DE112004001520T5

DE112004001520T5 - Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen

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Publication number: DE112004001520T5
Application number: DE112004001520T
Authority: DE
Inventors: Laurence S. Harbige; Michael J. Leach; Mohammed Sharief; Paul Barraclough
Original assignee: BTG International Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 2003-08-18
Filing date: 2004-08-13
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2024-08-14
Also published as: EP2324828A1; US20120142775A1; AU2004266480A1; FI20060154A; NO20061232L; CA2534202C; ES2304094A1; ES2304094B2; IS8246A; CH698539A8; US20100113595A1; GB2422373A; JP2007502805A; US20080194684A1; CH698539B1; US20100113810A1; CA2534202A1; GB0603646D0; AU2004266480B2; GB2422373B

Abstract

Ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an einer neurodegenerativen Krankheit leidet, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis eines Lipidglyzerids festgelegter Struktur, das einen Glyzerinrest aufweist, der mit einem oder mehreren Fettsäureresten verestert ist, an diesen Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid einen Fettsäurerest an der sn-2 Position aufweist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure und Arachidonsäure.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere solcher, bei denen eine Zunahme an transformierendem Wachstumsfaktor β (TGF-β) förderlich ist, insbesondere TGF-β1. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen bereit, insbesondere solcher wie etwa demyelinierende Krankheiten, wie etwa Multiple Sklerose, Alzheimer- und Parkinson-Erkrankungen und die degenerativen Folgeerkrankungen, die mit Schädeltrauma, Schlaganfall und intrakraniellen Blutungen verbunden sind, wobei die neuronale Funktion, z.B. durch Remyelinierung, im Vergleich zu einem beeinträchtigten Zustand verbessert oder wiederhergestellt werden kann.
Außerdem wird eine neue Verwendung bekannter und neuer Verbindungen, die ungesättigte Fettsäurereste umfassen, zur Herstellung von Medikamenten bereitgestellt, die in der Lage sind, solche Erkrankungen wirksam zu behandeln, insbesondere solche, die in der Lage sind, einen zuvor unerreichten Grad an Erfolg bezüglich der Wiederherstellung der neurologischen Funktion zu erzielen.
Die ebenfalls anhängige, unveröffentlichte Patentanmeldung PCT/GB04/002089 des Erfinders, auf die hier Bezug genommen und deren Inhalt in diese Anmeldung einbezogen wird, betrifft die Verwendung von Pflanzen- und Pilzölen zur Behandlung neurodegenerativer Krankheiten. Diese Öle weisen einen hohen Prozentsatz der essentiellen Fettsäure γ-Linolensäure (GLA) in der sn-2 Position ihrer Lipide auf, welche üblicherweise über 40% aller sn-2 Fettsäuren des Öls ausmacht.
In der Literatur ist ausführlich darüber berichtet worden, dass essentielle Fettsäuren (EFAs) mit einem n-3- und n-6-Doppelbindungsmuster günstige Auswirkungen auf einem weiten Feld physiologischer Funktionsstörungen beim Menschen, darunter Autoimmunerkrankungen, haben (WO 02/02105). Harbige (1998) Proc. Nut. Soc. 57, 555-562 lieferte eine Übersicht über die Nahrungsergänzung mit n-3- und n-6-Säuren bei Autoimmunerkrankungen und führte insbesondere Belege für den Nutzen von γ-Linolensäure (GLA)- und/oder Linolsäure (LA)-reichen Ölen auf.
Bates et al. stellten fest, dass Lipidöle, die eine Mischung aus Linolsäure- und γ-Linolensäureresten enthalten, bereits 1957 als möglicherweise wirksamer bei der Behandlung von Entzündungen und Autoimmunerkrankungen vorgeschlagen wurden, sie fanden jedoch, dass Patienten mit Rückfällen bei 3 g Öl pro Tag (Naudicelle Nachtkerzenöl 7:1 LA:GLA) mit dem Versuchsöl stärker erkrankten als mit der Vergleichssubstanz.
Obwohl die Ätiologie von MS weiterhin ungeklärt ist, haben Studien gezeigt, dass MS-Patienten eine höhere als normale Konzentration an Neuroantigen-autoreaktiven T-Zellen aufweisen. Diese T-Zellen reagieren unter anderem auf myelin basic protein (MBP) und Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) und befinden sich in einem im Vergleich zu gesunden Kontrollen erhöhten Aktivierungszustand. Die tatsächlichen Vorgänge der axonalen Schädigung, z.B. chronische Entzündung, Demyelinierung und Astrogliose bei MS ist komplex, aber eine Entzündung der weißen Substanz und Demyelinierung gelten als Bestimmungsmerkmale für die Schwere der Krankheit, während kürzlich erfolgte Studien darauf hindeuten, dass axonale Schäden bei MS in frühen Stadien der Krankheit beginnen und zur Behinderung beitragen (De Stefano et al., 2001).
Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) ist das am häufigsten verwendete Tiermodell für immunvermittelte Effekte bei MS. Studien in Meerschweinchen haben gezeigt, dass Linolsäure teilweise das Auftreten und die Schwere von EAE unterdrückt (Meade et al. (1978)). Narbige et al. ((1995), 1997b) zeigten einen krankheitsverändernden Effekt von Linolsäure und γ-Linolensäure an klinischen und histopathologischen Erscheinungsformen von EAE. In Abhängigkeit von der Dosis bot γ-Linolensäure einen völligen Schutz vor akuter Ratten-EAE, während Linolsäure einen dosisabhängigen Einfluss auf die klinische Schwere hatte, diese jedoch nicht beseitigte.
Trotz dieser Versuchsergebnisse ist zu konstatieren, dass die humane Erkrankung Multiple Sklerose hochgradig komplex ist und durch die Aktivität von T-Zellen und anderen Faktoren der Immunantwort sowohl verschlimmert wie auch gelindert werden kann. Basierend auf den Ergebnissen mit Linolsäure allein, wird angenommen, dass n-6-Fettsäuren Autoimmun- und Entzündungserkrankungen verstärken. Es wurde ex vivo gezeigt, dass die TGF-β1- und PGE₂-Produktion in Mäusen, die mit γ-Linolensäure gefüttert wurden, nicht-spezifisch erhöht war. Es wurde berichtet, dass TGF-β1 bei akuter und rückkehrender EAE schützt (Racke et al. (1993); Santambrogio et al. (1993)), und PG-Inhibitoren wie etwa Indomethacin zunehmen und so die Krankheit verstärken (Ovadia & Paterson (1982)).
Cytokine sind an der Pathogenese von MS beteiligt, und viele Studien zeigen einen Anstieg myelin-toxischer Entzündungscytokine (TNF-α, IL-1β und IFN-γ), der mit der Rückfallphase der Krankheit zusammenfällt. Umgekehrt scheint die Konzentration des Anti-Entzündungs- und immunsuppressiven Cytokins transformierender Wachstumsfaktor beta1 (TGF-β1) während einer Rückfallphase reduziert zu sein und anzusteigen, wenn der Patient in die Remissionsphase eintritt. Somit scheint das Gleichgewicht zwischen biologisch aktivem TGF-β1 und den pro-inflammatorischen TNF-α, IL-1β und IFN-γ während eines MS Rückfall-Remissions-Zyklus gestört zu sein.
Im Verlauf der natürlichen Erholungsphase von EAE inhibieren TGF-β1-sekretierende T-Zellen die EAE-Effektorzellen, TGF-β1 wird im ZNS exprimiert und TGF-β und PGE₂ werden bei oralem, Toleranz-induziertem Schutz vor EAE im Hirn exprimiert (Karpus & Swanborg (1991); Khoury et al. (1992)). Harbige (1998) schloss, dass die Effekte einer γ-Linolensäure-Ernährung auf EAE durch Th₃-artige Mechanismen, an denen TGF-β1 beteiligt ist, vermittelt werden, und möglicherweise durch die antioxidierende Aktivität von Superoxiddismutase.
Es konnte gezeigt werden, dass Borretschöl (typischerweise 20% bis 23% γ-Linolensäure und 34 bis 40% Linolsäure pro 100% Fettsäuregehalt) und Pilzöl von Mucor javanicus (siehe 1) im EAE-Tiermodell, das zur Identifierung von MS-Kandidaten verwendet wird, wirksam sind, jedoch konnte nie eine signifikante Wirksamkeit bei der humanen Erkrankung gezeigt werden. Hohe Konzentrationen an Linolsäure-reichem Öl, das geringe Konzentrationen an γ-Linolensäure aufweist (EPO: Linolsäure: γ-Linolensäure 7:1), unterdrückten teilweise das Auftreten und die Schwere von EAE in Ratten (Mertin & Stackpoole, 1978), während Bates' oben angeführte Naudicelle-Studie zur Verschlechterung bei den Patienten führte. Obwohl an Multipler Sklerose Leidenden Borretschöl und andere GLA/LA-enthaltende Öle wie etwa Nachtkerzenöl in den letzten etwa 30 Jahren verabreicht wurde, gelang es der überwiegenden Mehrheit der Patienten nicht, sich von der Krankheit zu erholen, es zeigte sich keine signifikante Verbesserung und die zugrundeliegende Krankheit schritt bis zum Tode fort.
Es wurde unter anderem vorgeschlagen, das γ-Linolensäure- und Linosäure-reiche Borretschöl als ein Mittel zur Immunsuppression bei Multipler Sklerose zu verwenden ( US 4,058,594 ). Es ist entscheidend, dass die darin vorgeschlagene Dosis 2,4 Gramm Öl pro Tag beträgt und kein tatsächlicher Beleg für die Wirksamkeit vorgelegt wurde. Dies ist deutlich geringer als die geringe 5 g/Tag-Dosis, die sich in der PCT/GB04/002089-Studie als unwirksam beim Menschen in vivo erwies.
Andere drastischere immunsuppressive Behandlungen, darunter T-Zell-reduzierende und -modulierende Substanzen wie etwa Cyclophosphamid, haben sich auch als im EAE-Modell wirksam herausgestellt, wenn diese jedoch bei der humanen Erkrankung Multiple Sklerose verwendet werden, verbessern sich zwar die Symptome, die zugrundeliegende Krankheit schreitet jedoch fort. Zwar produzieren T-Zellen im Menschen sowohl nützliche Cytokine wie etwa TGF-β1, aber auch schädliche. David Baker vom Institute of Neurology, Großbritannien, fasste das Missverhältnis zwischen dem, was bei EAE und was bei MS wirkt, mit der Veröffentlichung "Everything stops EAE, nothing stops MS" bei dem UK MS Frontiers-Treffen der britischen MS Society am 10. Mai 2004 zusammen.
Es ist klar, dass Immunsuppression alleine nicht MS heilen kann. Dies ist nahezu sicher auf eine zugrundeliegende fundamentale Stoffwechselstörung in MS-Patienten zurückzuführen, die zusammen mit der Autoimmunerkrankung zu Membranabnormalität, Cytokin-Fehlregulation und die darauf folgenden Immunattacken und Entstehung von Läsionen führt. Obwohl Patienten im Zuge einer Rückfall-Remissions-Erkrankung auch wieder in Remissions-Phasen kommen, schreitet die zugrundeliegende Demyelinierung fort.
Die "Maßstäbe setzende" Behandlung von MS besteht nach wie vor in Interferon, wie etwa mit β-Avonex^®, Rebif^® und anderen Interferon-Präparaten. Diese Maßstäbe setzende Behandlung erfüllt nur die Anforderungen von einigen, z.B. 30%, der Patienten und selbst bei diesen ist die Verbesserung der Symptome auf eine verringerte Schwere der Rückfälle beschränkt. Während die Symptome bei einem Teil der Patienten verringert werden können, schreitet die Krankheit gewöhnlich aufgrund der zugrundeliegenden Degenerierung zu weiterer Behinderung und zum Tode fort.
In ihrer bisher unveröffentlichten PCT/GB04/002089-Studie haben die Autoren der vorliegenden Erfindung überraschenderweise festgestellt, dass bei Einhaltung einer Behandlung mit "hohen Dosen" an Triglyzerid-Ölen, die eine hohe Konzentration an sn-2 γ-Linolensäure (> 40% der Reste in sn-2 Position sind γ-Linolensäure) zusammen mit einem passenden Fettsäuregehalt enthalten, ein bemerkenswerter Grad der Verbesserung nahezu aller Symptome von MS erreicht werden kann, wobei der Grad der bisherigen, den Maßstab setzenden Behandlung erheblich übertroffen wird. Ein solcher Erfolg überrascht insbesondere angesichts der erfolglosen bisherigen Verwendung anderer γ-Linolensäure-enthaltenden Präparate, wie etwa in der Naudicelle-Studie.
Die PCT/GB04/002089-Studie zeigt, dass über einen Zeitraum von 18 Monaten Patienten, die eine hohe Dosis (15 g/Tag) eines ausgewählten Borretschöls mit hohem sn-2 γ-Linolensäuregehalt nahmen, signifikante (p < 0,001) und merkliche Verbesserungen des EDSS-Wertes, eine reduzierte Rückfallrate, symptomatisches Nachlassen der Muskelspastizität und schmerzlicher sensorischer Symptome sowie verbesserte objektive Werte der kognitiven Funktionen zeigten. Geringe Dosen von 5 g/Tag dieses Borretschöls waren wirkungslos.
Patienten, die die höchste Dosis dieses Borretschöls nahmen, konnten ihre TGF-β1-Produktionsrate in peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) während des Untersuchungszeitraums aufrechterhalten, ihre pro-inflammatorischen Cytokine TNF-α und IL-1β waren signifikant und merklich (< 70%) reduziert und die langkettigen omega-6-Fettsäuren Dihomo-γ-Linolensäure (DHLA) und Arachidonsäure (AA) in den PBMC-Membranen blieben entweder konstant oder nahmen zu, im Gegensatz zu Patienten, die ein Placebo nahmen und die einen Verlust dieser Fettsäuren im Verlauf des Versuchszeitraums zeigten.
Während bei einer Immunsuppression zu erwarten wäre, dass die aktive Läsionsbildung und Neurodegeneration verringert wären, hat die Behandlung mit Öl mit hohem sn-2 GLA-Gehalt offenbar den Erhalt und/oder die Zunahme an Schlüsselmembranlipidkomponenten bewirkt, die andernfalls bei MS spezifisch verloren gehen, was mit einer Korrektur eines Stoffwechseldefekts übereinstimmt, welcher mit den derzeitigen Therapien nicht wirksam behandelt werden kann. Die Tatsache, dass die geringe Dosierung (5 Gramm/Tag) hierbei keinen Effekt zeigte, unterstützt eine solche Schlussfolgerung.
Es ist bekannt, dass γ-Linolensäure (18:3n-6, oder GLA) in vivo schnell in die längerkettigen, mehrfach ungesättigten omega-6-Fettsäuren Dihomo-γ-Linolensäure und Arachidonsäure umgewandelt wird (Phylactos et al. 1994, Harbige et al. 1995, 2000). Um zu bestimmten, wie die Konzentration von langkettigen omega-6-Fettsäuren in Membranen bei MS erhöht werden kann, überprüften die Erfinder daher ihre Ergebnisse, die mit mehreren GLA-enthaltenden Ölen erhalten wurden: sowohl Pilzöl (von Mucor javanicus) und Planzenöle (Borago officianalis, Nachtkerze Oenothera spp. oder schwarze Johannisbeere Ribes spp.) als auch ein synthetisches Tri-GLA-Öl als Systeme zur Bereitstellung von GLA in einem in vivo-Versuchstiermodell für MS, das als chronisch rückkehrende, experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (CREAE) bekannt ist.
Induktion von EAE in Ratten bewirkt jedoch nicht die histologischen Merkmale einer Demyelinierung (Brosnan et al. 1988), sondern induziert ein akutes monophasisches Krankheitsmuster, im Gegensatz zu MS, die durch ZNS-Demyelinierung charakterisiert ist und in der Mehrzahl der Fälle ein klinisches Rückfall-Remissions-Muster aufweist. Chronische Rückfall- und Demyelinierungs-EAE-Modelle (CREAE) zeichnen sich jedoch durch Demyelinierung und Rückfallphasen aus. Mit dem Nachweis, dass Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) ein wichtiges neuroantigenes Angriffsziel bei MS darstellt (Genain et al. 1999), und dem Nachweis weit stärkerer Reaktionen auto-reaktiver peripherer Blutlymphozyten auf dieses Neuroantigen im Vergleich zu MBP bei MS (Kerlero de Rosbo et al. 1993, 1997) wurde MOG-induzierte CREAE das Tiermodell der Wahl mit Merkmalen, die den bei MS beobachteten stark ähneln (Fazakerely et al. 1997, Genain et al. 1999, Amor et al. 1994).
Resultate aus CREAE- und Ratten-EAE-Fütterungsstudien der Erfinder zeigen, dass ein angereichertes Keimöl schwarzer Johannisbeeren (72 Gew.-% 18:3n-6, GLA) nicht vor EAE schützt (siehe Tabelle 3). Von Bedeutung ist dabei, dass das Keimöl schwarzer Johannisbeeren nur wenig sn-2 GLA aufweist und das meiste GLA in den sn-1 und sn-3 Positionen vorliegt (Lawson and Hughes 1988). Des weiteren bewirkte ein künstliches Triacylglyzerin, dass drei GLA-Reste aufweist (TG-GLA) schützende Effekte ähnlich denen des Borretschöls bei Verwendung bei CREAE (Tabelle 2). Dies würde mit einer wichtigen Rolle des sn-2 GLA zusammenpassen, d.h. das äußere Paar sn-1 und sn-3 GLA wird in vivo enzymatisch entfernt und vermutlich oxidiert, wodurch nur das sn-2 GLA zurück bleibt. Diese selektive Hydrolyse ergibt sich aus der bekannten Fähigkeit spezifischer Lipasen, die sn-1 und sn-3 Fettsäuren aus Triacylglyzerin-Molekülen zu entfernen, wobei die sn-2 Position in vivo offenbar geschützt ist (Lawson and Hughes 1988, Kyle 1990).
Diese Übersicht ließ die Erfinder postulieren, dass Glyzeride mit sn-2 γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-Linolensäure- oder Arachidonsäureresten bei der Korrektur des Stoffwechsels bei MS selbst dem Borretschöl mit hohem sn-2 γ-Linolensäuregehalt ihrer früheren Studien überlegen sein wird. Dies würde die Einnahme geringerer Dosen an Lipid erlauben und/oder möglicherweise den Behandlungszeitraum verringern, wodurch ein günstiger Effekt erzielt würde.
EP 0520624 (Efamol Holdings) vergleicht in Tabelle 3 den Triglyzeridgehalt von Nachtkerzen- und Borretschölen, wobei man erfährt, dass erstere wirksamer bei der Behandlung einer Auswahl von auf GLA-Gabe ansprechenden Funktionsstörungen sind als letzere. Dieses Dokument besagt, dass Borretschöl siebenundzwanzig verschiedene Triglyzeridkomponenten aufweist, wovon nur 20% sn-2 GLA aufweisen. Auf Seite 3, Zeilen 40-42 wird vermerkt, dass biologische Untersuchungen gezeigt haben, dass gleiche Mengen an GLA in der Tat sehr unterschiedliche Auswirkungen haben können, wenn das GLA aus verschiedenen Quellen stammt. Entscheidend ist, dass der Leser dann darauf hingewiesen wird, dass eine bestimmte Fraktion, die in Nachtkerzenöl (EPO), aber nicht in Borretschöl vorkommt, für die Überlegenheit des ersteren bei der Erhöhung von PGE1 verantwortlich ist (siehe EP 0520624 , Diagramm Seite 4 und Tabelle 2) und somit für die anti-inflammatorische Wirkung: Bei jener Fraktion handelt es sich um Di-linoyl-mono-γ-linolenyl-glyzerin (DLMG), von dem angegeben wird, dass es 18 bis 19% des gesamten Triglyzerids in EPO ausmacht. Entscheidend ist, dass Seite 6 deutlich darauf hinweist, dass die Position von GLA, ob in sn-1, 2 oder 3 Position, für diese Wirkung nicht wichtig ist.
Dines et al. (1994), Proceedings of the Physiological Society, Aberdeen Meeting 14.-16. September 1994, berichten über Studien zur Behandlung neuronaler Schäden bei diabetischer Neuropathie mit γ-Linolensäure enthaltenden Ölen der Art, wie sie von EP 0520624 vorgeschlagen werden, und bemerken erneut, dass Borretschöl im Gegensatz zu Nachtkerzenöl nicht sehr wirksam bei der Behandlung dieser Neurodegeneration war. Die Veröffentlichung schließt daraus, dass Borretschöl andere Bestandteile enthält, die die GLA-Aktivität stören.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung begannen nun, angesichts ihrer Ergebnisse mit Borretschöl mit hohem sn-2-γ-Linolensäuregehalt, zu zeigen, dass in der Tat das Vorliegen eines sn-2-γ-Linolensäure, Dihomo-γ-Linolensäure- oder Arachidonsäurerestes in einem Glyzerid, insbesondere einem Triglyzerid, für die Wirksamkeit bei der Behandlung von EAE, CREAE und der humanen Krankheit MS verantwortlich ist.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an einer neurodegenerativen Krankheit leidet, bereit, bestehend aus dem Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Dosis eines Lipidglyzerids definierter Struktur, das ein Glyzerinrest der mit einem oder mehreren Fettsäureresten verestert ist, aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid einen Fettsäurerest an der sn-2 Position aufweist, der aus der Gruppe von Resten ausgewählt ist bestehend aus Resten der γ-Linolensäure, Dihomo-γ-Linolensäure und Arachidonsäure.
Besonders günstig ist die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten, bei denen eine Demyelinierung auftritt. Das vorliegende Verfahren hält spezifisch die zugrundeliegende Neurodegeneration auf und stellt neuronale Funktionen wieder her. Insbesondere normalisiert das Verfahren die Zusammensetzung neuronaler Membranen und stellt ein gesundes Verhältnis an von PBMC spontan freigesetztem TGF-β1/TNF-α und die Verhältnisse von TGF-β1 mit anderen, von PBMC freigesetzten Cytokinen wieder her. Der wichtigste Vorteil des Verfahrens liegt darin, dass es die Neurodegeneration bei allen Arten Multipler Sklerose stoppt, insbesondere aber bei Rückkehr-Remissions-, primär progressiver und chronisch progressiver MS, sowie die teilweise oder vollständige Wiederherstellung neuronaler Funktion, wie sie etwa durch Kernspintomographie- oder Computertomographie- (MRI oder CAT) Aufnahmen oder über den EDSS-Wert gemessen werden. Solche Verfahren können auch bei der Behandlung cerebraler Beeinträchtigungen nach einem Schlaganfall, Schädeltrauma und interkranieller Blutung verwendet werden, wo eine Demyelinierung oder eine neuronale Schädigung vorliegt. Eine weitere Anwendung liegt in der Behandlung an derer chronischer Demyelinierungen, wie etwa bei Alzheimer- oder Parkinson-Erkrankungen.
Vorzugsweise wird das Lipid für eine Dauer und in einer Dosis verabreicht, die ausreicht, die TGF-β-Konzentration des Patienten auf therapeutischem Niveau aufrechtzuerhalten oder auf ein solches anzuheben. Unter therapeutischem Niveau werden Konzentrationen verstanden, die zumindest mit denen gesunder Subjekte übereinstimmen. Vorzugsweise ist die Dosis derart, dass ein TGF-β1/TNF-α-Verhältnis erzeugt wird, das spontan aus peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) freigesetzt und aus dem Blut eines Patienten isoliert wird, das nach 18 Monaten täglicher Dosierung bei 0,4 bis 3,0 liegt, zumindest 0,5 beträgt, vorzugsweise zumindest 0,75 und am meisten bevorzugt zumindest 1 beträgt. Vorzugsweise ist die Dosis derart, dass ein TGF-β1/IL-1β-Verhältnis im Blut eines Patienten nach 18 Monaten täglicher Dosierung von zumindest 0,5, vorzugsweise zumindest 0,75 und am meisten bevorzugt zumindest 1 erzeugt wird. Vorzugsweise werden diese Konzentrationen nach 12 Monaten und noch besser nach 6 Monaten erzielt.
Üblicherweise beträgt die Menge an täglich zu verabreichendem Lipid zwischen 0,5 und 30 Gramm, oral dosiert, bevorzugterweise zwischen 1 und 20 Gramm und am meisten bevorzugt zwischen 1 und 18 Gramm, üblicherweise 3 bis 5 Gramm.
Sollte die sn-2 Gruppe ein γ-Linolensäurerest sein, kann die Dosis näher am oberen Ende dieser Bereiche liegen, insbesondere wenn die sn-1 und sn-3 Gruppen relativ inert sind, z.B. Säuren, die im Stoffwechsel Verwendung finden wie etwa gesättigte Fettsäuren. Sollte die sn-2 Gruppe ein Dihomo-γ-linolensäurerest sein, kann die Dosis geringer sein, während im Fall, dass die sn-2 Gruppe ein Arachidonsäurerest ist, die Wirksamkeit höher liegt, die Dosierung aber auch aufgrund möglicher unerwünschter Nebeneffekte bei höheren Konzentrationen vorsichtiger erfolgen sollte.
Noch bevorzugter ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid ein Monoglyzerid, Diglyzerid oder Triglyzerid ist, das zumindest eine sn-2 γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-linolensäure- oder Arachidonsäuregruppe der allgemeinen Formel I enthält:
Formel I wobei R¹ und R³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff und Acylgruppen, und R² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-linolensäure- und Arachidonsäureresten.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung werden Acylgruppen definiert als zumindest eine Carbonylgruppe am Ende einer wahlweise substituierten Kohlenwasserstoffkette, die aus Alkyl- und Alkenylketten ausgewählt ist, enthaltend, wobei die Carbonylgruppe über ihren Kohlenstoff direkt an den Sauerstoff des in Formel I gezeigten Glyzerinrests gebunden ist.
Bevorzugte Acylgruppen R¹ und R³ sind gesättigte Fettsäurereste der Formel -CO-(CH₂)_n-CH₃, wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 22 ist, bevorzugterweise 4 bis 16, noch bevorzugter von 5 bis 12, am meisten bevorzugt von 6 bis 10. Besonders bevorzugte Acylgruppen sind die der Capryl- und Caprinsäuren, insbesondere 1,3-Dicapryl- oder 1,3-Dicapringlyzerin mit γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-linolensäure- oder Arachidonsäurerest in der sn-2 Position.
Triglyzeride sind bevorzugte Glyzeride für die Verwendung in der Erfindung.
US 4 701 469 beschreibt die Verwendung als Nahrungsergänzungsmittel von einigen möglichen Triglyzeriden, die die Autoren der vorliegenden Erfindung als für die Verwendung im Verfahren der Erfindung bestimmt haben, jedoch beschreibt es ausdrücklich nur 1,3-Dioctanyltriglyzeride, wobei die sn-2 Säure EFA ist, und nur die Herstellung von 1,3-Dioctanoylicosapentaglyzerin wird beschrieben. Diese werden als nützlich unter anderem bei der Immunmodulation beschrieben, aber obwohl eine Anzahl an Krankheiten genannt werden, ist die Verwendung zur Immunsuppression bei Neurodegeneration und MS nicht aufgeführt.
Während die am meisten bevorzugten Gruppen R¹ und R³ für den Einbau in die Verbindung der Formel I einfache gesättigte Fettsäuren oder natürlich vorkommende Fettsäuren mit einer strukturellen oder Stoffwechselfunktion sind, wie etwa mittellange oder langkettige Fettsäuren, gibt es weitere Möglichkeiten. Besonders bevorzugte Fettsäuren sind die, welche in erster Linie im Stoffwechsel zur Erzeugung von Energie verwendet werden. Sollte es sich um strukturelle Fettsäuren handeln, das heißt solche, die in Membranen vorliegen, sind dies passenderweise solche wie γ-Linolensäure-, Linolsäure-, Dihomo-γ-linolensäure- und Arachidonsäurereste. Unter Rest wird die Gruppe verstanden, die nach der Veresterung der Fettsäurecarboxylgruppe mit einer der Hydroxylgruppen des Glyzerinmoleküls übrig bleibt.
Weitere bevorzugte Säuren für sn-1 und sn-3 sind aus den Fettsäuren ausgewählt, die im Menschen metabolisiert werden um Energie zu erzeugen, im Gegensatz zu einer Fettsäure, die in erster Linie in den strukturellen Membranpool übergeführt wird; solche bevorzugte Säuren umfassen Ölsäure und Palmitinsäure.
Wenn die sn-1 und sn-3 Fettsäurekette (R¹ und R³) ungesättigt ist, können es auch andere essentielle Fettsäuren sein, wie etwa die n-3-Säuren wie etwa Stearidonsäure, Icosapentaensäure und Docosahexaensäure. Wenn die Fettsäure wahlweise substituiert ist, sind sie dies bevorzugterweise mit Hydroxyl-, Oxo-, Carboxyl-, Alkyl-, Alkenyl- und Alkoxygruppen. Die Kohlenwasserstoffkette ist bevorzugterweise von einer Länge von 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, weiter bevorzugt von einer Länge von 4 bis 28 Kohlenstoffatomen, noch weiter bevorzugt von einer Länge von 4 bis 24 Kohlenstoffatomen. Am meisten bevorzugt ist eine Kohlenwasserstoffkette einer Fettsäure, insbesondere einer mono- oder polyungesättigten Fettsäure.
Viele der bevorzugten Lipide zur Verwendung im Verfahren der Erfindung sind bekannt und können nach einem auf dem Gebiet bekannten chemischen Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel sind viele im Handel erhältlich, wie etwa Trigammalinolenin, bekannt als TLG, hier jedoch als GGG bezeichnet, was die Identität der Gruppen R¹R²R³ widerspiegelt, wobei G γ-Linolensäurereste darstellt.
GGG ist von Nu-Check-Pre Inc. erhältlich. EP 0 300 844 beschreibt seine Synthese unter Verwendung einer Base-katalysierten Umesterung von Triacetin mit Methylgammalinolenat, wobei ein Gemisch aus 80% GGG, unreagiertem Methyl-γ-linolenat und 10% Mono- und Diglyzeriden erhalten wird.
Triarachidin ist bekannt und in geringen Mengen im Handel, zum Beispiel von Sigma, erhältlich. AAA wurde aus Arachidonsäure unter Verwendung immobilisierter Lipase synthetisiert die für Angiogenese-verstärkende Aktivität patentiert ist, US 4 888 324 .
Während die Tri- und Di-γ-linolensäure-, -dihomo-γ-linolensäure- oder -arachidonsäure-di- oder -triglyzeride verwendet werden können, bevorzugen die Autoren der vorliegenden Erfindung die Verwendung der Mono-γ-linolensäure-, -dihomo-γ-linolensäure- oder -arachidonsäure-sn-2-estertriglyzeride, weil diese weniger von der immunmodulatorischen und pro-inflammatorischen Fettsäuren γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure oder Arachidonsäure bereitstellen, während die erhöhte Aktivität erhalten bleibt, die der sn-2 γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-linolensäure- oder Arachidonsäurerest bezüglich der erwünschten Membrannormalisierung und der Krankheits-modifizierenden Wirkung aufweist.
Neue bevorzugte Lipide sind über Prozesse und Verfahren, wie sie in den Beispielen hier vorgestellt sind, erhältlich. Die meisten bevorzugten Lipide weisen bloß einen einzigen γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-linolensäure oder Arachidonsäurerest, der mit dem Glyzerin in sn-2 Position verestert ist, auf, wobei die flankierenden sn-1 und sn-3 Säuren ungesättigte mittellange oder langkettige Säuren sind.
Dementsprechend liegt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung hier offenbarter neuer Lipide, umfassend Verbindungen der Formel II
wobei R¹ und R³ gleich und -C(O)(CH₂)_nCH₃ sind, wobei n zwischen 4 und 14 liegt, bevorzugterweise 6 bis 10 und am meisten bevorzugt 7, 8 oder 9 und R² ausgewählt ist aus γ-Linolenyl, Dihomo-γ-linolenyl und Arachidonyl.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Synthese einer Verbindung der allgemeinen Formel III
wobei R¹ und R³ gleich und -C(O)(CH₂)_nCH₃ sind, wobei n zwischen 4 und 14 liegt, bevorzugterweise 6 bis 10 und am meisten bevorzugt 7, 8 oder 9 ist und R² ein γ-Linolenylrest, Dihomo-γ-linolenylrest oder Arachidonylrest ist,
umfassend
die Reaktion von 1,3-Dihydroxyaceton mit einer Verbindung der Formel X-C(O)(CH₂)_nCH₃, wobei X ausgewählt ist aus Cl, Br und I,
wobei die entsprechende 1,3-Di-(C(O)(CH₂)_nCH₃)-2-keto-Verbindung erhalten wird, die Reduktion der Ketogruppe zum entsprechenden 1,3-Di-(C(O)(CH₂)_nCH₃)-2-ol,
und die Reaktion dessen mit γ-Linolenylchlorid oder Dihomo-γ-linolenylchlorid oder Arachidonylchlorid.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Synthese einer Verbindung der allgemeinen Formel IV
wobei R¹ bis R³ gleich sind und ausgewählt aus γ-Linolenylrest, Dihomo-γ-linolenylrest oder Arachidonylrest,
umfassend die Reaktion des entsprechenden γ-Linolenylchlorids, Dihomo-γ-linolenylchlorids oder Arachidonylchlorids mit Glyzerin.
Die Synthese einiger dieser Verbindungen ist nachstehend beschrieben und die Reaktionsschemata sind in den nachstehenden Figuren gezeigt.
Zum Beispiel kann eine Einschritt-Veresterung von Glyzerin unter Verwendung von GLA und einem Kopplungsmittel wie etwa die Kopplungsreagenzien DCCI/DMAP (1,1-Dicyclohexylcarbodiimid/4-Dimethylaminopyridin) durchgeführt werden. Dieses Verfahren weist eine gute Ausbeute auf, erzeugt jedoch Verunreinigungen, die, wenn sie nicht entfernt werden, das Öl am Schluss trüben. Dies kann umgangen werden durch Verwendung eines Kopplungsmittels wie etwa EDCI (1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid), das wasserlösliche Nebenprodukte entstehen lässt, die einfacher zu entfernen sind. Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 05310638 A2 , 22. November 1993, Heisei, Seite 6 ff., beschreibt die Herstellung von Tri-α-linolenin (LnLnLn, wobei Ln Linolsäure ist) unter Verwendung von DCCI, wie auch analoge aber verschiedene Reaktionen.
Ein alternativer Ansatz besteht in einer Zweischritt-Folge, die die Reaktion von GLA-Cl (hergestellt aus γ-Linolensäure und Oxalylchlorid) und Glyzerin in Dichlormethan/Pyridin verwendet, mit guten Ausbeuten bei einem vergrößerten Maßstab von 250 g, säulenchromatographisch gereinigt. Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 04328199 A2 , 17. November 1992, Heisei, Seite 5 ff., (Japan) Concentration of a-linolenic acid triglyceride by flash cromatography. Ando, Yukiki, Watanebe, Yoichi, Tagagi, Yoshiaki (Nisshin Oil Mills Ltd., Japan) beschreiben eine verwandte aber unterschiedliche Technik zur Reinigung von Tri-α-linolenin (LnLnLn).
Das Vergleichsbeispiel Tricaprin (Glyzerintridecanoat) ist eine bekannte Verbindung, die von Sigma erhältlich ist. Sie wurde durch Reaktion von Methyldecanoat und Natriumglyzeroxid mit anschließender Reinigung des Rohprodukts mittels Säulenchromatographie hergestellt (siehe E. S. Lutton und A. J. Fehl, Lipids, 5, 90-99 (1970)).
Ein alternatives Verfahren umfasst die Säure-katalysierte Reaktion von Glyzerin mit Decansäure, gefolgt von vier Kristallisationen (siehe L. H. Jenson und A. J. Mabis, Acta Cryst., 21, 770 (1966)).
Der Anmelder stellt außerdem ein verbessertes Verfahren vor, bei dem Glyzerin mit mehr als 3 Äquivalenten von Decanoylchlorid reagieren kann und das Tricaprin-Produkt mittels Umkristallisierung gereinigt wird.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung bestehen in der Verwendung der oben beschriebenen Triglyzeridöle zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung neurodegenerativer Krankheiten, wie sie für das Verfahren der Erfindung dargelegt sind. Besonders bevorzugte Medikamente dienen dem Anhalten und der Umkehrung der Neurodegeneration bei Multipler Sklerose aller Arten, insbesondere jedoch von Rückkehr-Remissions-, primär progressiver und chronisch progressiver MS und der teilweisen oder vollständigen Wiederherstellung der neuronalen Integrität/Funktion, wie sie zum Beispiel mittels MRI- oder CAT-Aufnahmen oder über den EDSS-Wert gemessen wird. Andere Krankheiten, die auf TGF-β1-Gabe reagieren, können wie zuvor dargelegt behandelt werden.
Die Lipide für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können über jedes in der Pharmazie bekannte konventionelle Vehikel verabreicht werden. Am einfachsten werden sie als reine Öle oder als Beimengung in Nahrungsmitteln, in Form von Kapseln, die solche Öle enthalten, oder in enterisch beschichten Formen verabreicht.
Weitere Verabreichungsformen sind dem Fachmann geläufig, siehe auch Remington Pharmaceutical Sciences, 19. Ausgabe.
Der Fachmann wird realisieren, dass andere nützliche Mittel mit den Lipiden zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kombiniert werden können oder in anderer Form Teil eines Behandlungsplans mit den Lipiden sein können. Dabei kann es sich um Ionenkanalblocker, z.B. Natriumkanalblocker, Interferone (α, β oder γ), T-Zell-abreichernde Mittel, Steroide oder andere palliative Mittel handeln. Man wird außerdem erkennen, dass bei der Modulierung von Immun- und Enzündungsreaktionen solche Kombinationen aufgrund der Komplexität dieser Systeme mit Vorsicht durchzuführen sind. In Anbetracht der verzögerten Reaktion auf die hier vorgestellten Öle können kürzer wirkende Wirkstoffe in den ersten Monaten der Behandlung nützlich sein, bevor die TFG-β1-Konzentrationen normalisiert sind, solange die zusätzliche Behandlung diesen Normalisierungsprozess nicht beeinträchtigt.
Die Synthese künstlicher Lipide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist nachstehend zusammen mit der Synthese von Vergleichsbeispielen beschrieben. Einige dieser Lipide sind neu, während andere bekannt sind, jedoch nicht für eine Behandlung gemäß der Erfindung verwendet wurden.
Die vorliegende Erfindung wird nun an Hand von Beispielen unter Bezugnahme auf die folgenden, nicht eingrenzenden Tabellen, Beispiele und Figuren beschrieben. Weitere Ausführungsformen, die in den Bereich der Erfindung fallen, werden dem Fachmann im Lichte dieser in den Sinn kommen.
TABELLEN
Tabelle 1: Zeigt die prozentuale Zusammensetzung des Gesamtfettsäuregehalts verschiedener Triglyzeridöle und die Schutzwirkung bei EAE.
Tabelle 2: Zeigt die Parameter der drei Behandlungsgruppen der in PCT/GB04/ 002089 beschriebenen Studie mit Borretschöl mit hohem sn-2 GLA-Gehalt.
Tabelle 3: Zeigt die Wirkung verschiedener Formen von GLA auf das Auftreten von EAE und den "clinical score" in SJL-Mäusen: ein geringerer Wert weist auf eine verbesserte therapeutische Wirkung hin.
Tabelle 4: Zeigt, dass angereichertes Öl schwarzer Johannisbeeren, ein Pflanzenöl mit hohem GLA-Gehalt, aber geringem sn-2 GLA-Gehalt, Pilz- und Borretschölen bei EAE nicht gleich kommt.
FIGUREN
1: Zeigt die spontane Cytokinproduktion peripherer mononuklearer Blutzellen menschlicher MS-Patienten, die 18 Monate mit Placebo und dem Versuchsöl nach PCT/GB04/002089 mit hohem sn-2 γ-Linolensäuregehalt behandelt wurden.
2: Zeigt die Wirkung von Placebo und gering dosiertem (5 g/Tag) Borretschöl mit hohem sn-2 GLA-Gehalt auf den EDSS-Wert menschlicher MS-Patienten im Vergleich mit hoch dosiertem (15 g/Tag), dargestellt als Histogramm mit Behandlungsmonaten auf der x-Achse.
3: Zeigt die Wirkung von Placebo, gering dosiertem und hoch dosiertem Borretschöl mit hohem sn-2 GLA-Gehalt auf die mittlere Rückfallrate (%) bei menschlichen MS-Patienten als Histogramm mit Monaten auf der x-Achse.
4: Zeigt das Reaktionsschema für die Synthese eines Triacylglyzerids einer einzigen Fettsäure für die Verwendung in dem Verfahren und die Verwendung dieser Erfindung.
5: Zeigt das Reaktionsschema für die Synthese der Kontrollverbindung Tricaprin.
6: Zeigt das Reaktionsschema für die Synthese von CGC, einem gemischten Fettsäuretriacylglyzerid der Erfindung.
7: Zeigt das Reaktionsschema für die Synthese von C-DHGLA-C, einem gemischten Fettsäuretriacylglyzerid der Erfindung.
8: Zeigt das Reaktionsschema für die Synthese der Kontrollverbindung GCG, 1,3-Dicapryl-2-γ-linolensäure.
9: Zeigt das Reaktionsschema für die Synthese von C-AA-C, einem gemischten Fettsäuretriacylglyzerid der Erfindung.
10 bis 19 zeigen die Ergebnisse von EAE-Studien in SJL- und C57BL-Mäusen, wie in den nachstehenden Beispielen dargelegt. (DHLA=DHGLA: A=AA).
BEISPIELE
Studie mit Borretschöl mit hohem sn-2 Gehalt (PGT/GB04/002089)
Achtundzwanzig Patienten (im Alter von 18 bis 65 Jahren) mit aktiver Rückfall-Remissions-Multipler Sklerose (zwei Rückfälle in den zurückliegenden 18 Monaten) nahmen an einer Placebo-kontrollierten Doppelblindstudie teil, um die Wirkungen von Borretschöl in Kapseln auf klinische Aktivität und Laborwerte über 18 Monate zu untersuchen. Dieses Öl wies einen hohen sn-2 γ-Linolensäure (GLA)-Gehalt (> 40% der sn-2 Reste sind γ-Linolensäure) mit geringem Monoengehalt (z.B. Erucasäure) auf, dem kein Vitamin E, ein bekannter Immunmodulator, zugesetzt wurde.
Die Patienten stammten aus ambulanten neurologischen Kliniken zweier innerstädtischer Krankenhäuser; die Einverständniserklärung wurde beim ersten Besuch (Basisdatum) im Krankenhaus erhalten. Die Ausschlusskriterien umfassen jede Form von Behandlung mit Steroiden oder immununterdrückenden Medikamenten, Schwangerschaft, Hyperlipidämie, regelmäßige Benutzung von Aspirin oder verwandten Medikamenten und Vitamin- oder Fettsäure-Nahrungsergänzungsmitteln innerhalb der letzten drei Monate.
Nur Patienten, die alle folgenden Kriterien erfüllen, wurden in den Versuch aufgenommen: (a) fähig, ihre Einverständniserklärung vor der Behandlung zu erteilen bei völligem Verständnis, dass das Einverständnis jederzeit unbeschadet zurückgezogen werden kann; (b) männliche oder weibliche ambulante Patienten im Alter zwischen einschließlich 18 und 60 Jahren; (c) mit bestätigter Diagnose einer klinisch festgestellten rückkehrenden MS; (d) mit zumindest drei dokumentierten klinischen Rückfällen in den letzten zwei Jahren; (e) mit einem Basis-EDSS-Wert (erweiterte Behinderungsskala) von einschließlich 0,0 bis 5,5, vorausgesetzt gut dokumentierte Verschlechterungen lagen vor; und (f) gesund, abgesehen von den MS-abhängigen Symptomen, bestätigt durch die Krankengeschichte, ärztliche Untersuchung und klinisch-chemische, Urin- und Hämatologietests.
Die Patienten wurden zufällig durch die Pharmazieabteilung einer der drei Gruppen zugeteilt, die jeweils 12 Patienten enthalten:

• Erste klinische Gruppe (n = 12), die Placebo erhielt (5 g Polyethylenglykol 400);
• Zweite klinische Gruppe (n = 12), die gering dosiertes (5 g) raffiniertes Borago officinalis-Öl erhielt;
• Dritte klinische Gruppe (n = 12), die hoch dosiertes (15 g) raffiniertes Borago officinalis-Öl erhielt.

Die Nahrungsergänzung erfolgte in Form einer täglichen Einnahme von Kapseln mit 1 g Öl (5/Tag bei geringer Dosis, 15/Tag bei hoher Dosis) für eine Dauer von 18 Monaten. Borago officinalis-Öl und mehrfach ungesättigte Omega-6-Fettsäuren gelten naten. Borago offcinalis-Öl und mehrfach ungesättigte omega-6-Fettsäuren gelten als Nahrungsbestandteile, die im Allgemeinen als sicher für den menschlichen Verzehr (GRAS) gelten. Es gibt kleine Klassifizierungs- oder Etikettierungsvorschriften nach EG-Richtlinien. Die klinische Auswertung umfasste: erweiterte Behinderungsskalenwerte (EDSS) und klinische Rückfallberichte. Für Laboruntersuchungen wurde im 1., 3., 6., 12., 15. und 18. Monat der Nahrungsergänzung venöses Blut (50 ml) entnommen.
Die folgenden biochemischen und immunologischen Parameter wurden bei jedem Besuch untersucht, um sie mit den Daten vor der Behandlung und zwischen den Gruppen zu vergleichen:

• Stimulierte und nicht stimulierte ex vivo-Cytokin-Produktion der peripheren mononuklearen Blutzellen: Änderungen bei TFG-β1, IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6 und IFN-β, die bei der Pathogenese von MS beteiligt sind. Expression von Cytokin- und verwandten Genen.
• Lösliche Adhäsionsmoleküle im Serum, insbesondere ICAM-1 und VCAM-1.
• Membranfettsäuren der peripheren mononuklearen Blutzellen und Zusammensetzung der Phospholipidfettsäuren im Blutplasma.

Die Ergebnisse sind in Tabellen 1 und 2 und 1 bis 5 aufgeführt.
Primärer Ergebnisparameter war die Anzahl klinischer Rückfälle zwischen Basisdatum (Monat 0) und dem Ende der Behandlung (Monat 18). Die sekundären Ergebnisparameter umfassten: die Zeit bis zum ersten klinischen Rückfall; die Schwere der Rückfälle, gemessen anhand des EDSS-Werts und der Behandlung mit Steroiden; und Änderungen des EDSS-Werts in den Monaten 3, 6, 9, 12 und 18 im Vergleich zum Basisdatum und definiert als ein Anstieg des EDSS-Werts von zumindest 1,0 Punkten, der über drei Monate aufrechterhalten wurde, oder ein Anstieg des EDSS-Werts im Vergleich zum Basis-EDSS-Wert von zumindest 1,5 Punkten, der über drei Monate aufrechterhalten wurde.
Elf Patienten befanden sich in der Placebogruppe, sieben Patienten nahmen gering dosiertes Borretschöl, und zehn Patienten nahmen hoch dosiertes Borretschöl ein. Das Medikament der Studie wurde gut angenommen und es gab keine ernsthaften negativen Ereignisse während des 18-monatigen Versuchs.
Isolierung und Kultivierung von PBMC
Heparinisiertes Gesamtblut wurde mit dem gleichen Volumen an Hanks' gepufferter Salzlösung (Sigma, Großbrittanien) verdünnt und das erhaltene verdünnte Blut auf Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norwegen) aufgetragen. Im Anschluss an eine Dichtezentrifugation bei 800 g für 30 Minuten wurden die PBMC aus der Grenzschicht entfernt und in Hanks-Lösung verdünnt. Die Zellen wurden dann zweimal mittels Zentrifugation für 10 Minuten bei 250 g gewaschen. Das am Schluss erhaltene Pellet wurde dann in Kulturmedium resuspendiert, das aus RPMI-1640-Medium (Sigma, Großbrittanien), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U Penicillin und 100 μg Streptomycin (Sigma, Großbrittanien) und 10% autologem Blutplasma, besteht. 2 × 10⁶ pro ml PBMC, wovon > 95% am Leben waren, beurteilt mittels Trypan-Blau-Ausschluss, wurden in Gewebekulturröhrchen (Bibby Sterilin Ltd., Stone, Großbrittanien) gegeben und für 24 Stunden bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert. Die Konzentration an Antigen, die Zelldichte und Kulturdauer wurden allesamt in früheren kinetischen Versuchen zur Bestimmung der maximalen Cytokin-Produktion bestimmt (nicht gezeigt). Routinemäßige Cytospin-Präparationen wurden auch für nachfolgende Differential-Blutbilder angefertigt. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Zellen aus der Kultur durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 250 g entfernt, die erhaltenen Überstände entfernt, aliquotiert und bei –70°C aufbewahrt.
Präparation der Blutplasmaproben
10 ml heparinisiertes Blut wurde für 10 Minuten bei 250 g zentrifugiert. Die erhaltene Blutplasmaschicht wurde entfernt, aliquotiert und bei –70°C aufbewahrt.
Nachweis pro-inflammatorischer Cytokine
TNF-α, IL-1β und IFN-γ in Zellkulturüberständen und Blutplasma wurden unter Verwendung im Handel erhältlicher gepaarter Antikörper, die den Cytokinnachweis im ELISA-Format ermöglichen (R&D Systems Ltd., Abingdon, Großbrittanien) nachgewiesen. Die Nachweisbereiche der TNF-α- und IFN-γ-ELISAs betrugen 15,6 bis 1000 pg/ml und 3,9 bis 250 pg/ml für IL-1β.
Nachweis des biologisch aktiven TGF-β1
Das biologisch aktive TGF-β1 in Zellkulturüberständen und Blutplasma wurde unter Verwendung des im Handel erhältlichen E_max-ELISA-Systems mit Nachweisgrenzen von 15,6 bis 1000 pg/ml (Promega, Southampton, Großbrittanien) nachgewiesen.
Statistische Analyse
Unterschiede in der Cytokin-Produktion wurden unter Verwendung des Student's t-Test und Mann-Whitney U-Tests verglichen und als signifikant gewertet, wenn die p-Werte weniger als 0,05 betrugen.
ERGEBNISSE
Zwei Patienten entwickelten Diarrhöe, in beiden Fällen wurde später bestätigt, dass sie hoch dosiertes Borretschöl einnahmen. Die Diarrhöe eines Patienten war mild, beim zweiten Patienten jedoch von mittlere Schwere, dieser beendete später die Einnahme des Studienmedikaments. Die Codierung wurde nicht aufgehoben, und die Diarrhöe endete nach dem Absetzen des Medikaments, trat jedoch bei Wiedereinnahme erneut auf. Daher wurde dieser Patient aus der Studie genommen. Die übrigen Patienten, die mit hoch dosiertem Borretschöl behandelt wurden, zeigten eine ausgezeichnete klinische Verbesserung aller primären und sekundären Ergebniskrite rien. Zum Beispiel verbesserte sich der mittlere EDSS-Wert nach 6 Monaten Behandlung im Vergleich zum Basis-EDSS-Wert (1). Wichtiger war, dass die mittlere Anzahl klinischer Rückfälle nach 6 Monaten Behandlung im Vergleich zur Anzahl der Rückfälle in der Placebogruppe signifikant reduziert war (2). Im Gegensatz dazu zeigten Patienten, die gering dosiertes Borretschöl erhielten, keinerlei klinische Verbesserung im Vergleich zur Placebogruppe. Zusätzlich zum günstigen Effekt auf die Aktivität der MS-Erkrankung bewirkte hoch dosiertes Borretschöl eine symptomatische Erleichterung der Muskelspastizität (Starrheit) und schmerzhafter sensorischer Symptome und auch eine Verbesserung kognitiver Funktionen.
Wie in den nachstehenden Figuren zu sehen ist, fiel die Rückfallrate nach 9, 12 und 18 Monaten auf Null in der Gruppe mit hoher Dosierung. Die Zunahme nach 15 Monaten beruhte auf einem Patienten, der aus dieser Gruppe herausfiel.
Im Folgenden sind drei kurze Krankengeschichten aufgeführt, um die therapeutischen Vorzüge von hoch dosiertem Borretschöl mit hohem sn-2 GLA-Gehalt zu illustrieren. Die ersten beiden stammen aus der Studie, während die dritte von einem Patienten stammt, der nach der Studie behandelt wurde und für den MRI-Ergebnisse gewonnen wurden.
Patient 1 (Behandlung):
Der erste Patient war eine 48-jährige Frau mit klinisch aktiver Rückfall-Remissions-MS seit 9 Jahren. Sie arbeitete ursprünglich Vollzeit in der Verwaltung des lokalen Gesundheitsamts, war jedoch aufgrund ihrer schweren MS nicht mehr in der Lage, ihre Pflichten zu erfüllen. Sie arbeitete daher später als Teilzeit-Sekretärin, hatte jedoch aufgrund von Muskelstarre und sensorischer Störungen immer noch Schwierigkeiten, sich zu bewegen. Sie erlitt auch schwere klinische Rückfälle, die im Mittel einmal alle neun Monate auftraten. Die meisten dieser Rückfälle erforderten eine Krankenhauseinweisung zur Steroid-Therapie. Angesichts ihrer aktiven MS nahm sie an der Borretschöl-Studie teil. Es gab keine mit der Studie in Zusammenhang ste henden, nachteiligen Ereignisse, und nach einer Einnahme des Medikaments über vier Monate verbesserte sich ihre Gehfähigkeit und sensorischen Symptome.
Ungefähr neun Monate nach der Behandlung ging es ihr gut genug, um eine Vollzeitstellung anzunehmen. Außerdem blieb sie während der 18-monatigen Dauer des klinischen Versuchs rückfallfrei. Im Anschluss an die Beendigung des Versuchs zeigte die Behandlungscodierung, dass sie hoch-dosiertes Borretschöl nahm.
Patient 2 (Kontrolle):
Der zweite Fall beschreibt eine 46-jährige Frau, die ebenfalls eine klinisch aktive Rückfalls-Remissions-MS seit 8 Jahren hatte. Sie arbeitete ursprünglich als Verkäuferin, wurde jedoch nach der Diagnose von MS arbeitslos.
Ihre Symptome umfassten Schwierigkeiten bei der Bewegung und schmerzhafte sensorische Symptome in beiden Beinen. Sie hatte drei klinische Rückfälle in den zwei Jahren vor der klinischen Studie und wurde zweimal zur Steroid-Therapie ins Krankenhaus eingewiesen. Daher nahm sie an der Borretschöl-Studie teil, ihre Gehfähigkeit verschlechterte sich jedoch weiter. Nach den ersten sechs Monaten des Versuchs benötigte sie einen Gehstock und wurde auch mit Baclofen behandelt, um die Spastizität der unteren Gliedmaßen zu verringern. Ungefähr zehn Monate nach Beginn der Borretschöl-Studie wurde sie aufgrund eines schweren klinischen Rückfalls, der mit Steroiden behandelt werden musste, ins Krankenhaus eingewiesen. Sie entwickelte später Blasenstörungen und begann damit, für lange Strecken einen Rollstuhl zu benutzen. Nach Beendigung der 18-monatigen Studie wurde die Behandlungscodierung aufgehoben, und es wurde festgestellt, dass sie Placebo nahm. Seither begann sie damit, einen Gehwagen für Strecken zu benutzen, die mehr als 45 Meter (50 Yards) betragen.
Patient 3: Behandlung (außerhalb des Versuchs)
Der dritte Fall beschreibt einen 26-jährigen Mann, der im April 2001 mit eindeutiger MS diagnostiziert wurde. Seine Symptome begannen 1999, als er diffuse, nicht-lokalisierbare Schmerzen in verschiedenen Teilen seines Körpers beklagte, insbesondere in der linken Seite der Brust und im Magen. Darauf folgte eine periodische Taubheit der Hände und Füße, verbunden mit fluktuierender Schwäche. Es traten auch peinliche Blasensymptome bezüglich Urinierhäufigkeit und -dringlichkeit auf. Die MS-Diagnose im Jahr 2001 basierte auf seinen Rückfall-Remissions-Symptomen und wurde durch eine positive Analyse der Cerebrospinal-Flüssigkeit und Kernspintomographie (MRI) des Gehirns bestätigt, wobei sich multiple Abnormalitäten der weißen Substanz in beiden Hirnhälften zeigten. Die Symptome zeigten keine Reaktion auf verschiedene pharmazeutische Therapien.
Im April 2003 begann die orale Nahrungsergänzung mit dem hier beschriebenen, hoch-dosierten Borretschöl. Der Patient berichtete eine dramatische Verbesserung seiner Symptome binnen drei Monaten nach Beginn dieser oralen Nahrungsergänzung. Seine schmerzhaften sensorischen Symptome verschwanden vollständig. Er berichtete über keinerlei Taubheit oder Schwäche ab Mai 2003 und bemerkte eine signifikante Verbesserung seiner Blasenkontrolle. Die orale Nahrungsergänzung verursachte keine negativen Ereignisse. Eine erneute Gehirn-MRI wurde durchgeführt, um die berichtete Verbesserung in Herrn N's Symptomen zu verifizieren. Die erneute MRI zeigte eine Reduktion der Größe und Verteilung der Abnormalitäten der weißen Substanz.
BEISPIELE. Künstliche sn-2 Lipide
In allen nachstehenden Beispielen wird eine höhere Reinheit dadurch erhalten, dass die Ausgangsmaterialien γ-Linolen-, Dihomo-γ-linolen- oder Arachidonsäure höherer Reinheit verwendet wurden, wie sie z.B. von Sigma Aldrich erhältlich sind. GLA95 bedeutet 95% reine γ-Linolensäure.
Synthesebeispiel 1: Synthese von Trigammalinolenin
1) Säurechlorid-Verfahren
2,0 g (7,2 mmol, 3,1 Äquiv.) GLA95 (95% reine γ-Linolensäure) wurden in 10 ml DCM gelöst. 1,01 g (0,71 ml, 8,0 mmol, 3,4 Äquiv.) Oxalylchlorid in 5 ml DCM wurde in 2-3 min tropfenweise unter Stickstoff zugegeben. Es wurde bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen. Dieses Säurechlorid wurde dann tropfenweise in 2-3 min zu einer gerührten Mischung aus 215 mg (2,3 mmol, 1 Äquiv.) Glyzerin, 0,58 ml (3,1 Äquiv.) Pyridin und 10 ml DCM unter Stickstoff zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Das gebildete Pyridinhydrochlorid wurde dann abfiltriert und mit DCM gewaschen. Die Lösung wurde mit 1 × 4 ml Wasser, 0,1N HCl, 5% Natriumhydrogencarbonat und 5% NaCl gewaschen. Es wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zu einem gelben Öl aufkonzentriert. Dieses Öl wurde auf einer Silicasäule unter Verwendung von 10% Ether in Hexan als Elutionsmittel gereinigt. Ein klares farbloses Öl wurde erhalten, von dem eine Probe umgeestert und anschließend mittels GC analysiert wurde. Das Produkt enthielt 96,3% GLA.
2) DCCI-Verfahren
2,19 g GLA95 (3,15 Äquiv.), 230 mg (1 Äquiv.) Glyzerin, 153 mg DMAP (0,5 Äquiv.) wurden in 10 ml DCM unter Stickstoff gerührt. 1,85 g DCCI (3,6 Äquiv.) in 5 ml DCM wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das entstandene DCU wurde abfiltriert und mit DCM gewaschen. DCM wurde mit 1 × 5 ml N HCl, Wasser, 5% Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen. Es wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zu einem Öl aufkonzentriert. Dieses Öl wurde dann auf einer Silicasäule unter Verwendung von 10% Ether in Hexan als Elutionsmittel gereinigt. 1,47 g (67%) eines leicht trüben Öls wurde erhalten. Eine Probe dieses Produkts wurde umgeestert und einer GC-Analyse unterzogen. Das Produkt enthielt 95,8% GLA.
Scale-up
20 g (0,072 mol, 3,1 Äquiv.) GLA95 (gamma-Linolensäure, 95%) wurden in 100 ml DCM gelöst. 13,7 g (9,3 ml, 0,11 mol, 4,78 Äquiv.) Oxalylchlorid wurden in 3-4 min unter Stickstoff zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Stickstoff gerührt. Es wurde dann im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen. Dieses Öl wurde dann tropfenweise in etwa 5 min zu einer gerührten Mischung aus 2,14 g (0,023 mol, 1 Äquiv.) Glyzerin, 100 ml DCM und 5,8 ml (5,68 g, 0,072 mol, 3,1 Äquiv.) Pyridin unter Stickstoff zugegeben. 85 mg (0,7 mmol, 0,03 Äquiv.) DMAP (4-Dimethylaminopyridin)-Katalysator wurde zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Das Pyridinhydrochlorid wurde abfiltriert und mit DCM gewaschen. Die DCM-Lösung wurde mit 1 × 25 ml: Wasser, 10% Natriumhydrogencarbonat, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen. (Während dieses Prozesses bildeten sich insbesondere zu Beginn Emulsionen.) Das DCM wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zu einem braunen Öl aufkonzentriert (~21 g).
Das Öl wurde auf einer Silicasäule unter Verwendung von zunächst 5% Ether in Hexan und dann 10% gereinigt. 15,6 g (77% Ausbeute) eines klaren Öls wurden erhalten. Laut Dünnschichtchromatographie enthielt dieses Material eine geringe Menge freies GLA. (Dieses Material wurde zu einem späteren Zeitpunkt weiter gereinigt.)
Großer Maßstab
Obige Reaktion wurde in 10-fachem Maßstab wiederholt. Dementsprechend wurden 200 g GLA 95, 1 l DCM, 137 g Oxalylchlorid und 21,4 g Glyzerin verwendet. Im Anschluss an die Zugabe des Säurechlorids wurde das Reaktionsgemisch in einem kal ten Wasserbad gekühlt und die Temperatur unter 35°C gehalten. 250 g eines braunen Öls wurden hergestellt. Dies wurde zunächst auf einer 500 g Silicasäule gereinigt. Das Öl wurde in 200 ml Hexan gelöst und auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde zunächst mit Hexan, dann mit 5% Ether in Hexan und dann 10% eluiert. Fraktionen wurden gesammelt und mittels Dünnschichtchromatographie analysiert, wobei schließlich zwei Fraktionen Öl erhalten wurden. Die erste A (66 g) enthielt eine kleine Menge einer mit der Laufmittelfront laufenden Verunreinigung und ein wenig GLA (welches langsamer läuft als TGL), die zweite Fraktion B (99 g) war ohne die mit der Laufmittelfront laufende Verunreinigung und enthielt ein wenig GLA.
Die Reaktion im großen Maßstab wurde unter Verwendung von 169 g GLA wiederholt und ergab wie oben zwei Fraktionen. Dieses Mal wurden 85 g der "A"-Fraktion und 54 g der "B"-Fraktion erhalten. Die beiden "A"-Fraktionen wurden zusammengegeben und auf einer 500 g Silicasäule erneut gereinigt. Mit den "B"-Fraktionen wurde in ähnlicher Weise verfahren (15 g an Material der Reaktion im kleinen Maßstab wurden ebenso zu diesem Ansatz gegeben).
Einige Fraktionen aus der obigen Reaktion wurden nochmals nachgereinigt, wobei schließlich 259 g Öl erhalten wurden. Das Öl wurde im Hochvakuum in einem Rotationsverdampfer auf ein konstantes Gewicht gebracht – 256 g. Dies entspricht einer Gesamtausbeute von 65%.
Analyse des Produkts
GC
Eine kleine Probe wurde umgeestert und einer GC-Analyse unterzogen: Der GLA-Gehalt betrug 97,1%. Die Hauptverunreinigung war Linolsäure – 1,91%. Bemerkung: Das ursprüngliche GLA95, das bei der Synthese verwendet wurde, enthielt 96,2% GLA und 2,42% Linolsäure.
HPLC
Ein HPLC-Verfahren wurde entwickelt unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (Hypersil C18 4,6 × 100 mm), Elution mit 80/20 Acetonitril/THF. UV-Detektion bei 210 nm. Dabei zeigte sich, dass das Produkt eine Mischung aus drei Komponenten ist. Das Hauptsignal (93,6%) war das gewünschte Produkt. Eine langsamer laufende Verunreinigung (die 5,0% des Produkts darstellt) war vermutlich GGLI-Triglyzerid (LI = Linolsäure). Eine zweite Verunreinigung lief geringfügig schneller und stellte 1,4% des Produkts dar.
Bemerkung: Die Absorption bei 210 nm schwankt beträchtlich zwischen Triglyzeriden mit unterschiedlichem Fettsäuregehalt. Zum Beispiel hat Trigammalinolenin eine 5- bis 6-mal stärkere UV-Absorption als Trilinolenin.
Zusammenfassung
254 g Glyzerintri-6,9,12-linolenat (gamma-Linolensäuretriglyzerid, Trigammalinolenin, GGG) wurde aus 96,2% GLA wurde über einen zweistufigen Säurechlorid-Weg hergestellt. Es ist ein klares, blassgelbes Öl und wurde unter Stickstoff im Gefrierschrank gelagert. Der GLA-Gehalt betrug 97,1% und keine C20:1-, C22:1- oder C24:1-Säuren wurden nachgewiesen. Die Reinheit gemäß HPLC betrug 93,6%.
Die Synthese von GGG höherer Reinheit kann leicht durch Verwendung von GLA98 (98% γ-Linolensäure: Scotia) oder höher als Ausgangsmaterial erzielt werden.
Veraleichslipid 1: Synthese Tricaprin (Glyzerintridecanoat)
Kleiner Maßstab
Glyzerin (3,0 g, 0,0325 mol, 1 Äquiv.), Pyridin (8,1 ml, 0,10 mol, 3,1 Äquiv.) und Dichlormethan (100 ml) wurden bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Decanoylchlorid (21 ml, 19,25 g, 0,10 mol, 3,1 Äquiv.) wurde dann tropfenweise in 5 min zugesetzt, wobei in einem Wasserbad extern gekühlt wurde, um die Temperatur bei 30-35°C zu halten. Als die Zugabe beendet war, wurde 4-Dimethylaminopyridin (DMAP, 0,12 g, 1 mmol, 0,03 Äquiv.) zugegeben und die Mischung über Nacht unter Stickstoff bei Zimmertemperatur gerührt. Das ausgefallene Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt und mit Dichlormethan gewaschen. Waschlösung und Filtrat wurden zusammengegeben und dann mit wässrigen Lösungen (20 ml) von 5% Natriumchlorid, 5% Natriumhydrogencarbonat, 0,1 N Salzsäure und 5% Natriumchlorid gewaschen. Die Dichlormethan-Phase wurde dann über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das zurück bleibende Öl kristallisierte mit der Zeit. Dieses Material wurde aus Isopropanol (40 ml) umkristallisiert, wobei 15,6 g (86 % Ausbeute) eines wachsartigen weißen Feststoffs erhalten wurde.
Analyse

GC – 99,8% rein
HPLC (C18 4,6 × 100 mm, ACN/THF 85/15 1 ml/min, λ 210 nm) – 94,9% rein

Großer Maßstab
Obige Reaktion wurde im 15-fachen Maßstab wiederholt. Glyzerin (45,0 g, 0,49 mol, 1 Äquiv.), Pyridin (121,5 ml, 1,50 mol, 3,1 Äquiv.) und Dichlormethan (1,5 l) wurden bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Decanoylchlorid (315 ml, 288,8 g, 1,50 mol, 3,1 Äquiv.) wurde dann tropfenweise in 15 min zugegeben, wobei im einem Wasserbad extern gekühlt wurde, um die Temperatur bei 30-35°C zu halten. Als die Zugabe beendet war, wurde 4-Dimethylaminopyridin (DMAP,1,8 g, 15 mmol, 0,03 Äquiv.) zugegeben und die Mischung über Nacht unter Stickstoff bei Zimmertemperatur gerührt. Das ausgefallene Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt und mit Dichlormethan gewaschen. Waschlösung und Filtrat wurden zusammengegeben und dann mit wässrigen Lösungen (300 ml) von 5% Natriumchlorid, 5% Natriumhydrogencarbonat, 0,1 N Salzsäure und 5% Natriumchlorid gewaschen. Die Dichlormethan-Phase wurde dann über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das zurück bleibende Öl kristallisierte mit der Zeit. Dieses Material wurde aus Isopropanol (400 ml) umkristallisiert, wobei 228 g (86% Ausbeute) eines wachsartigen weißen Feststoffs erhalten wurden.
Analyse

GC – 99,8% rein
HPLC (C18 4,6 × 100 mm, ACN/THF 85/15 1ml/min, λ 210 nm) – 94,9% rein

Ein weiterer Ansatz wurde durchgeführt und mit der Charge des obigen kleinen Maßstabs erneut aus Isopropanol umkristallisiert, wobei 44 g Produkt erhalten wurden. Die obigen Chargen wurden zusammengegeben (268 g) und erneut analysiert:
GC
99,9% rein
HPLC
97,9%
Zusammenfassung
263 g Glyzerintridecanoat (Tricaprin, CCC) wurde aus Decanoylchlorid (98%) in einem Einschritt-Verfahren (Schema unten aufgeführt) hergestellt. Es ist ein weißer, niedrigschmelzender Feststoff und wurde unter Stickstoff im Gefrierschrank gelagert. Der C-Gehalt betrug 99,9% des Fettsäuregehalts und die Reinheit gemäß HPLC betrug 97,9%.
Synthesebeispiel 2
1,3-Dicaprin-2-gammalinolenoat (Glyzerin-1,3-didecanoat-2-octadecatri-(6Z,9Z,12Z)-enoat oder CGC
Dieses Triglyzerid ist neu. Im Gegensatz zu CGC wurde sein Isomer CLnC (Ln = α-Linolensäure) als Bestandteil von Kokosnussöl identifiziert (siehe K. Long et al., Biotechnol. Lett., 20, 369-372 (1998) und H. Mu, P. Kalo et al., Eur. J. Lipid Sci. Technol., 102, 202-211 (2000). Außerdem wurde CLxC (Lx = eine Linolensäure mit nicht bestimmter Doppelbindungsposition) beschrieben (siehe J. Gresti et al., J. Dairy Sci., 76, 1850-1869 (1993)).
Die zwei Zwischenstufen, die bei der Synthese von CGC verwendet werden, sind bekannt (siehe L. EI Kihel et al., Arzneim.-Forsch./Drug. Res., 46, 1040-1044 (1996) und US 4 178 299 ). Der nachstehend beschriebene letzte Schritt ist neu und die ersten beiden Stufen sind ebenfalls erfinderisch, da sie besser für eine Produktion in großem Maßstab geeignet sind als die früher beschriebenen.
CGC wurde durch Reaktion von 1,3-Dicaprin mit GLA-Chlorid in Dichlormethan/Pyridin hergestellt. 1,3-Dicaprin wurde mittels Natriumborhydrid-Reduktion von 1,3-Didecanoyloxypropan-2-on hergestellt, welches wiederum durch Reaktion von Decanoylchlorid mit 1,3-Dihydroxyaceton erzeugt wurde. Die Zwischenstufe 1,3-Dicaprin muss vorsichtig behandelt werden, da in Gegenwart von Säuren, Basen und Wärme eine Acylumlagerung erfolgen kann. Ein älteres Verfahren zur Herstellung von 1,3-Dicaprin wurde beschrieben (siehe A. P. J. Mank et al., Chem. Physics Lipids, 16, 107-114 (1976)).
Eine vielseitige, flexible Synthese von 1,3-Diglyzeriden und Triglyzeriden mittels katalysierter Addition von Decansäure an einen Glycidylester (aus Epichlorhydrid) ist aufgrund der harscheren Reaktionsbedingungen und den Problemen der Acylumlagerung weniger attraktiv. Das Endprodukt CGC wurde mittels vorsichtiger Säulenchromatographie an Silica, welche Nebenprodukte entfernt, gereinigt.
Kleiner Maßstab
1,3-Didecanoyloxypropan-2-on
Decanoylchlorid (40,0 ml, 36,8 g, 0,19 mol, 1,98 Äquiv.) wurde tropfenweise in 10-15 min zu einer gerührten Suspension von 1,3-Dihydroxyaceton-Dimer (8,68 g, 0,048 mol, 1,0 Äquiv.), Pyridin (15,6 ml, 0,19 mol), 4-Dimethylaminopyridin (0,18 g, 0,0014 mol, 0,03 Äquiv.) und Dichlormethan (DCM, 150 ml) bei Zimmertemperatur unter Stickstoff zugegeben. Die Temperatur des Reaktionsgemischs wurde durch Kühlung in einem kalten Wasserbad unter 30°C gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das entstandene Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Filtrat und Waschlösungen wurden zusammengegeben und dann mit 1 × 25 ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO₃, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung wurde dann über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum zu einer gelblichen halbfesten Masse aufkonzentriert. Diese wurde dann aus Methanol (150 ml) kristallisiert, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde. Die Ausbeute betrug 28,2 g (73%).
1,3-Dicaprin
Das obige Keton (28,2 g, 0,071 mol) wurde in Tetrahydrofuran (THF, 200 ml) gelöst. Dann wurde Wasser (10 ml) zugegeben, die Lösung auf 5°C gekühlt, und Natriumborhydrid (5,38 g, 0,14 mol) portionsweise unter 10°C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 1 h bei Zimmertemperatur gerührt und dann im Vakuum aufkonzentriert, um das THF zu entfernen. Der Rückstand wurde in Ethylacetat und 5% Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wurde noch einmal mit Ethylacetat extrahiert und die zusammengegebenen Extrakte über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum zu einem wachsartigen Feststoff aufkonzentriert. Dieser wurde zweimal aus Hexan kristallisiert, wobei 11,2 g (40%) eines weißen Feststoffs erhalten wurden (99% + rein gemäß HPLC).
1,3-Dicaprin-2-gammalinolenoat (CGC)
Gamma-Linolensäure (GLA95, 8,34 g, 0,03 mol) wurde in Dichlormethan (DCM, 60 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt und Oxalylchlorid (3,9 ml, 5,67 g, 0,044 mol) tropfenweise in 5 min zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und dann im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen. Das zurück bleibende ölige Säurechlorid (GLA-Cl) wurde dann tropfenweise in 15 min (Eis/Wasser-Kühlung) zu einer gerührten Lösung aus 1,3-Dicaprin (11,2 g, 0,028 mol), DCM (50 ml), Pyridin (2,42 ml, 2,37 g, 0,03 mol) und 4-Dimethylaminopyridin (0,10 g, 0,0008 mol, 0,03 Äquiv.) bei 10-15°C zugegeben. Die Temperatur wurde durch Eis/Wasser-Kühlung aufrechterhalten. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Die Waschlösung und das Filtrat wurden zusammengegeben und mit 1 × 20 ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO₃, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung wurde dann über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das zurück bleibende braune Öl wurde mittels Säulenchromatographie an Silica gereinigt. Die Elution mit Hexan und dann mit 5% Ether/Hexan ergab 10,3 g (56%) eines farblosen Öls. Die Struktur wurde mittels ¹³C-NMR und GLC bestätigt. Die Reinheit wurde mittels HPLC bestimmt.
Großer Maßstab
1,3-Didecanoyloxypropan-2-on
Decanoylchlorid (272 ml, 250 g, 1,3 mol, 2 Äquiv.) wurde tropfenweise in 10-15 min zu einer gerührten Suspension aus 1,3-Dihydroxyaceton-Dimer (59,1 g, 0,65 mol, 1,0 Äquiv.), Pyridin (106 ml, 103,7 g, 1,3 mol), 4-Dimethylaminopyridin (2,38 g, 0,02 mol, 0,03 Äquiv.) und Dichlormethan (DCM, 750 ml) bei Zimmertemperatur unter Stickstoff zugegeben. Die Temperatur des Reaktionsgemischs wurde durch Kühlung in einem kalten Wasserbad unter 30°C gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das entstandene Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden zusammengegeben und dann mit 1 × 150 ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO₃, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung wurde dann über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum zu einer gelblichen halbfesten Masse aufkonzentriert. Diese wurde dann aus Methanol (500 ml) kristallisiert, wobei ein weißer Feststoff entstand. Die Ausbeute betrug 158 g (60%).
1,3-Dicaprin
Das obige Keton (158 g, 0,40 mol) wurde in Tetrahydrofuran (THF, 2,25 l) gelöst. Dann wurde Wasser (50 ml) zugegeben, die Lösung auf 5°C gekühlt und Natriumborhydrid (5,66 g, 1,5 Äquiv.) portionsweise unter 10°C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde mittels HPLC kontrolliert (C18, Elution mit ACN bei 1 ml/min, λ 210 nm) (Bemerkung: tatsächlich wurden nur etwa 4,5 g des Borhydrids zugegeben, da sämtliches SM bereits reagiert hatte). Das Reaktionsgemisch wurde für 1 h bei Zimmertemperatur gerührt und dann im Vakuum aufkonzentriert, um TFH zu entfernen. Der Rückstand wurde in Ethylacetat und 5%iger Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wurde erneut mit Ethylacetat extrahiert und die zusammengegebenen Extrakte über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum zu einem wachsartigen Feststoff aufkonzentriert. Dieser wurde zweimal aus Hexan kristallisiert, wobei man 96 g (60%) eines weißen Feststoffs erhielt (98% rein gemäß HPLC).
1,3-Dicaprin-2-gamma-linolenoat (CGC)
Gamma-Linolensäure (GLA95, 120,2 g, 0,43 mol) wurde in Dichlormethan (DCM, 750 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt und Oxalylchlorid (55,7 ml, 82,3 g, 0,65 mol, 1,5 Äquiv.) tropfenweise bei 15-20°C in 15 min zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und dann im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen. Das zurück bleibende ölige Säurechlorid (GLA-Cl) wurde dann tropfenweise in 30-40 min bei 10-15°C (Eis/Wasser-Kühlung) zu einer gerührten Lösung aus 1,3-Dicaprin (164,7 g, 0,41 mol), DCM (650 ml), Pyridin (33,3 ml, 32,5 g, 0,41 mol) und 4-Dimethylaminopyridin (1,50 g, 0,012 mol, 0,03 Äquiv.) bei 10-15°C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Die Waschlösung und das Filtrat wurden zusammengegeben und mit 1 × 150 ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO₃, 0,1 N NCl, 5% NaCl gewa schen. Die Lösung wurde dann über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, wobei ein braunes Öl (275 g) erhalten wurde.
Der Maßstab der obigen drei Reaktionen war der größte, in dem diese durchgeführt wurden. Die Reduktion mit Borhydrid ergab, zusätzlich zu 1,3-Dicaprin, ein Nebenprodukt in verschiedenen Ausbeuten. Die Gegenwart dieses Nebenprodukts beeinflusste stark die Ausbeute an isoliertem reinen 1,3-Dicaprin; das Nebenprodukt konnte nur durch zwei Kristallisationen des Rohprodukts entfernt werden. Da das Endprodukt CGC mittels Säulenchromatographie gereinigt wird, ist es erforderlich, dass das für den letzten Schritt verwendete 1,3-Dicaprin so rein wie möglich ist! In den obigen Reaktionen wurde etwa 440 g rohes CGC in Form eines braunen Öls hergestellt. Dies wurde auf einer Reihe von Silicasäulen unter Verwendung von Hexan, gefolgt von 2-3% Ether/Hexan, gereinigt. Die Reinigung erforderte 7 oder 8 Säulen, wobei 3-4 Kilo Silica und 25-30 Liter Lösungsmittel verwendet wurden (Wiederbenutzung des Lösungsmittels hielt diese Zahl gering – in der Praxis wurden über 100 Liter verwendet).
Das erhaltene Produkt, ein klares, fast farbloses Öl (264 Gramm), war gemäß HPLC (C18 4,6 × 100 mm, Elution mit 85/15 ACN/THF bei 1 ml/min. UV-Detektion λ 210 nm) 96,4% rein. GC zeigte ein Verhältnis von 66,1/33,9 C/G. Die NMR-Analyse zeigte, dass das Produkt die richtige CGC-Struktur aufwies und eine Reinheit von mindestens 95% hatte: δ_c (500 MHz, CDCl₃) 172,65 (2-GLA-Carbonyl), 173,25 (1,3-Caprylcarbonyl). Verhältnis der Signale 2,04:1. Das Fehlen eines Signals bei 173,0 wies auf die Abwesenheit von 1,3-GLA hin. Spuren eines Signals bei 172,79 könnten auf eine Ölsäure-Verunreinigung in GLA oder 2-Caprylsäure zurückzuführen sein.
Zusammenfassung
264 g Glyzerin-1,3-didecanoat-2-gammalinolenoat (1,3-Dicaprin-2-GLA, CGC) wurde in einem Dreischritt-Verfahren (Schema unten aufgeführt) aus Decanoylchlorid (98%) hergestellt. Es ist ein fast farbloses Öl (schwach gelber Farbton) und wurde unter Stickstoff im Gefrierschrank gelagert. Die Reinheit gemäß HPLC betrug 96,4%.
Synthesebeispiel 3
1,3-Didecanoat-2-dihomo-γ-linolenoat (Glyzerin-1,3-didecanoat-2-icosa-(8Z,11Z,14Z)-trienoat oder C(DHLA)C
Dieses Triglyzerid scheint neu zu sein – es wurde kein Literaturhinweis gefunden.
DHLA (3,93 g, 12,8 mmol, 1 Äquiv.) wurde in Dichlormethan (DCM, 20 ml) gelöst und bei Zimmertemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Oxalylchlorid (1,69 ml, 2,46 g, 19,4 mmol, 1,5 Äquiv.) wurde tropfenweise in 1-2 min zugegeben und über Nacht bei Zimmertemperatur rühren gelassen. Die erhaltene Lösung wurde im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen. Das zurück bleibende ölige Säurechlorid (DHLA-Cl) wurde dann tropfenweise in 5 min bei 25°C zu einer gerührten Mischung aus 1,3-Dicaprin (4,91 g, 12,2 mmol, 0,95 Äquiv.), Pyridin (0,98 ml, 0,96 g, 12,1 mmol, 0,95 Äquv.) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP, 8 mg, 0,07 mmol, 0,03 Äquiv.) zugegeben. Während der Zugabe stieg die Reaktionstemperatur auf 32°C. Die Reaktion wurde bei 30-35°C gerührt und mittels HPLC beobachtet. Die Reaktion wurde nach 1,5 h beendet. Das ausgefallene Pyridinhydrochlorid wurde abfiltriert und mit DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden zusammengegeben und dann mit 1 × 10 ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO₃, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung wurde dann über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, wobei das Rohprodukt als gelboranges Öl (8,9 g, 86% rein gemäß HPLC) erhalten wurde. Dieses Öl wurde an Silicagel (250 g) chromatographiert. Die Elution mit Hexan und Diethylether/Hexan (2-6%) ergab ein blaßgelbes Öl als gereinigtes Produkt. Die Behandlung einer Hexanlösung mit entfärbender Kohle und die Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum ergab C(DHLA)C als klares, farbloses Öl (6,48 g, 98,9% rein gemäß HPLC).
Synthesebeispiel 4
Triarachidin (Glyzerintriicosatetra-5Z,8Z,11Z,14Z-enoat) oder AAA
Arachidonsäure (50,9 g, 0,17 mol, 3 Äquiv.) wurde in Dichlormethan (DCM, 175 ml) gelöst und bei Zimmertemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Oxalylchlorid (21,9 ml, 31,9 g, 0,25 mol, 4,4 Äquiv.) wurde dann zu der gerührten Lösung in 5 min zugegeben, wobei die Temperatur um 4°C anstieg. Die erhaltene gelbgrüne Mischung wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und dann im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen. Das zurück bleibende ölige Säurechlorid (A-Cl) wurde dann tropfenweise in 15 min zu einer vorgewärmten (25°C), gerührten Mischung aus Glyzerin (5,11 g, 0,055 mol, 1 Äquiv.), Pyridin (13,5 ml, 13,2 g, 0,17 mol, 3 Äquiv.) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP, 0,20 g, 0,002 mol, 0,03 Äquiv.) zugegeben. Die Temperatur des Reaktionsgemischs stieg während der Zugabe auf 42°C an und ein leichter Rückfluss konnte beobachtet werden. Die Mischung wurde bei 30 bis 40°C gerührt und mittels HPLC kontrolliert. Nach 2 h wurde keine weitere Produktbildung mehr beobachtet. Das ausgefallene Pyridinhydrochlorid wurde abfiltriert und mit DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden zusammengegeben und dann mit 1 × 50 ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO₃, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung wurde dann über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, wobei das Rohprodukt als ein gelb-oranges Öl (57 g) erhalten wurde. Dieses Öl wurde mittels Säulenchromatographie an Silicagel (ca. 600 g) gereinigt. Die Elution mit Hexan und Diethylether (2-4%)/Hexan ergab 22,8 g des Produkts als ein Öl. Ein zweiter Ansatz (17,8 g) wurde aus 39,8 g Arachidonsäure hergestellt. Die zwei Chargen wurden zusammengegeben und restliche Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, wobei 40,5 g (43%) eines mobilen, blassgelben Öls erhalten wurden. HPLC-Reinheit 84,8%, GLC-Analyse 94,3% AA (Arachidonsäure).
Vergleichslipid 2
1,3-Di-(octadeca-6Z,9Z,12Z-enoyloxy)-propan-2-on
(1,3-Di-γ-linolenoyloxy)-propan-2-on, GonG), Zwischenprodukt der Stufe 1 für GCG
Gamma-Linolensäure (GLA95, 197 g, 0,71 mol, 2,2 Äquiv.) wurde in Dichlormethan (DCM, 600 ml), das sich in einem 2 l-Dreihalskolben befand, gelöst. Die erhaltene Lösung wurde bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Oxalylchlorid (93 ml, 136 g, 1,07 mol, 3,3 Äquiv.) wurde tropfenweise bei 15-20°C in 15 min zugegeben. Die braune Mischung wurde über Nacht bei Zimmermtemperatur gerührt und dann im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen. Das zurück bleibende ölige Säurechlorid (GLA-Cl) wurde dann tropfenweise in 20 min bei 25°C zu einer gerührten Mischung aus 1,3-Dihydroxyaceton-Dimer (28,99 g, 0,32 mol, 1,0 Äquiv.), Pyridin (52 ml, 50,9 g, 0,64 mol, 2,0 Äquiv.), 4-Dimethylaminopyridin (2,36 g, 0,02 mol, 0,06 Äquiv.) und Dichlormethan (DCM, 600 ml) bei Zimmertemperatur unter Stickstoff zugegeben. Die Temperatur des Reaktionsgemischs konnte auf bis zu 40°C ansteigen und die Mischung wurde für weitere 2 h unter Stickstoff gerührt (mittels HPLC beobachtet). Das entstandene Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden zusammengegeben und dann mit 1 × 150 ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO₃, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung wurde dann über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, wobei ca. 200 g eines gelben Öls erhalten wurden. Dieses Material wurde teilweise mittels Säulenchromatographie an Silica (600 g) gereinigt. Die Elution mit Hexan und anschließend Ether/Hexan-Mischungen (2-15%) ergab 42 g eines blassgelben Öls. Dieses Öl wurde nochmals an Silica (600 g) chromatographiert und mit Hexan und dann 1-10% Ether-Hexan eluiert, wobei das Produkt (95,9% rein) als blassgelbes Öl erhalten wurde. Die Ausbeute betrug 42 g (17%).
1,3-Di-(octadeca-6Z,9Z,12Z-enoyloxy)-propan-2-ol
1,3-Di-(γ-linolenovloxy)-propan-2-ol oder 1,3-Di-gamma-linolenin, GolG), Zwischenprodukt der Stufe 2 für GCG
13-Di-(γ-linolenoyloxy)-propan-2-on (GonG, 25,5 g, 0,04 mol, 1 Äquiv.) wurde in Tetrahydrofuran (THF, 375 ml) und Wasser (12,7 ml) gelöst. Die Lösung wurde hef tig bei –20°C gerührt, es wurde darauf geachtet, dass die Reaktionstemperatur unter –15°C blieb. Natriumborhydrid (790 mg, 0,02 mol, 1,25 Äquiv.) wurde portionsweise in 3 min zu der gerührten Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für weitere 10 min bei –20°C gerührt und dann Hexan (380 ml) zugegeben. Die immer noch kalte Mischung wurde dann mit Wasser (2 × 200 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, wobei die Titelverbindung als braunes Öl (27,8 g) erhalten wurde (82,6% rein gemäß HPLC, weniger als 1% Umlagerungsprodukte). Ein weiterer Ansatz wurde hergestellt und mit der ersten zusammengegeben, so dass man 50 g Rohprodukt erhielt. Dieses Material wurde mittels Säulenchromatographie an Silicagel (400 g) gereinigt. Die Elution mit Hexan und Diethylether/Hexan-Mischung (5 bis 20%) ergab 36,1 g des Produkts als ein blasses Öl (91,5% rein).
(Anmerkung: Es sollte darauf geachtet werden, dass die Verbindung an dem Silica nicht über Nacht gelassen wird, da offenbar eine Umlagerungsreaktion stattfindet, wobei GGol entsteht.)
1,3-Di-γ-linolenin-2-decanoat(Glyzerin-1,3-dioctadeca-(6Z,9Z,12Z)-trienoat-2-decanoat oder GCG)
Decanoylchlorid (13,5 ml, 12,4 g, 0,065 mol, 1,1 Äquiv.) wurde zu einer gerührten Lösung aus 1,3-Di-γ-linolenin (36,1 g, 0,059 mol, 1 Äquiv.), trockenem Pyridin (5,7 ml, 5,6 g, 0,07 mol, 1,1 Äquiv.), 4-Dimethylaminopyridin (0,2 g, 0,002 mol, 0,03 Äquiv.) und Dichlormethan (DCM, 150 ml) in ca. 10 min gegeben. Die Temperatur wurde während der Zugabe bei 17°C-23°C gehalten. Die Reaktion wurde dann bei 30-35°C gerührt und mittels HPLC beobachtet. Weitere 1-2 ml Decanoylchlorid wurden nach 1 h, 1,5 h und 2 h zugegeben. Die weitere Zugabe schien die Umsetzung zum Produkt zu erhöhen, wie die HPLC-Bestimmung ergab. Nach 3 h wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat mit DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden zusammengegeben und dann mit 1 × 50 ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO₃, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen. Das DCM-Extrakt wurde dann über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, wobei das Rohprodukt als ein blassgelbes Öl erhalten wurde (Reinheit 90% gemäß HPLC). Das Öl wurde mittels Säulenchromatographie an Silicagel (600 g) gereinigt. Die Elution mit Hexan und Diethylether-Hexan (1,5-2,5, dann 3,5%) ergab das Produkt (GCG) als ein klares Öl (35,5 g, 96,1% rein gemäß HPLC). Weitere 7,5 g reines Lipid wurde mittels weiterer Chromatographie einiger der Fraktionen, die nur eine geringe Menge an Verunreinigung enthielten, erhalten.
Synthesebeispiel 5
1,3-Dicaprin-2-arachidonat(Glyzerin-1,3-didecanoat-2-icosatetra-(5Z,8Z,11Z,14Z)-enoat oder CAC)
Dieses Triglyzerid ist bekannt. CAC wurde als Bestandteil der Lymphlipide von Ratten nach Gabe von Distelöl identifiziert. WO 03/013497 beschreibt ein Arachidonsäure enthaltendes Triglyzerid (hergestellt durch die Kultivierung von Mortierella alpina), das bei Krankheiten, die durch Gehirnunterfunktion verursacht werden, speziell jedoch zur Wahrnehmungssteigerung, verwendet werden kann. Die zwei Zwischenstufen, die bei der Synthese von CAC verwendet werden, sind bekannt.
Die Synthese von CAC aus 1,3-Dicaprin und die Reinigung dessen sind allesamt neu.
CAC wurde hier durch die Reaktion von 1,3-Dicaprin mit Arachidonylchlorid in Dichlormethan/Pyridin hergestellt. 1,3-Dicaprin wurde durch Natriumborhydrid-Reduktion von 1,3-Didecanoyloxypropan-2-on hergestellt, welches wiederum durch Reaktion von Decanoylchlorid mit 1,3-Dihydroxyaceton erzeugt wurde. Die Zwischenstufe 1,3-Dicaprin muss vorsichtig behandelt werden, da bei Anwesenheit von Säuren, Basen und Wärme eine Acylumlagerung erfolgen kann. Ein älteres Verfahren⁶ zur Herstellung von 1,3-Dicaprin durch die katalysierte Addition von Decansäure an einen Glycidylester (aus Epichlorhydrid) wurde aufgrund der harscheren Reaktionsbedingungen und den Problemen der Acylumlagerung als weniger attraktiv eingestuft. Das Endprodukt CAC wurde durch vorsichtige Säulenchromatographie an Silica gereinigt, wodurch Nebenprodukte entfernt wurden.
1,3-Dicaprin-2-arachidonat (CAC)
Arachidonsäure (AA96, 8,34 g, 0,03 mol) wurde in Dichlormethan (DCM, 60 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt und Oxalylchlorid (3,9 ml, 5,67 g, 0,044 mol) wurde tropfenweise in 5 min zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und dann im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen. Das zurück bleibende ölige Säurechlorid (CLA-Cl) wurde dann tropfenweise in 15 min (Eis/Wasser-Kühlung) zu einer gerührten Lösung aus 1,3-Dicaprin (11,2 g, 0,028 mol), DCM (50 ml), Pyridin (2,42 ml, 2,37 g, 0,03 mol) und 4-Dimethylaminopyridin (0,10 g, 0,0008 mol, 0,03 Äquiv.) bei 10-15°C zu-gegeben. Die Temperatur wurde durch Eis/Wasser-Kühlung konstant gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Waschlösung und Filtrat wurden zusammengegeben und mit 1 × 20 ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO₃, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung wurde dann über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das zurück bleibende braune Öl wurde mittels Säulenchromatographie an Silica gereinigt. Die Elution mit Hexan und dann mit 5% Ether/Hexan ergab 10,3 g (56%) eines farblosen Öls. Die Struktur wurde mittels ¹³C-NMR und GLC bestätigt. Die Reinheit wurde mittels HPLC bestimmt.
Großer Maßstab
1,3-Didecanoyloxypropan-2-on
Decanoylchlorid (272 ml, 250 g, 1,3 mol, 2 Äquiv.) wurde tropfenweise in 10-15 min zu einer gerührten Suspension aus 1,3-Dihydroxyaceton-Dimer (59,1 g, 0,65 mol, 1,0 Äquiv.), Pyridin (106 ml, 103,7 g, 1,3 mol), 4-Dimethylaminopyridin (2,38 g, 0,02 mol, 0,03 Äquiv.) und Dichlormethan (DCM, 750 ml) bei Zimmertemperatur unter Stickstoff zugegeben. Die Temperatur des Reaktionsgemischs wurde durch Kühlung in einem kalten Wasserbad unter 30°C gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das entstandene Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden zusammengegeben und dann mit 1 × 150 ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO₃, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung wurde dann über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum zu einer gelblichen halbfesten Masse aufkonzentriert. Diese wurde dann aus Methanol (500 ml) kristallisiert, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde. Die Ausbeute betrug 158 g (60%).
1,3-Dicaprin
Das obige Keton (158 g, 0,40 mol) wurde in Tetrahydrofuran (THF, 2,25 l) gelöst. Dann wurde Wasser (50 ml) zugegeben, die Lösung auf 5°C gekühlt und Natriumborhydrid (5,66 g, 1,5 Äquiv.) portionsweise unter 10°C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde mittels HPLC (C18, Elution mit ACN bei 1 ml/min, λ 210 nm) beobachtet (Bemerkung: tatsächlich wurden nur etwa 4,5 g des Borhydrids zugegeben, da das gesamte SM bereits reagiert hatte). Das Reaktionsgemisch wurde bei Zimmertemperatur für 1 h gerührt und dann im Vakuum aufkonzentriert, um THF zu entfernen. Der Rückstand wurde in Ethylacetat und 5%iger Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wurde nochmals mit Ethylacetat extrahiert und die zusammengegebenen Extrakte über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum zu einem wachsartigen Feststoff aufkonzentriert. Dieser wurde zweimal aus Hexan kristallisiert, wobei 96 g (60%) eines weißen Feststoffs erhalten wurden (98% rein gemäß HPLC).
1,3-Dicaprin-2-arachidonat (CAC)
Arachidonsäure (AA96, 78,8 g, 0,26 mol) wurde in Dichlormethan (DCM, 425 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt und Oxalylchlorid (33,9 ml, 49,4 g, 0,39 mol, 1,5 Äquiv.) tropfenweise bei 15-20°C in 15 min zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und dann im Vakuum aufkonzentriert, um DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen. Das zurück bleibende ölige Säurechlorid (GLA-Cl) wurde dann tropfenweise in 30-40 Minuten bei 10-15°C (Eis/Wasser-Kühlung) zu einer gerührten Lösung aus 1,3-Dicaprin (94,2 g, 0,24 mol), DCM (450 ml), Pyridin (19,1 ml, 18,6 g, 0,24 mol) und 4-Dimethylaminopyridin (1,72, 1,50 g, 0,014 mol, 0,06 Äquiv.) bei 10-15°C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Die Waschlösung und das Filtrat wurden zusammengegeben und mit 1 × 150 ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO₃, 0,1 N NCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung wurde dann über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, wobei ein braunes Öl (171 g) erhalten wurde.
Der Maßstab der obigen drei Reaktionen wanden größte, in dem diese durchgeführt wurden. Die Reduktion mit Borhydrid ergab zusätzlich zu 1,3-Dicaprin ein Nebenprodukt in unterschiedlicher Ausbeute. Die Gegenwart dieses Nebenprodukts beeinflusste die Ausbeute des isolierten reinen 1,3-Dicaprins stark; das Nebenprodukt konnte nur durch zwei Kristallisationen des Rohprodukts entfernt werden. Da das Endprodukt CAC mittels Säulenchromatographie gereinigt wird, ist erforderlich, dass das 1,3-Dicaprin, das in dem letzten Schritt verwendet wird, so rein wie möglich ist!
In den obigen Reaktionen wurden 412 g des rohen CAC erzeugt. Dieses Material wurde auf einer Reihe von Silicasäulen unter Verwendung von Hexan, gefolgt von 1-3% Ether/Hexan, gereinigt. Die Reinigung erforderte 7 oder 8 Säulen, die Verwendung von 3 bis 4 Kilo Silica und 100 Liter Lösungsmittel.
Das erhaltene Produkt, ein klares, sehr blassgelbes Öl (295 Gramm), war 95,8% rein gemäß HPLC (C18 4,6 × 100 mm, Elution mit 85/15 ACN/THF bei 1 ml/min. UV-Detektion λ 210 nm). GC zeigte ein Verhältnis von 66,3/32,1 C/A (1,6% Verunreinigungen, die von den 5% Verunreinigung in A stammen).
Zusammenfassung
295 g Glyzerin-1,3-didecanoat-2-arachidonat (1,3-Dicaprin-2-AA, CAC) wurde in einem Dreistufenverfahren (Schema unten aufgeführt) aus Decanoylchlorid (98%) und Arachidonsäure (95%) hergestellt. Es ist ein sehr blassgelbes Öl und wurde unter Stickstoff im Gefrierschrank aufbewahrt. Die Reinheit gemäß HPLC beträgt 95,8%.
Synthesebeispiel 7
1,3-Diolein-2-gammalinolenoat (Glyzerin-1,3-dioctadeca-9Z-enoat-2-octadecatri-(6Z,9Z,12Z)-enoat oder OGO)
Dieses Triglyzerid ist bekannt: Eine Kohlenstoff-14-markierte Version wurde durch normale chemische Synthese hergestellt und die normale nicht-markierte Form mittels biochemischer Synthese unter Verwendung von Lipasen. OGO ist kein Hauptbestandteil von Borretschöl, jedoch sein Isomer OOG (9%). Die zwei Zwischenstufen, die bei der Synthese von CGC verwendet wurden, sind bekannt. Der letzte Schritt ist neu.
Die Verwendung von, die Synthese aus 1,3-Diolein und die Reinigung von CGC sind allesamt vermutlich neu. Allgemein werden die Triglyzeride CXC aus Patent- und Kostengründen OXO vorgezogen.
OGO wurde hier durch Reaktion von 1,3-Diolein mit GLA-Chlorid in Dichlormethan/Pyridin hergestellt. 1,3-Diolein wurde durch Natriumborhydrid-Reduktion von 1,3-Dioleoylpropan-2-on hergestellt, welches wiederum durch Reaktion von Oleoylchlorid mit 1,3-Dihydroxyaceton erzeugt wurde. Die Zwischenstufe 1,3-Diolein muss vorsichtig behandelt werden, da in Gegenwart von Säuren, Basen und Wärme eine Acylumlagerung auftreten kann. Ältere Verfahren^7,8 zur Herstellung von 1,3-Diolein über Monotritylglyzerin oder Glycidylester wurde aufgrund der höherer Anzahl an Stufen und den Problemen der Acylumlagerung als weniger attraktiv eingestuft. Das End produkt OGO wurde mittels vorsichtiger Säulenchromatographie an Silica gereinigt, wodurch Nebenprodukte entfernt wurden.
Kleiner Maßstab
1,3-Dioleoylpropan-2-on
155,1 g Ölsäure (155,1 g, 0,55 mol, 1,0 Äquiv., Croda 094 RV05192) wurde in Dichlormethan (DCM, 500 ml) gelöst. Die Lösung wurde bei Zimmertemperatur (RT) unter Stickstoff gerührt und 104,4 g (1,5 Äquiv., 71 ml) Oxalylchlorid (104,4 g, 71,8 ml, 0,82 mol, 1,5 Äquiv.) wurde tropfenweise bei 15-20°C in etwa 20 min zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Das überschüssige Oxalylchlorid und DCM wurden im Vakuum entfernt und das zurück bleibende ölige Säurechlorid wurde tropfenweise in 15-20 min zu einer gerührten Suspension von 1,3-Dihydroxyaceton-Dimer (22,5 g, 0,24 mol Monomer), Pyridin (40,4 ml), 4-Dimethylaminopyridin (1,83 g) und Dichlormethan (DCM, 500 ml) bei Zimmertemperatur unter Stickstoff zugegeben. Die Temperatur des Reaktionsgemischs wurde durch Kühlung in einem Eis/Wasser-Bad unter 20°C gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das entstandene Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden zusammengegeben und dann mit 1 × 150 ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO₃, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung wurde dann über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum zu einer orange-braunen halbfesten Masse aufkonzentriert. Diese wurde in Methanol zerrieben und über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Der Feststoff, der sich dabei abgesetzt hat (90% rein gemäß HPLC) wurde dann aus Diisopropylether (DIPE) und Methanol kristallisiert, wobei 51,3 g eines cremefarbenen Feststoffs erhalten wurde, welcher 95% rein gemäß HPLC war. Nochmalige Kristallisation aus DIPE/Methanol lieferte 41 g (27%) eines 98% reinen Produkts.
1,3-Diolein
Das obige Keton (32,8 g, 0,053 mol) wurde in Tetrahydrofuran (THF, 250 ml) gelöst. Dann wurde Wasser (10 ml) zugegeben, die Lösung auf 5°C gekühlt und Natriumborhydrid portionsweise unter 10°C zugegeben. Die Reaktion wurde mittels HPLC verfolgt (C18, ACN/THF 90/10 bei 2 ml/min, λ 210 nm) und nachdem das gesamte Ausgangsketon reagiert hatte, wurde die Zugabe von Borhydrid beendet (830 mg, 0,022 mol zugegeben). Die Mischung wurde dann im Vakuum aufkonzentriert, um THF zu entfernen. Der Rückstand wurde in Ethylacetat und Wasser ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wurde nochmals mit Ethylacetat extrahiert und die vereinigten Extrakte über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum zu einem Öl (~33 g) aufkonzentriert, welches beim Kühlen fest wurde. Das Produkt (68% rein gemäß HPLC) wurde aus 100 ml Hexan bei –20°C (im Gefrierschrank) über Nacht kristallisiert. Dieses Produkt (92% rein, 21,1 g) wurde aus Hexan (50 ml) umkristallisiert, wobei 18,28 g (56% Ausbeute) eines gemäß HPLC 97,5% reinen Produkts erhalten wurde.
1,3-Diolein-2-gammalinolenoat (O-G-O)
γ-Linolensäure (GLA95, 41,2 g, 0,15 mol, 1,1 Äquiv.) wurde in Dichlormethan (DCM, 250 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt und Oxalylchlorid (19,1 ml, 28,2 g, 0,22 mol, 1,65 Äquiv.) tropfenweise in 5 min zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und dann im Vakuum aufkonzentriert, und DCM und überschüssiges Oxalylchlorid zu entfernen. Das zurück bleibende ölige Säurechlorid (GLA-Cl) wurde dann tropfenweise in 15 min (Eis/Wasser-Kühlung) zu einer gerührten Lösung aus 1,3-Diolein (83,5 g, 0,13 mol), DCM (250 ml), Pyridin (10,9 ml, 10,6 g, 0,14 mol) und 4-Dimethylaminopyridin (0,49 g, 0,004 mol, 0,15 Äquiv.) bei 10-15°C zugegeben. Die Temperatur wurde durch Eis/Wasser-Kühlung konstant gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Pyridinhydrochlorid wurde mittels Filtration entfernt und mit DCM gewaschen. Waschlösung und Filtrat wurden zusammengegeben und mit 1 × 80 ml-Portionen von 5% NaCl, 5% NaHCO₃, 0,1 N HCl, 5% NaCl gewaschen. Die Lösung wurde dann über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das zurück bleibende braune Öl wurde mittels Säulenchromatographie an Silica gereinigt. Die Elution mit Hexan und dann mit 5% Ether/Hexan ergab 63,6 g (54%) eines farblosen Öls. Die Reinheit wurde mittels HPLC bestimmt.
Zusammenfassung
64 g Glyzerin-1,3-oleoat-2-gammalinolenoat (1,3-Dioleat-2-GLA, OGO) wurde in einem Dreistufenverfahren (Schema unten aufgeführt) aus Oleoylchlorid (98%) hergestellt. Es war ein fast farbloses Öl (leicht gelber Farbton) und wird unter Stickstoff im Gefrierschrank gelagert. Die Reinheit gemäß HPLC betrug 89,4%.
¹³C-NMR-Daten der künstlichen Lipide

GGG δ_c (125,7 MHz, CDCl₃) 172,69 (1C, C2-Carbonyl), 173,09 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
CGC δ_c (125,7 MHz, CDCl₃) 172,76 (1C, C-2-Carbonyl), 173,17 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
CAC δ_c (125,7 MHz, CDCl₃) 172,65 (1C, C-2-Carbonyl), 173,28 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
C(DHLA)C δ_c (125,7 MHz, CDCl₃) 172,83 (1C, C-2-Carbonyl), 173,30 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
GCG δ_c (125,7 MHz, CDCl₃) 172,91 (1C, C-2-Carbonyl), 173,11 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
OGO δ_c (125,7 MHz, CDCl₃) 172,69 (1C, C-2-Carbonyl, 173,25 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
AAA δ_c (125,7 MHz, CDCl₃) 172,66 (1C, C-2-Carbonyl), 173,04 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)
CCC δ_c (125,7 MHz, CDCl₃) 172,81 (1C, C-2-Carbonyl), 173,21 (2C, C-1-, C-3-Carbonyle)

Experimentelle Vorgehensweise
Das Protonen-entkoppelte ¹³C-NMR-Spektrum mit unterdrücktem NOE wurde bei 21°C in einer 5 mm-Breitbandsonde an einem Joel 500 MHz-Spektrometer gesammelt, das bei 125,728 MHz arbeitet. Waltz-Entkopplung war die Entkopplungsart der Wahl, eingestrahlt wurde nur während der Aufnahmedauer von 14,89 s. Die Relaxationsverzögerung wurde auf 30 s gesetzt und der Pulswinkel betrug 90°. Das verwendete spektrale Fenster betrug ca. 35 ppm (von 173,5 bis 172,6 ppm) mit einem 170 ppm-Offset. Die Spektren wurden intern mit CDCl₃ bei 77,0 ppm korreliert. Üblicherweise lag die ungefähre Anzahl der Aufnahmen, die für ein adequates Signal-Rausch-Verhältnis gesammelt wurden, zwischen 300 und 1200 Aufnahmen, in Abhängigkeit von der Konzentration und Reinheit der Probe. Die Gesamtaufnahmedauer der Experimente lag zwischen 2-8 h, z.B. 1272 Aufnahmen; 65 536 Datenpunkte. Eingesetzt wurden, wenn möglich, konzentrierte Lösungen von bis zu 20% w/v, um die Aufnahmedauer zu reduzieren. Die aufgeführten chemischen Verschiebungen variieren mit der Konzentration der Lösung.
BIOLOGISCHE STUDIEN
Chronisch rückkehrende experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (CREAE)-Studien:
Induktion und klinische Bewertung von EAE
CREAE wurde in C57BL/6- und SJL-Mäusen induziert. Die Tiere wurden subkutan mit 100 μg des Neuroantigen-Peptids MOG 35-55 (Aminosäuresequenz MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK Genemed Synthesis, Inc.) oder 1 mg Rückenmarkhomogenat von Mäusen (SCH), in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), durch 10 min Ultraschall bei Zimmertemperatur emulgiert, in unvollständigem Freund's Adjuvans (DIFCO, Detroit, USA), das mit 480 μg Mycobacteria tuberculosis und 60 μg Mycobacteria butyricium (DIFCO, Detroit, USA) versetzt war, an den Tagen 0 und 7 wie früher beschrieben injiziert (Morris-Downes, MM., et al., 2002). Um die Erkrankung zu optimieren, erhielten die Mäuse zusätzlich 200 ng (intraperitoneal) Bordetella pertussis Toxin, gelöst in PBS, 1 h und 24 h nach der Immunisierung mit dem MOG-Neuroantigen und bei SCH an den Tagen 0, 1, 7 und 8 verabreicht.
Die Tiere wurden von Tag 5 an gewogen und täglich auf klinische neurologische Anzeichen von zwei erfahrenen Forschern untersucht und gemäß einem früher validierten Benotungssystem eingestuft (Morris-Downes, MM. et al., 2002 und andere): 0 = normal; 1 = schlaffer Schwanz und Füße; 2 = beeinträchtigter Korrekturreflex; 3 = partielle Lähmung der hinteren Gliedmaßen; 4 = komplette Lähmung der hinteren Gliedmaßen; 5 = sterbend; 6 = tot. Die Tiere, die klinische Anzeichen eines geringeren Schweregrads als üblich beobachtet wird aufweisen, wurden mit einer um 0,5 geringeren Stufe als angezeigt bewertet.
Literatur

Morris-Downes, MM., et al., (2002). Pathological and regulatory effects of anti-myelin antibodies in experimental allergic encephalomyelitis in mice. J. Neuroimmunol. 125, 114-124.

Der Durchschnitts-EAE-Wert der Gruppe wurde bei jeder Versuchsgruppe mit der jeweiligen Vergleichsgruppe mittels nicht-parametrischer statistischer Analyse (Mann Whitney U-Test) verglichen.
Alle MOG-CREAE-Studien umfassten die Behandlung einer Kontrollgruppe (C-C-C oder Salzlösung, je nach obiger Studie). Jedes künstliche Lipid wurde in 3 Dosierungsgraden getestet, sämtliche Behandlungen erfolgten durch orale Verabreichung über 2 Wochen beginnend an Tag 7 nach der Inokulation. Alle Behandlungsgruppen enthielten 10 Tiere. Nach Beendigung der Studien (Tag 21) wurden Gehirn und Rückenmark entfernt und die Hälfte der Proben auf Anzeichen von Orten der Infiltration perivaskulärer mononuklearer Leukozyten im ZNS und Demyelinierung untersucht.
Folgende Studien wurden durchgeführt:

Studie 2: Rückenmarkhomogenat (SCH) EAE in SJL-Mäusen EAE-Induktion: 1 mg SCH Tag 0 + Tag 7 subkutan. 200 ng Pertussis-Toxin Tag 0, 1, 7 & 8 intraperitoneal. 10 Mäuse/Gruppe. Die Mäuse wurden von Tag 7 bis 21 mit CCC oder CGC behandelt.
Studie 3: SCH EAE in SJL-Mäusen: Behandlung von PSD 7 bis 21, beide Tage inklusive.
Studie 4: MOG EAE in C57BL-Mäusen: Behandlung von PSD 7 bis 21, beide Tage inklusive.
Studie 5: SCH EAE in SJL-Mäusen: Behandlung von PSD 5 bis 18, beide Tage inklusive.
Studie 6: MOG EAE in C57BL-Mäusen: Behandlung an Tagen 5 bis 21 inklusive, mit Ausnahme der C-DHLA-C-Gruppe, bei denen die Behandlung von Tag 5 bis 15 inklusive erfolgte. Die Tiere wurden an PSD 25 getötet. [Fünf Tiere einer unbehan delten Gruppe, 3 Tiere einer Kontrollgruppe mit CCC-Behandlung, 5 Tiere einer Gruppe mit 150 μl GGG-Behandlung und 2 Tiere einer Gruppe mit 350 μl GGG-Behandlung wurden zur histologischen Analyse an PSD 20 entnommen.]
Studie 7: SCH EAE IN SJL-Mäusen Behandlung an Tagen 6 bis 20 inklusive.

Studie 2 – Rückenmarkhomogenat (SCH) in SJL-Mäusen: getestet CGC (50/150/350 μl); CCC (350 μl). GGG (50/350 μl) [Schwere Erkrankung beobachtet]
Studie 3 – SCH/SJL-Mäuse: getestet CCC (50/150/350 μl) CGC (25/50/150/350 μl) GGG (50/150/350 μl) OGO (25/50/150/350 μl) [Schwere Erkrankung beobachtet]
Studie 4 – MOG/C57BL-Mäuse: getestet CCC (50/150/350 μl) CGC (25/50/150/350 μl) GGG (50/150/350 μl) OGO (25/50/150/350 μl)
Studie 6 – MOG/C57BL-Mäuse: getestet CCC (150 μl) C-DHLA-C (50 μl) CAC (50/350 μl) AAA (50/150 μl) GCG (50 μl) CGC (50 μl) GGG (150/350 μl) [Pathologie: CCC; GGG]

Die histologische Untersuchung der entnommenen Gehirn- und Rückenmarkproben zeigten Läsionen, wie sie für experimentelle allergische Enzephalomyelitis üblich sind.
Örtlich begrenzte und diffuse Läsionen wurden durch Gliose, Myelin-Vakuolisierung, axonale Degeneration und perivaskuläre Ansammlung von Lymphozyten, Makrophagen und Neutrophilen festgestellt.
Rückenmarksläsionen wurden größtenteils in der subpialen weißen Substanz lokalisiert und Gehirnläsionen traten meistens in der weißen Substanz des Cerebellums auf. Die Läsionen im Rückenmark waren schwerer als die im Gehirn und während alle Tiere mit Gehirnläsionen auch Läsionen im Rückenmark aufwiesen, hatten nicht alle Tiere mit Rückenmarksläsionen auch Läsionen im Gehirn.
Die Unterschiede in der Schwere der Veränderungen zwischen einzelnen Mäusen wurde unter Verwendung eines halbquantitativen Fünfpunkte-Bewertungssystems zusammengefasst.
Unbehandelte Mäuse hatten histologische Werte von 3-4, die mit EAE-Werten von 1,5-3 korrelierten. Eine Maus wies kaum pathologische Veränderungen auf und hatte einen Wert von Null. Bei den mit GGG behandelten Mäusen zeigte die Mehrzahl keine Abnormalitäten. Zwei Mäuse dieser Gruppe hatten histologische Werte von 2 bzw. 3, die mit EAE-Schwere-Werten von 1 und 1,5 korrelierten.
Die Ergebnisse der vier Studien sind in den 11 bis 20 nachstehend dargestellt.
Diese zeigen, dass die Verbindungen G-G-G, A-A-A, C-G-C, C-DHGLA-C und C-A-C alle in der Lage sind, die Schwere von CREAE zu reduzieren, während die Verbindungen G-C-G und C-C-C die Erkrankung nicht behandeln konnten. Die Verbindung O-G-O wirkt vermutlich, wenn die Dosis angepasst wird.
Wie in der Beschreibung gewarnt wurde, sind die Arachidonsäure-Verbindungen effektiv, führen jedoch zum Tod einiger Tiere. Die überlebenden Tiere wiesen eine stark verringerte Erkrankung auf. Es wird angenommen, dass die Dosis dieser Verbindungen noch weiter reduziert werden kann, um ein Überleben mit einer zufriedenstellenden Behandlung zu erzielen.
Einige der Studien zeigen eine Reaktion in Form einer Glockenkurve für die Verbindungen C-G-C und G-G-G, was nahe legt, dass sehr hohe Dosen nicht optimal sind, wie oben dargelegt. Eine solche Dosierung kann vom Fachmann einfach bestimmt werden, z.B. durch Dosissteigerung und Beobachtung der Veränderungen des von PBMC spontan freigesetzten TGF-β1/TNF-α-Verhältnisses.
In Anbetracht der Ergebnisse mit hohem sn-2 γ-Linolensäuregehalt aus PCT/GB04/002089, der Wirkungslosigkeit von Öl schwarzer Johannisbeeren mit geringen sn-2 Gehalt und G-C-G bei CREAE und der Wirksamkeit von C-G-C und C-DHGLA-C geringer Dosis in 20 kann man sehen, dass sn-2 γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-linolensäure- und Arachidonsäurelipide eine neue Behandlung bei MS darstellen, die das Ergebnis jeder derzeitigen Therapie bei weitem übertrifft, insofern, als Läsionen und schwerwiegende Symptome behoben werden: abnehmende EDSS-Werte über einen Zeitraum von Jahren wurden bisher mit anderen Behandlungen nicht erzielt.
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Zusammenfassung
Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen
Ein Verfahren wird bereitgestellt zur Behandlung eines Patienten, der an einer neurodegenerativen Erkrankung leidet, welches das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Dosis eines Fettglyzerids, das einen Glyzerinrest und einen Fettsäurerest enthält, an diesen Patienten umfasst, wobei der Fettsäurerest ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus γ-Linolensäure, Dihomo-γ-Linolensäure und Arachidonsäure, dadurch gekennzeichnet, dass der ausgewählte Fettsäurerest an den Glyzerinrest in dessen sn-2 Position gebunden ist. Bevorzugt wird ein Verfahren, in dem das Lipid für die Dauer und in einer Dosis verabreicht wird, welche ausreichen, den TGF-β1-Spiegel im Patienten auf therapeutischem Niveau zu halten oder auf ein solches anzuheben.

Claims

Ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an einer neurodegenerativen Krankheit leidet, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis eines Lipidglyzerids festgelegter Struktur, das einen Glyzerinrest aufweist, der mit einem oder mehreren Fettsäureresten verestert ist, an diesen Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid einen Fettsäurerest an der sn-2 Position aufweist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure und Arachidonsäure.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei bei der neurodegenerativen Krankheit eine Demyelinierung auftritt.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Behandlung speziell die zugrundeliegende Neurodegeneration anhält und neurale Funktion wiederherstellt.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, das die neuronale Membranzusammensetzung bezüglich des γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-linolensäure- und Arachidonsäure-Lipidgehalts normalisiert.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, das gesunde TGF-β1/TNF-α-Verhältnisse wiederherstellt, wie sie durch spontane Freisetzung bei der Freisetzung von peripheren mononuklearen Blutzellen gemessen wird.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Krankheit Multiple Sklerose ist.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Krankheit eine Rückkehr-Remissions-Multiple Sklerose, primär progressive Multiple Sklerose oder chronisch progressive Multiple Sklerose ist.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Krankheit Multiple Sklerose ist und die Behandlung teilweise oder vollständig die neuronale Funktion oder neuronale Integrität wiederherstellt, wie sie anhand von einem oder mehreren aus MRI-Aufnahmen, CAT-Aufnahmen oder mittels EDSS-Wert gemessen wird.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Behandlung einer cerebralen Beeinträchtigung nach Schlaganfall, Schädeltrauma und intrakranieller Blutung, Alzheimer-Erkrankung oder Parkinson-Erkrankung erfolgt, wobei eine Demyelinierung oder ein neuronaler Schaden vorliegt.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Lipid für eine Dauer und in einer Dosis verabreicht wird, die ausreichen, den TGF-β1-Spiegel des Patienten auf einem therapeutischen Niveau zu halten oder auf ein solches anzuheben.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Lipid für eine Dauer und in einer Dosis verabreicht wird, die ausreichen, den TGF-β1-Spiegel des Patienten so zu halten oder derart anzuheben, dass das TGF-β1/TNF-α-Verhältnis, das aus peripheren mononuklearen Blutzellen spontan freigesetzt und aus dem Blut des Patienten isoliert wird, nach 18 Monaten einer täglichen Dosierung 0,4 bis 3,0, zumindest 0,5, bevorzugt zumindest 0,75, und am meisten bevorzugt zumindest 1 beträgt.
Verfahren wie in Anspruch 11 beansprucht, wobei die Dosis derart ist, dass ein TGF-β1/IL-1β-Verhältnis in aus dem Blut des Patienten isolierten PBMC nach 18 Monaten einer täglichen Dosierung von zumindest 0,75 erzeugt wird.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Menge an verabreichtem Lipid zwischen 0,5 und 30 Gramm, üblicherweise 3 bis 5 Gramm, pro Tag beträgt.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Lipid ein Monoglyzerid, Diglyzerid oder Triglyzerid ist, das zumindest einen sn-2 γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-linolensäure- oder Arachidonsäurerest aufweist, und das Lipid die allgemeine Formel I besitzt
Formel I wobei R¹ und R³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff und Acylgruppen, und R² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-linolensäure- und Arachidonsäureresten, deren Carbonylkohlenstoff an den Sauerstoff des Glyzerinrests gebunden ist.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei R¹ und R³ gesättigte Fettsäurereste der Formel -CO(CH₂)_n-CH₃ sind, wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 22 ist.
Verfahren wie in Anspruch 15 beansprucht, wobei R¹ und R³ gleich sind und n eine ganze Zahl zwischen 5 und 12 ist.
Verfahren wie in Anspruch 16 beansprucht, wobei n eine ganze Zahl zwischen 6 und 10 ist.
Verfahren wie in Anspruch 14 beansprucht, wobei R¹ und R³ ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus essentiellen Fettsäuren oder physiologisch akzeptablen Fettsäuren, die vom menschlichen Körper metabolisiert werden können.
Verfahren wie in Anspruch 14 beansprucht, wobei R¹, R² und R³ alle gleich und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-linolensäure- und Arachidonsäureresten.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Lipidglyzerid festgelegter Struktur enthält, welches einen Glyzerinrest aufweist, der mit einem oder mehreren Fettsäureresten verestert ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid einen Fettsäurerest an der sn-2 Position aufweist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer Neurodegeneration, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Lipidglyzerid festgelegter Struktur enthält, welches einen Glyzerinrest aufweist, der mit einem oder mehreren Fettsäureresten verestert ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid einen Fettsäurerest an der sn-2 Position aufweist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure und Arachidonsäure.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer demyelinierenden Erkrankung, die einen Glyzerinrest aufweist, der mit einem oder mehreren Fettsäureresten verestert ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid einen Fettsäurerest an der sn-2 Position aufweist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure und Arachidonsäure.
Ein Lipid der Formel II
wobei R¹ und R³ gleich und -C(O)(CH₂)_nCH₃ sind, wobei n ausgewählt ist aus 4 bis 14, bevorzugt 6 bis 10 und am meisten bevorzugt 7, 8 oder 9 ist, und R² ausgewählt ist aus γ-Linolenyl-, Dihomo-γ-linolenyl- und Arachidonylresten.
Die Verwendung eines Lipidglyzerids festgelegter Struktur, das einen Glyzerinrest aufweist, der mit einem oder mehreren Fettsäureresten verestert ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid einen Fettsäurerest an der sn-2 Position aufweist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure und Arachidonsäure, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neurodegenerativen Krankheit.
Verwendung wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei die degenerative Krankheit eine demyelinierende Erkrankung ist.
Verwendung wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei die Krankheit Multiple Sklerose ist.
Verwendung wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei das Medikament die neuronale Membranzusammensetzung bezüglich der γ-Linolensäure-, Dihomo-γ-linolensäure- und Arachidonsäurekonzentration der Lipide normalisiert.
Verwendung wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei das Medikament das TGF-β1/TNFα-Verhältnis, das von peripheren mononuklearen Blutzellen eines Patienten spontan freigesetzt wird, wieder auf ein gesundes Niveau bringt.
Verwendung wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei die Behandlung von Multipler Sklerose oder den degenerativen Folgeerkrankungen, die mit Schädeltrauma, Schlaganfall und intrakraniellen Blutungen verbunden sind oder neuronaler Schäden, die durch Alzheimer- oder Parkinson-Erkrankung verursacht werden, erfolgt.
Verwendung wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei das Medikament Läsionen des ZNS behebt.
Verwendung wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei das Medikament Muskelspastizität und/oder Schmerzen lindert.
Verwendung wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei das Medikament Rückfälle verhindert.
Verwendung wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei das Medikament den EDSS-Wert um zumindest 1 Einheit über einen Behandlungszeitraum von 1 Jahr verbessert.
Verwendung wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei das Medikament ausreicht, den EDSS-Wert eines Patienten mit einem EDSS-Wert über 2,5 auf unter 2 über einen Behandlungszeitraum von 1 Jahr zurückzubringen.
Verwendung wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei eine Verbesserung der Blasenkontrolle auftritt.
Ein Verfahren zur Synthese einer Verbindung der allgemeinen Formel III
wobei R¹ und R³ gleich und -C(O)(CH₂)_n-CH₃ sind, wobei n zwischen 4 und 14, bevorzugt 6 bis 10 und am meisten bevorzugt 7, 8 oder 9 ist, und R² ein γ-Linolenylrest, Dihomo-γ-linolenylrest oder Arachidonylrest ist, umfassend die Reaktion von 1,3-Dihydroxyaceton mit einer Verbindung der Formel X-C(O)(CH₂)_n-CH₃, wobei X ausgewählt ist aus Cl, Br und I, wobei die entsprechende 1,3-Di-(C(O)(CH₂)_n-CH₃)-2-keto-Verbindung erhalten wird, die Reduktion der Keto-Gruppe zum entsprechenden 1,3-Di-(C(O)(CH₂)_n-CH₃)-2-ol und die Reaktion dessen mit γ-Linolenylhalogenid oder Dihomo-γ-linolenylhalogenid oder Arachidonylhalogenid, wobei das Halogenid Chlorid, Bromid oder Iodid ist.
Ein Verfahren zur Synthese einer Verbindung der allgemeinen Formel IV
wobei R¹ bis R³ gleich und ausgewählt sind aus γ-Linolenylrest, Dihomo-γ-linolenylrest oder Arachidonylrest, umfassend die Reaktion des entsprechenden γ-Linolenylhalogenids, Dihomo-γ-linolenylhalogenids oder Arachidonylhalogenids, wobei das Halogenid Chlorid, Bromid oder Iodid ist, mit Glyzerin.
Ein Lipid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus, Glyzerin-1,3-didecanoat-2-octadecatri-(6Z,9Z,12Z)-enoat, Glyzerin-1,3-didecanoat-2-icosatri-(8Z,11Z,14Z)-enoat, Glyzerintriicosatetra-(5Z,8Z,11Z,14Z)-enoat.
Ein Lipid wie in Anspruch 38 beansprucht zur Verwendung bei einer Therapie.