DE69214891T2 - Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 7-Amino-Cephalosporansäure - Google Patents
Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 7-Amino-CephalosporansäureInfo
- Publication number
- DE69214891T2 DE69214891T2 DE69214891T DE69214891T DE69214891T2 DE 69214891 T2 DE69214891 T2 DE 69214891T2 DE 69214891 T DE69214891 T DE 69214891T DE 69214891 T DE69214891 T DE 69214891T DE 69214891 T2 DE69214891 T2 DE 69214891T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- formula
- ncimb
- carried out
- compounds
- microorganism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 5
- HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 7beta-aminocephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H]12 HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 0.000 title description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 28
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 8
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- 241001673062 Achromobacter xylosoxidans Species 0.000 claims description 4
- 241000736110 Sphingomonas paucimobilis Species 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims description 3
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 3
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 18
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 abstract description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract description 3
- 241000590020 Achromobacter Species 0.000 abstract description 2
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 16
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 6
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- IXUSDMGLUJZNFO-BXUZGUMPSA-N (7R)-7-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCCC(O)=O)[C@@H]12 IXUSDMGLUJZNFO-BXUZGUMPSA-N 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 D-5-amino-5-carboxypentanoyl side chain Chemical group 0.000 description 4
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N cephalosporin C Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylpiperidin-4-one Chemical compound CS(=O)(=O)N1CCC(=O)CC1 RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 3
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)benzaldehyde Chemical compound CN(C)C1=CC=C(C=O)C=C1 BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 125000003460 beta-lactamyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000012610 weak anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- HSHGZXNAXBPPDL-IOJJLOCKSA-N (6r)-3-(acetyloxymethyl)-7-amino-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)C(N)[C@@H]12 HSHGZXNAXBPPDL-IOJJLOCKSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanoic acid Chemical group CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N Clavulanic acid Natural products OC(=O)C1C(=CCO)OC2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589519 Comamonas Species 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 102000004674 D-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010003989 D-amino-acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004157 Nitrosyl chloride Substances 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000122973 Stenotrophomonas maltophilia Species 0.000 description 1
- 241001480014 Trigonopsis Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003781 beta lactamase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940126813 beta-lactamase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- YGBFLZPYDUKSPT-MRVPVSSYSA-N cephalosporanic acid Chemical class S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)C[C@H]21 YGBFLZPYDUKSPT-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N clavulanic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N 0.000 description 1
- 229960003324 clavulanic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical class [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- VPCDQGACGWYTMC-UHFFFAOYSA-N nitrosyl chloride Chemical compound ClN=O VPCDQGACGWYTMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019392 nitrosyl chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000006395 oxidase reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- UHZYTMXLRWXGPK-UHFFFAOYSA-N phosphorus pentachloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)(Cl)Cl UHZYTMXLRWXGPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
- C12P35/02—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin by desacylation of the substituent in the 7 position
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/025—Achromobacter
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/834—Bacillus cereus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 7-Aminocephalosporansäuren der Formel
- in der R ein Wasserstoffatom, eine OH-Gruppe oder einen Rest O-CO-R" darstellt, wobei R" einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, ein Verfahren, das die Durchführung einer enzymatischen Umwandlung von Verbindungen der folgenden Formel umfaßt,
- in der R' eine Carboxylgruppe bedeutet.
- 3-Acetoxymethyl-7-aminoceph-3-em-4-carbonsäure oder 7- Aminocephalosporansäure (7-ACA) ist eine Verbindung, die für die Industrie von großem Interesse ist, da sie für die Synthese von Cephalosporansäurederivaten eingesetzt wird, die eine antibakterielle biologische Aktivität besitzen. Dieses Produkt wird erhalten, indem die Seitenkette von Cephalosporin C [3- Acetoxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamid)-ceph-3-em-4- carbonsäure] entfernt wird.
- Industrielle Verfahren zur Deacylierung von Cephalosporin C werden chemisch durchgeführt, z.B. mittels Nitrosylchlorid in Ameisensäure in Gegenwart von Acetonitril (US-Patent 3 367 933).
- Ein anderes Verfahren umfaßt den Schutz der Carboxylgruppe der Aminopentansäurekette, die Umsetzung mit Phosphorpentachlorid und die anschließende Hydrolyse bei niedriger Temperatur mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (Belg. Patent 718 824).
- Diese Verfahren müssen im allgemeinen bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden und machen die Verwendung von teuren und toxischen Lösungsmitteln und Reagenzien erforderlich, wodurch große Probleme bezüglich Entsorgung und Umwelt entstehen können. Außerdem müssen wegen der Instabilität des β-Lactamrings spezielle Reaktionsbedingungen eingehalten werden (niedrige Temperaturen, Mitverwendung von Lösungsmitteln usw.), die das Verfahren vom industriellen Standpunkt her erschweren.
- Außerdem sind enzymatische Verfahren für die Deacylierung von Cephalosporin 0 in Position 7 bekannt. Z.B. besteht die Möglichkeit, spezifische Acylasen für die 0-Aminoadipinsäurekette von Cephalosporin 0 zu verwenden (FR 2 241 557, USP 4 774 179, EP-A 283 218). Diese Verfahren sind jedoch häufig nicht reproduzierbar und durch geringe Ausbeuten und lange Reaktionszeiten gekennzeichnet.
- Andererseits gibt es Verfahren, bei denen Cephalosporin mittels zweier enzymatischer Schritte in 7-AOA umgewandelt wird und die für die industrielle Herstellung interessant sind. Der erste Schritt besteht aus der Verwendung einer D- Aminosäureoxidase, z.B. des Enzyms, das aus einem zu den Trigonopsis-Arten gehörenden Mikroorganismus stammt (UK-Patent 1 272 769), das die D-5-Amino-5-carboxypentanoyl-Seitenkette in Verbindungen der Formel II oxidiert. Diese Verbindungen werden anschließend hydrolysiert, so daß 7-Aminocephalosporansäure erhalten wird, wobei ein spezifisches Enzym verwendet wird, das durch einen zu den Comamonas-Arten gehörenden Mikroorganismus produziert wird (US-Patent 3 960 662), das die Verbindungen der Formel II unter Erhalt der entsprechenden Derivate der Formel I deacyliert.
- Die vorliegende Erfindung betrifft also ein biotechnisches Verfahren, das aus der selektiven Deacylierung von Verbindungen der Formel II durch Verwendung eines Mikroorganismus oder eines darin enthaltenen Enzyms mit Acylase-Aktivität besteht.
- Diese Verfahren und alle enzymatischen Verfahren im allgemeinen sind vom industriellen Standpunkt her deshalb interessant, weil sie die mit der chemischen Synthese zusammenhängenden Probleme vermeiden, nämlich die Bereitstellung und Verwendung von Verbindungen, die für die Umwelt toxisch und schädlich sind.
- Enzymatische Umsetzungen werden nämlich im allgemeinen in einer wäßrigen Umgebung unter Bedingungen mit mittlerem pH- Wert und mittlerer Temperatur durchgeführt, wobei keine toxischen Substanzen oder Lösungsmittel eingesetzt werden.
- Die Verwendung von Mikroorganismen oder Enzymen daraus, die Verbindungen der Formel II, wobei R eine -COOH-Gruppe bedeutet, deacylieren können, wodurch 7-ACA erhalten wird, wurde z.B. in EP-A-0 275 901 und für die Herstellung von 7-ACA aus Glutaryl-7-ACA in FR-A-2 258 448 und in US-A-3 960 662 beschrieben.
- Ein Problem, das manchmal bei enzymatischen Verfahren auftritt, betrifft die geringe Selektivität der verwendeten Enzymarten. Der Anmelder hat jedoch verschiedene Mikroorganismen mit einer hohen Acylase-Aktivität ausgewählt, welche in der Deacylierung von Verbindungen der Formel II hochselektiv sind.
- Die vorliegende Erfindung betrifft folglich ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 7-Aminocephalosporansäuren der Formel (I)
- in der R' ein Wasserstoffatom, eine OH-Gruppe oder einen Rest O-CO-R" darstellt, wobei R" einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, umfassend die Durchführung einer selektiven Deacylierung von Verbindungen der folgenden Formel (II)
- in der R' eine -COOH-Gruppe bedeutet, in Gegenwart von
- (a) einem Mikroorganismus, ausgewählt aus
- Achromobacter xylosoxidans 13/D7, NCIMB 40407,
- Pseudomonas paucimobilis 4S/E7, NCIMB 40408,
- Pseudomonas sp. 13/F7, NCIMB 40409,
- Bacillus sp. 13/F8, NCIMB 40410,
- Bacillus cereus 146/1, NCIMB 40411, oder
- (b) einer Mutante davon, die noch die Enzymaktivität des Mikroorganismus in Bezug auf die Verbindungen der Formel (II) besitzt, oder
- (c) dem Enzym in freier Form oder immobilisiert, das zur selektiven Entfernung der Seitenkette von den Verbindungen der Formel (II) fähig ist, welches von dem Mikroorganismus oder einer Mutante davon stammt.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erweist sich bei der Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure als besonders wirksam, wobei als Ausgangsverbindung das Glutarylderivat verwendet wird.
- Die isolierten Mikroorganismen, die den Stämmen 13/D7, 13/F7, 13/F8, 45/E7 und 146/1 entsprechen und in einer Nährbrühe bei einem pH-Wert von 7 oder in einem Nähragar gezüchtet werden, haben die folgenden morphologischen Merkmale: Biochemische und physiologische Merkmale der Stämme 13/D7. 4S/E7 und 13/F7 Physiologische und biochemische Merkmale der Stämme 13/F8 und 146/1
- Die bei der morphologischen und biochemischen Untersuchung der in der Erfindung verwendeten Mikroorganismen erhaltenen Ergebnisse wurden mit den taxonomischen Merkmalen verglichen, die in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1. Aufl., 1986, und in "The Prokaryotes", Bd. I, 1981, beschrieben werden. Die Stämme 13/D7, 13/F7 und 4S/E7 erwiesen sich als gramnegativ, sie bilden keine Sporen, sind aerob und gehören daher zu den Gattungen Achromobacter und Pseudomonas. Insbesondere der Stamm 13/D7 wurde als Achromobacter xylosoxidans klassifiziert und bei NCIMB unter der Nummer 40407 registriert.
- Der Stamm 4S/E7 ergibt beim cytochromoxidase-Test eine negative Reaktion, eine Besonderheit von Pseudomonas maltophilia und Pseudomonas paucimobilis, während die anderen Arten von Pseudomonas im allgemeinen Oxidase-positiv sind. Der Test der Lysinverwertung zeigte ein negatives Ergebnis, was die Identifizierung des isolierten Mikroorganismus als Pseudomonas paucimobilis ermöglichte, der bei NCIMB unter der Nummer 40408 hinterlegt wurde. Die Stämme 13/F7, 13/D7b und 146/H9 ergeben eine positive Oxidase-Reaktion und besitzen alle Merkmale der Pseudomonas-Arten. Aus diesem Grund wurden sie als Pseudomonas sp. klassifiziert und bei NCIMB unter der Nummer 40409, 40473 bzw. 40474 hinterlegt.
- Die Mikroorganismen 13/F8 und 146/1 besitzen die Merkmale der Gattung Bacillus: sie sind grampositiv, bilden Endosporen, sind stäbchenförmig, Aerobier und Katalase-positiv. Insbesondere der Stamm 146/1 besitzt die physiologischen und biochemischen Merkmale von Bacillus cereus und wurde als solcher bei NCIMB unter der Nummer 40411 hinterlegt, wohingegen der Stamm 13/F8 als Bacillus spp. klassifiziert und bei NCIMB unter der Nummer 40410 hinterlegt wurde.
- Alle vorstehend beschriebenen Mikroorganismen erzeugen ein Enzym, das als 7-ACA-Acylase definiert ist, deren Aktivität festgestellt wird, indem die ganzen Zellen der isolierten Mikroorganismen verwendet werden; folglich ist für die Bestimmung der Acylase-Aktivität kein mechanischer Aufbruch der Zellwand, z.B. durch Ultraschall, erforderlich.
- Dieses Enzym kann induziert werden, denn die enzymatische Aktivität steigt an, wenn die Mikroorganismen in Gegenwart von geeigneten Induktoren, wie z.B. Glutarsäure, in Konzentrationen von 0,1 bis 0,05 % gezüchtet werden. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen wurden unter herkömmlichen Fermentationsbedingungen gezüchtet, wobei sie ein Kulturmedium benötigen, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze sowie eine Vitaminquelle enthält.
- Als Kohlenstoffquelle können organische Säuren oder einfache Zucker verwendet werden; die Stickstoffquelle kann aus Maisquellwasser, Pepton oder Casein bestehen; Hefeextakt kann als Vitaminguelle eingesetzt werden; die anorganischen Salze bestehen im allgemeinen aus Magnesium-, Eisensulfaten und -phosphaten.
- Außerdem werden die Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff und Glutarsäure bei einer Temperatur im Bereich von 28 bis 30ºC drei bis fünf Tagen gezüchtet, während dieser Zeit finden Induktion und Produktion des Acylase-Enzyms statt.
- Die Umsetzung kann mit ganzen Zellen durchgeführt werden, denn das Acylase-Enzym liegt vermutlich auf der Zellwand und das Reaktionsprodukt wird in die äußere Umgebung ausgeschieden. In einer anderen Ausführungsform können Zellysate oder Enzympräparate mit unterschiedlichem Reinigungsgrad verwendet werden, oder Zellen können eingesetzt werden, deren Zellwand permeabel gemacht wurde. Für diesen Zweck können 2,5 % Toluolund 2,5 % Ethanollösungen zu gleichen Teilen verwendet werden.
- Die Lysate können hergestellt werden, indem die Zellen der vorstehenden Mikroorganismen in geeigneten Pufferlösungen, z.B. 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, suspendiert und anschließend Ultraschallbehandlungen von jeweils etwa einer Minute unterzogen werden. Die auf diese Weise erhaltenen Proben werden zentrifugiert, wobei die Acylase-Aktivität im Überstand verbleibt.
- Eine partielle Reinigung der Acylase aus Zellysaten kann durch fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfat erhalten werden. Eine höhergradige Reinigung kann durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen, wie z.B. eines schwachen Anionenaustauscherharzes (DEAE), oder mittels Gelfiltration erhalten werden.
- Das Vorliegen von β-Lactamase in den isolierten Mikroorganismen kann bestimmt werden, indem Nitrocephin (Oxoid) verwendet wird, eine β-Lactamverbindung, die nach enzymatischer Hydrolyse des β-Lactamrings aufgrund der β-Lactamase eine Farbänderung zeigt (O'Callaghan et al., Antimicr. Ag. and Chem. 1 (1972), 283-288). Diese Farbänderung kann durch Spektrophotometrie bei 482 nm gemessen werden. Die Acylase-Aktivität kann durch spektrophotometrische Bestimmung der 7-ACA gemessen werden, die aus der Ausgangsverbindung Glutaryl-7-ACA erzeugt wird. Insbesondere kann das kolorimetrische Verfahren zur Bestimmung von 6-APA eingesetzt werden, das von Balasingham et al. [Biochim. Biophys. Acta, 276 (1972), 250] beschrieben wird und das auf 7-ACA umgestellt wurde. 100 µl einer 65 mM Lösung von Gl-7-ACA in einem 0,1 M Phosphatpuffer werden zu 900 µl Zellsuspension in einem 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, zugegeben, zu der 3 mg Kahumdavulanat zugefügt wurden, sofern die Zellen eine β-Lactamase-Aktivität besitzen, und das Gemisch anschließend eine Zeitspanne im Bereich von 30 Minuten bis 5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Zu der festgelegten Zeit wird das Reaktionsgemisch zentrifugiert und 0,5 ml Überstand abgenommen, zu welchem 3 ml einer 2:1-Lösung von 20 % Essigsäure und 0,5 M NaOH zugefügt werden. Diese Lösung wird zur Blockierung der enzymatischen Reaktion zugegeben. Sodann wird die Probe mit 0,5 ml p-Dimethylaminobenzaldehyd (PDAB) versetzt und nach Entwicklung der Farbe die Absorption bei 415 nm gemessen.
- Die Acylase-Aktivität (U/ml, Einheit pro Milliliter), wobei die Einheit als die Enzymmenge definiert ist, die 1 µMol Substrat in einer Minute umwandelt, wird gemäß der folgenden Formel bestimmt:
- wobei D415 die Absorptionsdifferenz bei 415 nm, d der Verdünnungsfaktor, sofern dies erforderlich ist, 0,4 der Extinktionskoeffizient von 7-ACA (µm/ml) und t die Reaktionszeit in Minuten ist.
- Die Deacylierungsreaktion wird in einer Pufferlösung bei einem pH-Wert von 6 bis 9, vorzugsweise 7 bis 8,5, und bei einer Temperatur im Bereich von 5 bis 50ºC, vorzugsweise 20 bis 40ºC, durchgeführt. Das Substrat kann bis zu einer Konzentration von 2 % (Gew./Vol.), vorzugsweise 0,1 bis 1 %, verwendet werden. Wenn die ganzen Zellen eingesetzt werden, wird das Reaktionsgemisch nicht nur mittels Thermostat reguliert, sondern auch unter Rühren gehalten, so daß das Substrat gleichmäßig verteilt wird.
- Am Ende der Umsetzung kann das Produkt der Formel I gewonnen werden, indem der Überstand nach Zentrifugation des Reaktionsgemisches an eine Säule adsorbiert wird, die mit einem schwachen Anionenaustauscherharz, wie z.B. DEAE-Sephadex , gefüllt ist. Diese Säule wird sodann mit destilliertem Wasser und mit einer NaCl-Lösung gewaschen. Die das Produkt der Formel 1 enthaltenden Fraktionen werden eingeengt, auf einen pH- Wert unter 5 gebracht und mehrere Stunden bei einer niedrigen Temperatur stehengelassen. Sobald ein Niederschlag entstanden ist, wird er abgetrennt und unter Vakuum getrocknet.
- Ein Fermentationsprozess mit einem Volumen von 1 Liter wurde in einem Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung durchgeführt:
- Hydrolysiertes Casein sauer 2 % (Gew./Vol.)
- Natrium-L-glutamat 0,5 %
- Hefeextrakt 0,5 %
- Maisquellwasser 0,2 % (Vol./Vol.)
- Glutarsäure 0,1 %
- pH-Wert 9,5
- Nach Sterilisation bei 121ºC für 25 Minuten wurde das Medium mit Zellen des Mikroorganismus 13/D7 beimpft, die aus einer Übernacht-Kultur in Nährbrühe stammten. Nach vier Tagen Fermentation bei 28ºC und unter Rühren mit 200 UPM wurden die Zellen abzentrifugiert, die Acylase-Aktivität, die mit dem spektrophotometrischen Test von Balasingham gemessen wurde, betrug 4,7 Einheiten pro Liter Fermentationsbrühe.
- Anschließend wurden die Zellen in 50 ml 25 mM Phosphatpuffer, pH 7, resuspendiert. 210 mg Glutaryl-7-ACA wurden zu diesem Gemisch zugegeben. Außerdem wurde eine wäßrige Lösung von Clavulansäure bis zu einer Konzentration von 3 mg/ml zum Reaktionsgemisch zugesetzt, um die β-Lactamase-Aktivität zu hemmen. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren bei 37ºC gehalten. Nach fünf Stunden wurde festgestellt, daß das Substrat unter Erzeugung von 7-Aminocephalosporansäure fast vollständig verschwunden war. Die Umwandlung betrug 91 % und wurde durch HPLC (RP-C18-Säule, 15 x 0,46 cm, Laufmittel 25 mM Phosphatpuffer, pH 4,4, und Acetonitril, 95:5) bestimmt.
- Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert und der überstand auf eine 100 ml-Säule adsorbiert, die das Harz DEAE Sephadex A25 enthielt.
- Die Säule wurde mit 100 ml destilliertem Wasser und mit 200 ml einer 0,05 M Naal-Lösung gewaschen, wodurch die 7-ACA eluiert wurde.
- Die 7-ACA enthaltenden Fraktionen wurden eingeengt und ihr pH-Wert mit HCl auf einen Wert von 4 gebracht, sodann wurden sie eine Nacht bei 5ºC stehengelassen. Der Niederschlag wurde unter Vakuum getrocknet. 74,3 mg 7-Aminocephalosporansäure wurden erhalten. (Elementaranalyse: C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub2;N&sub2;O&sub5;S; berechnet: C 44,11 %, H 4,44 %, N 10,29 %, S 11,78 %; experimentell bestimmt: C 43,9 %, H 4,72 %, N 10,1 %, S 11,2 %)
- Eine Fermentation wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. In diesem Fall wurde der Mikroorganismus 13/F7 verwendet. Die mit dem Balasingham-Verfahren festgestellte Aktivität betrug 3,8 Einheiten pro Liter Fermentationsbrühe. Die Umsetzung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, die Umwandlung betrug 75 %.
- Eine Fermentation wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei als Mikroorganismus der Stamm 146/1 verwendet wurde. Der spektrophotometrische Test nach fünf Tagen Fermentation zeigte eine Acylase-Aktivität von 2 Einheiten pro Liter Brühe. Die Umsetzung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, die Umwandlung betrug 50 %.
- Eine neue Fermentation von einem Liter wurde unter Verwendung des gleichen Kulturmediums wie in Beispiel 1 durchgeführt. Der verwendete Stamm war 4S/E7, der keine β-Lactamase- Aktivität besitzt. Gemäß der spektrophotometrischen Messung, die ohne β-Lactamase-Inhibitoren durchgeführt wurde, betrug die Acylase-Aktivität nach fünf Tagen Fermentation 2,2 Einheiten pro Liter Brühe.
- Die Umsetzung wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß zu dem Gemisch aus Zellen und Substrat keine davulansäure zugegeben wurde. Die Umwandlung, die durch HPLC unter Verwendung der gleichen Analysebedingungen wie in Beispiel 1 bestimmt wurde, betrug 50 %.
- Der Stamm 13/F8 wurde verwendet und eine Fermentation unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Acylase-Aktivität wurde wie in Beispiel 4 nach fünf Tagen Fermentation bestimmt und betrug 4,8 Einheiten pro Liter Brühe.
- Die Umsetzung der Zellen wurde wie in Beispiel 4 durchgeführt, denn der Mikroorganismus enthält auch in diesem Fall keine β-Lactamase.
- Die in diesem Fall beobachtete Umwandlung betrug 95 %.
- 20 g feuchte Zellen, die aus einer Kultur des wie in Beispiel 1 gezüchteten Mikroorganismus 13/D7 stammten, wurden in 40 ml 50 mM Tris-Puffer, 50 mM NaCl, pH 8, suspendiert.
- Die Zellen wurden aufgeschlossen, indem sie siebenmal jeweils zwei Minuten mit Ultraschall (200 Watt) behandelt wurden, wobei die Suspension dazwischen immer wieder gekühlt wurde, so daß ihre Temperatur unter 15ºC blieb. Anschließend wurde die Suspension zur Entfernung der Zelltrümmer zentrifugiert, mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 30 % versetzt und zentrifugiert. Ammoniumsulfat wurde zum Überstand bei einer niedrigen Temperatur bis zu einer Sättigung von 60 % zugegeben. Nach dreißigminütiger Zentrifugation bei 18 000 UPM wurde der feste Rückstand in 50 mM Tris-, 50 mM NaCl-Puffer, pH 8, resuspendiert, dialysiert und auf eine Chromatographiesäule aufgetragen, die mit dem Anionenaustauscherharz DEAE-Sephacel gefüllt und mit dem gleichen Puffer äquilibriert war. Das Acylase-Enzym wurde unter Verwendung eines NaCl-Gradienten von 50 bis 300 mM eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden sodann vereinigt und eingeengt. 7 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, und 40 mg Glutaryl-7-ACA wurden zu 3 ml dieser konzentrierten Lösung (0,3 U/ml) zugegeben. In vier Stunden bei 37ºC wurden das vollständige Verschwinden des Substrats und die Erzeugung von 7-ACA beobachtet. Die Umwandlung, die durch HPLC bestimmt wurde, betrug 95 %.
Claims (8)
1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von
7-Aminocephalosporansäuren mit der folgenden Formel (I)
in der R ein Wasserstoffatom, eine OH-Gruppe oder einen
Rest O-CO-R" darstellt, wobei R" einen Alkylrest mit 1
bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, umfassend die
Durchführung einer selektiven Deacylierung von Verbindungen
der folgenden Formel (II)
in der R¹ eine -COOH-Gruppe bedeutet, in Gegenwart von:
(a) einem Mikroorganismus, ausgewählt aus:
Achromobacter xylosoxidans 13/D7, NCIMB 40407,
Pseudomonas paucimobilis 45/E7, NCTMB 40408,
Pseudomonas sp. 13/F7, NCIMB 40409,
Bacillus sp. 13/F8, NCIMB 40410,
Bacillus cereus 146/1 NCIMB 40411, oder
(b) einer Mutante davon, die noch die Enzymaktivität des
Mikroorganismus in bezug auf die Verbindungen der
Formel (II) besitzt, oder
(c) dem Enzym, in freier Form oder immobilisiert, das
zur selektiven Entfernung der Seitenkette von den
Verbindungen der Formel (II) fähig ist, welches von
dem Mikroorganismus oder einer Mutante davon stammt.
2. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von
7-Aminocephalosporansäuren nach Anspruch 1, wobei die
Deacylierungsreaktion in einer Pufferlösung bei einem pH-Wert
von 6 bis 9 durchgeführt wird.
3. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von
7-Aminocephalosporansäuren nach Anspruch 1, wobei die
Deacylierungsreaktion bei einer Temperatur im Bereich von 5 bis
50ºC durchgeführt wird.
4. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von
7-Aminocephalosporansäuren nach Anspruch 1, wobei die
Deacylierungsreaktion bei einer Konzentration des Substrats der
Formel (II) von bis zu 2 % durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der pH-Wert der
Pufferlösung im Bereich von 7 bis 8,5 liegt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Temperatur im
Bereich von 20 bis 40ºC liegt.
7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Konzentration des
Substrats der Formel (II) im Bereich von 0,1 bis 1 %
liegt.
8. Biologisch reine Kultur von Achromobacter xylosoxidans
13/D7 NCIMB 40407.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITMI912039A IT1250698B (it) | 1991-07-24 | 1991-07-24 | Processo per la preparazione enzimatica di acidi 7-ammino-cefalosporanici. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69214891D1 DE69214891D1 (de) | 1996-12-05 |
| DE69214891T2 true DE69214891T2 (de) | 1997-05-15 |
Family
ID=11360414
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69214891T Expired - Fee Related DE69214891T2 (de) | 1991-07-24 | 1992-07-15 | Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 7-Amino-Cephalosporansäure |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5332663A (de) |
| EP (1) | EP0525861B1 (de) |
| JP (1) | JP3195058B2 (de) |
| AT (1) | ATE144794T1 (de) |
| CA (1) | CA2074032A1 (de) |
| DE (1) | DE69214891T2 (de) |
| DK (1) | DK0525861T3 (de) |
| ES (1) | ES2094278T3 (de) |
| GR (1) | GR3022044T3 (de) |
| IT (1) | IT1250698B (de) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100345994B1 (ko) * | 1994-06-22 | 2002-12-16 | 제일제당주식회사 | 7-아미노세팔로스포란산의효소적제조방법 |
| US5766871A (en) * | 1996-11-27 | 1998-06-16 | Food Industry Research And Development Institute | Screening and characterization of glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase |
| DE19924632B4 (de) | 1999-05-28 | 2006-04-13 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Verzögerung der Desaktivierung von Glutarylamidase während einer Enzymkatalyse |
| AU9688601A (en) | 2000-09-22 | 2002-04-02 | Bristol Myers Squibb Co | Glutaryl cephalosporin amidase from pseudomonas diminuta bs-203 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1357977A (fr) * | 1963-05-20 | 1964-04-10 | Merck & Co Inc | Procédé de production d'acide 7-aminocéphalosphalosporanique par voie enzymatique |
| CH475284A (de) * | 1963-11-19 | 1969-07-15 | Ciba Geigy | Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure |
| US3239394A (en) * | 1964-06-15 | 1966-03-08 | Merck & Co Inc | Process for producing 7-amino-cephalosporanic acid |
| CH590292A5 (de) * | 1973-12-20 | 1977-07-29 | Ciba Geigy Ag | |
| DK158316C (da) * | 1974-01-23 | 1990-10-08 | Toyo Jozo Kk | Fremgangsmaade til fremstilling af 3-substituerede 7-amino-3-cephem-4-carboxylsyrederivater |
| JPS5619999B2 (de) * | 1974-02-07 | 1981-05-11 | ||
| JPS5671092A (en) * | 1979-11-14 | 1981-06-13 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Optical active cephalosporin analogous derivative |
| NO155547C (no) * | 1979-02-10 | 1987-04-15 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Optisk aktive cefalosporin-analoge og salter derav samt fremgangsmaate for deres fremstilling. |
| JPS6121097A (ja) * | 1984-07-10 | 1986-01-29 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ７−アミノセフアロスポラン酸及びその誘導体の製造法 |
| ATE90382T1 (de) * | 1987-01-17 | 1993-06-15 | Hoechst Ag | Verwendung von gamma-glutamyl-transpeptidase. |
| EP0322032A3 (de) * | 1987-12-21 | 1991-01-30 | Merck & Co. Inc. | Enzymatische Umwandlung von Cephalosporin C und Derivaten in 7-Aminocephalosporinsäure und Derivate in einem Schritt |
| US5104800A (en) * | 1989-06-27 | 1992-04-14 | Merck & Co., Inc. | One-step cephalosporin c amidase enzyme |
| CA2040707C (en) * | 1990-04-27 | 2002-07-09 | Kenji Mitsushima | Cephalosporin acetylhydrolase gene and protein encoded by said gene |
| JPH088877B2 (ja) * | 1990-06-19 | 1996-01-31 | 塩野義製薬株式会社 | デアセチル―７―アミノセファロスポラン酸の製造法 |
| JPH04104792A (ja) * | 1990-08-22 | 1992-04-07 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規アクレモニウム・クリソゲナム |
| GB9019724D0 (en) * | 1990-09-10 | 1990-10-24 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Cephalosporin c acylase |
| IT1252308B (it) * | 1990-12-21 | 1995-06-08 | Antibioticos Spa | Procedimento enzimatico per la produzione di acido 7- amminocefalosporanico e derivati |
-
1991
- 1991-07-24 IT ITMI912039A patent/IT1250698B/it active IP Right Grant
-
1992
- 1992-07-14 US US07/913,041 patent/US5332663A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-15 EP EP92202159A patent/EP0525861B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-15 DE DE69214891T patent/DE69214891T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-15 ES ES92202159T patent/ES2094278T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-15 DK DK92202159.7T patent/DK0525861T3/da active
- 1992-07-15 AT AT92202159T patent/ATE144794T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-07-16 CA CA002074032A patent/CA2074032A1/en not_active Abandoned
- 1992-07-24 JP JP19836392A patent/JP3195058B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-12-16 GR GR960403471T patent/GR3022044T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1250698B (it) | 1995-04-21 |
| GR3022044T3 (en) | 1997-03-31 |
| EP0525861A1 (de) | 1993-02-03 |
| EP0525861B1 (de) | 1996-10-30 |
| ITMI912039A0 (it) | 1991-07-24 |
| DK0525861T3 (da) | 1997-03-17 |
| US5332663A (en) | 1994-07-26 |
| ITMI912039A1 (it) | 1993-01-25 |
| JP3195058B2 (ja) | 2001-08-06 |
| CA2074032A1 (en) | 1993-01-25 |
| ES2094278T3 (es) | 1997-01-16 |
| JPH05211889A (ja) | 1993-08-24 |
| ATE144794T1 (de) | 1996-11-15 |
| DE69214891D1 (de) | 1996-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3750523T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-2-Amino-4-(hydroxymethyl-phosphinyl)-Buttersäure. | |
| DE3687946T2 (de) | Verfahren zur herstellung der 2-keto-l-gulonsaeure. | |
| EP0152948B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von 6-Hydroxynikotinsäure | |
| DE2631048B2 (de) | Verfahren zur Herstellung von D-Phenylglycin | |
| Fujisawa et al. | Accumulation of deacetylcephalosporin C by cephalosporin C negative mutants of Cephalosporium acremonium | |
| DE69214891T2 (de) | Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 7-Amino-Cephalosporansäure | |
| DE3785508T2 (de) | Rhodococcus-Bakterie zur Herstellung von Aryl Acylamidase. | |
| DE3882255T2 (de) | Ein-Schritt-enzymatische Konversion von Cephalosporin C und seiner Derivate in 7-Aminocephalosporinsäure und Derivate. | |
| DE2842940C2 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Sarcosin-Oxidase | |
| DE2502706A1 (de) | Verfahren zur herstellung von 7-amino-cephem-verbindungen | |
| DE3600563C2 (de) | ||
| DE69212713T2 (de) | Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Cephalosporinderivaten | |
| DE3027380A1 (de) | Herstellung eines cephalosporins durch fermentierung | |
| DE3153683C2 (de) | ||
| DE3931399A1 (de) | N-acetylhexosamin-dehydrogenase, verfahren zu deren herstellung, verfahren zur quantitativen analyse von n-acetylglucosamin oder n-acetylgalactosamin unter verwendung derselben, sowie kit fuer die quantitative analyse | |
| DE4445084B4 (de) | Neue Kreatinamidinohydrolase und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
| US4141790A (en) | Process for the preparation of 7-amino-cephem compounds using mold fungi | |
| DE2811303B2 (de) | Enzymatisch* Komplexe, die zur Umwandlung racemischer Hydantoine in optisch aktive Aminosäuren geeignet sind, sowie deren Anwendung | |
| DE3024915C2 (de) | ||
| DE2920764C2 (de) | ||
| DE3741198C2 (de) | ||
| DE3689181T2 (de) | Thermostabile Tryptophanase, Verfahren zu deren Herstellung und thermostabile Tryptophanase erzeugender Mikroorganismus. | |
| DE2929277C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-&alpha;-Glycerophosphatoxidase | |
| DE68913128T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Alanin-Dehydrogenase und Mikroorganismusstamm des Genus Sporolactobacillus. | |
| DE69118641T2 (de) | Acyl-carnitin-Esterase, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zur Analyse von Acyl-carnitinen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |