JPH088877B2 - デアセチル―７―アミノセファロスポラン酸の製造法 - Google Patents
デアセチル―７―アミノセファロスポラン酸の製造法Info
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- JPH088877B2 JPH088877B2 JP2161746A JP16174690A JPH088877B2 JP H088877 B2 JPH088877 B2 JP H088877B2 JP 2161746 A JP2161746 A JP 2161746A JP 16174690 A JP16174690 A JP 16174690A JP H088877 B2 JPH088877 B2 JP H088877B2
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- enzyme
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- aminocephalosporanic acid
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、デアセチル−７−アミノセファロスポラン
酸の製造法に関する。
酸の製造法に関する。
従来の技術 ７−アミノセファロスポラン酸（以下、7ACAと略記す
る）から３−アセトキシ基を化学的に脱離させデアセチ
ル−７−アミノセファロスポラン酸（以下、DACAと略記
する）を製造することは、酵素法に比べ経済的に不利で
あるため、通常、7ACAをアセチルハイドロラーゼと反応
させDACAを製造する（次頁の反応式参照）。
る）から３−アセトキシ基を化学的に脱離させデアセチ
ル−７−アミノセファロスポラン酸（以下、DACAと略記
する）を製造することは、酵素法に比べ経済的に不利で
あるため、通常、7ACAをアセチルハイドロラーゼと反応
させDACAを製造する（次頁の反応式参照）。
上記のようなアセチルハイドロラーゼを用いるDACAの
製造法は、特開昭49−132294、特開昭61−70999、特公
昭39−9894、特公昭42−7553、特公昭49−35993、特公
昭54−43598、特公昭56−46839、特公昭61−11600など
に開示されている。
製造法は、特開昭49−132294、特開昭61−70999、特公
昭39−9894、特公昭42−7553、特公昭49−35993、特公
昭54−43598、特公昭56−46839、特公昭61−11600など
に開示されている。
また、同様にして、アセチルハイドロラーゼを用いて
デアセチルセファロスポリンＣを製造する方法が、特開
昭55−39735、特開昭56−42596、特開昭57−39798、特
開昭59−108790、特公平１−47158、特公平１−54998な
どに開示されている。
デアセチルセファロスポリンＣを製造する方法が、特開
昭55−39735、特開昭56−42596、特開昭57−39798、特
開昭59−108790、特公平１−47158、特公平１−54998な
どに開示されている。
上記のアセチルハイドロラーゼを用いるDACAやデアセ
チルセファロスポリンＣの製造法においては、通常、中
和剤として水酸化ナトリウム（苛性ソーダ）が用いられ
ており、また、反応溶媒としては中性付近で緩衝能を有
するリン酸塩緩衝液が用いられていた。また、反応終了
後の結晶の析出には、塩酸や酢酸が用いられていた。
チルセファロスポリンＣの製造法においては、通常、中
和剤として水酸化ナトリウム（苛性ソーダ）が用いられ
ており、また、反応溶媒としては中性付近で緩衝能を有
するリン酸塩緩衝液が用いられていた。また、反応終了
後の結晶の析出には、塩酸や酢酸が用いられていた。
特開昭61−67489には、固定化枯草菌を用いてデアセ
チル−７−β−アシルアミドセファロスポラン酸を製造
するときに、中和剤としてアンモニア水を用いる方法が
開示されている。
チル−７−β−アシルアミドセファロスポラン酸を製造
するときに、中和剤としてアンモニア水を用いる方法が
開示されている。
発明が解決しようとする課題 従来法による、アセチルアピドロラーゼを用いる7ACA
のDACAへの変換には、長時間を要し、また、固定化酵素
を用いる場合には、繰り返し使用するにつれ、酵素活性
が低下し、さらに長時間を要するようになる。
のDACAへの変換には、長時間を要し、また、固定化酵素
を用いる場合には、繰り返し使用するにつれ、酵素活性
が低下し、さらに長時間を要するようになる。
従って、迅速かつ安定なDACAの製造方法が待望されて
いた。
いた。
課題を解決するための手段 本発明は、7ACAを脱アセチル化しうる酵素に7ACAを反
応させDACAを製造する方法において、該反応における中
和剤としてアンモニア水を用いることを特徴とするDACA
の製造法を提供する。
応させDACAを製造する方法において、該反応における中
和剤としてアンモニア水を用いることを特徴とするDACA
の製造法を提供する。
該酵素は、7ACAを脱アセチル化しDACAに変換しうるも
のであればよい。特に、DACAの大量生産においては、大
量かつ安価に入手可能な枯草菌（Bacillus subtilis）
由来のセファロスポリンアセチルハイドロラーゼが好ま
しい。枯草菌由来とは、遺伝子組換え技術などにより枯
草菌のセファロスポリンアセチルハイドロラーゼ遺伝子
を組み込んだ枯草菌以外の宿主から産生されるものな
ど、枯草菌のセファロスポリンアセチルハイドロラーゼ
と実質的に同一の酵素を除外することを意味するもので
はない。セファロスポリンアセチルハイドロラーゼを産
生する枯草菌としては、例えば、Bacillus subtilis SH
S0133が挙げられ、これは平成２年２月15日から茨城県
つくば市大東１−１−３の微生物工業技術研究所にブダ
ペスト条約に基づき微工研条寄第2755号（FERM BP−275
5）として寄託されている。
のであればよい。特に、DACAの大量生産においては、大
量かつ安価に入手可能な枯草菌（Bacillus subtilis）
由来のセファロスポリンアセチルハイドロラーゼが好ま
しい。枯草菌由来とは、遺伝子組換え技術などにより枯
草菌のセファロスポリンアセチルハイドロラーゼ遺伝子
を組み込んだ枯草菌以外の宿主から産生されるものな
ど、枯草菌のセファロスポリンアセチルハイドロラーゼ
と実質的に同一の酵素を除外することを意味するもので
はない。セファロスポリンアセチルハイドロラーゼを産
生する枯草菌としては、例えば、Bacillus subtilis SH
S0133が挙げられ、これは平成２年２月15日から茨城県
つくば市大東１−１−３の微生物工業技術研究所にブダ
ペスト条約に基づき微工研条寄第2755号（FERM BP−275
5）として寄託されている。
該アンモニア水の濃度は特に限定されるものではな
い。該アンモニア水の添加量は、原料の7ACAを中和し、
かつ反応副産物である酢酸を中和するに充分な量であ
り、理論的には原料の7ACAの２当量である。しかし、該
反応液のpHを、用いる酵素の至適pH付近でかつ7ACAおよ
びDACAが分解しないpH付近に保つに必要な量を添加すれ
ば充分である。
い。該アンモニア水の添加量は、原料の7ACAを中和し、
かつ反応副産物である酢酸を中和するに充分な量であ
り、理論的には原料の7ACAの２当量である。しかし、該
反応液のpHを、用いる酵素の至適pH付近でかつ7ACAおよ
びDACAが分解しないpH付近に保つに必要な量を添加すれ
ば充分である。
枯草菌由来のセファロスポリンアセチルハイドロラー
ゼを用いる場合には、該反応液はpH8.0〜8.5の範囲内に
保つのが好ましい。この範囲以下では酵素が不活性であ
り、この範囲以上では7ACAおよびDACAが分解する。
ゼを用いる場合には、該反応液はpH8.0〜8.5の範囲内に
保つのが好ましい。この範囲以下では酵素が不活性であ
り、この範囲以上では7ACAおよびDACAが分解する。
上記のように反応液をpH8.0〜8.5の範囲内に保つため
には、該反応は、リン酸緩衝液中で行なうこともできる
が、硼酸緩衝液中で行なうのが好ましい。硼酸緩衝液
は、pH8.0〜8.5付近で緩衝能を有するばかりでなく、殺
菌作用を有しており、特に大規模なDACAの反復製造にお
いて好ましい。硼酸緩衝液としては、後記実施例に示し
た四硼酸ソーダ／硼酸系、アンモニア／硼酸系、水酸化
ナトリウム／硼酸系などの組合わせの緩衝液を用いるこ
とができる。
には、該反応は、リン酸緩衝液中で行なうこともできる
が、硼酸緩衝液中で行なうのが好ましい。硼酸緩衝液
は、pH8.0〜8.5付近で緩衝能を有するばかりでなく、殺
菌作用を有しており、特に大規模なDACAの反復製造にお
いて好ましい。硼酸緩衝液としては、後記実施例に示し
た四硼酸ソーダ／硼酸系、アンモニア／硼酸系、水酸化
ナトリウム／硼酸系などの組合わせの緩衝液を用いるこ
とができる。
また、後記実施例に示されるとおり、リン酸塩緩衝液
や中和剤として水酸化ナトリウムを用いる従来法と比較
して、硼酸緩衝液と中和剤としてアンモニア水を用いる
本発明の方法は、反応時間および繰返し反応における安
定性の点で明らかに優位性を示していた。すなわち、本
発明の方法によれば、20回以上の繰返し反応において
も、反応時間が70〜100分であり、工業的に優れた方法
であり経済的である。
や中和剤として水酸化ナトリウムを用いる従来法と比較
して、硼酸緩衝液と中和剤としてアンモニア水を用いる
本発明の方法は、反応時間および繰返し反応における安
定性の点で明らかに優位性を示していた。すなわち、本
発明の方法によれば、20回以上の繰返し反応において
も、反応時間が70〜100分であり、工業的に優れた方法
であり経済的である。
本発明の反応の温度は、10〜30℃であり、好ましくは
20℃前後、特に好ましくは20〜22℃である。30℃を越え
ると7ACAが分解し、10℃より低いと反応速度が遅くなり
好ましくない。
20℃前後、特に好ましくは20〜22℃である。30℃を越え
ると7ACAが分解し、10℃より低いと反応速度が遅くなり
好ましくない。
反応終了後に、反応終了液でDACAを晶析させる時に
は、工業的かつ経済的な塩酸、硫酸、硝酸などの鉱酸を
用いることができる。すなわち、鉱酸を加えて反応終了
液を約pH4に調整しDACAを晶析させる。従来法で用いら
れてきた酢酸などの有機酸は、鉱酸と比較して高価であ
りかつ廃液中の生物学的酸素要求量（BOD）の点で問題
がある。これに対して、鉱酸は安価であり廃液中のBOD
の問題がない。
は、工業的かつ経済的な塩酸、硫酸、硝酸などの鉱酸を
用いることができる。すなわち、鉱酸を加えて反応終了
液を約pH4に調整しDACAを晶析させる。従来法で用いら
れてきた酢酸などの有機酸は、鉱酸と比較して高価であ
りかつ廃液中の生物学的酸素要求量（BOD）の点で問題
がある。これに対して、鉱酸は安価であり廃液中のBOD
の問題がない。
本発明の方法に用いる酵素としては、酵素溶液を用い
てもよいが、繰り返し反応に用いる事ができる点で、固
定化酵素が好ましい。固定化酵素としては、例えば、ポ
リスチレンまたはポリアクリル骨格にアミノ基などを導
入したイオン交換樹脂にグルタルアルデヒドで固定化し
た酵素を用いることができる。
てもよいが、繰り返し反応に用いる事ができる点で、固
定化酵素が好ましい。固定化酵素としては、例えば、ポ
リスチレンまたはポリアクリル骨格にアミノ基などを導
入したイオン交換樹脂にグルタルアルデヒドで固定化し
た酵素を用いることができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する
が、本実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
が、本実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１ 3.1gのH3BO3と2.89gのNa2B4O7・10H2Oを1Lの水に溶か
した緩衝液（pH8.25、以下この緩衝液をホウ酸緩衝液と
略記する）82mlに、バシラス・サチリス（Bacillus sub
tilis SHS0133、微工研条寄第2755号（FERM BP−275
5））の培養液から得た純度50％（タンパク質比）のセ
ファロスポリンアセチルハイドロラーゼ（以下CAHと略
記する）溶液（酵素活性200U/ml＊）を18ml加える。こ
の液に、40gの7ACAをホウ酸緩衝液280mlに懸濁した液を
10分間で加えるか、もしくは、40gの7ACAを含むホウ酸
緩衝液に4Nアンモニア水を加えて溶解（pH8.25）した液
337mlを直ちに加える。得られた懸濁液もしくは溶解液
は、4Nアンモニア水または4N水酸化ナトリウムでpH8.25
に抑制しながら22℃で撹拌し反応させた。原料7ACAおよ
び生成物DACAは、HPLCで定量した。
した緩衝液（pH8.25、以下この緩衝液をホウ酸緩衝液と
略記する）82mlに、バシラス・サチリス（Bacillus sub
tilis SHS0133、微工研条寄第2755号（FERM BP−275
5））の培養液から得た純度50％（タンパク質比）のセ
ファロスポリンアセチルハイドロラーゼ（以下CAHと略
記する）溶液（酵素活性200U/ml＊）を18ml加える。こ
の液に、40gの7ACAをホウ酸緩衝液280mlに懸濁した液を
10分間で加えるか、もしくは、40gの7ACAを含むホウ酸
緩衝液に4Nアンモニア水を加えて溶解（pH8.25）した液
337mlを直ちに加える。得られた懸濁液もしくは溶解液
は、4Nアンモニア水または4N水酸化ナトリウムでpH8.25
に抑制しながら22℃で撹拌し反応させた。原料7ACAおよ
び生成物DACAは、HPLCで定量した。
結果は第１表に示す。
＊酵素活性は、1.09ミリモル濃度の酢酸パラニトロフ
ェニルのリン酸２水素ナトリウム−リン酸水素２ナトリ
ウム緩衝液（0.2ミリモル、pH6.8）溶液で、30℃で16.1
分間の酵素反応で生成したパラニトロフェノール量で表
わし、１マイクロモル／分を１単位（Ｕと略記）とし
た。
ェニルのリン酸２水素ナトリウム−リン酸水素２ナトリ
ウム緩衝液（0.2ミリモル、pH6.8）溶液で、30℃で16.1
分間の酵素反応で生成したパラニトロフェノール量で表
わし、１マイクロモル／分を１単位（Ｕと略記）とし
た。
実施例２ バシラス・サチリス（FERM BP−2755）の培養液から
得た純度50％（タンパク質比）のCAHをグルタルアルデ
ヒドでイオン交換樹脂（スミカイオンKA890）に固定化
し、ホウ酸緩衝液または、0.1モルリン酸二水素ナトリ
ウム−リン酸水素二ナトリウム緩衝液（pH8.25:以下、N
aPiと略す）で洗浄して、酵素活性90U/g担体の固定化酵
素を得た。
得た純度50％（タンパク質比）のCAHをグルタルアルデ
ヒドでイオン交換樹脂（スミカイオンKA890）に固定化
し、ホウ酸緩衝液または、0.1モルリン酸二水素ナトリ
ウム−リン酸水素二ナトリウム緩衝液（pH8.25:以下、N
aPiと略す）で洗浄して、酵素活性90U/g担体の固定化酵
素を得た。
この固定化酵素75ml（全酵素活性4.4KU）にホウ酸緩
衝液またはNaPi235mlを加え、40gの7ACA結晶を280mlの
ホウ酸緩衝液またはNaPiで懸濁した液を15分間で添加し
た。上記懸濁液の添加開始と同時に4Nのアンモニウア水
または、4Nの水酸化ナトリウムで中和し、pH8.25に制御
した。本反応は22℃の撹拌槽で実施した。反応終了後、
静置し、固定化酵素面まで反応終了液を抜き取った。こ
の抜き取った反応終了液に38％硫酸または99％酢酸を加
え、pH4に下げることにより晶析させた。生成した結晶
をガラルフィルターで濾過し、メタノールで洗浄し、静
置乾燥することによりDACA結晶を得た。上記操作を22回
繰返した。
衝液またはNaPi235mlを加え、40gの7ACA結晶を280mlの
ホウ酸緩衝液またはNaPiで懸濁した液を15分間で添加し
た。上記懸濁液の添加開始と同時に4Nのアンモニウア水
または、4Nの水酸化ナトリウムで中和し、pH8.25に制御
した。本反応は22℃の撹拌槽で実施した。反応終了後、
静置し、固定化酵素面まで反応終了液を抜き取った。こ
の抜き取った反応終了液に38％硫酸または99％酢酸を加
え、pH4に下げることにより晶析させた。生成した結晶
をガラルフィルターで濾過し、メタノールで洗浄し、静
置乾燥することによりDACA結晶を得た。上記操作を22回
繰返した。
結果は第２表に示す。
第１図は、繰返し反応における従来法と本発明法の比較
結果を、それぞれの反応回数目の反応所要時間で示す。
結果を、それぞれの反応回数目の反応所要時間で示す。
Claims (2)
- 【請求項１】７−アミノセファロスポラン酸を脱アセチ
ル化しうる酵素に７−アミノセファロスポラン酸を反応
させデアセチル−７−アミノセファロスポラン酸を製造
する方法において、該酵素が枯草菌由来のセファロスポ
リンアセチルハイドロラーゼであり、該酵素がポリスチ
レンまたはポリアクリルにアミノ基を導入したイオン交
換樹脂にグルタルアルデヒドで固定した固定化酵素であ
り、該反応が硼酸緩衝液中で行なわれ、該反応における
中和剤としてアンモニア水を用いることを特徴とするデ
アセチル−７−アミノセファロスポラン酸の製造法。 - 【請求項２】該反応がpH8.0〜8.5の範囲内で行なわれる
請求項１に記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2161746A JPH088877B2 (ja) | 1990-06-19 | 1990-06-19 | デアセチル―７―アミノセファロスポラン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2161746A JPH088877B2 (ja) | 1990-06-19 | 1990-06-19 | デアセチル―７―アミノセファロスポラン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0453499A JPH0453499A (ja) | 1992-02-21 |
| JPH088877B2 true JPH088877B2 (ja) | 1996-01-31 |
Family
ID=15741102
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2161746A Expired - Lifetime JPH088877B2 (ja) | 1990-06-19 | 1990-06-19 | デアセチル―７―アミノセファロスポラン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH088877B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1250698B (it) * | 1991-07-24 | 1995-04-21 | Mini Ricerca Scient Tecnolog | Processo per la preparazione enzimatica di acidi 7-ammino-cefalosporanici. |
| AT402929B (de) * | 1994-05-25 | 1997-09-25 | Biochemie Gmbh | Neue cephalosporinderivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| KR100270508B1 (ko) * | 1998-04-24 | 2001-02-01 | 고두모 | 신규세파로스포린디아세틸라아제유전자및이를이용한단백질제조방법 |
| KR100383136B1 (ko) * | 2000-12-20 | 2003-05-12 | 씨제이 주식회사 | 7-아미노세팔로스포라닌산의 결정화 방법 |
| WO2003031451A1 (en) * | 2001-10-06 | 2003-04-17 | Ckd Bio Corp. | Method for crystallization of 7-aminocephalosporanic acid |
| CN107936042A (zh) * | 2017-12-25 | 2018-04-20 | 伊犁川宁生物技术有限公司 | 一种d‑7aca的制备方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3432060A1 (de) * | 1984-08-31 | 1986-03-06 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Immobilisierte zellen von bacillus subtilis, immobilisierungsverfahren und verwendung des praeparats zur abspaltung der 3-acetoxygruppe aus 7-ss-acylamido-cephalosporansaeuren |
| JPH0249587A (ja) * | 1988-08-09 | 1990-02-19 | Nippon Zeon Co Ltd | 固定化酸素、その製造法、及びそれに用いる支持体 |
-
1990
- 1990-06-19 JP JP2161746A patent/JPH088877B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0453499A (ja) | 1992-02-21 |
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Legal Events
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