JPH034559B2 - - Google Patents

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JPH034559B2
JPH034559B2 JP56038606A JP3860681A JPH034559B2 JP H034559 B2 JPH034559 B2 JP H034559B2 JP 56038606 A JP56038606 A JP 56038606A JP 3860681 A JP3860681 A JP 3860681A JP H034559 B2 JPH034559 B2 JP H034559B2
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ganglioside
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Rui Taiyo Jan
Tarudei Mitsusheru
Kuuru Gyui
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ANSUCHI MERYUU
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Publication of JPH034559B2 publication Critical patent/JPH034559B2/ja
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    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K39/02—Bacterial antigens
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明はガングリオシドの新規誘導体、その製
造方法およびその適用に関する。 ガングリオシドの役割は、細胞膜の生物学的性
質において、一段と重要になり、かつ一層明らか
にされてきているようである。これは、特に種々
の生物的巨大分子（ホルモン、ウイルス、インタ
ーフエロン、微生物毒素など）に対する特異的受
容体として機能し、従つてこれらの利用により
夫々細胞に対する毒性のもしくは有益な情報を明
らかにすることができる。この特異的受容体の生
物学的機能により、医薬の領域およびアフイニテ
イークロマトグラフイーによる精製の分野で極め
て多岐にわたる応用が可能となる。 ガングリオシドが、特に脳、肝臓および腎蔵か
ら単離することのできるグリコ脂質であり、この
分子は化学的に結合した特に脂肪酸、スフインゴ
シン、糖およびシアリン酸を含有する。特に、ガ
ングリオシドはＮ−アシル基（脂肪酸のアシル誘
導体）およびガラクトーシアミンのＮ−アセチル
基を少なくとも１つ有している。 スヴエナーホルム〔J.NEUROCHEM.10，613
（1963）〕により提唱された命名法に従えば、種々
のガングリオシドは、該ガングリオシドがモノ
−、ジ−、トリ−もしくはテトラ−シアロガング
リオシドのいずれであるかに従つて、文字Ｇの後
に４種の文字Ｍ、Ｄ、ＴもしくはＱを付して表わ
される。これら文字は次に、同量のシアリン酸を
含むが、違つたクロマトグラフイーの移動度を有
しているガングリオシドを区別することができる
ように、整数値を有する。ガングリオシドGM1
に対するスヴエナーホルムの提唱した命名法と同
様に、以下「リゾガングリオシド」によつてガン
グリオシドのＮ−アセチルおよびＮ−アシル基を
全てNH2基に加水分解して得られる生成物を表
す。 本発明において出発物質として使用する種々の
ガングリオシドは例えばイオン交換樹脂上に吸着
させ、メタノール中の酢酸カリウムの漸増的濃度
勾配で選択的に溶出する〔フレツドマン（Fred
−man）等、Biochimica et Biophysica Acta.
（1980）；フレツドマン等の報告「ガングリオシド
の構造および機能（Sthucture and func−tion
of gangliosides）」ル・ビツシエンベール（Le
Bischenberg）会議、ストラスブール
（Strasbourg）、1979年４月、プレナム・プレス
（Plenum Press）版参照〕などの公知の方法に従
つて製造することができる。 所定のガングリオシドを、選ばれた適当なクロ
マトグラフイー用担体表面に化学的に固定し得た
場合、このガングリオシドを自然にかつ選択的に
認識する粒子または生物学的巨大分子に対する特
異的アフイニテイーに基く、新規なクロマトグラ
フイ用担体を提供することができる。 従つて、薬理学的に極めて重要なあらゆる族の
生物学的巨大分子の精製もしくは単離、並びに特
定のガングリオシドが指定する粒子（もしくは細
胞）を標識しもしくは単離するために不動化する
ことが可能となる。 かくして、ガングリオシドGM1により担体上
を被覆することにより、コレラ毒素もしくはE.コ
リおよび他の腸バクテリアにより分泌される熱不
安定性腸毒素を精製することが可能となる。ホル
ムアルデヒドもしくは他の公知の方法により不活
化した後、相当するワクチンを調整することが可
能となる。 担体表面をガングリオシドGD1a、GD1bまたは
GT1で被覆することにより、破傷風毒素を固定す
ることができ、かつ次いで精製して、従来のワク
チンよりも一層純粋でかつ一層免疫学的に適した
抗破傷風ワクチンを調製するために使用すること
ができる。 ガングリオシドGM2により担体を被覆して、イ
ンターフエロンを単離もしくは精製することがで
き、このインターフエロンは、現在薬理学的に抗
ウイルス性並びに制癌性において大きな期待が寄
せられているものである。 ここ数年間に、多数のクロマトグラフイー用担
体および多数の化学反応が開発され、配位子（特
異的認識能を付与された分子または受容体）を、
特にアフイニテイークロマトグラフイーで使用す
るために、担体上に固定することが行われてい
る。 一般に担体上に必要とされる化学基はアルコー
ル性−OH、アミノ基−NH2、カルボキシル基−
COOH、エポキシ基
【式】アルデヒド 基−CH＝Ｏである。 配位子上の補足的化学基は公知の原理に従つて
同じ基から選ばれる。この原理は、例えば研究
「アフイニテイークロマトグラフイー、原理およ
び方法（Affinity Chromatogrphy，prinicples
and methods）」フアルマ−シア・フアインケミ
カルズ（pharmacia Fine Chemicals）、ウプサ
ラ（UPSALLA）、スウエーデン（1974）におい
て記載されている。 特にガングリオシドとグリコ脂質の場合におい
て、２種の型の反応性化学基が当然自由に利用で
きる。事実、多数のアルコール基およびしばしば
Ｎ−アセチルノイラミン酸もしくは他のシアル酸
の有している１またはそれ以上のカルボキシル基
がある。しかしながら、実験ではこのような基を
介して固定することはかかる担体に対する特異的
アフイニテイーを破壊するか、もしくは無用のも
のとしてしまうことがわかつている。 この問題は、従つてガングリオシドまたはグリ
コ脂質上に他の化学基を、これらの生物学的活性
を損うことなしに、形成させることを必要とす
る。 ウエムラ（UEMURA）等およびウイーガント
（WIEGANDT）等により開発された種々の方法
は二重結合状態にあるスフインゴシンの末端部分
を酸化して、エポキシ型のもしくはアルデヒド型
の反応性基を生成することからなつている。 しかしながら、この方法はわずかの利益しか与
えない。 1963年にタケトミ（TAKETOMl）等によつ
て開発された他の方法〔J.Biochem.，54−5444
（1963）〕はガングリオシドをリゾガングリオシド
に変えることからなつている。Ｎ−アセチルおよ
びＮ−アシル基が、120℃にてブタノール−10N
水酸化カリウム（90：10）混合液中で２時間加熱
還流することにより完全にアミノ基−NH2に加
水分解される。水性相中に抽出し、蒸発により濃
縮した後、かくして得られるリゾガングリオシド
は種々のマトリツクス上に容易に結合させること
ができる。かくして、リゾガングリオシドGM1を
種々のポリサツカライド担体に結合させて、コレ
ラ毒素を精製することができる（フランス特許出
願第7728163号参照）。 しかしながら、破傷風毒素の受容体である、ガ
ングリオシドGD1a、GD1bまたはGDT1を固定するた
めに、同様の方法を使用しても、破傷風毒素に対
するアフイニテイーを付与された担体を得ること
は不可能であり、これは逆に通常予想されること
である。 今や、ガングリオシドを注意深く加水分解する
ことにより、上記欠点を有さない「活性」ガング
リオシドの新規誘導体に転化し得ることが見出さ
れた。この新規誘導体は、生物学的巨大分子に対
する特異的アフイニテイーを有する配位子の性質
を損うことなしに、種々の方法により種々の担体
上に固定することを可能とする反応性基を有して
いる。 この方法は、多数のＮ−アシル基をしているあ
らゆるガングリオシドに対して極めて一般的に応
用することができる。 アフイニテイークロマトグラフイー用担体の使
用は、ガングリオシドGD1a、GD1bまたはGT1の誘
導体の場合において、単一の工程により破傷風毒
素を精製することを可能とした。このことはガン
グリオシドの化学的活性化の新しい条件がこれら
の生物学的活性を損わないことを示している。こ
のような性質の、簡単かつ急速な精製は、我々の
知る限りではまつたく知られていなかつた。 このガングリオシドの注意深い活性化方法は、
同様にガングリオシドGM1および他の純粋なガン
グリオシドもしくはこれらの混合物に対して首尾
よく適用することができる。 本発明はガングリオシドの新規誘導体を目的と
し、これらはGD1a、GD1bおよびGT1からなる群か
ら選ばれるの部分的脱アシル化生成物であり、ニ
ンヒドリン試験における正反応によつて証拠づけ
られる遊離アミノ基を有し、クロロホルム−メタ
ノール−水系（60：32：７）中でのシリカゲルの
薄層クロマトグラフイーに対し移動性であり、か
つもとのガングリオシドの特異的アフイニテイー
を有することを特徴とし、該誘導体は部分的脱ア
シル化の際に生成されるアミノ基を介して、前記
特異的アフイニテイーを損うことなしに、固体担
体に結合することができる。 本発明は同様にガングリオシドの新規活性誘導
体の製造方法をも目的とする。 ガングリオシドの生物学的特性を本質的に活性
化するための本発明の方法に従えば、０〜120℃
の範囲の温度にて、該ガングリオシドを塩素性水
性溶液で処理するだけでよく、該温度は媒質が高
塩基性であればある程低くなければならない。
1N水酸化カリウムもしくは水酸化ナトリウムに
匹敵するアルカリ性度を有する最終溶液に対して
は、温度は100℃を越えないことが重要である。
１／10 Ｎの水酸化ナトリウムまたは水酸化カリ
ウムに匹敵するアルカリ性度の溶液に対しては、
120℃を越えないことが重要である。極普通には
40〜100℃の範囲内で操作することのできる条件
が選ばれる。 反応時間は遊離アミノ基を生成させるのに十分
な時間でなければならないが、更に完全に脱アシ
ル化される前に反応を停止しなければならない。
この反応時間は、各場合において、例えばニンヒ
ドリン試験またはジニトロフルオロベンゼンによ
るサンジエール（SANGER）試験を利用し、完
全脱アシル化後にみられる色よりも強度の低い中
間色を見出すことによる、簡単な実験によつて決
定することができる。一般的には、この反応時間
は30分〜24時間の範囲で変化する。 反応溶媒は水、または水と有機溶媒との混合物
である。有機溶媒としてはブタノールなどのアル
コール類を挙げることができる。 本発明の方法において使用することのできる塩
基の中では、水中においてPH９〜14を与えること
のできるもの、特にナトリウムまたはカリウムな
どのアルカリ金属の水酸化物を挙げることができ
る。 最も簡単な方法は、選ばれたガングリオシドを
1Nの水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム中
に溶解し、該溶液を60〜100℃の範囲の温度にて
約２時間温置することである。 この転化はＮ−アセチル基またはＮ−アシル基
の部分的加水分解によつて得られる、少なくとも
１つのアミノ基の出現により示され、その数は公
知の方法に従つて、該アミノ基−NH2によつて
固定することのできる十分な値であるが、この転
化を充分に制限して、選ばれたガングリオシドの
生物学的性質を本質的に維持しなければならな
い。 このような塩基性加水分解の新規な条件が、タ
ケトミ（TAKETOMl）により記載された条件
で完全に加水分解して得られるリゾガングリオシ
ドとはまつたく異つたガングリオシドの誘導体を
与えることを立証することができる。事実、クロ
ロホルム−メタノール−水系（60：32：７）系で
のシリカゲル上における薄層クロマトグラフイー
において、タケトミの方法に従つて得られるリゾ
ガングリオシドは完全には移動せず、一方本発明
の方法に従つて活性化したガングリオシドは対応
する天然のガングリオシドのRf値と同等もしく
はそれ以下のRf値を与えるが、出発点に対し常
に移動がみられる。 前に述べたように、本発明はまた、部分的に加
水分解することにより生成されるアミノ基を介し
て固体担体上に結合された、部分的に加水分解さ
れたガングリオシドの新規誘導体をも発明の目的
とする。出発ガングリオシドは前述のガングリオ
シドGD1a、GD1bおよびGT1である。 クロマトグラフイー以外の応用、特に生物学的
試験に対する応用において、同様に吸着性を有す
る他の固体担体、例えばポリスチレン、ポリプロ
ピレン、ラテツクスなどもしくは上記の如き化学
的結合剤を固定することのできるもの（デキスト
ラン、セルロースなど）を利用することができ
る。 これら固体担体はクロマトグラフイー用に使用
し得る固体担体であることも可能である。 本発明は、更に担体上に結合された本発明のガ
ングリオシドの新規誘導体の製造方法をも発明の
目的としている。 前記のような注意深い加水分解工程を含む本方
法は、更に公知の方法に従つて、ガングリオシド
誘導体を、生成されたアミノ基を介して固体担体
上に固定する工程を含むことを特徴とする。 この結合反応は、必要ならば上記の如く、公知
の方法に従つて中間的結合剤（２官能性誘導体）
の存在下で行うことができる。使用し得る固体担
体としては、多孔性固体担体を例示することがで
きる。多孔性固体担体は、例えばシリカ、アルミ
ナ、マグネシアなどの金属酸化物もしくはガラ
ス、ケイ酸塩、硼ケイ酸塩またはカオリンなどの
前記金属酸化物の天然または合成誘導体もしくは
ポリサツカライド、ポリアクリル酸などのビニル
ポリマー、ポリスチレンなどの有機ポリマーであ
る。 多孔性無機担体は、部分的脱アシル化の際に生
成されるガングリオシドのアミノ基を介して、ガ
ングリオシドの新規誘導体を有利に固定すること
のできる反応性基を有するように変性された担体
であり得る。該反応性基は２官能性誘導体（結合
剤）の１官能基と反応することのできる基であ
り、従つて他の官能基は前記ガングリオシドの−
NH2基と反応性である。 HH2基と反応し得る、前記官能基は良く知ら
れており、特にエポキシ基、カルボニル基（特に
アルデヒド基）、カルボジイミドの存在下でのカ
ルボキシル基などである。 特別な本発明の実施態様に従えば、結合が担体
および／エポキシ型の結合剤もしくはエポキシ型
の担体と共に行われた場合注意深い加水分解反応
並びに結合反応は、初めにもしくは加水分解反応
中に担体を添加することにより同時に起こり得
る。 ガングリオシド誘導体は、例えばポリサツカラ
イド粒子上に固定することができる。「ポリサツ
カライド」なる表現は、変性ポリサツカライドを
も包含するものとする。このポリサツカライド
は、特にデキストラン、セルロース、殿粉、アガ
ロースなどもしくは特にジエチルアミノエチルデ
キストラン、ジエチルアミノエチルセルロースな
どの、ジアルキルアミノアルキル−またはジ（ヒ
ドロキシアルキル）アミノアルキル−ポリサツカ
ライドなどといつた変性ポリサツカライドであ
る。 このガングリオシド誘導体を、ジエポキシド、
ジカルボニル化合物、エピクロルヒドリンもしく
はシアン化ブロムなどの結合剤によつて、公知の
方法に従つてポリサツカライド上に固定する。 ポリサツカライドは粒子形状ではなく、無機粒
子上の被膜の状態で使用することも可能であり、
該無機粒子は特に前記した如き無機酸化物であ
る。 ポリサツカライドもしくは変性ポリサツカライ
ドで被覆した多孔性無機粒子は、特にフランス特
許出願第7623176もしくは第7728163号に記載され
たようなものであり得る。 フランス特許出願第7623176号によるポリサツ
カライドにより被覆された無機粒子は、アミノ化
ポリサツカライドポリマーにより表面が直接被覆
された多孔性無機酸化物などの、多孔性無機担体
により構成されている。 多孔性無機担体はシリカ、アルミナ、マグネシ
ア、酸化チタン、もしくはこれらの合成または天
然誘導体、例えばガラス、硼ケイ酸塩、ケイ酸
塩、カオリンなどであり得る。 アミノ化ポリサツカライドポリマーは担体上に
接着によつて固定される。 多孔性無機担体の内部表面は、例えば100m2／
ｇもしくはそれ以下であり、５〜80m2／ｇの範囲
内であり得る。平均孔径は好ましくは25nmまた
はそれ以上であり、50〜100nmの範囲内であり得
る。より大きな表面もしくはより小さな孔径の担
体に対して、担体内部表面はポリサツカライドポ
リマーには受け入れられないものとなつてしま
う。多孔性無機担体は、例えばシリカもしくはア
ルミナおよび好ましくは多孔性シリカ担体であ
り、これはフランス特許第1473239号、第1473240
号、第1475929号、第1482867号などに記載された
方法に従つて得られ、陰イオン性であることを特
徴とし、例えばローヌ・プーラン・シミー・フエ
ン（RHONE−POULENC CHIMIE FINE）社
により商品名スフエロジル（SPHEROSIL）
XOB 030、XOB 015、XOB 005およびXOC
005などである。 多孔性無機担体の内部表面を含浸もしくは被覆
するために使用されるアミノ化ポリサツカライド
ポリマーは高い陽イオン性を有し、かつ良好なる
親水性を有している。これらは少なくとも104ダ
ルトンに等しい分子量を持たなければならず、
105〜106ダルトンの範囲であり得る。これらの式
はいずれでもよく、特にデキストラン、殿粉、セ
ルロース、アガロースもしくはあらゆる公知の糖
の天然または合成ポリマーのアミノ化誘導体であ
り得る。 ポリサツカライドポリマーのアミノ基は第１、
第２または第３アミンもしくは第４アンモニウム
であり得る。 アミノ化ポリサツカライドポリマーは特に次
式： Ｒ−（CH2）o−NR1（R2） ここで、Ｒは例えばデキストラン、殿粉、セル
ロース、またはアガロースなどのポリサツカライ
ドの残基を表し、ｎは１〜10の範囲の数、好まし
くは２〜５の数であり、R1およびR2は同一また
は異つており、低級ヒドロキシアルキルまたはア
ルキル基、例えば−CH3，−CH2−CH3，−
CH2OH，−CH2−CH2OHまたは−CHOH−CH2
を表す、に相当するものであり得、これらのポリ
マーは古典的な４級化剤、例えばハロゲン化アル
キルまたはヒドロキシアルキル、硫酸ジメチルな
どによつて４級化することができる。 この種のポリマー中では、特に商品名DEAEデ
キストラン（ジエチルアミノエチルデキストラ
ン）分子量500000およびQAEデキストラン（４
級化ジエチルアミノエチルデキストラン）でフア
ルマーシア（PHARMACIA）社により市販され
ている公知の化合物および商品名DEAE殿粉（ジ
エチルアミノエチル殿粉）として知られる化合物
並びにロケツト・ナシヨナル（ROQUETTE
NATIONAL）社により商品名CATOとして市
販されているような陽イオン性殿粉などを例示す
ることができる。 アミノ化ポリサツカライドポリマーは、また架
橋剤、例えばカルボニル化合物、１，４−ブタン
ジオールジグリシジルエーテルなどのジエポキシ
ド、またはエピクロルヒドリンもしくはエピブロ
モヒドリンなどによつて架橋することもできる。 かくして被覆された担体上にガングリオシド誘
導体を、例えば既に上記したような結合剤によつ
て固定することができる。 フランス特許出願第7728163号に従つて、変性
または未変性ポリサツカライドにより被覆された
多孔性無機粒子は、前述の如きポリサツカライド
ポリマー、変性ポリサツカライドポリマーおよび
アミ化ポリサツカライドポリマーなどによつて被
覆された多孔性無機担体により構成され、該ポリ
サツカライド被覆は必要ならば架橋によつて安定
化され、該ポリサツカライドもしくは変性ポリサ
ツカライド被覆は模式的式R″−NH2を有するガ
ングリオシドでグラフトされ、ここでB″はガン
グリオシド誘導体分子の残基である。該分子のグ
ラフト結合は式： R3−CH2−NH−R″ ただし、R″は前記定義通りであり、R3−CH2
−は、例えば水素化硼素を用いた還元を伴う、酸
化開裂反応に付した際の前記ポリサツカライドま
たは変性ポリサツカライドポリマーの残基を表
す、 により表される。 多孔性無機担体は既に前記したようなものであ
る。ポリサツカライドポリマーは特にセルロース
であり、変性ポリサツカライドポリマーは、特に
ジエチルアミノエチルセルロースであり、変性も
しくは未変性ポリサツカライドポリマーの被覆
は、必要ならば既に上記したような架橋剤により
架橋して安定化される。 これら物質の製造方法は、多孔性無機担体をポ
リサツカライドポリマーまたは変性ポリサツカラ
イドポリマーによつて被覆し、必要によりポリサ
ツカライドポリマー被覆を変性ポリサツカライド
被覆に転化し、必要により該被覆を安定化するた
めに架橋し、該ポリサツカライドまたは変性ポリ
サツカライド被覆を公知の方法に従つて酸化開裂
反応に付し、かくして得られる酸化生成物を、上
記のような、模式的な式R″−NH2を有するガン
グリオシド活性誘導体と反応させ、次いで得られ
るイミノ化誘導体を、イミノ結合をアミノ結合に
還元することのできる還元剤の作用に付すことを
特徴とする。 本発明は、同様に新規なガングリオシドの部分
的脱アシ化生成物の、生物学的巨大分子、粒子ま
たは細胞の精製または単離もしくはこれらの除去
に対する適用をも発明の目的とする。 この応用は前述の如きガングリオシドの活性誘
導体を表面上に固定した担体を、精製、単離もし
くは除去すべき巨大分子、粒子または細胞を含有
もしくは含有している可能性のある液と接触させ
ることを特徴とする。次いで、精製並びに単離の
観点から、活性誘導体により被覆された担体上に
おける巨大分子（または粒子もしくは細胞）の存
在もしくは不在を調べ（公知の方法に従つてわか
る）、該巨大分子（または粒子もしくは細胞）を
分離することができる。このようにして、ガング
リオシドGD1aおよび／またはGD1bおよび／または
GT1の活性誘導体で被覆された担体上に破傷風毒
素を固定することができる。 特別な実施態様に従えば、この適用はアフイニ
テイ−クロマトグラフイー法を利用することによ
り実施される。このために、上で定義したような
ガングリオシドの活性誘導体を表面上に固定した
担体を使用してカラムをつくり、このカラムに精
製もしくは単離しようとする巨大分子を含有する
溶液を通す。必要ならば、該分子がガングリオシ
ド誘導体上に固定された後、該分子を溶出して単
離する。 活性ガングリオシド上に不純物を固定すること
により、単に該不純物を除去したい場合には、必
ずしも最終的に溶出を行う必要はない。 逆に、活性グリコ脂質上に選択的に固定された
生成物を得たい場合には、最終的に溶出を行うこ
とが有利である。 本発明の応用の特殊な実施態様に従えば、以下
のようにして破傷風毒素を含有する溶液から該毒
素を分離する。 即ち、まず活性ガングリオシドGD1bおよび／ま
たはGT1を表面上に固定した担体を用いてカラム
を調製し、該カラムに破傷風毒素を含有するもし
くは含有している可能性のある溶液を通し、かつ
次に必要に応じて、精製された破傷風毒素を回収
したい場合には該毒素を溶出する。 以下、実施例により本発明を更に説明するが、
これら実施例により本発明は何等限定されるもの
ではない。 実施例 １ ガングリオシドGD1bの活性化 10マイクロモルのGD1bを1N水酸化カリウム１
ml中に溶解し、この溶液を60℃にて２時間温置。
ニンヒドリン試験に対して正の、得られた溶液を
次に希釈し、前述のような方法のいずれか従つ
て、この活性化ガングリオシドを結合するために
調節する。 同様な方法を他のガングリオシドに対して適用
することができる。 実施例 ２ ガングリオシドGT1の活性化 10マイクロモルのGT1をブタノール−10N水酸
化カリウム（90：10）混合液10ml中に懸濁。この
懸濁液は最終的には1Nの水酸化カリウムに等価
である。60℃にて２時間温置し、等量の水を添加
した後、活性化ガングリオシドを含有する水性相
（これはニンヒドリン試験に対し正）を取り出し
て、前述の方法のいずれかに従つて、該活性化ガ
ングリオシドを結合するために調節する。 同様な方法を他のガングリオシドに対して適用
することができる。 実施例 ３ ガングリオシドGD1bの活性化 15マイクロモルのGD1bを10mlのブタノール−
1N水酸化カリウム（90：10）混合液中に懸濁。
この懸濁液は最終的に１／10N水酸化カリウムに
等価である。120℃にて２時間（還流しつつ）温
置し、等量の蒸留水を添加した後、活性化ガング
リオシドを含有する水性相を取り出し、前述の方
法のいずれかに従つて、該活性化ガングリオシド
を結合するために調節する。このものはニンヒド
リン試験に対し正である。 同様な方法を他のガングリオシドに対して応用
することができる。 実施例 ４ エポキシ基を有する２官能性試薬を介しての、 かくして活性化したガングリオシドのポリサツ
カライドマトリツクス上への結合 すべての場合において、結合法は注意深い加水
分解により生成された第１アミノ基の極めて安定
な誘導体としてガングリオシドをアミノ結合によ
り固定する。これにより極めて寿命の長い担体を
得ることができる。 ４−１ 例えばフアルマーシア社（スウエーデ
ン、ウプサラ）により「活性化エポキシセフアロ
ーズ（Sepharose）6B）の名で市販されているア
ガロースの誘導体を使用して、製造業者の勧める
方法に従つて固定することができる。１〜10ミリ
モル／mlの量が推奨される。結合前および後のシ
アリン酸の量により配位子の良好な固定を確かめ
ることができる。 ４−２ セルロースなどの他のポリサツカライド
を使用することができる。ジエポキシ試薬、例え
ば１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル
〔アルドリツチ（Aldrich）〕による結合では、周
囲温度にて一夜、10gのセルロースを、1N
NaOH 20ml、ブタン−ジオールジグリシジルエ
ーテル20mlおよびNaBH440mgを含む混合物中で
温置することができる。 翌日、該担体をアルコール、水、および最後に
0.1N NaOHで洗浄。過により脱水した後、こ
の担体を0.1N NaOH溶液としての予め活性化し
たガングリオシドの１種と、１夜接触させる。１
〜10ミリモル／mlの量が推奨される。20〜40℃の
温置温度を使用することが好ましい。 ４−３ 同様に前に述べた、フランス特許出願第
7623176号において記載されているようなおよび
２次的にジエポキシ試薬などによつて活性化され
た、ポリサツカライドで含浸した多孔性無機担体
を使用することもできる。この担体は、特に工業
的用途に対して推奨できる。 実施例 ５ 過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化されたポリサ
ツカライドマトリツクス上への活性化ガングリ
オシドの結合 この方法に対しては、フランス特許出願第
7623176号に記載されたようなポリサツカライド
で含浸した多孔性担体もしくはセルロースが好ま
しい。アガロースは同じ条件下でわずかに酸化さ
れる。 この方法は既にタケトミ（TAKETOMl）の
方法に従つて調製されたリゾガングリオシドの結
合のために応用されている（フランス特許出願第
7728163号参照）。 本発明の方法に従つて活性化したガングリオシ
ドを固定するための条件も同じである。 10gの担体（例えばセルロース）を、0.02モル
の過ヨウ素酸ナトリウム100mlに添加し、周囲温
度で２時間保持。 この担体を、次に10g／のNaClを添加したPH
９の0.02モル炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、過
により脱水し、前記実施例１〜３のいずれかに従
つて活性化したPH９のガングリオシド溶液15mlを
添加。１〜10ミリモル／mlの担体を使用すること
が推奨される。 周囲温度にて一夜温置した後、水素化硼素ナト
リウム、NaBH4を20℃にて２時間かけて添加
（最終的に0.2モル）し、形成されたイミノ基を極
めて安定なアミノ結合に還元。結局、かくしてつ
くられた担体は優れた耐用寿命を有し、かつ数十
もしくはそれ以上の多数回に亘り再使用し得る。 実施例 ６ シアン化ブロム法によるポリサツカライドマト
リツクス上への活性化ガングリオシドの結合 この方法はポラス（PORATH）等のNature，
215，1491（1967）に記載されている方法である。
実施に当つては、使用上の注意書きに従つて、PH
11にて、フアルマーシア社により市販されている
シアン化ブロムで活性化したセフアローズを混合
するだけで十分である。ゲル／ml当たり１〜10ミ
リモルの活性化ガングリオシドの使用を、ここで
も推奨する。この方法をセルロースまたは前記の
如き多孔性無機担体に対して、操作条件を全く変
えることなく応用することができる。 実施例 ７ 破傷風毒素の固定並びに精製に対する適用１例
として、既にフランス特許出願第7723176号に記
載した方法に従つて、ポリサツカライドで含浸し
た多孔性無機担体について得られた結果を以下に
述べる。この担体は、特に懸著な機械的抵抗性を
有し、工業的精製に対して極めて有用であるので
選んだ。 この多孔性無機担体はローヌ・プーラン社によ
りスフエロジルXOC005なる名称で市販されてい
るようなシリカ担体である。このものの比表面積
は約10m2／ｇであり、平均孔径は約300nmであ
り、このシリカはDEAEデキストランの単分子層
で被覆され、既に述べたフランス特許出願第
7623176号に記載した方法に従つて架橋されてい
る。前記実施例６〜８の１つに記載した方法を適
用して、担体10gに対して、例えば本発明の前記
実施例１〜３のいずれかに従つて予め活性化した
ガングリオシドGD1bまたはGT150マイクロモルを
固定することができる。このために、10gの担体
を0.1N水酸化ナトリウム溶液で洗浄し、カラム
に充填する。これは体積約23mlを占める。このカ
ラムを、グリコール（Glycocolle）20g／およ
びNaCl10g／を含む溶液で平衡にする。破傷風
毒素を粗製状態で、滴定によれば、500単位
（Lf／ml）を含有する「クロストリジウム テタ
ニ（Clostridium teta−ni）の培養液を同じ緩
衝液で透析した。この破傷風毒素の未精製溶液50
mlを上記カラムで過した。ガングリオシドGD1b
またはGT1を認識しないあらゆる不純物がカラム
を通過する。破傷風毒素のみがカラム上に固定さ
れ、これは0.1NアンモニアもしくはPH９のグリ
ココール20g／とNaCl60g／とを含有する緩
衝液による溶出で回収することができる。 回収された生成物は元の培養物の有していた生
物活性の約70％を有している。この１工程のみ
で、該毒素の精製が達成され、既に報告された規
準を越えている〔B.ビツジニ（BIZZINI）等の
Bull.lnst.Pasteur，72，177（1974）参照〕。かく
して破傷風毒素は平均約3500Lf／mg窒素の特異
的活性を保持して精製される。比、（D.
O.280nm）／（D.O.260nm）は約２に等しい。 元の培養物の液について多数の沈殿曲線を与
える培養物の抗液血清（se′rum anti−filtrat）
に対するゲロースによる免疫拡散
（immunodiffusion）により、かくして精製され
た破傷風毒素についてはただ一つの沈殿曲線が観
察される。この曲線は基準の特異抗毒素血清もし
くはパスツール研究所から供せられた標準精製毒
素と完全に同じ応を与えている。 前記文献のタケトミにより記載された一種強い
条件下で加水分解したガングリオシドGD1bまたは
GT1について同様な方法で調製した担体は破傷風
毒素を殆ど固定できない。活性化されていない同
様なガングリオシドでも上記方法によつては担体
上に固定することはできない。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 固体担体に結合された際に特異的アフイニテ
    イーを示す、ガングリオシドGD1a、GD1bおよび
    GT1からなる群から選ばれるガングリオシドの部
    分的脱アシル化誘導体であつて、ニンヒドリン試
    験における正反応により証拠づけられる遊離アミ
    ノ基を有し、60：32：７のクロロホルム−メタノ
    ール−水系におけるシリカゲルの薄層クロマトグ
    ラフイーにおいて移動性で、かつガングリオシド
    に基づく特異的アフイニテイーを有し、前記誘導
    体は前記特異的アフイニテイーを失うことなし
    に、部分的脱アシル化の際に生成されるアミノ基
    を介して固体担体に結合させ得るものであること
    を特徴とする、前記誘導体。 ２ 該ガングリオシドがガングリオシドGD1aまた
    はGD1bである、特許請求の範囲第１項記載の誘導
    体。 ３ 該ガングリオシドがガングリオシドGT1であ
    る、特許請求の範囲第１項記載の誘導体。 ４ 固体担体に結合された際に特異的アフイニテ
    イーを示す、ガングリオシドGD1a、GD1bおよび
    GT1からなる群から選ばれるガングリオシドの部
    分的脱アシル化誘導体であつて、ニンヒドリン試
    験における正反応により証拠づけられる遊離アミ
    ノ基を有し、60：32：７のクロロホルム−メタノ
    ール−水系におけるシリカゲルの薄層クロマトグ
    ラフイーにおいて移動性で、かつガングリオシド
    に基づく特異的アフイニテイーを有し、前記誘導
    体は前記特異的アフイニテイーを失うことなし
    に、部分的脱アシル化の際に生成されるアミノ基
    を介して固体担体に結合させ得るものである前記
    誘導体の製造方法において、 ガングリオシドまたはガングリオシドの混合物
    を、０〜120℃の範囲の温度にて塩基性水性溶液
    で処理し、該温度は媒質が高塩基性であればある
    程それだけ低くなければならないことを特徴とす
    る方法。 ５ 塩基を、40〜100℃で操作するように選ぶこ
    とを特徴とする、特許請求の範囲第４項記載の製
    造方法。 ６ 反応時間を、原料のガングリオシドの全脱ア
    シル化を達成するのに必要とされる時間よりも短
    くなるように選ぶことを特徴とする、特許請求の
    範囲第４または５項記載の製造方法。 ７ 反応時間が30分〜24時間である、特許請求の
    範囲第６項記載の製造方法。 ８ 塩基が水中でPH９〜14を与えることのできる
    塩基である、特許請求の範囲第４〜７項のいずれ
    か１項に記載の製造方法。 ９ 100℃を越えない温度にて、1N水酸化カリウ
    ムまたは水酸化ナトリウムに匹敵するアルカリ性
    度を有する溶液で操作することを特徴とする、特
    許請求の範囲第４〜８項のいずれか１項に記載の
    製造方法。 １０ 約60〜100℃にて約２時間操作することを
    特徴とする、特許請求の範囲第９項記載の製造方
    法。 １１ １／10N水酸化ナトリウムに匹敵するアル
    カリ性度の下で120℃もしくはそれ以下の温度で
    操作する、特許請求の範囲第４、６〜８項のいず
    れか１項に記載の製造方法。
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