공액 리놀레산 (CLA)은 CLA의 영양학적, 치료적, 및 약물학적 특성을 이용하고자 하는 다수의 연구 프로그램에서 주목받고 있다.
리놀레산 이중 결합의 공액 위치로의 재배열은 고온에서 니켈 또는 알칼리와 같은 촉매로 처리되는 중에, 그리고 자체 산화 중에 일어나는 것으로 나타났다. 이론적으로, 9,11 및 10,12 옥타데카디엔산의 가능한 8개의 기하 이성질체 (c9,c11;c9,t11;t9,c11;t9,t11; c10,c12;c10,t12;t10,c12 및 t10,t12)는 c9,c12-옥타데카디엔산의 이성질화로부터 형성될 수 있다. 리놀레산의 이성질화에 대한 일반적인 메카니즘은 코완(J.C. Cowan)의 문헌[JAOCS72:492-99 (1950)]에 기재되어 있었다. 활성화 촉매와의 충돌의 결과로 이중 결합이 분극화되는 것으로 믿어진다. 이어서, 분극화된 탄소 원자와 그의 인접 탄소는 자유롭게 회전하고, 부족한 탄소 원자가 본질적으로 평면이 되도록 할 정도의 힘이 존재한다. 이어서, 이 계가 완화되도록 움직일 때, 충돌의 결과로써 이 힘은 경감되고, 시스 및 트랜스형모두가 형성된다. CLA의 특정 이성질체의 형성이 열역학적으로 우세하다. 이는 공액 이중 결합 주위의 5개의 탄소 원자의 동일 평면 특성 및 공명 라디칼의 공간적인 충돌에 기인한다. 9,11 및 10,12 이성질체의 상대적으로 높은 분포는 명백하게 c9,t11 또는 t10,c12 기하 이성질체의 추가적인 안정화에 기인한다.
가스 크로마토그래피의 발전으로 인해 연구자들은 CLA 샘플의 이성질체 조성물을 정확하게 결정할 수 있게 되었다. 크리스티(Christie) 등의 문헌[JAOCS74(11):1231 (1997)]에는, 시판되는 CLA 샘플의 이성질체 분포가 8,10(14%); 9,11(30%); 10,12(31%) 및 11,13(24%)인 것으로 보고되어 있다. 크리스티 등에 의해 출판된 다른 연구 문헌[Lipids33(2):217-21(1998)]에는, 시판되는 CLA 제제의 CLA 이성질체 조성이 t11,t13(0.74%);t10,t12(1.23%);t9,t11(1.18%);t8,t10 (0.46%);c11,t13 및 t11,c13(21.7%); c10,t12 및 t10,c12(29.0%);c9,t11 및 t9,c11(29.5%);c8,t10 및 t8,c10(12.3%);c11,c13(0.96%);c10,c12(0.88%);c9,c11 (0.88%); 및 c8,c10(0.20%)인 것으로 보고되어 있다. 이들 연구로부터 알 수 있는 바와 같이, 특정 이성질체의 형성이 유리하더라도, CLA의 다른 이성질체가 알칼리 이성질화된 CLA 제제의 조성물에 크게 기여할 수 있다.
1978년에 위스콘신 대학의 연구자들이 돌연변이 억제를 나타내는 조리된 소고기에 포함된 물질이 무엇인지 발견하였다. 이 물질은 CLA인 것으로 밝혀졌다. 공액 불포화 상태의 지방산은 보통은 소의 사료의 구성 성분이 아니다. 그러나, 케플러(Kepler) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 241:1350-54(1966)]에 보고된 바와 같이 혐기성생물 박테리아인 부티리비브리오 피브리솔벤스 (Butyrivibrio fibrisolvens)로부터의 리놀레산 이성질화 효소에 의해 리놀레산의 생물학적 수소첨가 반응시에 c9,t11 옥타데카디엔산이 제1 중간체로서 반추위에 형성된다.
CLA의 각 이성질체의 생물학적 활성은 상당한 고찰의 대상이었다. 문헌에서는 일반적으로 생물학적으로 활성인 이성질체는 부티리비브리오 피브리솔벤스에 의해 형성된 c9,t11 이성질체인 것으로 제안되어 있다 (이 부분에 대한 개론으로 파로디(P.W.Parodi)의 문헌 [J.Nutr.127(6):1055-60(1997)], 벨러리(M.A. Belury의 문헌[Nutrition Reviews53(4):83-9(1995)] 참조). 이런 가정을 지지하는 추가의 데이터는 하(Ha) 등의 문헌 [Cancer Res., 50:1097(1991)]에 기재되어 있다. 여기서, 연구자들은 표지된 흡수 연구를 수행하였다. 이 연구에서는 9,11 이성질체가 다소 우세하게 흡수되고 동물 조직의 인지질 분획 내로 혼입되고, 10,12 이성질체는 다소 덜한 것으로 나타났다.
CLA와 관련된 생물학적 활성은 다양하고 복잡하다. 현재 진행 중인 몇몇 전임상 및 임상 연구가 생리학적, 생화학적 작용 방법에 대해 새로이 밝히고는 있으나, CLA의 작용 메카니즘에 대해서 거의 알려져 있지 않다. CLA의 항암 성질에 대해서는 잘 알려져 있다. CLA의 투여는 하 등의 문헌[Cancer Res., 52:2035-s (1992)]에 기재된 바와 같이 쥐의 유방의 종양 발생을 억제한다. 하 등의 문헌 [Cancer Res., 50:1097 (1990)]에는 쥐의 전위 종양 모델에서 비슷한 결과가 보고되어 있다. CLA는 또한 시험관내에서 표적이 되는 사람의 흑색종, 직장결장 및 유방암 세포에 대한 강한 세포 독성제인 것으로 밝혀졌다. 최근의 주요 개론문은 개별적인 연구로부터 이끌어 낸 결론을 확립하였다 [Ip,Am. J. Clin. Nutr., 66(6):1523s (1997)].
CLA 작용의 메카니즘은 여전히 불확실하지만, 최소한 생체내에서는 면역 체계의 일부 성분이 관여된 것으로 볼 수 있는 증거가 있다. 쿡(Cook) 등의 미국 특허 제5,585,400호에는 CLA를 함유하는 음식물을 투여함으로써 타입 I에 의해 매개되는 동물 내 알레르기 반응 또는 TgE 과민 반응을 감소시키는 방법이 개시되어 있다. 약 0.1 내지 1.0% 농도의 CLA 역시 백혈구의 보존에 있어서 효과적인 보조제로 밝혀졌다. 쿡 등의 미국 특허 제5,674,901호에는 CLA를 유리산 또는 염 형태로 경구 또는 비경구 투여하는 것이 세포 매개 면역과 관련 있는 CD-4 및 CD-8 림프구 하위 군의 증가를 가져 오는 것이 개시되어 있다. CLA를 투여한 동물에 있어서, 외인성 종양 괴사 인자를 사용하여 선처리함으로써 발생하는 유해한 영향은 CD-4 및 CD-8 세포 수치를 간접적으로 상승 또는 유지함으로써 경감시킬 수 있다. 마지막으로, 미국 특허 제5,430,066호에는 면역 자극에 의한 체중 감소 및 식욕 부진을 방지하는 데 있어서의 CLA의 효과가 기재되어 있다.
상기에 기재한 바와 같이 CLA의 치료적, 약물학적 용도의 가능성과는 별도로, CLA를 식이 보조제로서 영양학적으로 사용하는 것을 고려해보려는 여러 시도가 있어왔다. CLA는 신체 조성에 상당한 전반적인 영향을 미치는 것으로, 특히 비만 및 결핍 조직을 재분배하는 것으로 밝혀졌다. 쿡의 미국 특허 제5,554,646호에는 0.5%의 CLA가 함유된 음식물을 돼지, 마우스 및 사람에게 공급하는, 식이 보조제로서 CLA를 사용하는 방법이 기재되어 있다. 각각의 종에 있어서, 지방 함량에서의 상당한 감소가 관찰되었으며, 이 때 단백질의 증가가 수반되었다. 흥미로운 것은이러한 동물에 있어서, CLA의 첨가로 인한 음식물의 지방산 함량의 증가가 체중의 증가를 가져오지는 않았으며, 체내 지방 및 결핍된 곳의 재분배와 관련이 있다는 점이다. 또다른 흥미로운 식이 현상은 CLA 보충이 사료의 전환율에 영향을 미친다는 것이다. 쿡의 미국 특허 제5,428,072호는 CLA를 동물 사료 (조류 및 포유류)에 혼입하였더니 사료 전환 효율이 증가하여 CLA를 보충한 동물에게 더 많은 체중 증가가 있었음을 나타내는 데이타를 제공한다.
식용 동물 사육자에게 있어서 CLA의 보충이 가져올 수 있는 유리한 효과가 있음은 명백하다. 실질적으로 생물학적 활성인 이성질체는 어떤 것이고 이들 이성질체가 이용될 수 있는 적합한 비율은 어떤 것인지를 결정하는 것이 필요하다.
<발명의 개요>
학술 문헌에는 활성 CLA 이성질체가 c9,t11 이성질체인 것으로 제안되어 있다. 그러나, 본 명세서에서 나타나는 바와 같이, 9,11 이성질체에 대한 10,12 이성질체의 비가 커질수록 CLA 제제의 생물학적 활성에 미치는 효과가 뚜렷해진다. 따라서, 본 발명의 목적은 생물학적으로 유리한 비로 CLA 이성질체를 함유하는 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 CLA 이성질체를 생물학적으로 우세한 비로 함유하고 생물학적으로 활성인 이성질체를 목적하는 생물학적 효과의 최적화를 위한 강화된 양으로 함유하는 조성물을 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 10,12-리놀레산 및 9,11 리놀레산, 가장 바람직하게는 t10,c12 공액 리놀레산 및 c9,t11 공액 리놀레산을 1.2:1 이상의 비로, 가장 바람직하게는 약 1.2:1 내지 3:1의 비로 포함하는 공액 리놀레산 조성물을 제공한다. 다른 실시태양에서, 제공된 공액 리놀레산 조성물은 또한 사람 또는 동물의 음식물에 대한 일일 규정식의 일부가 될 수 있다. 일일 규정식은 액상 성분을 갖는 비히클을 포함한다. 액상 성분은 10,12 공액 리놀레산, 바람직하게는 t10,c12 공액 리놀레산을 0.01 내지 10 g 당량 함유하거나 포함한다. 별법으로, 다른 실시태양에서, 본 발명은 t10,c12 및 c9,t11 CLA 이성질체의 혼합물을 90% 이상 함유하거나 포함하는 것을 특징으로 하는 리놀레산 이성질체를 함유하거나 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 공액 리놀레산 이성질체를 50% 이상 함유하거나 포함하는 공액 리놀레산 조성물을 제공한다. CLA 이성질체는 t10,c12 및 c9,t11 이성질체의 혼합물을 90% 이상 함유하는 것을 특징으로 할 것이다. 바람직하게는, 이들 이성질체의 비는 t10,c12 이성질체가 우세하도록 1.2:1 이상이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 여전히 t10,c12 CLA가 강화된 다른 조성물 및 제제를 제공한다. 일부 실시태양에서 t10,c12 CLA가 적어도 약 80%의 순도로 존재하고, 다른 실시태양에서 t10,c12 CLA가 적어도 약 90%의 순도로 존재하고, 또다른 실시태양에서 t10,c12 CLA가 적어도 약 92%의 순도로 존재한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 동물과 사람에게 급식하기 위한 c9,t11 CLA가 강화된 조성물을 제공하는 것이다. 일부 실시태양에서, t10,c12 CLA에 대한 c9,t11 CLA의 비는 약 1.4:1 내지 3.0:1이다. 다른 실시태양에서, t10,c12 CLA에 대한 c9,t11 CLA의 비는 약 1.8:1 내지 2.2:1이다. 또다른 실시태양에서, t10,c12CLA에 대한 c9,t11 CLA의 비는 약 2.0:1이다.
상기 조성물이 아실글리세리드 또는 알킬에스테르에 혼입될 수 있다. 일부 실시태양에서, 하기 구조식을 갖는 아실글리세롤 분자 복수개를 포함하고, R1, R2및 R3위치에 t10,c12 옥타데카디엔산을 약 80% 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물이 제공된다. 다른 실시태양에서, 아실글리세롤 조성물은 R1, R2및 R3위치에 t10,c12 옥타데카디엔산을 약 90% 이상 함유하는 것을 특징으로 한다. 또다른 실시태양에서, 아실글리세롤 조성물은 R1, R2및 R3위치에 t10,c12 옥타데카디엔산을 약 92% 이상 함유하는 것을 특징으로 한다. 또다른 실시태양에서, c9,t11 이성질체 강화 CLA는 상기한 바와 같은 비와 퍼센트에 따라 아실글리세롤 중에 R1, R2및 R3위치로 결합될 수 있다.
상기 식에서, R1, R2및 R3은 히드록실기 및 옥타데카디엔산으로 이루어진 군에서 선택된다.
다른 실시태양에서, t10,c12 강화 조성물 및 c9,t11 강화 조성물은 동물 사료 및 사람 소비용 음식물을 포함하는 식품 내로 혼입되거나, 부형제 또는 경구 운바 비히클과 함께 제형화될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 광범위한 영양학적, 치료적 및 약물학적 용도를 갖는 것으로 밝혀졌다. c9,t11 함유 조성물이 성장율, 급식 효율 및 중량 증가율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 동물 및 c9,t11 강화 CLA 조성물이 제공된다. 일부 실시태양에서, t10,c12 CLA에 대한 c9,t11 CLA의 비는 약 1.4:1 내지 3.0:1이다. 다른 실시태양에서, t10,c12 CLA에 대한 c9,t11 CLA의 비는 약 1.8:1 내지 2.2:1이다. 또다른 실시태양에서, t10,c12 CLA에 대한 c9,t11 CLA의 비는 약 2.0:1이다. 또다른 실시태양에서, c9,t11 CLA 강화 조성물은 c9,t11 CLA를 약 40-60%, t10,c12 CLA를 약 20-30% 포함한다. 또다른 실시태양에서, c9,t11 강화 제제는 동물에게 투여되어 급식 전환율, 성장율 또는 중량 증가율을 증가시킨다. t10,c12 CLA를 함유한 조성물이 사람 및 다른 동물의 체지방을 감소시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 동물 및 t10,c12 CLA 조성물이 제공된다. 일부 실시태양에서 t10,c12 CLA는 약 80% 이상의 순도이고, 다른 실시태양에서 t10,c12 CLA는 약 90% 이상의 순도이고, 또다른 실시태양에서 t10,c12 CLA는 약 92% 이상의 순도이다. 또다른 실시태양에서, t10,c12 제제는 사람을 포함하는 동물에 투여되어 체지방을 감소시킨다. 이들 조성물에 대한 다른 용도로는 동물의 근육질 증가, 동물의 알레르기 반응 감소, 동물의 면역 자극에 기인하는 체중 손실 예방, 동물의 CD-4 및 CD-8 세포 수의 증가, 동물의 골 무기질 함량 증가, 동물의 골격 이상 예방, 및 동물의 혈내 콜레스테롤 양 감소를 들 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 해바라기유, 잇꽃유, 대두유 및 옥수수유를포함하는 (이들로 제한되지는 않음) 일용의 종자유로부터 t10,c12 CLA를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 일용의 종자유, 및 이 종자유의 처리 방법이 제공된다. 다른 실시태양에서, 종자유는 t10,c12 CLA를 포함하는 제제가 제조되도록 하는 조건하에서 처리된다. 일부 실시태양에서 CLA는 약 80% 이상이 t10,c12이고, 다른 실시태양에서 CLA는 약 90% 이상이 t10,c12이고, 또다른 실시태양에서 CLA는 약 92% 이상이 t10,c12이다. 다른 실시태양에서, 알킬에스테르의 혼합물이 일용의 종자유로부터 형성된다. 또다른 실시태양에서, 알킬에스테르가 이어서 공액된다. 일부 실시태양에서, 공액 알킬에스테르는 용매 중에서 희석되고, 온도를 약 -56℃ 내지 -57℃로 낮춤으로써 침전된다. 또다른 실시태양에서, 포화 지방산은 온도를 약 -30℃로 낮춤으로써 제제로부터 제거된다. 또다른 실시태양에서, 포화 지방산은 우레아 분류법에 의해 제거될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 상기된 방법에 의해 제조된 t10,c12 CLA를 제공한다.
도 1은 식육용 돼지의 등부위 지방 감소 퍼센트에 대한 CLA의 10,12와 9,11 이성질체의 비를 비교한 3가지 개별 연구에 대한 대수 회귀 분석 플롯이다.
도 2는 등부위 지방 감소 퍼센트에 대한 식육용 돼지의 음식물 중 CLA의 10,12 이성질체 총 퍼센트를 비교한 3가지 개별 연구에 대한 선형 회귀 분석 플롯이다.
정의:
본 명세서에서 사용하는 용어 "공액 리놀레산" 또는 "CLA"는 임의의 공액 리놀레산 또는 옥타데카디엔 유리 지방산을 나타낸다. 이 용어는 분자 내의 임의의 위치에 존재하는 2개의 공액 탄소-탄소 이중 결합이 있는 리놀레산의 모든 위치 및 기하 이성질체를 포함하고 나타내도록 의도된 것이다. 일반적인 리놀레산은 9번 및 12번 위치의 탄소 원자에 이중 결합이 있다는 점에서 CLA는 일반적인 리놀레산과 다르다. CLA의 예로는 위치 이성질체인 2,4-옥타데카디엔산, 4,6-옥타데카디엔산, 6,8-옥타데카디엔산, 7,9-옥타데카디엔산, 8,10-옥타데카디엔산, 9,11-옥타데카디엔산, 10,12-옥타데카디엔산 및 11,13-옥타데카디엔산의 시스- 및 트란스 이성질체 ("E/Z 이성질체")를 들 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "CLA"는 단일 이성질체, 두 개 이상의 이성질체의 선택된 혼합물, 및 천연 공급원으로부터 얻어지는 이성질체의 선택되지 않은 혼합물뿐 아니라 합성 및 반합성 CLA를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, CLA의 "트리글리세리드"는 트리글리세리드 골격 상의 3 위치 중 임의의 또는 전체 위치에 CLA를 함유하는 것으로 의도된 것이다. 따라서, CLA를 함유하는 트리글리세리드는 CLA의 위치 및 기하 이성질체 중 임의의 것을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, CLA의 "에스테르"는 CLA의 임의의 모든 위치 및 기하 이성질체가 에스테르 연결기를 통해 생리학적으로 허용가능한 천연 알코올 (예, 메탄올, 에탄올, 프로판올)을 포함하는 (이들에 제한되지는 않음) 알코올 또는 임의의 다른 화학군에 결합되어 있는 것을 포함하도록 의도된 것이다. 따라서, CLA의 에스테르 또는 에스테르화된 CLA는 CLA의 위치 및 기하 이성질체 중 임의의 것을 함유할 수 있다.
CLA의 "비천연 이성질체"는 옥타데카디엔산의 c11,t13; t11,c13; t11,t13; c11,c13; c8,t10; t8,c10; t8,t10; c8,c10 및 트랜스-트랜스 이성질체를 포함하나 (이들에 제한되지는 않음), 옥타데카디엔산의 t10,c12 및 c9,t11 이성질체는 포함하지 않도록 의도된다. "비천연 이성질체"는 또한 CLA가 알칼리 이성질화에 의해 합성될 경우 대개 소량으로 생성되기 때문에 CLA의 "소량의 이성질체"로 언급될 수도 있다.
"제조 식품"은 사람 소비용으로 적합한 것으로 증명된 임의의 예비포장된 음식물을 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "c"는 시스 방향의 화학 결합을 나타내고, "t"는 트랜스 방향의 화학 결합을 나타낸다. CLA의 위치 이성질체가 "c" 또는 "t" 없이 표시되어 있는 경우, 이 표시는 4가지의 가능한 이성질체를 모두 포함하는 것이다. 예를 들어, 10,12 옥타데카디엔산은 c10,t12; t10,c12; t10,t12 및 c10,c12 옥타데타디엔산을 포함하는 것인 반면, t10,c12 옥타데카디엔산 또는 CLA는 단일 이성질체만을 나타낸다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "유(오일)"는 장쇄 지방산 (예, CLA) 또는 기타 장쇄 탄화수소기 함유 유리 유동액을 나타낸다. 장쇄 지방산은 CLA의 다양한 이성질체를 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "생리학적으로 허용가능한 담체"는 유성 제약에 통상적으로 사용되는 임의의 담체 또는 부형제를 나타낸다. 이러한 담체 또는 부형제로는 오일, 녹말, 수크로즈 및 락토오즈를 들 수 있으나, 이들에 제한되는것은 아니다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "경구 전달 비히클"은 캡슐, 환제, 정제 및 시럽제를 비롯해 제약을 경구적으로 전달하는 임의의 수단을 나타내나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "식품"은 사람, 비반추 동물, 또는 반추 동물에 의해 소비되기에 적절한 임의의 음식 또는 사료를 나타낸다. "식품"은 제조 포장된 음식 (예, 마요네즈, 샐러드 드레싱, 빵 또는 치즈 음식) 또는 동물 사료 (예, 압출되고 펠렛화된 동물 사료 또는 거친 혼합 사료)일 수 있다. CLA의 다양한 용도는 특허 문헌 및 학술 문헌에 잘 기재되어 있다. 이런 용도는 2종의 일반적인 카테고리로 분류될 수 있다. 첫번째 카테고리는 식이 보조제로서 CLA의 영양학적 용도이다. 두번째 카테고리는 치료적 및 약물학적 용도이다.
본 명세서에 참고로 인용된 쿡 등의 미국 특허 제5,554,646호에는 동물의 체지방을 감소시키기 위한 CLA의 용도가 개시되어 있다. 이 방법에서, 체중을 감소시키기에 충분한 안정하고 유효한 양의 CLA가 동물에 공급된다. 0.5% CLA를 함유하는 음식물을 공급받은 쥐의 공급 말기의 총 지방 함량은 0.5% 옥수수유를 함유하는 음식물을 공급받은 대조용 쥐의 지방 함량보다 현저히 적었다. 체지방이 감소되도록 투여되는 CLA의 정확한 양은 동물, 사용된 CLA 형태, 및 투여 경로에 좌우된다. 양은 일반적으로 동물 체중 kg 당 약 0.001 g 내지 약 1 g이다. 제약학적 양은 일반적으로 사람 음식물 중의 CLA가 약 1,000 ppm(parts per million)내지 약 10,000 ppm이다. 그러나, CLA가 비교적 비독성이므로 사용되는 양의 상한은 중요하지 않다. 이런 용도 및 다른 용도를 위한 CLA는 또한 다양한 형태로 제조될 수 있다. 이런 다양한 형태로는 제약학적 희석제 및 활성 에스테르와 조합된 CLA의 비독성 나트륨염 또는 칼륨염을 들 수 있다. CLA는 또한 동물 사료 또는 사람에게 공급될 음식 중량의 약 0.01% 내지 2.0% 또는 그 이상을 구성하도록 동물 사료 또는 사람의 음식물에 직접적으로 혼입될 수 있다. 이 특허에는 또한, CLA로 동물 사료를 보충하는 것은 동물내 체단백질을 비축시키고 동물내 근육 단백질을 증가시키는 작용을 하게할 것이라고 개시되어 있다.
CLA의 다른 영양학적 용도가 본 명세서에 참고로 인용된 쿡 등의 미국 특허 제5,428,072호에 개시되어 있다. 즉, 동물에게 안전하고 유효한 양의 CLA를 공급하는 것은 중량 증가율 및 동물내 급식 효율을 증진시키는 것으로 나타났다. 0.5% CLA가 보충된 음식물이 공급된 병아리 군은 음식물을 보다 소량 섭취하더라도 0.5% 리놀레산이 공급된 대조 병아리와 동일한 중량 증가율을 나타내었다. 더욱이, 0.5% CLA가 공급되고, 이어서 엔도톡신이 주사된 병아리는 중량 증가율을 나타낸 반면, 대조 음식물이 공급된 병아리는 중량이 손실되거나 중량이 매우 조금 증가되었다. 0.5% CLA를 함유한 음식물이 공급된 쥐와 0.5% 또는 1%의 CLA가 공급된 토끼에서 유사한 결과나 나타났다. 음식물에 공급되거나 포함되는 CLA의 양에 대한 지침은 미국 특허 제5,554,646호에 개시된 것과 동일하다.
연구에 의해서, CLA가 사람의 체중을 실질적으로 감소시킬 수 있음이 입증되었다. 1997년 에링 톰 (Erling Thom)에 의해 노르웨이에서 수행된 이중 블라인드(blind) 연구에서, 20명의 건강한 개체가 섭취할 음식물에 CLA 혼합물 3g또는 위약 3g이 보충되었다. CLA가 공급된 군이 체중과 체지방 퍼센트 감소 둘다를 경험한 반면, 위약이 공급된 군은 체중과 체지방 퍼센트 증가를 경험하였다. PCT 공개 공보 WO 제97/46230호에는 기존 체지방 및(또는) 체중을 유지하기 위한 방법이 개시되어 있다. 이 특허의 특허청구범위는 CLA가 총 3명의 개체에 의해 소비되는 일화적이고 비제어적인 연구에 의존한다.
CLA 용도에 대한 다른 특허에서는 면역 반응에서의 CLA의 역할에 주목하였다. 본 명세서에 참고로 인용된 쿡 등의 미국 특허 제5,585,400호에는 CLA 함유 음식물을 투여함으로써 타입 I에 의해 매개되는 동물내 알레르기 반응 또는 TgE 과민 반응을 감소시키는 방법이 개시되어 있다. 이 특허에는 또한 CLA를 약 0.1 내지 1.0%의 농도로 투여하여 백혈 세포의 수를 유지하는 것이 개시되어 있다. 이 특허에 개시된 연구는, 기니아 피그 기관 알레르기 모델을 이용하였다. 기니아 피그에는 2주 동안 0.25% CLA 또는 대조 음식물이 공급되었고, 이어서 과면역화를 위해 2 및 3 주째에 난알부민으로 면역처리되었다. 과융합 모델계를 사용하여 공급된 CLA가 알레르기 항원에 의해 유도되는 기관 위축에 어떤 영향을 미치는 지를 결정하였다. CLA가 공급된 기니아 피그로부터의 기관은 대조군이 공급된 기니아 피그의 기관에 비해 과융합계에서 보다 안전하였다. 알레르기 항원이 기니아 피그 기관 상에서 주입될 때, CLA가 공급된 동물의 조직에서 기관 위축이 보다 덜한 것으로 관찰되었다. CLA가 공급된 동물의 백혈 세포 수는 대조 동물에 비해 증가하였다. 대조 동물의 백혈 세포 수가 2.4 x 106+/-0.3인데 비해, CLA가 공급된 동물의 백혈 세포 수는 3.5 x 106+/-0.6이었다.
성장을 증진시키고, 면역 자극 (예를 들어, 에도톡신 노출) 및 신진대사 호르몬(예를 들어, IL-1)의 부작용에 기인하는 식욕 감퇴 및 체중 손실을 막는 CLA의 용도가 본 명세서에 참고로 인용된 쿡 등의 미국 특허 제5,430,066호에 개시되어 있다. 0.5% CLA의 음식물이 공급되고 이어서 엔도톡신이 주사된 병아리가 중량 증가를 나타낸 반면, 대조 음식물이 공급된 병아리는 엔도톡신 노출후 중량 증가가 나타나지 않았다. 0.5% 옥수수유의 대조 음식물이 공급된 동물과 비교할 때, 0.5% CLA를 함유한 음식물이 공급된 쥐에서도 유사한 결과가 얻어졌다. 개시된 제법 및 투여량 범위는 미국 특허 제5,554,646호에 개시된 것과 동일하다.
CD-4 및 CD-8 세포 농도를 유지하거나 증가시키고, 종양 회저 인자 (TNF)를 생성하거나 외인성 투여함으로써 또는 바이러스에 의해 야기된 동물에 대한 부작용을 예방하거나 경감시키기 위해 동물에 안전하고 효과적인 양의 CLA를 투여하는 것으로 이루어지는 동물을 치료하는 방법이 본 명세서에 참고로 인용된 쿡 등의 미국 특허 제5,674,901호에 개시되어 있다. 마우스에 대조 음식물 또는 0.5% CLA가 공급되고, 이어서 TNF가 주사된다. CLA가 공급된 마우스는 대조 마우스에 비해 중량 손실이 덜하다. 유사하게, 0.5% CLA 음식물이 공급되고 이어서 살아있지만 약해된 가금의 수두 바이러스가날개 웹에 주사된 병아리는 대조 음식물이 공급된 병아리에 비해 중량이 더 증가하였다. 0.5% CLA 음식물이 공급된 병아리는 대조 음식물이 공급된 병아리에 비해 CD-4 및 CD-8 세포의 퍼센트가 현저히 증가되었음을 나타내었다.
본 명세서에 참고로 인용된 리벤스(Lievense) 등의 유럽 특허 출원 제779,033 A1호에는 혈지질 프로파일을 향상시키기 위한 CLA의 용도가 개시되어 있다. 간략히, 햄스터에 트리글리세리드에 혼입된 CLA를 음식물 총 칼로리의 1.5%의 속도의 지방 분무 형으로 함유하는 음식물이 공급되었다. CLA가 공급된 햄스터는 총 콜레스테롤 감소, HDL 콜레스테롤 감소, 및 LDL 콜레스테롤 감소를 나타내었다.
둘다가 본 명세서에 참고로 인용된 쿡 등의 PCT 공개 공보 WO 제98/05318 및 쿡 등의 WO 제98/05319호에 보고된 바와 같이, CLA는 또한 골 퇴적을 수행하는 것으로 설명되어 있다. 음식물 중 CLA를 0.1875%, 0.375%, 또는 0.75% 함유하는 음식물이 공급된 병아리는 음식물 중 CLA를 섭취하지 않은 병아리에 비해 골격 이상이 실질적으로 감소된 것으로 나타났다. 더욱이, 0.5% CLA를 함유한 음식물이 공급된 병아리는 골 무기질 함량이 증가된 것으로 나타났다.
다른 특허에는 각종의 CLA 제제가 기재되어 있다. 유럽 특허 출원 EP 제779033 Al호에는 공액 리놀레산 잔기를 0.05 내지 20 중량% 함유하는 식이성 지방 스프레드가 개시되어 있다. 여기에는, 리놀레산 함량이 95.3%인 유리 지방산의 시판 혼합물이 에틸렌 글리콜 중의 NaOH로 알칼리 이성질화 처리되었다. 유리 지방산은 팜유와 리파아제 10부와 혼합됨으로써 트리글리세리드로 혼입되었다. 혼합물이 45 ℃에서 48 시간 동안 교반되고, 리파아제 및 유리 지방산이 제거되었다. 이 조성물 70부 및 물 29부, 유장 단백질 분말 0.5부, 염 0.1부, 및 향미료 및 (4.5의 pH를 얻기 위해) 시트르산 소량을 합하고 가공하여 지방 스프레드를 제조하였다.
안전하고 유효한 양의 CLA를 함유하는 다른 음식물이 본 명세서에 참고로 인용된 쿡 등의 PCT 공개 공보 WO 제97/46118호에 개시되어 있다. 여기서, 약 0.33-0.5 마이크로미터 직경의 유화 지방 분자를 함유하는 사람에게 비경구 투여하기 위한 액상 식이성 음식이 개시되어 있다. 유탁액은 CLA를 0.5 mg/g 내지 10 mg/g, 또는 별법으로 음식물 지질을 기준으로 CLA를 0.3% 내지 100%, 또는 100 칼로리의 음식물 당 CLA를 0.03 g 내지 0.3 g 함유한다. 이 출원에는 또한 단백질 2.66 g, 지방 5.46 g, 탄수화물 10.1 g, 물 133 g, 및 일일 권장 허용량의 비타민과 무기질과 함께 비슷한 양의 CLA를 함유하는 유아용 배합물이 개시되어 있다. 고단백질, 고비타민 및 고무기질 보조제로서 유용한 액상의 장 식이성 제품의 다른 예가 개시되어 있다. 이 보조제는 CLA를 제품의 0.05 중량% 내지 약 5 중량%의 양으로, 또는 존재하는 지질의 0.3% 내지 약 100%의 양으로, 또는 100 칼로리당 CLA를 약 0.03 내지 0.3 g의 양으로 함유한다. 추가로, 140 칼로리의 대표적인 배합물은 달걀 흰자위 고형분 7.5 g, CLA 1 g, 슈크로즈 또는 가수분해된 옥수수 전분과 같은 탄화수소 27.3 g, 물 1.9 g, 및 일일 권장 허용량의 비타민 및 무기질을 함유할 수 있다.
본 발명에서, 10.12 이성질체 또는 9,11 이성질체 중 어느 하나가 강화된 제제는 상기한 각 적용 분야에 바람직하게 이용된다. 9,11 이성질체 강화 제제는 마트레야 (Matreya, 펠실베니아주 스테이트 칼리지 소재)로부터 시판된다. t10,c12 이성질체 강화 CLA 제제는 바람직하게는 제조용 가스 크로마토그래피 또는 실시예4에 제시된 침전법에 의해 바람직하게 제조될 수 있다.
본 발명자들은, 가장 최근의 과학적 견해와는 달리, 특정 활성 CLA 이성질체가 실질적으로 CLA의 t10,c12 이성질체일 수 있음을 밝혀내었다. 본 발명에서, 사람 음식 보조제 및 동물 사료에 첨가된 9,11 이성질체에 대한 10,12 이성질체의 비, 가장 바람직하게는 c9,t11 이성질체에 대한 t10,c12의 비는 바람직한 영양학적, 치료적, 그리고 약물학적 효과가 제공되도록 조절된다. 사용된 9,11 이성질체에 대한 10,12 이성질체의 비, 가장 바람직하게는 c9,t11 이성질체에 대한 t10,c12의 비는 약 1.2:1 이상, 가장 바람직하게는 약 1.2:1 내지 3:1이다. CLA는 비독성이므로, 9,11에 대한 10,12 비의 상한은 중요하지 않다. 그러나, 역치인 3:1 비를 초과하면 추가적인 이점이 비교적 적어질 것으로 예측된다. 그러나, 10,12 강화 CLA의 섭취는 관찰된 최대 효과를 초과하는 정도로 효과가 있다.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 t10,c12 이성질체 강화 제제와 9,11 이성질체 강화 제제 또는 알칼리 이성질화에 의해 제조된 일반적인 CLA 제제 중 하나와의 배합에 의해 제형화된다. 각 경우에, 9,11 이성질체에 대한 10.12 이성질체의 바람직한 비가 얻어지도록 10,12 이성질체 강화 제제가 첨가된다. 다양한 CLA 제제의 이성질체 조성물은 바람직하게는 당업계에 공지된 가스 크로마토그래피에 의해 확인될 수 있다.
별법으로, 10,12 이성질체는 10,12 이성질체 0.01 내지 10 g 당량, 가장 바람직하게는 t10,c12 이성질체 0.01 내지 10 g 당량을 함유하거나 포함하는 지질 성분과 함께 비히클 중에 일일 규정식만큼 제공될 수 있다. 그램(g) 당량이란 존재하는 다른 이성질체와 독립적으로, 제공된 10,12 이성질체의 총량이 0.01 내지 10 g인 것을 의미한다. 존재하는 10,12 이성질체의 양은 결국 9,11 이성질체에 대한 10,12 이성질체의 비가 약 1.2:1이상이 되도록 하는 양일 것이다. 10,12 이성질체가 일일 규정식의 일부로서 제공될 때 섭취량은 단일 투여량만큼이거나, 음식 중 하루동안 소비되는 각종의 식품 중의 일련의 투여량만큼일 것이다.
본 발명의 조성물은 또한 상업적으로 판매되는 부피가 큰 제품의 형태를 취할 수 있다. 부피가 큰 CLA 제품은 공액 리놀레산 이성질체를 약 50% 이상 함유하거나 포함한다. 리놀레산 이성질체는 t10,c12 이성질체와 c9,t11 이성질체를 90% 이상함유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 이들 이성질체는 t10,c12가 우세하게 약 1.2:1 이상의 비, 가장 바람직하게는 약 1.2:1 내지 3:1 범위의 비로 제공된다. 이같은 부피가 큰 제품은 동물의 사료, 사람의 식이 보조제, 및 사람의 식품과 같은 영양학적 제품내로 희석될 수 있다. 이들 제품은 t10,c12 이성질체와 c9,t11 이성질체의 혼합물을 90% 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 리놀레산 이성질체를 함유하거나 포함하는 조성물일 것이다. 바람직하게는, 이들 이성질체는 t10,c12가 우세하게 약 1.2:1 이상의 비, 가장 바람직하게는 약 1.2:1 내지 3:1 범위의 비로 제공된다.
본 발명의 조성물은 다양한 용도를 가질 것이다. 이런 용도로는 동물의 체지방 감소, 동물의 근육질 증가, 동물의 급식 효율 증가, 사람의 체중 감소, 동물의 알레르기 반응 감소, 동물의 면역 자극에 기인하는 체중 손실 예방, 동물의 CD-4 및 CD-8 세포 수의 증가, 동물의 골 무기질 함량 증가, 동물의 골격 이상 예방,및 동물의 혈내 콜레스테롤 양 감소를 들 수 있다. 각 경우에, 동물이란 용어는 사람을 포함하는 모든 포유류를 포함한다. 각각의 적용에 사용되는 10,12 이성질체, 가장 바람직하게는 t10,c12 이성질체의 바람직한 투여량 및 비는 상기한 바와 동일하다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 안전하고 효과적인 영양학적 또는 치료적 양의 t10,c12 CLA가 (사람을 포함하는) 동물에 경구 투여되어 체중 또는 지방을 감소시킨다. 일부 실시태양에서 t10,c12 CLA는 약 80% 이상의 순도를 나타내고, 다른 실시태양에서 t10,c12 CLA는 약 90% 이상의 순도를 나타내고, 또다른 실시태양에서 t10,c12 CLA는 약 92% 이상의 순도를 나타낸다. t10,c12 CLA는 비만인 사람과 비만이 아닌 사람에게 투여될 수 있다. t10,c12 CLA가 약물이 아니고 비독성인 천연 음식물 성분이기 때문에 t10,c12 CLA가 정규 음식물의 일부로서 소비될 수 있고, 비만을 일으키지 않으면서 사람의 일일 영양의 일부로서 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 영양학적 유효량은 순수한 형태로 또는 식이 보조제로서 섭취될 때 적절한 영양을 손상시키거나 간섭하지 않은채 체중 또는 지방을 감소시키는 t10,c12 CLA의 양이다. 따라서, t10,c12 CLA를 영양학적 유효량 투여함으로써 음식 섭취의 감소와 관련된 지각 손실없이 중량 손실을 이룰 수 있다. 또한, t10,c12 CLA는 마른 사람을 충분한 임상적 비만도를 갖도록 치료하는데 사용될 수 있다. 임상적으로 비만한 사람을 치료할 때, 치료적 유효량의 t10,c12 CLA가 투여된다. 치료적 유효량은 임상적으로 비만한 사람의 중량 또는 체지방 감소를 일으키는 양이다. 본 발명에서 CLA는 일일 약 0.1 내지 15 g 투여될 수 있고, 바람직하게는 일일 약 0.1 내지 5 g이 투여될 수 있고, 가장 바람직하게는 일일 약 1.8 g이 투여될 수 있다. 일반적으로, 투여된 CLA의 양은 영양학적으로 또는 치료적으로 유효할 정도로 충분하기만 하다면 중요하지 않다. 영양학적으로 또는 치료적으로 유효한 것으로 생각되는 CLA의 양은 4주 이상의 기간 동안 투여될 때 중량 또는 지방이 측정가능한 정도로 손실되는 양이다.
체중, 기초 신진대사, 운동, 및 음식물의 다른 측면과 같은 파라미터가 개체마다 다르기 때문에 효율면에서 다소 차이가 있을 것으로 예상된다. 개체는 초기 2주 동안 바람직하게는 1.8 g의 투여량이 투여되기 시작하고, 이어서 중량 손실이 없다면 CLA 투여량이 일일 약 10-15 g 까지 점차적으로 증가된다.
본 발명에서는 또한 이성질체 강화 CLA 제제의 유도체의 용도에 대해 연구하였다. 예를 들어, CLA는 유리되어 있거나, 에스테르 결합을 통해 결합되거나, 실시예 5에 기재된 이성질체 강화 CLA 트리글리세리드 함유 오일 형태로 제공될 수 있다. 이들 실시태양에서, 트리글리세리드는 글리세롤 골격에 부착된 이성질체 강화 CLA로 부분적으로 또는 전체적으로 구성될 수 있다. 이성질체 강화 CLA는 또한 실시예에 기재된 바와 같이 메틸에스테르 또는 에틸에스테르로서 제공될 수 있다. 더욱이, 이성질체 강화 CLA는 칼륨염 또는 나트륨염과 같은 비독성 염 (예를 들어, 유리산 화학적 등가량과 알칼리 수산화물을 약 8 내지 9의 pH에서 반응시킴으로써 형성된 염)의 형태일 수 있다.
일부의 바람직한 실시태양에서, 투여 방식은 경구 투여이다. 이성질체 강화 CLA는 전분, 슈크로스 또는 락토오스와 같은 적합한 담체와 함께 정제, 환제,당의정, 캡슐제, 용액제, 액제, 슬러리제, 현탁제 및 유화제의 형태로 제형화될 수 있다. 이성질체 강화 CLA는 수성 용액, 유성 용액으로서, 또는 상기 논의된 임의의 다른 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 정제 또는 캡슐제가 약 6.0 내지 7.0의 pH에서 용해되는 장용피로 도포될 수 있다. 소장에는 용해되지만 위에서는 용해되지 않는 적합한 장용피는 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트이다. 바람직한 제형에서, 이성질체 강화 CLA는 연질 젤라틴 캡슐로서 제공된다. 이성질체 강화 CLA는 또한 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 포막내, 심실내, 경피, 피하, 복막내, 비강내, 장, 국소, 설하, 또는 직장내 수단을 포함하는 다수의 다른 경로에 의해 제공될 수 있으나, 이를 경로에 제한되는 것은 아니다. 제형화 및 투여를 위한 기술에 대한 추가의 상세한 사항은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(펜실베니아주 이스톤 소재의 Maack 출판사] 최근판에서 확인할 수 있다.
이성질체 강화 CLA는 또한 다양한 제조 식품 및 음료에서 보조제로 제공될 수 있다. 이러한 적용 목적상, 제조 식품은 이성질체 강화 CLA가 첨가된 임의의 천연, 가공, 식이 또는 비식이 식품을 의미한다. 이성질체 강화 CLA는 유리 지방산의 형태로, 또는 이성질체 강화 CLA의 트리글리세라이드를 부분적으로 또는 전체적으로 함유하는 오일로서 첨가될 수 있다. 따라서, CLA는 식이 음료, 다이어트 바 (diet bar), 보조제, 제조 냉동식, 캔디, 스낵 제품 (예, 칩), 제조 육류 제품, 우유, 치즈, 요구르트 및 기타 지방 또는 오일 함유 음식을 비롯한 다양한 제조 식품에 직접 혼입될 수 있다.
CLA는 또한 산화에 민감하다. 따라서 사람이 사용하는 용도로는 이성질체강화 CLA를 레시틴, 토코페롤, 아스코르베이트, 아스코르빌 팔미테이트, 또는 로즈마리 추출물과 같은 향신료 추출물 등의 적절한 산화방지제로 포장하는 것이 바람직하다.
최근에, 대부분의 CLA는 알칼리 이성질화 공정에 의해 제조된다. 해바라기 유, 달맞이꽃유 또는 잇꽃유와 같은 리놀레산을 다량 함유하는 오일이 불활성 질소 환경에서 수산화칼륨 및 프로필렌 글리콜과 같은 용매와 약 180 ℃에서 약 2.5 시간 동안 반응한다. 반응 산물은 산화되고, 산성수로 수회 세척되고, 최종적으로 진공하에서 건조된다. 알칼리 이성질화에 의해 CLA를 실험실적 규모로 제조하는데 대해서는 이에 대해 완벽하게 기재되어 있는, 본 명세서에 참고로 인용된 미국 특허 제5,554,646호를 참조한다. CLA는 또한 본 명세서에 참고로 인용된 미국 특허 제4,164,505호에 기재된 연속 유동 알칼리 이성질화 공정에 의해 제조될 수 있다. 이런 공정으로부터 얻어진 반응 산물은 CLA, 리놀레산과 원료 오일 중에 발견되는 다른 지방산의 혼합물이다. 일반적으로, 해바라기유의 알칼리 이성질화로부터 유도된 CLA의 양은 총 유리 지방산 산물의 약 60%이고, c9,t11 및 t10,c12 이성질체를 거의 등량 함유한다.
주로 시스-9, 트랜스-11 CLA로 이루어진 제제를 제조하기 위한 다른 방법은 본 명세서에 참고로 인용된 미국 특허 제5,674,901에 개시되어 있다. 이 방법에서, 리놀레산 함유 오일은 미생물 부티리비브리오 피브리솔벤스와 함께 배양된다. 부티리비브리오 피브리솔벤스는 리놀레산을 시스-9,트랜스-11 CLA로 전환시키는△12-시스, △11-이성질화 효소를 함유한다.
실시예 1:
사료 중 CLA 함량과 식육용 돼지의 등부위 지방량 사이의 관계를 검토하는 3가지 상이한 연구를 수행하였다. 아이오와 주립 대학(Iowa State University)에서 수행되어 미드웨스트 에니멀 사이언스 미팅(Midwest Animal Science meeting)에서 보고된 연구에서, 틸(R.L. Thiel) 등은 CLA를 먹인 돼지가 등부위 지방이 감소한 것을 보고하였다. 간단히 설명하면, 초기 평균 체중이 26.3 ㎏인 한배에서 나온 거세 수퇘지 5마리의 8마리 복제동물들을 개별 축사에 무작위로 배당하였다. 돼지들을 평균 93일 동안 사육하였고, 도축시 평균 체중은 116 ㎏이었다. 0.5% CLA의 사료를 먹인 군에서는 등부위 지방이 10.3% 감소하였다. 처음에 발표되지는 않았지만 사료 중에 사용된 CLA는 CLA의 10,12:9,11 이성질체를 1.05:1 비율로 함유하였다.
캔사스 주립 대학(Kansas State University)에서 연구자들에 의해 수행되어 미드웨스트 에니멀 사이언스 미팅에서 보고된 다른 연구에서는 초기 평균 체중이 37.35 ㎏(83 lbs)인 36마리의 잡종 거세 수퇘지에게 0.50% CLA를 함유하는 사료를 먹였다. 평균 최종 체중은 약 103.5 ㎏(약 230 lbs)이었다. CLA를 함유하는 사료를 먹인 수퇘지에서는 등부위 지방이 7.2% 감소하였다. 이 실험에 사용된 CLA 중에서 CLA의 10,12:9,11 이성질체의 비는 0.487:1이었다.
아직 발행되지 않은 다른 연구에서는, 초기 체중이 26 ㎏인 24마리의 거세 수퇘지에게 0.48% CLA를 함유하는 사료 또는 대조 사료를 먹였다. 돼지를 최종 체중 118 ㎏까지 사육하였다. CLA를 먹인 돼지에서는 등부위 지방이 13.7% 감소하였다. 이 실험에서 CLA의 10,12:9,11 이성질체의 비는 1.16:1이었다.
이들 각 연구에서 사용된 CLA의 10,12:9,11 이성질체의 비를 등부위 지방 감소%에 대해 플로팅하여 대수 회귀법으로 분석하였다. 결과를 도 1에 나타냈다. 이들 결과는 CLA의 10,12:9,11 이성질체의 비가 증가함에 따라 등부위 지방 감소%도 또한 증가하는 것을 보여준다. 따라서, 약 1.2:1 이상의 비로 10,12:9,11를 함유하는 CLA의 제제가 바람직하다.
사료 중 10,12 이성질체의 총량이 또한 등부위 지방 축적에 영향을 끼칠 수 있다. 사료 중 10,12 이성질체%를 등부위 지방 감소%에 대해 플로팅하여 선 회귀법으로 분석하였다. 결과를 도 2에 나타냈다. 이들 결과는 사료 중 10,12 이성질체의 총량이 증가함에 따라 등부위 지방이 감소하는 것을 증명한다. 보이는 영향은 이성질체 비율에 대한 것만큼 크지는 않다. 그러나, 이들 결과는 비율에 대한 결과와 일치할 수 있다. 신뢰되는 연구들에서는 이성질체들 사이를 구별짓지 않았다. 존재하는 9,11 및 다른 이성질체들의 양과 비율이 사료 중 10,12의 증가%에 관련한 임의의 영향을 차폐시켰을 수도 있다. 10,12 이성질체 강화 CLA의 제제를 사용하면, 그 결과가 비율에 대한 결과에 필적할 것으로 예상된다.
실시예 2:
학술 문헌에서는 CLA의 생물 활성 이성질체들이 확인되지 않았거나, 또는c9,t11 CLA이 생물 활성 이성질체인 것으로 나타낸다. 본 발명자들은 실시예 1의 결과에 기초하여, t10,c12 이성질체가 활성 이성질체인 것으로 믿는다. 따라서, CLA 이성질체들을 상이한 비율과 양으로 마우스에 먹인 효과를 검토하여, t10,c12 이성질체가 생물 활성 이성질체이며 t10,c12:c9,t11의 비를 조정하여 원하는 생물학적 효과를 나타내도록 할 수 있음을 증명한다.
시험은 할란 스프라그 돌리(Harlan Sprague Dawley, 위스콘신주 매디슨)에서 입수한 ICR 마우스 84마리를 이용하여 수행하였다. 기초 사료, 설탕, 옥수수유와 공액 리놀레산의 이성질체들 중 하나 또는 이성질체들의 배합물을 사용하여 사료를 배합하였다. 각 처리군은 3마리 마우스의 축사 2개로 이루어졌다. 마우스가 사료와 물에 자유롭게 접근하도록 하였다. 사료 소비량을 매일 모니터하고 마우스를 깔깃을 교체할 때 격주로 체중을 재었다. 사료를 먹인 지 3주째에, 마우스를 CO2에 의해 안락사시키고 최종 체중을 재었다. 이어서, 마우스를 부검하여 지방층의 무게를 재었다. 또한 마우스를 총 체지방에 대해 분석하였다. 마우스를 동결건조시키고 갈았다. 2개씩의 샘플을 근성 분석(proximate analysis)(에테르 추출, 회분, 킬달(Kjeldahl) 및 수분)으로 분석하였다. 결과를 하기 표 1에 기록하였다.
처리9,11:10,12 |
체중 증가 (g) |
사료 소비량0-3주 (g) |
사료 전환율0-3주 |
지방% |
0.0:0.0 |
9.88 |
85.75 |
8.75 |
13.995 |
0.0:0.1 |
9.38 |
87.67 |
9.34 |
8.806 |
0.0:0.2 |
8.88 |
81.72 |
9.73 |
6.439 |
0.0:0.4 |
9.35 |
83.27 |
8.97 |
3.003 |
0.1:0.0 |
9.77 |
86.58 |
8.87 |
9.880 |
0.2:0.0 |
11.38 |
92.83 |
7.02 |
10.346 |
0.4:0.0 |
11.55 |
88.62 |
7.86 |
13.403 |
0.1:0.1 |
10.49 |
92.38 |
8.89 |
9.560 |
0.1:0.2 |
8.17 |
82.98 |
10.28 |
7.306 |
0.2:0.0 |
11.38 |
92.83 |
7.02 |
10.346 |
0.2:0.1 |
11.23 |
89.43 |
8.49 |
7.922 |
0.2:0.2 |
8.75 |
79.82 |
9.15 |
7.115 |
0.2:0.4 |
10.23 |
88.20 |
8.64 |
3.088 |
0.4:0.0 |
11.55 |
88.62 |
7.86 |
13.403 |
0.4:0.2 |
9.50 |
85.27 |
8.98 |
7.508 |
0.4:0.4 |
9.97 |
81.57 |
8.19 |
0.476 |
c9,t11 CLA만을 먹인 마우스는 t10,c12이 존재하지 않을 때 직선형의 성장 개선율(16%)을 보였다. t10,c12 이성질체를 사용한 경우에는 반대로 되었고, 이 때 성장이 10% 감소하였다. 결과적으로, c9,t11은 0.2%:0% 비에서 또한 사료 소비량을 8% 증가시켰다. 이들 데이타는 또한 사료 중 t10,c12 이성질체양을 증가시키면 체지방을 감소시킨다는 것을 보여준다. 사료 중에 CLA를 제공하지 않은 대조군 마우스와 비교하면, t10,c12 CLA만을 먹인 마우스에서는 체지방이 감소하였고 성장도 감소하였다. 반대로, c9,t11 CLA만을 제공한 마우스에서는 성장, 체중 증가율과 사료 전환율이 모두 증가한 것으로 나타났다. 마우스에게 t10,c12와 c9,t11 CLA를 모두 먹였을 때에는, t10,c12가 증가함에 따라 체지방이 감소하였다. 성장과 사료 전환율을 개선시키면서 지방을 감소시키는 최적 비율은 약 2:1의 c9,t11:t10,c12인 것으로 밝혀졌다. 이들 데이타는 상이한 CLA 이성질체들이 상이한 생물학적 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 3:
10,12 이성질체 강화 CLA의 제제를 제조용 가스 크로마토그래피에 의해 제조하였다. 얻어진 생성물을 가스 크로마토그래피로 분석하였다. CLA 이성질체를 동정하기 위한 가스 크로마토그래피 방법의 최근의 설명에 대해서는 문헌[Christie 등, JAOCS 74(11): 1231 (1997); Christie 등, Lipids 33(2): 217-21 (1998); Sehat 등, Lipids 33(2): 217-21 (1998); 및 Marcel S.F. Lie Ken Jie 및 J. Mustafa, Lipids 32(10): 1019-34 (1997)]을 참조하시오. 상기 문헌들은 본원에 참고로 인용한다. 가스 크로마토그래피 조건은 다음과 같았다:
시스템: 퍼킨-엘머 오토 시스템(Perkin-Elmer Auto System)
주입기: splitless, 240℃
검출기: 화염 이온화 검출기, 280℃
캐리어: 헬륨
칼럼: WCOT 융합 실리카 0.25 ㎜×100M, FAME에 대해 CP-SL 88, DF 0.2
오븐 프로그램: 80℃(0분), 10℃/분으로 220℃로 승온, 220℃에서 10분 유지
모든 결과를 상대 피크 면적%로 표시하였다. 분석 결과는 다음과 같았다:
이성질체 |
면적(%) |
C16:0 |
2.01 |
C18:0 |
0.57 |
C18:1 |
0.26 |
c9,t11 |
1.61 |
t10,c12 |
92.75 |
t9,t11; t10,t12 |
1.16 |
미확인 |
1.64 |
전체 |
100.0 |
실시예 4:
별도의 방법으로 t10,c12 CLA를 대량 생산할 수 있다. 완전 정제된 해바라기 기름 (홍화유로 대체할 수 있다)을 원료로 사용하였다. 오일에 1% 나트륨-에틸레이트를 촉매로서 함유하는 순수 에탄올 과량을 첨가함으로써 에틸에스테르를 형성하였다. 혼합물을 교반하면서 30분간 60℃로 가열하고, 분리시켰다. 하층을 배수시키고, 상층을 약산성 물을 사용하여 세척하고 진공 하에 건조시켰다.
이어서, 에틸에스테르 혼합물을 160℃ 및 10-2mbar 압력에서 분자 증류하여 정제하고, 잔류물을 폐기하였다. 에틸 에스테르에 에탄올 0.5-1%와 칼륨 에틸레이트 0.5-1%를 첨가하고 혼합물을 120℃에서 1시간 동안 진탕시켜 공액화를 수행하였다. 묽은 시트르산을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 이어서, 오일을 세척하고 건조시켰다.
이어서, 공액 에틸에스테르를 아세톤 중에 희석시키고 -30℃로 냉각시키고 여과하여 대부분의 포화 지방산을 제거하였다. 이어서, 여액을 -56 내지 -57℃로 더욱 냉각시켜 t10,c12 에틸에스테르를 침전시켰다. 약간 가온하면서 진공을 인가하여 침전물로부터 아세톤을 제거함으로써 에틸에스테르를 수득하였다. 이렇게 수득한 t10,c12 에틸에스테르는 약 90% 이상 순수하였다. 보다 고순도가 요구되면, 공액화하기 전에 에틸에스테르로부터 추가로 포화 지방을 제거할 수도 있다. 이는 요소 분류법으로 수행할 수 있다. 얻어진 생성물은 최종 침전 이후에 약 97% 이상의 t10,c12이다.
유리 지방산은 에틸에스테르로부터 비누화시킨 후 중화시킴으로써 생산하였다. 비누화시키기 위해, 용해도를 증가시키기 위해 10%량의 물을 함유하는 에탄올과 100% 과량의 NaOH를 알킬에스테르에 첨가하여 비누를 형성시켰다. 반응은 70℃에서 수행하였다. 이어서, 비누를 물로 희석하고, HCl을 잘 교반하면서 첨가하여 전체 혼합물을 산성으로 만들었다. 유리 지방산이 분리되어 상층을 형성하며, 이를 묽은 시트르산으로 세척하고 마지막으로 건조시켰다. 결과를 상기한 가스 크로마토그래피로 분석하였다. 요소 분류법을 수행한 결과는 다음과 같았다:
이성질체 |
면적 (%) |
c9,t11 |
1.80 |
t10,c12 |
97.49 |
t9,t11; t10,t12 |
0.71 |
전체 |
100.0 |
요소 분류법을 수행하지 않은 결과는 다음과 같았다:
이성질체 |
면적 (%) |
C16:0 |
1.75 |
C18:2, c9,c12 |
0.16 |
C18:1, c9 |
2.22 |
c9,t11 |
6.36 |
t10,c12 |
88.84 |
t9,t11; t10,t12 |
0.23 |
c9,c11; c10,c12 |
0.15 |
미확인 |
1.64 |
전체 |
100.0 |
실시예 5:
CLA의 트리아실글리세롤은 직접 에스테르화에 의해 제조할 수 있다. 고정 칸디다 안타르크티카(Candida antarctica) 리파제 (1.25 g)을 글리세롤 (1.22 g, 13.3 밀리몰)과 유리 지방산(분자량 280.3 g/mol; 11.6 g, 41.5 밀리몰)으로서 이성질체가 강화된 (t10,c12 또는 c9,t11이 강화된) CLA와의 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 65℃에서 0.01 내지 0.5 토르의 연속 진공 하에 자기 교반기 열판 상에서 부드럽게 교반하였다. 반응이 진행하는 동안 생성되는 휘발성 물은 액체 질소로 냉각시킨 트랩 내로 연속적으로 응축시켰다. 48시간 후 반응을 중단시키고, n-헥산을 첨가하고, 효소를 여과하여 분리 제거하였다. 유기상을 탄산나트륨의 알칼리성 수용액으로 처리하여 과다한 유리 지방산을 제거하였다 (요구될 때). 유기 용매 (적절한 경우 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 후)를 진공 하에서 회전 증발기 상에서 제거한 후 고진공 처리하여 실질적으로 순수한 생성물을 약간 황색을 띤 오일로서 수득하였다. 화학량론적인 양의 유리 지방산을 사용한 경우, 표정한 수산화나트륨으로 적정하여 조 반응 생성물의 유리 지방산 함량을 측정하였다 (에스테르기의 몰 수에 기초한 유리 지방산 함량 1% 미만, 99% 이상의 포함량에 상응함, 이는 97%의 트리글리세리드 함량의 최소치와 동일하다). 조 생성물을 n-헥산 중 10% 디에틸에테르로 용출시키는 HPLC 내에 직접 도입하여, 100% 순수한 트리글리세리드를 무색 오일로서 수득하였다.
반응의 진행을 모니터하고 개별 글리세리드들의 조성을 보다 상세히 하기 위해, 샘플을 반응이 진행함에 따라 규칙적으로 수집하였다. 이들을 H-NMR 분광법으로 분석하여, 반응이 진행하는 동안 모노-, 디- 및 트리아실글리세롤의 조성을 충분히 통찰하였다.
실시예 6
본 실시예는 공액 홍화 FAME(지방산 메틸 에스테르)의 대규모 배치식 생산을설명한다. 홍화의 공액 FAME의 생산은 2 단계, 즉, 가메탄올분해와 공액화로 나눌 수 있다. 가메탄올분해를 위해, 홍화유 6,000 ㎏를 밀폐 반응기에 넣었다. 반응기를 대기압에서 질소로 퍼징시키고, 메탄올 1150 ℓ와 NaOCH3(30% 용액) 160 ㎏를 첨가하였다. 혼합물을 교반하면서 65℃로 가열하고, 65℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응기를 질소 기체로 퍼징시키면서, 생성된 하층을 따루어 냈다. 이어서, 물 (40-50℃, 시트르산 일수화물 50 ㎏를 용해시킴) 1000 ℓ를 교반하면서 첨가하였다. 층들을 분리시키고 (약 60분), 반응기를 질소 기체로 퍼징시키면서 하층을 따루어 냈다. 얻어진 홍화 FAME 생성물을 80℃에서 진공 하에 1시간 동안 건조시켰다. 얻어진 홍화 FAME 생성물을 상기한 바와 같이 공액화시키고 t10,c12 CLA 또는 c9,t11 CLA에 대해 강화되도록 할 수 있다.