JPH0249587A - 固定化酸素、その製造法、及びそれに用いる支持体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、高活性の固定化酵素、その製造法、及びそれ
に用いる支持体に関する。さらに詳しくは、固定化によ
る酵素の失活や活性低下が小さく、酵素の脱離が少なく
、さらに固定化される酵素量が大きく、高活性である固
定化酵素、その製造法、及びそれに用いる支持体に関す
る。

（従来の技術） 生体触媒である酵素の物質変換能力は産業上広い分野で
、物質生産、分析、測定等にバイオ・リアクターやバイ
オ・センサー等の形で利用されている。これは、常温、
常圧といった緩和な条件下で効率よく反応を触媒し、ま
た作用特異性が高いという酵素の特徴による。しかし、
酵素は酵素反応に適した条件下でも比較的速く失活し、
また、有機溶媒、熱、強酸、強アルカリ等に対し不安定
である。このため、反発後生成物を反応終了液から回収
する際に酵素を失活させずに回収し再利用することは難
しく、残存酵素は失活させて除去し、生成物を分離して
いた。最近ではこれらの酵素の欠点を解決する方法とし
て、酵素を一定の空間内に閉じ込め、連続的酵素反応・
回収後の再利用を可能にした固定化酵素の利用が多くな
っている。

酵素の固定化法は、■担体結合法、■架橋法、■包括法
の三つに大別できるが、酵素の安定性が高い■の担体結
合法がよく使われている。特にクルクルアルデヒドをス
ペーサーとして用いる担体架橋法がよく利用されるが、
他の方法と比較して、多くの酵素を安定に固定化するこ
とがよく知られており、担体がアミノ基を持っていれは
、グルタルアルデヒドとの間にシッフ塩基を形成して簡
便に固定できる。それはグルタルアルデヒドは安価であ
り、また水溶液を用いることができるので有機溶媒によ
る酵素の活性低下をさけられるためである。

しかし、グルタルアルデヒドをスペーサーとしてアミノ
基を持つ担体に酵素を固定化する方法においても、グル
タルアルデヒドと酵素の結合による高次構造の変化等に
よる酵素の失活や活性低下があり、固定化に要する時間
も十分には速くはない。また、シップ塩基は加水分解し
やすいため担体とグルタルアルデヒド、グルタルアルデ
ヒドと酵素の結合も開裂しやすいため酵素が担体より脱
離しやすく、その結果固定化された酵素の活性の再現性
がないという欠点があった。

（本発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、このような従来技術の欠点を克服して、
酵素の脱離が少なく、固定化により酵素が失活したり大
きく活性低下したすせず、固定化反応が速く、固定化さ
れる酵素量が多く、活性の高い固定化酵素を開発すべく
鋭意研究を重ねた。

その結果、グルタルアルデヒド重合体をスペーサーとし
てアミノ基を持つ担体に酵素を固定化することにより、
目的を達成しうろことを見いだし、本発明を完成するに
到った。

（課題を解決するための手段） かくして本発明によれば、第一の発明として、グルタル
アルデヒド重合体をスペーサーとしてアミノ基を持つ担
体に酵素を固定化した固定化酵素が提供され、第二の発
明として、グルタルアルデヒド重合体をスペーサーと１
ノでアミノ基を持つ担体に酵素を固定化することを特徴
とする固定化酵素の製造法が提供され、第三の発明とし
て、アミノ基を持つ担体にグルタルアルデヒド重合体を
スペーサーとして結合させた酵素の支持体が提供される
。

本発明に用いる担体はアミノ基を持つもので使用する反
応溶媒等に不溶・化学的に安定であれは、有機物、無機
物を問わず、例えはシリカ、多孔質ガラス、デキストラ
ンのゲル等にアミノ基が結合したものでよい。市販のア
ミノ基を有する担体としてはＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｎ
Ｈ２／ＣＮ　（ファルマシア社製）や、ＬＳ−４５０Ｎ
ｌ２　（東ソー社製）等があるが、ここでは、特にＨＰ
ＬＣ用の水酸基を持つ樹脂をアミノ基に置換したもが推
賞される。これは、市販のアミノ基を有する担体は、種
類が限られており、ボア径が十分に大きい担体がないた
めである。

担体の水酸基をアミノ化するには、トシル化して、その
後、ジアミンと反応させればよい。この場合、用いたジ
アミンとスペーサーとして用いるグルタルアルデヒド重
合体の鎖を合わせた長さが実質的なスペーサーの長さと
なる。

グルタルアルデヒド重合体を得るには、例えばグルタル
アルデヒド水溶液にグルタルアルデヒドとは反応せずに
重合の触媒としてのみ働く３級アミン、例えはトリエチ
ルアミンを触媒量添加すれはよい。

固定化する酵素の種類によって、用いるグルタルアルデ
ヒド重合体の分子量が小さいほと高い活性値を示す固定
化酵素、分子量が大きいほど高い活性値を示す固定化酵
素などがある。用いるグルタルアルデヒド水溶液の濃度
が濃いほどグルタルアルデヒド重合体の分子量は高くな
るので、固定化する酵素の種類に合わせてグルタルアル
デヒド水溶液の濃度、グルタルアルデヒド重合体の分子
量を調整すればよい。例えば、０．２５％のグルタルア
ルデヒド水溶液を用いた場合およそ２００〜１０００．
２５％の場合はおよそ１０００−１００００の分子量の
グルタルアルデヒド重合体が得られる。

重合反応液の２８０ｎｍの吸光が消滅し、　２３５ｎｍ
の吸光の増大が止まった時点で重合反応は終了する。

２８０ｎｍの吸収はグルタルアルデヒＩＳ、　２３５ｎ
ｍの吸収はグルタルアルデヒド重合体に特徴的に認めら
れる。

アミノ基を持つ担体にグルタルアルデヒド重合体を結合
させるには、グルタルアルデヒドをスペーサーとする場
合と同じで、例えはクルタルアルデヒド重合体水溶液に
アミノ基を持つ担体を加え、脱気して放置するだけでよ
い。

アミノ基を持つ担体からのスペーサーであるクルクルア
ルデヒド、グルタルアルデヒド重合体の脱離の様子は、
担体な加えたスペーサーの水溶液の上澄み液の２３５ｎ
ｍの吸収を測定することで判る。

スペーサーがグルタルアルデヒドの場合も、担体から脱
離したグルタルアルデヒドはアミノ基が触媒してグルタ
ルアルデヒド重合体となるためである。吸光度を測定す
る以外に、担体な水中に保存したときの上澄み液をＮＭ
Ｒにより計測することで測定することもできる。

その結果、グルタルアルデヒドは担体から脱離するが、
クルタルアルデヒド重合体は担体から脱離しないことが
わかった。グルタルアルデヒドを用いた場合はアミノ基
とアルデヒド基がシップ塩基で結合し結合が不安定であ
り容易に分解するのに対し、グルタルアルデヒド重合体
を用いた場合はアミノ基がα、β−不飽和アルデヒドの
炭素炭素二重結合部分にミカエル付加し強固な結合を形
成するためにこの様な結果が得られるものと考えられる
。

このようにして得られたアミノ基を持つ担体にグルタル
アルデヒド重合体をスペーサーとして結合させた支持体
に酵素を固定するには、グルタルアルデヒドをスペーサ
ーとする場合と同しく、例えはアミノ基を持つ担体とク
ルクルアルデヒド重合体を反応した後、濾過し、よく水
洗し、酵素水溶液を加えて脱気し、放置すれはよい。こ
の時、固定化する酵素が失活しない条件下で操作を行う
必要がある。

担体とスペーサーの結合と同様に、酵素とスペーサーの
結合もグルタルアルデヒドを用いた場合はアミノ基とア
ルデヒド基がシッフ塩基で結合し結合が不安定であり容
易に分解するが、グルタルアルデヒド重合体を用いた場
合はアミノ基かα。

β−不不飽和アル上ヒト炭素−炭素二重結合部分にミカ
エル付加し強固な結合を形成すると考えられる。

（発明の効果） かくして本発明によれは、脱離を起こし難く、酵素に失
活や大きな活性低下を起こさず、さらに固定化される酵
素量が大きい固定化酵素、その製造法、及びそれに用い
る支持体が得られ、物質生産、分析、測定等にバイオ・
リアクターやバイオ・センサー等の形で効率よく用いる
ことができる。

（実施例） 以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例　１ （１）　　ポリマーケルのアミノ化 叶基を持つＨＰＬＣ用Ｇ５０００ＰＷ　（東ソー製）を
アセトニトリルで洗浄後濾過し、アセトニトリル中で脱
気した後−晩装置、ジクロロメタンで洗浄後濾過し、ジ
クロロメタン中に一晩放置した。ドラフト内でピリジン
で洗浄後濾過し、Ｇ５０００　Ｐ　Ｗ４ｇｅこピリジン
ｌＯｍＱを加え、０℃でトシルクロライド１２ｇ　／　
２５ｍＱピリジンを徐々に滴下し、０℃で６時間反応さ
せ、　５℃で２４時間放置し、純水、２Ｎ硫酸純水、　
５％炭酸水素ナトリウム水溶液、純水、アセトニトリル
で順次洗浄・濾過し、アセトニトリル中に保存した。

このトシル化ＣＣ５０００ＰＷ２にアセトニトリル５０
ｍＱを加え、ざらにＪ＼キサメチレンシアミン５ｇを加
えて５時間還流し、純水、１０％炭酸ナトリウム水溶液
、純水、メタノール、純水で順次洗浄・濾過し、アミツ
ノ＼キシル化Ｇ５０００ＰＷを得、室温で純水中に保存
した。

（２）　グルタルアルデヒドの重合 ０．２５％のグルタルアルデヒド水溶？１５００　ｍＱ
にトリエチルアミン１００ｄを添加し、２４時間反応さ
せて、グルタルアルデヒド重合体を得た。

（３）　グルタルアルデヒド重合体と担体の結合アミノ
化Ｇ　５０００　Ｐ　Ｗ　１．０ｍ１２にグルタルアル
デヒド重合体水溶液またはグルタルアルデヒド水溶液を
４０ｍ１ｉ！加え、室温で水流アスピレータによる減圧
下に３０分装いて脱気し、以後大気圧下に放置した。

この反応において、上澄み液の２３５ｎｍの吸光度変化
を経時的に追った。グルタルアルデヒド重合体水溶液を
用いた場合を第１図（ａ）に、グルタルアルデヒドを用
いた場合を第１図（１））に示す。

アミノ基を持つ担体とグルタルアルデヒドの結合が最大
となり上澄み液の吸収が最小値を示す反応開始２時間後
以降、上澄み液の吸収は徐々に増え、グルタルアルデヒ
ドが脱離していることを示した。一方、グルタルアルデ
ヒド重合体を用いた場合はアミノ基を持つ担体とグルタ
ルアルデヒド重合体の結合が最大となり上澄み液の吸収
が最小値を示す反応開始１５分後辺降、吸収は一定を保
ち、グルタルアルデヒド重合体の脱離がなく、安定で強
固な結合をしていること、また反応が速いことが示され
た。

大気圧下で９０分放置したものをデカンテーションによ
り純水で充分に洗浄して以下の実験に用いた。

（４）　酵素の固定化 フォスフォリパーセＤ　（Ｅ、Ｃ，３，１，４，４，）
　ｌｏｍｇとコリンオキシダーセＤ　（Ｅ、Ｃ，１，１
，３，１？、　）　２０ｍｇを０．１ｍＭ塩化カルシウ
ム含有１５０ｍＭ）リス塩酸緩衝ｔ＆　（ｐ）Ｉ　７）
に溶解して１０ｍＱとし、グルタルアルデヒドまたはグ
ルタルアルデヒド重合体をスペーサーとして結合させた
支持体に加え、室温で水流アスピレータによる減圧下に
３０分装いて脱気し、以後５℃大気圧下に６０分放置し
て２種の酵素を同時固定した。最後に未固定の粗酵素を
デカンテーションにより０．１ｍＭ塩化カルシウム含有
１５０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７）で充分に洗浄
して除去した。

得られた固定化酵素は湿潤状態で５℃で保存した。

第１表にスペーサーの違いによる固定化酵素の結合タン
パク量、活性値の違いを示した。

結合タンパク量は、支持体に加えたタンパク量と固定化
反応終了後の反応液上澄み中のタンパク量の差から求め
た。

固定化酵素の活性は、固定化酵素０．０５ｍ９を０．１
ｍＭ塩化カルシウム含有１５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ７）に加え、４０℃に１０分装いた後、卵黄レシチ
ン１０ｍｇ／＋ｒｌ！２を０．２ｍ９加え、　５分間４
０℃で撹拌し、１Ｎ塩酸０．５ｍ９を加えて反応を停止
し、ＩＮ水酸化ナトリウム０．５ｍＱを加えて中和した
後、　０．５ｍＭ４−アミノアンチピリン、　０．３ｍ
ＭＴ　ＯＯＳ、　６．７Ｕ／　ｍＱペパーキシダーゼ（
Ｅ、Ｃ，１，１１，１，７，）を含む０９１ｍＭ塩化カ
ルシウム含有１５０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７）
を加えて発色させ、　５５５ｎｍの吸光を測定して求め
た。４０℃、ｐＨ７において１分間に１ハ４の過酸化水
素を産生ずる酵素活性をＩＵとして表した。

グルタルアルデヒド重合体をスペーサーとして用いると
、固定化される酵素量が多く、また、活性も高いことが
示された。

第１表

【図面の簡単な説明】

第１図はグルタルアルデヒド重合体（ａ）およびグルタ
ルアルデヒド（ｂ）を担体に結合させる反応における上
澄み中のグルタルアルデヒド重合体の濃度変化を２３５
ｎｍの吸収で経時的に測定した結果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グルタルアルデヒド重合体をスペーサーとしてアミ
   ノ基を持つ担体に酵素を固定化した固定化酵素。 ２、グルタルアルデヒド重合体をスペーサーとしてアミ
   ノ基を持つ担体に酵素を固定化することを特徴とする固
   定化酵素の製造法。 ３、アミノ基を持つ担体にグルタルアルデヒド重合体を
   スペーサーとして結合させた酵素の支持体。