CN100564523C - 含环氧基固定化酶载体及制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型含环氧基固定化酶载体及制备方法与用途。该载体是由一种含有环氧基功能基和亲水性的酰胺基和羟基的交联聚合物树脂，作为酶固定化的载体。本发明载体具有聚合物骨架的高度亲水性、既可以制成大孔型也可以制成凝胶型、机械强度高、化学和生物稳定性好、可固载所有的酶及其它蛋白质、合成工艺简单、固定化酶的酶活性高等优点。

Description

含环氧基固定化酶载体及制备方法与用途

【技术领域】

本发明涉及酶固定化载体，具体地说是含有环氧基功能基和亲水性的酰胺基和羟基的交联聚合物树脂，作为酶固定化载体。

【背景技术】

生物体内形形色色的化学反应均是在酶催化下进行的。酶催化反应的特点有：①催化效率高，转化率往往可达到100％；②专一性高，对反应物(低物)催化的选择性很高，产物纯度高，副反应少；③反应条件温和，反应在生物体体温温度左右及常压下进行，反应介质为水(近年来也发现一些酶催化反应可以在有机溶剂中进行，这大大地扩展了酶催化反应的应用范围)。因此人们试图将酶催化反应应用于工业催化中，用于合成某些化合物。但酶催化反应也有缺点，主要是：酶价格较高，回收困难，因此合成成本较高；不易回收的酶污染产物，使产物的纯化费用增加；酶对环境如热、酸、碱等敏感，易失活。酶的固定化技术则部分地解决了酶催化的上述缺点，固定化酶很容易将酶回收再用，重复使用次数可高达上千次，大大地降低了酶催化反应的成本，而且解决了残留酶污染反应产物的问题。酶的固定化往往还增加酶的耐热、酸、碱的稳定性，使酶的使用寿命更长。

酶的固定化方法有：吸附法、离子交换法、包埋法、共价键固定法等。其中以通过载体上的环氧基与酶分子的氨基或巯基反应使酶分子通过共价键固载于载体上的方法应用最广，因为酶作为蛋白质都含有氨基，因此含环氧基的载体是固定化酶的普适性载体。固定化酶的载体应具有如下一些性能：固定化酶的活性高、亲水性好、化学稳定性好、机械强度高、对于分子量较大的酶的固定化需载体为多孔性且孔径较大等。文献报道的含环氧基载体包括：(1)天然高分子材料，如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，此类载体的优点是亲水性好，缺点是机械强度差、易生物降解、成本高。(2)合成高分子载体，此类载体又包括很多种。研究最多的载体为通过水相中的悬浮聚合得到的交联聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，使用的交联剂有二乙烯苯和双甲基丙烯酸乙二醇酯。此种载体的优点是合成简单、成本低，其缺点是骨架的亲水性差，因骨架的刚性搅拌时载体的表面逐渐掉下聚合物碎片，不仅易使后处理的滤器赌赛，污染产物，且固定化酶的使用寿命短。德国Rohm公司采用反相悬浮聚合法，以甲基丙烯酰胺、N，N’-甲叉-双甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯缩水甘油醚为单体，合成的含环氧基的载体具有亲水性好、机械强度高等优点，是到目前为止使用最广泛的酶固定化载体。此缺点是：由于甲基丙烯酰胺和N，N’-甲叉-双甲基丙烯酰胺为水溶性单体，而甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯缩水甘油醚为脂溶性单体，后者在水中的溶解度很低，在反相悬浮聚合时它们在油相中的分配比例比在水相中的大，这不仅使这两种单体的利用率很低。而且在这样的分配使悬浮聚合的成球率很低，聚合过程中树脂珠体易粘结成块，使载体的收率很低。另一缺点是，反相悬浮聚合不易得到大孔树脂。

【发明内容】

本发明的目的正是针对上述的现有酶固定化载体的缺点，提出一种采用含有亲水性的酰胺基和羟基并含有环氧基功能基的凝胶型或大孔型的交联聚合物树脂作为酶固定化的载体，以及制备这种树脂和利用这种载体的的方法。

本发明新型含环氧基固定化酶载体，其特征在于含有环氧基功能基和亲水性的酰胺基和羟基的交联聚合物树脂，作为酶固定化的载体。载体的骨架和功能基可用如下的结构式表示：

R＝H或CH₃

本发明新型含环氧基固定化酶载体的制备方法，其特征在于：

A.丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯与二乙烯苯进行悬浮自由基共聚合，得到凝胶型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂；

或丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯与二乙烯苯在致孔剂的存在下进行悬浮自由基共聚合，得到大孔型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂；

B.聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂与乙醇胺反应，然后与环氧氯丙烷反应得到所述的树脂。

本发明新型含环氧基固定化酶载体的用途，其特征在于所述含环氧基的树脂与酶在pH 6-14的介质中，在4℃到室温反应2-48小时，将酶固载于树脂上，制成固载量为10-150mg酶/g树脂。

本发明载体具有聚合物骨架的高度亲水性、既可以制成大孔型也可以制成凝胶型、机械强度高、化学和生物稳定性好、可固载所有的酶及其它蛋白质、合成工艺简单、固定化酶的酶活性高等优点。

【具体实施方式】

新型含环氧基固定化酶载体，其含有环氧基功能基和亲水性的酰胺基和羟基的交联聚合物树脂，既可以是凝胶型的树脂，也可以是大孔型的树脂。

该载体的合成方法为：首先丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯与二乙烯苯进行悬浮共聚合得到凝胶型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂；或丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯与二乙烯苯在致孔剂的存在下进行悬浮自由基共聚合，得到大孔型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂。

然后凝胶型或大孔型的聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂与乙醇胺进行酯的胺解反应，得到含有酰胺基和羟基的高度亲水的树脂，胺解后的树脂与环氧氯丙烷反应得到本发明的最终酶固定化载体。

在胺解后的树脂与环氧氯丙烷的反应中，树脂上只有很小比例的羟基发生了反应而引入功能基，其余大部分羟基仍保留，以保证载体的亲水性。合成反应式可表示如下：

R＝H或CH₃

丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯与二乙烯苯进行悬浮共聚合的交联度为2-20％，得到凝胶型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂。在上述的悬浮共聚中加入致孔剂，则得到大孔型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂。交联度为6-40％。单体与致孔剂的重量比例为1∶0.3-1∶2。致孔剂可以是芳烃类如甲苯，高级醇类如丁醇、己醇、环己醇，烷烃类如庚烷、溶剂汽油、液体石蜡、固体石蜡等。致孔剂可以单独使用或任何两种的混合使用。

凝胶型或大孔型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂与乙醇胺的反应的反应温度为50-150℃，反应时间为2-48小时。

凝胶型或大孔型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂与乙醇胺的胺解反应所得树脂与环氧氯丙烷的反应既可以用酸催化，也可以用碱催化。

用酸催化时，可用二氧六环、四氢呋喃作为溶剂，树脂与酸催化剂(硫酸)的重量比为1∶0.01-1∶0.2，树脂与环氧氯丙烷的重量比为1∶0.1-1∶2，反应温度为50℃到回流温度，反应时间为8-24小时。

用碱催化时，可用水、二甲基亚砜或水与二甲基亚砜的混合物作溶剂，水与二甲基亚砜的比例为1∶0-0∶1，树脂与环氧氯丙烷的重量比为1∶0.1-1∶2，碱(氢氧化纳或氢氧化钾)的摩尔数为环氧氯丙烷摩尔数的1.1倍。

在中性到弱碱性的条件下，酶与上述含环氧基的树脂在2℃到室温下反应，酶通过其上的羟基和/或巯基与环氧基反应而将酶固载于载体上。作为蛋白质，任何酶都含有胺基，而本发明的载体含有活泼的易于与胺基反应的环氧基，因此此类载体适合任何酶的固定，例如青霉素酰化酶、葡萄糖化酶、葡萄糖异构酶、氰基水解酶、脂肪酶、蛋白酶等。

实施例1

凝胶型聚甲基丙烯酸甲酯的制备：

在1000ml三口瓶中加入400ml含5％氯化钠和0.5％聚乙烯醇的水溶液，加入由92.6g甲基丙烯酸甲酯、7.4g二乙烯苯(含量为54.3％)和0.5g过氧化苯甲酰组成的有机相溶液，调整搅拌速度，使水相中的有机相液珠直径在30-60目之间，在此搅拌速度下升温到80℃并维持8小时。将所得珠状聚合物用热水洗涤数次，晾干，筛分取30-60目树脂。

实施例2

凝胶型聚丙烯酸甲酯的制备：

在1000ml三口瓶中加入400ml含5％氯化钠和0.5％聚乙烯醇的水溶液，加入由89.0g丙烯酸甲酯、11.0g二乙烯苯(含量为54.3％)和0.5g过氧化苯甲酰组成的有机相溶液，调整搅拌速度，使水相中的有机相液珠直径在30-60目之间，在此搅拌速度下升温到80℃并维持8小时。将所得珠状聚合物用热水洗涤数次，晾干，筛分取30-60目树脂。

实施例3

大孔型聚甲基丙烯酸甲酯的制备：

在1000ml三口瓶中加入400ml含5％氯化钠和0.5％聚乙烯醇的水溶液，加入由40.1g甲基丙烯酸甲酯、19.9g二乙烯苯(含量为54.3％)、48g正丁醇和0.3g过氧化苯甲酰组成的有机相溶液，调整搅拌速度，使水相中的有机相液珠直径在30-60目之间，在此搅拌速度下升温到80℃并维持8小时。将所得珠状聚合物用热水洗涤数次，晾干后在索氏提取器中用丙酮提取6小时，筛分取30-60目树脂。

实施例4

大孔型聚丙烯酸甲酯的制备：

在1000ml三口瓶中加入400ml含5％氯化钠和0.5％聚乙烯醇的水溶液，加入由27g丙烯酸甲酯、23g二乙烯苯(含量为54.3％)、33.3g甲苯、16.7g液体石蜡和0.25g过氧化苯甲酰组成的有机相溶液，调整搅拌速度，使水相中的有机相液珠直径在30-60目之间，在此搅拌速度下升温到80℃并维持8小时。将所得珠状聚合物用热水洗涤数次，晾干后在索氏提取器中用丙酮提取8小时，筛分取30-60目树脂。

实施例5

实施例1所得聚甲基丙烯酸甲酯树脂的胺解：

30g实施例1所得聚甲基丙烯酸甲酯树脂悬浮于300ml乙醇胺中，搅拌下加热到120℃反应24小时，所得树脂用水洗涤到中性，干燥。测得树脂的氮含量为9.6％。

实施例6-8

实施例2-4所得树脂的胺解：

分别用实施例2、实施例3和实施例4所得聚丙烯酸甲酯树脂或聚甲基丙烯酸甲酯树脂取代实施例5中所用的聚甲基丙烯酸甲酯树脂，作相同的操作。所得树脂的氮含量分别为：10.5％、6.5％和6.0％。

实施例9

实施例5所得胺解树脂的碱性环氧基化：

10g实施例5所得胺解树脂悬浮于70ml二甲基亚砜和30ml水的混合液中，加入10g环氧氯丙烷，在搅拌下滴加饱和氢氧化钠溶液使体系的pH值在10-12之间，反应8小时后用水洗涤树脂至洗涤液中性，得含环氧基的树脂。环氧基含量为1.2mmol/g。

实施例10

实施例6所得胺解树脂的酸性环氧基化：

10g实施例6所得胺解树脂悬浮于70ml二氧六环、5g环氧氯丙烷和1g硫酸中，在搅拌下加热到115℃反应12小时，用水洗涤树脂至洗涤液中性，然后将树脂悬浮于50ml氢氧化钠溶液(0.5mol/L)中搅拌30分钟，用水洗涤到中性，得含环氧基的树脂。环氧基含量为1.6mmol/g。

实施例11

实施例7所得胺解树脂的碱性环氧基化：

10g实施例7所得胺解树脂悬浮于50ml二甲基亚砜和50ml水的混合液中，加入10g环氧氯丙烷，在搅拌下滴加饱和氢氧化钠溶液使体系的pH值在10-12之间，反应8小时后用水洗涤树脂至洗涤液中性，得含环氧基的树脂。环氧基含量为1.4mmol/g。

实施例12

实施例8所得胺解树脂的碱性环氧基化：

10g实施例8所得胺解树脂悬浮于50ml二甲基亚砜和50ml水的混合液中，加入10g环氧氯丙烷，在搅拌下滴加饱和氢氧化钠溶液使体系的pH值在10-12之间，反应8小时后用水洗涤树脂至洗涤液中性，得含环氧基的树脂。环氧基含量为0.8mmol/g。

实施例13

实施例9所得含环氧基树脂固定化胰蛋白酶：

1g实施例9所得含环氧基树脂悬浮于10ml冰冷的浓度为4mg/ml的胰蛋白酶磷酸缓冲液中(pH7.0)，在4℃条件下振荡48小时，得固定化胰蛋白酶。固定化蛋白质的量为24mg/g，固定化胰蛋白酶的活性为120U/g。

实施例14

实施例10所得含环氧基树脂固定化根霉脂肪酶：

1g实施例10所得含环氧基树脂悬浮于5ml根霉脂肪酶的磷酸缓冲液中(pH7.5，酶活为10U/ml)，在25℃条件下振荡12小时，得固定化根霉脂肪酶。固定化蛋白质的量为30mg/g，固定化根霉脂肪酶的活性为32U/g。

实施例15

实施例11所得含环氧基树脂固定化青霉素酰化酶：

1g实施例11所得含环氧基树脂悬浮于10ml浓度为8mg/ml的青霉素酰化酶的磷酸缓冲液中(pH 7.5)，在25℃条件下振荡24小时，得固定化青霉素酰化酶。固定化蛋白质的量为46mg/g，固定化青霉素酰化酶活性为482U/g。

实施例16

实施例12所得含环氧基树脂固定化葡萄糖异构酶：

1g实施例12所得含环氧基树脂悬浮于10ml浓度为10mg/ml的葡萄糖异构酶的磷酸缓冲液(pH 7.5)，在25℃条件下振荡24小时，得固定化葡萄糖异构酶。固定化蛋白质的量为46mg/g，固定化葡萄糖异构酶的活性为2350U/g。

Claims (6)

1.一种含环氧基固定化酶载体，其特征在于是由如下结构式所示的含有环氧基功能基和亲水性的酰胺基和羟基的交联聚合物树脂，作为酶固定化的载体：

R＝H或CH₃；

所说的树脂是凝胶型的树脂，或是大孔型的树脂；

所说的树脂其制备方法为：

A.丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯与二乙烯苯进行悬浮自由基共聚合，得到凝胶型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂；

或丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯与二乙烯苯在致孔剂的存在下进行悬浮自由基共聚合，得到大孔型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂；

B.聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂与乙醇胺反应，然后与环氧氯丙烷反应得到交联聚合物树脂；

所说的凝胶型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂的交联度为2-20％；大孔型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂的交联度为6-40％；

其致孔剂是：甲苯、丁醇、己醇、环己醇、庚烷、溶剂汽油、液体石蜡、固体石蜡，致孔剂是单独使用或任何两种的混合使用，单体与致孔剂的重量比例为1∶0.3-1∶2。

2.按照权利要求1所述的含环氧基固定化酶载体，其特征在于凝胶型或大孔型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂与乙醇胺反应的反应温度为50-150℃，反应时间为2-48小时。

3.按照权利要求1或2所述的含环氧基固定化酶载体，其特征在于凝胶型或大孔型聚丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂与乙醇胺反应所得的树脂与环氧氯丙烷的反应，使用酸催化或用碱催化。

4.按照权利要求3所述的含环氧基固定化酶载体，其特征在于用酸催化时，用二氧六环、四氢呋喃作为溶剂，树脂与酸催化剂的重量比为1∶0.01-1∶0.2，树脂与环氧氯丙烷的重量比为1∶0.1-1∶2，反应温度为50℃到回流温度，反应时间为8-24小时。

5.按照权利要求4所述的含环氧基固定化酶载体，其特征在于用碱催化时，用水、二甲基亚砜或水与二甲基亚砜的混合物作溶剂，水与二甲基亚砜的比例为1∶0-0∶1，树脂与环氧氯丙烷的重量比为1∶0.1-1∶2，碱的摩尔数为环氧氯丙烷摩尔数的1.1倍。

6.权利要求1的含环氧基固定化酶载体的用途，其特征在于所述含环氧基的树脂与酶在pH 6-14的介质中，在4℃到室温反应2-48小时，将酶固载于树脂上，制成固载量为10-150mg酶/g树脂。