaktor (Parr Modell 450 ML Benchtop Alloy 400, ausgestattet mit einem Druckmesser und Rührer) wie in Tabelle 1, Spalten 1 und 2, angegeben, hinzugefügt. Das NaOH durfte sich auflösen, und Distelöl (Spalte 3) wurde dem Reaktor zugegeben. Der Reaktor wurde verschlossen und für 2 Min. mit Stickstoff gespült, worauf alle Ventile geschlossen wurden. Der Reaktor wurde in einer Elektromanschette auf die gewünschte Temperatur (Spalte 4) erhitzt und auf jener Temperatur für die gewünschte Zeit gehalten (Spalte 5). Die Temperatur wurde dann auf 60°C gesenkt, bevor Druck abgelassen und der Reaktor geöffnet wurde. Für jede Reaktion wurden zwei Gramm der resultierenden verfestigten Seife aus dem Reaktor entnommen und in Wasser bei etwa 40°C gelöst. Dann wurde Zitronensäure zur Senkung des pH-Werts der Lösung auf unterhalb von 6 zugesetzt. Eine Probe wurde aus der oberen Fettsäureschicht entnommen und für die Gaschromatographie präpariert.
  • Die Ergebnisse der Gaschromatographie sind in Säule 6 (Gesamtprozentsatz an 9,11- und 10,12-Isomeren), Spalte 7 (Gesamtprozentsatz an 11,13-Isomeren) und Spalte 8 (Gesamtprozentsatz aller CLA-Isomere oder Ausbeute) dargestellt. Diese Daten zeigen, dass mit zunehmender Reaktionsdauer und Temperatur die Gesamtmenge der Konjugation und der Prozentsatz an 11,13-Isomeren zunimmt. Unter Bedingungen, bei denen die Bildung des 11,13-Isomers gering ist, ist die Gesamtmenge der Konjugation ebenfalls gering.
  • TABELLE 13
    Figure 00420001
  • Beispiel 8
  • Konjugation des Distel-Fettsäuremethylesters (FAME)
  • Die Reaktion wurde in einem geschlossen Gefäß vorgenommen. Die folgenden Komponenten wurden miteinander vermischt: 100 g Distel-FAME und ein Gemisch von etwa 2,8 g KOCH3 und 2,8 g Methanol. Es lag möglicherweise mehr KOMe als Methanol aufgrund von Verdampfung des Methanols während der Vermischung der beiden Komponenten vor. Das Gemisch wurde für 5 Stunden bei 111–115 Grad C in einer Stickstoffatmosphäre in einem geschlossenen Reaktionsgefäß gerührt. Die Verteilung der Isomere wurde mittels Gaschromatographie analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Die GC-Rohdaten sind in Tabelle 3 dargestellt. Diese Daten zeigen, dass die Konjugation des Distel-FAME unter milden Be dingungen erreicht werden kann, was ein Produkt ergibt, dem nennenswerte Mengen an unerwünschten 8,10- und 11,13-Isomeren fehlen. TABELLE 14: Isomerverteilung
    Palmitinsäure 6,6 %
    Stearinsäure 2,7 %
    Oleinsäure 12,9 %
    Linolsäure 5,7 % (unkonjugiert)
    CLA c,9,t11 34,1 %
    CLA t10,c12 33,3 %
    CLAC c,c 1,8 %
    CLA t,t 1,0 %
    CLA insgesamt 70,2 %
  • Beispiel 9
  • Großmaßstäbliche Chargenproduktion von konjugiertem Distel-FAME
  • Die Produktion von konjugiertem Distel-FAME kann in zwei Schritte aufgeteilt werden, die Methanolyse und die Konjugation. Für die Methanolyse wurden 6.000 kg Distelöl in einen geschlossenen Reaktor gepumpt. Der Reaktor wurde mit Stickstoff bei atmosphärischem Druck gespült, woraufhin 1150 Liter Methanol und 160 kg Na-OCH3 (30 % Lösung) zugegeben wurden. Das Gemisch wurde auf 65°C unter Rühren erhitzt und bei 65°C für 2 Stunden umgesetzt. Die resultierende Bodenschicht wurde abgegossen, während der Reaktor mit Stickstoffgas gespült wurde. 1000 Liter Wasser (40–50°C, in denen 50 kg Zitronensäuremonohydrat gelöst worden waren) wurden dann unter Rühren hinzugegeben. Die Schichten durften sich trennen (etwa 60 Min.), und die Bodenschicht wurde unter Spülen des Reaktors mit Stickstoffgas abgegossen. Das resultierende Distel-FAME-Produkt wurde bei 80°C unter Vakuum für eine Stunde getrocknet.
  • Um das Distel-FAME zu konjugieren, wurden 250 kg KOCH3, gelöst in Methanol zur Bildung einer Paste, dem Reaktor zugegeben. Das Gemisch wurde dann auf 120°C unter Rühren erhitzt und die Reaktion für 3 Stunden fortgesetzt. Das Gemisch wurde auf 100°C abgekühlt, und 1000 Liter Wasser (40–50°C, in denen 50 kg Zitronensäuremonohydrat gelöst worden waren) wurde unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wurde für 15 Minuten gerührt, woraufhin die Schichten sich für 20 Minuten auftrennen durften. Die Bodenschicht wurde abgegossen und das Produkt bei 80°C für 1 Stunde getrocknet und dann unter Stickstoff gelagert.
  • Die resultierende CLA wurde unter Verwendung eines Perkin Elmer Autosystem CL GC unter den folgenden Bedingungen analysiert:
    Säule: WCOT Quarzglas 100 m × 0,25 mm, Beschichtung CP SIL 88
    Träger: He-Gas, 30,0 psi
    Temp.: 220°C
    Durchlaufzeit: 35–90 Min.
    Injekt.: Splitless, 240°C
    Detekt.: FID, 280°C
  • Die GC-Ergebnisse sind in Tabellen 15 und 16 zusammengefasst.
  • TABELLE 15
    Figure 00450001
  • TABELLE 16
    Figure 00450002
  • Die folgenden Tabellen stellen Beispiele typischer Tierfutter-Rationen dar, die die freien CLA-Fettsäuren (engl.: CLA free fatty acids), Triglyceride und Ester der vorliegenden Erfindung enthalten.
  • Beispiel 10 A. JUNGSCHWEINE-FUTTERRATIONEN Tabelle 17
    Figure 00460001
  • B. FUTTERRATIONEN FÜR WACHSENDE/AUSGEWACHSENE SCHWEINE (40–240 LBS [18–109 KG]) Tabelle 18
    Figure 00470001
  • C. SCHWEINEFUTTERRATIONEN FÜR WACHSENDE/AUSGEWACHSENE (FÜR SCHWEINE MIT 121–240 LBS [55–109 KG]) Tabelle 19
    Figure 00470002
  • ZUSAMMENSETZUNG UND ANALYSE DER SPURENMINERALIENVORMISCHUNG FÜR SCHWEINE Tabelle 20
    Figure 00480001
  • ZUSAMMENSETZUNG DER VITAMIN-VORMISCHUNG FÜR SCHWEINE Tabelle 21
    Figure 00480002
  • D. 18 % PROTEIN-FUTTERRATIONEN FÜR LEGEHENNEN Tabelle 22
    Figure 00490001
  • E. FUTTERRATIONEN FÜR JUNGEIAUSGEWACHSENE MASTHÜHNER Tabelle 23
    Figure 00500001
  • F. FUTTERRATIONEN FÜR WACHSENDE/AUSGEWACHSENE TRUTHÜHNER Tabelle 24
    Figure 00510001
  • G. HUNDE-TROCKENFUTTERREZEPTUREN Tabelle 25
    Figure 00520001
  • H. HALBFEUCHTE HUNDEFUTTERREZEPTUREN Tabelle 26
    Figure 00530001

Claims (21)

  1. Eine Zusammensetzung, die mindestens 50% konjugierte Linolsäure enthält, wobei die Zusammensetzung dadurch charakterisiert ist, dass sie (a) insgesamt weniger als ein Prozent 11,13-Octadecadiensäureisomere, (b) insgesamt weniger als ein Prozent 8,10-Octadecadiensäureisomere und (c) ein Gesamtniveau von t9,t11-Octadecadiensäure und t10,t12-Octadecadiensäure von weniger als einem Prozent aufweist.
  2. Linolsäurehaltige Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ein isomerisiertes gängiges Keimöl ist.
  3. Linolsäurehaltige Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das gängige Keimöl ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sonnenblumenöl und Distelöl.
  4. Eine biologisch aktive konjugierte Linolsäurezusammensetzung mit: einer Mischung von freien Fettsäure-konjugierten Linolsäureisomeren, wobei die Mischung mindestens 30% t10,c12-Octadecadiensäure, mindestens 30% c9,t11-Octadecadiensäure, und (a) insgesamt weniger als ein Prozent 11,13-Octadecadiensäureisomere, (b) insgesamt weniger als ein Prozent 8,10-Octadecadiensäureisomere und (c) ein Gesamtniveau von t9,t11-Octadecadiensäure und t10,t12-Octadecadiensäure von weniger als einem Prozent enthält.
  5. Eine biologisch aktive Acylglycerolzusammensetzung, die eine Vielzahl von Acylglycerolmolekülen der Struktur:
    Figure 00550001
    enthält, wobei R1, R2 und R3 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einer Hydroxylgruppe und einer Octadecadiensäure, wobei die Zusammensetzung dadurch charakterisiert ist, dass sie mindestens 30% t10,c12-Octadecadiensäure, mindestens 30% c9,t11-Octadecadiensäure und (a) insgesamt weniger als ein Prozent 11,13-Octadecadiensäureisomere, (b) insgesamt weniger als ein Prozent 8,10-Octadecadiensäureisomere und (c) ein Gesamtniveau von t9,t11-Octadecadiensäure und t10-t12-Octadecadiensäure von weniger als einem Prozent an den Positionen R1, R2 und R3 enthält.
  6. Eine biologisch aktive konjugierte Linolsäurezusammensetzung mit: einer Mischung von Estern von konjugierten Linolsäureisomeren, wobei die Mischung mindestens 30% t10,c12-Octadecadiensäure, mindestens 30% c9,t11-Octadecadiensäure und (a) insgesamt weniger als ein Prozent 11,13-Octadecadiensäureisomere, (b) ingesamt weniger als ein Prozent 8,10-Octadecadiensäureisomere und (c) ein Gesamtniveau von t9,t11-Octadecadiensäure und t10,t12-Octadecadiensäure von weniger als einem Prozent enthält.
  7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, die ferner ein die t10,c12-Octadecadiensäure einschließendes Nahrungsprodukt umfasst.
  8. Die Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Nahrungsprodukt für den menschlichen Verzehr bzw. Verbrauch ist.
  9. Die Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Nahrungsprodukt ein Futter ist, das für den tierischen Verzehr bzw. Verbrauch formuliert ist.
  10. Ein Verfahren zur Herstellung der konjugierten Linolsäure von Anspruch 1 umfassend Bereitstellen einer Linolsäure, die Keimöl, Propylenglycol, und ein Alkali, das mit einem nichtwässrigem Medium kompatibel ist, enthält; Bilden einer vermengten Reaktionsmischung mit dem Keimöl, dem Propylenglycol und dem Alkali, das mit einem nichtwässrigen Medium kompatibel ist; Isomerisieren der in dem Keimöl enthaltenen Linolsäure durch Erhitzen, um konjugierte Linolsäuren zu bilden; und Wässern, um Glycerol freizusetzen.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Erhitzen bei 130 bis 165°C für etwa 2 bis 6,5 Stunden ausgeführt wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 10 zusammen mit den weiteren Schritten des Ansäuerns, um Glycerol freizusetzen, des Vakuumtrocknens, um Wasser zu entfernen, und der molekularen Destillation, um nicht-konjugierte Linolsäureverunreinigungen zu entfernen, und der Desodorierung.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Erhitzen bei 130 bis 165°C für etwa 2 bis 6,5 Stunden ausgeführt wird.
  14. Ein Verfahren mit dem Verfahren nach Anspruch 10 und ferner mit dem Schritt des Behandelns der freien Fettsäurekonjugierten Linolsäure mit Lipase, um Triglyceride zu bilden.
  15. Ein Verfahren zur Herstellung biologisch aktiver konjugierter Linolsäure mit geringer Verunreinigung, mit: Bereitstellen einer Linolsäure, die Keimöl, Propylenglycol und ein mit einem nichtwässrigen Medium kompatibles Alkali enthält; Behandeln der Linolsäure, die Keimöl enthält, um Alkylester der Linolsäure zu bilden; Bilden einer vermengten Reaktionsmischung mit den Alkylestern, dem Propylenglycol und dem mit einem nichtwässrigen Medium kompatiblen Alkali; Isomerisieren der Alkylester durch Erhitzen, um konjugierte Linolsäuren nach Anspruch 1 zu bilden; und Wässern, um Glycerol freizusetzen.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Erhitzen bei 130 bis 165°C für etwa 2 bis 6,5 Stunden ausgeführt wird.
  17. Eine isomerisierte vermengte Reaktionsmischung mit 30 bis 60% behandeltem Keimöl, 10 bis 40% Alkali, und 30 bis 60% Propylenglycol.
  18. Ein Tierfutter, das aus konventionellen Inhaltsstoffen in einem Verhältnis, das für die Spezies und das Alter eines Tieres typisch ist, zusammen mit Alkylestern konjugierter Linolsäuren nach Anspruch 1 in einer biologisch aktiven Konzentration zusammengesetzt ist.
  19. Das Tierfutter nach Anspruch 18, wobei die Konzentration konjugierter Linolsäurealkylester in dem Futter ungefähr 0,05 bis 3,5 Gew.% ist.
  20. Das Tierfutter nach Anspruch 18, wobei der konjugierte Linolsäurealkylester aus mindestens 50 Gew.% bis zu etwa 99 Gew.% Octadecadiensäurealkylesterisomeren, die aus der Gruppe bestehend aus c9,t11-Octadecadiensäurealkylester und t10,c12-Octadecadiensäurealkylester ausgewählt sind, besteht, mit weniger als einem Prozent von 11,13-Octadecadiensäurealkylester und Trans-Transalkylester.
  21. Ein Verfahren zur Herstellung von Alkylestern von konjugierten Linolsäuren nach Anspruch 1 zur Verwendung in Haustierfutter, Nahrungsinhaltsstoffen, oder menschlichen Diätzusätzen, umfassend: Bereitstellen eines unraffinierten Linolsäurealkylesters mit einem Phosphatidylrest im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 0,5%, Behandeln mit einem Alkalialkoholat bei niederer Temperatur in der Gegenwart von einem einwertigen nieder(gewichts)-molekularen Alkohol, um eine Isomerisierung von mindestens 50% des Linolsäurealkylesters zu konjugiertem Linolsäurealkylester bei niederer Temperatur zu bewirken, Ansäuren durch Zusatz einer wasserhaltigen Säure, und Abtrennen des linolkonjugierten Linolsäurealkylesters von der wässrigen Säure ohne Destillation.
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