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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist insbesondere eine stabilisierte,
bivalente Hepatitis A/Flecktyphus (HA-Vi)-Vakzinzusammensetzung, in der die Vi-Valenz
ihre immunogene Wirkung während
wenigstens ungefähr
24 Monaten behält.
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Hepatitis
A und Flecktyphus sind zwei Krankheiten, für die man bereits ein Vakzin
zur Verfügung
hat. Sie treten beide in den Regionen der Welt auf, in denen die
Hygienezustände
weit davon entfernt sind, optimal zu sein. In dem Maße, in dem
die entsprechenden infektiösen
Mittel denselben Übertragungsweg
(oraler, fäkaler
Weg) gemeinsam haben, und in dem Maße, in dem die endemischen
Zonen dieser Krankheiten sich in großem Umfang decken, scheint
es interessant zu sein, die zwei Valenzen in einem Produkt zu kombinieren. Es
ist insbesondere leicht einzusehen, dass eine HA-Vi-Kombination
auf dem Gebiet der Vakzine für
Reisende attraktiver wäre
als die zwei monovalenten Vakzine Ha und Vi, die getrennt verabreicht
werden müssen.
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Es
wurden bereits Untersuchungen durchgeführt, um zu beweisen, dass die
Valenzen HA und Vi insbesondere bezüglich Unschädlichkeit, immunogener Wirkung
und Stabilität
kompatibel sind. Diese Studien verwenden HA-Vi-Kombinationen, die
ausgehend von monovalenten Vakzinen, die es bereits auf dem Markt gibt,
hergestellt wurden; diese sind insbesondere zwei an der Zahl: einerseits
die Untersuchungen, die unter Kombination der monovalenten Produkte
HavrixTM (HA) und TypherixTM (Vi)
von SmithKline Beecham Biologicals (Rixensart, Belgien) durchgeführt wurden,
und andererseits die Untersuchungen, die unter Kombination der monovalenten
Produkte AvaximTM (HA) und Typhim ViTM (Vi) von Aventis Pasteur (Lyon, Frankreich)
durchgeführt
wurden.
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In
den zwei Untersuchungsreihen wird das monovalente HA-Vakzin durch das
inaktivierte und an Aluminiumhydroxid adsorbierte Hepatitis A-Virus
gebildet. Das monovalente Flecktyphus-Vakzin besteht aus dem Polysaccharid
der Kapsel von Salmonella typhi, das ohne Adjuvans bleibt. Schließlich werden
die bivalenten Kombinationen in identischer Weise produziert, indem
nur die entsprechenden monovalenten Vakzine (diese monovalenten
Vakzine werden in flüssiger
Form vertrieben) vermischt werden. So werden eine Dosis AvaximTM und eine Dosis Typhim ViTM zusammengemischt,
um eine Dose der bivalenten HA-Vi-Kombination zu ergeben.
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Die
zwei Untersuchungsreihen wurden mit Kombinationen durchgeführt, die
weniger als 20 Monate vor ihrer Verwendung als Injektionen im Rahmen
der klinischen Versuche hergestellt worden waren. Diese Untersuchungen
haben gezeigt, dass die bivalenten Kombinationen insbesondere bezüglich der
immunogenen Wirkung den entsprechenden monovalenten äquivalent
waren. Demnach hat die bivalente Kombination von SmithKline Beecham
Biologicals den behördlichen
Anforderungen von Großbritannien
genügt
und bereits eine Zulässung
für den
Markt in diesem Land erhalten. Diese Zulassung hat allerdings als
Beschränkung
ein Verfallsdatum, das auf 12 Monate nach der Herstellung festgesetzt
ist.
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Auf
dem Gebiet der Vakzine kann ein Verfallsdatum von 12 Monaten nach
Herstellung als nicht ausreichend angesehen werden, wenn man insbesondere
die Zeit berücksichtigt,
die für
die Kontrollen der Chargen vor der Verteilung notwendig ist. Ein
Verfallsdatum, das auf 24 oder noch besser 36 Monate festgelegt
ist, erleichtert die Kommerzialisierung der Chargen sehr.
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Die
Anmelderin hat im Fall der HA-Vi-Kombinationen bemerkt, dass die
Vi-Valenz ab 16 bis 18 Monate, die ab dem Herstellungsdatum vergangen
waren, progressiv ihre immunogene Wirkung verlor und hat eine Hypothese
bezüglich
der Ursache für
diese Instabilität
aufgestellt. In der Tat hydrolysieren die O-Acetyl-Gruppierungen
des Polysaccharids Vi, die für
die Immunogenität
von Vi charakteristisch sind, im Laufe der Zeit, vor allem unter
alkalischen Bedingungen. Diese Hydrolyse wird als für die Verringerung
der immunogenen Wirkung des Polysaccharids Vi verantwortlich gehalten
und basiert auf der Adsorption der Verbindung Vi auf Aluminiumhydroxid,
das in der bivalenten Kombination als Adjuvans der HA-Valenz vorhanden
ist. Die Vi-Valenz adsorbiert unverzüglich an das Aluminiumgel,
sobald die monovalenten Vakzine miteinander vermischt sind. Diese
Adsorption bringt das Halten des Polysaccharids Vi in alkalischer
Umgebung mit sich. In der Tat ist Aluminiumhydroxid positiv geladen,
zieht die OH-Ionen des Mediums an, das Gelegenheit für die pH-Erhöhung in der
Mikroumgebung des Aluminiumgels gibt, in dem sich Vi nach seiner
Adsorption befindet. Was die Hydrolyse der O-Acetyl-Gruppierungen angeht,
so ist sie ein sehr langsames Phänomen,
deren Wirkungen in der Tat nach etwa 16 bis 18 Monaten wahrnehmbar
sind.
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Die
Anmelderin hat nicht nur das Problem der Instabilität der Vi-Valenz
im Lauf der Zeit bewiesen, sondern sie schlägt auch eine Lösung vor,
die darin besteht, der bivalenten Kombination ein Anion wie ein
Phosphat- oder Citration zuzusetzen, welches die Adsorption der
Vi-Valenz an dem Aluminiumgel verhindert wird, während die HA-Valenz in Form
ohne Adjuvans gehalten wird.
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In
ihrer allgemeinsten Lehre bezieht sich die Erfindung auf eine Vakzinzusammensetzung,
die wenigstens zwei Valenzen umfasst: (i) eine erste Valenz, die
als Adjuvans Aluminiumhydroxid zugesetzt enthält, und (ii) eine zweite Valenz,
die ein Bakterienkapsel-Polysaccharid, das eine oder mehrere O-Acetylgruppierung(en) enthält, umfasst
und die nicht an Aluminiumhydroxid adsorbiert ist, das der ersten
Valenz als Adjuvans zugesetzt wird, und zwar infolge des Vorliegens
einer zusätzlichen
Verbindung, die die Adsorption der zweiten Valenz an dem Aluminiumhydroxid
verhindert, ohne die Adsorption der ersten Valenz zu stören.
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Nach
einer vorteilhaften Ausführungsform
wird die Adsorption der zweiten Valenz durch das Vorliegen einer
anionischen Schutzverbindung verhindert, unter der Bedingung, dass
sie alle notwendigen Sicherheitsgarantien für eine Verwendung zu Impfzwecken
erfüllt.
Diese Schutzverbindung ist ein Phosphat, ein Citrat oder auch ein
Carbonat. Es ist auch möglich,
eine Kombination unterschiedlicher Anionen zu verwenden, z.B. eine
Kombination von Phosphat- und Citrationen. Als Beispiel kann man
präzisieren,
dass die Phosphationen insbesondere durch eine Lösung, die Monokaliumphosphat,
Dinatriumphosphat und Natriumchlorid enthält, eingebracht werden können.
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Die
Verwendung einer Schutzverbindung ermöglicht es insbesondere, die
Antigenaktivität
der zweiten Valenz über
einen langen Zeitraum (24 Monate oder mehr), vorzugsweise während einer
Konservierung bei Lagerung bei Normaltemperatur oder erhöhter Temperatur
(z.B. 37°C),
zu stabilisieren. Die Stabilität
der immunogenen Aktivität
kann durch unterschiedliche Techniken bestimmt werden, indem diese
Aktivität
zu dem Zeitpunkt, zu dem die Zusammensetzung hergestellt wird, gemessen
wird, und dann identische Messungen im Lauf der Zeit oder wenigstens
nach 24 Monaten ab dem Fabrikationsdatum durchgeführt werden
und indem die erhaltenen Resultate verglichen werden. Wenn die chiffrierten
Angaben sich nicht als statistisch unterschiedlich erwiesen haben,
muss davon ausgegangen werden, dass die immunogene Aktivität stabil
ist. Das Titrieren der immunogenen Aktivität eines Antigens kann durch
die ELISA-Technik erfolgen, die auf dem Gebiet der Vakzine in gängiger Verwendung
ist.
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Die
erste Valenz kann eine beliebige vakzinale Valenz ohne Beschränkung des
Typs oder die Struktur sein, natürlich
vorausgesetzt, dass die Notwendigkeit eines Adjuvans besteht. Genannt
wird insbesondere die Hepatitis A (HepA oder HA)-Valenz, die Hepatitis B (HepB)-Valenz
und die Pneumokokken-Valenz.
Diese erste Valenz kann aus einem inaktivierten Virus, z.B. dem
inaktivierten HA-Virus oder dem inaktivierten Polio-Virus; einem
abgeschwächten
Virus, einer viralen oder bakteriellen Antigen-Untereinheit, wie
dem Oberflächen-Gen des
Hepatitis B-Virus, dem Diphterie- oder Tetanusanatoxim, bestehen.
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Die
zweite Valenz besteht per Definition aus einem Polysaccharid, das
konjugiert ist oder nicht, das im Inneren seiner Repetiereinheit
eine oder mehrere O-Acetyl-Gruppierungen
enthält.
Das Polysaccharid der Kapsel von Salmonella typhi (auch Polysaccharid
Vi bzw. Vi-Polysaccharid genannt) ist das der Kapsel von Neisseria
meningitidis-Gruppe
A, das dieser Definition entspricht. In diesen Fällen spricht man von der Vi-Valenz
oder Flecktyphus-Valenz und der Meningo A-Valenz.
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Unter "Bakterienkapsel-Polysaccharid" versteht man ein
Polysaccharid, das aus einer Verkettung der charakteristischen Repetiereinheit
eines Kapselpolysaccharids besteht, und zwar unabhängig von
seiner Größe und unabhängig von
einer angefügten
Modifikation. Die Repetiereinheit eines Polysaccharids, das in die Zusammensetzung
der Erfindung eingebracht wird, enthält notwendiger Weise wenigstens
eine O-Acetyl-Gruppierung.
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Zu
Zwecken der vorliegenden Erfindung kann das Polysaccharid in gereinigter
Form, ausgehend vom Ursprungsbakterium nach ganz herkömmlichen
Techniken erhalten werden. Nach Bedarf kann das Polysaccharid (i)
fragmentiert sein oder nicht und (ii) oder an einen Polypeptidträger wie
Diphterie- oder Tetanus-Anatoxin konjugiert sein oder nicht.
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In
einem spezifischeren Rahmen hat die Erfindung eine Vakzinzusammensetzung
zum Gegenstand, umfassend (i) die HA-Valenz, die mit Aluminiumhydroxid als
Adjuvans versetzt ist, (ii) die Flecktyphus-Valenz, die aus dem
Polysaccharid Vi besteht, wobei in der Zusammensetzung die Vi-Valenz
nicht an Aluminiumhydroxid adsorbiert ist, und (iii) Phosphat-,
Citrat- oder Carbonationen.
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Zu
Zwecken der vorliegenden Erfindung kann die erste Valenz mit einem
Adjuvans versetzt sein, z.B. durch Präzipitation mit Aluminiumhydroxid
oder durch Adsorption auf Aluminiumhydroxid.
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Das
Aluminiumhydroxid, das als Adjuvans für die erste Valenz dient, kann
reines Aluminiumhydroxid sein (d.h. eine Aluminiumverbindung, die
nur Al3+-Ionen und Hydroxidionen enthält) oder
irgendein unter demselben Namen bekanntes Aluminiumhydroxid sein,
wenn sie unter chemischen Gesichtspunkten nicht ausschließlich aus
Aluminiumhydroxid bestehen. So kann es sich um gemischte Aluminiumverbindungen
handeln wie die, die mit dem Namen Aluminiumhydroxyphosphat oder
-hydroxysulfat bezeichnet werden. Im Allgemeinen handelt es sich
um jede Aluminiumverbindung, die insbesondere Hydroxidionen enhält. Als
Beispiel kann man das Aluminiumhydroxid AlhydrogelTM,
das von der Société Superfos
Biosector vertrieben wird, nennen.
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Die
Phosphat-, Citrat- oder Carbonationen (Schutzverbindung) müssen in
einer Menge zugesetzt werden, die ausreicht, um die Adsorption der
zweiten Valenz zu verhindern, wobei die erste Valenz in der Form mit
Adjuvans gehalten wird. Diese Menge hängt von verschiedenen Faktoren
ab, unter denen die Menge und die Natur der ersten Valenz, der Modus
der Adjuvanswirkung, die Menge und die Natur des Aluminiumhydroxids
und die Menge der zweiten Valenz sind. Der Fachmann auf dem Gebiet
der Vakzine ist jedenfalls in der Lage, diese Beschränkungen
zu berücksichtigen,
um die geeignete Menge der Verbindung, die die Adsorption der zweiten
Valenz verhindert, sobald die anderen Faktoren festgelegt wurden,
zu bestimmen, so dass das Aluminiumhydroxid durch die Phosphationen
gesättigt
wird, wobei jedoch die erste Valenz in der Form mit Adjuvans gehalten
wird.
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Dennoch
gibt man genau an, dass die Vakzine des Handels üblicherweise 0,6 bis 1,5 mg
Aluminium/ml enthalten. In den HepA-Vakzinen des Handels befindet
sich das Aluminiumoxidgel, das in herkömmlichen Dosen vorliegt (ausgedrückt als
Aluminiummenge), bezüglich
des HepA-Antigens in großem Überschuss,
je nachdem wie weit die Adsorptionsstellen des Aluminiumoxidgels
davon entfernt sind, gesättigt
zu werden. Sc tritt in der Praxis nur die Aluminiummenge als Determinante
zur Entwicklung der Menge der Schutzverbindung, die vorliegen muss,
auf.
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Für eine erfindungsgemäße Zusammensetzung,
die 0,3 mg Aluminium in Form von Aluminiumhydroxid und in einem
Volumen von 0,5 ml enthält,
ist es zweckdienlich, ungefähr
20 mM Phosphationen zuzusetzen. Wenn die Aluminiumdosis bei demselben
Volumen verdoppelt wird, ist es zweckdienlich, zweimal mehr Phosphationen,
d.h. 20 mM, zuzusetzen. Für
eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung,
die 0,6 mg Aluminium in einem Volumen von 1 ml enthält, sind
aber 20 mM Phosphationen ausreichend.
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Als
Beispiel gibt man an, dass ein bivalentes Vakzin gemäß der Erfindung
in einem Volumen von 0,5 ml (i) 160 Antigen-Einheiten oder 1440 ELISA-Einheiten
des inaktivierten Virus von Hepatitis A, adsorbiert auf (ii) Aluminiumhydroxid,
das 0,3 mg Aluminium enthält,
(iii) 0,025 ml Polysaccharid Vi und (iv) 20 mM Phosphationen, enthält.
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Die
Antigeneinheiten und die ELISA-Einheiten, die oben genannt wurden,
sind entsprechend Einheiten, die mit Hilfe von geeigneten ELISA-Referenztests
für die
Firmen Aventis Pasteur und SmithKline Beecham Biologicals (van Hoecke
et al., J. Travel. Med. (1998) 5: 116 und Andre et al. In Prog.
Med. Virol., Melnick JL, Herausg., Basel, Karger (1990) 37: 72)
entwickelt wurden. Dies kann auch auf andere Weise geschehen, denn es
existiert keine internationale standardisierte Referenz für das HepA-Vakzin.
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Eine
Zusammensetzung gemäß der Erfindung
ist vorteilhafter Weise in flüssiger
Form und eine Vakzindosis wird vorteilhafter Weise in einem Volumen
zwischen 0,5 und 1 ml, die Grenzen eingeschlossen, formuliert.
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Eine
Zusammensetzung gemäß der Erfindung
kann hergestellt werden:
- (i) indem man Phosphat-,
Citrat- oder Carbonationen zu einer Präparation gibt, die eine andere
Valenz als die Flecktyphus-Valenz
zusammen mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans enthält, gibt; und
- (ii) indem man die in Punkt (i) erhaltene Präparation mit einer Präparation
mischt, welche die Flecktyphus-Valenz enthält.
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Beispiel: Präparation einer HA-Vi-Zusammensetzung
gemäß der Erfindung
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A – Präparation des adsorbierten HA-Bestandteils
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99
ml einer Charge an inaktiviertem HA-Virus, deren Antigentiter 885
E ELISA/ml ist, werden mit 5,94 ml 25%igem 2-Phenoxyethanol vermischt.
Während
15 min wird eine Homogenisierung durchgeführt, dann wird die Präparation
mit Millipak 40 MPGL 04SH2-Filter filtriert. Nach Filtration erhält man 95
ml einer Präparation
mit einem Titer von 835 E ELISA/ml.
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Zu
dieser Präparation
gibt man 47,5 ml eines Aluminiumoxidgels, das 3,14 mg Aluminium/ml
enthält. Man
ergänzt
mit 40 mM PBS (Phosphatpuffer) auf 48 ml. Das Rühren wird eine Nacht bei 5°C (18 h)
durchgeführt,
damit der Bestandteil HA auf dem Aluminiumoxidgel adsorbiert. Der
pH ist 7,28.
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B – Herstellung
einer 10-fach konzentrierten Lösung
von Polysaccharid Vi
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Man
stellt ein Polysaccharid Vi-Pulver nach dem Verfahren von Gotschlich
et al., Prog. Immunobiol. Standard (1972) 5: 485 her. In einen 30
ml-Kolben, der 16,64 mg Vi (9,5 g% Restfeuchtigkeit oder 15,06 mg Trockengewicht)
enthält,
gießt
man nach und nach 25,1 ml destilliertes Wasser, das zur Injektion
präpariert
war (ppi) und setzt das Rühren
fort. Man lässt
24 h bei 5°C
weiter rühren,
um eine vollständige
Auflösung
des Polysaccharids zu erhalten. Diese Präparation wird mit Millex 0,22 μm GV SLGV
025-Filter filtriert. Der Filter wird mit 5 ml destilliertem ppi-Wasser
gespült.
Das Endvolumen ist dann 30,1 ml.
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C – Herstellung des bivalenten
HA-Vi-Vakzins
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Zu
62 ml der in Punkt A erhaltenen Präparation (HA) gibt man 10,6
ml einer 24 mM Phosphat-Lösung, dann
8,1 ml der in Punkt B erhaltenen Präparation (Vi). Die Merkmale
des so erhaltenen Vakzins sind die folgenden.
Endkonzentration
an Phsophat: 20 mM
pH: 7,3
Osmolarität: 578 mOsm/kg
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Diese
Präparation,
die Präparation
P2 genannt wird, wird dann in Dosen mit 0,5 ml verteilt.
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Parallel
dazu hat man auch zwei andere bivalente Zusammensetzungen P2' und P2'' hergestellt, die nicht mehr 20 mM Phosphat,
sondern in entsprechender Weise 10 bzw. 40 mM Phosphat enthalten.
Dazu gibt man 10,6 ml einer Phosphat-Lösung,
je nach Art mit 17,6 mM oder 246 mM.
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Das
Verhalten der Bestandteile HA und Vi in den Zusammensetzungen P2,
P2' und P2'' wurde unverzüglich untersucht, indem diese
Bestandteile in den Zusammensetzungen wie sie waren oder nach Zentrifugation
durch ELISA bestimmt wurden. Man hat festgestellt, dass HA mit 10
mM Phosphat adsorbiert blieb, Vi aber am Aluminiumoxidgel adsorbiert
wurde, während
bei 40 mM Phosphat Vi nicht adsorbierte, HA aber partiell desorbierte.
Mit 20 mM Phosphat sind die gesuchten Bedingungen erfüllt: HA
bleibt adsorbiert, während Vi
nicht adsorbiert.
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Im
Folgenden wurde die Stabilität
der Dosen P2 bei 5°C ± 3°C während 30
Monaten untersucht. Die Antigenkapazität des Polysaccharids Vi in
den genommenen Vakzindosen wurden durch ELISA in ihrer Gesamtheit
und nach Zentrifugation im Überstand
bestimmt (der an dem Aluminiumoxidgel adsorbierte Bestandteil sedimentiert
mit dem Gel); das erlaubt außerdem
den Prozentwert an nicht-adsorbiertem Vi zu bestimmen.
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ELISA
wird als indirekte Methode verwendet. Das zu bestimmende Antigen
Vi wird zwischen den anti-Vi-Antikörpern, die den Boden eines
Plaques bedecken, und den Maus-anti-Vi-Antikörper genommen. Man gibt einen
biotinylierten Antikörper
gegen Maus-IgG, dann den biotinylierten Streptavidinkomplex, der
an Meerrettichperoxidase gebunden ist, zu. Die Reaktion wird durch
Zugabe des Substrats ortho-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (OPD) entwickelt. Der
Abbau von OPD lässt
sich durch eine braun-orange Färbung
erkennen, die proportional zur Menge an Antigen Vi ist. Ihre Intensität wird mit
dem spektralen Fotometer gemessen.
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In
Platten mit 96 Vertiefungen verteilt man 100 μl eines anti-Salmonella typhi-Serums.
Man lässt
5 h bei 37°C
inkubieren, dann leert man die Platte und führt 3 Waschgänge mit
PBS (Phosphatpuffer)-Tween 0,05 % durch. Man sättigt die freien Stellen, indem
man 200 μl
einer Lösung
von Milchpulver, verdünnt
in PBS, zusetzt. Man inkubiert 1 h 30 bei 37°, dann leert man die Platte
und führt
3 Waschgänge
durch. Man stellt Reihenverdünnungen
im Verhältnis
von 2 von einem Standardvakzin her, um einen Standardbereich zu
erhalten. Die zu titrierenden Vakzindosen sowie eine Referenzdosis
(ermöglicht
es, den Standardbereich zu verifizieren) werden in geeigneter Weise
verdünnt;
100 μl jeder
Verdünnung
werden in die Vertiefungen verteilt und man lässt eine Nacht bei 37°C inkubieren.
Man leert die Platten und führt
Waschgänge
durch. Dann gibt man 100 μl
eines anti-Vi-Mausserums,
das in geeigneter Weise verdünnt
ist, pro Vertiefung hinzu. Man lässt
1 Stunde bei 37°C
inkubieren, dann leert man die Platte und führt Waschgänge durch. Man fixiert so die
biotinylierten Anti-Immunglobuline von Mäusen (100 μl einer geeigneten Verdünnung pro
Vertiefung). Man lässt
1 Stunde bei 37°C
inkubieren, dann leert man die Platte und führt Waschgänge durch. Dann fixiert man
das biotinylierte Streptavidin, das an Peroxidase konjugiert ist
(100 μl
einer geeigneten Verdünnung
pro Vertiefung). Man lässt 1
h bei 37°C
inkubieren, dann leert man die Platte und führt Waschgänge durch. Man entwickelt die
Platte, indem man pro Vertiefung 100 μl einer OPD-Lösung mit
1 mg/ml in Citratphosphat-Puffer, pH 5, zusetzt. Man lässt 30 min
bei Umgebungstemperatur in der Dunkelheit inkubieren, bevor man
100 μl 2
N Schwefelsäure
in die Vertiefungen gibt. Das Lesen der Platte erfolgt im Spektrophotometer
bei 492 nm. Man entwickelt die Eichkurve mit der Extinktion als
Funktion der Konzentration. Der Titer jeder der getesteten Verdünnungen
wird mit Hilfe der Eichkurve erreicht und in ng/ml ausgedrückt. Um
den mittleren Titer jeder untersuchten Vakzindosis zu erhalten,
bildet man den Mittelwert der Titer, die mit der Gesamtheit der
Verdünnungen
erhalten wurden. Der Titer wird in μg/Dosis angegeben.
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Man
hat auch die Menge der O-Acetylgruppen des Polysaccharids Vi, die
im Überstand
vorliegen, nach Zentrifugation bestimmt. Die O-Acetylgruppen werden
durch eine kolorimetrische Methode unter Verwendung von Hydroxylamin
titriert (Hestrin S. J. Biol. Chim. (1949) 180: 249). Hydroxylamin
bildet in alkalischem Milieu mit den Estern eine Hydroxamsäure, die
in Gegenwart von Eisen(III)-salz eine kastanienfarbige Färbung gibt,
deren Intensität
mit dem Spektralphotometer bei 540 nm gemessen wird.
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Parallel
dazu hat man eine identische Untersuchung mit einer Präparation,
die Präparation
P1 genannt wird und die in der gleichen Weise wie P2 lediglich mit
dem Unterschied, dass man zum Zeitpunkt der Konstitution des bivalenten
Vakzins kein Phosphat zusetzt, hergestellt wurde, durchgeführt. In
diesem Fall adsorbiert der Bestandteil Vi unverzüglich an das Aluminiumoxidgel
und um seine Dosierung nach Zentrifugation wie für P2 zu bestimmen, muss er
vorher desorbiert werden. Diese Desorption wird durch Modifikation
des pH und der Innenstärke
des Mediums erreicht. Nach Zentrifugation wird das Aluminiumoxidgel
für 6 Stunden
bei 37°C
mit einer 150 mM Trinatriumcitrat-Lösung in Kontakt gebracht. Dann
zentrifugiert man, um den Überstand
zu erhalten, indem sich der Bestandteil Vi befindet.
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Die
Resultate sind in der folgenden Tabelle I angegeben.
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Die
Stabilität
der Formulierung P2 wurde auch bei 25°C ± 2°C während 6 Monaten und bei 37°C ± 3°C während 3
Monaten untersucht. Die Resultate sind in den folgenden Tabellen
II und III angegeben. TABELLE II
25°C | | | T0 | 1
Mon. | 3
Mon. | 6
Mon. |
Vi im ganzen Vakzin | Vi ELISA
(μg/Dosis) | P2 | 23,6 | 23,6 | 21,7 | 20,6 |
P1 | 24,4 | 19,6 | 11,3 | 7,4 |
Vi im Oberstand nach Zentrifugation | Vi ELISA
(μg/Dosis) | P2 | 24,3 | 25,5 | 22,6 | 20,1 |
P1 | 21 | 15 | 10,3 | 6,3 |
O-Acetyl
(μmol/Dosis) | P2 | 0,127 | 0,130 | 0,103 | 0,137 |
P1 | 0,081 | 0,053 | 0,041 | 0,029 |
Polysaccharid
(μg/Dosis) | P2 | 32,5 | 31,6 | 25,5 | 27,2 |
P1 | 20,8 | 17,3 | 10,3 | 6,3 |
% Desorption
von Vi in P1 | 86
% | 77
% | 91
% | 85
% |
TABELLE III
37°C | | | T0 | 1
Mon. | 3
Mon. |
Vi im ganzen Vakzin | Vi ELISA
(μg/Dosis) | P2 | 23,6 | 24,1 | 21 |
P1 | 24,4 | 12,7 | 5,6 |
Vi im Oberstand nach Zentrifugation | Vi ELISA
(μg/Dosis) | P2 | 24,3 | 25,5 | 21,1 |
P1 | 21 | 9,9 | 4,7 |
O-Acetyl
(μmol/Dosis) | P2 | 0,127 | 0,143 | 0,104 |
P1 | 0,081 | 0,050 | 0,026 |
Polysaccharid
(μg/Dosis) | P2 | 32,5 | 36 | 22,5 |
P1 | 20,8 | 15,4 | 9,9 |
% Desorption
von Vi in P1 | 86
% | 78
% | 84
% |