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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Lipidglyzerids
festgelegter Struktur wie in Anspruch 1 angegeben.
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Die
ebenfalls anhängige,
nicht vorveröffentlichte
Patentanmeldung
WO
2004/100943 A1 , auf die hier Bezug genommen und deren Inhalt
in diese Anmeldung einbezogen wird, betrifft die Verwendung von
Pflanzen- und Pilzölen
zur Behandlung neurodegenerativer Krankheiten. Diese Öle weisen
einen hohen Prozentsatz der essentiellen Fettsäure γ-Linolensäure (GLA) in der sn-2 Position
ihrer Lipide auf, welche üblicherweise über 40%
aller sn-2 Fettsäuren
des Öls
ausmacht.
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In
der Literatur ist ausführlich
darüber
berichtet worden, dass essentielle Fettsäuren (EFAs) mit einem n-3-
und n-6-Doppelbindungsmuster günstige
Auswirkungen auf einem weiten Feld physiologischer Funktionsstörungen beim
Menschen, darunter Autoimmunerkrankungen, haben (
WO 02/02105 ). Harbige (1998) Proc. Nut.
Soc. 57, 555–562
lieferte eine Übersicht über die
Nahrungsergänzung
mit n-3- und n-6-Säuren bei
Autoimmunerkrankungen und führte
insbesondere Belege für
den Nutzen von γ-Linolensäure (GLA)-
und/oder Linolsäure
(LA)-reichen Ölen
auf.
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Obwohl
die Ätiologie
von MS weiterhin ungeklärt
ist, haben Studien gezeigt, dass MS-Patienten eine höhere als normale Konzentration
an Neuroantigen-autoreaktiven T-Zellen
aufweisen. Diese T-Zellen reagieren unter anderem auf myelin basic
Protein (MBP) und Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) und
befinden sich in einem im Vergleich zu gesunden Kontrollen erhöhten Aktivierungszustand.
Die tatsächlichen
Vorgänge
der axonalen Schädigung,
z.B. chronische Entzündung,
Demyelinierung und Astrogliose bei MS ist komplex, aber eine Entzündung der
weißen
Substanz und Demyelinierung gelten als Bestimmungsmerkmale für die Schwere
der Krankheit, während
kürzlich
erfolgte Studien darauf hindeuten, dass axonale Schäden bei MS
in frühen
Stadien der Krankheit beginnen und zur Behinderung beitragen (De
Stefano et al., 2001).
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Experimentelle
Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) ist das am häufigsten verwendete Tiermodell
für immunvermittelte
Effekte bei MS. Studien in Meerschweinchen haben gezeigt, dass Linolsäure teilweise
das Auftreten und die Schwere von EAE unterdrückt (Meade et al. (1978)).
Harbige et al. ((1995), 1997b) zeigten einen krankheitsverändernden
Effekt von Linolsäure
und γ-Linolensäure an klinischen
und histopathologischen Erscheinungsformen von EAE. In Abhängigkeit
von der Dosis bot γ-Linolensäure einen
völligen
Schutz vor akuter Ratten-EAE, während
Linolsäure
einen dosisabhängigen
Einfluss auf die klinische Schwere hatte, diese jedoch nicht beseitigte.
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Trotz
dieser Versuchsergebnisse ist zu konstatieren, dass die humane Erkrankung
Multiple Sklerose hochgradig komplex ist und durch die Aktivität von T-Zellen
und anderen Faktoren der Immunantwort sowohl verschlimmert wie auch
gelindert werden kann. Basierend auf den Ergebnissen mit Linolsäure allein,
wird angenommen, dass n-6-Fettsäuren
Autoimmun- und Entzündungserkrankungen
verstärken.
Es wurde ex vivo gezeigt, dass die TGF-β1- und PGE2-Produktion
in Mäusen,
die mit γ-Linolensäure gefüttert wurden,
nicht-spezifisch erhöht
war. Es wurde berichtet, dass TGF-β1 bei akuter und rückkehrender
EAE schützt
(Racke et al. (1993); Santambrogio et al. (1993)), und PG-Inhibitoren
wie etwa Indomethacin zunehmen und so die Krankheit verstärken (Ovadia & Paterson (1982)).
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Cytokine
sind an der Pathogenese von MS beteiligt, und viele Studien zeigen
einen Anstieg myelin-toxischer Entzündungscytokine (TNF-α, IL-1β und IFN-γ), der mit
der Rückfallphase
der Krankheit zusammenfällt.
Umgekehrt scheint die Konzentration des Anti-Entzündungs-
und immunsuppressiven Cytokins transformierender Wachstumsfaktor
beta1 (TGF-β1)
während
einer Rückfallphase
reduziert zu sein und anzusteigen, wenn der Patient in die Remissionsphase
eintritt. Somit scheint das Gleichgewicht zwischen biologisch aktivem
TGF-β1 und
den pro-inflammatorischen TNF-α,
IL-1β und IFN-γ während eines
MS Rückfall-Remissions-Zyklus
gestört
zu sein.
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Im
Verlauf der natürlichen
Erholungsphase von EAE inhibieren TGF-β1-sekretierende T-Zellen die EAE-Effektorzellen,
TGF-β1 wird
im ZNS exprimiert und TGF-β und
PGE2 werden bei oralem, Toleranz-induziertem
Schutz vor EAE im Hirn exprimiert (Karpus & Swanborg (1991); Khoury et al. (1992)).
Harbige (1998) schloss, dass die Effekte einer γ-Linolensäure-Ernährung auf EAE durch Th3-artige Mechanismen, an denen TGF-β1 beteiligt
ist, vermittelt werden, und möglicherweise
durch die antioxidierende Aktivität von Superoxiddismutase.
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Es
konnte gezeigt werden, dass Borretschöl (typischerweise 20% bis 23% γ-Linolensäure und
34 bis 40% Linolsäure
pro 100% Fettsäuregehalt)
und Pilzöl
von Mucor javanicus (siehe 1) im EAE-Tiermodell, das
zur Identifizierung von MS-Kandidaten
verwendet wird, wirksam sind, jedoch konnte nie eine signifikante Wirksamkeit
bei der humanen Erkrankung gezeigt werden. Obwohl an Multipler Sklerose
Leidenden Borretschöl
und andere GLA/LA-enthaltende Öle
wie etwa Nachtkerzenöl
in den letzten etwa 30 Jahren verabreicht wurde, gelang es der überwiegenden
Mehrheit der Patienten nicht, sich von der Krankheit zu erholen, es
zeigte sich keine signifikante Verbesserung und die zugrundeliegende
Krankheit schritt bis zum Tode fort.
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Es
wurde unter anderem vorgeschlagen, das γ-Linolensäure- und Linosäure-reiche
Borretschöl
als ein Mittel zur Immunsuppression bei Multipler Sklerose zu verwenden
(
US 4,058,594 ). Es ist
entscheidend, dass die darin vorgeschlagene Dosis 2,4 Gramm Öl pro Tag
beträgt
und kein tatsächlicher
Beleg für
die Wirksamkeit vorgelegt wurde.
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Andere
drastischere immunsuppressive Behandlungen, darunter T-Zell-reduzierende
und -modulierende Substanzen wie etwa Cyclophosphamid, haben sich
auch als im EAE-Modell wirksam herausgestellt, wenn diese jedoch
bei der humanen Erkrankung Multiple Sklerose verwendet werden, verbessern
sich zwar die Symptome, die zugrundeliegende Krankheit schreitet
jedoch fort. Zwar produzieren T-Zellen im Menschen sowohl nützliche
Cytokine wie etwa TGF-β1,
aber auch schädliche.
David Baker vom Institute of Neurology, Großbritannien, fasste das Missverhältnis zwischen
dem, was bei EAE und was bei MS wirkt, mit der Veröffentlichung "Everything stops
EAE, nothing stops MS" bei
dem UK MS Frontiers-Treffen der britischen MS Society am 10. Mai
2004 zusammen.
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Es
ist klar, dass Immunsuppression alleine nicht MS heilen kann. Dies
ist nahezu sicher auf eine zugrundeliegende fundamentale Stoffwechselstörung in
MS-Patienten zurückzuführen, die
zusammen mit der Autoimmunerkrankung zu Membranabnormalität, Cytokin-Fehlregulation
und die darauf folgenden Immunattacken und Entstehung von Läsionen führt. Obwohl
Patienten im Zuge einer Rückfall-Remissions-Erkrankung auch
wieder in Remissions-Phasen kommen, schreitet die zugrundeliegende
Demyelinierung fort.
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Die übliche Behandlung
von MS besteht nach wie vor in Interferon, wie etwa mit β-Avonex®, Rebif® und anderen
Interferon-Präparaten.
Diese Maßstäbe setzende
Behandlung erfüllt
nur die Anforderungen von einigen, z.B. 30%, der Patienten und selbst
bei diesen ist die Verbesserung der Symptome auf eine verringerte Schwere
der Rückfälle beschränkt. Während die
Symptome bei einem Teil der Patienten verringert werden können, schreitet
die Krankheit gewöhnlich
aufgrund der zugrundeliegenden Degenerierung zu weiterer Behinderung
und zum Tode fort.
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In
der nicht vorveröffentlichten
Studie (
WO 2004/100943
A1 ) haben die Autoren der vorliegenden Erfindung überraschenderweise
festgestellt, dass bei Einhaltung einer Behandlung mit "hohen Dosen" an Triglyzerid-Ölen, die
eine hohe Konzentration an sn-2 γ-Linolensäure (> 40% der Reste in sn-2
Position sind γ-Linolensäure) zusammen
mit einem passenden Fettsäuregehalt
enthalten, ein bemerkenswerter Grad der Verbesserung nahezu aller
Symptome von MS erreicht werden kann, wobei der Grad der bisherigen,
den Maßstab setzenden
Behandlung erheblich übertroffen
wird. Ein solcher Erfolg überrascht
insbesondere angesichts der erfolglosen bisherigen Verwendung anderer γ-Linolensäure-enthaltenden
Präparate.
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Diese
Studie zeigt, dass über
einen Zeitraum von 18 Monaten Patienten, die eine hohe Dosis (15 g/Tag)
eines ausgewählten
Borretschöls
mit hohem sn-2 γ-Linolensäuregehalt
nahmen, signifikante (p < 0,001)
und merkliche Verbesserungen des EDSS-Wertes, eine reduzierte Rückfallrate,
symptomatisches Nachlassen der Muskelspastizität und schmerzlicher sensorischer
Symptome sowie verbesserte objektive Werte der kognitiven Funktionen
zeigten. Geringe Dosen von 5 g/Tag dieses Borretschöls waren
wirkungslos.
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Patienten,
die die höchste
Dosis dieses Borretschöls
nahmen, konnten ihre TGF-β1-Produktionsrate in
peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) während des Untersuchungszeitraums
aufrechterhalten, ihre pro-inflammatorischen Cytokine TNF-α und IL-1β waren signifikant
und merklich (< 70%)
reduziert und die langkettigen omega-6-Fettsäuren Dihomo-γ-Linolensäure (DHLA)
und Arachidonsäure
(AA) in den PBMC-Membranen
blieben entweder konstant oder nahmen zu, im Gegensatz zu Patienten,
die ein Placebo nahmen und die einen Verlust dieser Fettsäuren im
Verlauf des Versuchszeitraums zeigten.
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Während bei
einer Immunsuppression zu erwarten wäre, dass die aktive Läsionsbildung
und Neurodegeneration verringert wären, hat die Behandlung mit Öl mit hohem
sn-2 GLA-Gehalt offenbar den Erhalt und/oder die Zunahme an Schlüsselmembranlipidkomponenten
bewirkt, die andernfalls bei MS spezifisch verloren gehen, was mit
einer Korrektur eines Stoffwechseldefekts übereinstimmt, welcher mit den
derzeitigen Therapien nicht wirksam behandelt werden kann. Die Tatsache,
dass die geringe Dosierung (5 Gramm/Tag) hierbei keinen Effekt zeigte,
unterstützt
eine solche Schlussfolgerung.
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Es
ist bekannt, dass γ-Linolensäure (18:3n-6,
oder GLA) in vivo schnell in die längerkettigen, mehrfach ungesättigten
Omega-6-Fettsäuren
Dihomo-γ-Linolensäure und
Arachidonsäure
umgewandelt wird (Phylactos et al. 1994, Harbige et al. 1995, 2000).
Um zu bestimmen, wie die Konzentration von langkettigen Omega-6-Fettsäuren in
Membranen bei MS erhöht
werden kann, überprüften die
Erfinder daher ihre Ergebnisse, die mit mehreren GLA-enthaltenden Ölen erhalten
wurden: sowohl Pilzöl
(von Mucor javanicus) und Pflanzenöle (Borago officianalis, Nachtkerze
Oenothera spp. oder schwarze Johannisbeere Ribes spp.) als auch
ein synthetisches Tri-GLA-Öl
als Systeme zur Bereitstellung von GLA in einem in vivo-Versuchstiermodell
für MS, das als
chronisch rückkehrende,
experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (CREAE) bekannt ist.
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Induktion
von EAE in Ratten bewirkt jedoch nicht die histologischen Merkmale
einer Demyelinierung (Brosnan et al. 1988), sondern induziert ein
akutes monophasisches Krankheitsmuster, im Gegensatz zu MS, die
durch ZNS-Demyelinierung charakterisiert ist und in der Mehrzahl
der Fälle
ein klinisches Rückfall-Remissions-Muster
aufweist. Chronische Rückfall-
und Demyelinierungs-EAE-Modelle (CREAE) zeichnen sich jedoch durch
Demyelinierung und Rückfallphasen
aus. Mit dem Nachweis, dass Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein
(MOG) ein wichtiges neuroantigenes Angriffsziel bei MS darstellt
(Genain et al. 1999), und dem Nachweis weit stärkerer Reaktionen auto-reaktiver
peripherer Blutlymphozyten auf dieses Neuroantigen im Vergleich
zu MBP bei MS (Kerlero de Rosbo et al. 1993, 1997) wurde MOG-induzierte
CREAE das Tiermodell der Wahl mit Merkmalen, die den bei MS beobachteten
stark ähneln
(Fazakerely et al. 1997, Genain et al. 1999, Amor et al. 1994).
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Resultate
aus CREAE- und Ratten-EAE-Fütterungsstudien
der Erfinder zeigen, dass ein angereichertes Keimöl schwarzer
Johannisbeeren (72 Gew.-% 18:3n-6, GLA) nicht vor EAE schützt (siehe
Tabelle 3). Von Bedeutung ist dabei, dass das Keimöl schwarzer
Johannisbeeren nur wenig sn-2 GLA aufweist und das meiste GLA in
den sn-1 und sn-3 Positionen vorliegt (Lawson and Hughes 1988).
Des weiteren bewirkte ein künstliches
Triacylglyzerin, dass drei GLA-Reste aufweist (TG-GLA) schützende Effekte ähnlich denen
des Borretschöls
bei Verwendung bei CREAE (Tabelle 2). Dies würde mit einer wichtigen Rolle
des sn-2 GLA zusammenpassen, d.h. das äußere Paar sn-1 und sn-3 GLA
wird in vivo enzymatisch entfernt und vermutlich oxidiert, wodurch
nur das sn-2 GLA zurück
bleibt. Diese selektive Hydrolyse ergibt sich aus der bekannten
Fähigkeit spezifischer
Lipasen, die sn-1 und sn-3 Fettsäuren
aus Triacylglyzerin-Molekülen
zu entfernen, wobei die sn-2 Position in vivo offenbar geschützt ist
(Lawson and Hughes 1988, Kyle 1990).
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Diese Übersicht
ließ die
Erfinder postulieren, dass Glyzeride mit sn-2 γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-Linolensäure- oder
Arachidonsäureresten
bei der Korrektur des Stoffwechsels bei MS selbst dem Borretschöl mit hohem
sn-2 γ-Linolensäuregehalt
ihrer früheren
Studien überlegen
sein wird. Dies würde
die Einnahme geringerer Dosen an Lipid erlauben und/oder möglicherweise
den Behandlungszeitraum verringern, wodurch ein günstiger
Effekt erzielt würde.
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EP 0520624 (Efamol Holdings)
vergleicht in Tabelle 3 den Triglyzeridgehalt von Nachtkerzen- und
Borretschölen,
wobei man erfährt,
dass erstere wirksamer bei der Behandlung einer Auswahl von auf
GLA-Gabe ansprechenden Funktionsstörungen sind als letztere. Dieses
Dokument besagt, dass Borretschöl
siebenundzwanzig verschiedene Triglyzeridkomponenten aufweist, wovon
nur 20% sn-2 GLA aufweisen. Auf Seite 3, Zeilen 40–42 wird
vermerkt, dass biologische Untersuchungen gezeigt haben, dass gleiche
Mengen an GLA in der Tat sehr unterschiedliche Auswirkungen haben
können,
wenn das GLA aus verschiedenen Quellen stammt. Entscheidend ist,
dass der Leser dann darauf hingewiesen wird, dass eine bestimmte
Fraktion, die in Nachtkerzenöl
(EPO), aber nicht in Borretschöl
vorkommt, für
die Überlegenheit
des ersteren bei der Erhöhung von
PGE1 verantwortlich ist (siehe
EP
0520624 , Diagramm Seite 4 und Tabelle 2) und somit für die anti-inflammatorische
Wirkung: Bei jener Fraktion handelt es sich um Di-linoyl-mono-γ-linolenoyl-glyzerin
(DLMG), von dem angegeben wird, dass es 18 bis 19% des gesamten
Triglyzerids in EPO ausmacht. Entscheidend ist, dass Seite 6 deutlich
darauf hinweist, dass die Position von GLA, ob in sn-1, 2 oder 3
Position, für
diese Wirkung nicht wichtig ist.
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Dines
et al. (1994), Proceedings of the Physiological Society, Aberdeen
Meeting 14.–16.
September 1994, berichten über
Studien zur Behandlung neuronaler Schäden bei diabetischer Neuropathie
mit γ-Linolensäure enthaltenden Ölen der
Art, wie sie von
EP 0520624 vorgeschlagen
werden, und bemerken erneut, dass Borretschöl im Gegensatz zu Nachtkerzenöl nicht
sehr wirksam bei der Behandlung dieser Neurodegeneration war. Die
Veröffentlichung
schließt
daraus, dass Borretschöl
andere Bestandteile enthält,
die die GLA-Aktivität stören.
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Die
Autoren der vorliegenden Erfindung begannen nun, angesichts ihrer
Ergebnisse mit Borretschöl mit
hohem sn-2-γ-Linolensäuregehalt,
aufzuzeigen, dass in der Tat das Vorliegen eines sn-2-γ-Linolensäure- oder
Dihomo-γ-Linolensäurerestes
in einem Glyzerid, insbesondere einem Triglyzerid, für die Wirksamkeit
bei der Behandlung der humanen Krankheit MS verantwortlich ist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Lipidglyzerids
festgelegter Struktur gemäß Anspruch
1 zur Behandlung der multiplen Sklerose.
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Besonders
günstig
ist die Behandlung von multipler Sklerose, bei der eine Demyelinierung
auftritt. Die Lipidglyzeride halten spezifisch die zugrundeliegende
Neurodegeneration auf und stellen neuronale Funktionen wieder her.
Insbesondere normalisieren sich die neuronalen Membranen und es
stellt sich ein gesundes Verhältnis
an von PBMC spontan freigesetztem TGF-β1/TNF-α und die Verhältnisse
von TGF-β1
mit anderen, von PBMC freigesetzten Cytokinen wieder her. Der wichtigste
Vorteil liegt darin, dass die Neurodegeneration bei allen Arten
Multipler Sklerose gestoppt wird, insbesondere aber bei Rückkehr-Remissions-,
primär
progressiver und chronisch progressiver MS, sowie die teilweise
oder vollständige
Wiederherstellung neuronaler Funktion, wie sie etwa durch Kern-spintomographie-
oder Computertomographie-(MRI oder CAT)Aufnahmen oder über den
EDSS-Wert gemessen werden.
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Vorzugsweise
wird das Lipidglyzerid für
eine Dauer und in einer Dosis verabreicht, die ausreicht, die TGF-β-Konzentration
des Patienten auf therapeutischem Niveau aufrechtzuerhalten oder
auf ein solches anzuheben. Unter therapeutischem Niveau werden Konzentrationen
verstanden, die zumindest mit denen gesunder Subjekte übereinstimmen.
Vorzugsweise ist die Dosis derart, dass ein TGF-β1/TNF-α-Verhältnis
erzeugt wird, das spontan aus peripheren mononuklearen Blutzellen
(PBMCs) freigesetzt und aus dem Blut eines Patienten isoliert wird,
das nach 18 Monaten täglicher
Dosierung bei 0,4 bis 3,0 liegt, zumindest 0,5 beträgt, vorzugsweise
zumindest 0,75 und am meisten bevorzugt zumindest 1 beträgt. Vorzugsweise
ist die Dosis derart, dass ein TGF-β1/IL-1β-Verhältnis im Blut eines Patienten
nach 18 Monaten täglicher
Dosierung von zumindest 0,5, vorzugsweise zumindest 0,75 und am
meisten bevorzugt zumindest 1 erzeugt wird. Vorzugsweise werden diese
Konzentrationen nach 12 Monaten und noch besser nach 6 Monaten erzielt.
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Üblicherweise
beträgt
die Menge an täglich
zu verabreichendem Lipid zwischen 0,5 und 30 Gramm, oral dosiert,
bevorzugterweise zwischen 1 und 20 Gramm und am meisten bevorzugt
zwischen 1 und 18 Gramm, üblicherweise
3 bis 5 Gramm.
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Sollte
die sn-2 Gruppe ein γ-Linolensäurerest
sein, kann die Dosis näher
am oberen Ende dieser Bereiche liegen, insbesondere wenn die sn-1
und sn-3 Gruppen relativ inert sind, z.B. Säuren, die im Stoffwechsel Verwendung
finden wie etwa gesättigte
Fettsäuren.
Sollte die sn-2 Gruppe ein Dihomo-γ-linolensäurerest sein, kann die Dosis
geringer sein.
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Das
erfindungsgemäß eingesetzte
Lipidglyzerid ist ein Lipid der Formel II
Formel
II wie in Anspruch 1 angegeben.
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Die
Reste R1 und R3 sind
gleich und entsprechen der Formel -CO-(CH2)n-CH3, wobei n eine
ganze Zahl zwischen 4 und 14 ist, bevorzugterweise 5 bis 12, am
meisten bevorzugt von 6 bis 10. Besonders bevorzugte Acylgruppen
sind die der Capryl- und Caprinsäuren,
insbesondere 1,3-Dicapryl- oder 1,3-Dicapringlyzerin mit γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-linolensäurerest
in der sn-2 Position.
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US 4 701 469 beschreibt
die Verwendung als Nahrungsergänzungsmittel
von einigen möglichen
Triglyzeriden, die die Autoren der vorliegenden Erfindung als für die Verwendung
im Verfahren der Erfindung bestimmt haben, jedoch beschreibt es
ausdrücklich
nur 1,3-Dioctanyltriglyzeride, wobei die sn-2 Säure EFA ist, und nur die Herstellung
von 1,3-Dioctanoylicosapentaglyzerin wird beschrieben. Diese werden
als nützlich
unter anderem bei der Immunmodulation beschrieben, aber obwohl eine
Anzahl an Krankheiten genannt werden, ist die Verwendung zur Immunsuppression
bei Neurodegeneration und MS nicht aufgeführt.
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Viele
der bevorzugten Lipide sind bekannt und können nach einem auf dem Gebiet
bekannten chemischen Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel
sind viele im Handel erhältlich,
wie etwa Trigamma-linolenin, bekannt als TLG, hier jedoch als GGG
bezeichnet, was die Identität
der Gruppen R1R2R3 widerspiegelt, wobei G γ-Linolensäurereste darstellt.
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GGG
ist von Nu-Check-Pre Inc. erhältlich.
EP 0 300 844 beschreibt
seine Synthese unter Verwendung einer Base-katalysierten Umesterung
von Triacetin mit Methylgammalinolenat, wobei ein Gemisch aus 80% GGG,
unreagiertem Methyl-γ-linolenat
und 10% Mono- und Diglyzeriden erhalten wird.
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Die
Autoren der vorliegenden Erfindung bevorzugen die Verwendung der
Mono-γ-linolensäure- oder -dihomo-γ-linolen-säure-triglyzeride,
weil diese weniger von der immunmodulatorischen und pro-inflammatorischen
Fettsäuren γ-Linolensäure oder
Dihomo-γ-linolensäure bereitstellen,
während
die erhöhte
Aktivität
erhalten bleibt, die der sn-2 γ-Linolensäure- oder
Dihomo-γ-linolensäurerest
bezüglich
der erwünschten
Membrannormalisierung und der Krankheits-modifizierenden Wirkung
aufweist.
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Neue
bevorzugte Lipide sind über
Prozesse und Verfahren, wie sie in den Beispielen hier vorgestellt sind,
erhältlich.
Die Lipide weisen bloß einen
einzigen γ-Linolensäure- oder Dihomo-γ-linolensäurerest
auf, der mit dem Glyzerin in sn-2 Position verestert ist, wobei
die flankierenden sn-1 und sn-3 Säuren die angegebenen ungesättigten
mittellangen oder langkettigen Säuren
sind.
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Die
Lipidglyzeride sind erhältlich
durch die Reaktion von 1,3-Dihydroxyaceton mit einer Verbindung
der Formel X-C(O)(CH2)nCH3, wobei X ausgewählt ist aus Cl, Br und I, wobei
die entsprechende 1,3-Di-(C(O)(CH2)nCH3)-2-keto-Verbindung
erhalten wird, die Reduktion der Ketogruppe zum entsprechenden 1,3-Di-(C(O)(CH2)nCH3)-2-ol, und die Reaktion
dessen mit γ-Linolenoylchlorid
oder Dihomo-γ-linolenoylchlorid.
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Wie
bereits angesprochen betrifft die Erfindung in besonderer Weise
das Anhalten und die Umkehrung der Neurodegeneration bei Multipler
Sklerose aller Arten, insbesondere jedoch von Rückkehr-Remissions-, primär progressiver
und chronisch progressiver MS und der teilweisen oder vollständigen Wiederherstellung
der neuronalen Integrität/Funktion,
wie sie zum Beispiel mittels MRI- oder CAT-Aufnahmen oder über den EDSS-Wert
gemessen wird.
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Die
Lipide für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können über jedes in der Pharmazie
bekannte konventionelle Vehikel verabreicht werden. Am einfachsten
werden sie als reine Öle
oder als Beimengung in Nahrungsmitteln, in Form von Kapseln, die
solche Öle
enthalten, oder in enterisch beschichten Formen verabreicht.
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Weitere
Verabreichungsformen sind dem Fachmann geläufig, siehe auch Remington
Pharmaceutical Sciences, 19. Ausgabe.
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Der
Fachmann wird realisieren, dass andere nützliche Mittel mit den Lipiden
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kombiniert werden können oder
in anderer Form Teil eines Behandlungsplans mit den Lipiden sein
können.
Dabei kann es sich um Ionenkanalblocker, z.B. Natriumkanalblocker,
Interferone (α, β oder γ), T-Zell-abreichernde
Mittel, Steroide oder andere palliative Mittel handeln. Man wird
außerdem
erkennen, dass bei der Modulierung von Immun- und Enzündungsreaktionen
solche Kombinationen aufgrund der Komplexität dieser Systeme mit Vorsicht
durchzuführen
sind. In Anbetracht der verzögerten
Reaktion auf die hier vorgestellten Öle können kürzer wirkende Wirkstoffe in
den ersten Monaten der Behandlung nützlich sein, bevor die TFG-β1-Konzentrationen
normalisiert sind, solange die zusätzliche Behandlung diesen Normalisierungsprozess
nicht beeinträchtigt.
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Die
Synthese künstlicher
Lipide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist nachstehend
zusammen mit der Synthese von Vergleichsbeispielen beschrieben.
Einige dieser Lipide sind neu, während
andere bekannt sind, jedoch nicht für eine Behandlung gemäß der Erfindung
verwendet wurden.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun an Hand von Beispielen unter Bezugnahme
auf die folgenden, nicht eingrenzenden Tabellen, Beispiele und Figuren
beschrieben. Weitere Ausführungsformen,
die in den Bereich der Erfindung fallen, werden dem Fachmann im
Lichte dieser in den Sinn kommen.
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TABELLEN
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Tabelle
1: Zeigt die prozentuale Zusammensetzung des Gesamtfettsäuregehalts
verschiedener Triglyzeridöle
und die Schutzwirkung bei EAE.
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Tabelle
2: Zeigt die Parameter der drei Behandlungsgruppen der in
WO 2004/100943 A1 beschriebenen
Studie mit Borretschöl
mit hohem sn-2 GLA-Gehalt.
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Tabelle
3: Zeigt die Wirkung verschiedener Formen von GLA auf das Auftreten
von EAE und den "clinical
score" in SJL-Mäusen: ein
geringerer Wert weist auf eine verbesserte therapeutische Wirkung
hin.
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Tabelle
4: Zeigt, dass angereichertes Öl
schwarzer Johannisbeeren, ein Pflanzenöl mit hohem GLA-Gehalt, aber
geringem sn-2 GLA-Gehalt, Pilz- und Borretschölen bei EAE nicht gleich kommt.
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FIGUREN
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1:
Zeigt die spontane Cytokinproduktion peripherer mononuklearer Blutzellen
menschlicher MS-Patienten, die 18 Monate mit Placebo und dem Versuchsöl nach
WO 2004/100943 A1 mit
hohem sn-2 γ-Linolensäuregehalt
behandelt wurden.
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2:
Zeigt die Wirkung von Placebo und gering dosiertem (5 g/Tag) Borretschöl mit hohem
sn-2 GLA-Gehalt auf den EDSS-Wert menschlicher MS-Patienten im Vergleich
mit hoch dosiertem (15 g/Tag), dargestellt als Histogramm mit Behandlungsmonaten
auf der x-Achse.
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3:
Zeigt die Wirkung von Placebo, gering dosiertem und hoch dosiertem
Borretschöl
mit hohem sn-2 GLA-Gehalt auf die mittlere Rückfallrate (%) bei menschlichen
MS-Patienten als Histogramm mit Monaten auf der x-Achse.
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4:
Zeigt das Reaktionsschema für
die Synthese eines Triacylglyzerids einer einzigen Fettsäure.
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5:
Zeigt das Reaktionsschema für
die Synthese der Kontrollverbindung Tricaprin.
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6:
Zeigt das Reaktionsschema für
die Synthese von CGC, einem gemischten Fettsäuretriacylglyzerid.
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7:
Zeigt das Reaktionsschema für
die Synthese von C-DHGLA-C, einem gemischten Fettsäuretriacylglyzerid.
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8:
Zeigt das Reaktionsschema für
die Synthese der Kontrollverbindung GCG, 1,3-Dicapryl-2-γ-linolensäure.
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9:
Zeigt das Reaktionsschema für
die Synthese von C-AA-C, einem gemischten Fettsäuretriacylglyzerid.
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10 bis 19 zeigen
die Ergebnisse von EAE-Studien in SJL- und C57BL-Mäusen, wie
in den nachstehenden Beispielen dargelegt. (DHLA = DHGLA: A = AA).
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BEISPIELE
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Achtundzwanzig
Patienten (im Alter von 18 bis 65 Jahren) mit aktiver Rückfall-Remissions-Multipler Sklerose
(zwei Rückfälle in den
zurückliegenden
18 Monaten) nahmen an einer Placebo-kontrollierten Doppelblindstudie
teil, um die Wirkungen von Borretschöl in Kapseln auf klinische
Aktivität
und Laborwerte über
18 Monate zu untersuchen. Dieses Öl wies einen hohen sn-2 γ-Linolensäure (GLA)-Gehalt
(> 40% der sn-2 Reste sind γ-Linolensäure) mit
geringem Monoengehalt (z.B. Erucasäure) auf, dem kein Vitamin
E, ein bekannter Immunmodulator, zugesetzt wurde.
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Die
Patienten stammten aus ambulanten neurologischen Kliniken zweier
innerstädtischer
Krankenhäuser;
die Einverständniserklärung wurde
beim ersten Besuch (Basisdatum) im Krankenhaus erhalten. Die Ausschlusskriterien
umfassen jede Form von Behandlung mit Steroiden oder immununterdrückenden
Medikamenten, Schwangerschaft, Hyperlipidämie, regelmäßige Benutzung von Aspirin
oder verwandten Medikamenten und Vitamin- oder Fettsäure-Nahrungsergänzungsmitteln
innerhalb der letzten drei Monate.
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Nur
Patienten, die alle folgenden Kriterien erfüllen, wurden in den Versuch
aufgenommen: (a) fähig, ihre
Einverständniserklärung vor
der Behandlung zu erteilen bei völligem
Verständnis,
dass das Einverständnis jederzeit
unbeschadet zurückgezogen
werden kann; (b) männliche
oder weibliche ambulante Patienten im Alter zwischen einschließlich 18
und 60 Jahren; (c) mit bestätigter
Diagnose einer klinisch festgestellten rückkehrenden MS; (d) mit zumindest
drei dokumentierten klinischen Rückfällen in
den letzten zwei Jahren; (e) mit einem Basis-EDSS-Wert (erweiterte
Behinderungsskala) von einschließlich 0,0 bis 5,5, vorausgesetzt
gut dokumentierte Verschlechterungen lagen vor; und (f) gesund,
abgesehen von den MS-abhängigen
Symptomen, bestätigt
durch die Krankengeschichte, ärztliche
Untersuchung und klinisch-chemische, Urin- und Hämatologietests.
-
Die
Patienten wurden zufällig
durch die Pharmazieabteilung einer der drei Gruppen zugeteilt, die
jeweils 12 Patienten enthalten:
- • Erste klinische
Gruppe (n = 12), die Placebo erhielt (5 g Polyethylenglykol 400);
- • Zweite
klinische Gruppe (n = 12), die gering dosiertes (5 g) raffiniertes
Borago officinalis-Öl
erhielt;
- • Dritte
klinische Gruppe (n = 12), die hoch dosiertes (15 g) raffiniertes
Borago officinalis-Öl
erhielt.
-
Die
Nahrungsergänzung
erfolgte in Form einer täglichen
Einnahme von Kapseln mit 1 g Öl
(5/Tag bei geringer Dosis, 15/Tag bei hoher Dosis) für eine Dauer
von 18 Monaten. Borago officinalis-Öl und mehrfach ungesättigte Omega-6-Fettsäuren gelten als
Nahrungsbestandteile, die im Allgemeinen als sicher für den menschlichen
Verzehr (GRAS) gelten. Es gibt kleine Klassifizierungs- oder Etikettierungsvorschriften
nach EG-Richtlinien. Die klinische Auswertung umfasste: erweiterte
Behinderungsskalenwerte (EDSS) und klinische Rückfallberichte. Für Laboruntersuchungen
wurde im 1., 3., 6., 12., 15. und 18. Monat der Nahrungsergänzung venöses Blut
(50 ml) entnommen.
-
Die
folgenden biochemischen und immunologischen Parameter wurden bei
jedem Besuch untersucht, um sie mit den Daten vor der Behandlung
und zwischen den Gruppen zu vergleichen:
- • Stimulierte
und nicht stimulierte ex vivo-Cytokin-Produktion der peripheren
mononuklearen Blutzellen: Änderungen
bei TFG-β1,
IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6 und
IFN-β, die
bei der Pathogenese von MS beteiligt sind. Expression von Cytokin-
und verwandten Genen.
- • Lösliche Adhäsionsmoleküle im Serum,
insbesondere ICAM-1 und VCAM-1.
- • Membranfettsäuren der
peripheren mononuklearen Blutzellen und Zusammensetzung der Phospholipidfettsäuren im
Blutplasma.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabellen 1 und 2 und 1 bis 5 aufgeführt.
-
Primärer Ergebnisparameter
war die Anzahl klinischer Rückfälle zwischen
Basisdatum (Monat 0) und dem Ende der Behandlung (Monat 18). Die
sekundären
Ergebnisparameter umfassten: die Zeit bis zum ersten klinischen
Rückfall;
die Schwere der Rückfälle, gemessen
anhand des EDSS-Werts und der Behandlung mit Steroiden; und Änderungen
des EDSS-Werts in den Monaten 3, 6, 9, 12 und 18 im Vergleich zum
Basisdatum und definiert als ein Anstieg des EDSS-Werts von zumindest
1,0 Punkten, der über
drei Monate aufrechterhalten wurde, oder ein Anstieg des EDSS-Werts
im Vergleich zum Basis-EDSS-Wert von zumindest 1,5 Punkten, der über drei
Monate aufrechterhalten wurde.
-
Elf
Patienten befanden sich in der Placebogruppe, sieben Patienten nahmen
gering dosiertes Borretschöl,
und zehn Patienten nahmen hoch dosiertes Borretschöl ein. Das
Medikament der Studie wurde gut angenommen und es gab keine ernsthaften
negativen Ereignisse während
des 18-monatigen Versuchs.
-
Isolierung und Kultivierung
von PBMC
-
Heparinisiertes
Gesamtblut wurde mit dem gleichen Volumen an Hanks' gepufferter Salzlösung (Sigma,
Großbritannien)
verdünnt
und das erhaltene verdünnte
Blut auf Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norwegen) aufgetragen. Im Anschluss
an eine Dichtezentrifugation bei 800 g für 30 Minuten wurden die PBMC
aus der Grenzschicht entfernt und in Hanks-Lösung verdünnt. Die Zellen wurden dann
zweimal mittels Zentrifugation für
10 Minuten bei 250 g gewaschen. Das am Schluss erhaltene Pellet
wurde dann in Kulturmedium resuspendiert, das aus RPMI-1640-Medium
(Sigma, Großbrittanien),
ergänzt
mit 2 mM L-Glutamin, 100 U Penicillin und 100 μg Streptomycin (Sigma, Großbrittanien)
und 10% autologem Blutplasma, besteht. 2 × 106 pro
ml PBMC, wovon > 95%
am Leben waren, beurteilt mittels Trypan-Blau-Ausschluss, wurden
in Gewebekulturröhrchen (Bibby
Sterilin Ltd., Stone, Großbritannien)
gegeben und für
24 Stunden bei 37°C
mit 5% CO2 inkubiert. Die Konzentration
an Antigen, die Zelldichte und Kulturdauer wurden allesamt in früheren kinetischen
Versuchen zur Bestimmung der maximalen Cytokin-Produktion bestimmt
(nicht gezeigt). Routinemäßige Cytospin-Präparationen
wurden auch für
nachfolgende Differential-Blutbilder angefertigt. Im Anschluss an
die Inkubation wurden die Zellen aus der Kultur durch Zentrifugation
für 10
Minuten bei 250 g entfernt, die erhaltenen Überstände entfernt, aliquotiert und
bei –70°C aufbewahrt.
-
Präparation der Blutplasmaproben
-
10
ml heparinisiertes Blut wurde für
10 Minuten bei 250 g zentrifugiert. Die erhaltene Blutplasmaschicht
wurde entfernt, aliquotiert und bei –70°C aufbewahrt.
-
Nachweis pro-inflammatorischer
Cytokine
-
TNF-α, IL-1β und IFN-γ in Zellkulturüberständen und
Blutplasma wurden unter Verwendung im Handel erhältlicher gepaarter Antikörper, die
den Cytokinnachweis im ELISA-Format ermöglichen (R&D Systems Ltd., Abingdon, Großbritannien)
nachgewiesen. Die Nachweisbereiche der TNF-α- und IFN-γ-ELISAs betrugen 15,6 bis 1000
pg/ml und 3,9 bis 250 pg/ml für
IL-1β.
-
Nachweis des biologisch aktiven TGF-β1
-
Das
biologisch aktive TGF-β1
in Zellkulturüberständen und
Blutplasma wurde unter Verwendung des im Handel erhältlichen
Emax-ELISA-Systems mit Nachweisgrenzen von
15,6 bis 1000 pg/ml (Promega, Southampton, Großbritannien) nachgewiesen.
-
Statistische Analyse
-
Unterschiede
in der Cytokin-Produktion wurden unter Verwendung des Student's t-Test und Mann-Whitney
U-Tests verglichen und als signifikant gewertet, wenn die p-Werte weniger als
0,05 betrugen.
-
ERGEBNISSE
-
Zwei
Patienten entwickelten Diarrhöe,
in beiden Fällen
wurde später
bestätigt,
dass sie hoch dosiertes Borretschöl einnahmen. Die Diarrhöe eines
Patienten war mild, beim zweiten Patienten jedoch von mittlere Schwere,
dieser beendete später
die Einnahme des Studienmedikaments. Die Codierung wurde nicht aufgehoben,
und die Diarrhöe
endete nach dem Absetzen des Medikaments, trat jedoch bei Wiedereinnahme
erneut auf. Daher wurde dieser Patient aus der Studie genommen.
Die übrigen
Patienten, die mit hoch dosiertem Borretschöl behandelt wurden, zeigten
eine ausgezeichnete klinische Verbesserung aller primären und
sekundären
Ergebniskrite rien. Zum Beispiel verbesserte sich der mittlere EDSS-Wert
nach 6 Monaten Behandlung im Vergleich zum Basis-EDSS-Wert (1).
Wichtiger war, dass die mittlere Anzahl klinischer Rückfälle nach
6 Monaten Behandlung im Vergleich zur Anzahl der Rückfälle in der
Placebogruppe signifikant reduziert war (2). Im Gegensatz
dazu zeigten Patienten, die gering dosiertes Borretschöl erhielten,
keinerlei klinische Verbesserung im Vergleich zur Placebogruppe.
Zusätzlich
zum günstigen
Effekt auf die Aktivität
der MS-Erkrankung bewirkte hoch dosiertes Borretschöl eine symptomatische
Erleichterung der Muskelspastizität (Starrheit) und schmerzhafter
sensorischer Symptome und auch eine Verbesserung kognitiver Funktionen.
-
Wie
in den nachstehenden Figuren zu sehen ist, fiel die Rückfallrate
nach 9, 12 und 18 Monaten auf Null in der Gruppe mit hoher Dosierung.
Die Zunahme nach 15 Monaten beruhte auf einem Patienten, der aus dieser
Gruppe herausfiel.
-
Im
Folgenden sind drei kurze Krankengeschichten aufgeführt, um
die therapeutischen Vorzüge
von hoch dosiertem Borretschöl
mit hohem sn-2 GLA-Gehalt zu illustrieren. Die ersten beiden stammen
aus der Studie, während
die dritte von einem Patienten stammt, der nach der Studie behandelt
wurde und für
den MRI-Ergebnisse gewonnen wurden.
-
Patient 1 (Behandlung):
-
Der
erste Patient war eine 48-jährige
Frau mit klinisch aktiver Rückfall-Remissions-MS seit 9 Jahren. Sie
arbeitete ursprünglich
Vollzeit in der Verwaltung des lokalen Gesundheitsamts, war jedoch
aufgrund ihrer schweren MS nicht mehr in der Lage, ihre Pflichten
zu erfüllen.
Sie arbeitete daher später
als Teilzeit-Sekretärin,
hatte jedoch aufgrund von Muskelstarre und sensorischer Störungen immer
noch Schwierigkeiten, sich zu bewegen. Sie erlitt auch schwere klinische
Rückfälle, die
im Mittel einmal alle neun Monate auftraten. Die meisten dieser
Rückfälle erforderten
eine Krankenhauseinweisung zur Steroid-Therapie. Angesichts ihrer
aktiven MS nahm sie an der Borretschöl-Studie teil. Es gab keine
mit der Studie in Zusammenhang ste henden, nachteiligen Ereignisse,
und nach einer Einnahme des Medikaments über vier Monate verbesserte
sich ihre Gehfähigkeit
und sensorischen Symptome.
-
Ungefähr neun
Monate nach der Behandlung ging es ihr gut genug, um eine Vollzeitstellung
anzunehmen. Außerdem
blieb sie während
der 18-monatigen Dauer des klinischen Versuchs rückfallfrei. Im Anschluss an
die Beendigung des Versuchs zeigte die Behandlungscodierung, dass
sie hoch-dosiertes Borretschöl nahm.
-
Patient 2 (Kontrolle):
-
Der
zweite Fall beschreibt eine 46-jährige
Frau, die ebenfalls eine klinisch aktive Rückfalls-Remissions-MS seit
8 Jahren hatte. Sie arbeitete ursprünglich als Verkäuferin,
wurde jedoch nach der Diagnose von MS arbeitslos.
-
Ihre
Symptome umfassten Schwierigkeiten bei der Bewegung und schmerzhafte
sensorische Symptome in beiden Beinen. Sie hatte drei klinische
Rückfälle in den
zwei Jahren vor der klinischen Studie und wurde zweimal zur Steroid-Therapie
ins Krankenhaus eingewiesen. Daher nahm sie an der Borretschöl-Studie
teil, ihre Gehfähigkeit
verschlechterte sich jedoch weiter. Nach den ersten sechs Monaten
des Versuchs benötigte sie
einen Gehstock und wurde auch mit Baclofen behandelt, um die Spastizität der unteren
Gliedmaßen
zu verringern. Ungefähr
zehn Monate nach Beginn der Borretschöl-Studie wurde sie aufgrund
eines schweren klinischen Rückfalls,
der mit Steroiden behandelt werden musste, ins Krankenhaus eingewiesen.
Sie entwickelte später
Blasenstörungen
und begann damit, für
lange Strecken einen Rollstuhl zu benutzen. Nach Beendigung der
18-monatigen Studie wurde die Behandlungscodierung aufgehoben, und
es wurde festgestellt, dass sie Placebo nahm. Seither begann sie
damit, einen Gehwagen für
Strecken zu benutzen, die mehr als 45 Meter (50 Yards) betragen.
-
Patient 3: Behandlung (außerhalb
des Versuchs)
-
Der
dritte Fall beschreibt einen 26-jährigen Mann, der im April 2001
mit eindeutiger MS diagnostiziert wurde. Seine Symptome begannen
1999, als er diffuse, nicht-lokalisierbare
Schmerzen in verschiedenen Teilen seines Körpers beklagte, insbesondere
in der linken Seite der Brust und im Magen. Darauf folgte eine periodische
Taubheit der Hände
und Füße, verbunden
mit fluktuierender Schwäche.
Es traten auch peinliche Blasensymptome bezüglich Urinierhäufigkeit
und -dringlichkeit auf. Die MS-Diagnose im Jahr 2001 basierte auf seinen
Rückfall-Remissions-Symptomen
und wurde durch eine positive Analyse der Cerebrospinal-Flüssigkeit und
Kernspintomographie (MRI) des Gehirns bestätigt, wobei sich multiple Abnormalitäten der
weißen
Substanz in beiden Hirnhälften
zeigten. Die Symptome zeigten keine Reaktion auf verschiedene pharmazeutische Therapien.
-
Im
April 2003 begann die orale Nahrungsergänzung mit dem hier beschriebenen,
hoch-dosierten Borretschöl.
Der Patient berichtete eine dramatische Verbesserung seiner Symptome
binnen drei Monaten nach Beginn dieser oralen Nahrungsergänzung. Seine
schmerzhaften sensorischen Symptome verschwanden vollständig. Er
berichtete über
keinerlei Taubheit oder Schwäche
ab Mai 2003 und bemerkte eine signifikante Verbesserung seiner Blasenkontrolle.
Die orale Nahrungsergänzung
verursachte keine negativen Ereignisse. Eine erneute Gehirn-MRI
wurde durchgeführt,
um die berichtete Verbesserung in Herrn N's Symptomen zu verifizieren. Die erneute
MRI zeigte eine Reduktion der Größe und Verteilung
der Abnormalitäten
der weißen Substanz.
-
BEISPIELE. Künstliche sn-2 Lipide
-
In
allen nachstehenden Beispielen wird eine höhere Reinheit dadurch erhalten,
dass die Ausgangsmaterialien γ-Linolen-,
Dihomo-γ-linolen-
oder Arachidonsäure
höherer
Reinheit verwendet wurden, wie sie z.B. von Sigma Aldrich erhältlich sind.
GLA95 bedeutet 95% reine γ-Linolensäure.
-
Synthesebeispiel 1: Synthese von Trigammalinolenin
-
1) Säurechlorid-Verfahren
-
2,0
g (7,2 mmol, 3,1 Äquiv.)
GLA95 (95% reine γ-Linolensäure) wurden
in 10 ml DCM gelöst.
1,01 g (0,71 ml, 8,0 mmol, 3,4 Äquiv.)
Oxalylchlorid in 5 ml DCM wurde in 2–3 min tropfenweise unter Stickstoff
zugegeben. Es wurde bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid
zu entfernen. Dieses Säurechlorid
wurde dann tropfenweise in 2–3
min zu einer gerührten
Mischung aus 215 mg (2,3 mmol, 1 Äquiv.) Glyzerin, 0,58 ml (3,1 Äquiv.) Pyridin
und 10 ml DCM unter Stickstoff zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht
bei Zimmertemperatur gerührt.
Das gebildete Pyridinhydrochlorid wurde dann abfiltriert und mit
DCM gewaschen. Die Lösung
wurde mit 1 × 4
ml Wasser, 0,1 N HCl, 5% Natriumhydrogencarbonat und 5% NaCl gewaschen.
Es wurde über
Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zu einem gelben Öl aufkonzentriert.
Dieses Öl
wurde auf einer Silicasäule
unter Verwendung von 10% Ether in Hexan als Elutionsmittel gereinigt.
Ein klares farbloses Öl wurde
erhalten, von dem eine Probe umgeestert und anschließend mittels
GC analysiert wurde. Das Produkt enthielt 96,3% GLA.
-
2) DCCI-Verfahren
-
2,19
g GLA95 (3,15 Äquiv.),
230 mg (1 Äquiv.)
Glyzerin, 153 mg DMAP (0,5 Äquiv.)
wurden in 10 ml DCM unter Stickstoff gerührt. 1,85 g DCCI (3,6 Äquiv.) in
5 ml DCM wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht
bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das entstandene DCU wurde
abfiltriert und mit DCM gewaschen. DCM wurde mit 1 × 5 ml N
HCl, Wasser, 5% Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen. Es
wurde über
Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zu einem Öl aufkonzentriert.
Dieses Öl
wurde dann auf einer Silicasäule
unter Verwendung von 10% Ether in Hexan als Elutionsmittel gereinigt. 1,47
g (67%) eines leicht trüben Öls wurde
erhalten. Eine Probe dieses Produkts wurde umgeestert und einer GC-Analyse
unterzogen. Das Produkt enthielt 95,8% GLA.
-
Scale-up
-
20
g (0,072 mol, 3,1 Äquiv.)
GLA95 (gamma-Linolensäure,
95%) wurden in 100 ml DCM gelöst.
13,7 g (9,3 ml, 0,11 mol, 4,78 Äquiv.)
Oxalylchlorid wurden in 3–4
min unter Stickstoff zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht
unter Stickstoff gerührt.
Es wurde dann im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid
zu entfernen. Dieses Öl
wurde dann tropfenweise in etwa 5 min zu einer gerührten Mischung
aus 2,14 g (0,023 mol, 1 Äquiv.)
Glyzerin, 100 ml DCM und 5,8 ml (5,68 g, 0,072 mol, 3,1 Äquiv.) Pyridin
unter Stickstoff zugegeben. 85 mg (0,7 mmol, 0,03 Äquiv.) DMAP
(4-Dimethylaminopyridin)-Katalysator wurde zugegeben. Die Mischung
wurde über
Nacht bei Zimmertemperatur gerührt.
Das Pyridinhydrochlorid wurde abfiltriert und mit DCM gewaschen.
Die DCM-Lösung
wurde mit 1 × 25
ml: Wasser, 10% Natriumhydrogencarbonat, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen.
(Während
dieses Prozesses bildeten sich insbesondere zu Beginn Emulsionen.)
Das DCM wurde über
Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zu einem braunen Öl aufkonzentriert
(~21 g).
-
Das Öl wurde
auf einer Silicasäule
unter Verwendung von zunächst
5% Ether in Hexan und dann 10% gereinigt. 15,6 g (77% Ausbeute)
eines klaren Öls
wurden erhalten. Laut Dünnschichtchromatographie
enthielt dieses Material eine geringe Menge freies GLA. (Dieses
Material wurde zu einem späteren
Zeitpunkt weiter gereinigt.)
-
Großer Maßstab
-
Obige
Reaktion wurde in 10-fachem Maßstab
wiederholt. Dementsprechend wurden 200 g GLA 95, 1 l DCM, 137 g
Oxalylchlorid und 21,4 g Glyzerin verwendet. Im Anschluss an die
Zugabe des Säurechlorids wurde
das Reaktionsgemisch in einem kal ten Wasserbad gekühlt und
die Temperatur unter 35°C
gehalten. 250 g eines braunen Öls
wurden hergestellt. Dies wurde zunächst auf einer 500 g Silicasäule gereinigt.
Das Öl
wurde in 200 ml Hexan gelöst
und auf die Säule
aufgebracht. Die Säule
wurde zunächst
mit Hexan, dann mit 5% Ether in Hexan und dann 10% eluiert. Fraktionen
wurden gesammelt und mittels Dünnschichtchromatographie analysiert,
wobei schließlich
zwei Fraktionen Öl
erhalten wurden. Die erste A (66 g) enthielt eine kleine Menge einer
mit der Laufmittelfront laufenden Verunreinigung und ein wenig GLA
(welches langsamer läuft
als TGL), die zweite Fraktion B (99 g) war ohne die mit der Laufmittelfront
laufende Verunreinigung und enthielt ein wenig GLA.
-
Die
Reaktion im großen
Maßstab
wurde unter Verwendung von 169 g GLA wiederholt und ergab wie oben
zwei Fraktionen. Dieses Mal wurden 85 g der "A"-Fraktion
und 54 g der "B"-Fraktion erhalten.
Die beiden "A"-Fraktionen wurden
zusammengegeben und auf einer 500 g Silicasäule erneut gereinigt. Mit den "B"-Fraktionen wurde in ähnlicher
Weise verfahren (15 g an Material der Reaktion im kleinen Maßstab wurden
ebenso zu diesem Ansatz gegeben).
-
Einige
Fraktionen aus der obigen Reaktion wurden nochmals nachgereinigt,
wobei schließlich
259 g Öl
erhalten wurden. Das Öl
wurde im Hochvakuum in einem Rotationsverdampfer auf ein konstantes
Gewicht gebracht – 256
g. Dies entspricht einer Gesamtausbeute von 65%.
-
Analyse des Produkts
-
GC
-
Eine
kleine Probe wurde umgeestert und einer GC-Analyse unterzogen:
Der
GLA-Gehalt betrug 97,1%. Die Hauptverunreinigung war Linolsäure – 1,91%.
Bemerkung: Das ursprüngliche
GLA95, das bei der Synthese verwendet wurde, enthielt 96,2% GLA
und 2,42% Linolsäure.
-
HPLC
-
Ein
HPLC-Verfahren wurde entwickelt unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (Hypersil
C18 4,6 × 100
mm), Elution mit 80/20 Acetonitril/THF. UV-Detektion bei 210 nm.
Dabei zeigte sich, dass das Produkt eine Mischung aus drei Komponenten
ist. Das Hauptsignal (93,6%) war das gewünschte Produkt. Eine langsamer
laufende Verunreinigung (die 5,0% des Produkts darstellt) war vermutlich
GGLI-Triglyzerid (LI = Linolsäure).
Eine zweite Verunreinigung lief geringfügig schneller und stellte 1,4
des Produkts dar.
-
Bemerkung:
Die Absorption bei 210 nm schwankt beträchtlich zwischen Triglyzeriden
mit unterschiedlichem Fettsäuregehalt.
Zum Beispiel hat Trigammalinolenin eine 5- bis 6-mal stärkere UV-Absorption
als Trilinolenin.
-
Zusammenfassung
-
254
g Glyzerintri-6,9,12-linolenat (gamma-Linolensäuretriglyzerid, Trigammalinolenin,
GGG) wurde aus 96,2% GLA wurde über
einen zweistufigen Säurechlorid-Weg
hergestellt. Es ist ein klares, blassgelbes Öl und wurde unter Stickstoff
im Gefrierschrank gelagert. Der GLA-Gehalt betrug 97,1% und keine
C20:1-, C22:1- oder C24:1-Säuren wurden
nachgewiesen. Die Reinheit gemäß HPLC betrug
93,6%.
-
Die
Synthese von GGG höherer
Reinheit kann leicht durch Verwendung von GLA98 (98% γ-Linolensäure: Scotia)
oder höher
als Ausgangsmaterial erzielt werden.
-
Vergleichslipid 1: Synthese Tricaprin
(Glyzerintridecanoat)
-
Kleiner Maßstab
-
Glyzerin
(3,0 g, 0,0325 mol, 1 Äquiv.),
Pyridin (8,1 ml, 0,10 mol, 3,1 Äquiv.)
und Dichlormethan (100 ml) wurden bei Zimmertemperatur unter Stickstoff
gerührt.
Decanoylchlorid (21 ml, 19,25 g, 0,10 mol, 3,1 Äquiv.) wurde dann tropfenweise
in 5 min zugesetzt, wobei in einem Wasserbad extern gekühlt wurde,
um die Temperatur bei 30–35°C zu halten.
Als die Zugabe beendet war, wurde 4-Dimethylaminopyridin (DMAP,
0,12 g, 1 mmol, 0,03 Äquiv.)
zugegeben und die Mischung über
Nacht unter Stickstoff bei Zimmertemperatur gerührt. Das ausgefallene Pyridinhydrochlorid
wurde mittels Filtration entfernt und mit Dichlormethan gewaschen. Waschlösung und
Filtrat wurden zusammengegeben und dann mit wässrigen Lösungen (20 ml) von 5% Natriumchlorid,
5% Natriumhydrogencarbonat, 0,1 N Salzsäure und 5% Natriumchlorid gewaschen.
Die Dichlormethan-Phase wurde dann über MgSO4 getrocknet
und das Lösungsmittel
im Vakuum entfernt. Das zurück bleibende Öl kristallisierte
mit der Zeit. Dieses Material wurde aus Isopropanol (40 ml) umkristallisiert,
wobei 15,6 g (86 Ausbeute) eines wachsartigen weißen Feststoffs
erhalten wurde.
-
Analyse
-
- GC – 99,8%
rein
- HPLC (C18 4,6 × 100
mm, ACN/THF 85/15 1 ml/min, λ 210
nm) – 94,9%
rein
-
Großer Maßstab
-
Obige
Reaktion wurde im 15-fachen Maßstab
wiederholt. Glyzerin (45,0 g, 0,49 mol, 1 Äquiv.), Pyridin (121,5 ml,
1,50 mol, 3,1 Äquiv.)
und Dichlormethan (1,5 l) wurden bei Zimmertemperatur unter Stickstoff
gerührt.
Decanoylchlorid (315 ml, 288,8 g, 1,50 mol, 3,1 Äquiv.) wurde dann tropfenweise
in 15 min zugegeben, wobei im einem Wasserbad extern gekühlt wurde,
um die Temperatur bei 30–35°C zu halten.
Als die Zugabe beendet war, wurde 4-Dimethylaminopyridin (DMAP,
1,8 g, 15 mmol, 0,03 Äquiv.)
zugegeben und die Mischung über
Nacht unter Stickstoff bei Zimmertemperatur gerührt. Das ausgefallene Pyridinhydrochlorid
wurde mittels Filtration entfernt und mit Dichlormethan gewaschen.
Waschlösung
und Filtrat wurden zusammengegeben und dann mit wässrigen
Lösungen
(300 ml) von 5% Natriumchlorid, 5% Natriumhydrogencarbonat, 0,1
N Salzsäure und
5% Natriumchlorid gewaschen. Die Dichlormethan-Phase wurde dann über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.
Das zurück
bleibende Öl
kristallisierte mit der Zeit. Dieses Material wurde aus Isopropanol
(400 ml) umkristallisiert, wobei 228 g (86 Ausbeute) eines wachsartigen
weißen
Feststoffs erhalten wurden.
-
Analyse
-
- GC – 99,8%
rein
- HPLC (C18 4,6 × 100
mm, ACN/THF 85/15 1 ml/min, λ 210
nm) – 94,9%
rein
-
Ein
weiterer Ansatz wurde durchgeführt
und mit der Charge des obigen kleinen Maßstabs erneut aus Isopropanol
umkristallisiert, wobei 44 g Produkt erhalten wurden. Die obigen
Chargen wurden zusammengegeben (268 g) und erneut analysiert:
GC
99,9%
rein
HPLC
97,9%
-
Zusammenfassung
-
263
g Glyzerintridecanoat (Tricaprin, CCC) wurde aus Decanoylchlorid
(98%) in einem Einschritt-Verfahren (Schema unten aufgeführt) hergestellt.
Es ist ein weißer,
niedrigschmelzender Feststoff und wurde unter Stickstoff im Gefrierschrank
gelagert. Der C-Gehalt betrug 99,9% des Fettsäuregehalts und die Reinheit
gemäß HPLC betrug
97,9%.
-
Synthesebeispiel 2
-
1,3-Dicaprin-2-gammalinolenoat (Glyzerin-1,3-didecanoat-2-octadecatri-(6Z,9Z,12Z)-enoat
oder CGC
-
Dieses
Triglyzerid ist neu. Im Gegensatz zu CGC wurde sein Isomer CLnC
(in = α-Linolensäure) als Bestandteil
von Kokosnussöl
identifiziert (siehe K. Long et al., Biotechnol. Lett., 20, 369–372 (1998)
und H. Mu, P. Kalo et al., Eur. J. Lipid Sci. Technol., 102, 202–211 (2000).
Außerdem
wurde CLxC (Lx = eine Linolensäure mit
nicht bestimmter Doppelbindungsposition) beschrieben (siehe J. Gresti
et al., J. Dairy Sci., 76, 1850–1869 (1993)).
-
Die
zwei Zwischenstufen, die bei der Synthese von CGC verwendet werden,
sind bekannt (siehe L. El Kihel et al., Arzneim.-Forsch./Drug. Res.,
46, 1040–1044
(1996) und
US 4 178 299 ).
Der nachstehend beschriebene letzte Schritt ist neu und die ersten
beiden Stufen sind ebenfalls erfinderisch, da sie besser für eine Produktion
in großem
Maßstab
geeignet sind als die früher
beschriebenen.
-
CGC
wurde durch Reaktion von 1,3-Dicaprin mit GLA-Chlorid in Dichlormethan/Pyridin
hergestellt. 1,3-Dicaprin wurde mittels Natriumborhydrid-Reduktion
von 1,3-Didecanoyloxypropan-2-on
hergestellt, welches wiederum durch Reaktion von Decanoylchlorid
mit 1,3-Dihydroxyaceton erzeugt wurde. Die Zwischenstufe 1,3-Dicaprin
muss vorsichtig behandelt werden, da in Gegenwart von Säuren, Basen
und Wärme
eine Acylumlagerung erfolgen kann. Ein älteres Verfahren zur Herstellung
von 1,3-Dicaprin
wurde beschrieben (siehe A. P. J. Mank et al., Chem. Physics Lipids,
16, 107–114
(1976)).
-
Eine
vielseitige, flexible Synthese von 1,3-Diglyzeriden und Triglyzeriden
mittels katalysierter Addition von Decansäure an einen Glycidylester
(aus Epichlorhydrid) ist aufgrund der harscheren Reaktionsbedingungen
und den Problemen der Acylumlagerung weniger attraktiv. Das Endprodukt
CGC wurde mittels vorsichtiger Säulenchromatographie
an Silica, welche Nebenprodukte entfernt, gereinigt.
-
Kleiner Maßstab
-
1,3-Didecanoyloxypropan-2-on
-
Decanoylchlorid
(40,0 ml, 36,8 g, 0,19 mol, 1,98 Äquiv.) wurde tropfenweise in
10–15
min zu einer gerührten
Suspension von 1,3-Dihydroxyaceton-Dimer (8,68 g, 0,048 mol, 1,0 Äquiv.),
Pyridin (15,6 ml, 0,19 mol), 4-Dimethylaminopyridin (0,18 g, 0,0014
mol, 0,03 Äquiv.)
und Dichlormethan (DCM, 150 ml) bei Zimmertemperatur unter Stickstoff
zugegeben. Die Temperatur des Reaktionsgemischs wurde durch Kühlung in
einem kalten Wasserbad unter 30°C
gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur
unter Stickstoff gerührt.
Das entstandene Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt
und mit DCM gewaschen. Filtrat und Waschlösungen wurden zusammengegeben
und dann mit 1 × 25
ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO3, 0,1
N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung
wurde dann über
MgSO4 getrocknet und im Vakuum zu einer
gelblichen halbfesten Masse aufkonzentriert. Diese wurde dann aus
Methanol (150 ml) kristallisiert, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde.
Die Ausbeute betrug 28,2 g (73%).
-
1,3-Dicaprin
-
Das
obige Keton (28,2 g, 0,071 mol) wurde in Tetrahydrofuran (THF, 200
ml) gelöst.
Dann wurde Wasser (10 ml) zugegeben, die Lösung auf 5°C gekühlt, und Natriumborhydrid (5,38
g, 0,14 mol) portionsweise unter 10°C zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde für
1 h bei Zimmertemperatur gerührt
und dann im Vakuum aufkonzentriert, um das THF zu entfernen. Der
Rückstand
wurde in Ethylacetat und 5 Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die
wässrige
Phase wurde noch einmal mit Ethylacetat extrahiert und die zusammengegebenen
Extrakte über
MgSO4 getrocknet und im Vakuum zu einem
wachsartigen Feststoff aufkonzentriert. Dieser wurde zweimal aus
Hexan kristallisiert, wobei 11,2 g (40%) eines weißen Feststoffs
erhalten wurden (99% + rein gemäß HPLC).
-
1,3-Dicaprin-2-gammalinolenoat (CGC)
-
Gamma-Linolensäure (GLA95,
8,34 g, 0,03 mol) wurde in Dichlormethan (DCM, 60 ml) gelöst. Die
erhaltene Lösung
wurde bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt und Oxalylchlorid (3,9
ml, 5,67 g, 0,044 mol) tropfenweise in 5 min zugegeben. Die Mischung
wurde über
Nacht bei Zimmertemperatur gerührt
und dann im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen.
Das zurück
bleibende ölige
Säurechlorid
(GLA-Cl) wurde dann tropfenweise in 15 min (Eis/Wasser-Kühlung) zu
einer gerührten
Lösung
aus 1,3-Dicaprin (11,2 g, 0,028 mol), DCM (50 ml), Pyridin (2,42
ml, 2,37 g, 0,03 mol) und 4-Dimethylaminopyridin (0,10 g, 0,0008
mol, 0,03 Äquiv.)
bei 10–15°C zugegeben.
Die Temperatur wurde durch Eis/Wasser-Kühlung aufrechterhalten. Das
Reaktionsgemisch wurde über
Nacht bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Pyridinhydrochlorid
wurde mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Die Waschlösung und
das Filtrat wurden zusammengegeben und mit 1 × 20 ml-Portionen von 5% NaCl,
5% NaHCO3, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen.
Die Lösung
wurde dann über
MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel
im Vakuum entfernt. Das zurück
bleibende braune Öl
wurde mittels Säulenchromatographie
an Silica gereinigt. Die Elution mit Hexan und dann mit 5 Ether/Hexan
ergab 10,3 g (56%) eines farblosen Öls. Die Struktur wurde mittels 13C-NMR und GLC bestätigt. Die Reinheit wurde mittels
HPLC bestimmt.
-
Großer Maßstab
-
1,3-Didecanoyloxypropan-2-on
-
Decanoylchlorid
(272 ml, 250 g, 1,3 mol, 2 Äquiv.)
wurde tropfenweise in 10–15
min zu einer gerührten Suspension
aus 1,3-Dihydroxyaceton-Dimer (59,1 g, 0,65 mol, 1,0 Äquiv.),
Pyridin (106 ml, 103,7 g, 1,3 mol), 4-Dimethylaminopyridin (2,38
g, 0,02 mol, 0,03 Äquiv.)
und Dichlormethan (DCM, 750 ml) bei Zimmertemperatur unter Stickstoff
zugegeben. Die Temperatur des Reaktionsgemischs wurde durch Kühlung in
einem kalten Wasserbad unter 30°C
gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur
unter Stickstoff gerührt.
Das entstandene Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt
und mit DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden
zusammengegeben und dann mit 1 × 150
ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO3, 0,1
N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung
wurde dann über
MgSO4 getrocknet und im Vakuum zu einer
gelblichen halbfesten Masse aufkonzentriert. Diese wurde dann aus
Methanol (500 ml) kristallisiert, wobei ein weißer Feststoff entstand. Die
Ausbeute betrug 158 g (60%).
-
1,3-Dicaprin
-
Das
obige Keton (158 g, 0,40 mol) wurde in Tetrahydrofuran (THF, 2,25
l) gelöst.
Dann wurde Wasser (50 ml) zugegeben, die Lösung auf 5°C gekühlt und Natriumborhydrid (5,66
g, 1,5 Äquiv.)
portionsweise unter 10°C
zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde mittels HPLC kontrolliert
(C18, Elution mit ACN bei 1 ml/min, λ 210 nm) (Bemerkung: tatsächlich wurden
nur etwa 4,5 g des Borhydrids zugegeben, da sämtliches SM bereits reagiert
hatte). Das Reaktionsgemisch wurde für 1 h bei Zimmertemperatur
gerührt
und dann im Vakuum aufkonzentriert, um TFH zu entfernen. Der Rückstand
wurde in Ethylacetat und 5%iger Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die
wässrige
Phase wurde erneut mit Ethylacetat extrahiert und die zusammengegebenen
Extrakte über
MgSO4 getrocknet und im Vakuum zu einem
wachsartigen Feststoff aufkonzentriert. Dieser wurde zweimal aus
Hexan kristallisiert, wobei man 96 g (60%) eines weißen Feststoffs
erhielt (98% rein gemäß HPLC).
-
1,3-Dicaprin-2-gamma-linolenoat (CGC)
-
Gamma-Linolensäure (GLA95,
120,2 g, 0,43 mol) wurde in Dichlormethan (DCM, 750 ml) gelöst. Die erhaltene
Lösung
wurde bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt und Oxalylchlorid (55,7
ml, 82,3 g, 0,65 mol, 1,5 Äquiv.)
tropfenweise bei 15–20°C in 15 min
zugegeben. Die Mischung wurde über
Nacht bei Zimmertemperatur gerührt
und dann im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen.
Das zurück
bleibende ölige
Säurechlorid
(GLA-Cl) wurde dann tropfenweise in 30–40 min bei 10–15°C (Eis/Wasser-Kühlung) zu
einer gerührten
Lösung
aus 1,3-Dicaprin (164,7 g, 0,41 mol), DCM (650 ml), Pyridin (33,3
ml, 32,5 g, 0,41 mol) und 4-Dimethylaminopyridin (1,50 g, 0,012
mol, 0,03 Äquiv.)
bei 10–15°C zugegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde über
Nacht bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Pyridinhydrochlorid
wurde mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Die Waschlösung und
das Filtrat wurden zusammengegeben und mit 1 × 150 ml-Portionen von 5% NaCl,
5% NaHCO3, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewa schen. Die
Lösung
wurde dann über
MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel
im Vakuum entfernt, wobei ein braunes Öl (275 g) erhalten wurde.
-
Der
Maßstab
der obigen drei Reaktionen war der größte, in dem diese durchgeführt wurden.
Die Reduktion mit Borhydrid ergab, zusätzlich zu 1,3-Dicaprin, ein
Nebenprodukt in verschiedenen Ausbeuten. Die Gegenwart dieses Nebenprodukts
beeinflusste stark die Ausbeute an isoliertem reinen 1,3-Dicaprin;
das Nebenprodukt konnte nur durch zwei Kristallisationen des Rohprodukts
entfernt werden. Da das Endprodukt CGC mittels Säulenchromatographie gereinigt
wird, ist es erforderlich, dass das für den letzten Schritt verwendete 1,3-Dicaprin
so rein wie möglich
ist!
-
In
den obigen Reaktionen wurde etwa 440 g rohes CGC in Form eines braunen Öls hergestellt.
Dies wurde auf einer Reihe von Silicasäulen unter Verwendung von Hexen,
gefolgt von 2–3%
Ether/Hexen, gereinigt. Die Reinigung erforderte 7 oder 8 Säulen, wobei
3–4 Kilo
Silica und 25–30
Liter Lösungsmittel
verwendet wurden (Wiederbenutzung des Lösungsmittels hielt diese Zahl
gering – in
der Praxis wurden über
100 Liter verwendet).
-
Das
erhaltene Produkt, ein klares, fast farbloses Öl (264 Gramm), war gemäß HPLC (C18
4,6 × 100 mm,
Elution mit 85/15 ACN/THF bei 1 ml/min. UV-Detektion λ 210 nm)
96,4% rein. GC zeigte ein Verhältnis von
66,1/33,9 C/G. Die NMR-Analyse zeigte, dass das Produkt die richtige
CGC-Struktur aufwies und eine Reinheit von mindestens 95% hatte: δc (500
MHz, CDCl3) 172,65 (2-GLA-Carbonyl), 173,25
(1,3-Caprylcarbonyl). Verhältnis
der Signale 2,04:1. Das Fehlen eines Signals bei 173,0 wies auf
die Abwesenheit von 1,3-GLA hin. Spuren eines Signals bei 172,79
könnten
auf eine Ölsäure-Verunreinigung
in GLA oder 2-Caprylsäure
zurückzuführen sein.
-
Zusammenfassung
-
264
g Glyzerin-1,3-didecanoat-2-gammalinolenoat (1,3-Dicaprin-2-GLA,
CGC) wurde in einem Dreischritt-Verfahren (Schema unten aufgeführt) aus
Decanoylchlorid (98%) hergestellt. Es ist ein fast farbloses Öl (schwach
gelber Farbton) und wurde unter Stickstoff im Gefrierschrank gelagert.
Die Reinheit gemäß HPLC betrug
96,4%.
-
Synthesebeispiel 3
-
1,3-Didecanoat-2-dihomo-γ-linolenoat
(Glyzerin-1,3-didecanoat-2-icosa-(8Z,11Z,14Z)-trienoat
oder C(DHLA)C
-
Dieses
Triglyzerid scheint neu zu sein – es wurde kein Literaturhinweis
gefunden.
-
DHLA
(3,93 g, 12,8 mmol, 1 Äquiv.)
wurde in Dichlormethan (DCM, 20 ml) gelöst und bei Zimmertemperatur
unter einer Stickstoffatmosphäre
gerührt.
Oxalylchlorid (1,69 ml, 2,46 g, 19,4 mmol, 1,5 Äquiv.) wurde tropfenweise in
1–2 min
zugegeben und über
Nacht bei Zimmertemperatur rühren
gelassen. Die erhaltene Lösung
wurde im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen.
Das zurück bleibende ölige Säurechlorid
(DHLA-Cl) wurde dann tropfenweise in 5 min bei 25°C zu einer
gerührten
Mischung aus 1,3-Dicaprin (4,91 g, 12,2 mmol, 0,95 Äquiv.),
Pyridin (0,98 ml, 0,96 g, 12,1 mmol, 0,95 Äquv.) und 4-Dimethylaminopyridin
(DMAP, 8 mg, 0,07 mmol, 0,03 Äquiv.)
zugegeben. Während
der Zugabe stieg die Reaktionstemperatur auf 32°C. Die Reaktion wurde bei 30–35°C gerührt und
mittels HPLC beobachtet. Die Reaktion wurde nach 1,5 h beendet.
Das ausgefallene Pyridinhydrochlorid wurde abfiltriert und mit DCM
gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden zusammengegeben
und dann mit 1 × 10
ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO3, 0,1
N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung
wurde dann über
MgSO4 getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert,
wobei das Rohprodukt als gelboranges Öl (8,9 g, 86% rein gemäß HPLC)
erhalten wurde. Dieses Öl
wurde an Silicagel (250 g) chromatographiert. Die Elution mit Hexan
und Diethylether/Hexan (2–6%)
ergab ein blaßgelbes Öl als gereinigtes
Produkt. Die Behandlung einer Hexanlösung mit entfärbender Kohle
und die Entfernung des Lösungsmittels
im Vakuum ergab C(DHLA)C als klares, farbloses Öl (6,48 g, 98,9% rein gemäß HPLC).
-
Vergleichslipid 2
-
1,3-Di-(octadeca-6Z,9Z,12Z-enoyloxy)-propan-2-on
-
(1,3-Di-(γ-linolenoyloxy)-propan-2-on,
GonG), Zwischenprodukt der Stufe 1 für GCG
-
Gamma-Linolensäure (GLA95,
197 g, 0,71 mol, 2,2 Äquiv.)
wurde in Dichlormethan (DCM, 600 ml), das sich in einem 2 l-Dreihalskolben
befand, gelöst.
Die erhaltene Lösung
wurde bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Oxalylchlorid (93 ml,
136 g, 1,07 mol, 3,3 Äquiv.)
wurde tropfenweise bei 15–20°C in 15 min zugegeben.
Die braune Mischung wurde über
Nacht bei Zimmertemperatur gerührt
und dann im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen.
Das zurück
bleibende ölige
Säurechlorid
(GLA-Cl) wurde dann tropfenweise in 20 min bei 25°C zu einer
gerührten
Mischung aus 1,3-Dihydroxyaceton-Dimer (28,99 g, 0,32 mol, 1,0 Äquiv.),
Pyridin (52 ml, 50,9 g, 0,64 mol, 2,0 Äquiv.), 4-Dimethylaminopyridin (2,36
g, 0,02 mol, 0,06 Äquiv.)
und Dichlormethan (DCM, 600 ml) bei Zimmertemperatur unter Stickstoff
zugegeben. Die Temperatur des Reaktionsgemischs konnte auf bis zu
40°C ansteigen
und die Mischung wurde für weitere
2 h unter Stickstoff gerührt
(mittels HPLC beobachtet). Das entstandene Pyridinhydrochlorid wurde
mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Das Filtrat und
die Waschlösungen
wurden zusammengegeben und dann mit 1 × 150 ml-Portionen von 5% NaCl,
5% NaHCO3, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen.
Die Lösung
wurde dann über
MgSO4 getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert,
wobei ca. 200 g eines gelben Öls erhalten
wurden. Dieses Material wurde teilweise mittels Säulenchromatographie
an Silica (600 g) gereinigt. Die Elution mit Hexan und anschließend Ether/Hexan-Mischungen
(2–15%)
ergab 42 g eines blassgelben Öls. Dieses Öl wurde
nochmals an Silica (600 g) chromatographiert und mit Hexan und dann
1–10 Ether-Hexan eluiert,
wobei das Produkt (95,9% rein) als blassgelbes Öl erhalten wurde. Die Ausbeute
betrug 42 g (17%).
-
1,3-Di-(octadeca-6Z,9Z,12Z-enoyloxy)-propan-2-ol
-
1,3-Di-(γ-linolenoyloxy)-propan-2-ol
oder 1,3-Di-gamma-linolenin, GolG), Zwischenprodukt der Stufe 2
für GCG
-
13-Di-(γ-linolenoyloxy)-propan-2-on
(GonG, 25,5 g, 0,04 mol, 1 Äquiv.)
wurde in Tetrahydrofuran (THF, 375 ml) und Wasser (12,7 ml) gelöst. Die
Lösung
wurde hef tig bei –20°C gerührt, es
wurde darauf geachtet, dass die Reaktionstemperatur unter –15°C blieb.
Natriumborhydrid (790 mg, 0,02 mol, 1,25 Äquiv.) wurde portionsweise
in 3 min zu der gerührten
Lösung
gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für weitere 10 min bei –20°C gerührt und
dann Hexan (380 ml) zugegeben. Die immer noch kalte Mischung wurde
dann mit Wasser (2 × 200
ml) gewaschen, über
MgSO4 getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert,
wobei die Titelverbindung als braunes Öl (27,8 g) erhalten wurde (82,6%
rein gemäß HPLC,
weniger als 1% Umlagerungsprodukte). Ein weiterer Ansatz wurde hergestellt
und mit der ersten zusammengegeben, so dass man 50 g Rohprodukt
erhielt. Dieses Material wurde mittels Säulenchromatographie an Silicagel
(400 g) gereinigt. Die Elution mit Hexan und Diethylether/Hexan-Mischung
(5 bis 20%) ergab 36,1 g des Produkts als ein blasses Öl (91,5%
rein).
-
(Anmerkung:
Es sollte darauf geachtet werden, dass die Verbindung an dem Silica
nicht über
Nacht gelassen wird, da offenbar eine Umlagerungsreaktion stattfindet,
wobei GGol entsteht.)
-
1,3-Di-γ-linolenin-2-decanoat
(Glyzerin-1,3-dioctadeca-(6Z,9Z,12Z)-trienoat-2-decanoat oder GCG)
-
Decanoylchlorid
(13,5 ml, 12,4 g, 0,065 mol, 1,1 Äquiv.) wurde zu einer gerührten Lösung aus 1,3-Di-γ-linolenin
(36,1 g, 0,059 mol, 1 Äquiv.),
trockenem Pyridin (5,7 ml, 5,6 g, 0,07 mol, 1,1 Äquiv.), 4-Dimethylaminopyridin
(0,2 g, 0,002 mol, 0,03 Äquiv.)
und Dichlormethan (DCM, 150 ml) in ca. 10 min gegeben. Die Temperatur
wurde während
der Zugabe bei 17°C–23°C gehalten.
Die Reaktion wurde dann bei 30–35°C gerührt und
mittels HPLC beobachtet. Weitere 1–2 ml Decanoylchlorid wurden
nach 1 h, 1,5 h und 2 h zugegeben. Die weitere Zugabe schien die
Umsetzung zum Produkt zu erhöhen,
wie die HPLC-Bestimmung ergab. Nach 3 h wurde das Reaktionsgemisch
filtriert und das Filtrat mit DCM gewaschen. Das Filtrat und die
Waschlösungen
wurden zusammengegeben und dann mit 1 × 50 ml-Portionen von 5% NaCl,
5% NaHCO3, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen.
Das DCM-Extrakt wurde dann über
MgSO4 getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, wobei
das Rohprodukt als ein blassgelbes Öl erhalten wurde (Reinheit
90% gemäß HPLC).
Das Öl
wurde mittels Säulenchromatographie
an Silicagel (600 g) gereinigt. Die Elution mit Hexan und Diethylether-Hexan (1,5–2,5, dann
3,5%) ergab das Produkt (GCG) als ein klares Öl (35,5 g, 96,1% rein gemäß HPLC).
Weitere 7,5 g reines Lipid wurde mittels weiterer Chromatographie
einiger der Fraktionen, die nur eine geringe Menge an Verunreinigung
enthielten, erhalten.
-
Synthesebeispiel 4
-
1,3-Diolein-2-gammalinolenoat (Glyzerin-1,3-dioctadeca-9Z-enoat-2-octadecatri-(6Z,9Z,12Z)-enoat
oder OGO)
-
Dieses
Triglyzerid ist bekannt: Eine Kohlenstoff-14-markierte Version wurde
durch normale chemische Synthese hergestellt und die normale nicht-markierte
Form mittels biochemischer Synthese unter Verwendung von Lipasen.
OGO ist kein Hauptbestandteil von Borretschöl, jedoch sein Isomer OOG (9%).
Die zwei Zwischenstufen, die bei der Synthese von CGC verwendet
wurden, sind bekannt. Der letzte Schritt ist neu.
-
Die
Verwendung von, die Synthese aus 1,3-Diolein und die Reinigung von
CGC sind allesamt vermutlich neu. Allgemein werden die Triglyzeride
CXC aus Patent- und Kostengründen
OXO vorgezogen.
-
OGO
wurde hier durch Reaktion von 1,3-Diolein mit GLA-Chlorid in Dichlormethan/Pyridin
hergestellt. 1,3-Diolein wurde durch Natriumborhydrid-Reduktion
von 1,3-Dioleoylpropan-2-on
hergestellt, welches wiederum durch Reaktion von Oleoylchlorid mit
1,3-Dihydroxyaceton erzeugt wurde. Die Zwischenstufe 1,3-Diolein
muss vorsichtig behandelt werden, da in Gegenwart von Säuren, Basen
und Wärme
eine Acylumlagerung auftreten kann. Ältere Verfahren7,8 zur
Herstellung von 1,3-Diolein über
Monotritylglyzerin oder Glycidylester wurde aufgrund der höherer Anzahl
an Stufen und den Problemen der Acylumlagerung als weniger attraktiv eingestuft.
Das End- Produkt
OGO wurde mittels vorsichtiger Säulenchromatographie
an Silica gereinigt, wodurch Nebenprodukte entfernt wurden.
-
Kleiner Maßstab
-
1,3-Dioleoylpropan-2-on
-
155,1
g Ölsäure (155,1
g, 0,55 mol, 1,0 Äquiv.,
Croda 094 RV05192) wurde in Dichlormethan (DCM, 500 ml) gelöst. Die
Lösung
wurde bei Zimmertemperatur (RT) unter Stickstoff gerührt und
104,4 g (1,5 Äquiv., 71
ml) Oxalylchlorid (104,4 g, 71,8 ml, 0,82 mol, 1,5 Äquiv.) wurde
tropfenweise bei 15–20°C in etwa
20 min zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur
gerührt.
Das überschüssige Oxalylchlorid
und DCM wurden im Vakuum entfernt und das zurück bleibende ölige Säurechlorid
wurde tropfenweise in 15–20
min zu einer gerührten
Suspension von 1,3-Dihydroxyaceton-Dimer (22,5 g, 0,24 mol Monomer),
Pyridin (40,4 ml), 4-Dimethylaminopyridin (1,83 g) und Dichlormethan
(DCM, 500 ml) bei Zimmertemperatur unter Stickstoff zugegeben. Die
Temperatur des Reaktionsgemischs wurde durch Kühlung in einem Eis/Wasser-Bad
unter 20°C
gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur
unter Stickstoff gerührt.
Das entstandene Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt
und mit DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden
zusammengegeben und dann mit 1 × 150
ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO3, 0,1
N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung
wurde dann über
MgSO4 getrocknet und im Vakuum zu einer
orange-braunen halbfesten Masse aufkonzentriert. Diese wurde in
Methanol zerrieben und über
Nacht im Kühlschrank
aufbewahrt. Der Feststoff, der sich dabei abgesetzt hat (90% rein
gemäß HPLC) wurde
dann aus Diisopropylether (DIPE) und Methanol kristallisiert, wobei
51,3 g eines cremefarbenen Feststoffs erhalten wurde, welcher 95%
rein gemäß HPLC war.
Nochmalige Kristallisation aus DIPE/Methanol lieferte 41 g (27%)
eines 98% reinen Produkts.
-
1,3-Diolein
-
Das
obige Keton (32,8 g, 0,053 mol) wurde in Tetrahydrofuran (THF, 250
ml) gelöst.
Dann wurde Wasser (10 ml) zugegeben, die Lösung auf 5°C gekühlt und Natriumborhydrid portionsweise
unter 10°C
zugegeben. Die Reaktion wurde mittels HPLC verfolgt (C18, ACN/THF
90/10 bei 2 ml/min, λ 210
nm) und nachdem das gesamte Ausgangsketon reagiert hatte, wurde
die Zugabe von Borhydrid beendet (830 mg, 0,022 mol zugegeben).
Die Mischung wurde dann im Vakuum aufkonzentriert, um THF zu entfernen.
Der Rückstand
wurde in Ethylacetat und Wasser ausgeschüttelt. Die wässrige Phase
wurde nochmals mit Ethylacetat extrahiert und die vereinigten Extrakte über MgSO4 getrocknet und im Vakuum zu einem Öl (~33 g)
aufkonzentriert, welches beim Kühlen
fest wurde. Das Produkt (68% rein gemäß HPLC) wurde aus 100 ml Hexan
bei –20°C (im Gefrierschrank) über Nacht
kristallisiert. Dieses Produkt (92% rein, 21,1 g) wurde aus Hexan
(50 ml) umkristallisiert, wobei 18,28 g (56% Ausbeute) eines gemäß HPLC 97,5%
reinen Produkts erhalten wurde.
-
1,3-Diolein-2-gammalinolenoat (O-G-O)
-
γ-Linolensäure (GLA95,
41,2 g, 0,15 mol, 1,1 Äquiv.)
wurde in Dichlormethan (DCM, 250 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde
bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt und Oxalylchlorid (19,1
ml, 28,2 g, 0,22 mol, 1,65 Äquiv.)
tropfenweise in 5 min zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht
bei Zimmertemperatur gerührt
und dann im Vakuum aufkonzentriert, und DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen. Das
zurück
bleibende ölige
Säurechlorid
(GLA-Cl) wurde dann tropfenweise in 15 min (Eis/Wasser-Kühlung) zu
einer gerührten
Lösung
aus 1,3-Diolein (83,5 g, 0,13 mol), DCM (250 ml), Pyridin (10,9
ml, 10,6 g, 0,14 mol) und 4-Dimethylaminopyridin (0,49 g, 0,004
mol, 0,15 Äquiv.)
bei 10–15°C zugegeben.
Die Temperatur wurde durch Eis/Wasser-Kühlung konstant gehalten. Das
Reaktionsgemisch wurde über
Nacht bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Pyridinhydrochlorid
wurde mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Waschlösung und
Filtrat wurden zusammengegeben und mit 1 × 80 ml-Portionen von 5% NaCl,
5% NaHCO3, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen.
Die Lösung
wurde dann über
MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel
im Vakuum entfernt. Das zurück
bleibende braune Öl
wurde mittels Säulenchromatographie
an Silica gereinigt. Die Elution mit Hexan und dann mit 5% Ether/Hexan
ergab 63,6 g (54%) eines farblosen Öls. Die Reinheit wurde mittels
HPLC bestimmt.
-
Zusammenfassung
-
64
g Glyzerin-1,3-oleoat-2-gammalinolenoat (1,3-Dioleat-2-GLA, OGO)
wurde in einem Dreistufenverfahren (Schema unten aufgeführt) aus
Oleoylchlorid (98%) hergestellt. Es war ein fast farbloses Öl (leicht
gelber Farbton) und wird unter Stickstoff im Gefrierschrank gelagert.
Die Reinheit gemäß HPLC betrug
89,4%.
-
13C-NMR-Daten
der künstlichen
Lipide
-
- GGG δc (125,7 MHz, CDCl3)
172,69 (1C, C2-Carbonyl), 173,09 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
- CGC δc (125,7 MHz, CDCl3)
172,76 (1C, C-2-Carbonyl), 173,17 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
- CAC δc (125,7 MHz, CDCl3)
172,65 (1C, C-2-Carbonyl), 173,28 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
- C(DHLA)C δc (125,7 MHz, CDCl3)
172,83 (1C, C-2-Carbonyl), 173,30 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
- GCG δc (125,7 MHz, CDCl3)
172,91 (1C, C-2-Carbonyl), 173,11 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
- OGO δc (125,7 MHz, CDCl3)
172,69 (1C, C-2-Carbonyl, 173,25 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
- AAA δc (125,7 MHz, CDCl3)
172,66 (1C, C-2-Carbonyl), 173,04 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
- CCC δc (125,7 MHz, CDCl3)
172,81 (1C, C-2-Carbonyl), 173,21 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
-
Experimentelle Vorgehensweise
-
Das
Protonen-entkoppelte 13C-NMR-Spektrum mit
unterdrücktem
NOE wurde bei 21°C
in einer 5 mm-Breitbandsonde an einem Joel 500 MHz-Spektrometer
gesammelt, das bei 125,728 MHz arbeitet. Waltz-Entkopplung war die
Entkopplungsart der Wahl, eingestrahlt wurde nur während der
Aufnahmedauer von 14,89 s. Die Relaxationsverzögerung wurde auf 30 s gesetzt
und der Pulswinkel betrug 90°.
Das verwendete spektrale Fenster betrug ca. 35 ppm (von 173,5 bis
172,6 ppm) mit einem 170 ppm-Offset.
Die Spektren wurden intern mit CDCl3 bei
77,0 ppm korreliert. Üblicherweise
lag die ungefähre
Anzahl der Aufnahmen, die für
ein adequates Signal-Rausch-Verhältnis
gesammelt wurden, zwischen 300 und 1200 Aufnahmen, in Abhängigkeit
von der Konzentration und Reinheit der Probe. Die Gesamtaufnahmedauer
der Experimente lag zwischen 2–8
h, z.B. 1272 Aufnahmen; 65 536 Datenpunkte. Eingesetzt wurden, wenn
möglich,
konzentrierte Lösungen
von bis zu 20% w/v, um die Aufnahmedauer zu reduzieren. Die aufgeführten chemischen
Verschiebungen variieren mit der Konzentration der Lösung.
-
BIOLOGISCHE STUDIEN
-
Chronisch rückkehrende experimentelle Autoimmun-Enzephalomvelitis
(CREAE)-Studien:
-
Induktion und klinische Bewertung
von EAE
-
CREAE
wurde in C57BL/6- und SJL-Mäusen
induziert. Die Tiere wurden subkutan mit 100 μg des Neuroantigen-Peptids MOG
35-55 (Aminosäuresequenz
MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK Genemed Synthesis, Inc.) oder 1 mg Rückenmarkhomogenat
von Mäusen
(SCH), in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), durch 10 min Ultraschall
bei Zimmertemperatur emulgiert, in unvollständigem Freund's Adjuvans (DIFCO,
Detroit, USA), das mit 480 μg
Mycobacteria tuberculosis und 60 μg
Mycobacteria butyricium (DIFCO, Detroit, USA) versetzt war, an den
Tagen 0 und 7 wie früher
beschrieben injiziert (Morris-Downes, MM., et al., 2002). Um die Erkrankung
zu optimieren, erhielten die Mäuse
zusätzlich
200 ng (intraperitoneal) Bordetella pertussis-Toxin, gelöst in PBS,
1 h und 24 h nach der Immunisierung mit dem MOG-Neuroantigen und
bei SCH an den Tagen 0, 1, 7 und 8 verabreicht.
-
Die
Tiere wurden von Tag 5 an gewogen und täglich auf klinische neurologische
Anzeichen von zwei erfahrenen Forschern untersucht und gemäß einem
früher
validierten Benotungssystem eingestuft (Morris-Downes, MM. et al.,
2002 und andere): 0 normal; 1 = schlaffer Schwanz und Füße; 2 =
beeinträchtigter
Korrekturreflex; 3 = partielle Lähmung
der hinteren Gliedmaßen;
4 = komplette Lähmung
der hinteren Gliedmaßen;
5 = sterbend; 6 = tot. Die Tiere, die klinische Anzeichen eines
geringeren Schweregrads als üblich
beobachtet wird aufweisen, wurden mit einer um 0,5 geringeren Stufe
als angezeigt bewertet.
-
Literatur
-
- Morris-Downes, MM., et al., (2002). Pathological and regulatory
effects of anti-myelin antibodies in experimental allergic encephalomyelitis
in mice. J. Neuroimmunol. 125, 114–124.
-
Der
Durchschnitts-EAE-Wert der Gruppe wurde bei jeder Versuchsgruppe
mit der jeweiligen Vergleichsgruppe mittels nicht-parametrischer
statistischer Analyse (Mann Whitney U-Test) verglichen.
-
Alle
MOG-CREAE-Studien umfassten die Behandlung einer Kontrollgruppe
(C-C-C oder Salzlösung, je
nach obiger Studie). Jedes künstliche
Lipid wurde in 3 Dosierungsgraden getestet, sämtliche Behandlungen erfolgten
durch orale Verabreichung über
2 Wochen beginnend an Tag 7 nach der Inokulation. Alle Behandlungsgruppen
enthielten 10 Tiere. Nach Beendigung der Studien (Tag 21) wurden
Gehirn und Rückenmark
entfernt und die Hälfte
der Proben auf Anzeichen von Orten der Infiltration perivaskulärer mononuklearer
Leukozyten im ZNS und Demyelinierung untersucht.
-
Folgende
Studien wurden durchgeführt:
Studie
2: Rückenmarkhomogenat
(SCH) EAE in SJL-Mäusen
EAE-Induktion:
1 mg SCH Tag 0 + Tag 7 subkutan. 200 ng Pertussis-Toxin Tag 0, 1,
7 & 8 intraperitoneal.
10 Mäuse/Gruppe.
Die Mäuse
wurden von Tag 7 bis 21 mit CCC oder CGC behandelt.
Studie
3: SCH EAE in SJL-Mäusen:
Behandlung von PSD 7 bis 21, beide Tage inklusive.
Studie
4: MOG EAE in C57BL-Mäusen:
Behandlung von PSD 7 bis 21, beide Tage inklusive.
Studie
5: SCH EAE in SJL-Mäusen:
Behandlung von PSD 5 bis 18, beide Tage inklusive.
Studie
6: MOG EAE in C57BL-Mäusen:
Behandlung an Tagen 5 bis 21 inklusive, mit Ausnahme der C-DHLA-C-Gruppe,
bei denen die Behandlung von Tag 5 bis 15 inklusive erfolgte. Die
Tiere wurden an PSD 25 getötet.
[Fünf Tiere
einer unbehan delten Gruppe, 3 Tiere einer Kontrollgruppe mit CCC-Behandlung,
5 Tiere einer Gruppe mit 150 μl
GGG-Behandlung und 2 Tiere einer Gruppe mit 350 μl GGG-Behandlung wurden zur histologischen
Analyse an PSD 20 entnommen.]
Studie 7: SCH EAE IN SJL-Mäusen
Behandlung
an Tagen 6 bis 20 inklusive.
Studie 2 – Rückenmarkhomogenat (SCH) in
SJL-Mäusen:
getestet
CGC (50/150/350 μl);
CCC (350 μl).
GGG
(50/350 μl)
[Schwere
Erkrankung beobachtet]
Studie 3 – SCH/SJL-Mäuse: getestet
CCC (50/150/350 μl)
CGC
(25/50/150/350 μl)
GGG
(50/150/350 μl)
OGO
(25/50/150/350 μl)
[Schwere
Erkrankung beobachtet]
Studie 4 – MOG/C57BL-Mäuse: getestet
CCC
(50/150/350 μl)
CGC
(25/50/150/350 μl)
GGG
(50/150/350 μl)
OGO
(25/50/150/350 μl)
Studie
6 – MOG/C57BL-Mäuse: getestet
CCC
(150 μl)
C-DHLA-C
(50 μl)
CAC
(50/350 μl)
AAA
(50/150 μl)
GCG
(50 μl)
CGC
(50 μl)
GGG
(150/350 μl)
[Pathologie:
CCC; GGG]
-
Die
histologische Untersuchung der entnommenen Gehirn- und Rückenmarkproben
zeigten Läsionen, wie
sie für
experimentelle allergische Enzephalomyelitis üblich sind.
-
Örtlich begrenzte
und diffuse Läsionen
wurden durch Gliose, Myelin-Vakuolisierung, axonale Degeneration
und perivaskuläre
Ansammlung von Lymphozyten, Makrophagen und Neutrophilen festgestellt.
-
Rückenmarksläsionen wurden
größtenteils
in der subpialen weißen
Substanz lokalisiert und Gehirnläsionen
traten meistens in der weißen
Substanz des Cerebellums auf. Die Läsionen im Rückenmark waren schwerer als
die im Gehirn und während
alle Tiere mit Gehirnläsionen
auch Läsionen
im Rückenmark
aufwiesen, hatten nicht alle Tiere mit Rückenmarksläsionen auch Läsionen im
Gehirn.
-
Die
Unterschiede in der Schwere der Veränderungen zwischen einzelnen
Mäusen
wurde unter Verwendung eines halbquantitativen Fünfpunkte-Bewertungssystems
zusammengefasst.
-
Unbehandelte
Mäuse hatten
histologische Werte von 3–4,
die mit EAE-Werten von 1,5–3
korrelierten. Eine Maus wies kaum pathologische Veränderungen
auf und hatte einen Wert von Null. Bei den mit GGG behandelten Mäusen zeigte
die Mehrzahl keine Abnormalitäten.
Zwei Mäuse
dieser Gruppe hatten histologische Werte von 2 bzw. 3, die mit EAE-Schwere-Werten
von 1 und 1,5 korrelierten.
-
Die
Ergebnisse der vier Studien sind in den 11 bis 19 nachstehend
dargestellt.
-
Diese
zeigen, dass die Verbindungen G-G-G, A-A-A, C-G-C, C-DHGLA-C und
C-A-C alle in der Lage sind, die Schwere von CREAE zu reduzieren,
während
die Verbindungen G-C-G und C-C-C die Erkrankung nicht behandeln
konnten. Die Verbindung O-G-O wirkt vermutlich, wenn die Dosis angepasst
wird.
-
Die
nicht beanspruchten Arachidonsäure-Verbindungen
sind effektiv, führen
jedoch zum Tod einiger Tiere. Die überlebenden Tiere wiesen eine
stark verringerte Erkrankung auf. Es wird angenommen, dass die Dosis
dieser Verbindungen noch weiter reduziert werden kann, um ein Überleben
mit einer zufriedenstellenden Behandlung zu erzielen.
-
Einige
der Studien zeigen eine Reaktion in Form einer Glockenkurve für die Verbindungen
C-G-C und G-G-G, was nahe legt, dass sehr hohe Dosen nicht optimal
sind, wie oben dargelegt. Eine solche Dosierung kann vom Fachmann
einfach bestimmt werden, z.B. durch Dosissteigerung und Beobachtung
der Veränderungen
des von PBMC spontan freigesetzten TGF-β1/TNF-α-Verhältnisses.
-
In
Anbetracht der Ergebnisse mit hohem sn-2 γ-Linolensäuregehalt aus
WO 2004/100943 A1 , der
Wirkungslosigkeit von Öl
schwarzer Johannisbeeren mit geringem sn-2 Gehalt und G-C-G bei
CREAE und der Wirksamkeit von C-G-C und C-DHGLA-C geringer Dosis
in
19 kann man sehen, dass sn-2 γ-Linolensäure- und Dihomo-γ-linolen-säurelipide
eine neue Behandlung bei MS darstellen, die das Ergebnis jeder derzeitigen
Therapie bei weitem übertrifft,
insofern, als Läsionen
und schwerwiegende Symptome behoben werden: abnehmende EDSS-Werte über einen
Zeitraum von Jahren wurden bisher mit anderen Behandlungen nicht erzielt.
-
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